TW448295B - Improved method and reagent composition for performing leukocyte differential counts on fresh and aged whole blood samples, based on intrinsic peroxidase activity of leukocytes - Google Patents

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448295 A7 -~------B7 五、發明説明（1 ) 〜--- , 曼範圍 、本發月關於全血樣本之改良白血球（即白血球細跑）差式 、、及用於此方法中之試劑組合物。本發明差式方法和試 劑组。物的基礎爲白血球内過氧化酶活性之測定。無論是 對新鮮血樣，或已貯存在室溫下約48小時或冷藏之陳化^ 樣:當樣本供光學掃描和吸收流動式細胞分析法作電予光 學分析時，本發明方法和组合物都可以保持準確性和精密 性。 -發明览！ 通常在全血樣中可發現之五類白血球細胞或白血球爲嗜 =性球、淋巴球、單核球、嗜酸性球和嗜鹼性球。爲測定 =五類正常白血球之相對比例，及偵測全血樣中任何不正 吊細胞4存在和濃度，傳統的醫學診斷步驟是檢測顯微玻 』片上經乾燥和染色的血液抹片。此種步驟稱爲差式白血球 計數，描述於 Mia丨e，j· Β.，"Laboratory Medicme_ 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 ---------ά—— (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Hematology , (1967), C.V. Mosby Company, St. Louis, Missouri，pp. 822_830, 1 126, U27 an(J 113〇。除了前述五類 血樣中的白血球以外，差式白血球計數亦偵測和計算大型 未染色細胞（，，LUCs”）。LUCs代表正常血樣中的白血球的 —小部份，並包括一些細胞種類，如大型淋巴球、經活化 之淋巴球、漿細胞、芽細皰和過氧化酶陰性之單核球、嗜 中性球和嗜酸性球β

I— I 1 -- 8- I I -I 因此發展出了半-和全-自動化血液學方法和自動化流動 式系統裝置以減輕差式白企球計數和血樣分析之負擔，如 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 448295 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 五、發明説明（

Ansley等人之美國專利第3,741，875;Kim的美國專利第 4,099,917號和Cremins等人之美國專利第4,801，549和 4,978,624號中所描述。此種方法和系統使用電子光學和細 胞化學程序去特異地偵測、鍾定、定量和標記各細胞種類 °此外，此技藝中已知有測定白血球差式計數之手控程序 ，如 Miale，J.B.，’’Laboratory Medicine-Hematology”，（1967) C.V. Mosby Company, St. Louis, Missouri c

Hamaguchi等人之美國專利第5,389,549號描述分類白血球 之方法和試劑，其中該方法涉及偵測高頻下之電阻改變或 粒子和液體介質導電度之差異，且該試劑需一或二種成份 溶液，其含有特定種類之陰離子性和非離子性以聚氧乙缔 爲基礎之界面活性劑’每分子含有1 8 - 3 〇個重覆的氧乙稀 單位，其中亦含有高-或低-滲透性試劑及安定劑。此二成 份試劑同時需要第一液體稀釋液及第二溶血試劑液。 如Kim之美國專利第4,〇99,917號中所描述，先前用以製 備供用於此系統中之細胞懸浮液之方法包括以界面活性劑 處理未凝集企樣約1 . 5分鐘以使紅血球預設至待溶解狀释； 再加入固定劑至細胞約丨分鐘，並同時保持中性pH ;然後 培養該混合轴於約58»(：至60»(：歷約2分鐘以溶解紅血球並 固定白血球a

Cremins等人之美國專利第4,801，549和4,978 624號描述差 式白血球計數測定之較快速方法和試劑，其可在全血樣中 溶解紅血球而不破壞白血球，且其造成最小的額外細胞沉 澱或細胞集結。此種沉澱或細胞集結導致程序中細胞偵測 私紙張尺度適用中國固家標準（CNS〉八斗祕（21〇乂297公慶 ---------^------II------,/-, -· {請先閲讀背面之注意Ϋ項再填寫本頁> 經濟部中央標隼局貝工消費合作社印策 4 4 8 2 9 5 a? B7 五、發明説明（3 ) 和辨識階段之模糊。所述方法（或過乳化酶方法')涉及一 種混合物，其包括過氧化物（如過氧化氫）和一種適當的色 原體以染色和區辨白血球類別中之特定細胞種類c 在該等方法中之任何一種中，都必需把紅血球盡量溶解 掉，因爲在正常血液中，紅血球數目超過白血球約1000倍 。因此，即使紅血球僅殘留百分之一未被溶解，仍很難精 密而準確地進行白i球細胞差式計數。 在美國專利第4,801，549和4,978,624號所描述之過氧化酶 方法中，在全血樣與一個溶液混合後，紅血球被溶解而白 血球被交聯或”固定"，該溶液包括僅一種界面活性劑，— 種固定劑如三聚甲越或甲越、一種糖或糖醇及一種缓衝劑 以保持約中性pH。位在一些特定白血球即嗜中性球、嗜酸 性球和單核球細胞質令的過氧化酶陽性顆粒中，過氧化氣 和一種供電子色原體（如4-氣-1-莕酚）形成深紫色沉殿r此 沉澱是一種不溶性反應產物，其是受細胞内顆粒中之内過 氧化酶催化而形成》區辨細胞種類是藉電子光學分析來進 行，以逐個細胞的方式來測定細胞大小和染色程度（即正角 散射對吸收），並點記在細胞圖中，然後進行分析以得到白 血球總數和樣本中不同種類白血球的差式計數。此外，白 血球總數可與差式計數分開獲取。 在本發明提供改良和優點前，已描述有—種鹼性過氧化 酶稀釋劑，特別可用於白血球分類用之鹼性過氧化酶方法 中’該方法是在Technicon H6〇〇〇TM自動化分析系统上進行 °先前之鹼性過氧化酶稀釋劑有些主要缺點，如試劑成^ -6-

^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4说格(Ti〇^97^5~)-------J "^ir------/ I J * ί請先閲讀背面之注意事項再填寫本貰) 448295 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印掣 五、發明説明（4 的不安疋性和所造成的短暫搁置和聍存壽命。此外，使用 者必需製備鹼性過氧化酶稀釋劑之均勻工作溶液，以進行 鹼性過氧化酶方法。使用者需要混合一種含高量（即4 5%) 硫酸十二酯鈉之溶液和一種含高量（即30%)Briji) 35之溶液 ，造成工作用鹼性過氧化酶稀釋劑含高濃度的二種界面活 性劑β此種使用者製備程序不僅涉及刺激性稀釋劑試劑成 份，亦造成費力，且必需進行多次，因爲所得-均勻工作用 鹼性過氧化酶稀釋劑只安定—週。下文將會清楚説明，鹼 性過氧化酶稀釋劑之不安定性、短暫貯存能力和使用者操 作問題以及相關之缺點，都可被本發明大幅改善和克服。 在本發明之前，另有一項阻礙細胞分離和定量方法精密 性和可信度之主要缺點，特別是對白血球差式計數之過氧 化酶而言，該缺點是方法中之易變潤洗攜移（carryover)e已 知潤洗攜移隨不同系統和分析而有不同。特別是基於過氧 化酶反應方法之白血球差式分析的精密性和準確性常受到 方法中所進行此種易變潤洗攜移的影響，熟習是項技藝之 人士假設潤洗攜移只對方法有體積稀釋作用，及假設潤洗 穩移在方法的反應步驟中未扮演活性或功能性角色。事實 上，在本發明之發現以前’熟練之操作者並未發現潤洗攜 移對血樣分析不只是单純的體積效應，且尚無本發明所提 出和描述之解決方式。 再者，此技藝中需要改良的試劑和方法，以自新鮮（即取 出後少於或等於S小時）血樣和已在室溫下貯存高達约4 8小 時之陳化血樣中分析和汲取有用的臨床資料。亦需要發展 本紙張从適用辛囷國家標準（CNS )八4胁（2Η5Χ297公釐） ¾-- I I * (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

•1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4482 9 5 A7 I-------- B7 五、發明説明ΐΤ] — -—'^— 適當的試劑溶液和组合物，其包括可減少由易變潤洗鵠移 所引起的前逑問題和可產生精密又可信顇的結果之成份， 特別疋但不限於此）用於各種不同血樣種類之電子光學分折 中，血樣種類如以各種不同方式（如冷藏或室溫下貯藏）保 存之新鮮全血樣、陳化全血樣、異常全血樣（如醫院或病患 來源）及正常全血樣（如非醫院或”健康"提供者之來源）^此 技藝尚需要試劑组合物，其非常安定、具長久擱置和貯存 壽命（如大於一週），且在用來進行白血球差式計數方法及 由此方去中獲得資料之前，無需使用者或消費者之製備或 操作。在用自動化分析儀進行室溫貯存或陳化血樣之差式 計數時，必需能使所得細胞圖原點處之雜訊達到及/或保持 可接受的程度。 發明要點 本發明提供用於定量和區辨新鮮和陳化全血樣中的白血 球之改良試劑组合物和方法，係使用電子光學程序和流動 式細胞計數分析。 本發明之目的在於提供用於半·和全_自動化系統中之最 適化、改良試劑組合物和方法，以避免將所不欲之反應成 份由一方法步驟攜移至另一方法步驟的間題，如此使得細 胞種類得以乾淨地分開和定量，而不致在用於白血球差式 計數的方法所得的細皰圖中產生無法接受之原點雜訊程度 和細跑污染。 本發明進一步的目的在於提供一種潤洗試劑溶液，其在 白血球差式方法的反應步，裸不扮演任何功能性角色，且不 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（2〖0>c297公疫） ^------、u-------^ W -- f請先閑讀背面之注意事項再填寫本頁) 448295 A7 B7_ 五、發明説明（e ) ' *一~~· 參與此方法的反應化學，特別是對過氧化酶方法而言& 本發明另一目的在於提供自動化過氧化酶方法和試劑組 合物，其可對各種不同血樣種類得到準確和精密的結果，

如陳化和新鮮血樣，異常和正常血樣，及冷藏和室溫下貯 藏之樣本。 'T 本發明尚有一目的在於提供一種改良的試劑組合物，其 可用於過氧化酶方法中以計數和區辨全血樣中的不同白也 球種類，係使用吸收流動式細胞計數法。 本發明還有一目的在於提供最適化且改良的方法和試劑 組合物，用來快速並有效地定量測定全血樣中之白血球數 目和亞群基式計數，係使用内過氧化酶染色，運用使用自 動化血液學分析和流動式細胞計數法。 本發明另一目的在於提供一種試劑製品，其可改良白血 球樣本中嗜酸性球亞群之分離。 本發明另一目的在於提供平衡及安定之試劑組合物，用 於在涉及陳化全血樣過氧化酶染色之白也球差式計數方法 中’將反應步蝶最適化，及用於避免此方法辛潤洗攜移的 負面效果。 本發明還有一目的在於提供安全又安定之試劑製品和方 法’其中該試劑組合物係方便且立即可用的，不需要由使 用者或消費者在使用前作額外的製備和混合。本發明試劑 组合物在室溫下是安定的，且可維持長久的貯存和摘置壽 命（如大於一週且至少約一年）。另一目的在於使白血球差 式计數方法合理化，及減少進行此方法的步驟時所需的試 -9- 本紐妓適用中g—轉（CNS >从祕（加χ297/>楚）1 — ---- ί請先閑讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝· 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印裝 j 4482 9 5 A7 五、發明説明（7 ) --- 劑數目。 本發明的目的和優點將於下列詳述中更爲清楚說明a 縮寫及 下列縮寫和術語芡定義或解釋係爲方便熟習此項技銜之 人士，而絕非欲限制本發明之範圍： 在所例π之自動化分析儀上所進行的過氧化酶方法中， 紅血球;容解定義爲打破細胞膜而造成大部#或全部血紅素 自、田胞中流出。所得紅血球虛體（ghost)能被存在過氧化酶 万法所用組合物中之固定剞作化學交聯或固定。紅血球虚 體在細跑圖原點區域中被偵測爲雜訊，其係用流動式細胞 4數法由樣本中以電予光學偵測細胞而得。 過氧化酶在本案中全縮窝爲"P X，’。 在本案中’所用的術語水性試劑組合物、試劑溶液和稀 釋劑係相當的。 R1是白血球細胞差式計數px方法中的第—反應相。如本 文中所詳述，在px方法之R1相中，白血球樣本是與根據本 發明所調配的第一水性試劑組合物（’’ p x R 1試劑組合物"或 ”過氧化酶R 1試劑组合物·，）相混合。在Ρ χ方法之R 1相中， 經由R1試劑組合物中所存在的固定劑，樣本中所有或大部 份紅血球被溶解，且白血球被化學交聯或固定。 新鮮金樣是指血樣在取出後少於或等於8小時時即用於分 析。術語"新鮮血樣，，與本文中所用”第一天樣本，，是同義詞 0 陳化血樣是取出後已在室溫下貯存高達約4 8小時之血樣 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----------^------1T------^ " ·-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 82 9 5 A7 __B7_一 _ 五、發明説明（s) 。術語"陳化血樣”涵蓋本文令所用的"第二天血樣” 一詞。 圖示説明 附圖可進一步描述本發明，並經由澄清其各種不同方面 而有助於了解本發明，圖示乃呈現一些細胞圖，這些細胞 圖在用自動化血液學分析儀電子光學偵測裝置來進行差式 白血球計數之過氧化酶方法時，使用根據本發明所製得之 备種水性試劑組合物或稀釋劑或其改良試劑所)导到。圖1中 之數字標記是爲標示細胞圖中之不同區域，且在各圖中是 相同的。如所示，數字！表示淋巴球族群區域：數字2表示 單核球族群區域；數字3表示嗜中性球族群區域；數字4表 示嗜酸性球族群區域；數字5表示由血小板和紅血球虛體造 成之原點雜訊區域；及數字6表示LU C族群區域》 圖1 A-1 D的實驗結果係爲測試當使用只含離子性界面活 性劑之過乳化酶R 1試劑組合物進行白血球差式計數之p X方 法時’是否能得到可接受的結果。Px方法進一步包括一個 潤洗循環，其中潤洗是調配成不含非離子性界面活性劑， 或含有非溶血性界面活性劑piur〇nie。圖1八細胞圖是以第一 天血樣進行Ρχ方法所得之結果。圖1A中所用的111試劑組 合物含0.105克/升SDS(硫酸十二酯鈉）；圖^八中所用的潤洗試劑 溶液含3,0克/升Brij® 35和2 ^克/升SDS。圏…細皰圖是以 第二天血樣進行Ρχ方法所得之結果。圖1^中所用的111試 測組合物含0.105克/升SDS ;圖丨Β中所用的澗洗試劑溶液含 3.0克/升Brf 35和2.〇克/升SDS。圖lc細胞圖顯示以^ 二天血樣進行Px方法之結果。圖1(：中所用之111試劑組合 ---------装------訂------^ J 二 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 本紙張尺纽财 X 297^·釐） A7 B7 448295 五、發明説明（9 ) 物含0.105克/升S D S。相對於圖1 A和1 B，圖1 C中所用之 潤洗試劑溶液含1 〇克/升非溶血性界面活性劑phir〇nic 1〇5 ’其存在於磷酸鹽緩衝食鹽水中（見表2)。圖id細胞圖顯 示以第二天血樣進行p x方法所得之結果。如同圖1 C，圖 1D中所用之Px Ri試劑組合物含SDS，但具較高濃度，即 〇 17克/升SDS。潤洗試劑溶液和圖i c中所述者相同。圈J A_ 1 D結果圖示，相較於第一天血樣分析結果（國^ A )，其係用 只含S D S之R 1試劑组合物和含離子性界面活性劑s d S和非 離子性界面活性劑Brij® 35二者之潤洗試劑來進行，第二天 血樣分析是用只含S D S之R 1試劑組合物和與圖]a相同的潤 洗循環來進行’可得到可接受的原點雜訊，相對地，若潤 洗液只含Pluronic Pi〇5界面活性劑（圖1<::和1D)，則細胞圖 顯示無法接受程度之原點雜訊。圖1 C和1 D顯示，富潤洗液 不含非離子性界面活性劑如Brij® 3 5時’ Ρχ試劑組合物中只 含離子性界面活性劑是不足以由ρ χ方法中得到可接受的和 有用的結果。如本案發明人所測定，圖i c和i D之第二天血 樣分析結果無法接受是因試劑組合物中缺乏非離子性界 面活性劑。 圖2 A - 2 J的實驗結果係爲測試當使用只含不同濃度非離 予性界面活性劑之Px R1試劑組合物來進行ρχ方法時，是 否能得到可接受的數據和結果。如所示，圖2 Α _ 2 Ε細胞圖 是以第一天血樣進行ΡΧ方法所得之結果’圈2F2J細孢圖 是以第二天血樣進行Ρχ*法所得之結果。圖2A*2F中所 用之Ρ χ R 1試劑組合物含0 〗2克，升3 5和2 · 〇克/升 -12- 本紙乐尺度it财關家標準（CNS ) A4規格（2數297公餐1 一· ^------ΐτ------,λ ..** ί請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 448295 A7 B7 五、發明説明（10) {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} S D S ’係作爲第一天和第二天血樣分析之對照组。圖2 B -2 E和圖2 G-2 J中所用Px R 1試驗試劑組合物不含離予性界 面活性劑（即0 〇克/升S DS )。試驗試劑組合物含下列含量 之非離子性界面活性劑Brij® 35 :圖2Β和2G含0.0克/升 BrijίJ35;圖2C和2H含0·14克/升Btij'¾35;圖2D和2I含 0.2 8 克 / 升 Brij® 35;及圖 2E和 2J含0.42 克 / 升 Brij® 35。如 圖2 A- 2 J所示，p x R 1試劑組合物中只含非‘子性界面活 性劑時，P X方法所得細胞圖的結果係無法接受的β因此， 只有#離子性界面活性劑是不足以自ρ X方法得到可接受的 結果的》 經濟部中央標準局員工消費合作.杜印製 圖3 A - 3 D的實驗結果係爲測試當ρ χ方法包括—個樣本潤 洗循環JL使用兼含非離子性界面活性和離子性界面活性劑 之Ρ X R 1試劑組合物時，是否能提供可接受之數據和結果 ’特別是用第二天血樣進行分析時β如所示，圖3 a和3 Β細 胞圖疋用第一天血樣進行px方法之結果，所用ρχ R1試劑 組合物含0·0克/升Brij* 35和0.105克/升SDS。圖3A分析 中所用之潤洗溶液含3 0克/升Brij® 35和2.0克/升SDS。 圖3B分析中所用之潤洗溶液含〇 〇克35和2 〇克/ 升S D S »周3 C細胞圖是以第二天血樣進行ρ X方法之結果 ，所用Px R1試劑組合物含〇.〇克/升Brjj® 35和2.0克/升 S D S，及潤洗循環試劑含〇 〇克,,升3 5和2 〇克/升 S D S。圖3 D細胞圈是以第二天血樣進行ρχ方法之結果， Px R1試劑组合物兼含0.12克/升Bdj® 35和2·〇克/升SDS ，及新揭示之潤洗試劑溶液含非溶血性界面活性劑phir〇nic -13- 本紙張从適财關家辟（CNS ) Α4_( 2ΐ()χ297ϋ } A7 B7 448295 五、發明説明（11) P105而無SDS或Bdj* 35。圖3A-3D之結果顯示，以第二天 血樣作分析時，若欲得細胞圖之完整性，R1試劑組合物中 ，除了離子性界面活性劑以外，需要包括非離子性界面活 性劑（如Brij® 35)，而潤洗溶液不含Brij® 35。. 圖4A-4F細胞圖是在全血樣上之實驗結果，爲測試衣發 明過氧化酶方法中易變潤洗攜移之影響（見實例5)。圖4A_ 4F所示實驗中所用之px R1試劑組合物含〇 1〇5克/升s〇s a潤洗循環中所用澗洗溶液之組成有所不同，潤洗液本2 〇 克/升SDS(圖4A、4C和4E)或2.0克/升SDs+3 〇克，升 Brij® 35(圖祁' 4D和4F)。阁4A和4B是Ρχ方法中所用潤洗循 %有約7.9微升潤洗搞移體積時所得之細跑圖結果；圖4匸 和4D是Ρχ方法中所用澗洗循環有約丨微升潤洗攜移體 積時所得之細胞圖結果；及圖4Ε和4F是Ρχ方法中所用潤洗 搪環有1 3 3微升潤洗攜移體積時所得之細胞圖結果。細胞 圖顯示，若攜移體積超過約8.0微升，則潤洗溶液中存在有 非離子性界面活性劑Brij* 35會產生無法接受之結果。 發明詳述 本發明大致是關於用過氧化酶（PX)方法來測定和定量白 血球差式計數的改良方法和試劑組合物，其依據特定種類 白血球之内過氧化酶活性的測定。本發明特定是關於半自 動化和自動化流動式細胞計數分析儀，及關於白血球測量 和亞群測定用之過氧化酶方法之改良。 爲助了解本發明，乃摘要説明測定白血球差式計數之自 動化過氧化酶方法中所發生之細胞和分子事件t在過氧化 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )人4说格（2I0X297公楚） ^-----Ί.1Τ------^ - _ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 448295 Α7 Β7 五 經濟部中央捃準局貝工消費合作社印裝 發明説明（12〉 酶方法之第一或R1相中，血樣是和水性第一試劑（R1)組合 物（即R 1溶液或稀釋劑）混合，混合物加熱至約7 〇 »C約丨5 . 2 〇秒。在此期間，紅血球溶解，其血紅素流出，所得紅血 球虛體被固定。白血球被固定劑（如甲醛）化合物化學交聯 或”固定”，以對抗在其餘反應中溶解。一般而言，紅血球 較白血球和血小板易於溶解，然而，在此程序所用之條件 下，紅血球虛體和血小板被交聯並非不尋常，-因溶解和交 聯是發生在相同樣本反應混合物中之競爭過程。因此，在 血认中，過氧化酶方法需要在紅血球溶解和白血球固定間 達到精密平衡。若Px m試劑組合物之溶解力太強，紅血 球和白血球都被破壞。相反的，若固定劑濃度太高，在紅 血球溶解前，所有細胞都被固定。因此，白血球差式計數 可達高精密度；及準確測定細胞種類和細胞數目，特别是 根據本發明發展出之改良過氧化酶方法的速度和最適反應 條件和試劑配方，用半·和全·自動化血液學系統中進行快 速樣本分析& 全血中紅血球對白血球之比例爲約丨〇〇〇:丨。因此，爲使全 血樣分析用之自動化過氧化酶方法達最佳功效，顯然樣本 中之所有紅血球必需在分析前期即被溶解。結果在用R i稀 釋劑於第一反應中時，紅血球溶解和白血球交聯間有競爭 。若紅血球在溶解步驟中存活，帶有血紅素，則很可能會 干擾差式計數，因其會被誤認爲淋巴球，在所得細胞圈中 之淋巴球區域佔據位置。然而，在過氧化酶方法Ri相中， 血樣中的白血球不被溶液攻擊或分解亦很重要。 -15- ΐ紙張尺度適準(CNS) λ^·2-1〇χ297公釐， ---------t------ir------^ - : (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —---*1 4 482 9 5 A7 B7 五、發明説明（13) 先 聞 8 背二 面 之 注 意 事 項 存 接著過氧化酶R1相後是第二反應相（亦稱爲"反應2,，或 R2 )，將過氧化氫基質溶液和電子提供者（如心氣小茶 )‘，至R 1反應混合物中。該等化合物爲内部細胞性過氧 化酶，基質’在這些白血球種類中差異地存在可"染色，. L括單核球、嗜中性球和嗜酸性球。淋巴球和大型未染色 細胞(LUCS)，T'含内過氧化酶，因此在此方法中不被染色。 紅血球和血小板的組合，其亦不含内過氣化酶，不被染色 :但能造成原點雜訊。在幾乎所有涉及全面細胞分析的 方法都會遭遇此現象。不完全溶解的紅血球，含一些或所 用的血紅素，可在以方法所得之細胞阑的淋巴球區域被偵 測到，並于擾此方法。血小板和血小板凝集團亦可在淋巴 球區域被偵測到，此乃另一干擾來源。 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印策 在過氧化酶方法中，"染色，，是複雜化學反應之結果，其 中電子提供者基質如4-氣-1-茶紛被氧化和聚合成深紫色反 應產物，被束缚在細胞中。細胞内顆粒被染成紫色，因此 ，若在顯微鏡下可觀察到過氧化酶反應混合物（,，沖提液,，） 中之細胞（用顯微鏡肉眼檢視時，染色細胞看似黑色）。在 自動化血液學分析系統中，如以H#TM系統爲例，其可以商 品名TECHmCONHfT' η春，η鲁3TM等購得，甴本 案受讓人出售，可藉測定吸光（基於紫色反應產物）和光散 射（根據細胞大小）來作電子光學偵谢j。 本發明提供一種新穎的試劑組合物，可用於過氧化酶方 法中之R1相’以改良和最適化過氧化酶方法之整體功效， 此乃因新加入一個成份至試劑組合物中；該成份爲溶血性 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210X297公釐） Α7 Β7 448295 五、發明説明（Η) 、非離子性界面活性劑，如Brij* 35。在新穎試劑組合物中 同時存在有此種非離子性界面活性劑和離子性界面活性劑 ，乃提供了一種新穎pxI試劑或稀釋劑，其可成功地和其他 試劑一同用於上述過氧化酶方法之接續反應相十3熟習此 項技藝者知道Px方法之R1相中，界面活性劑之量和濃量是 很重要的·即太多界面活性劑會造成樣本中之白血球被侵襲 而太；^界面活性劑則無法遑當溶解紅血球，因而造成所 得細胞圖中有過高之原點雜訊。 在本發明具體實施例中，當在過氧化酶方法中亦用水性 潤洗試劑進行潤洗循環時，本發明新穎R 1試劑组合物亦可 成功地使用，限制條件爲潤洗溶液不亦含溶血性非離予性 界面活性劑，如Brij* 35。特別是，本發明R 1試劑組合物 可和一種新穎潤洗試劑組合物共同使用，該潤洗試劑組合 物被調配成只含Plurnoic類界面活性劑，完全沒有其他種類 界面活性劑（即無離子性界面活性劑，如S D S，亦無非離子 性界面活性劑，如Brij® 3 5)。 本發明試劑組合物解決了下列問題，在下列説明和實例 中將更爲清楚。本案發明人測定了目前以自動化分析系統 進行過氧化酶反應時’如上述所例示之Η ♦ τ M系統，在過氧 化酶方法一個樣本循環终了時留在反應室中之濶洗溶液體 積通常爲約8微升。似乎小量潤洗攜移會成爲下—樣本循環 的一部份；進行此方法之人士單純地假設此體積不具影響 此方法之功能ώ 然而，現發現當此潤洗攜移體積超過約1 0微升時，過氧 -17- 本紙張尺度逋用中S國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） ---------裝------訂------^ - Ψ * (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁，} 經濟部中央橾準局負工消費合作社印聚 4482 9 5 A7B7 五、發明説明（15) 化酶万法之功效劣化。本案發明人亦意外發現，潤洗溶液（並 攜移至R 1試劑中）中存在有非離子性界面活性劑如35 的確造成此方法之劣化，離子性界面活性劑如SDS則無此 作用：簡言下文中亦將描述，本發明發現習用於過氧 化酶方法中之含Bn广35澗洗液會，，輸送，，非離子性溶血性界 面活性劑至此方法R 1相中，因此造成Bri广35以功能性但 非所欲的方式參與此方法。基於這些了解，本案發明人發 現，用於過氧化酶方法中之潤洗液的確提供所需成份（即非 離子性界面活性劑如Brij*35)iPx方法之R1相中，且當潤 洗攜移體積隨系統而變時，過氧化酶方法之功效和結果受 到不良影響。根據本發明之發展，本案發明人首度了解到 潤洗攜移不只是對過氧化酶方法功效無害之現象。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 這些知識導致本案發明人設計出上述改良之111試劑组合 物，其兼含非離予性界面活性劑和離子性界面活性劑，供 用於過氧化酶方法之R1相中。此外，本案發明人進一步改 良此万法，自潤洗溶液中移除非離子性界面活性劑如 3 5，此潤洗溶液亦可經由潤洗循環而用於此方法中。再者 ’頃發現含非溶血性、非離子性界面活性劑如piur〇nic之新 穎潤洗溶液最適合和新穎R1試劑组合物—同用於ρχ方法中 。籍除去潤洗溶液中之溶解性非離子性界面活性劑（或藉使 用非溶血性PlUronic作爲潤洗液中唯一的界面活性劑），及 藉調配新穎Pxl試劑組合物爲兼含適當非離子性界面活性劑 和離予性界面活性劑，R丨試劑中之非離子性界面活性劑可 在1^方法中以經控制的速率最佳地輸送。潤洗撙移體積之 18- 本錄尺度適用中國國CNS (· 2!o-x29 448295 A7 ----------- B7 五、發明説明（16) 變動亦不會影響此新方法所得之結果。結果在改良R 1試劑 和過氧化酶方法中，活性非離子性界面活性劑成份只存在 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 用於此方法R 1相中之試劑组合物中，其功能性活性爲紅血 球洛解所必需。此外，當此方法中使用潤洗液時，不含

Brij* 35之潤洗組合物（或只含非溶血性p〗ur〇nic作爲界面活 性劑）最好不含任何會活性地參與過氧化酶方法之界面活性 劑’因而避免潤洗溶液中之有害成份造成無法:接受或無用 之結果。 在自動化血液學方法中之潤洗攜移的發生及其相關問題 進一步討論如下：用自動化血液學分析儀分析全血樣時，所 有待分析之血樣和試劑溶液混合，並流過共用之水道（即通 道）中。在每次樣本循環間，藉引入定量潤洗液來清潔或潤 洗通道。在此過程中，通道從無法完全除去潤洗溶液或使 其乾燥。此潤洗過程結果造成部份潤洗溶液留滯，並進入 下—樣本循環。此描述了潤洗攜移現象。 經濟部中央梂準局員工消費合作社印製 在一些用於進行過氧化酶方法之系統中，已知潤洗攜移 將造成不定量反應成份由一樣本循環進入下一樣本循環中 。當比較不同系統時，這更爲明顯。潤洗攜移體積之系統 變異會對自動化分析儀上所進行之方法結果造成負面影響 ，其程度可能很細微，也可能更爲明顯。例如，在後者的 情沉中，更大量潤洗攜移（如大於约1 〇微升）造成此方法有 不良結果。在前者的情況中，潤洗體積更細微的系統變異（ 例如在不同系統中有7.5微升，8.0微升，8 · 3微升體積）會 造成系统進行得些微不同。直到本發明才描述，此二種潤 -19- 本纸張尺度適用中國國家梯準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 4482 95 A7 ___ ____ 五、發明説明（Π) 洗攜移體積之變異均對既存之過氧化酶差式計數方法有負 面影響並造成問題。 如前文所述，在本發明以前，熟習此項技藝之人士接受 一項説法’即易變之潤洗攜移僅爲逗行此方法中所發生的 輕微體積攜移效應。然而，如本文進一步描述，本案發明 人經由定量搞移體積及分析反應成份和方法步驟，發現在 白血球鑑定和定量用之過氧化酶方法中，潤洗-搞移（無論其 發生是較細微而潛藏’隨系統而有有限但不同之體積，或 無ίΛ其發生是隨系統而有更劇烈之體積改變）對此方法不只 是體積稀釋作用，造成既存方法之偏差和瑕疵，並惡化此 方法之功效，乃扮演一活性之角色，而非不活性之爲色。 在一特例中，發現在此方法R 1相中，活性界面活性劑之 量超過特定程度時會造成所得細胞圖偏差，其特徵爲受損 嗜酸性球集結和升入•細胞圖之嗜令性球區域中（圖4 A _ 4 F) ，且嗜中性球染色不佳且族群不規則。實例5説明潤洗溶液 攜移使可變量之非離子性界面活性劑Brij® 35進入p X方法之 R 1相中（涉及紅血球溶解和白血球交聯）。 因此’本發明成功地藉除去潤洗液中之界面活性劑成份 而減少潤洗溶液中界面活性劑成份對Ρχ方法之活性參與， 亦使此方法免受易變潤洗攜移之影響。此藉由調製新穎ρχ R 1試劑組合物而進一步達成，最後結果是，，活性，，界面活性 劑成份只存在Ρ X R 1試劑組合物中（其輪送在ρ χ方法R i相 中是經控制且固定的），而不存在潤洗溶液中（其中經甴樣 本潤洗循環而造成的潤洗試劑成份輸送是可變動的，且不 -20- 本紙張尺度適用中國固家標準（CNS) A4規格（210x297公釐） 裝------訂------/ - '. (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) Μ濟部中央樣準局負工消費合作社印裝 ” 4482 9 5 Α7 ------- Β7 五、發明説明（IS) 易控制良好）。因此在整體方法中，本發明產生精確的結果 ’及逋當種類非離子性界面活性劑（如Brij* 35)之濃度保持 固定〇 本發明發展試劑組合物和過氧化酶改良方法之另—g標 是簡化自動化分析系統的設計，方式爲減少目前用於進行 過氧化酶方法和其他自動化血液學分析方法之不同種類潤 洗液的數目。若能發展和發現一種潤洗試劑可和許多不同 血液分析方法和自動化系統相容，則系統設計終將更爲簡 單和經濟。 雖然最簡單的澗洗組合物可調配成不含溶血性、非離子 性界面活性劑，如Brij⑧35，但是亦發現任何’，不含Brij® 3 5"之潤洗溶液在用於過氧化酶方法中時，仍爲無法接受的 。例如，只含SDS之水性潤洗溶液在用於此方法中時，被 測試爲無法接受的，因爲S D S在低溫下會結晶。此種S D S 之現象阻礙其於水性潤洗组合物中之用途和適當性，水性 潤洗組合物必須能貯存長期，而對其成份或於潤洗試劑组 合物或此方法潤洗循環中之操作性無不良影響。因此，必 需發現和發明可接受的潤洗試劑配方。所以本發明的一方 面是一種水性潤洗组合物配方，其只含非溶血性界面活性 劑Plurnoic，供ρχ方法中之新穎用途。 如下文和實例所詳述，使用改良、含雙重界面活性劑之 ρ X R 1試劑組合物，以及進行潤洗循環時所用的適當潤洗 溶液，造成改良的過氧化酶方法，其對所分析的新鮮和陳 化血樣都能提供可接受的結果。相對地，用習知R 1試劑組 -21 - 本紙浪尺度適用中國國家樣準（CNS )八4祕（2丨ϋρ ----------^------訂------威 - ;* 【請先閲讀背面之注^^項再填寫本頁) 岁 448295 A7 B7 五 經濟部中央標準局具工消費合作社印製 發明説明（I9 ) 5、物（即其配方不含非離子性界面活性劑，如Brij® 35)所進 行的現行P X方法，當分析陳化血樣時，造成無法接受的結 果，其有高度的原點雜訊^已注意到的是，用於新穎p>; R 1試劑组合物中之非離子性界面活性劑的濃度1和現行過 氧化酶方法中所發現因潤洗攜移而帶入R 1相中之非離子性 界面活性劑Brijφ 3 5的濃度，相當接近。 根據本發明之改良ρ X方法’頃發現陳化血樣-細胞圖原點 雜訊可接受裎度爲px R 1反應混合物中所含遑當非離子性 界面活性劑如Brij® 35之函數（圖1A-1D和3A-3D)=亦發現 當潤洗溶液不含溶解性界面活性劑（或含適當非溶血性界面 活性劍如P〗urouic)時，可在白血球差式計數之過氧化薛方 法中，由陳化血樣得到有用之結果，並有助於使原點雜訊 在可接受的程度。 新穎R1試劑組合物有多項優點，利於使過氧化酶方法產 生成功的功效和結果e例如先前所述，水性R 1試劑組合物 係調配成兼含非離子性界面活性劑和離予性界面活性劑， 其濃度足以溶解紅血球，但對樣本中白血球族群之分析無 不良影響。用於改良的白血球差式方法中之潤洗溶液最好 含有一種非溶血性界面活性劑，其不同於過氧化酶改良方 法中用來增進新穎R丨稀釋劑的操作性之界面活性劑。合併 使用R 1稀釋試劑和上述潤洗試劑於過氧化酶方法中，可使 其不受潤洗攜移所造成的活性界面活性劑轉移效應之影響 °因此，雖然無法完全除去或減輕潤洗攜移，但使用不含 非離子性溶丘性界面活性劑（如Brij* 35)之潤洗液可除去此 本紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 私衣------、玎------.成 - 4 r · (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1482 9 5五、發明説明（2〇) A7 B7 經濟部中央梂準局負工消費合作社印製 方法進行中潤洗攜移造成的負面或不良影響，並避免潤洗 攜移造成的系統内變異。再者，本發明新穎試劑溶液，如 前述係調配成含二種界面活性劑，可成功地保持盖式分析 之精確性’且當分析貯存在呈溫和低溫下至少約4 §小時之 陳化血樣時，亦可達到可接受程度之原點雜訊。 根據本發明，改良和新穎之R1試劑組合物最好是水性的 ，含有二種溶解性成份，其爲不同類的界面活祆劑：至少— 種非離子性界面活性劑，如長鏈烷基醚聚乙氧酸酯，如聚 乳乙歸'(2-20)十一基、十7T基、十四基 '十八基和十八缔 基醚，如Br丨j® 3 5，調製爲和至少一種離子性界面活性劑合 併，最妤的一類是具約10至約16碳原子之硫酸烷酯之鹼金 屬鹽，如硫酸十二酯鈉（S D S )。可用於P X R 1試劑组合物 中之遍當離子性界面活性劑亦包括兩性磺基甜菜鹼一類， 具有約1 0至約1 6碳原子之直鏈跋基，如十四燒基二甲基胺 基丙基磺酸酯或TDAPS及癸基二甲基胺基丙烷磺酸酯或 D D AP S。本發明P x R 1試劑混合物中所含界面活性劑之組 合作用和適當濃度’造成本文所述之適當紅血球溶解，及 被溶解紅血球之血紅素内容物流出和喪失。 改良之Ρχ試劑组合物亦包括固定劑或交聯成份（如甲醛或 三聚甲醛）、糖或糖醇、緩衝劑或緩衝劑混合物以保持試劑 在中性或近中性pH範圍 '—種或多種無機鹽及視需要加入 多價金屬離子之嵌合劑&改良試劑組合物和方法的所有成 份，包括反應R1溶解相之溫度和反應時間，均被平衡和最 適化以達到此方法之改良結果。本發明所造成之改良可提 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0 X 297公釐） f請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝· 訂' -丨戒 ' 4482 9 5 經濟部中央標準局貝工消費合作社印装 A7 ___________B7 五、發明説明（：n ) 高此方法結果之臨床實用性。 用於過氧化酶方法R 1 (相中之新穎、含雙重界面活性劑 之試劑組合物爲穩定的，且具有長久之搁置壽命，例如， 爲測試試劑組合物之長期耐久性，乃在6 〇。(：下製備新穎R 1 試劑组合物，並貯存30天（即在加連安定性試驗之條件下， 對熟習此項技藝者而言，此試劑終將在室溫（即約2 2 _ 3 〇。〇 )下安定歷一年或更久）。當使用此”長期”保存-之試劑於過 氧化酶方法中時，所得結果仍爲可接受而有用的。 在發展和調製本發明試劑組合物時，製備試驗試劑，及 用第一天和第二天血樣來測試，特別是該等在室溫下陳化 的血樣。 用來評估本發明R 1試劑組合物中非離子性界面活性劑（ 特別是聚乙氧酸酯）之適當性的化學參數已知爲親水性親脂 性平衡或HLB値（HLB値和化學式，參見EncvdnpftHin r.f Surfactants, compiled by Michael and Irene Ash. Chemical

Publishing Company，New York, New York，19S0;及 Mc-

Cutcheon's Emulsifiers and Detergents. McCutcheon Division, MC Publishing Company, Glen Rock, New Jersey，1987)。界 面活性劑之性質和H L B値相關。因此，根據本發明，特定 界面活性劑之H L B値可作爲該界面活性劑是否適合作爲本 發明試劑組合物成份之有用指標。特定言之，下列所迷之 適當HLB値表示該界面活性劑可用來改良在室溫下貯存至 少二天之全血樣的分析和差式計數结果。 根據本發明之另一方面，一試劑組合物所含非離子性界 -24- 民張尺度適用中國囤家標準（CNS ) Μ規格（2丨0Χ297公$ ) ' ---------^------、玎------^ (t先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 B7 4482 95 五、發明説明（22 ) 面活性劑具有H L B太於約1 7.3至1 7.5，表示其親水性太大 ’不適合改良此方法之功效。適用於本發明試剤組合扬中 之界面活性劑的H LB値在約9至約1 7 _ 5之範圍内，較佳 約9.3至約1 7.3，及更丨圭約9 _ 5或9 6至約1 6 _ 9。理想上， 本發明試劑組合物中之界面活性劑需能應用在油於水中之 乳化作用上，其中水不溶性油（即來自細胞膜之脂昉）係被 存在於水性溶劑中之界面活性劑微粒體（Micelles)*·溶解'，。 在水溶液中，微粒體是橢圓形或球形，爲界面活性劑分子 群（如含約1 0 0個分予），其中接性基團面向水溶劑，而藏水 性核心則位在内部（M. J. Rosen, 1978，"Surfactant and Interfacial Phenomena", Wiley and Sons Ititersci^nce Publications, New York，New York)。HLB値爲約 9.5 至約 1 7.5表示於此種油在水中之乳化作用中之實用性e如前述 ’ H LB値高於約1 7_ 3至17.5，更特定言之，爲1 7.3時， 不能改良此方法之功效。表9和1ϋ呈現本發明白血球差式 方法之，4果’其係用各種不同之知離子性界面活性劑於自 動化分析儀上進行（見實例7)。同樣地，HLB値小於約9 3之 界面活性劑通常亦不適用於此方法。 經濟部中央樣隼局員工消費合作社印製 就具約1 0至約1 6碳原子之硫酸技醋之險金屬鹽_類的離 子性界面活性劑而言，本發明R 1試劑组合物之較佳鹼金屬 離子爲鈉、鉀和鋰。更佳者爲硫酸十二酯鹼金屬鹽，最{圭 者爲硫酸十二酯鈉。陰離子性界面活性劑之適用濃度範園 之例子爲約0.030克/升至约0.150克/升，較佳爲約0.0 5 0克/ 升至約〇 . 1 2 5克/升，及更佳爲约0.085克/升至約0 ,丨〇 5克/ -25- 本紙伕尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公着） 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 五、發明説明（23) 升。具約1 0至约1 8碳原子之陰離子烷基苯磺酸鈉亦適用。 亦逋用於本發明中之典他陰離子界面活性劑實例爲N -醢基-正-烷基牛胺磺酸酯（例如，其中 R=C10H23，C14H29; R':CH3或Η ;及Μ+二Li+, Na+或K+) c.再者， 兩性離予性界面活性劑適合用於本發明，如磺基甜菜鹼族 之成員，其亦包栝同源C16和C12成員，如TDAPS(十四基二 f基胺基丙烷磺酸酯）。其他可用於本發明中之兩性離子性 界面活性劑的例子有膽酸衍生物，如CHAPSO(3-[(3 -氣 醯胺丙基）二肀基胺基】-2-羥基-1-丙虎磺酸酯，及具有約 12至16碳原子之烷基-N，N-二甲基N -氧化物，亦稱爲N-氧化物〇 N -氧化物之一個特例（但非限於此）爲十二基二甲 基胺N -氧化物（L Ο)等。和T D AP S相似但具有較少碳原子 之界面活性劑，例如C丨2者如D D A P S ( N -十二基-N，N -二 甲基-3-胺基·1-丙坑績酸黯）亦可用於本發明過氧化酶方法 和試劑中〇 逋合用於本發明試劑組合物之非離子性界面活性劑家族 爲（1 )聚氧乙蟑炫基或芳基酿（亦稱爲聚乙氧酸酿），包栝直 鏈脂族疏水性經醚化爲聚乙二醇或聚氧乙烯乙醇，如Brij® 35; (2)支鏈脂族/芳族（如辛基苯盼）競水物經醚化爲聚乙二 醇，如Triton X®-100; (3)直鏈脂族/芳族（如正·壬基苯酚） 疏水物經謎ί匕爲聚乙二醇’如Igepal®C0897;及（4)直键 脂族（如羧酸）疏水物經酯化爲聚乙二醇，如Myrj*53 〇在此 四家族中，酯類在水溶液中會水解，且預期比醚類界面活 性劑不穩定一些。 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------^------ir------^ - m 一 * (諳先閲讀背面之注^T項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印策 4482 9 5 A7 ----——-___ B7 五、發明説明（Μ) 技笫族非離予性界面活性劑之例子包括（但不改於此）：（聚 氧乙缔（4)十二基醚（Bri广3〇)=聚氧乙缔（23)十二基醚（Brij® h) 氧乙烯（2)十六基醚⑴nj*.52);聚氧乙烯(2〇丨十六基醚 (Brij ：>8);聚氧乙晞（2)十八基醚（ΒΓγ72)_,聚氧乙烯（1〇)十 八基醚（Brij*76);聚氧乙埽（20)十八基醚（Brij* 78);聚氧乙 烯十八缔基醚（Brij«92);聚氧乙烯（1〇)十八烯基醚 (Brij®96);及聚氧乙缔（2〇)十八埽基靆（Brije98);聚氧乙缔 (21)十八基醚（Brij® 72i);聚氧乙烯（1〇〇〇)十八基醚（b叫彩 700))。在Brij®界面活性劑中，最佳者爲Bdj·® 35 s需注意的 是’雖然聚氧乙缔十八烯基醚可用於本發明組合物中，其 在長期貯存中可能較不穩定’因其分子結構中存在有雙鍵 ，使其易氧化。熟習此項技術者亦知，最適合的非離子性 界面活性劑爲HLB値在本發明所述範圍中者D第二族非離 子性界面活性劑之其他.非限制性例子包括Trit〇n χ、ι〇〇(非 還原或還原的），Triton X气U4(非還原或違原的），Triton χ®_ 165及TritonXtSOSC非還原或還原的）。非離予性界面活性劑 存在本發明試劑組合物中之濃度必須爲由約〇 1〇克/升至約 〇·20克/升；更佳之濃度範園爲由約升至約〇 ^克/升 •，及最佳之濃度範圍爲由約〇_12克/升至約0.14克/升。 组合物中之糖或糖醇包括蔗糖、果糖、葡萄糖、葡萄糖 醇和甘露糖醇。本發明試劑组合物中所用之較佳糖類爲葡 萄糖。然而，更佳者爲糖醇，如葡萄糖醇。糖醇提供長 時間中更穩定的試劑溶液，因爲糖醇不會在空氣中被氧化 。理想上’糖和糖醇存在於試劑組合物中之濃度爲約u〇 〇 -27- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS > A4規格（210)<297公董 ----- ^.------ΐτ------说· {請先W讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 4 8 2 9 5 A7 ________ B7 ------ 五、發明説明（25) 克/升至約U0.0克/升，更佳爲U3力克/升。若使用葡萄糖以 外之糖或葡萄糖醇以外的糖醇，用量必須調整到使替代 性糖或糖酵之存在滚发（克/升）約與葡萄糖或葡萄糖醇相 同：試劑溶液中存在有糖或糖醇可增加淋巴球在雜訊（即红 血球虚體和血小板）以上之可偵測性。可使用糖或糖酵，視 分析之本質和需要而定。 本發明試劑溶液中所用之甲醛或三聚甲醛是做爲白血球 固定劑（化學交聯化合物）^若使用f醛，其在溶液中之存 在量爲約5 0克/升至約6 0克,/升《更佳地，甲醛的存在濃度 爲約5 2克/升至約5 8克/升。 當使用糖醇時，與使用還原糖如葡萄糖相較，試劑溶液 具有增高的穩定性，此乃關於葡萄糖（但糖醇則無）會隨時 間而在空氧令氧化或葡萄庚酸。參見例如Nishikido et al Jap. Kokai Tokyo Koho 80 40, 606, Chem. Abs.· 9V，；21：20d (1950)和美國專利第4,801.549號。葡糖酸之存在會降低溶液 之pH値a當卩!^降至本發明範圍以外時’如本發明中所論及 ，本發明將受到樣本中未溶解之紅血球所干擾。此外，無 法在空氣中氧化之糖醇，可和甲醛化學結合以形成聚縮醛 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ，因而阻止曱醛氧化成甲酸，其若產生，亦會降低試劑溶 液之pH(美國專利第4,8〇1，549號）。 試劑溶液中亦可加入無機鹽β適用於本發明之鹽可爲鹼 金屬氣化鹽類，如NaCl，KC丨和UC1。氣化鈉NaC丨是較佳的 鹽。此等鹽類可選擇性地存在，因其有助於區辨嗜中性球 和嗜酸性球，係利用光掃描/吸收光學來造成過氧化酶染色 -28- 本紙張尺錢财目( 2丨0X297公釐） 4 482 9 5 Α7 Β7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印装 五、發明説明（％ 強度之差異而達成。其他齒鹽（即氣化物、澳化物和礎化物 )過度抑制嗜中性球之過•氧化酶活性，因而阻礙了嗜中性球 和其他未染色白血球（WBCs)之區辨。當使用鹽類（如Naci丨 時’其存在量較佳爲約6 _ 8 m \1至約1 〇 _ 3 m Μ (或约〇 4克， 升至約0 · 6克/升）。 可用於本發明之缓衝劑或緩衝劑混合物必須能維持試劑 溶液ρ Η在約6.8至約8 0，較佳爲約6 9至約7 · 6，更佳爲 約7.0至約7.3。當ρ Η太低，即低於約6.8時，細胞圖中可 觀察到紅血球之干擾。適當的緩衝劑包括磷酸鈉或绅鹽， 丙二酸二乙酯，3-(Ν-嗎啉基）丙烷磺酸，（MOPS)，Ν-2-乙醯胺-2-胺基乙烷磺酸（ACES)和4-(2-羥乙基）·ι_六氫峨 畊-乙烷磺酸（Η E P E S )。較佳者爲N a 2 Η Ρ 0 4 (嶙酸鈉，單驗 基）和NaH^POJ磷酸鈉，二鹼基）之混合物。如所示，緩 衝劑存在本發明試劑溶液中之量需適合維持溶液p Η在大約 中性。例如，當使用Na2HP04*NaH2P04之混合物時，該混 合物須含有N a 2 Η P 0 4對N a Η 2 P 0 4莫耳比例在約2 . 〇 4 : 1至 約0 8 1 : 1，以產生ρ Η範圍在約6,9至約7.6之一系列溶液 ’較佳由約7.0至7 3 6本發明試劑溶液中之此種混合物的 緩衝劑濃度係甴約7 5 m Μ至約1 2 5 m Μ。高於約1 2 5 m Ν/ί 可能會造成所得細胞圖中之紅血球干擾。 可用於實施本發明之試劑溶液是一種水溶液，較佳是用 去離子水。溶液製法是將成份輿水合併《j需密切注意溶液 ρ Η以確保其維持在所欲範圍內。若需要，熟習此項技銜者 亦可於試劑溶液中加人其他添加物6特別是金屬螯合劑， -29- 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) Α4規格（2Ι0χ297公釐） " —---- Μ------IT-------^ f .· * ί請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} ^ A48295 A7 _ B7 五、發明説明（) {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 例如伸乙二胺四乙酸（EDTA)和伸乙基雙_(氧伸乙基次氣基 )-四乙酸（EGTA)二納或三鈉鹽（EDTA)可包括於試劑组合 物中’濃度爲約1 mM至約5 mM，以保護組合物中其他成 -fo免於多價金屬離子淮ί匕.丨生I自動氧化作用s除E 〇 τ a以 外’ E D T A或E G T A之二納、三鈉和四钟可用於板合物中 ’奉义佳爲E D T A二鈉之二水合物。例如，甲酸、葡萄糖-醇、SDS和Brij® 35均對自動氧化作用敏感β多價金屬離子 催化劑，如Cu — 2和Fe”，常以ppb濃度存在於水中，水是用 作爲調配用溶劑（”？〇丨丫11^31&13山2&1^〇11”，1972,£(1.，\^丄-Hawkins, Wiley-Interscience, New York. New York) ° 不適用於過氧化酶方法R 1相之試劑組合物的共同模式特 歡實例如下：原點雜訊百分比高於3 3 ;人爲提高白血球計數 ;及扭曲之嗜中性球百分比和淋巴球百分比。基於對許多 含各種不同界面活性劑之試劑配方的測試，以及評估其對 新鮮和陳化血樣之功效，乃決定出了本發明改良試劑組合 物和方法之適當成份= 經濟部中央標準局貝工消費合作社印聚 表1提供了本發明含雙重界面活性劑之水性試劑組合物中 之較佳成份和最適濃度和濃度範圍的一個例子。熟習此項 技術者需知，所列氟試劑成份之濃度和範圍可有約土 5%直 1 0 %之偏差，而不會對组合物或其於方法中之用途有不利 影響。此外，對表1所列之新穎P X R 1試劑組合物之各成份 而言’每升之較佳含量示於括I中，但不限制其範圍。 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐） 448295 A7 B7 五、發明説明（28 ) 表1 經濟部中央標準局員工消費合作社印掣 成份 含量/升 非離子性界面活性劑（如0.10克-0.20克 Brij<D3 5) (0.12-0.14 克） 離子性界面活性劑（如硫酸十二0.085克-0.115克 酯鈉，SDS或TDAPS) (0.105 克） 糖或糖酵(如葡萄糖醇） 110 克-120 克 (113.0 克） 嶙酸納，單驗基 1.98克-2.18 克 (2.08 克） 磷酸鈉，雙鹼基 11.30 克-12.5 克 (11.89 克） 無機鹽（如，NaCl，KC1，LiCl) 0.4 克-0.6 克 (0.488 克） 金屬離子螯合劑(如EDTA; EFTA;或〇.675克_〇.825克 EDTA或EGTA之二、三或四鈉鹽） (0.750 克） 固定劑（如甲褡37 g/dL) 50克-60克 (150毫升） 去離子水，調至pH 100升 6.9-7.6 (7.0-7.5) (诗先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明另一方面關於過氧化酶方法分析結果之進一步改 良，其乃併入一個潤洗循環及使用適當水性潤洗試劑组合 物於該方法中之結果β用於改良方法澗洗循環中之潤洗試-31 - 本紙依尺度適用中g国家標準（CNS ) Α4規格（2Ι0Χ 297公釐） 4482 9 5 Γ"' ' 第^104571號專利申請案 + ΐλ説明書修正頁(87年3月） 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 Α7 Β7 五、發明说明（29) 劑對半-和全-自動化系統特別有利和有用，特別是 TECHNICON Η·1ΤΜ，Η_2ΤΜ*η·3ΤΜ 系統等，其 可快速進行白血球差式計數之過氧化酶方法。本發明潤 洗試劑描述於同在申請中之美囷專利申請序號〇8/442,363 中’於1995年5月16日提出申請，名稱爲”可用於全血樣 血液學分析之通用潤洗試劑组合物"，讓與給本發明之受 讓人。 可用於改良白血球差式計數方法中之潤洗試劑組合物 包括一或多種緩衝劑或化合物或其混合物，例如，單驗 基磷酸鈉和雙鹼基磷酸鈉，以使Ρ Η和滲透性接近生理値 ，例如，ρ Η爲約6.9至约7.6 ’較佳ρ Η爲約7 . 〇至约7 3 ’及滲透性値約3 0 0 mOsmol/kg;抗菌化合物以阻滞微生 物生長；非溶血性界面活性劑，如ρ丨uronics，如P84，pm P104, P104, P105和P123 (P105爲較佳，因在潤洗溶液中之 用量時爲非溶解性，其分子量約6 5 0 0，及包括以重量計 約5〇%聚氧乙烯）；鹼金屬氯化鹽類，如Naci，Kcl， L i C 1等。適當抗菌劑之非限制性例子有ρ roc 1 in 1 5〇 (2_甲 基-4 -異4唑啉_3-酮）和proclin 300 (5-氣-2 -甲基-4-異 11 塞处"林-3-嗣）（R〇hni & Haas); Germall 115 (N，N1-亞 甲基雙-羥甲基）-2，5 -二氧-4 -四氫咪唑基]脉 )(Sutton Laboratories); Dowacil 200 (1-(3-氯丙締基）_3，5 ’ 7-二氮-1-氮鑌金鋼燒氣化物）（d〇w Chemical);及 Bronopol (Angus Chemical Company)。Proclin 150是用於 潤洗組合物中之較佳者。 亦可使用水溶性抗氧化劑化合物以穩定潤洗試劑组合 物中之非溶血性界面活性劑，抗氧化劑化合物的例子有3， 本紙依尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------^------ΐτ------線 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 j ! 4 4 8 2 9為觸?1號專利申請案 中文説明書修正頁(87年3月） 五、發明説明（30) 3 ’ -硫二丙酸；3，3，-二硫乙酸；Trolox® (即水溶性維生素 E ’赫夫孟拉羅）；BHT，丁基化#曱苯或（2，6-二第三丁基 -4 -甲基苯酚）；BHA’ 丁基化羥基苯甲醚或（2 -第三丁基 -4 -甲氧基苯酚）；及MEHQ(p -曱氧基苯酚）；或其混合物 。3 ’ 3 '-硫二丙酸爲用於組合物中之較佳者。潤洗溶液 之取終渗透性爲約2 8 5 mOsm/kg至約3 0 5 mOsm/kg。 在最簡單的配方中，潤洗試劑可包括磷酸緩衝劑（如磷 奴緩衝食鹽水，p Η爲約6.8至7.8 )及P luronic族或類之非 離子性和非落血性界面活性劑。piur〇nics爲聚氧乙締和 聚氧丙烯之嵌段共聚物’其結構爲（E〇)x-(p〇)y_(E〇)x(見 P luronic—&—Tetroni c Surfactants. BASF Corporation, Parsippany，New Jersey，1987)，其係用環氧丙烷之控制聚 合作用合成聚丙二醇單元而形成。由於Pluronics之分子 量可由約950至約14600克/莫耳，及（PO)可包括以重量 計約20至90%，所以，’y，i可在約3至62單元之範圍内。接 著’ EO聚合鏈在聚（p〇)單元之二邊形成，產生p丨ur〇nic 共聚物。此技術領域中之人士知道，Ε Ο聚合作用可對稱 控制’所以"X11在Pluronic分子之各邊或各端大致相等。 可用於通用潤洗組合物中之適當piurn〇ics的Μχ”和,,y"非限 制性例子如下：'’ X ”爲約1至3 6單元，更佳爲約7至2 7，及 ” y "較佳約1 4至4 8單元。 適用於潤洗試劑中之Pluronics具有％ E 0値以重量計爲 約2 0至8 0 %，分子量爲約2〇〇〇至約8000克/莫耳。更佳地 ，％ Ε Ο以重量計在約3 〇至7 0 %範圍内，分子量在約3〇〇〇 至約7000範圍内。例如，p]uronic ρι〇5和P85具有％E◦値以 重量計爲約50%，及Plurnoic PI04和？84具有％丑0値以重 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!0X297公釐） ----------1------,玎------.^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 ^ 448295 Α7 ____ Β7 _ _ 五、發明説明（) 量计爲約50%，及Plurn〇ic pi〇4和P84具有％E〇値以重量計 爲約4 0 %。 表2列出潤洗試劑之實例配方，可用於進一步改良過氧化 酶方法，其包括較佳量之各成份，以使最終試劑溶液有遴 當且°丁操作的p Η和淨透性。熟習此項技術者可知，所列各 潤洗洛液成份之濃度和範圍可有約5 %至1 〇 %之偏差，而對 組合物或其於改良方法中之用途無不良影響。此外，如前 述’對表2所列潤洗試劑组合物之各成份而言，每升之較佳 含量列於括弧中，但弈欲限制其範圍。 表2 成份 含量/升 抗菌化合物 0,2 5毫升- 0,60毫井 (如 Proclin 1 50) (0.40毫升） 非溶血性非離子性界面活性劑 0.50克-1.5克 (如Pluronic P105) (1‘00 克） 磷酸鈉，單鹼基 0.285 克-0.31 5 克 (0‘3 00 克） 磷酸鈉，雙鹼基 2.28 克-2.52 克 (2.40 克） 無機鹽 7.4 0 克-8,0 克 (如NaCl，Kcl，或LiCl) (7·70 克） 如抗氧化劑化合物 0.050 克-0.150 克 (如3，3·-硫二丙酸） (0.100 克） 去離予水調至 1.00 升 PH 6.9-7.5 (7,0-7.3) 滲透性(mOsmol/kg) «285-305 mOsm (300 mOsm) -34- 本紙张尺度適用中國囷家標準（CNS ) A4規格（2丨0 X 297公釐} ---------^.------.玎------d (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 4482 9 5 A7 __B7___ 五、發明説明（32 ) 在亦使用潤洗循環之Px方法中，改良試劑之一個顯著優 點是本發明試劑組合物經設計和最逋化，以除去易變满洗 攜移所造成之不良影響，其中潤洗的界面活性劑成份在此 方法中扮演所不欲及無法接受之功能性角色=此試劑配方 和方法亦允許用陳化A樣而測定白血球差式計數，其已在 室溫下貯存高達2天，並不會因原點雜訊而犧牲結果之精密 性、準確性和可信度。此外，使用本發明試劑組合物連同 本發明潤洗溶液配方時，該潤洗溶液不參與差式計數方法 之過氧化酶化學中： 在實行本發明所涵蓋的方法時，試劑溶液很快地和待分 析之樣本混合形成此方法R 1相之反應混合物。試劑溶液和 血樣互相接觸後之約5秒内，必須產生均勻之混合物。若此 二者並未快速和均勻地混合，則會發生紅血球不均勻程度 之固定’其會阻礙紅血球溶解，因而大幅影響此方法實行 時所得差式WBC計數之精確性。 混合時’試劑溶液和血樣约略高室溫（如約5 °C )。然後將 反應混合物（包括血樣）快速加熱至約6 2 aC至約7 6 X：，理想 約70 °C至約75 aC，較佳係藉注入溫度維持在適當高溫下之 自動化血液學分析儀逍當槽室中而加熱。反應混合物之加 熱必須在約1 5秒内發生，較佳約在2 〇秒内，否則會發生紅 血球固定；固定的紅血球不會溶解，且會被誤測爲淋巴球 ，因而干擾差式WBC計數之精確性。 隨後立即將染色混合物與該反應混合物相混合，該染色 ___ -35- 本紙張尺度财巾義家標) A4· ( 21Qxi97&^y ---------抽衣------IT------^ (資^·閲讀r面之注意事項再填寫本頁) 4482 9 5 at __ B7 經濟部中央樣準局貞工消费合作社印製 五、發明説明（33 ) 混合勒包括過氧化氫和適當色原質，如4 ·氣_丨-審紛β染色 混合物之起始；星度可爲室溫，且理想上（但非必要），染色 混合物和反應混合物相混合後，其溫度在約3 〇秒内（較佳由 約8至約1 5秒内）由約6 2 °C增加至約7 2 °C (較诖由約6 5 °C至 約7 0 C )’以染色具過氧化酶活性之嗜中性球、單核球和嗜 酸性球。 實務上’反應可以如下方式進行：自動化血液學分析儀反 應室保持在溫度約7 2 aC。在室溫下，將丨2.0微升全血和 2，5 0微升本發明R 1試劑組合物同時注入系統中，快速混合 二者以形成反應混合物，然後培育最多不超過約3 〇秒，較 佳約16秒’在此期間，混合物溫度由約62«c升高至約”^ °在培育期間末了，紅血球以最佳狀況溶解，及白血球被 固定（即交聯）。 隨後立即同時注入1 2 5微升色原質混合物（洌如，70克/ 升於氧二乙醇中之4 -氣-1-蓁酚）和250微升含3.0克/升過 氧化氫之過氧化氫溶液。二試劑最初爲室溫，钽因反應室 中之溫度，染色遇合物之溫度在約3 〇秒内由約6 3 Ό升至約 6 9 °C，此時，嗜中性球和嗜酸性球之過氧化酶染色完成。 以所揭示之潤洗溶液潤洗反應室及系統硬體，以減輕試劑 和溶液由一樣本分析循環攜移至下—循環，並避免反應室 中污染試劑之存在所造成之偏斜結果。關於自動化反應步 驟之進一步詳情描述於實例6。 雖然本發明試劑組合物和步驟係用自動化儀器來説明， 熟習此項技術者很明白的是，本發明亦適用於手控方式， -36- ----------f------1T -* - * (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張1適用t國國家標準（CNS )以胁（2 i 〇 χ Μ?公复） A7 4482 9 5 -----------* - 五、發明説明（34) 以及=料法和半_自勤化或全自動化方法之結合。再 者’ y明試心合物和步㈣用全血來作差式wbc計數 。熟習此項技街者應知，本發明亦可用於血球㈣存校正 剤、對照劑及其他溶液，其乃特別製備的或市售來校正及 維持裝置精密度的。，，进太，，—句戈 樣本 幻右未特別修挪，在本文中 係包括全JIIL或其他含血球之溶液。 實例 ' 下列實例說明本發明。其係供進一步輔助了解本發明之 觀念，而非被解释爲限制本發明^ 實例1 乙、舍離？ I生—不含非離子性界面活性劑（如只令 ___化酶r 1稀釋劑試劑組合物之詷 製和測試 設計和進行—些實驗，以測定用於過氧化酶IU相中之過 乳化酶稀釋落液的最佳配方。 最初研芄可接受和可操作的R丨組合物或稀釋劑之調製時 ，乃涉及製備和測試在試劑組合物十只含離子性界面活性 劑（即陰離子性界面活性劑SDS)而無非離子性界面活性劑（ 即Brije35)之試劑溶液。Ri試劑溶液乃基於將SDS濃度由 約0_105克/升增加至約〇 17至〇 2〇克/升而製備β完成數項 研究以分析該等含高量S D S之"測試”斌劑在自動化系統上 之功效’每小時通過1〇2和120個樣本。 特疋s之’使用自動化血液學分析譌，製满含〇 .〖6至 〇-20 克/ 升 SDS(如 0.16, 0.17, 0.18, 0_ 19和 0.20克 / 升）之測 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNs > Α4規格（210Χ297公釐） 私衣-- -» -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .1Τ .丨線 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 *--- _ 娌濟部中央樣準局員工消费合作社印製 448 2 9 5 A7 _________B7 五、發明説明（35 ) 試R1試劑洛液，以所示方式對第]天和第2天血樣作測試。 該S D S測試R 1稀釋劑不含B r丨j * 3 5 (如〇 〇克/升p用於此等 實驗分析中之血樣乃在Κί£ΕΠ'Α存在下f收集於 Vacutainer"™管中。此外，在進行該等測試時，用於潤洗循 環中之潤洗溶液不含Bri•广35。亦使用含非溶血性界面活性 劑Pluronic P105之潤洗溶液。該等分析之結果示於表3中， 顯示對第2天血樣而言，所有測試試劑均得無法-接受之結果 β將°/。嗜中性球和％淋巴球麥數之數據和標準方法比較，標 準方法十，观洗溶液含Brij® 3 5農度爲3 . 〇克/升，及s D S濃 度爲2·0先/升》對第2天血樣而言，該2參數之回收接近在 0.2 0克/升S D S之標準。然而，當使用s r> S之濃度在〇 . 1 6 -0· 19克/升間時，精確度不佳，因爲ρ?：方法有無法接受之 原點雜訊。有注意到特定樣本重覆測試間有巨大差異。 如圖1 A-1D所示，當使用含SDS(〇二㈦克/升）不含Brij* 35 之標準過氧化扭試劑溶液於過氧化酶方法中分析第1天血樣 ’且包括一個潤洗循環’使用含Brij® 35 3_0克/升及SDS 2.0克/升之潤洗溶液，則細胞圖無擴散現象，有清楚分離 之細胞族群和最小之原點雜訊（見圖1A)。圖1B顯示使用與 囷1 A結果所述之相同^^尺丨試劑溶液和潤洗溶液來分析第 2天血樣之結果。然而’相對於圖1 a之結果，第2天血樣之 細胞圖顯示有細皰族群間之擴散及較高之原點雜訊。圖1C 顯示以第2天血樣分析之結果，使用只含離子性界面活性劑 (以O.lOy克/升SDS之形式）之^測試試劑溶液，且包括一 個潤洗循環，所使用之潤洗試劑溶液含有非溶血性界面活 -38- i紙張尺度適用中國國家榇準（CNS ) I------π------^ -1 二 (諳先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 448295 A7 B7 五、發明説明（π 劑Plurnoic P 1〇5於磷酸緩衝食鹽水令（無Bdp 35，亦無 SDS)。圖^ c細胞圖結果顯示有無法接受之原點雜訊。使用 坌較向量離子性界面活性劑（即〇丨7克/升s D s )和無②之 測試試劑溶液及使用與圈丨c所述相同之潤洗溶液來分軒第 2天血樣（見圖1D)時，亦得到無法接受之原點雜訊的相同 問題。因此，乃作出結論，只含離子性界面活性劑（如蹌離 子性界面活性劑SDS)之過氧化酶以組合物和"無以丨广，潤 洗合併使用於白血球差式方法中時，並非最佳狀況。 詩 注

I i 装 订 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 9 3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（210X297公楚） 4 厶 8 2 9 5 at B7 五、發明説明（37 )

6L0 31.6 57.1 31.1 69019.4 69.3SU1 59.Awo ts.ootogL·, 6PS 60.2 20 5S.8 27.9 59.5 2S,0 64.1 26.0 62b 25.8 61.4

β. %N %L 〇\ H-* ON On 产 <J\ 〇\ h-* 〇 g g 〇\ Q\ K) h ON V〇 〇\ 00 Ul 0〇 00 σ> 1/1 b bo ^ Ui ΙΛ 0l to σ\ M ιο p\ N> K) Lf\ on K) V〇 to CO K) to G\ U\ VO VO o b〇 Lr» bo b\ W K> Lo μ-* bo w 00 s f

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%2;"5.20 %N 5¾ 1^^^2;^„ώ.萍(r;Ht,^.nt^ii;,HridM^i:.%^ff±^9eut) 、tr i旅 dA82 9 5 A / B7五、發明説明（3S )

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54.5 51.1 62·35-s 5-5 6PS 35.4 40.3 26b 35-s 3-Q 30.5 6-8 I4_4

袖 21^. loly %L 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 59’3 30.7 60.3 29.2 52.1 53.5 58,4 55.6 63‘7 61.3

39Λ 3-2 31_1 3P3 27-2 28.S 57b 3L1 CU9 . %n 58.4 5-0 55.3 5S_9 60.6 6L6 3S 3Q.6 35.9 31.° 30.7 27_6 56.6 31-4 T1 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 4482 9 5 A7 B7 五、發明説明（39) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 級樣本中之嗜中性料分比；仏樣本令之林巴球百分 口標準表示—個標準或對照R1稀㈣，奴⑼w =離予性界面活性劑，及，洗猶環及含3〇克,,升 Brij 35和2.0克/升SDS之溶液。 *第2天表示血樣在室訂約36.4§小時後進行分析。 m 〇‘17; 〇.18, Q.19和請爲SDS在測試過氧化酶以試 劑洛设中之存在濃度(克/升）。潤洗液含i 0克/升Ph_ic P105於释酸緩衝食鹽水（PBS)中" 樣本組爲]0個非醫院血液，二重覆分析。纟自相同提供者 組之管切存在室溫下24小時，與後作爲第2天樣本加以 分析。實例2悻劑不含離子性界面活性剖f如r气 氧化酶R 1稀釋試劑組合物之調配色 測試 除了測試R 1試劑組合物以如實例1所述調配成只含S D s 而不含非離子性界面活性劑，亦設計試劑組合物以測試只 存在有非離子性界面活性劑（即Brij® 35)而無離子性界面活 性劑（如陰離子性界面活性劑S 〇 S )的情形。因此，製備和 分析數種測試R 1稀釋試劑组合物，其含Brij® 35濃度爲〇 . 〇 克./升’ 0 . 1 4克/升，〇 . 2 8克/升和〇 . 4 2克/升。爲測試分析 只含Brij® 3 5之R 1稀釋溶液，用於潤洗循環之潤洗溶液含非 洛血性界面活性剖Ph丨r0nic p 1 〇5，如用於實例I分析中者。 比 m- ^-- -t -I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1T. 丨線 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0X297公酱） )' 4482 9 5 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（4〇) 含Brij® 35之各種不同R 1測試溶液網製如下：3〇 〇克/升之 Brij®35貯存溶液製備於蒸餾水中。於50毫升小份之過氧化 酶R 1组合物（無非離子性界面活性劑）中，加入下列體積之 Bdj® 35貯存溶液：〇.〇毫升Bdj® 35貯存溶液以製備含Brij® 35最終濃度爲〇.〇克/升之ri稀釋劑；〇·233毫升貯存溶液以 製備含Brij® 35最終濃度爲0.14克/升之R1稀釋劑；0.466毫 升貯存溶液以製備含Brij® 3S最終濃度爲0.2 8克/升之R 1稀 釋劑；及0.699毫升貯存溶液以製備含Bri.j®35最終濃度爲 〇 . 4 2克/升之R 1稀釋劑。將溶液混合及貯存在聚丙烯旋蓋 試管中。 進行測試運轉時，正常血樣收集於VaculainerTM管中，並 以K3EDTA抗凝集。以開口管模式進行樣本分析。來自相同 提供者組之未開口樣本貯存在室溫下過夜，並在第2天（即 第2天樣本）作分析。在自動化血液學分析儀上以手控方式 收集數據。標準運轉爲102樣本/小時；測試運轉爲（20樣本/ 小時。對含5對二重覆的運轉而言，標準偏差SD(多個提供 者之合併S D)以下列方程式計算過氧化酶通道參數 ;SD = [Sum (d2)/2N]l/2,其中α爲以特定一個試劑所得二重 覆數値間的差異，及Ν爲試驗中之樣本數。 表4列示由該等實驗所得之數字數據摘要。以測試試劑ΙΑ 進行 過氧化 酶方法 R 1 之功效 ，和 用標準 R 1 試劑於 過氧化 酶方法中之功效（即含SDS濃度島0.105克/升之襟準R1試 劑）作比較。對第1天血樣分析而言測試試劑—般會產生無 法接受之結果。對試劑I (即不含Brij*或SDS之過氧化酶r 1 -43- 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ---------^------1T------Φ -· t* (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ϊ1 4482 9 5 A7 —---—__________ ______B7 五、發明説明（4!) 試劑）而言，無法得到差式數據，此乃因未溶解紅血球之嚴 重干捷。對測試p x r 1試劑2至4 (即試劑2 · 35濃度 = 0.14而無SDS;試劑3:Brij® 35濃度=0.28而無SDS:試劍 4· Brij 3 5濃度=〇 4 2克/升而無S D S )而言，與方法説明相 較’有顯著數目之精密度和不準確性失誤（以星號表示）。 對試劑1，2和3而言，雜訊百分比很高（即> 3 4 % 。對第2 天血樣用只含Brij® 3 5而無SDS之測試試劑，所-得數字數據 亦無法被接受。因此，數字數據顯示測試試劑组，包括含 Bnj® 3 5 ( 0 . 1 4 _ 〇 , 4 2克/升及無S D S )之過氧化酶方法R 1試 劑，得到無法接受之表現。 ^-- · r 0 <請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 订 線 經濟部令央橾準局員工消资合作社印製 -44-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 〇 X 297公釐） 448295 Α7 Β7 五、發明説明（42 ) 表4 含較高toBdj* 35且4 SDS之過氣化弟Rl試劑虹合物分析 第1天樣本 WBCP SSeui %Lv %M %Eos %LUC %Nois 試劑 標準 5.27 56.9 28.5 8 3J 2.1 23.71 0,017 0.75 0.34 0.74 0.38 0.29 0.6 l·.無 SDS 15.25 ND ND ND ND ND 89.5 無 Brij® 0.545* 0.43 2:無 SDS 5.36 61.9* 21,7* 9.7* 3.7 2.1 47,7 Biij*:0.14 克/升 0.16 1.65*, 1,45* 0.82 0.4 0,28 1.44 3::無 SDS 5.36 57.3 28.6 7.9 3.6 1.9 34 Brij®:0.26 克研 0.1M 1.73* 1.66* 0.59 0.22 0.55* 2.66 4:無 SDS 4.77 53.2* 27.3* 10.1* 3.5 5Λ* 19.2 Brij®:0.42 克/升 1.569* 7.47* 6.11* 1.83* 0.57* 2.52* 4.75 精密度説明 〇.i5 標準偏差説明 1)16 4· 0·1· 5 9 °·°· 2 5 °·°· /A N/ 5 5 °·°· ^ 裝 ^ 訂 ------ ϋ I -*-· (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 標準 5Λ9 60.6 0.081 1,43 1: ^ SDS ND ND ^ Brij® 2:無 SDS 6.75 66.7 BrijlO.M 克/外 0.509 3.41 第2天樣本 27 7.2 2.6 L8 29.8 0,82 0.49 0.61 0.29 3.66 ND ND ND ND C0.1 5.77 16,4 12,8 1.8 1.2 44.9 3.97 0.86 0.19 0.18 3.82 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐.) 448295 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（43)

3:無 SDS 13ri产0.26充崎 5.4 0.177 57.6 2.76 29 1.6 9.1 1.18 1.9 0.76 1.7 0.23 33.4 2 4:無 SDS Brij®:0.42 克/升 5.27 0.25 » 55.4 2.57 26.7 1.96 10.7 1.15 1.6 0.28 4.6 2.61 15.2 2.93 陳化之 精密度説明 0.32 2.8 2.2 1.6 1 1 N/A 在表4中，星號表示數値超過用來進行此方法之自動化分 析儀的情密度説明n "ND"表示未得到可接受之有用的數據 。” WBCP"表示由過氧化酶方法測得之白血球數目； "% N e u t ”表示嗜中性球百分比；"％ L y "表示淋巴球百分比 ;”％M"表示單核球百分比："《/oEOS，·表示嗜酸性球百分比 ;” ％ L U C "表示大型未染色細胞百分比；及"％ n o i s ”表示 原點雜訊百分比。得自實例2所描述之第1天和第2天血樣 分析之一組代表性細胞圖示於圖2 A - 2 J。圖2 A - 2 E代表第1 天血樣分析=圖2 F - J代表第2天血樣分析 如所述，血樣 係取自含K3EDTA之VacutainerTM管中。用於該等分析之試 劑以如下方式對應於所得細胞圖：圖2 A (第1天血樣）及圖 2F(第2天血樣）：標準R1試劑包括〇. 12克/升Brij® 35和 0.105克/升SDS;^2B(第I天血樣）和圖2G<第2天jk樣）： 無S D S測試試剗1包括0.0克/升Brijφ 3 5和0.0克/升S D S ;圖 2 C (第1天血樣）和圖2 Η (第2天血樣）：無s D S之測試試劑2 包括0. 1 4克/升Bii广35和0.0克/升SDS;圈2D(第1天血樣）和圖 2 I (第2天血樣）：無S D S之測試試劑3包括〇 . 2 8克/升Brij* 35 -46- · 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4現格（2丨〇X 297公釐）—' '~~ ^'1T -- * (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 ^ 4 482 9 5 A7 __B7 五、發明説明（44) 和0·0克/升SDS;及圖2E(第i天血樣）和圖2J(第2天血樣）:

無S D S之測試試劑4包括〇 . 4 2克/升Brij® 35和0.0克/升SDS 〇 在第1天血樣之分析中，用含Brij® 35 012克/升和SDS 〇 . 1 0 5克/升P x R 1試劑組合物所得之細胞圖係可接受的。 然而，當不存在Brij® 3 5和S D S時（如試劑1 )，此方法之結 果很失敗，且無法得到差式計數資料：細胞圈顯示非常濃 的雜訊區域，且偵測到極少白血球（圖2 B >。用試劑進行此 方法之失敗可歸因於無界面活性劑，導致大量紅血球未溶 解，其產生交聯而造成高量原點雜訊。高量原點雜訊的可 能成因是明顯需要界面活性剤未增加血球對過氧化酶基質 之滲透性：若無界面活性劑，可能會有效抑制白血球内發 生的染色反應。 試劑2(圈2C)，3(圖2D)和4(圖2E)產生和試劑！大约相 同無法接受之細胞圖結果。在該等例子中，細跑圖顯示無” 界限（valley)(即濃密區域間之清淅區域）存在於淋巴球和雜 訊之間，並顯示有擴散的細胞集團和寬廣的，，樹幹，_(即粗糙 垂直的柱形’其包括雜訊和淋巴球）。當Brij®濃度增加時， 樹幹的密度減少，但細胞族群之擴散增加。 大致而言’與新鮮血樣相較’第2天或陳化血樣之細胞圖 顯得較差 <'以第2天血樣作分析時，細胞變得會漏，以致細 皰圖所顯示之分離細胞族鮮變得更擴散。對嗜中性球更是 如此。對第1天樣本而言’以試劑1所進行之方法並不成功（ 圖2G)。當Ρχ R1試劑溶液中之Brij«濃度增加時，樹幹密度 -47* 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0 X 297公着） ^-- (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 i線 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 448295 A7 ---------B7_ 五、發明説明（#) 悄向減少（圖2H_2J)。試劑2，3和4在細胞圖中並未顯示界 限，且以試劑2(圏2H)和4(圈2J)所得之差式計數有嚴重扭 曲。 通寺實驗之結果顯示，只含非離予性界面活性劑（即Brij® 35)濃变在升而無SDS之測試過氧化酶^試 劑组合物，當與潤洗循環中無Bri广之潤洗溶液共同使用時 產一…、法接受之數字數據和細胞圖c同樣地，如實例1所 通’只含SDS(〇.16-0.20克/升）而無Brij®35之Px R1稀釋 劑當與不含Brij®(如無Brij®之潤洗液）之潤洗溶液共同使用 時’亦非有效試劑。因此結論爲在ρ χ方法中，含離子性界 面活性劑或非離予性界面活性劑之ρ χ R1稀釋劑無法提供 可接受之結果。事實上，爲在此方法中達到精密而準確之 结果，本發現顯示離子性界面活性劑（如S D S )和非離子性 界面活性劑（如Brij®》5)二者必須同時調配入ρ X R 1試劑組 合物中〇本發明另提供一項知識和發現，當與潤洗循環連 合’且所用潤洗溶液不含非離子性界面活性劑如Brij® 35時 ，過氧化酶R 1試劑組合物顯得特別重要，下列實例3有進 —步詳述。 實例3 兼含非離子性界面活性舟丨和離子性界面活性劑之過氧化鷗 R 1稀釋試劑組合物之調配和測試 製備第3種R 1試劑組合物以測試將非離子性界面活性劑 和離子性界面活性劑調配於過氧化酶組合物和方法中。爲 調配含雙重界面活性劑之R1稀釋劑，乃將濃度爲0.080克/ -48- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（2i〇X297公釐） #------1玎------^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 32 9 5 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（46 ) 升’ 〇 · 1 2克/升和0 1 6克/升之：Bri广35調入亦含s D S 〇 · 1 〇 5克/升之R1稀釋劑组合物中。使用含雙重界面活性劑 之試劑組合物以測試第1天和第2天血樣，用白血球差式計 數之遇氡化酶方法來進行。 進行一項實驗以測試此R 1試劑配方，對一組五份血樣來 做’ ▲樣係取自含K 3 E D T A之Va.cutainerTM管子°以標準試 劑組來分析第1天和第2天樣本，在自動化分柝儀上以1 〇 2 樣本/小時來進行。此外’亦用兼含〇 . 1 〇 5克/升s D S和 0.080，0.12和0.16克/升Brij® 3 5之測試P X R 1試劑來分 析第1天和第2天樣本，以1 2 0樣本/小時來進行。對第2天 樣本而言，標準P X R 1試劑含〇」〇 5克/升S D S而不含Brij® 35，用來與潤洗溶液合併使用，其含界面活性劑piur〇nic P105於鱗酸缓衝食鹽水中，以與測試r 1試劑配方比較。 得到精密度和準確度數據（見表5和圖3A-3D)。對第1天 樣本而言，準確度的精密度對所有過氧化配通道參數上都 在方法説明以内。對第2天樣本而言，含s D S和Bri广3 5 〇 . 1 2克/升及〇 . 1 6克/升之測試試劑的精密度（相對於第1天 樣本和標準）是可接受的，具有s D S和0.0 8 0克/升Brij® 35 時，％嗜中性球計數在精密度説明以外。上述標準試削 及潤洗劑在120樣本/小時下，產生無法接受之精密度結果 ’具有熟悉形態的升高WBCP*%淋巴球，及下降之。/{>嗜中性 球。 此實驗說明對第1天和第2天樣本，以含s D S濃度爲 0.1 0 5克/升和Brij® 3 5濃度範圍爲〇 ·丨2克/升至〇 ·丨6克，'升 -49- ¥紙張尺度適i中國國家標準（CNS ) A4規格"( 210x297公餐) ' ^ 私衣1τ------線 r · * · W (請先閏讀背面之注意事項再填寫本頁) "4432 9 5 A7 A7 I------- B7 五、發明説明（47 ) ^ ~- 之測試P X R 1試劑溶液可得到可接受之準確度和精密度。 圖3 A説明用過氧化酶方法對第1天血樣之白企球差式分 析的可接受結果。示於圖3 A之分析中所用之R〗試劑组合物 爲一種標準，及含0.105克'IhSDS ;標準潤洗試剤含3 〇克 /升以#35和2.0克/升SDS。圖38説明用第i天血樣進行 測試Px方法之功效結果，其中ρ‘χ R1試劑組合物含〇 1〇5克 /升S D S，及潤洗試劑含2 · 〇克./升s D s而無Brij® 35。圈3 Ci 説明用第2天血樣進行測試p X方法所得之功效結果，其中 P X R 1試劑组合物含〇 ,〗0 5克/升S 〇 S，及潤洗試劑含2 . 〇 克/升S DS而無Brij* 35。阚3 D説明用第2天血樣進行測試 P X方法所得之功效結果，其中p x R1試劑组合物含〇 ^ 2克 /升Brij*35和0.105克/升SDS，及潤洗試劑不含SDS及 Brij® 35，但含本文中表2所述之潤洗試劑組合物，其包括 非溶血性界面活性劑Plur0I1ic Pi〇5。由圖3C和圖3D之比較 可知，當R 1試劑組合物中有非離子性界面活性劑Bdj® 35存 在時，雜訊區域之厚度明顯下降。 裝-- (-15?^·閲讀#面之注意事項再填寫本頁) 訂 .丨線 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印装 50 本纸張尺度適用中國囷家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 4482 9 5 Μ Β7 五、發明説明（48 ) βκ 鹄一冲 鹄一 A %2广初2^ 0.105f) 0.105 I- 0.105οί) 0.S59m) 0.105(-其) SD1- 0.105 (SS)

Brii® 353 Ο p〇so 0.12 0·16 Ο Ο *9.53 6‘46 6.23 Ρ04 6·12 0-05 6b9 -0.06 WBOP 6’31 Ρ10 *44b 5-9 59.6 Ρ3. 59.3 0·5 5-6 1.1 ^I^eut 5-1ro *45·6 29·2 3Ρ50,8 3Ρ0 0.4 29_7 Ρ3 29.7 0,7 6.6 7b •4 0.5 •4 S •1 PS 2 Ρ3 ^rvmph %Μοπο 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -_3 1,8 -•6 1·6 3.1 Ρ2 •8 0.22.6 0·3 1.5 0·1 1‘6 0.2 1‘30.1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） ^Eos2_s Ρ3 浈UJn 1.6 0.4 知5 -^^^^^^^^^-^35)=^^^^^^^^(30-53^^^^^^^^ 白眾2其查"命玆奇抄社涔 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .裝. -?τ -—球 82 95 A7 B7 經濟部中央標準局貝工消費合作社印31 五、發明説明（49 第2天 0.105 (測試） 0.080 6.32 *56.0 30.7 6.8 *L7 1.2 第2天 Ω.105 (測試） 0.12 * 6.17 60,0 29.5 7.2 *1.5 1.3 第2天 .0.105 (蜊試） .0.16 6.15 61.1 28.0 7.6 *15 1.2 + :第1天血樣是在取出後不到8小時内使用；- 第2天血樣是在室溫下陳化24小時。五個樣本以每試劑 進行二重覆。 * :陳化血樣超過系統説明之數値。 + + + :Std:標準；Brij*35和SDS在R1試劑溶液中之濃度以 克/升計。 WBCP:過氧化酶方法中之白血球計數； %Neut:樣本中之％嗜中性球；％Lymph:樣本中之％淋巴球 ;%MomK樣本中之％單核球;％£；08:樣本中之％嗜酸性 球;％LUC:樣本中之％大型未染色細胞。 如圖3 A和3 B所測定，對第1天血樣使用只含離子性界面 活性劑（即SDS)之Px RI試劑組合物，以及含或不含仏^ 之潤洗試劑配方時，原點雜訊被認爲是正常和可接受的。 然而，當使室溫下陳化之第2天血樣來分析時，則觀察到不 同結果。對這種陳化血樣分析而言，含O iM*/升SDS之ρχ R 1試劑連同不含Brij® 3 5而含2 . 〇充/升s D S之潤洗試劑時 ’所得細胞圖表現無法接受之原點雜訊（圈3 C)。很有趣地 ，根據本發明之發現，第2天樣本之雜訊問題可藉加入非離 -52· 本紙ί&ΧΛ顧巾關( CNS) ( 2歌297公着） --------^— (t•先閲讀·背面之注意事項再填寫本頁) 訂 .丨線 2 95 A7 B7 五、發明説明（5〇 ) ---------^ I — f請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 子性界面活性劑（如Brij* 35)至Px方法之過氧化酶ri試劑 中而改善（圈3D)。更特宅言之，用於圖3D之Px 試劑组 合物含0.丨2克/升1^|*35和0.1〇5克/升8£)8，及所用潤洗試劑 不含Brij及S D S ’偉含非溶血性界面活性劑piur〇nic PW5 。因此’發現用於過氧化酶R1試劑組合物中之最適濃度， 及樣本潤洗循環和含非溶血性界面活性劑如Plur〇nie ρι 〇5 之對應潤洗試劑之最佳使用狀況，使最終非離子性界面活 性劑濃度適合血樣之條件和體積，造成過氧化酶差式計數 方法功故及所得結果精密度、準確度和可接受度之顯著改 良。 實例4 選擇非離予性界面活性劊於R I試劑組合物中之 供用於Px方法中，其使用樣本潤洗循環及無溶解性非趙早 性界面活性劑如Brif 3 5之潤洗溶液 實驗之進行係爲選擇非離子性界面活性劑於過氧化酶尺1 試劑組合物中之最佳濃度，以Brij® 35爲例示用非離予性界 面活性劑，及用一種試劑形態，其包括一種無非離子性界 面活性劑（如Brij® 35)之潤洗液（表4)。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 功效數據係得自一項實驗，其中所用Brij® 3 5之最終濃度 爲0_ 10, 0,1 2和0‘14克/升，有二组樣本：〇 26個非醫院樣本及 2) 1 4個醫院樣本。數據係得第！天和第2天樣本，係收集 和貯存於含K3 E D T A作爲抗凝劑之Vacutainer™管中6數字 和細胞圖數據均被考慮。 含0‘10，0.12和0.14克/升BrijMS之Px- R1測試試劑溶 -53- 本錄尺度顧巾關家料（CNS ) ( 21Qx297公着) 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（Μ ) 液的製法是分別將0.085, 1.02和1.19毫升3 0克/升Brij43 35加 入過氧化酶R 1試剞混合物（除去界面活性劑）之小份中。在 用各種不同R 1測試試劑組進行過氧化酶方法步驟之後，乃 使用如本文所述之含非溶解性界面活性劑Pluroinc界面活性 劑於樣本潤洗循環中β就標準或對照試劑形態而言，所用 R 1稀釋劑含0· 105克/升離子性界面活性劑S D S而無非離子 性界面活性劑’潤洗試劑溶液兼含Bri广35和SDS。非醫院 樣本係得自假定爲正常之志廟者，及醫院樣本係得自紐約 衛其斯郡醫學中心（Westchester c〇unty Medicai center)之病 人。 使用自動化血液學分析儀（如TECI-INICON H#TM系列）以 手控開口管取放方式來收集數據。用各試劑組來分析二重 覆第1天樣本。來自相同提供者組之未開口樣本貯存於室溫 下過夜’並在第2天（即第2天血樣）以手控開口管取放方式 作分析。標準運轉之敕體是在樣本/小時（s / h)。測試樣本 以1 2 0 s / h運轉。每天在運轉樣本前，根據使用者手册所設 七之一般性維持指示清洗自動化系統。根據使用者乎册所 列之分析儀説明來没定過氧化酶通道收取（ehannel gains)。 在評估測試試劑之前和之後，以軟體和試劑之標準形態來 測定系統不準確性。一個新鮮非醫院血樣經取放十次，然 後對所有C B C參數測定（由系統自動進行）平均値和標準偽 差（S D )。此s D s和新鮮非醫院血樣之系統不準確性説明來 比較。此程序是在每天研究之後進行。測試方法不準確性 是在不連續狀態用下列方程式來計算：SD = [Sum -54- t ^ i) ( CNS ) A4J^fg- ( 2Ϊ〇χ 297^¾ ) I---------#------------^ <請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) Α7 Β7 448295 五、發明説明（52 ) (d2)/2N]1/2，其中d是以特定試剤所得二重覆數値間之差 別，及N是組内樣本數。

Brij* 35對白血球差式計數値過氧化酶方法結果的影響 (26非醫院樣本）。 在此實驗中，對26非醫院樣本測試過氧化酶方法，使用 上述標準Rl試劑，及使用含价丨广35濃度0_10，〇.12和 0.1 4克/升之測試過氧化酶方法Ri試劑來進行（見表6)。就 第1天血樣而言，臨床參數對Brij®；35濃度不敏感。對精密 度説明來説，單核球百分比很低，及雜訊百分比随Brij® 35 濃度之増加而降低。除％單核球以外，所有其他參數可滿 足精密度和準確度説明。 對第2天血樣而言，％嗜酸性球低於昧化血樣之精密度説 明，對標準方法和所有三個測試方法皆然。所有其他臨床 參數皆在可接受之限度内。％雜訊反應和由所試第〗天血樣 觀察到的結果相近。對這數據組來説，第1天和第2天樣本 在Brij 35濃度範固〇.2和0.14克/升内，數字數據 大致相同。比較〇.14對0.10克/升玢丨广顯示％雜訊降低之妤 處：對新鮮和陳化血樣分別爲丨3。/〇和丨70/〇。

Brije 35濃度變異（14醫院樣本） 在此實驗中，14醫院血樣組以標準過氧化酶方法試劑來 測試，亦用含〇·1〇, ^和^斗克/升玢丨广^之測試卜 R1試劑來測試（見表7)。就第1天和第2天血樣，所有測試 試劑大致都滿足精密度説明。 -55- 家^^iiT2I0X297公廣） ---------^------iT------旅 ,♦ * (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央榡準局員Η消費合作社印製 4482 9 5 A7

7 B 五、發明説明（53) 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 基不同Brij*35濃度在Ρχ方法中之影響（2$非醫院樣本） 第1天血樣 BrijMSi 克 /升] VVUCP %N %L %Μ %Ε %LU C %Nois Sid 6.08 58,7 29.1 7 2,7 1.9 21,2 0,1 1 *1.4 0,5 0·2_ 0,2 0.6 0.1 6.12 58.7 29.4 *6.2 2.8 2.2 25 .0.12 0.9 0.9 0.5 0.4 0,2 1.4 0.12 6.1 58.9 29.5 *6.2 2.8 2.1 22.9 0.11 1 0.8 0.5 0.3 0.2 1.3 0.14 6.1 58.6 29,6 *6.4 2.8 2 21.7 0Λ2 0.8 0,7 0.6 0.2 0.3 1.4 第2天血樣 Brij<®35(克/ 升) WJBCP %N %L %Μ %Ε %LU C %Nois Std *6.48 59.2 29.8 6.9 *1.6 1.7 27.1 0.18 4,2 4.2 0.6 0.3 5 2,3 0.1 6.29 57,7 31 ΊΛ η.6 1.8 24.9 0.14 1.5 1.7 0.7 0,2 0.4 1.8 0.12 6.24 58,6 29·9 7.2 *1.6 1.8 23.9 0.13 1.2 1.2 0.7 0.2 0.3 2.3 0.14 CJ2 59,8 29.1 7 *1.6 1.7 20.8 0.12 1‘2 1.3 0.8 0.4 0.2 1.8 説明..： 第1天SD 0.1(5 1,4 1.1 0·9 0·5 0.5 無 第I天acc 0.15 1 0.5 0.5 0.2 0.5 無 第2天acc 0.32 2.8 2.2 1.8 1 i 無 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -56-本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X M7公釐） 448295 A7 B7 經濟部中央標準局員工消賢合作杜印製 五、發明説明（54) 由醫院和非醫院數據組所得之細胞圖以下列特性作定性 分析·雜訊/淋巴球分離；嗜中性球、淋巴球、單核球、嗜 酸性球和LUC族群之緊密度：細胞圖中細跑族群之染色強 度和位置；雜訊區和淋巴球區間浮動低闕値之變異；及整體 一般外觀與用標準試劑於過氧化酶方法中作血樣分析所得 之細胞圓作比較β於過氧化酶方法中分析之樣本组包括第i 天和第2天非醫院樣本（1 1樣本）和醫院樣本（丨1樣本）。 由所得細胞圖推得之結論爲過氧化酶R1稀釋劑令有〇12 克/升Brij® 35可在細胞族群分離和可接受原點雜訊方面， 產生最佳整體細胞圖；0.10和0.14克/升不如0.12克/升， 但皆爲在此方法中可接受的。對第2天樣本，Px R1測試稀 釋劑中0 . 1 0克/升Brij® 35所造成之雜訊百分比略高於012 克/升Brij* 3 5(即對第1天樣本爲2 1.7 %對1 6.7。/0，及對第2 天樣本爲18.9%對17.7%)，但對第2天血樣分析而言， 0 . 1 0克/升Brij ® 3 5濃度被測定爲較佳（即細胞族群區域較緊 密）。相反的，R1測試稀釋劑中之0.14克/升Brij® 35所造成 之雜訊百分比比〇 . 1 2克/‘升此界面活性劑略低（即對第1天樣 本爲1 6 2 %對1 6.7 %);然而’ 〇 _ 1 4克/升此界面活性劑對 第2天血樣之邊界來説爲較往（即〇 . 1 4克/升Brij* 35造成細 胞族群擴散，乃因較高界面活性劑濃度對細胞之衝擊所造 成細皰固定性檢視之結果和數値分析一致。 57- 衣紙張尺度適用中國国家標準（€奶）八4^格（210父297公釐 ----------^------ΐτ------^ j * (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 448295

A B 五、發明説明（55 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 表7:Srij*35濃度變異於PxRl試劑組合物中之影響(14醫院後本） 第1夭血樣 Brij* 35 冼/升1 WBCF %N %L %M %E %LVC %Nois Std [5Λ5 71.8 16.5 5.2 0.7 5.5 8.6 0.16 *2.9 *3.0 *1.8 O.i *2.3 0.4 0.10 15.12 71.9 16.7 AJ QJ 5.7 10.9 +0.18 1.3 0.7 *1.3 0.2 0.5 0.6 0.12 15,12 71.7 17,0 4.9 0.7 5,4 9.2 0.13 0.8 1.0 0.5 0.1 0.5 0.5 0.14 15,23 71.2 + 17.6 5.3 0.6 *4.9 9.1 *0.!9 0.8 ΛΛ 0.5 0.1 2.5 0.7 第2天血樣 Brp 35(克/升) WBCP %N %L %M %E %LUC %Nois Std 14.92 71.0 17.3 6.2 0.6 4.3 12,8 0.67 2.3 4.2 1-5 0Λ 1J LO 0.10 15.00 70.8 17.7 5,4 0.5 4.9 11.6 0.29 0,6 L3 0.4 0.1 9J 2.3 0.12 15.10 70.5 17.3 5.6 0.6 5.4 10.7 0.37 1.3 1.3 0.5 0.1 0Λ LO 0.14 15.23 70.1 17.7 5,8 0.7 5,2 9.8 0.37 [.5 2.1 2.1 0.1 1.3 LO 説明 ： 第1天SD 0.16 1.4 1.1 0.9 0.5 0.5 無 第1天acc 0.15 I 0.5 0.5 0.2 0.5 無 第2夭acc 0,32 2.8 2.2 1.8 1 1 .無 ------1T------^ I*·. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -58- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!〇X297公釐） 經濟部中央摞準局貝工消費合作.杜印製 4 4 8 2 9 5 A7 __B7 五、發明説明（56) 相似實驗之結果亦顯示，所試五種不同批次35大致 得到相同功效，對第1天和第2夭正常和醫院血樣均如此Λ 因此’ Brij® 35之批次間差異不預期會成爲含此非離子性界 面活性劑之試劑製備時的問題基於數字和細胞圖結果之 综合’過氧化酶R1試劑組合物中Bri广3 5最佳濃度範圍選在 約〇‘1〇克/升至約〇.15克/升，更诖爲約0.1丨克/升至約〇13 克/升。須了解的是，試劑組合物中之非離子4界面活性劑 (如Brij ® 3 5)之濃度可由熟練的操作者作例行調整，視用來 進行差式計數方法之血液學分析系統而定。 實例5 在磷氧化酶方法中，使用含非溶血性界面活性劑之潤洗溶 致，-並使用含雙重界面活性劑之R1試劑組合物，以避免易 變潤洗攜移的問韻 在自動化分析儀上進行過氧化酶白血球差式計數方法時 ，爲避免潤洗攜移問題，本發明方法可藉包括—種澗洗溶 液而進一步改良’該潤洗溶液所含非離子性、非溶血界面 活性劑不同於本發明R 1試劑組合物所含之非離子性界面活 性劑。該潤洗溶液已描述於前文中，包括非溶血性界面活 性劑如Plurnoic P105 ’其在過氧化酶方法中爲不活性及非功 能性’且對方法只有造成些微體積增加，於半·和全-自動 化血液學分析儀上進行過氧化酶白血球差式計數方法時， 樣本間潤洗可消除沉積形成，及避免數次樣本取放後過氧 化酶反應室中之樣本/試劑混合物攜移。 潤洗攜移問題之特定説明如下：在設計改良的本試劑和方 -59- 本紙張尺度適用中國國家標隼（_CNS ) A4規格（210X297公釐) ' --------- ---------^.------、ΤΓ------^ I · · (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央榡隼局員工消費合作社印裝 4482 9 5 at Β7 五 '發明説明（57) 法前’本案發明人發現在冤成樣本間调洗循環後，有约8 _ 1 0微升潤洗溶液留在反應室中當根據本發明將潤洗溶液 調配成含非離子性界面活性劑Brij® 35時，似乎小量潤洗液 體積（即8至1 0微升）造成加入一些Brij* 3 5至方法之r 1相中 ，這已足以對細胞圖所示細胞分離結果造成不利影響a例 如’當潤洗攜移體積超過約1 〇微升時，細胞圖中嗜酸性球 族群上移至嗜中性球族群中，及單核球和淋巴球都在細胞 圖中下移。再者，當潤洗攜移體積爲約i 3 3微升時，過氧 化酶方法因Brij® 35之存在而完全破壞。由於在此方法第— 反應相中所加入之P X R 1試劑溶液體積爲〇 2 5毫升，過氧 化酶方法第一反應相中所計算得之Brij*> 35濃度爲約〇 〇93克 /升至0.1 2 0克/升，其對應於潤洗攜移體積約8 〇至〗〇 〇微 升。 在該等測試期間’定量由潤洗攜移轉移至ρ χ方法R 1滢段 之Brij® 3 5濃度，列示如下：潤洗溶液含3 〇克/升Brij® 3 5。 潤洗攜移體積爲1 0微升，其相當於3 〇微克Brij* 35 ;轉移 3 〇微克Bnj* 3 5至過氧化酶方法之r 1相中（即2 5 〇微升過氣 化酶R 1稀釋劑+ 1 2微升血液，或〜7微升血漿，十丨〇微升澗 洗溶液，產生總體積〜2 67微升），再於方法1〇相中造成 Bnj 8 3 5濃度爲〇 . 1 1 2克/升。測試過氧化酶R i試劑均調配 成基本上含相同濃度Brij® 3 5 ’使在過氧化酶方法中輸送固 定濃度之此非離子性界面活性劑。 厲4 A- 4 F顯示使用無非離子性界面活性劑（如Brij® 35)(圖 4 A ’ 4 C和4 E )之水性潤洗組合物，及有非離子性界面活性 -60- 本紙張尺度_巾關丨辟（GNS ) Α4ί^ ( 21(^97么 ------iT------养· (十先閲讀r面之注意事項再填寫本頁) 4482 95 A7 經濟部中央標準局貝工消費合作杜印製 B7 五、發明説明（5S) ~ --- 劑（圖4B，4D和4F)之水性潤洗組合物時，不同潤洗攜移 體積對本發明過氧化酶方法之影響。在過氧化酶方法R丨和 R2相中，如圈4A-4F所示，此方法之R1試劑含〇丨…克/升 SDS而無Bdj®35」圖4A和4B出示由過氧化酶方法和沣隨 之潤洗循環所得之細胞圖，潤洗溶液攜移造成過氧化酶… 試劑溶液最终體積中之7·9微升（圖4A:無Brij® 35於潤洗溶 液中：圖4B:Brij®35存在於潤洗溶液中）。圖4(：和41)所示 細胞圖係由過氧化酶方法和所伴隨之潤洗循環所得到，潤 洗溶液攜移造成過氧化酶R丨試劑溶液最終體積中之1〇1微 升（圖4 C :潤洗溶液中無Brij« 3 5;圖4 D : Brij® 3 5存在於潤洗 溶液中）。圖4 E和4 F所示細胞圖係由過氧化酶方法和所伴 隨之满洗循環所得到，潤洗溶液攜移造成過氧化酶試劑 溶液最終體積中之1 3 · 3微升（圖4 E :潤洗溶液中無Brij * 3 5; 圖4F : Brij* 35存在於潤洗溶液中）^由結果可知，潤洗溶液 中存在之Brij*35和澗洗攜移之影響，造成細胞圖結果之普 遍劣化。當在Brij® 35存在下而潤洗攜移體積増加時，亦可 觀察到此結果（圖4B，4D和4F)。 使用本發明改良之試劑組合物和方法時，攜移很顯著； 此外’結果之精密度和準確度是高度可接受的。本案發明 人測定出非離子性界面活性劑Brij® 35爲該試劑成份，若其 存在於潤洗组合物或溶液中，或若攜移不同量至過氧化酶 方法中時，會造成無法接受的細胞圖結果，對細胞圖中白 血球聚集之破壞特別明顯。 如本文所述，於過氧化酶方法潤洗溶液中使用非溶血性 -61 - 本紙張尺度適用中國国家標準（CNS ) A4規格（2丨〇><297公廣 ---------I ! (免‘先閲讀f·面之注意事項再填寫本頁} 訂· —線. 4482 9 5 a?_ Β7 經濟部申夬樣準局貝工消費合作杜印裝 五、發明説明（59) 界面活性劑如Pluronic (如Pluronic P105)，及調配本發明新 穎而改良之R 1褅釋劑組合物，可減輕易變潤洗攜移之影響 ，保持原點雜訊在可接受程度，及使得以自第2天血樣用 Px方法獲得可接受之結果。因此，根據本發明，由實驗發 現，兼含離子性界面活性劑（如S D S )和非離子性界面活性 劑（如聚乙氧酸酯Brij® 35)之R 1試劑組合物可用於在室溫下 已陳化2 4小時或更久之血樣。再者，根據本鮝明，使用含 Pluronics類界面活性劑之潤洗溶液亦可改良本文所述白血 球差式計數方法之結果。 實例6 虽R 1試劑組合物和過氧化酶方法進行白血球差式計數方法 之自動化分柝 本實例描述快速（即1 2 0樣本/'小時對6 0或1 0 2樣本/小時） 白血球差式分析之決定，其中使用自動化血液學分析儀和 本發明之改良方法和試劑《具有此技術之人士很清楚的是 可用备種不同分析儀和系統以得到本發明方法和試劑之優 點。 使用全血樣，在此方法之R1反應相中，以250微升含雙 重界面活性劑之R 1試劑稀釋劑來輸送1 2髁升樣本。約1 9 秒後，加入250微升含過氧化氫（3.0克/升）之稀釋劑及125 微升含4-氣-α-莕酚（70克/升）之稀釋劑，此爲第二反應相 (R 2 )。加入含色原質之試劑以後約1 3秒時，流出液通過電 子光學偵測系統及製得細胞圖。以細胞爲基礎來測量（正角 散射對吸光）白血球染色之大小和程度，並點畫在細胞圖上-62- ---------装------1Τ------手 : : : (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2丨0Χ297公釐） 4 4 8 2 9 5 A7 _______________B7 五、發明説明（6〇)

請： 先 閲 讀， 背 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 X 電腦上分析細胞圖，以得到全部白血球計數及嗜中性 球嗜酸眭球、卓核球、淋巴球和大型未染色細胞之亞群 f式计數。圖示説明一些細胞圖，係得自用來在自動化裝 典上進行本發明方法之自動化血液學分析儀電子光學偵測 系統細胞圏顯π以本發明試劑和方法區辨出之白血球種 類（即WBCs): 1)淋巴球；2)單核球；3)嗜中性球；嗜酸性 球，5)由紅血球虛體和血小板造成的原點雜訊，-和(見 圖 1 A)。 全血最終稀釋度爲1:53，及全部反應時間爲約3〇_32秒 。在自動化分析儀上進行之過氧化酶方法的溫度型態，其 一般性及非限制性例子如下·在方法之R i相中，血樣和R工 試劑稀釋劑進入溫度設在約6 9 t 土 2 -c之過氧化酶室中。 訂 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 R 1反應相期間約1 5至2 0秒，溫度增高至約6 5 t至約7 5 ，或至約6 5 C至約7 0。(：。然後，將受質試劑加入方法之第 2反應相（即R 2 ); R 2溫度爲約5 0 °C至約6 5 aC，期間有約5至 8秒，其間溫度升至約7 3 °C 土 2 Ό，此乃過氧化酶方法完成 時之取終溫度。過氧化酶方法r 2相完成後，於潤洗循環中 使用潤洗溶液。需要樣本潤洗循環以避免樣本自一樣本循 環攜移至另一樣本循環，及避免自動化血液學分析儀系統 之水份影響累積。 實洌7 _分析各種不同非離子性界面活性劑於本發明R ]試劑組合| 和方法中之適合度 爲決定非離子性聚乙氧酸酯界面活性劑種類是否遑合用 -63- 本紙張尺度適用中圉国家標準（CNS ) A4規格（2丨0X297公釐 (4482 95 at ____________B7 五、發明説明（61) '~' -- 於本發明改良試劑組合物和過氧化酶方法中，乃作下列實 驗。 用於方法中第一反應相之過氧化酶R 1測試試劑組合物係 以如下方式製備：將2 〇 〇微升各種不同聚氧乙酸酯於蒸餾水 中之3.0克/升溶液加入5 〇 _ 〇毫升之第丨相試劑組合物中， 並置入6 0毫升之聚丙締旋蓋離心管中。界面活性劑溶液之 製法是加3.0克聚乙氧酸酯至9 7.0毫升蒸餾水中，及加熱 攪拌至溶液開始沸騰。冷卻至室溫歷約3 〇分鐘後，將2 〇 〇 微升溶液加入至過氧化酶R 1試劑组合物之其他成份中以製 成R 1測試試劑。此處被測試之聚乙氧酸酯可購自許多不同 來源；例如，Brij®界面活性劑係得自ici和Ruger; Macol 界面活性劑係得自M az er，S i p i 〇 n i c界面活性劑係得自 Alcolac; Triton X®界面活性劑係得自 Sigma, Union Carbide 或 Rohm & Haas; Igepal C0987係得自 GAF; Pluronic P105 係得自B AS F ; S urfonic N3 1.5係得自Huntsman。在離子性 界面活性劑方面，TDAPS係得自Boehringer-Mamiheim及 TTAB係得自 Sigma。 如表8所示，使用下列族群或類別之聚乙氧酸酯： (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) •菸. 訂 經濟部令央標準局員工消費合作社印裝 64 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 4 4 8 2 9 5 A7 B7 五、發明説明（62) 表8 界面活性劑 .値 较水物t 親水物 1)直鏈疏水物經醚化成聚匕二皡 Brij® 52 5.3 cI6h„o POEi Brij® 30 9,7 poe4 Brij® 76 12.4 C[8li37〇 -P〇El0 Macol® TD12 14.5 C13H170 POEu Siponic® L12 14.6 c12hu0 P0Eu Brij® 78 15.3 ^13^J7〇 ΡΟΕϊο Brij® 58 15.7 CiaH370 ΡΟΕί。 Siponic® El5 16.9 C16H330/ClgH370 POE32 Brij® 35 16.9 ^|2^25〇 POEij 2)支鏈辛苯基较水物經醚化爲聚乙二醇 Triton X®-100 13.5 CsHj7OC6H4〇 POE9.5 Triton X®-165* 15.8 0811|70061140 Ρ〇Ε1β Triton X®-305' 17.3 C8Hl70C6H40 POE30 Triton X®-405* 17.9 CsiIn0C6H40 ΡΟΕ,ο 3)直鏈壬苯基疏水物經謎化爲聚乙二醇 Igepal® C0897· 17.8 c9h19oc6h4o p〇h40 句直缝猫昉酸經酯化爲聚乙二醇 . Myrj® 53 17.9 C17H35C02 P〇EJ0 {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 *原料爲70%(重量/重量)之水中溶液：因此，4.30克界面活性劑溶液和95.7克蒸 餾水混合以產生最终激度3.00百分比(重量/重量)界面活性則於過氧化酶方法第 一反應相試劑組合物中* -65- 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 2 95 A7 B7 五、發明説明（《 由正常提供者收集每試劑組1 〇份血樣至Vacutainer®管中 ，並以IC^EDTA抗凝集。於自動化分析儀上收集數據，以手 控取放開口管。每試劑组之第1天血樣取放二重覆。來自相 同提供者之未開口樣本貯存在室溫下過夜，第2天作手控分 析（第2天樣本）。標準運轉軟體發生在1 〇 2樣本/小時：測 試樣本和試劑在通過1 2 0樣本/1小時之情泥下運轉。每天在 運轉樣本前’根據操作指示清洗系統，及過氧化酶通道收 取係根據所用各自動化系統之操作指示來設定。 在評估測試試劑之前和之後，用軟體和試劑之標準形態 來測定系統不準確性》—個第1天血樣取放十次，及對听有 參數測定（由系統自動進行）平均値和標準偏差。標準偏差 和由新鮮血液測出之系統不準確性説明作比較。每天作研 究時都進行此步骧。 爲測定測試方法之不準確性’將i 〇樣本取放二重覆。在 不連線狀態估計不準確性，以下列方程式計算過氧化酶通 道參數之標準偏差SD(多重提供者sd之合併）：SD = [Sum (d2) / 2 N ]'- ’其中d是以特定試劑所得之二重覆數値間之 差異，和N是十樣本組中之樣本數。 在二組中評估測試Px R1試劑。對各組而言，併入標準 過氧化酶方法（如在TECHNICON Η·ΤΜ自動化分析儀上進 行）作爲參考3參考値之定義爲第1天平均値，其係在無本 發明改良方法和試劑之情況下獲得c第1天和第2天樣本分 析之精密度（” a c c ”）是相對於參考來測定；第i天和第2天 陳化血樣之精密度要求不同。此外，不準確性只對第1天血 -66- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公；^ ) 請·· 先 閲 讀· 背- 面 之 注 裝 訂 經濟部中央標隼局員工消费合作社印裝 ^^82 95 A7 --- ------B7 五、發明説明（6^7 ' " 樣測定（見表9)。

Bnj* 52見HL B爲5 _ 3 (見表1〇 )，因此爲疏水性，通常用 於水在油中之乳化應用上a在Η·3 τμ自動化分析儀上進行 的自動化過氧化酶方法在過氧化酶流出物之水性環境中， 係利用油在水中乳化作用（即紅血球和血小板細胞膜之脂質 被界面活性劑微粒體••溶解a I— i · ¾.! f辞先聞讀背面之注意事項再填寫本頁} 經濟部中央標準局貝工消費合作社印裝 67 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X29·?公釐） 4 4 8 2 9 5 a7 B7 五、發明説明（65 ) 部中央標準局員工消費合作社印製 a § r> Ρ· η & 1： 匕 !S. D 今 σϊ H 3' 3 X i 8 K 2 ϊν §| X S·· (M* * o o $ vj (B a t>A oe s. <A E. 弈 ο ο b; ο S Os h p ON U O Ϊ3 〇\ p 〇\ t p Os ω p ΟΊ p «-w Ol A o s ϋ L/i i s b b ρ o 4i s be 匚 〇>. 1： s tA ΪΟ σ\ b ω — b s p 0\ b §- 5 匚 ο Ια 5 y U1 〇 hJ r K) A b hJ ij p »〇 to r y w b to ΰ p M K> D\ ΐΰ r e ο ''Ο ε p U 〇 Irt O' •私 o Ui CTv o p u Cri Ό p "'J p Cs ίη o Ij Οχ b\ p 0\ Ot a s« 2 O z o σ υ« ο Μ ο ί»> Id be 〇 t-J s> o ΙΛ Kl o L> bJ *·-» o O U> l〇 W p r>j p IJ hJ 的 s ¢/5 ο όν Ο Ιλ ο κι to o M K) LJ £ 卜 Pl Li 〇 o ts> o o Οι p s> IJ o ’私 to !j Vt r c o > •ο "σ* 〇 !〇 U O K) μ b ¢9 •O i j l-J J» b i： i5 La o ¢9 o m Ζ > •ζ > ϊ〇 Γ3 !〇 5； ίο La H Ul E Ο p Ο n K n M 3 Ο a n l· 〇 X !? Π lc % ΪΤ 〇 ΪΙ： a mF 嵙 O δ * r〇 •C? Lh s » u ο m 谇 .粦 s-Hs'SJlsi屮谇令&谇贪逢凉韧一冲甘被2^苌啉片今鸯 ----------装------1T------千 ***, (請先閱讀背面之注意事項再填寫本K) 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X297公釐） 448295 明説 明發 '五

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 * k 0 t ί 卜 赘 〇 h *4- Μ C. σ u tj W η 1Λ U Π >5, L/I U> a 今 5ί S|' s m 2 a fV 5. 3 X « S tn « n s C3 9 «Λ eo Ln ο. it Κ) ο ϋ c£ 2 Os gs t p Vj CN b> ΪΛ Ό O' b* &y bs ιο § 〇 -- ts> b〇 c« ίο s « ίΛ s CO *- s Lrt Ui o 〇\ 承 2： ΓΪ 5 JO ίο w u 03 ιΐ i〇 Ui 一 * U> u u K> JO r i ΰ 〇>. σ\ ί·Λ ON CN σ> o w p« Li 沪 2 O z o ο 兽 z * !-j - 沪 o ΪΛ ς <3 C .t° b； - to L> 妁 r n Ui n ΰ U3 w u> L* Ό p: U1 u b ΰ> to 泸 z o 2 ΐ Us Φ- 〇； i〇 ? Ln ίη t； K ε is. 芽 I---------Μ------ir------0 t i 1 ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） A7 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 448295 B7 五、發明説明（07 )

VI α Macol®TD12 tn Brij® 30 a Triton X® 300 S« Triton X* 165 CL Siponic® L12 & Brij® 35 tn o- Brij® 52 C/3 & 試劑： 枣1天血樣 0*15 7·01 0.10 7.05 0.12 7.04 0.09 7.04 0.15 6.97 | 0.15 1 6.97 1 0.09 i *7.20 0.14 7,02 WBCP 〇 ν〇 62.3 ο ν〇 61.5 ο 62*4 i o 62· 1 o 一 2 p 〇\ K> »—· b 62.4 o bo 62.4 %NEUT ο 一 25,4 Ο ^4 »〇 ο bo 25.4 ' o 25.7, o 25.Ί o b\ ! 25.9 o bo 25.5 o ! 25.2 %LYMP ο ίή ΟΝ V Ο Ιλ ίΛ ο Co 〇\ ο o 一 ◦ La o In Os b 〇 b. ON b o Ιλ O'· ί-Λ %MONO ο W ο Ο W ο u> to o k> to o Lj »—* 〇 w uj io O io o w %EOS ο κ— to ο ρ ι—* r〇 ο ίο ro Lj o Li ΪΟ k> o OJ N) ω o Ui K> »—· p K> o io NJ 〇 %LVC ο ^£> 19.0 Ο ’〇 21.0 ! ί—· ίο 27.9 1 p 23.0 i 19.4 o bo 22.5 K) o 32.4 o ΙΛ 20,3 %N0IS 14.5 \〇 1 17.3 ! _1 C； w 14.6 】6.9 HLB cnnv C„Hb C,HI7Ph C8Hl7Ph C,2Ha c16h,3 結播疏半物 r·· Μ 5； M to II . 報今物 POE -70- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210><297公釐） d482 9 5 A7 B7 五、發明説明（6〇 經濟部中央標隼局貝工消費合作社印策 1 aged j ^cc spec CO v=： -0 CO Macol^TDl Brij® 30 Triton X® 300 Triton X® 165 Siponic® L12 Brij1» 35 Brij® 52 | 5. 試剎 ' Ί 0.32 7.03 6.90 7.04 +8.90 7.07 6.95 7.10 -13.10 7.16 WBCP h〇 Oo 63.8 〇\ to 62.6 60.8 62.6 62.7 _ί 62.5 *47.8 〇\ Lj %NHUT ； K) ί〇 25,1 24.3 _1 26.0 27,0 25.7 LA 25.8 *33,2 j 25.8 %LYMP -J ί/1 *-4 M -j i» k) '^O -0 Li -4 bs %M0N0 b to Κ» Ni W si Li 卜 io to fo 舞 b to io %E0S | b CO *—· bo o %LUC ίΡ 17,3 n.3 17.0 1 ' 1 21.9 14,5 Ch 35.6 22.4 , %NOIS Γν；Λ I 15.3 14.5 L^.i 15.8 14.5 16.9 La Lj HLB 涵2^一萍 sd spc accy spec to 00 0.16 0.15 o k 7.10 - 61.4 二 0 01 1 25.6 , o ίο o U O σ\ o Ln 〇 io o Lj o 〇 On ε o L) N) N) ¥ | 23.4 : N/A N/A 15-3 CtiHyj ---------^------IT------ -* 1 . {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -71 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 經濟部中夫標隼局貝工消費合作社印製 4 4 8 2 9 5 a7 ___B7 五、發明説明（69 ) 一般而言，過氧化酶流出物包括下列成份：〇 . 2 5毫升P X R 1試劑溶液，P X 1; 0 . 1 2 5毫升含色原質之試劑溶液，P χ-2: 0.25毫升含過氧化氫之試劑溶液，ρχ 3;和12微升血樣 。Ρ X 1和Ρ X 3 (3 · 0克/升過氧化氩水溶液）爲水溶液，而ρ χ 2爲4-氣-莕酚溶於二乙二醇中之（非水性但可與水相混之溶 劑）之溶液。 具HLBs値在3-6範圍之界面活性劑較宜用於水於油中之 乳化作用中。相對的，較宜用於油於水中乳化作用中之 H LB 範圍爲約 8 -1 8 ( M. J. Rosen，1978, Surfactant and Interfacial Phenomena. Wilev-Interscience, pp. 243-244) 0 Triton X*8 305顯示爲高親水性，因其具h LB爲1 7.3 .逋 合用於油於水中乳化作用。然而，在分析條件下，其非常 親水性的結果可能是達不到最佳功效e本案發明人由數項 過氧化酶研究發現，紅血球在室溫下貯存後變得更不易溶 解’因在貯存期間產生生物化學改變。由於血樣會隨時間 劣化’且有需要對此種樣本進行分析，並在非最佳陳化樣 本條件下得到適當結果，衣發明方法和試劑的精密度和可 信度是特別重要的。 對於含離子性界面活性劑加上下列非離子性界面活性劑 之過氧化酶R1試劑組合物而言：Brij® 58，Igepal® C0897，

Triton X®-100，Siponic®1 E15，Triton Brij® 76，及

Myrj® 53 ’均在第1天血樣分析中表現得精密且可接受。然 而’對第 2 天樣本，含 Igepai® c〇897，Triton 和

Myrj* 53之PX R1試劑組合物似乎產生無法接受之數字和細 -72- 本紙張尺纽财關緖準(CNS ) A4規格（210 ;公釐） — 襄-- (#:先閏^背面之注意事項再填寫本頁) . 線 448295 A7 -------B7 五、發明説明（?〇 ) 胞圖結果（見表i 1和1 2 )。該等聚乙氧酸酯具H L B値分別爲 17.8, 17.9和17.9，及平均％雜訊値分別爲33〇 , 3 3 3和31 8 。此外，由於使用該等界面活性劑而造成的其他共同特性 爲升高之WBCP和扭曲的％嗜中性球和％淋巴球a如所示， Myrj 5 3爲十八酸之幾酸黯，其在水性溶液可能較不安定 ’因其會水解。用於表11和12中之縮窝爲：WBCP:%全白血 球；％NEUT··%嗜中性球；〇/〇LYMPH:〇/。淋巴球;。说〇\〇:〇/0單核 球;。/〇EOS:%嗜酸性球；LUC:%大型未染色細胞;。/oN〇IS:%進行 過氧化酶方法後之原點雜訊；HLB:親水性親脂性平衡値。 不受任何理論所限，過氧化酶方法所用R 1試劑組合物中 之界面活性郝的可能功能包括下列之一者或二者_(1 )對細胞 膜之穿透導致紅血球和血小板之溶解，（2 )水不溶性4 -氣茶 紛之複合’及此受質運送至發生染色之細跑，及（3>紅血球 殘駭之乳化，因而減少過氧化酶通道之累積。 在附圖所示之代表性細胞圖中，在原點處之雜訊/淋巴球 ”樹幹"的寬度和深色度（和細胞數相關）隨雜訊百分比之增 加而增加。一般而言，得自陳化血樣之細胞圖表現出嗜中 性球降低至新鮮血樣嗜中性球族群之界限以下D在陳化血 樣中’族群並不傾向散佈出去。由此實例的結果顯示，在 所測試之聚乙氧酸醋界面活性劑之各種不同家族中，細跑 圖係相當的（見表8實例7 ) ^'然而，特別的是，如上所述衍 生自界面活性劑家族1和2(如直鏈或支鏈辛苯基疏水物經醚 化爲聚乙二醇）及具H L B範圍爲約9 6至約1 6.9之界面活性 劑，在第1天和第2天血樣分析中均可得可接受之結果。這 -73- 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS]A4規格（210X297公釐） ~I I. I u ~~ 訂 I i I -1 -線. • ί T A (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 經濟部央標準局員工消费合作社印裝 4482 9 5 A7 ------B7 五、發明説明（71 ) 些結果和被推薦用於油於水t乳化作用令之界面活性劑 HLB範圍約8-1 8爲一致的。在自動化過氧化酶方法中，如 在所例示之H#3 TM系統上所進行的，紅血球細胞膜殘骇爲 脂仿（"油”）物質’其在水性環境中被界面活性劑微球粒所 乳化；因此，該等類型分析之操作模式爲油於水中乳化作 用。 實例8 I—低H L B値之界面活性劑的分析，及piuronics*Px R 1試劑 座全趣和白血球差式計數過氧化酶方法之評估 進行實驗以測試具較低HLB範圍（〜8)之聚乙氧酸酸酿界 面活性劑經調配入含0.105克/升SDS之Px R1試劑組合物中 之用途及功效。因此，測試了 HLB値由5.3至17.9之界面 活性劑。 屬試劑組一部份之測試R1試劑组合物，其功效係以—組 樣本來測試，包括5個第1天非醫院血樣及5個在室溫貯存 後之第2天非醫院樣本。其功效根據現行自動化分析儀之精 密度和準確度説明來評斷。偵蜊下列參數：W Bc P%，％嗜 中性球（％N或Neut)，％淋巴球（％Ly)，％單核球 嗜酸性球（％Eos)，％大型未染色細胞（％LUCs)*%過氧化 酶雜訊（°/。Noise)。 測試Px R1試劑含有SDS(0.105克/升）及下列其他界面活性 劑’如 Brij*' 35, Macol* NP4, Surfonic® N31.5，Plurnoic P105, Macol® Td3,及Triton X® 35,其製法係根據實例7所述 方法。例示之測試界面活性劑和其對應之H L B値如下： -74- 本紙浪尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨OX297公釐） 裝------訂------線. (請先閱讀背面之注意Ϋ項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 32 9 5五、發明説明（72) 界面活性杳i Brij® 3 5 Macol®' NP4 Surfonic® N3 1.5 Pluronic P105 Macol® TD3 Triton X® 35 A7 B7 HLB値 16.9 8.9 7.7 12-18 8.0 7.8 另進行一些研究以測試用Phiroincs代替本發明過氧化甿 R 1試劑組合物中作爲非離予性界面活性劑之35。 如實例7和表11和I2所示，使用Η[Β値由約9 3至 1 6,9之界面活性劑對第！天和第2天血樣都可得到可接受的 自動化過氧化酶方法結果^ R 1試劑組合物中之界面活性劑 具高於約17.3之HLB値及低HLB値（如HLB:5.3)則得到益 法接受之數據。 … Pluronics,包括P105，其結構和其他用於所述實驗中的聚 乙氧酸酯很不同=在Pluronics的結構中，有三嫡功能部位 :(Ρ〇Ε)η-(ΡΟΡ)π1-(ΡΟΕ)η，其中P〇E和POP分別代表聚氧乙晞和 聚氧丙烯> POE功能部位爲親水性的（即親水物，_)及pop功 能部位爲疏水性的（即H疏水物"）。亦有p〖Ur〇〖nc"反向 (reverse)”或"R"系列’其中POE功能部份旁有二個pQp功能部 位（見 Pluroinc & Tetronic Surfactants, BASF Corporation, 1987)，Pluronics已有被指定之HLB値。Pl〇5之HLB値爲12-18。PI 05之寬廣HLB範圍和雙功能部份聚乙氧酸g旨者有明 顯不同。因Phironic結構和其他雙功能部位聚乙氧酸酯（聚 75 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS ) A4規狢（2丨0X297公釐） ---------^------、玎------0 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 4482 9 5 A7 B7 經濟部中央橾準局員工消費合作社印製 五、發明説明（73 乙軋酸酯化之醇類和酚類）明顯不同，所以pluronics代表不 同類的聚乙氧酸酯。因;t ’雙和三功能部位聚乙氧酸酯間 之不同，使知可用H L β刻度作爲雙功能部份聚乙氧酸酯可 成功用於本發明過氧化酶試劑和方法中作爲有潛力的斿離 子性界面活性劑之實用性指標。 雙功Β&部位類聚乙氧酸酯可用疏水物來 代表。疏水物可爲長鏈、支鏈或直鏈醇，如〜丨」·⑥Μ ^或者 ，其中常用的疏水物結構爲辛苯基（如ΤΗί〇η χ'系列）或壬 苯基類（如 Triton Ν® 系列，Macol® ΝΡ 系列，Surfotiic⑩ ΝΡ 系列等 >，其直或支鏈烴結合至酚結構上，其再結合至POE 功能部位上。 當過氧化酶R 1試劑組合物經調配成兼含s DS和具HLB値 由約7，7至8 · 9之聚乙氧酸酯化之醇或酚，且該等組合物用 於分析第2天血樣，所有細胞圖中，淋巴球區域和雜訊區域 間都無通道。因此，在四例中，淋巴球百分比很高，及在 二的中’嗜中性球百分比很低；整組這種試劑被許斷爲不 適合用於過氧化酶方法之R1試劑組合物中。所觀察到不可 接受之表現的最可能原因爲用自動化血液學分析儀作過氧 化酶方法應用時，該等聚乙氧酸酯疏水性太高（即HLB太低 )。因此’結論是在離子性界面活性劑（如SDS或TDAP3) 存在下聚乙氧酸酯化之醇或酚所需HLB値需介於約9.3至 約1 7 · 3，較佳爲約9 . +7至1 6.9。因P丨uronics代表獨立—類 之非離子性界面活性劑，但此類中之一員，即Pluronic P10 5 ’經測定可用於過氧化畴試劑和方法，熟諳此項技術 -76- 本紙張尺度適用中國國家標孪（CNS) A4現格（210X297公釐） ----------^-- :* (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •1T_ --------------- 經濟部中央梂準局負工消費合作社印製 4 4B2 9 5 A? ____ B7 五、發明説明（74 ) " 之人士應知，其他具不同結構或性質的phir〇nics可能有用 ，因其不同HLB値提供用於本發明試劑所需之足夠界面 性劑溶解性質。 . 因此，根據這些研究，就〇.12克/升之雙功能部位聚乙氧 酸酯非離子性界面活性劑而言，在過氧化酶R丨試劑組合物 中存在有0.105克/升SDS時，具有Hlb値介於約5_3和約 8.9，及大於約^ 7.3，可被接受用於此方法中，相對的， 調配入R1試劑中且其HLB値在約9.7至16.9範圍内之界面 活性劑（即該等界面活性劑具有包括三種常見疏水物之結構 者），可在此方法中得到可接受的結果。plur〇nics包括獨特 一類聚乙氧酸酯界面活性劑，由於其具三功能部位結構。 由於其非溶血性特質，當調配入過氧化酶R丨試劑組合物中 至〇」2克/升（在0.105克/升SDS存在下），piur〇flie ρι〇5是 無法接受的’即使Pluronic具寬度H LB範圍12-18而此範圍 和雙功能部位聚乙氧酸酯之有用HLB範圍重疊。 實例9 全垡類離子性界面活性劑是否適用於白血球差式計數 Ρ X R 1試劑组合物和過氧化酶方法 爲測定是否其他類離子性界面活性劑（如陽離予性或兩性 離子性界面活性劑）適用於本發明改良試劑组合物和方法， 乃另用此種離子性界面活性劑進行實驗。設計該等研究以 測試是否陽離子性和兩性離子性界面活性劑（而非陰離子性 界面活性劑如S D S )適合和〇 . 1 2克/升非離子性界面活性劑（ 如Brij® 3 5)併用於過氧化酶R 1試劑組合物。此等實驗以自 • 77- 本紙張尺度適用中國囤家標準（CNS ) A4洗格（2丨〇 χ 297公釐） ----------^------.玎------^ : t (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 448295 經濟部中央標率局負工消費合作社印裝 A7 ______ B7 五、發明説明（75 ) 動化血液學分析儀中進行，並使用無一 Bri.广3 5潤洗液之潤 洗循環°例如所測試的一種陽離子性界面活,丨生劑爲溴化十 四基三甲基銨或TTAB;及例如，所測試的一種兩性離子性界 面活性劑爲十四基胺丙烷磺酸酯或TD AP S。 不含SDS(如Ρχΐ/無SDS)之測試R1試劑係製成含Brij® 35(4.0毫升30克/升於蒸餾水中之溶液）；葡萄糖醇 ， 113.0克；嶙酸鈉，單鹼基，2.08克（Mallinkrodt):磷酸鈉 ’二鹼基，11.89克（1^111!^1'〇£11);\、0：1，0.488克（?^111111〇'〇射 7581KMER); Na2EDTA，0.750 (Mallinkrodt 4931KMHK);甲 搭，37〇/〇，150毫升（Mallinkrodt)。分析過程中之pH离7.23。測 試試劑過濾通過0.2微米聚砜膜（47毫米）盤（Gelman Supor) 。離子性界面活性劑以下列方式加入p x〖/無s d S中：2 0 0微 升TDAPS或TTAB之30克/升溶液加入於60毫升聚丙烯旋蓋 管中之5 0 _ 〇毫升p x〖/無s d S。在所以測試分析之潤洗循環 中，乃使用含Plllronic P105之潤洗試劑。每组有自正常志 顧者攻集之5個正常血樣，於\’acutainerTM管中並以 KjEDT A抗凝集。在TecHNIC0N H#TM系列之自動化血液學 分析儀上以手控開口管取放方式收集數據，以實例2方式進 行此方法。 在所述之白血球差式計數標準或對照方法中，發現含 SDS作爲唯一離子性界面活性劑及3 5之ρ χ ri試劑组 合物因潤洗攜移（即潤洗液含Brij® 35和SDS，見實例5)而 進入R 1相中。根據本發明發現而進行的測試方法中，Px R 1試劑組合物兼含陰離子性界面活性劑S 〇 s和非離子性界 -78- 本紙張尺纽财®目家標準（CNSTT^F^0X297公f ----------^------1T------.^ (f先閲$"面之注意事項再填寫本X〕 4482 9 5 Α7 ________Β7 五、發明説明（76 ) 面活性劑Brij* 35，及潤洗溶液不含s d S及Brip。 亦分析用其他P X 1試劑組合物之p x方法的功效，其中陰 離子性界面活性劑SDS以陽離子性、四級銨卣化物界面活 性劑TTAB取代，濃度爲〇. 12克/升，或以兩性離予性界面活 性劑T D A P S取代’濃度馬〇 . 1 2克/升。得自含(].1 2克/升 丁丁八8和0‘12克/升日1^*135(_1試劑1”）之111試劑的結果出 人意外-未得到過氧化酶數據，因紅血球溶解不良，導致細 胞圖左侧有紅血球的條紋。相對的，含〇丨2克/升T D A p s 和0 _ 1 2克/升Bri广35之R1試劑則在以過氧化酶方法中用第 1天和第2天血樣分析都提供可接受的數據（見表丨丨）。該等 結果顯示，如T D AP S之兩性離子性界面活性劑適合和非離 子性界面活性劑併用於本發明過氧化酶方法之ρ χ R〗試劑 组合物中〇 ----------^------1T------^ (f先聞t背面之注意事項再填寫本頁j 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 -79. ---*---- 本紙張你t财關家辟（CNS) Α4^·γ^χ297公缓 448295 A7 B7 五、發明説明（77 ) 巧貪雙重界面活性劑之R1試刑組合物埤扞過氤化時方法之功效，其調製 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 第1天 試劑 * Px Rl 界面活if生奁 WBCP «LYM KEOS %LVC 9SNOIS 活性 射種拥 結構. 疏水Jlfi 結構- 親水物 Sid 5DS 6.09 60.2 27.1 7.6 1.9 2A 19.6 Λ CjiHjjO S03- sd 0,11 0.5 0.6 0.2 0.3 0.4 0.8 1 πΑΒ及 ID.(紅血球未溶解J N.D. N.U. C.N N(CK3>3 + 2 TPAPSt Λ Brij*35 6.01 61.4 27.2 ♦5.8 2.4 2.6 20.9 Ζ,Ν cmh„ sd 0.(M 0.8 0.7 0.5 0.2 0-2 0.7 ace. spec o.ts 1 0.5 0.5 0.2 0,5 TTT7 sd spec 0.16 Ϊ.4 U 0.9 0,5 0.5 無 第2夭 試劑 WBCP ?iNEU SLYM MON %EOS SLUC %mis S(d 5.96 61.5 25.8 8.1 1.5 2.3 n.6 1 2 TTAB 及 Btij*35 TDAPS r 1% Brij，35 N.D. N.D. N.D. NIX N.D, 5.81 62.0 26.6 6.6 •2.0 2.1 17.2 acc. spec fii化 0.J2 l.B 2.2 1.8 1.0 1.0 無 ·:.，％«自知化AS學分竹通故明 ，N，二 n®.4.1.狀.磺磨-® BrfjSDS>： πΑΒν· N ' D:©MfeH好而得別數技 CliHClIjVNtCi^ViCHiVSCV· R水物=-i^CH^CIWSiV TDAPS是兩性軲子性·力N上有+價，在〇上有 |ΤΤΛΒ:溴化十Π基三甲基胺：抗洱離子是ΒΓ· -80- 本紙張尺度埠用中國闺家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 裝 訂 線(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 4 8 2 9 5 A7 ----------- B7_______ 五、發明説明（π) 摘要而言，實例7 - 9 +之實驗中，具H L B値介於約7.7和 8.9之聚乙氧酸酯化之醇和紛無法接受作爲p x r 1試劑組 合物中非離子性界面活性劑Brij® 35之替代物a Pluronic P105，一種嵌段共聚物（聚氧乙烯聚氧丙烯-聚氧乙烯）亦 不適合和離子性界面活性劑S d s併用於p x r 1試劑組合物 中（其在細胞圖中造成高5雜訊）^發現陽離子性界面活性劑 (如ΤΤΛΒ)不適合作爲Px R1試劑组合物中sbs之替代物 。然而，發現兩性離子性界面活性劑（如TDAps)是sds之 可接受和有用的替代物。 所有引據之專利申請案、專利、書籍和發表之文獻和參 考文獻都全文列爲本案之參考資料。 上述組合物T製成各種不同改變而Η離本發明之範固 和精神，上述説明、附圖和申請專利範圍之内容應解釋爲 説明性而非限制性的。 訂 線 1 :*- {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁〕 經濟部中央橾準局負工消费合作社印裝 準 標 家 國 國 中 一用 -適 一度 尺 張 紙

Claims (1)

1. 4 4 鮮利申請案 A8 B8 中文申請專利範圍修正本(9〇年4月）g卷

   經濟部中央標卒局貝工消费合作社印装 七、申請專利範圍 ~ 1. 一種對含紅血球和白血球之新鮮或陳化全血樣進行白 企球差式計數及亞群分析之改良方法，該方法之基礎 為該樣本中白血球亞群之内過氧化酶活性，其包括下 列步驟： a) 該血樣與一種水性試劑組合物混合形成均勻的反應 混合物，該試劑组合物包括：（i) 一種非離子性聚乙氧 酸酷界面活性劑’其濃度可有效溶解紅血球以釋出血 紅素但不溶解血樣中之白血球族群；（u) 一種陰離子 性或兩性離子性之離子性界面活性劑，其濃度可有效 溶解紅血球以釋出血紅素但不溶解血樣中之白血球族 群；（iii)曱醛或三聚甲醛，其濃度可有效地將白血球 交聯但不將血樣中可溶解之紅血球交聯；（i v)糖或糖 醇，其濃度可有效增加樣本中淋巴球之可偵測性；及 (v ) —種緩衝劑或緩衝劑混合物，以維持該反應混合 物在中性或近中性pH，介於6,8至8.0之間； b) 將步騾a)之反應混合物加熱至6 0 °C至7 5 t：，以使 樣本中之紅血球溶解及使白血球固定；及 c )將該反應混合物中之白血球的至少—部份染色，以 在懸浮液中產生被染色之白血球族群及未被染色之白 血球族群； 其中該水性試劑組合物中同時存在有非離子性界面活 性劑及離子性界面活性劑，因此對新鮮血樣及取出後 在室溫下儲存至少一天之陳化血樣，在步騾c)之後， 都可得到白血球差式計數結果。 本紙張尺皮適用中國囲家梂準（CNS ) A4乳格（2丨0 X 297公釐） (铕先》讀背面之注意事項再填寫本頁〕 "裝· -.1T 經濟部中央橾準局员工消費合作社印策 4482 9 5 A8 B8 C8 --- D8 六、申請專利範圍 2.根據申請專利範園第丨項之方法，其中步騾a)i)之非 離予性界面活性劑具有親水性親脂性平衡或H l b值介 於9.3至1 7 · 5之間。 3·根據申請專利範園第2項之方法，其中該非離子性界 面活性劑之HLB值介於9.5至17.3之間。 4‘根據申請專利範圍第3項之方法，其中該非離子性界 面活性劑之HLB值介於9.7至16.9之間。 5·根據申請專利範圍第！項之方法，該方法之基礎為該 樣本中白血球亞群之内過氧化酶活性，其包括下列步 驟： a) 該血樣與一種水性試劑組合物混合形成一個反應混 合物’該試劑组合物包括：（i) 一種非離子性聚乙氧酸 醋界面活性劑，其具有親水性親脂性平衡或H LB值介 於9.3至1 7.5之間’濃度可有效溶解紅血球以釋出血 紅素但不溶解血樣中之白血球族群；（ϋ) 一種陰離子 性或兩性離子性之離子性界面活性劑，其濃度可有效 溶解紅血球以釋出血紅素但不溶解血樣中之白血球族 群；（iii)甲醛或三聚甲醛’其濃度可有效地將白血球 X聯但不將血樣中可溶解之紅血球交聯；（iv)糖或糖 醇’其濃度可有效增加樣本中淋巴球之賴測性，·及（v ) 一種緩衝劑或緩衝劑混合物’以維持該反應混合物在 中性或近中性p Η，介於6 8至8 · 0之間； b) 將步驟a)之反應混合物加熱至6 〇。(；至7 5 °C，以使 樣本中之紅血球溶解及使白血球固定；及 -2- 本纸張尺度逍用中國國家揉準（CMS > A4規格（210X297公釐） --- ί - - - i -- --- —i tyl 1--- --- — - - -— - i m .— - -- - - - - -- (請先閲讀背面之注f項再填寫本頁) 448295 A8 B8 C8 DS 經濟部中央榇準局—工消费合作社印裝 六、申請專利範圍 C)將該反應混合物中之白血球的至少一部份染色，以 在懸浮液中產生被染色之白血球族群及未被染色之白 血球族群； 其中該水性試劑組合物中同時存在有非離子性界面活 性劑及離子性界面活性劑，因此對新鮮血樣及取出後 在室溫下儲存至少一天之陳化血樣，在步驟幻之後， 都可得到白血球差式計數結果。 6.根據申請專利範圍第5項之方法，其中該非離子性界 面活性劑之H L B值介於9 · 5至1 7,3之間。 7，根據申請專利範圍第6項之方法，其中該非離子性界 面活性劑之H L Β值介於9 _ 7至1 6 · 9之間。 8.根據申請專利範圍第1或5項之方法，其中該非離子性 聚乙氧酸酯界面活性劑係選自下列族群：直鏈脂族疏 水物經醚化為聚乙二醇；支鏈脂族或芳香族辛苯基疏 水物經醚化為聚乙二醇；直鏈脂族或芳香族壬苯基疏 水物經醚化為聚乙二醇；及直鏈脂族脂肪酸經酯化為 聚乙二酵。 9·根據申請專利範圍第8項之方法，其中該非離子性界 面活性劑直鏈脂族疏水物經醚化為聚乙二醇， 10. 根據申請專利範圍第9項之方法，其中該非離子性界 面活性劑為Brij⑧35 » 11. 根據申請專利範圍第8項之方法，其中該非離子性界 面活性劑支鍵脂族或芳香族辛苯基疏水物經謎化為聚 乙二醇。 -3- 本纸張尺度通用中國國家揉準（CNS ) M规格（21〇x297公嫠） ^^1 ^^1 —^1 .^ϋ III - n^i n^i h 士........1 - n In I -1" {請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 448295 經濟部中央揉準局員工消費合作社印袋 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍 12·根據申請專利範園第1 1項之方法，其中該非離子性界 面活性劑為Triton X®-1〇〇。 13.根據申請專利範圍第1或5項之方法，其中該非離子性 聚乙氧酸酯界面活性劑存在於步騾a)水性試劑組合物 中之量為0.09克/升至〇, 21克/升。 14，根據申請專利範圍第1或5項之方法，其中該非離子性 界面活性劑為陰離子性類。 15. 根據申請專利範園第14項之方法，其中該陰離予性界 面活性劑包括含1 0至1 6碳原子之硫酸烷酯之鹼金屬 鹽。 16. 根據申請專利範圍第15項之方法，其中該陰離子性界 面活性劑包括硫酸十二烷酯之鹼金屬鹽， 17. 根據申請專利範固第！ 6項之方法，其中該陰離子性界 面活性劑為硫酸十二垸醋鈉。 K根據中請專利範圍第項之方法，其中該離子性界 面活性劑為一種兩性離子性界面活性劑。 19.根據申請專利範園第18項之方法，其中該兩性離子性 界面活性劑為磺基甜菜鹼。 2α根據申請專利範園第19項之方法，丨中該項基甜菜驗 為十四基二甲基胺基丙燒項酸醋（TDAps)或癸基二甲 基胺基丙烷磺酸酯（DDAPS)。 21.根據申請專利範圍第1 8項之方法，甘a .. 1 , a a Λ夂力邊，其中菽兩性離子性 界面活性劑為一種膽酸之衍生物。 泣根據申請專利範圍第21項之方法，其中該膽酸之衍生 -4. 本紙張纽適用中固爾家梯準（CNS ) ( 21〇χ297<!^γ I I I I I -^裝— I 訂 11111〆 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 4482 9 5 AS B8 C8 D8 丙燒 申請專利範圍 物為3-[(3-氣醯胺丙基）二甲基胺基]·2_羥基 磺酸酯。 23. 根據申請專利範圍第14項之方法，其中該陰 兩性離子界面活性劑存在於步驟3)試劑組合物中之^ 為0.050克/升至0.125克/升。 24. 根據申請專利範圍第α之方法，其中該陰離子性或 兩性離子界面活性劑存在於步驟a )試劑組合物中之量 為0.050克/升至0.125克/升。 25. 根據申請專利範圍第1或5項之方法，其中步驟〇水 性試劑組合物進一步包括一種多價金屬離子之螯合劑 〇 26. 根據申請專利範園第2 5項之方法，其中多價金屬離子 誓合劑 EDTA ; EGTA; EDTA或EGTA之鈉鹽；eDTA 或EGTA之三鈉鹽；或四鈉鹽，其濃度為i τπΜ至5 mM。 27. 根據申請專利範圍第！或5項之方法，其中步驟& )水 性試劑組合物進一步包括一種氣化鹼金屬鹽。 28. 根據申請專利範固第27項之方法，其中該步驟y水 性試劑組合物中之氣化鹼金屬鹽係選自由NaC卜KC1 和LiCl所組成之族群。 汶根據申請專利範園第28項之方法，其中該鹽係Naci ’其存在於該試劑組合物中之量為6.8 mM至10.3 m Μ。 3〇.根據申請專利範園第1或5項之方法，其中甲醛存在於 本紙張尺度適用中a si家橾车（CNS)从祕（2l Q χ 297公羡） (請先閲讀背面之注項再填寫本頁)

   經濟部t央標準局貝工消費合作社印製 448295 A8 B8 C8 ___D8 六、申請專利範圍 該試劑组合物中之濃度為52克/升至58克/升。 31，根據申請專利範園第丨或5項之方法，其中該緩衝劑或 緩衝劑混合物保持該水性試劑組合物之p H介於7 〇至 7.4之間。 32. 根據申請專利範圍第！或5項之方法’其中該緩衝劑包 括Na2HP〇4和NaH2P〇4之緩衝劑混合物。 33. 根據申請專利範園第1或5項之方法，其中該染色步碌 涉及具過乳化酶活性之白血球之過氧化酶染色。 34. 根據申請專利範園第33項之方法，其中該染色步驟包 括將s亥反應混合物很快的與過氧化氫和色原質混合。 35. 根據申請專利範園第34項之方法，其中該色原質為 4 -氯-1 -奈酚。 36. 根據申請專利範圍第1或5項之方法’其中該糖和糖醇 係選自由蔗糖、果糖、葡萄糖、葡萄糖醇和甘露糖醇 所组成之族群。 37. 根據申請專利範目第36項之方法，其中該糖醇係葡萄糖 醇。 38_根據申請專利範固第3 7項之方&，其中該葡萄糖醇存 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 在於步騾a)試劑组合物中之量為i 1〇克/升至丨2〇克/升 〇 39. 根據申請專利範圍第丨或5項之方法，其進一步包括將 步驟<染色及未染色白血球懸浮液通過一個電子光學 系統，及得到懸浮液中白血球之差式計數。 40. 根據中請專利範圍第39項之方法，其’中該步驟係 -6- 448295 A8 B3 C8 D8 六、申請專利範圍 動化血液學分析儀之反應室中進行。 41. 根據申請專利範圍第4〇項之方法，其在進行差式計數 方法之步驟a)至c)後，進一步包括步驟d)，以水性潤 洗試劑組合物潤洗該自動化分析儀之反應室，該水性 满洗試劑組合物包括非溶血性非離子性界面活性劑， 其為環氧乙烷和環氧丙烷之共聚物，較佳的分子量為 950至8000聚氧丙烯和10%至80%聚氧乙烯。 42. 根據申請專利範圍第4 1項之方法，其中該潤洗試劑组 合物所含之界面活性劑為普魯羅（Plur〇nic)類之一員 〇 43. 根據中請專利範圍第4 2項之方法，其中該普魯羅為 Pluronic P105。 44. 根據申請專利範園第4丨項之方法，其中該潤洗試劑组 合物進一步包括一或多種下列成份：一種氣化鹼金屬 鹽，選自由NaCl、KC1和LiCl所组成之族群；一種抗 菌化合物，選自由 Proclin 150，Proclin 300，Germall 115，Dowacil 200和Bronopol所組成之族群；—種抗氧 化化合物’選自3，3，-硫二丙酸，3，3，-二硫乙酸， Tro：l〇xTM4維生素E，BHT或 2，6-二第三丁基 _4-甲基盼’ BHA或2 -第三丁基-4 -甲氧基紛，及MEHQ 或·甲氧基酚；及一種緩衝劑或緩衝劑混合物以維持 該水性潤洗组合物之p Η在6.9至7.6。 45. 根據申請專利範圍第4 1項之方法’其中該水性潤洗試 劑組合物具有渗透性介於28 5 m〇smol/kg至305 本紙張尺度適用中國國家搮丰（CNS )八4说格（210XM7公釐） ---------- '裝-- (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) <1T 經濟部中央揉率局負工消費合作社印裝 5 9 2 8 4 Δ 8 8 8 8 ABCD 經濟部t央橾準局貝工消費合作社印装 〜、申請專利範圍 mOsmol/kg。 46·根據申請專利範園第料項之方法，其中該潤洗試劑组合 物包括NaCl ’ Proclin 150，3，3，-硫二丙酸及一種緩衝 劑或缓衝劑混合物以維持該水性潤洗組合物之P Η在 7.0至7.5 。 47. 根據申請專利範圍第4 6項之方法，其中在該潤洗試劑 組合物中，NaCl存在之濃度為7.40克/升至8.0克/升 ’ Proclin 150存在之濃度為0 25毫升/升至0 6〇毫升/ 升’及3 ’ 3，·硫二丙酸存在之濃度為50毫克/升至 150毫克/升。 48. —種用於對全血樣進行白血球差式計數及亞群分析之 改良試劑組合物’該差式計數之基礎為測定該樣本中 白血球亞群之内過氧化酶活性，其水性混合物包括下 列成份： (a) —種非離子性聚乙氧酸酯界面活性劑，其濃度可 有效溶解紅血球以釋出血紅素但不溶解樣本中之白血 球族群； (b )—種陰離子性或兩性離子性界面活性劑，其濃度 可有效溶解紅血球以釋出血紅素但不溶解樣本中之白 血球族群； (〇 —種糖或糖醇，其濃度可有效增加樣本中淋巴球 之可偵測性； (d)甲醛或三聚甲醛，其濃度可有效地將白血球交聯 但不將樣本中可溶解之紅血球交聯；及 -8- 本纸張尺度適用1^國因( CNS ) ( 210X297公羞） " ^^^1 .^1^1 ^^^1 1^1 ^—a^i —Λ --- - Ε fgJ (請先閔讀背面之注意事項再填寫本頁) 4482 9 5 Λ8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 (e)—種緩衝劑或缓衝劑混合物，以維持該試劑混合 物之pH介於6.8至8,0之間。 I 1^1 ^^1 ^^1 ^^1 ^^1 ^^1 I ar. 士RHI HI i an 1 - m 、-B {請先H讀背面之注意Ϋ項再填寫本頁) 49.根據申請專利範圍第4 8項之组合物，其中該非離子性 界面活性劑具有親水性親脂性平衡或H L B值介於9.3 至1 7.3之間。 50‘根據申請專利範圍第4 9項之組合物，其中該非離子性 界面活性劑之H L Β值介於9 · 7至1 6.9之間。 51. 根據申請專利範圍第4 8項之组合物，其進一步包括— 種多價金屬離子之螯合劑。 52. —種在全血樣白血球差式計數及亞群分析中用來溶解 紅血球及染色淋巴球之改良試劑組合物，該差式計數 之基礎為測定該血樣中淋巴球亞群之内過氧化酶活性 ’其水性混合物包括下列成份： (a) —種非離子性聚乙氧酸酯界面活性劑，其具有親 水性親脂性平衡或H L B值介於9.3至1 7.5之間，濃度 可有效溶解紅血球以釋出血紅素但不溶解樣本中之白 血球族群； (b) —種陰離子性或兩性離子性界面活性劑，其濃度 經濟部中央標準局負工消費合作社印装 可有效落解紅血球以释出血紅素但不溶解樣本中之白 血球族群； (e)—種糖或糖醇，其濃度可有效增加樣本中淋巴球 之可偵測性； (d)甲趁或三聚甲醛，其濃度可有效地將白血球交聯 但不将樣本中可溶解之紅血球交聯；及 -9- 本紙法纽適财_210X297^*) 4 4 8 2 9 5 as B8 C8 _____D8 六、申請專利範圍 (e) —種緩衝劑或緩衝劑混合物，以維持該試劑混合 物之pH介於6.8至8.0之間。 53. 根據申請專利範固第4 8或5 2項之組合物，其中該非 離子性聚乙氧酸酯界面活性劑係選自下列族群：直鏈 脂族疏水物經醚化為聚乙二醇；支鏈脂族或芳香族辛 苯基疏水物經醚化為聚乙二醇；直鏈脂族或芳香族壬 苯基疏水物經醚化為聚乙二醇；及直鏈脂族脂肪酸經 酯化為聚乙二醇。 54. 根據申請專利範園第5 3項之組合物，其中該非離子性 界面活性劑直鏈脂族疏水物經醚化為聚乙二醇。 55·根據申請專利範圍第5 4項之组合物，其中該非離子性 界面活性劑為Brij® 35。 56.根據申清專利範圍弟5 3項之組合物，其中該非離子性 界面活性劑為支鏈脂族或芳香族疏水物經隨化為聚乙 二醇。 57_根據申請專利範園弟5 6項之组合物，其中該非離子性 界面活性劑為Triton X®-1 〇〇。 經濟部中央樣準局貝工消費合作社印装 ---------ί------ir (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 58. 根據申請專利範園第料或52項之組合物，其中該非離子 性聚乙氧酸酯界面活性劑存在於組合物中之量為〇 〇 9 克/升至0.20克/升。 59. 根據申請專利範圍第4 8或5 2項之組合物，其中該非 離子性界面活性劑為陰離子性界面活性劑。 6〇.根據申請專利範固第5 9項之組合物，其中該陰離子性 界面活性劑包括含1 〇至丨6碳原子之硫酸烷酯之鹼金 10- 本紙法尺度適用_國國家梯準（CNS ) ( 2丨0X297公釐) 一 --- ABCD .448295 六、申請專利範圍 屬鹽。 i - - tit i nn l^aJ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 61. 根據申請專利範固第6〇項之組合物，其中該陰離子性 界面活性劑包括硫酸十二烷酯之鹼金屬鹽。 62. 根據申請專利範圍第61項之組合物，其中該陰離子性 界面活性劑為硫酸十二烷酯鈉。 63. 根據申請專利範園第4 8或5 2項之组合物，其中該離 子性界面活性劑為—種兩性離子性界面活性劑。 64. 根據申請專利範園第63項之組合物，其中該兩性離子 性界面活性劑為磺基甜菜鹼。 65. 根據申請專利範圍第6 4項之組合物，其中該磺基甜菜 驗為十四基二甲基胺基丙烷磺酸酯（TDAPS)或癸基二 甲基胺基丙虎績酸酯（DDAPS) = 66. 根據申請專利範圍第6 3項之組合物，其中該兩性離子 性界面活性劑為一種膽酸之衍生物。 67-根據申請專利範園第6 6項之組合物，其中該膽酸之衍 生物為3-[(3 -氣醯胺丙基）二甲基胺基]_2_羥基-卜丙 烷磺酸酯》 經濟部中央標準局員工消費合作杜印装 68. 根據申請專利範圍第4 8或5 2項之组合物，其中該陰 離子性或兩性離子界面活性劑存在於組合物中之量為 0.050克/升至0.125克/升。 69. 根據申清專利知圍第4 8或5 2項之组合物，其進一步 包括一種氣化絵金屬鹽。 70·根據申請專利範圍第69項之組合物，其中該氣化驗金 屬鹽係選自由NaC卜KC1和LiCl所組成之族群。 -11 - 本k張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4说格（210X297公釐） —' 一^ 4482 95 A8 B8 C8 D8 經濟部央標率局貞工消費合作社印製 六、申請專利範圍 71. 根據申請專利範圍第70項之組合物，其中該鹽係 NaCl ’其存在於截試劑組合物中之量為68讯“至 10.3 m Μ ° 72. 根據申請專利範圍第48或52項之組合物，其中甲嗤 存在於該組合物中之濃度為52克/升至58克/升。 73. 根據申請專利範圍第49或52項之组合物，其中該緩 衝劑包括Na2HP〇4和NaH2P〇4之緩衝劑混合物。 74_根據申請專利範圍第4 8或5 2項之組合物，其中該糖 和糖醇係選自由蔗糖、果糖、葡萄糖、葡萄糖醇和甘 露糖醇所組成之族群。 75. 根據申請專利範圍第7 4項之組合物，其中該糖酵係葡 萄糖醇。 76. 根據申請專利範圍第7 5項之組合物，其中該葡萄糖醇 存在於组合物中之量為110克/升至120克/升。 77. 根據中請專利範圍第4 8或5 2項之組合物，其進_步 包括一種多價金屬離子之螯合劑。 78‘根據申請專利範圍第7 7項之組合物，其中該多價金屬 離子螯合劑為EDTA; EGTA; EDTA或EGTA之二鈉鹽； EDTA或EGTA之三鈉鹽；或EDTA或EGTA之四#5鹽 〇 79. 根據申請專利範圍第7 8項之組合物，其中該多價金屬 離子螯合劑為EDTA或EGTA之二鈉鹽，其存在濃度 為 1 mM至5 mM。 80. 根據申請專利範圍第I項或第5項之方法，其中該緩衝 -12- 本紙張尺度逍用中國國家揉準（CNS > A4規格（2〗0X297公釐） I - - I - - - - - f. =. - I —^1 I--^ (請先聞讀背面之注$項再填寫本頁) A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 劑或緩衝齊Π昆合物維㈣水性反應肩組合物之0在 6,9至7,6之間。 81. 根據申請專利範圍第48項或第52項之組合物，其中 該緩衝劑或緩衝劑混合物維持該水性反應劑組合物之 pH在6.9至7.6之間。 82. —種決定白血球細胞差別計數及含有紅血球及白血球 之全血血樣中子群偵測之改進方法，此中並利用過氧 化酶染色及自動化血液學分析儀進行，此改善方法包 括： a) 混合血樣與水性試劑組合物以形成試劑混合物，該 試劑組合物包括：（i)非離子聚乙氧化界面活性劑，其 濃度可有效溶解紅血球釋出血紅素，但不會溶解該樣 品中之白血球細胞族群；（ii)陰離子或兩性離子類之離 子化界面活性劑，其濃度可有效溶解該紅血球，但不 溶解該樣品中之白血球細胞族群；（Hi)甲駿或三聚甲 链’其濃度可有效地化學交聯該白血球，但不會交聯 樣品中該可溶解之紅血球；（i v)糖或糖醇，其濃度可有 效增加樣品中淋巴細胞之可偵測度；及（v)緩衝物質或 經濟部中央榡率局貝工消費合作杜印袋 n m (請先Mti背面之注意事項再填寫本頁) 緩衝物質混合物以維持反應混合物之pH在中性或近中 性： b) 加熱a)步騾之反應混合物至60°C至75°C溫度，由是 該血樣中之紅血球可被溶解’而白企球被固定；及 c) 將反應混合物中至少部份白血球細胞染色，以生成 經染色之白血球細胞族群及未經染色之白血球族群於 -13- 用中國國家橾準（CNS)A4規格（210X297公釐） 4Λ82 9 5 A8 B8 C8 D8 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印策 六、申請專利範圍 懸液中；其中存在於水性試劑混合物中之非離子界面 活性劑及離予性界面活性劑，依循幻步騾可針對新鮮 血樣及老化之血樣提供正確及可信賴之白血球細胞差 別計數結果，其中老化之血樣係在室溫下貯放至少抽 後一天之久； d) 將步騾0之經染色及未染色之白血球細胞懸液通過 光電偵測系統並得到懸液中白血球細胞之差別白血球 細胞計數；及 e) 以水性沖洗試劑組合物沖洗該自動化分析儀以移去 在進行白血球血樣分析後累積在系統硬體部份及其元 件中之血樣及試劑混合物，該水性沖洗試劑溶液在摻 合物中含有：i)非溶血性及非離子性界面活性劑，其為 環氧乙fe及環氧丙烷多元醇終止在第一巍基之嵌段共 水物’其中環乳乙垸在該界面活性劑分子中之重量百 分率為由10至80% ;且該界面活性劑分子具有由95〇 至8000克/莫耳之分子量；及Η)緩衝物質或其混合物 以維持該沖洗試劑組合物在生理ρ Η值下。 83. 根據申請專利範園第82項之方法，其中a)步驟之試劑 組合物中之非離子性界面活性劑為直鏈脂族疏水物鼓 化至聚乙二醇上。 84. 根據申凊專利範園第8 3項之方法’其中該非離子性界 面活性劑是Brij® 3 5。 85. 根據申凊專利範園第8 2項之方法，其中該a)步驟試劑 组合物之陰離子界面活性劑包括含有由1〇至16個碳原 -14- 本紙張；ut逋用中國si家標齡297公產） I n I I I— n m n », tl n n I I I T 03-e (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 182 9 5 5» C8 D8六、申請專利範圍 經濟部中央捸準局貞工消費合作社印¾ 子之硫酸姨•酯之驗金屬鹽。 86. 根據申請專利範圍第8 5項之方法 活性劑包括疏酸十二酯之驗金屬鹽 87. 根據申請專利範圍第8 6項之方法 活性劑是硫酸十二酯鈉。 88. 根據申請專利範圍第8 2項之方法 活性劑於_a)步驟試劑组合物中之含量為〇 〇 9至〇 2 i克/ 升。 89. 根據申請專利範圍第82項之方法，其中該陰離子或兩 性離子界面活性劑於a)步驟試劑組合物中之含量為 0.050 至 0. 125 克/升。 90. 根據申請專利範圍第S2項之方法，其中甲醛於a)步驟 試劑組合物中之含量為由52至58克/升·> 91. 根據申請專利範園第82項之方法’其中a)步驟試劑組 合物進一步含有鹼金屬氣化物，選自NaCi、KC1及 LiCl。 92. 根據申請專利範圍第9 1項之方法，其中該鹽是N & c ^， 且於試劑中之含量為由6,8 mM至10.3 mM。 91根據申請專利範圍第82項之方法，其中該緩衝物質或 其混合物可維持a)步驟之試劑溶液p H值在7 〇至7 5 間。 94_根據申請專利範圍第Η項之方法，其中a)步驟試劑中 之緩衝物質包括Na2HP〇4 ’ NaH2P〇4或其混合物。 95.根據申請專利範圍第82項之方法，其中a)步驟試劑組 其中该陰離子界面 其中該陰離子界面 其中該非離子界面 (請先閎讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· -訂 • 15- 私紙張適用中國固家揉準（CNS ) A4規養（210X297公釐） d4B295 A8 B8 C8 D8 經濟部中央橾隼局貝工消費合作社印装 六、申請專利範圍 &物進一步包括多價硬體離予之整合物，選自下列包 括EDTA、EGTA、及EDTA或EGTA之二、三或四納。 96·根據申请專利範圍第9 5項之方法’其中該硬體離子螯 合物於該試劑組合物中之濃度為1 mM至5 mM。 97. 根據申請專利範圍第8 2項之方法，其中該d)步驟染色 涉及過氧化酶活性白血球之過氧化酶染色，係以過氧 化氮及色原快速混合該反應混合物。 98. 根據申請專利範圍第97項之方法，其中該色原是扣氯· 1 -審齡。 99·根據申請專利範園第μ項之方法，其中a)步驟之試劑 組合物進一步包括以山梨糖醇為該糖醇，其在試劑組 合物中之濃度為由110.0克/升至12〇 〇克/升。 1〇〇_根據申請專利範圍第S2項之方法，其中該勾步騾沖洗 中之界面活性劑係選自Pluronic P84，P85，Pi〇3， P105及P123 。 101.根據申請專利範圍第1〇〇項之方法，其中該步驟沖洗 中之界面活性劑為p 1 〇 5。 1〇2_根據申請專利範圍第S2項之方法，其進一步在^步锦 之沖洗試劑組合物中包括驗金屬鹽。 1〇3,根據申請專利範圍第1〇2項之方法，其中於e)步驟該沖 洗試劑组合物中之鹼金屬氣化物鹽ANaC1、Kcl碑 LiCl 。 ^ 104.根據申請專利範圍第103項之方法，其中該鹼金 物是NaCl。 -16- 本紙張適用t國®家揉率（CNS ) A4洗格（210X297公釐） I- a^i —^1-----I i m ί τ (锖先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) A4B295

   '申請專利範圍 1〇5,根據申請專利範圍第g 2項之方法，其中該e)步驟沖洗 試劑組合物進一步含有抗菌化合物，選自下列包括 Proclin 150、Proclin 300、Germall 115、Dowacil 2 0 0 及 B r ο η ο p ο 1 ° 106. 根據申請專利範圍第8 2項之方法，其中e)步驟之沖洗 試劑组合物進一步含有抗氧化劑，選自下列包括3,3, _ 硫二丙酸' 3，3 ’ -二硫醋酸、T r ο 1 〇 jt tm或水溶性維生素 E、BHT或2,6-二-第三、丁基-4-甲基酚，BHA或2-第三、丁基-4 -甲氧基酚，及1^£只(3或(〇 -甲氧基酚。 107. 根據申請專利範圍第82項之方法，其中e)步驟沖洗試 劑組合物具有由285m Osmol /公斤至305m 〇sm〇i /公 斤之滲透度，且進一步其中該緩衝物質維持由6.8至 7.6之p Η值。 108. 根據申請專利範圍第8 2項之方法，其中e )步驟沖洗試 劑组合物中的缓衝物質或緩衝物質混合物維持由6 9至 7.5之pH值》 - - - I ^^^1 I 1^1 0¾-55 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標隼局員工消費合作社印装 本纸張尺度適用中國國家揉準（CNS ) A4洗格（210X297公釐）