TW528802B

TW528802B - Modified thermostable DNA polymerase

Info

Publication number: TW528802B
Application number: TW086110793A
Authority: TW
Inventors: David Harrow Gelfand; Lisa Vivian Kalman; Fred Lawrence Reichert
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1996-08-06
Filing date: 1997-07-29
Publication date: 2003-04-21
Also published as: CN1154733C; EP0823479B1; HUP9701341A3; IL121441A0; IL121441A; JP3170229B2; BR9704260B1; HUP9701341A2; DK0823479T3; CA2210951C; KR100510619B1; CA2210951A1; AU3319797A; RU2235773C2; ES2227640T3; CZ229997A3; CN1177640A; DE69730926T2; JPH1066588A; BR9704260A

Description

528802 A7 B7 五、發明説明（1 ) 發明範圍本發明係關於可提昇核糖核甞三磷酸引進效率之熱穩定性DNA聚合酶。本發明提供分離此聚合酶的方法。本發明酵素在很多應用方面都很有幫助，特別是核酸定序的應用。因此本發明同時提供核酸定序分析之改良方法。發明背景 DNA定序一般而言，是產生4組單股DNA片段，這些 DN A片段中，有一端點爲相同的，另一端點則不同，這些不同端點一般終止於特定核甞酸基（鳥嘌呤（G)，腺嘌呤（A) 胸腺喊p定（T)，或胞p密淀（C)。這四組不同片段，根據長度的差異，可以將它們分離，分離的方式是使用高解析能力的聚丙醯胺膠體，因此可確認序列的位置。最常使用的DNA定序法是二去氧或鏈鎖終止定序法，該法可產生一股酵素合成的DNA( Sanger等人；1997，Proc. Natl. Acad. Sci. 74:5463)。一般進行四種不同的合成，每個反應會終止於特定鹼基（G, A，T，or C)，主要是經由特定鏈鎖終止核苷酸的引進，譬如二去氧核苷酸。由於每行列僅相對應於G，A，T或C中的一種，因此，反應產物很容判讀。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在二去氧鏈鎖終止反應中，一短的單股引子結合於單股模板上◦引子的3 '端，藉加入去氧核苷酸（dNTPs)而延長，直到二去氧核苷酸（ddNTP)的加入爲止。當一ddNTP加入時，延長反應即停止於該鹼基。然而，爲了確保DNA複製的準確性，DNA聚合酶有強烈的偏好於加入它們的正常 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 528802 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（2 ) 受質，如dNTPs，並且排斥核^:酸類似物的加入，此類似物稱之爲特殊核：y：酸。在dnA合成的例子中，核糖核:y：酸 (rNTPs) ’可視爲特殊核芬酸，因爲就如同ddNTPs，rNTPs 並非DNA聚合酶的正常活體内受質。在細胞中，此性質會減緩不正常驗基，如去氧纖維核菩三嶙酸（dITp)，或 rNTPs，進入成長中的的DNA股。兩種常用的自動定序法爲引子染色及終結子染色定序法。這些方法適合螢光標定的基團使用，雖然，也可以用同位素標定的基團進行定序，但是，以螢光方式的定序法已越來越受歡迎。簡言之，在引子染色定序法中，螢光標定的引子與未標定的ddNTPs結合使用，此方法需要四個合成反應’以及四行列電泳膠體的凹槽遒進行定序（每行列相對應於一種鹼基專一性終止反應之產物）。引子展延後，含有引進二去氧核甞酸之終止反應產物之定序反應混· 合物’以一般的DN A定序膠體進行電泳分析。經電泳分離後’以雷射’從膠體的底部激發螢光標定的產物，並且以適當的監視器偵測螢光。在自動分析系統中，檢測器會在電泳的過程中，掃描膠體的底部，偵測是否有任何含螢光的基團，從反應混合物中通過此膠體（Smith等人，1986, Nature 121:674-679)。在修飾過後的方法中，使用四種不同的螢光標籤（marker)來標定四種引子，當四個分別的定序反應完成後’將所有的反應混合物放在一起，且將此混合後的反應混合物，置於一列凹槽中，進行電泳膠體分析，結果，不同螢光標籤可以分別的被檢測出來（每一個 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） ----5---^---裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 囔 528802 A7 B7 五、發明説明（3 ) 螢光代表四種不同鹼基專一性終止反應之產物中之一種）。另外，也可使用終子染色定序法，在此方法中，DNA聚合酶通常將dNTPs及螢光標定的ddNTPs加入DNA引子的成長端（Lee等人，1992, Nucleic Acid Research 尬:2471)，此方法的優點是：不需要合成螢光標定的引子，此外，終子染色反應更是方便，可以將四種反應，在同一管子中進行，經修飾的熱穩定性DNA聚合酶，如先前所述，可以降低對ddNTPs的分辨力（參考歐洲專利申請編號EP-A-65 5,506及美國專利申請序號08/448,223)。一種經修飾之熱穩定性DNA聚合酶之實例爲T. aquaticus嗜溫菌之DNA聚合酶之突變型，該突變型稱之爲F667YTaqDNA聚合酶突變型，主要是將原來第667位置的酪胺酸改變成苯胺基丙酸。由 Hoffmann-La Roche 製備，且經由 Perkin Elmer 行銷的AmpliTaq® FS可減少標的物於有效核酸序列分析時對 ddNTP 之需求量 100 至 1，000 倍，AmpliTaq⑥ FS 爲 T. aquaticus之DNA聚合酶之突變型，該突變型中不僅有 F667Y之突變，而且其第46位置之天門冬胺酸（爲甘胺酸所取代；G46D突變）。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 熱穩定性DN A聚合酶有一項需求爲：可以改變核酸合成法的準確性及用量，並且可以使核酸DNA序列分析更有效率。最好能夠有一種不需要使用二去氧核甞的螢光方法。本發明即針對這些需求進行探討。發明摘要 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 528802 A7 B7 五、發明説明（4 ) 本發明提供含有SerGlnlleXaaLeuArgXaa(序列編號：1 ) 胺基酸序列之模版依賴型（template-dependent)熱穩定性 DNA聚合酶，其中此序列之第4個胺基酸nXaan可爲任何一種胺基酸，但不可爲麩胺酸（Glu)，且此序列之第7個胺基酸纈胺酸（Val)或異白胺酸（lie)，若以單一字母碼來表示此序列，可以改爲S Q I X L R V/I來表達，其中第4 個位置X可爲任何胺基酸，但不可爲麩胺酸。含有上述胺基酸序列，且第4個胺基酸不是麩胺酸之熱穩定性DNA聚合酶，與先前已知的熱穩定性DNA聚合酶相比，可以降低排斥核糖核甞酸引進的辨認力。因此，首要特點，本發明之新酵素可將特殊的鹼基類似物，例如核糖核甞酸，以比先前已知之熱穩定性DNA聚合酶，超過數次方的效率，加入DNA之成長股中。本發明同時還提供編碼這些酵素之基因，以及重組表現載體（recombinant expression vectors)與含有這些載體的宿主細胞（host cells)。從這些轉形的 (transformed)宿主細胞，可純化出大量的熱穩定性聚合酶酵素。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在本發明中，已確認出熱穩定性DNA聚合酶之胺基酸序列中之一個區域（region)或序列段（sequence motif)，可提升聚合酶加入核糖核甞酸的能力，並保留其正確加入去氧核糖核嘗酸（deoxyribonucleotides)的能力。將此區域加入改變，例如，改變一個或更多的胺基酸（如，點專一性突變 (site specific mutagenesis)，則此熱穩定性聚合酶便可在 DNA模版上合成RNA或RNA/DNA之鑲嵌（chimeric)或交合 -7- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210X297公釐） 528802 五、發明説明（5 ) (hybrid)股。 ”特:沾本發明提供對標的核酸定序的改良方法及、、且口物，其中將鏈鎖終止反應所需之ddNTPs刪除。經由此改良良方法，核糖核甞酸（rNTPs)加入引子所延展的產物中口爲此酵素可以準確，且有效率地將rNTPs或dNTPs加入’所以定序反應中可使用兩種核苷酸的混合物。引子延反f後，依據先前技藝已知的方法譬如，水解反應，可將新口成的寡核苷酸（〇lig〇nucle〇tide)產物，從rNTps的位置切斷’因而形成一群片斷，可用傳統方法，譬如膠體電泳 (gel electrophoresis)進行分離與定序分析。因此，本發明亦棱供使用此新熱穩定性DNA聚合酶酵素之方法，本發明的此特點乃提供含有特定序列SerGlnIleXaaLeuArgXaa(序列編唬· 1 )之熱穩定性DNA聚合酶，其中第4個位置，可為任何一種胺基酸，但是不可爲麩胺酸（Glu)，且第7個位置之” Xaa，’爲纈胺酸（Val)或異白胺酸⑴勾。經濟部中央標準員工消費合作社印製本I明的另一項特點是，此經修飾之聚合酶提供一些方法，可加入核糖核苷酸或第2個位置含有羥基或其他取代基的頜似物。這些取代基是一般去氧核糖核甞酸所沒有的:這些核苷酸可經不同的標定，提供不同於一般使用二去氧核糖核苷酸於DNA定序之應用。本發明之突變型熱穩定性聚合酶之特性爲：比野生型 (JvilcMype)酵素能更有效率的引進特殊的核甞酸，特別疋，核糖核苷酸。在本發明較佳具體實施例中，此被引進的特殊核苷酸可爲鏈終止鹼基類似物（chain_terminating ------- --- _ 8 - 本紙張尺度適;( CNS-) 528802 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 Β7 五、發明説明（6 ) base analogue)，例如：2’-羥基-3,去氧ATP[可待西潘三嶙酸；（cordycepin triphosphate)]，爲 ATP 之，，核黃素終子，， (riboterminator)類似物，或非鏈終止核：y：酸（non-chainterminating nucleotide) ，如 rNTP 〇本發明的另一項特點爲：所提供的突變型熱穩定性聚合酶酵素，與其相對的野生型酵素相比，其特性爲：能更有效的引進特殊核苷酸，特定言之，核糖核甞酸。因此本發明的此項特點爲：提供重組的熱穩定性DNA聚合酶酵素，該酵素的特性⑷其天然型（native f〇rm)聚合酶含有 SerGlnlleGlu LeuArgXaa(序列編號：2 )胺基酸序列，其中第7個位置之”xaa”爲纈胺酸或異白胺酸;(…重組酵素之此胺基酸序列產生突變，較好是此序列的第4個胺基酸位置，因此第4位置之麩胺酸可變成其它的胺基酸，較好爲甘胺酸，且（c)此重組酵素與天然型相比能夠降低排斥核· 糖核苷酸及核糖核苷酸類似物引進的辨別力。本發明聚合酶之另一項特點爲：提供一種便利的方法，將已經擴增之產物及引子延展之產物斷裂，這些斷裂的產物可適用於雜交法（hybridization-based methodologies)，以及其它各種序列檢測的方法。本裔明的酵素與編碼這些酵素的基因，可作爲DNA定序 ^應時，所使用的組合物，該定序反應包括有：傳統之核菩酸之混合物與至少一種核糖核替酸或核糖核苷酸類似物。本發明之較具體實例爲：此特殊核甞酸爲核糖核菩酸，且核糖核苷酸的濃度低於其它的去氧核糖核苷酸之濃士紙張 ) A4 規格 ----!---1---裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 、訂 528802 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（7 ) 度，譬如，rNTP:dNTP之比例爲1:1或更少。本發明的酵素也可商品化爲套組（kit)，該套組還可包括其它核酸序列分析反應所需要的成分，譬如：dNTPs，rNTPs，缓衝溶液 (buffer)，且或引子。本發明之詳細説明本發明提供一種新的且改良過的經修飾之熱穩定性DNa 聚合酶’組合物與反應組，這些產物和進行申請的專利範圍項目，所界定的相同，本發明的酵素與先前已知的聚合酶，或衍生出本酵素之野生型聚合酶相比，能更有效率的引進特殊的核芬二鱗酸。並且亦提供解碼產生這些經修飾之酵素之DNA序列，表現此經修飾之酵素之質體，以及已經接受這些質體轉移的細胞。本發明酵素能夠使用於一種比先前技藝已知的DNA定序法更爲優良的新DNA定序法。爲了使本發明更容易了解，一些專有名詞的定義如下。當核酸基提到” 一般的”一詞，是指核苷三磷酸，或者存在於自然界之聚核苷酸（polynucleotide)中之核苷酸（譬如，以DNA而言，這些核：y：爲dATP，dGTP，dCTP及dTTP)。另外’在體外DNA合成反應，譬如··定序，c7dGTP與dITP常用來取代dGTP。總言之，這些所指的爲去氧核醣核菩三磷酸（dNTPs)。 M表現系統’’ 一詞，是指含有欲解碼之序列及與操作相關的調控序列之DNA序列，因此，經過這些序列轉形的宿主能產生解碼的蛋白質。爲了讓轉形作用更有效，表現系統可能包含於質體中，然而，相關的DNA也可能嵌入宿主的 ----J------裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 -10-

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 528802 A7 --.B7 五、發明説明（8 染色體（chromosome)中。 ”基因π —詞乃是指一段DNA序列，含有可產生一種可回收的（recoverable)且具有生物活性之多胜肽或前驅物所必需之調控與解碼序列。此多胜肽可由全長（fuU-length)的基因序列解碼產生’或只要保持酵素活性之任何部分之解碼序歹丨J (coding sequence) 0 ’’宿主細胞’’ 一詞，乃是指原核（pr〇kary〇te)單細胞與眞核 (eukaryote)細胞兩者；譬如··細菌、酵母菌、放線菌 (actinomycetes)及經細胞培養之高等之植物或動物單細胞。 n DNA定序反應混合物” 一詞乃是指由dna定序反應所必需之成分之反應混合物。因此，此DNA定序反應混合物，可用於測定標的核酸序列之DNA定序法，雖然此反應混合物最初可能是不完整的，但也因爲如此，使用者可以控制定序反應最初的進行，以此種方式，一旦最後的成分，譬如：酵素，加入後，就成爲完整的DNA定序反應混合物，反應便開始進行。典型的DN Α定序反應須含有一種適合聚合酶活性的緩衝液，核：y：三磷酸，及至少一種特殊的核嘗。反應混合物也可能含有一種可令聚合酶在標的DnA序列上進行延展的引子，聚合酶以及標的核酸。不論是引子或任何一種核苷酸通常以一種可檢測的成分加以標定，譬如·螢光標定’通常，反應是一種含有4種一般的核甞酸及至少一種特殊的核甞酸之混合物。本發明之一較好具體實例爲··該聚合酶爲一種熱穩定性聚合酶，且該特殊核菩 -11 - 本紙張尺度賴巾關家轉（CNS ) A4規格（21GX297公董） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝·

-、1T 528802 A7 B7 五、發明説明（9 ) 酸爲核糖核甞酸。 ’’寡核甞酸，’一詞的定義爲含有2個以上的去氧核糖核甞酸或核糖核茹酸分子，較好大於3，且通常大於10。寡核苷酸的實際大小必須取決於許多因子，包括其最佳功能或寡核甞酸的使用。寡核苷酸可以任何合適的方法製備，包括：選殖與限制適當的序列，以及由Narang等人所發表的磷酸三酉旨 (phosphotriester)之直接化學合成法 Narang等人 1979，Meth. Enzvmol. 68:90-99; the phosphodiester method of Brown et 3l.，1979，Meth· Enzvmol.处_: 109-151 ;二乙基磷酸醯胺 (diethylphosphoramidite)法 Beaucage等人.，1981，Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 ;三酯法（triester method)，Matteucci 等人，1981，i. Am. Chem. Soc. 103:3 185-3 191 ;自動合成法 (automated synthesis methods);或固相支持法（solid support method)美國專利編號：4,458,066。經濟部中央標準局Θ貝工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 這裡所用的”引子”一詞是指一種寡核苷酸無論是天然的或合成的都可以，只要能夠在特定情況下，作爲合成的起始點，讓引子的延展開始進行。引子較好爲單股的寡去氧核糖核甞酸。引子的合適長度取決於想要使用的引子，但一般介於1 5至3 5個核荅酸短的引子分子通常需要較低的溫度，才能與模版形成有效的穩定交合複合體（hybrid complexes)。引子並不需要反應出正確的模版序列，但必須要能夠與模版有效的互補交合，使引子的延展能夠進行0 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 528802 五、發明説明（10 ) 如果需要，引子可藉由引進一稀π # t 搜可偵測的標纖加以標定，偵測的方式包括有：光譜學的，夹 ..t v 九化學的，生物化學的，免疫化學的或是化學的方法。例 #田AA搞，例如··常用的標纖包括：同位素32p，螢光染料，電子宓疮吧丁在度強化劑（electr〇n_ dense reagent)，酵素（如ELISAs常用的酵素），生物素 (biotin)，半抗體（hapten)及可以用抗血清（antisera)及單株抗體（monoclonal antibodies)辨認之蛋白質。 ’’熱穩定性聚合酶”一詞是指在高溫下維持穩定的酵素，此種酵素不僅可對抗高溫，且能維持有效的活性。當在可使雙股核酸分離的南溫下加入此酵素，仍可在隨後的引子延長反應中發生作用。和先前技藝—般，此熱穩定性聚合酶適用於溫度循環反應’譬如··聚合酶鏈鎖反^ (polymerase chain reaction; PCR)。對熱穩定性聚合酶而舌，其酵素活性是指以特定的方式，催化核甞酸的連接，· 產生引子延展的產物，該產物並與模版核酸的一股相互補。經濟部中央標準局員工消費合作社印製核酸分離的溫度條件必須取決於：譬如：緩衝液之鹽類濃度，組合物，及將被分離的核酸長度，但一般的範圍界於90°c至105°C，較好9(TC至l〇(TC，至於所需的時間，1 主要取決於溫度及核酸的長度，一般是從幾秒鐘至四分鐘。特殊的π或π經修飾π等詞是指核酸驗基，核苷三轉酸，或核嘗酸，包括一般核智:驗基之經修飾產物，衍生物或類似物，或自然界存在於DNA之核甞酸。更特別的是，如先 13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（2ΐ〇Χ297公釐 528802 A7 B7 11 五、發明説明（前技藝一般，與一般的dNTPs相比特殊的核甞酸的修飾位置，是在核醣的2，位置。因此，雖然對rna而言，其天然的核苷酸爲核糖核：y：酸譬如：ATP，GTP，CTP，UTP，總稱rNTPs)，但，因爲與dNTPs相比，這些核替酸的糖基2, 位置有輕基，因此與先前技藝一般，核糖核甞酸爲特殊核 ^酸。在2 ’位置具有取代基的核糖核芸酸類似物，譬如： 2 -氟_或2’-胺基取代類似物，均包括在本發明之内。此外’在3 ’位置經修飾的核糖核苷酸類似物，譬如··將正常的喪基以氫取代（3’去氧），可作爲一種核糖核甞酸類似物終子。這種核苷酸也屬於”特殊核苷酸"之範圍内。因爲DNA—般由dNTPs組成，所以引進rNTPs將是非常特殊，也因此，rNTP爲一種特殊鹼基。所以，在一項本發明較具代表性之實例中，對於DNA引子延長法，包括〇1^八定序法，其核酸產物將含有一般的與特殊的核甞酸，且以一· 般的核苷酸，dNTPs，爲主。特殊鹼基可以用螢光素（flu〇rescein)或若大明（rh〇“mine) 3等進行螢光標定；用生物素進行非螢光標定；用η?， 33P，35S等同位素進行同位素標定、或不需標定。爲了使本發明更容易被了解，將以獨特的熱穩定性DNA 聚合酶<特性作爲本發明的實例，然而，這些參考説明，並非想限制本發明，雖然，此新熱穩定性聚合酶，如前述’可用於需要此酵素活性之任何用途，但在本發明之 =體之代表實例中，本發明之熱穩定性酵素使用於各種不同的核酸定序法。本發明酵素亦可用於擴增反應本紙張尺度適用CNS )

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發明説明（. 經濟部中央標準局員工消費合作社印製特的序列段内，可對此序列之 ΛΛ ^ ^ 』艾^、匕位置乏胺基酸進行額外 ^飾，較好的胺基酸可選自越酸酿胺⑹瞻如叫⑽〇r Μ)。，白胺酸（Leucine; Leu or L)或精胺酸心 π 本發明可藉由對編碼熱穩定性DNA聚合酶《基因序列進仃特殊的修飾作用’製備出具有優良特性的熱穩定性DNA 聚合酶酵素。雖然非-嗜高溫（_-!!«)眞菌（eubacteria) 馬本，明範圍所涵蓋，詳述如下，但在本發明較具體之代表性實例中，此基因序列與受解碼的酵素是來自嗜高溫菌屬。與其他的同質性的酵素，譬如··塔可聚合酶 (Taq p〇lymerase)比較，若從此特定的獨特序列段之高度保留（c〇nserved)性質看來，可發現此新熱穩定性DNa聚合酶與其他的聚合酶間是相類似的。只要胺基酸序列中含有s Q ί X L R V/I序列之熱穩定性聚合酶均爲本發明範圍所涵· 盖’其中X可爲任何一種胺基酸，但不可爲越胺酸，且與天然型的Taq聚合酶相較，其胺基酸序列至少要有約39。/〇的整體相似性（overall homology)，較好約60%，最好約 80%，全長的Taq聚合酶序列由WO 89/06691所提供，且經 GENESEQ專利序列資料庫授權使用，其編號（accessi〇nN〇.) 爲P905 56，或EMBL序列資料庫的編號M26480與PIR序列資料庫之編號A33530。本發明之熱穩定性DNA聚合酶之實例爲下列表格1所列微生物之天然型聚合酶之重組（recombinant)衍生物。表格 1列出此獨特序列段之特別的序列及這些天然型聚合酶每 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 項再填* 裝· 訂嗦 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 528802 A7 ____B7 五、發明説明（14 ) 一個的X胺基酸所在的位置。因爲每一種熱穩定性DNA聚合酶是很特別的，所以每個酵素的獨特序列段之胺基酸位置互不相同。下列之聚合酶中，獨特的S Q J χ L R V/I序列中’ X位置之胺基酸爲麩胺酸。本發明之聚合酶較好之分子f範圍爲85,000至1〇5,〇〇〇，最好介於9〇, 〇〇〇至95, 〇〇〇之間。這些聚合酶之胺基酸序列由約75〇至95〇個胺基酸基所組成，較好介於800至850個胺基酸基之間。本發明之聚合酶也可由約540或更多的胺基酸組成，且至少包括聚合酶功能部位（domain)與一個相對於3，至5，外切核酸酶 (exonuclease)功能部位的部分（最終的聚合酶可能具3，至5，外切核酸酶活性，或沒有活性）及可能具5，至3，外切核酸酶功能邵位之邵分，該功能部位佔許多的全長熱穩定性聚合酶酵素之胺基酸序列之最初的三分之一部分。表格1所列之熱穩定性DNA聚合酶，一旦其胺基酸序列之獨特序列段或同源性序列段（consensus motif)被確認，則可以很谷易確認出要加以修飾的越胺酸。將被其它胺基酸取代的麩胺酸（G1U)，不論它是在熱穩定 DNA聚合酶内的那一個位置，一定座落於SerGlnIleGluLeu ArgXaa序列段内（序列編號：2)，其中此序列第7位置的 Xaa爲纈胺酸（Val)或異白胺酸（Ile)，並位於聚合酶功能部位’可以使此熱穩定性聚合酶能更有效地引進特殊的核菩酸。在一種較具代表性的實例中，麩胺酸可以由不帶電荷的極性燒基（uncharge(j polar R group)譬如：甘胺酸 (glycine)，絲胺酸（serine)，胱胺酸（CySteine)，穌胺酸 -17- 本紙張尺度適财麵家標準（CNS ) A4規格（21()><297公董） I-----L---^-裝------訂----- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 528802 A7 B7 五、發明説明（15 ) (threonine)等胺基酸取代，或由具有小的非極性燒基（small nonpolar R group)的胺基酸，如：丙胺酸（alanine)取代。最具代表性的實例中，則以甘胺酸（G)取代麩胺酸。胺基酸與核酸序列的配對程式（alignment programs)可從Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin (威斯康辛州，麥迪遜市，科學大道575號，遺傳電腦小組）獲得。透過此軟體，只要輸入此特定片段序列，由”GAP”， "BESTFIT1·及PILEUP等程式，可以協助確認要加以修飾之正確序列區域。經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 根據以下表格1的證據，嗜高溫微生物之熱穩定性DNA 聚合酶酵素之聚合酶功能部位内，很明顯，有二種保留型的 SerGlnlleGluLeuArgXaa(序列編號：2)序列段。SerGln IleGluLeuArgVal(序列編號：3 )序列段出現於嗜溫菌種的天然型熱穩定性聚合酶中，該菌種包括：水生棲熱菌 (Thermus aquaticus)，Thermus caldophilus，嗜熱棲熱菌 (Thermus thermophilus、，黃色棲熱菌(Thermus flavus)，與絲狀棲熱菌(Thermus filiformis)，及棲熱菌屬sps 17與Z05。 SerGlnlleGluLeuArgVal(序列編號：3 )序列段也出現於其它熱穩定性DNA聚合酶酵素之聚合酶功能部位内，這些酵素的來源有：Thermosipho africanus輿不同的桿菌(Bacillus、菌株，包括Bacillus caldotenax及嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Bacillus stearothermophilus) 0 SerGlnIleGluLeuArgIle(序歹丨J 編號：4)序歹1J 段出現於 Thermotoga maritima，Thermotoga neapolitanaKAnaerocellum thermophilum等之天然型熱穩定 -18 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐） 528802 A7 B7 五、發明説明（16 ) 性聚合酶。表格1 微生物胺基酸的麵:胺酸位置保留性序列段 S Q IX L R V/I Thermus aquaticus fTaa) S Q IE L R V 615 Thermus caldophilus (Tea) S Q IE L R V 617 Thermus thermophilus (Tth) S Q IE L R V 617 Thermus flavus (Tfl) S Q IE L R V 616 Thermus filiformis (Tfi) S Q IE L R V 613 Thermus specie spsl7 S Q IE L R V 613 Thermus specie Z05 S Q IE L R V 617 Thermotoga maritima (Tma) S Q IE L R I 678 Thermotoea neapolitana iTne) S Q IE L R I 678 Thermosipho africanus (Taf) S Q IE L R V 677 Anaerocellum thermophilum (Ath) S Q IE L R I 632 Bacillus caldotenax fBca) S Q IE L R V 659 Bacillus stearothermoohilus (Bst) S Q IE L R V 658, 661, or 736 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) * 表示依據所選擇的胺基酸序列（參考下歹4)

Taq，Tth，Z05，spsl7，Tma及Taf聚合酶之完整核酸及胺基酸序列，已發表於美國專利編號5,466,591，並列入本發明之參考。Tea，Tfl，Tne，Ath，Bca，及Bst DNA聚合酶之序列，已發表於如下·· Tea於EMBL序列資料庫，編號： -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 528802 A7 B7 五、發明説明（17 ) 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) U62584(如同，1977，Mol. Cells 1(2): 264-271) ; Tfl 於 Akhmetzjanov and Vakhitov, 1992, Nucleic Acids Research 跋(21):5839; Tne 於 WO97/09451 及 WO 96/41014 ; Ath 於 EMBL序歹資料庫，編號：X98575 (Ath菌株的詳細資料可參考 Rainey 红 al.，1993，i. Bacteriol· 175Π 5 V 4772-2779; Bst於 Uemori si 肚，1993, i. Biochem. 113:401-410^ EMBL 序列資料庫，編號：U23l49(同時可參考Phang et al.，1995, Gene 163:65-68)。Bst聚合酶之胺基酸序列由曰本專利JP 05/304 964A，歐洲專利編號·· ΕΡ-Α·699,760，及Aliotta 红 ai.，1996, Genet. Anal· 11: 185-195，所提供，該胺基酸序列之獨特序列段之麩胺酸（E)位於第658位置。發表於Gene 163:65^68 (1995)之序列，其獨特序列段之麩胺酸（E)位於第 661位置。Bca於 Uemori 红 ai·，1993，L Biochem. 113:401-410與EMBL序列資料庫，編號：D12982。Thermus filiformis之熱穩定性DNA聚合酶（參考FEMS Microbiol· Lett· 21: 149-153，1994 ;及 ATCC庫存編號：43280)可用美國專利編號4,889,818的方法並依據表格1所提供的序列資料進行回收。上述每一個序列及文獻均列入本發明之參考資料。WO 89/06691之天\然型Taq聚合酶與前述之Tfl聚合酶兩者間胺基酸序列的序列類似性（序列相同性）爲87.4% 與Tth聚合酶之對應類似性爲87.4%，與Tea聚合酶相比爲 86.6%，與Bst聚合酶（編號：U23149)爲42.0%，與Bca聚合酶爲42.6%，及與Ath聚合酶爲39.7%。如表格1所示，這些熱穩定性DNA聚合酶之獨特序列段 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇><297公釐） 528802 A7 ____________B7_ 五、發明説明（18 ) 具有明顯的保留性。本發明酵素乃是將編碼此聚合酶之基因之麩胺酸位置πχπ加以改變，本發明酵素與此獨特序列段未經修飾的Taq聚合酶相比，更能有效地引進rNTPs。因此，本發明係關於一系列的酵素包括來自：Thermus oshimai (Williams et aL9 1996，Int. J. Syst. Bacteriol. 46 (2): 403-408; Thermus silvanus及Thermus chliarophilus (Tenreiro ei al.? 1995, Int. J. Syst. Bacteriol. 45 (4): 633-639); Thermus scotoductus (Tenreiro ei ai·，1995，Res. Microbiol. 146 (4): 315-324); Thermus brockianus (Munster，1986，Gen. Microbiol. 132: 1677)與Thermus ruber, Loginov et al.5 1984, Int. J. Syst· Bacteriol. ϋ: 498-499 ;同時亦包括ATCC庫存編號35948之熱穩定性 DNA聚合酶，與其相對基因及表現載體。此外，本發明還包括來自 Thermotoga elfii (Ravot et al.? 1995? Int. J. Syst· Bacteriol. 45: 312; DSM康存編號9442)輿Thermotoga thermarum (Windberger et ai.5 1992, Int. J. Syst. Bacteriol. 42: 327 ;可來自DSM庫存編號5069)之經修飾之熱穩定性DNA聚合酶，與其相對基因及表現載體。上述的每一個序列及發表文獻均列入本發明之參考資料。在本發明的較具代表性實例中，將被修飾的獨特序列段乃位於 LeuAspTyrSerGlnlleGluLeuArgValLeuAlaHisLeuSer (序列編號：5 )胺基酸序列内，因此，本發明的其中一項特點爲產生突變型熱穩定性DNA聚合酶，且該突變型聚合酶是以一種模板依賴性的方式，大量的提升引進特殊核酸的效率。在最具代表性實例中，此聚合酶含有 ____ -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事_ ，項再填、 :寫本頁) 經濟部中央標準局員Η消費合作衽印製 528802 A7 B7 五、發明説明（19)

LeuAspTyrSerGlnlleGlyLeuArgValLeuAlaHisLeuSer(序歹，J 編號：6)序列。此類熱穩定性DNA聚合酶特別適用於DNA定序反應，DNA引導之RNA合成，與rNTP取代DNA之體外合成。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 可提升特殊鹼基引進效率之熱穩定性DNA聚合酶之製備，可使用點謗導突變（site-directed mutagenesis)方法。可參考，{列飧口，Sambrook al·，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989，second edition, Chapter 15.51，’’寡核棼媒介突變，此資料列入本發明之參考資料。例如，將Thermus aquaticus (Taq) DNA聚合酶基因序列（參考序列編號：7)中，編碼第615位置麩胺酸之密碼第2個位置ΠΑ’’，突變爲’’G”時，結果，在一般核嘗酸，例如 dNTPs，存在下，可增加引進特殊核甞酸之效率達500倍以上，並可保留執行PCR反應的酵素活性。在Taq聚合酶中，此特殊的突變可使胺基酸E (麩胺酸）變成G (甘胺酸）。雖然此特別胺基酸的改變，實質地影響此酵素引進特殊核甞酸的能力，但，以其它的胺基酸，例如：絲胺酸，半胱胺酸（cysteine)，酥胺酸，丙胺酸，纈胺酸或白胺酸等來取代此麩胺酸，可預期得到相同的效果。雖然 E615G爲較具代表性的實例，但，以其它胺基酸取代E615 仍爲本發明範圍所涵蓋。因此，本發明的此項特點爲序列編號：1的胺基酸序列段的第4個胺基酸不是麩胺酸。點謗導突變可藉由點專一性引子謗導突變（site-specific primer-directed mutagenesis)方法達成。此項技術目前爲一 -22- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇 X 297公釐） 528802 A7 B7 五、發明説明（20 ) 種標準技藝，且是以互補於單股（single strand)嗟菌體 (phage) DNA之合成的寡核苷酸引子來完成突變，該引子除了欲進行突變的位置與噬菌體DNA無法配對外，均與該 DNA互補。簡言之，此合成的寡核甞酸是做爲引子，引導合成一股互補於質體（plasmid)或噬菌體的DNA，且最後完成的雙股DNA可轉形進入可容許噬菌體的宿主細菌。最後可以用，例如，DNA定序，或探針（probe)雜交 (hybridization)等方法來分析此細菌，確認這些菌斑 (plaques)攜帶有欲突變的基因序列。除此之外，也可使用 ’’重組 PCR”（recombinant PCRM)方法，該方法在 PCR Protocols, San Diego，Academic Press, Innis et al. editors， 1990，這本書的第22章，標題’'Recombinant PCRn，作者 Higuchi，第177至183頁中有詳細描述。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 如表格1所示，Taq聚合酶之獨特列序段内之麩胺酸在其它的熱穩定性DNA聚合酶中，是有保留性的，但其位置可能不同，不過，仍位於鄰近的胺基酸位置内。Thermus菌種之熱穩定性DNA聚合酶與其相似的Thermotoga. Thermosipho與Anaerocellum菌種之DNA聚合酶之序列編號：2内具保留性的麩胺酸之突變，與含有序列編號：2的 Taq聚合酶相比，都會有使這些聚合酶引進特殊核甞酸效率增加之類似效果。其它熱穩定性DNA聚合酶之獨特序列段内之麩胺酸的突變，可依照點謗導突變法的原則與技術來達成。目前已經有許多Bacillus stearothermophilus DNA 聚合酶的序列發表於GeneBank，或SwissProt/PIR資料庫。 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 528802 A7 五、發明説明（21 ) 這些序列彼此有很鬲的類似性，但互不相同，不過每一個都含有已知的獨特序列段SerGlnIleGluLeuArgXaa(序列編號：2)，其中此序列段之第7位置” Xaa，，雖然位於胺基酸序列内不同位置，但爲_胺酸（Val)或異白胺酸（ne)。根據已公開發表的熱穩定性DNA聚合酶之胺基酸與核酸序列資料，可藉由傳統的重組方法，構築含有來自不同熱穩定性DNA聚合酶之功能部位的鑲嵌聚合酶（chimeric polymerases)。美國專利編號 5,466,59 1 與 5,374,553 中，描經濟部中央標準局員工消費合作社印製 J 1 1^-批衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 曹述交換不同熱穩定性聚合酶之功能部位，例如：5，至3，端外切核酸酶功能部位，3 ’至5，端外切核酸酶功能部位與聚合酶功能部位等的方法，可產生新的酵素。較好的鑲嵌熱穩足聚合酶酵素包括有一個5 ’至3 ’端外切核酸功能部位，一個3 '至5 ’端外切核酸酶功能邵分與一個聚合酶功能部位’其中，每一個功能部位各來自不同的聚合酶，且其中· 聚合酶功能邵位含有獨特序列段序列SerGlnIleXaaLeu ArgXaa(序列編號：1 )，其中此序列第4個位置”xaa”爲任何一種胺基酸，但不可爲越胺酸（Glu)，且此序列第7個位置’’Xaa，’爲纈胺酸（Val)或異白胺酸（ne)。此種鑲嵌分子例子有Taq/ Tma鑲後酵素，其詳細組成列於表格2。如此表格所示，這些Taq/Tma鑲嵌酵素之聚合酶功能部位之前述獨特序列段内具有突變。 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 528802 A7 ______ 五、發明説明（22 ) 表格2 5’至3’外核甞酸酶 3’至5’外核甞酸酶聚合酶功能部分功能部位功能部位 Taq aa. 1-289 aa. 290-422 aa. 423-832 Tma aa. 1-291 aa. 292-484 aa. 485-893 Taq/Tma aa. 1-289 (Taq) aa. 292-484 (Tma) aa. 423-832 (Taq) 含E615G突變 Taq/Tma aa. 1-289 (Taq) aa. 292-484 (Tma) aa. 485-893 (Tma) 含E678G突變 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製依據布達佩斯條約（Budapest Treaty)西元1996年7月1 7曰質體？(：1已被存入八丁(：(：，且列入編號98107。質體？(：1含有編碼一種熱穩定性聚合酶的基因，該聚合酶有一密碼產生_ 突變，且此密碼爲編碼天然型Taq聚合酶之第61 5個位置之麩胺酸，此項突變結果產生一個在第615個位置爲甘胺酸的突變型Taq聚合酶（E615G突變型Taq聚合酶）。由於此質體的列入，提供了另外一種能產生具能有效引進特殊核甞酸類似物之熱穩定性DNA聚合酶的方法◦實例1中説明：使用側端限制酶點（flanking restriction site)可適用於E61 5G 的次選殖（subcloning);產生其它的熱穩定性DNA聚合酶。因爲許多熱穩定性DNA聚合酶的完整基因序列已經知道，所以，基於本發明所提供的獨特序列段的序列資訊，可利用其它的方法，例如··限制酶分解與片段取代，或點專一 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 528802 A7 B7 五、發明説明（23 ) 性體外突變fin vitro mutagenesis)等方法，在編碼E61 5的密碼上產生突變。以點專一性突變法製備的經修飾基因或基因片段’可藉由傳統的方法，從質體或噬菌體中回收，並連接於表現載體，以便於進一步的培養並純化此酵素。許多種選殖與表現載體，包括哺乳動物與細菌的系統，均可適用於本發明，並且於，例如，Sambrook gi Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition，Cold Spring Harbor，1989，中有進一步描述。基於方便性，本發明的實例中所用PL起動子（promoter)衍生的嗤菌體（Shimatake ai·，1981，Nature 292: 128)。此起動子的使用，於美國專利編號：4,711，845 與5,079,3 52中有特別的描述。本發明之熱穩定性DNA聚合酶一般從大腸桿菌（E. coli) 等微生物中純化而得，該微生物已經被已連接野生型或經’ 修飾之熱穩定性DNA聚合酶基因之表現載體所轉形。一種合適的宿主微生物爲 Lawyer si ai.，1993，PCR Methods and Applications 2_: 275-287 ’中所描述的大腸桿菌株DG116 ’ 該菌株可由美國型培養收集庫（American Type Culture Collection)中獲得，其編號ATCC 53601。此熱穩定性聚合酶的純化方法於，例如，Lawyer ei al·，1993，PCR Methods and Applications 2_: 275-287 中有進一步描述。從那些先前技藝中可以肯定上述之具強化特殊核铝酸引進效率之熱穩定性DN A聚合酶，藉由重組DN A的技術，可以非常容易製備得到。任何人想要製備本發明的其中一種 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事' 項再填· :寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 24 528802 五、發明説明（酵素’或衍生物’或這些酵素的類似物一般都需經過表現载體的構築’以載體轉形宿主細胞，及在載體可以進行表現的情況下培養轉形的宿主細胞等過程，才能得到重組的酵素。表現載體的製備，轉形與培養轉形的宿主細胞之方在先技二中已爲人所熟悉，並於’例如，sambro〇k si al·，1989 ’參考前文中有詳細的描述。本發明提供可使用核糖核苷三磷酸來做爲許多方面應用的熱％足性DNA聚合酶，這些應用包括：核酸的擴增，偵測與DNA的定序方法。定序使用的核甞酸應避免使用價格同叩的ddNTPs等鏈終止類似物⑽如七㈤似㈣ analogues)，並可增加新的擴增反應產物之製備，該產物不僅可用於DN A定序分析，而且還可以做爲其它分析使用，例如，電泳，或無需進rdna定序反應的雜交反應。使用嗜中溫聚合酶與熱穩定性DNA聚合酶時，已知焦鱗· 酸酶可藉由減少焦磷酸水解的量，使延展產物累堆，因而促進疋序的效果。的確，先前技藝之循環定序方法中，定序反應需額外的添加酵素。然而，本發明的一項非常有用，並且有利的特點是：DNA定序時無需使用焦磷酸酶。 =此，使用本發明所提供的新酵素，可以減少因額外添加第二種酵素於定序反應混合中所需的費用。當使用本發明酵素時，擴增反應與定序反應結合一起，因此可節省時間與材料，並且也簡化了整體的分析。這些優點’與其它，主要是因爲可以引進一般的核苷酸與核糖核荅酸及核糖核荅酸類似物於引子延展產物中所致的，^ 爾尺度適用中國國^57^) μ規格 ----τ — .―ΊΤ--^-裝------訂----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -27 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 528802 A7 B7 五、發明説明（25 ) RNA/DNA鑲嵌股中的RNA可被水解。RNA的水解不會影響DNA的骨架，並形成一群核酸片段，每個DNA片段終止於取代dNTP之核糖核苷酸處。水解反應可藉由不同的方法達成，這些方法包括：鹼（alkali)(例如，以氫氧化鈉處理，最終濃度爲0.2莫耳，如實例VI所示），加熱，或以核糖核甞酸酶（RNase)進行處理（Vogel红d.，editors， Informational Macromolecular. New York，Academic Press, 1963，由Berg等人所撰寫之章節，其標題爲nThe Synthesis of Mixed Polynucleotides Containing Ribo- and Deoxyribonucleotide by Purified Preparation of DNA Polymerase from E. coli，’，第 467 至 483 頁）。在較具代表性實例中，本發明提供特別適用於DNA定序法的新的且改良的組合物。本發明之新酵素於核酸定序法中，無論是使用終子染色或引子染色，以及其它定序方法，都有很好的效果。如先前所述，鏈鎖終止方法，一般需要有鏈-終止核甞酸加入模板-依賴性之引子延展反應，結果會形成一系列長度不一的片段，因此可藉由大小不同加以分離。標準的二-去氧定序法，使用二去氧核铝三磷酸做爲鏈終子，並且使用大腸桿菌Pol I之克雷諾（Klenow) 片段做爲DNA聚合酶。（參考Sanger gi ai.，參考前文）。因此，基本的二去氧定序法的步驟包括⑴寡核苷酸引子粘附於模板上；（ii)在4種分別的反應中，經由DNA聚合酶將引子延長，每一個反應中包涵一種標定的核苷酸，或標定的引子，未經標定的dNTPs混合物，及一種鏈-終止反應 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •項再填办 528802 A7 B7 五、發明説明（ 26 經濟部中央標準局員工消費合作社印製二了； (iH)藉由，例如，高_解析變性聚丙醯胺/尿素膠: …永：毛細分離’或其它的分離方法等將4組反應的產勿刀離，則lv)產生膠體的自動幅射性影像，根據此影像可以檢查並比對該序列。此外，質譜儀法或雜交法，藉

由螢光‘疋的引子或核：y：酸的使用，可以獲得DN 資訊。熱穩定性聚合酶，例如Taq聚合酶的有效性可以改良定 ==方法（參考美國專利編號：5,〇75,216)與修飾所謂，,循 ¥定序，'法。在循環定序法中，加熱與冷卻的循環一再重覆，以便大量的產生每個標的分子的延展產物（偷㈣， 8889)。與模版序列相互補的標的序列之不對稱性擴增反應（asymmetric amplification)，在二去氧鏈終子的存在下，會產生任何可能的長度之延展產物。 DNA模版的延展反應產物經過變性分離（denaturati〇n) 後，在二去氧終子的存在下，進行引子粘附與引子延的重覆循環。熱穩定性DNA聚合酶在循環定序反應中具有許多優點；它們可以忍受嚴格的粘附溫度，此種溫度是引子要專一性的交合到標的核酸上所必需的，且可以忍受多次的局溫循環變性，每個循環會發生變性，例如9〇_95t。因此，不同型式的AmpliTaq®DNA聚合酶已被列入丁aq循環定序套組中，且由Perkin Elmer，Norwalk，CT行鎖。雖然如此，Taq DNA聚合酶對特殊核甞酸，例如， ddNTPs，引進的排斥性質是使用循環定序方法上的一項問 — 11^--^裝------訂----- (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 29- 528802 A7 B7 五、發明説明（27 ) 題，因爲循環定序時，ddNTPs或螢光標定的ddNTPs必須被引進，做爲鏈鎖反應的終子。在本發明之前，一般以熱穩定性DNA聚合酶進行DNA定序反應，需要一種高濃度鏈鎖-終止的核甞酸混合物，通常爲二去氧核苷酸，來保證可超過幾百個鹼基的所有可能長度片段的延長產物可以被產生◦爲了解決此大量消耗的問題最常使用方式是用非常低濃度的一般dNTPs，結果造成反應變成毫無效率。具有低濃度dNTPs與高濃度ddNTPs的反應混合物，會形成一種熱穩定性聚合酶等待核甞酸受質的情況。即使是使用AmpliTaq®DNA聚合酶F S等經修飾的酵素，可讓dNTPs的濃度增加到最好的程度，但此先前的酵素仍然需要有價格昂貴的ddNTPs來進行DNA定序。相反的，本發明的酵素不僅可讓dNTPs的濃度增加，而且還可以避免使用價格昂貴的ddNTPs，取而代之的是將rNTPs引進成長股中。此新酵素能有效地影響部份核糖核苷酸取代的能力，並幫助產生DNA序列梯（sequencing ladders)，且不需要在分別的反應中引進終子核甞酸。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 適合DNA定序法使用的特殊核苷酸類似物的選擇，在先前乃著重於其可被熱穩定性DN A聚合酶引進的能力。但，很不幸的，這類的核苷酸類似物的價格都非常昂貴，例如，ddNTPs的價格大約爲rNTPs或dNTPs價格的2 5倍以上。因爲先前技藝的熱穩定性DNA聚合酶無法有效地將容易取得的且便宜的rNTPs引進DNA成長股中，因此rNTPs無法在熱穩定性DNA聚合酶的定序反應中使用。本發明排除 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 528802 五、發明説明（28 ) 了 DNA定序反應中對ddNTps的需求，因此，本發明的一項特點爲提供—種比先前鏈鎖終止法實質便宜的DNA定序分析法。引子延展反應中鎂離子的存在會影響聚合酶準確地插入正確的配對的核苷酸之能力。鍰離子可以用來強迫不正確的核苷基配對，或舒緩核甞酸類似物引進的排斥力。已經有研九人員，於dNA複製或擴增反應過程，利用鎂離子來房導產生哭變，因此，鎂離子可以影響聚合反應的準確 DNA疋序法所得到的最後序列結果可能不正確或難以、’〗本矣明的方法並不需要在定序反應混合物中加入鎂離子足種二價的陽離來迫使聚合酶引進特殊核苷酸。與先㈤技藝之DN A聚合酶相反，本發明確認出聚合酶功能部位内扠制分辦2 ’取代與非取代核甞酸的獨特序列段，是不需要鎂離子。、本發明酵素，在定序時，並不需要高濃度的特殊驗基類似物在本發明之前，特殊鹼基類似物與相對的一般鹼基的比例，其一般範圍約13:1至24:丨，此比例可用於定序法的鏈鎖終止反應（參考美國專利編號：5,〇75,2丨6 Μ nis et ,al.)，相較之下，本發明之熬穩定性聚合酶可將特殊鹼基類似物與一般鹼基的比例降低一百至數千倍。使用本發明之新酵素，rNTP:dNTp的使用比例可爲1:1或更少，便可有效的進行DNA定序分析。在本發明較具代表性實例中，rNTP:dNTP的比例減少至低於1:8。2’取代核甞酸與相對的天然dNTP的比例可低至1:80或1:200，視特別的實驗 31 本紙張尺度適用中國格（21Qx297公酱）訂费 528802 A7 B7 五、發明説明（29 ) 設計需求及想要獲得的片段長度而決定。因此，由於本發明酵素可引進2 ’取代核甞酸等特殊核甞酸，所以不需要用高濃度的rNTP來迫使rNTP的引進，與限制其相對的dNTP濃度，所以，本發明方法可以最佳的 dNTPs濃度與低量的rNTPs—起使用。當本發明之經修飾聚合酶，用於引子染色定序法等合適的定序方法時，與每一種dNTP濃度爲百萬分之50-500莫耳時一起使用，可以得到良好的DNA定序結果。較好的 dNTP濃度介於百萬分之100至300莫耳。在這個dNTP濃度範圍内，rNTP可以使用相同的濃度或更少，較好的rNTP 濃度爲百萬分之0.1莫耳至百萬分之100莫耳，最好的rNTP 濃度約百萬分之2.5莫耳至百萬分之25莫耳。本發明之經修飾酵素之適當rNTP濃度，可以藉那些先前技藝的一般技術的定量與最佳化實驗決定出來。rNTP或類似物的需求量會受不同的實驗所影響，而且也會受標的物之長度以及緩衝液的選擇與酵素的特殊種類所影響。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) rNTP: dNTP的比例將決定rNTPs引進成長中的寡核嘗酸之頻率。由於水解將在引進的rNTP處發生，所以rNTP: dNTP的比例可由使用者彈性的調整，以便增加或減少最終的片段大小。 DNA爲dNTPs的聚合物已是爲眾人所知，每一個去氧核苷三磷酸包涵一 3 f位置爲羥基與2 ’位置爲氫基的核糖。核糖核甞酸也含有3 ’位置爲羥基的糖基。然而，rNTPs與 dNTPs的差別在於糖基的第2 ’位置，其中羥基爲氫原子所 -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 528802 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（3〇取代二t本文中，ΓΝΤΡ爲本發明酵素能夠準確的引進2,取代：甞酸的實例。然而，本發明的化合物不限於使用核糖核甘酸做馬特殊核：y：酸。將已確認的獨特序列段之序列加以修飾的熱穩定聚合酶，可以使2，取代核甞酸，例如， 2 - «基，3 ’ -去氧核苷酸與取代的2，_氟或胺基核甞酸依模版的引導引進。如貝例中所描述，3 ’ -去氧，2 ’ -羥基ATP，本發明所指爲蛹蟲草菌素（cordycepin)三磷酸，可被產生第2個位置突變的熱穩定性聚合酶更有效的引進，該突變的聚合酶，降低了含有3 ’位置爲羥基的核糖之核苷酸引進的辨別力。這類的酵素於先前已經有描述，例如eP_a-655506與西元 1995年5月2 3日許可的美國專利序號〇8/448,223，這些都列入本發明之參考。ATCC庫存編號：69820，基於西元 1995年5月1 〇日之布達佩斯條約所列入，提供了編碼 Thermus闕之經修飾熱穩定性DNA聚合酶之基因，該聚合酶已降低ddNTPs等類似物的辨認力。二去氧核甞酸與一般的dNTP相比在3，位置已被取代，因此，與本發明的雙重哭變的聚合酶，例如E615G，F667Y Taq聚合酶突變種一起使用’提供能夠使核誓酸類似物的方法，該類似物與 dNTPs相比’在其核醣的3 ’與2 ’位置已被取代。本發明的一項特別的應用爲rNTP定序法，其中定序引子以特別螢光或同位素標籤進行可偵測的標定。不同於 ddNTPs，引進未修飾的rNTPs並不會導致鏈鎖終止的發生。在含有rNTP與dNTP並結合本發明酵素的DNA定序反 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） ^ϋ- mi ϋί— - 111 I —ϋ I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -訂 528802 A7 ^-~___B7 — 五、發明説明（31 ) * --- 應中，、產生隨機取代的引子延長產物之混合物，該產物於核糖核甘酸與去氧核糖核甞酸間的3，_5，磷酸二酯連結處可 1被切斷。於，例如PCR擴增反應或循環定序反應之引子延長反應之後，與藉由，例如，膠體電泳分離引子延長反 2產物之前，將反應混合物以鹼，加熱，核糖核酸酶或其它万法進行處理，使延展的產物於核糖核菩酸的位置發生水解。至於每一種標定的引子延展產物，唯有來自標定引子互即延展後的大部分5 ’片段產物才可以在定序膠體上被偵測到。針對特定的標的，定序膠體的分析可提供相對應於標的核酸序列的序列梯度列，該梯度爲一系列的G， A ’ T與C的確認訊號。不論是以傳統方法使用ddNTps或用rNTPs與本發明之新熱穩定性聚合酶，最後的定序梯度所提供的訊息是相同的。因此，使用本發明方法時，dna 定序將不再需要筇貴的ddNTPs(參考實例V I)。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ----^ L 丨-L--ip 裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) # 在另一種定序法中，使用鏈鎖-終止核糖核甞酸，在本發明的此項具體實例中，cordycepin三鱗酸等2’-輕基，3，-去氧核甞酸可當做終子，這些rNTPs的類似物可以經螢光標定’並使用於DNA定序法。Lee等人（參照前文）曾經説明終子染色ddNTPs的應用，EP-A-655,506與1995年5月23 日核准的美國專利序號08/448,223中説明經修飾酵素與 ddNTPs的使用。一種含有AmpliTaq® DNA聚合酶F S (參考前文）的修飾與序列編號：1特點的本發明熱穩定性DNA聚合酶，可以在鏈鎖終止定序反應中，有效的引進已標定的 rNTPs類似物。此過程可以自動化，且不需要合成染料標 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 528802 A7 __B7 五、發明説明（32 ) 定之引子。再者，由於終子染色反應可讓4種反應同時在一管中進行，所以他們比引子染色法更爲方便。2 ’ -羥基，3 ’ -去氧核甞酸可由已商業化的產品3 ’核棼酸（3’ dA， 3’ dC，3’ dG與3’ dT，例如可從 Sigma Chemical Corporation， ST· Louis，MO 購得）來合成，且依照 Ludwig，Biophosphates and Their Synthesis Structure. Metabolism and Activity, editiors， Bruzik and Stec, Amsterdam, Elsevier Science Publishers, 1987 ? 第201至204頁中所描述的方法加入5 f三磷酸。除了在新的定序法使用本發明酵素外，本發明的經修飾酵素可在許多的分子生物應用方面使用。在一項具體實例中，此經修飾酵素可以擴增含有一般與特殊核棼酸的反應混合物，此混合物包括，例如，dNTP與至少一種可偵測得到的已標定rNTP，標定的方式包括螢標定或同位素標定。由模版引導所合成的互補股提供了一種在其長度中不同位置上含有核糖核甞單磷酸的DNA產物。加熱且/或鹼處理可將核酸延展產物之每個核糖核茹酸水解。因此，形成了一群DNA片段，其中每個片段在其3 ’端含有標定基團，最後核酸片段的大小可以藉由反應中rNTP的比例與含量加以修飾。用rNTPs與本發明酵素來擴增標的物，依據特別的應用，可得到許多的優點，在前述使用已標定之rNTP的方法中，最後的片段群，都以相同強度加以標定：每個寡核苷酸片段含有一個標定。若以已固定於矽膠體上之寡核苷酸探針，做爲核酸偵測的方法，爲了控制雜交的動力學 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） I—----《---AW· ^------訂----- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 528802 五、發明説明（33 (hybridization kinetics)，最好其擴增的標的產物片段爲隨機的’且大小落在可重覆的固定範圍内以防止二級結構的產生。此外，胃了偵測矽片上成千排列的探針的雜交，核酸片段較好以相同強度加以標定。本發明提供了一種可產生合乎此標準的片段群的方法，因此，促進了其它偵測方法的使用。例如，Cr〇nin 红 ai.，1996, Human Mutation 7: 244-255所描述的矽膠片法（chip_based聊化油）〇在另外-項具體實例中，在本發明熱穩定性聚合酶與 rNTPs及dNTPs -起存在的擴增反應中，同時使用—種已標經濟部中央標準局員工消費合作社印製定的引子Μ #未標定的引子時，則提供了一種可同時進行擴增與定序反應的方法。此種方法需要進行4種不同的擴增反應’每lNTP進行一種反應。因此，例如，因爲本發明酵素適合藉由，例如，pcR，或其它擴增方法將標的物擴增丄所以，如果最後的產物形成，則可用部分的反應. 產物’精由膠體電泳或探針雜交等傳統方法加以偵測。這二，測方去不會造成引進的核糖核苷水解，且鑲甘人月又的！·生貝與—般的核酸擴增產物相同。如果偵測到期待的產物’則剩餘部分的相同反應產物，可以經鹼處理，並以膠體電泳進行分析’決定其核酸序列。因此，在產物偵測後的進—步定序反應是不需要的。此簡化的方法，不僅肩下時間愈姑、 ^刊竹，而且，藉由步驟的省略，提供更準確的方法·偵測到的產物即爲定序產物。、另外返有一種類似的方法可以使用，其中使用四種已標疋的rNTPs與—種生物素標定的引子。在擴增反應之後， 36 210X297公釐）。張尺度適用 528802 五、發明説明（34 經濟部中央標準局員工消費合作社印製以驗產物刀解，與引子有關的產物可藉由與鏈抗生素蛋白（strepavidin)包覆的顆粒小體之反應，加以分離，被捕獲的產物’可随後進行足序膠體的分析。此經修飾的方法，可讓定序反應在同-管中完成，因此刪除了需進行4 種分別的擴增反應的需求。在本發明的另外-项特點中，可用本發明酵素從dna模版中製備RNA，*製備可經驗消毒的取代性dna，該消毒方式，、.、而使用尿密呢-胺基.糖解酶（则cU.N-giy； UNG)，等傳統消毒劑，UN(}可參考國際專利發行編號： WO 92/01814 0 在-項具代表性實例中，在其5，至3,外切核酸酶功能部位中含有突變的熱穩定性聚合酶可大大的減弱此外切核酸酶的活性。在美目專利編號：5,466,591巾，有此類經修飾的Taq聚合酶的説明。在本發明一項具體實例中，在胺基酸第46個位置編碼甘胺酸（G)的密碼，以編碼天門夂酸⑴) 的密碼取代。最後此酵素，由於其5,至3,外切核細的活性降低，因而增強了其循環定序的效用，且與本發明一起使用時，是較具有特點的。與野生型酵素相比，g46d 的哭變，並不影響聚合酶功能部位的胺基酸序列與聚合酶活性。 … 在本發明的商品化代表性實例中，含有根據本發明的熱穩定性聚合酶之核酸定序套組，爲本發明商品化具體實例 =代表。此套組一般還包括rNTPs，dNTp與適合的緩衝液等DNA足序反應的試劑，其*rNTp是未標定的，可能也包 1L--1---衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 —一 37嗎 i紙張尺國國家標準(CNS) • n n H· 528802 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 ___B7 五、發明説明（35 ) 含一種已標定的引子。下列所提供的實例主要在於説明，且無意於限制本發明的專利範圍。

實例I 已降低對特殊核甞酸排斥的經修飾Taq聚合酶基因的表現 Taq DNA聚合酶的C -端胺基酸部份編碼活性的聚合酶功能部位（Lawyer 过以.，1993，PCR Methods and Applications 2_\ 275-287，已列入本發明之參考資料）。含有此區域的DNA 片段可由全長的Taq基因中分離出，並且在鎂離子的存在下，藉由PCR擴增反應，產生突變（Leung红ai.，1989, Technique J_( 1): 11 -1 5)。至於本實例，所有的限制酶是購自 New England Biolabs，Beverly，MA.已產生突變的 DNA片段以限制酶ΕιίΙ與MJI進行分解，並選殖入Taq表現質體，在這裡所用的爲質體pLKl 02，該質體已先前以限制酶 PstI與BjlII進行分解。質體pLKl 02爲Taq表現質體 pSYC 1 578 (Lawyer ai.，如前文所述）的修飾型。刪除位於 3 ’端至聚合酶解碼區域的HincII/EcoRY片段，產生質體 pLKlOl。含有898個鹼基對的mi-Β^ΙΠ片段隨後從pLKlOl 中刪除，並以一短的Pstl-EcoRV-Bglll雙股寡核甞酸取代，形成質體pLK 102。因此，此刪除過程將Taq DNA聚合酶V端的900個驗基對移走，並以一較短的DNA片段取而代之。將最終的表現質體轉形入大腸桿菌株N1624(參考 Gottesman，1973, i. M〇i- Mai II: 53 1 ;也可由耶魯大學的 E. -38- 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 费‘ 528802 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 __B7五、發明説明（36 ) coli Genetic Stock Center 獲得，其菌株編號爲 CGSC #5066)，最後所得的轉形菌株可藉由與野生型酵素，比較其引進rNTPs的效力來篩選。利用此方法，篩選出具有更好的rNTPs引進效力的C 1突變種。爲了檢測Taq聚合酶基因的那一個部分會影響其表現型，由C1突變種中分離出的Taq表現質體突變種pCl，以不同的限制酶加以分解，且將最後得到的限制酶分解的片段DNA次選殖（subcloned)入pLK101野生型TaqDNA聚合酶基因中，將未經過突變的限制酶分解片段取而代之。從次選殖的最後分析結果看來，會影響表現型的突變是位於 Nhel至BamHI限制酶分解片段内的265鹼基對内。利用ABI PRISMS終子染色循環定序核心套組與Applied Biosystems 373A型的DNA定序系統進行pCl此特定區域的 DNA序列分析，該試劑包括來自Applied Biosystems，Foster City，CA的AmpliTaq®DNA聚合酶。由序列分析結果中確認出Taq聚合酶基因中Nhel與BamHI兩種限制酶分解位置之間有兩個誤義突變（1^3361136 1111^1：丨011)。第615位置的胺基酸突變，使麩胺酸（E)變爲甘胺酸（G)，而在另外第653位置的突變，使丙胺酸（A)變成酥胺酸（T)。胺基酸的編號是從成熟蛋白質的第一個解碼的甲硫胺酸（methionine)算起，例如美國專利編號5,079,352。E615G的突變是第615個密碼由 GAG變成GGG所導致的，而A653T突變是由第653個密碼由 GCC變成ACC所導致的。根據布達佩斯條約，於1996年7 月1 7日，將大腸桿菌株N1624宿主中的質體C1存入ATCC -39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 528802 A7 B7 五、發明説明（37 ) 中，並給予編號98107。利用重組 PCR的方法（Innis 红 editor，PCR Protocols, San Diego, Academic Press，1990，第 22 章，標題"Recombinant PCR” Higuchi，第177-183頁），藉由分別的將每一個突變點次選殖入天然型的Taq聚合酶基因中，分別的分析這兩個突變點。分析最後的表現產物以決定到底是E6 1 5G或 A653T或兩個突變同時影響核糖核茹酸引進的表現型。最後的實驗結果顯示：只有E6 15G的突變影響此突變種的表現型。爲了更進一步的分析，且定量其對核苷酸類似物的引進效率，將含有E615G的265鹼基對之MmHI-NMI限制酶分解的PCR片段選殖入pRDA3-2的Taq表現載體，該載體含有全長且可連接至嗟菌體lambda PL起動子的Taq基因上，此載體之Taq基因之外切核酸酶功能部位含有一個突變點，該突變點發生於解碼產生第4 6個胺基酸-甘胺酸的密碼上，使得5 ’至3 1的外切核酸酶活性降低。然而，pRDA3-2 表現載體的聚合酶功能部位内的基因序列與野生型Taq基因的序列完全相同。質體RDA3-2於美國專利編號 5,466,591中有詳細描述，此專利亦列入本發明之參考資料，其中此質體即爲π第3-2株（clone 3-2)。以限制醃BamHI 輿Nhel將質體pRDA3-2分解，並且將含有265個鹼基對的 PCR片段，以傳統的方法連接於此載體上。將最後的質體一 PLK108轉形入大腸桿菌株DG116中 (Lawyer giai·，1993，參考前文，同時亦可得ATCC編號 -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事，項再填- :寫本頁} 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 38 528802 五、發明説明（ 5<3 606的美國型培養收集庫中獲得）質體⑽編碼一種熱釔疋合酶，在此稱之爲G46D，E615G 丁叫，藉由重且PCR方去，將£615<3與F677Y的突變與BamHI-Nhel限制酶分解的片與^士人+ , 巧半又'、、口泛在一起，結果產生了 G46D，E615G， F667Y Taq的笑變種。將此片段選殖入質體，產生了質體PLK109。由質體pLKl〇8與pLK1〇9所表現的熱穩定DNA聚合酶蛋白質，可根據。胃以红社，Η%，參考前又，所描述的方法進行純化，雖然删除了其中的層析步驟。此外來的序列可藉由DNA序列分析的方式加以確認，在pLKlG8中的此外來序列中，|現了另外—個突點，但是，此項突變並不會影響此蛋白質的胺基酸序列。一經過部分純化後，根據Lawyer红吐，1989，i. Biol. Chern. 6427-6437，己列入本發明參考資料的方法，定量此經修飾酵素的活性。此經修飾酵素之活性的計算方式如下：每個單位酵代表，於3〇分鐘内可合成十億分之耳的產物。在引進的dCMp濃度達兆分之8〇至1〇〇莫耳時，原生型酵素的DNA聚合酶活性與酵素濃度呈線性比例關係 (每個反應中，酵素的稀釋範圍爲〇12至〇15單位），在引進的dCMP濃度達兆分之〇.25至3莫耳時，E615g，〇4奶與 E615G，F667Y，G46D突變種的活性與其酵素濃度呈線= 比例關係。（在每個反應中，該酵素的稀釋範圍爲6/ι〇·4 至5 X ΙΟ」單位）。在實例m至ν中，本發明製備的此酵可應用於引進與定序反應。至於根據Lawyer红此，（參考前文）説明所純化的酵素，則用於實例11與以。則 ----r —. —..----^^裝-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -41 - 528802 A7 B7 五、發明説明（39 ) 實例11 比較引進效率的分析 G46D與G46D，E615G，Taq引進rNTP的相對能力是藉由測量其於特定酵素濃度下，將[π -32P]rNTP引進已活化的鮭魚精子DNA模版的含量所決定的爲了測量rATP的引進，所以必需製備一含有12.5" g已活化之鮭魚精子DNA的50微升反應混合物，其製備方式如下··各200//N^々dCTP，dGTP 與dTTP (Perkin Elmer, Norwalk，CT)，100# Μ[汉-32P]rATP，1 毫莫耳-氫硫基乙醇（/? -mercaptoethanol)，25毫莫耳胺基-三 [羥基甲基]甲基-3-胺基-丙烷硫磺酸（25 mM N-tris[hydroxmethyl]methyl-3-amino-propanesulfonic acid (TAPS) pH 9.5，20°C，50毫莫耳氯化鉀與2.25毫莫耳氯化鎂。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 可製備相似的反應混合物來測量rCTP，rGTP與rUTP的引進。在每一個例子中，以同位素標定100 A Μ的rNTP，其它三種未標定的（1]^丁？3則各別爲200 //]^(標定1：(：丁？時，則爲 dATP，dGTP與 dTTP，標定 rGTP 時，貝|J 爲 dATP，dCTP 與 dTTP，標定 rUTP時，貝ll 爲 dATP，dCTP與dGTP)。爲了標準化，同時測量每一酵素對相對的[a -32P]dNTP的引進。除了以100"“相對的[“-32?]41^?取代[“_32?]1^丁？之外，這些分析的分析混合物與上述rNTP引進分析的分析混合物很類似。來自 Worthington Biochemical，（Freehold, NJ)的粗製鮭魚精子DNA，1克/升，可藉由與1〇毫莫耳三（羥基甲基）胺基乙烷（Tris-HCl) pH 7.2，5毫莫耳氯化鎂，於2°C至8°C 下培養96小時，加以活化。然後，分別加入12.5毫莫耳乙 -42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇X297公釐） 528802 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（4〇二胺四乙酸（EDTA)與〇.1莫耳的氯化鈉。DNA隨後以酚/氯仿溶液萃取’緊接著以乙醇沉澱，以及以1 0亳莫耳Tris， 1毫莫耳EDTA，pH 7.5重新溶解。將此配製好的已活化 DNA ’以相同的緩衝液進行透析。分別取出4 5微升的每個反應混合物至5支〇. 5毫升的小管中（例如，Eppendorf)，做爲每個5 ’ _標定的核苷酸前驅物。因此，G46D Taq與G46D，E615G Taq每一個都進行二之分析，其餘一管則做爲負反應控制組。每個分析的兩管聚合反應，最初以5微升的G46D Taq聚合酶（〇.〇2單位）或 G46D，E615G Taq (0.002單位）混合。至於背景値的控制，則可用5微升稀釋酵素緩衝液來取代酵素，加入負反應控制中。將每個反應經短暫的振搖後，於7 5 培養1 〇分鐘，最後，藉由加入1 0微升的6 0毫莫耳EDTA來終止反應，並置於冰浴上。至於每個樣本，從6 〇微升的反應物取出5 〇微升’以1¾升的2¾莫耳EDTA ’ 5 0微克/毫升的片段鈇魚精子DNA溶液加以稀釋。利用標準的方法，以tca將dna 沉殿並收集於GF/C濾、紙圓片上（Whatman，Kent，England)。已標定的核苷酸或核糖核棼酸的引進量可藉由液態閃燦光譜分析儀加以定量，並計算出引進十億分之多少莫耳。每種酵素引進每一種rNTP的十億分之一莫耳數，可藉由每種酵素引進相對的[a-32P]dNTP的十億分之一莫耳數，予以常態化（normalized)。最後結果如下·· -43- 本紙張又度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事 !· 項再填· 裝-- -寫本頁) 訂 • — - i -— 528802 A7 ___ B7_ 五、發明説明（41 ) G46D與G46D，EM5G Tag對rNTP虡dNTP的引進比值酵素 dATP G46D 27.74 (100%) G46D5E615G 0.67 (100%) 這些結果顯示引進之十億分之一莫耳(百分率） ίΑΊΡ dCTP iCIP dGIP |CTP JITP 腿 0.052 34.6 076 36.94 0.133 28.79 0 (0.18%) (100%) (022%) (100%) (036%) (100%) (0) ^ 1.41 2.82 5.33 3,27 5.96 0.688 0.545 (210%) (100%) (189%) (100%) (181%) (100%) (79%) ·· G46D，E615G引進核糖核苷酸的效率比 G46D超過500倍以上（例如，對rGTP為181:0.36=502倍，對 rCTP為 189:0.22=859倍，及對 rATP為 210:0.18=1166倍的效率）。因此，在聚合酶基因第615位置密碼的誤義突變，產生了一種新表現型：一種除了二去氧核糖核甞酸外，能有效的引進核糖核苷酸的熱穩定性DNA聚合酶。

實例III 比較3 ’去氫ATP (Cordvcepinl之引造效率的分析 G46D ; G46D，E615G ; G46D，E615G，F667Y，與G46D， F667Y Taq等引進3’·去氧腺嘌呤核苷5’_三磷酸（cordycepin 三磷酸）的相對效力，可藉由於特定酵素濃度下，每種酵素將[邙-32P]cordyeepin三麟酸引進已活化的鮭魚精子DNA 模版的量加以測得。為了測量[a _32P]cordyeepin三磷酸的引進量，在50微升的分析反應物中，最後含有：12.5微克的已活化鮭魚精子DNA，各含200 // Μ的dCTP，dGTP與 -44 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 528802 A7 B7 五、發明説明（42 ) dTTP，5 0 /i Μ 的〇1八丁？（？6化111£111^〇，5 0//以[“麵32?]-3’-dATP/3’dATP (New England Nuclear，Sigma)，1 毫莫耳 y5 -氫硫基乙醇，25毫莫耳的胺基-三-[羥基甲基]甲基-3-胺基-丙烷硫磺酸（TAPS)，pH 9.5，2 0 °C，5 5毫莫耳氯化鉀與2.25毫莫耳氯化鎂。從每個反應混合物中各取出4 5微升，放入9支0.5毫升的小管中，因此，每個反應將以G46D ; G46D，E615G ; G46D，E615G，F667Y或 G46D，F667Y Taq等各反應二次，剩餘的一管將做爲不含酵素的控制組。其中二管的分析混合物之聚合反應，從加入5微升（0·058單位）的G46D Taq聚合酶開始，至於 G46D，E615G Taq (0_0025 單位），G46D， E615G，F667Y Taq (0.0034 單位）或 G46D，F667Y Taq (0.083 單位）等的作法也是相同。剩餘的一管則以酵素的稀釋緩衝液取而代之，做爲背景値的控制。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 每個反應物經短暫的振搖後，於7 5 °C中培養1 0分鐘。最後藉由加入1 〇微升的6 0毫莫耳的EDTA來終止反應，並置於冰上。對每個樣本，從6 0微升的反應物中取出5 0微升，並以1毫升的2毫莫耳EDTA，5 0 // g/ml鮭魚精子碎片 DNA溶液加以稀釋，利用標準的方法，以TCA將DNA沉殿，並且收集於GF/C濾紙圓片上（Whatman，Kent， England)。[α-32Ρ]標定的核甞酸之引進量，可藉由液態閃爍分光光譜儀進行定量，並計算出引進的十億分之一莫耳數。每個酵素所引進的[π -32P]cordycepin三磷酸之十億分之一莫耳數，須除以，分析中，每個酵素所用的單位數， -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 528802 A7 B7 五、發明説明（ 43 以得到每單位酵素所引進的十億分< 下列圖表所。莫耳數。此結果如 G46D^G46D V.E6J5G ；〇46ΒΛΕβ11(} , F667Yj,G46D , g^YM?iA^^ordvcePin G46D 0.221 G46D，E615G 1.56 G46D，E615G，F667Y 893.6 G46D，F667Y 0.74 進之十億分之一莫耳 ----τ I .i--裝-- (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作衽印製

從這些結果頰示：E615G與F667Y兩個突變是能有效的將！ cordycepin分子引進DNA所必需的。訂實例IX | 利用G46D ’ E615G Taq聚合酶進行驗分解dn A定序反應 ! 本實例説明··本發明之經修飾聚合酶可應用於鹼分解定丨序法，該法是針對部分rNTP取代的dnA。反應混合物中的 f rNTP對dNTP之比例爲介於1:80與1:8之間。引子延長反應 | 是在含有50毫莫耳的百新（Bicine)(胺基，胺基-二（2 羥基〔乙基）甘胺酸；pH 8.3)，2 5毫莫耳的醋酸鉀與2.5毫莫耳的卜氯化鍰的緩衝液中進行。進行四種各別的反應，每個反應 I 中含有4種rNTPs。在每個反應中（5 0微升）含有各別爲200 | 亳莫耳的 dATP，dCTP，dGTP與dTTP (Perkin-Elmer)，以及十億分之0.09莫耳的已連接5’-[32P]標定的DG48 (Lawyer红 I ! I -46- I 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 528802 A7 B7 五、發明説明（44 ) ai·, 1993，PCR Methods and Applications 2: 275-287)的 Ml 3mpl 8單股DNA模版。反應中同時還分別含有2.5，2.5， 2·5或2 5 的 rATP，rCTP，rGTP或rUTP。四個反應中每一個反應都是藉由加入7單位的G46D， E615G Taq DNA聚合酶才開始進行的，並置於75°C中作用 1 0分鐘。反應最後經由加入1 〇微升的60 mM EDTA來終止，並置於冰上。將每個反應的2 0微升的反應物加入8 0 微升含有50 mM Bicine (pH 8.3)，25 mM醋酸鉀溶液與2.5 mM氯化鎂中。藉由加入7微升的1當量（n)氫氧化鈉，並於 9 8 °C下作用1 5分鐘，則可產生分解的產物。反應最後以7 微升的1當量氯化氫加以中和。每個反應各加入3 12微升的 95%酒精與1 〇微升3莫耳的醋酸鈉（pH 4.8)進行沉澱。以微量離心收集反應的沉澱物，去除上層液，並以5〇0微升70〇/〇酒精清洗沉降物（pellet)並乾燥之。每個沉澱物以5微升的 0.5倍終止緩衝液（可取自PerKill Elmer，Norwalk CT，該緩衝液含 95% 甲醛，20 mM EDTA與〇·〇5%溴酚藍（bromphenol blue)重新溶解，並在98°C下加熱3分鐘後，直接的注入已先行電泳（pre-electrophoresed)的6 %聚丙醯胺/ 8 Μ尿素的 DNA電泳膠體上進行電泳分析。電泳後將膠體乾燥，並以 X -光片進行曝光反應。從最後得到的χ _光底片中，可清楚的看到超過1〇〇個以上的正確序列之鹼基之序列梯。

實例V ILa^46D，，F667Y Taq DNA聚合酶輿3,去氧核望^磷酸進行DNA定序 -47- 本紙張尺度適财η國家標準（見格（210x^jy ----_---,---^-裝— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂费 528802 A7 B7 五、發明説明（45 ) 本實例説明··經修飾的G46D，E615G，F667Y Taq聚合酶利用3 ’去氧核甞三磷酸來進行DNA定序的應用。此項實驗是以3 ’去氧ATP來進行；然而，也可延伸至使用其它的3 ’ 去氧核甞酸。引子延展反應是在含有50毫莫耳Bicine (pH 8.3)，2 5毫莫耳醋酸鉀，與2.5毫莫耳氯化鎂的緩衝溶液中進行。每個反應各分別含有200 # Μ的dATP，dCTP，dGTP 與dTTP (Perkin-Elmer)與十億分之0.09莫耳的已連接5丨-[32P] 標定的 DG48 (Lawyer gi ai·，1993，PCR Methods and Applications 2_: 27 5-287)的 Ml3mpl8 單股 DNA模版（Perkin-Elmer)。這些反應還各分別含有〇，0.1 ’ 0.25，0.5 ’ 1 ’或 5 a Μ的3’去氧ATP。這些反應的每一個反應都是藉由加入7單位的G46D， E615G，F667Y Taq DNA聚合酶才開始反應的進行，並於 7 5 °C下作用1 0分鐘。反應的終止是藉由1 〇微升6 0毫莫耳 EDTA的加入，並置於冰上。將每個反應的3 0微升反應物以酒精沉澱，並且以終止緩衝液重新溶解，於9 8 °C加熱3 分鐘後，直接注入已先行電泳的6 %聚丙醯胺/ 8莫耳尿素的DNA定序膠體上進行電泳分析。電泳後，將膠體乾燥，並以X -光片進行曝光反應。在這些行列中，於反應時含有cor dye ep in的行列，可清楚的看到終止反應梯。含 cordycepin最多；例如，5 # Μ，的行列，其終止反應梯的平均紋帶（band)，明顯的比其它含較低濃度cordycepin的行列較短。在不含cordycepin的反應行列中，只看到幾乎是全長的產物，沒有終止反應梯。從這些結果顯示：此突變 -48- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填、 :寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 528802 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（46 ) 種酵素可引進cordycepin，而且將此分子引進引子延展產物時，會導致終止反應的發生。本發明方法也可以用3 ’去氧CTP，3’去氧GTP，與3’去氧UTP等來產生〇ΝΑ定序梯。

實例V I 利用G46D E615G Taq DNA聚合酶進杆染抖引子PCR定序反應本實例説明：本發明之經修飾聚合酶在引子染色定序法的應用，該定序法於PCR反應中使用核糖核甞三磷酸，且 rNTP:dNTP的比例爲小於1:30。在4個各另的反應中，每個反應中各分別含有一種rNTP。PCR定序反應於含有25毫莫耳Tris-HCl (pH 9) ’ 5.0¾莫耳氣化鎮與10%甘油（骨豊積比）的緩衝溶液中進行。每個反應同時還含有各500 # Μ的 dATP，dCTP，dGTP，dTTP (Perkin Elmer)，5 X 106樣模(copy)/ 微升的pBSM13+以XmnI限制性内切核酸酶直線化的質體 (stratagene)模版，與 0.05 單位 / 微升的 G46DE615GTaqDNA 聚合酶。核糖-ATP反應（1 0微升）中，含有2.5 a Μ ATP (Pharmacia Biotech)，0.1 # M JOE M13 逆向引子染色（Perkin Elmer)，與 0.1 # Μ 引子 ASC46 (5，-CGCCATTCGCCATTCAG)。核糖-CTP 反應（1 〇微升）中，含有 2.5 a M CTP (Pharmacia Biotech)，0· 1 " M FAM M13 逆向引子染色（Perkin Elmer)，與〇·1 "M引子ASC46。核糖GTP反應（2 0微升）中，含有2.5 "M GTP (Pharmacia Biotech)，0.1 " M TAMRA M13 逆向引子染色（Perkin Elmer)，與 0·1 # Μ引子 ASC46。核糖-UTP反應（20微升）中，含有 16//M UTP (Pharmacia Biotech)，0· 1 #MBOX]VI13逆向引子染色（PerkinElmer)，與0·l//M引子 -：一 —_-49-__ 本紙張尺度適用中酬家檩準（CNS ) M規格（训幻97公釐） n. I- - - —Jt 1 I—-1 1— II I: I ........ - - - I— I.-----II . 1— II » - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 47 47 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 528802 五、發明説明（ ASC46 。和 4 種反應各置於 Perkin Elmer GeneAmp® PCR System 9600熱循環器上預熱（75。〇)，然後進行3〇個95。[，秒叙’ 5 5 C 1 〇秒鐘，以1分鐘時間上升至6 5，在6 5，$ 分鐘的循環反應。rATP與rCTP的反應，各產生6 X 1011個擴增300個驗基對的染料標定樣模產物。而⑷”與⑴丁卩反應則各產生1·2 X 1〇12個擴增30〇鹼基對的染料標定的樣模產物。若不需要各別的酵素DNA定序反應，而決定擴增的PCR 產物之DN Α定序，須將所有反應物集合一起，以鹼，加熱’中和，與沉澱等依序的處理。各別從ATP與CTP反應物中取出4微升，與各別取自GTP與UTP反應的8微升反應物匯集一起。在此匯集的混合物中加入2微升的〇.25莫耳 EDTA (pH 8.0)(終濃度1 〇毫莫耳），！〇微升的莫耳氫氧化納（終濃度200毫莫耳）與1 4微升的水，然後，置於

GeneAmp®PCR System 9600熱循環器上，以 95 °C，作用 5 分鐘，並以1 〇微升的1莫耳氯化氫中和。隨後以150微升的95%乙醇將匯集的反應混合物置於4。(：，作用1 5分鐘，使之〉几灸。在4 C下’微量離心1 5分鐘’收集沉降物，且將上層液吸除。接著，以300微升的70%乙醇清洗沉降物，微量離心5分鐘，將上層液吸除，並使沉降物乾燥。最後將沉降物以6微升的甲醛5 0毫克/毫升的藍聚葡萄糖（Biue dextran)(於25毫莫耳EDTA) 5··1(體積比）溶液重新溶解，並於9 0 °C加熱3分鐘。將1.5微升的沉降物重新溶解液直接 -50· 表紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） j -«---衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 着 1 - 1-二 528802 A7 B7 五、發明説明（48 ) 注入已預電泳的 5% Long Ranger (FMC BioProducts)，6 莫耳尿素定序膠體上。隨後，依據説明，以Perkin Elmer ABI Prism™ 377 DNA定序儀，進行電泳分析。藉由Perkin Elmer ABI PrismTM定序分析軟體的自動化鹼基呼應，以大於99%精確度，決定出PCR擴增的300個驗基對產物之DNA 序列。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 528802 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 A7 __ B7五、發明説明（49 ) 序列清單 (1) 一般資料： (i) 申請者： (A) 姓名：F. Hoffmann-La Roche公司 (B) 街：Grenzacherstrasse 124 (C) 城市：巴塞 (D) 省：BS (E) 國名：瑞士 (F) 郵遞區號·· CH-4070 (G) 電話：（0) 61 688 24 03 (H) 傳眞··（0) 61 688 13 95 (I) 電傳：962292/965512 hlr ch (ii) 發明名稱：經修飾之熱穩定性DNA聚合酶 (iii) 序歹丨J數目·· 8 (iv) 電腦謂取型式： (A) 中型：軟碟磁片 (B) 電腦·· IBM PC相容的 (C) 作業系統：PC-DOS/MS-DOS (D) 軟體：Patentln釋出 #1.0，1.30版(EPO) (vi)先前申請資料： (A) 申請號碼：US 60/023,376 (B) 核准曰期：06-AUG-1996 (2)序列編*5虎：1之相關貧料. (i)序列性質： -52- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Φ ，項再填. 裝· 訂 528802 A7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ____B7_五、發明説明（50 ) (A) 長度：7個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)位相幾何學：線性 (ii)分子類型··胜肽 (ix)特徵： (A) 名稱/要點：胜肽 (B) 位置：4 (D)其它資料：/label=Xaa /note=’，wherein Xaa is any amino acid but not Glu” (ix)特徵： (A) 名稱/要點：胜肽 (B) 位置·· 7 (D)其它資料：/label^Xaa /note=Mwherein Xaa is lie or Valf, (xi)序列描述：序列編號：1 : Ser Gin lie Xaa Leu Arg Xaa 1 5 (2)序列編號·· 2之相關資料： (i) 序列性質： (A) 長度：7個胺基酸 (B) 類型··胺基酸 (D)位相幾何學：線性 (ii) 分子類型··胜肽 (ix)特徵·· -53- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事- 4 ▼項再填· 裝— :寫本頁)

、1T 528802 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 _ B7五、發明説明（51 ) (A) 名稱/要點··胜肽 (B) 位置·· 7 (D)其它資料·· /label=Xaa /note=Mwherein Xaa is lie or Val" (xi)序列描述：序列編號：2 : Ser Gin lie Glu Leu Arg Xaa 1 5 (2)序列編號：3之相關資料： (i) 序列性質： (A) 長度：7個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)位相幾何學：線性 (ii) 分子類型：胜肽 (xi)序列描述··序列編號·· 3 ·· Ser Gin lie Glu Leu Arg Val" 1 5 (2)序列編號：4之相關資料： (i) 序列性質： (A) 長度：7個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)位相幾何學：線性 (ii) 分子類型：胜肽 (xi)序列描述：序列編號：4 : (請先閱讀背面之注意事_ 4 項再填- 裝II ,寫本頁) 、11 着· _-54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 528802 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（52 )

Ser Gin lie Glu Leu Arg lie 1 5 (2)序列編號：5之相關資料： (i) 序列性質： (A) 長度：1 5個胺基酸 . (B) 類型：胺基酸 (D)位相幾何學：線性 (ii) 分子類型··胜肽 (xi)序列描述：序列編號：5 :

Leu Asp Tyr Ser Gin lie Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser 15 10 15 (2)序列編號：6之相關資料： (i) 序列性質： (A) 長度：1 5個胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (D)位相幾何學：線性 (ii) 分子類型：胜肽 (xi)序列描述：序列編號：6 :

Leu Asp Tyr Ser Gin lie Gly Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser 15 10 15 (2)序列編號：7之相關資料： (i)序列性質： (A) 長度：2626個核苷酸基對 (B) 類型：核酸 -55- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） I---J ^---裝------訂-----4^線-IL (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 528802 A7 B7 五、發明説明（53 ) (C) 股別：雙股 (D) 位相幾何學：線性 (ii) 分子類型：DNA (genomic) (iii) 假設性的：無 (iv) 逆向性的··無 (vi)最初來源· (A)微生物:Thermus aquaticus (ix)特徵··

(A) 名稱/要點·· CDS (B) 位置：121..2616 (xi)序列描述··序列編號·· 7 : AAGCTCAGAT CTACCTGCCT GAGGGCGTCC GGTTCCAGCT GGCCCTTCCC GAGGGGGAGA 60 GGGAGGCGTT TCTAAAAGGC CTTCAGGACG CTACCCGGGG GCGGGTGGTG GAAGGGTAAC 120 ATG AGG GGG ATG CTG CCC CTC TTT GAG CCC AAG GGC CGG GTC CTC CTG 168

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 15 10 15 GTG GAC GGC CAC CAC CTG GCC TAC CGC ACC TTC CAC GCC CTG AAG GGC 216

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30 CTC ACC ACC AGC CGG GGG GAG CCG GTG CAG GCG GTC TAC GGC TTC GCC 264

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gin Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 AAG AGC CTC CTC AAG GCC CTC AAG GAG GAC GGG GAC GCG GTG ATC GTG 312

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val lie Val 50 55 60 GTC TTT GAC GCC AAG GCC CCC TCC TTC CGC CAC GAG GCC TAC GGG GGG 360

Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80 TAC AAG GCG GGC CGG GCC CCC ACG CCG GAG GAC TTT CCC CGG CAA CTC 408

Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gin Leu 85 90 95 GCC CTC ATC AAG GAG CTG GTG GAC CTC CTG GGG CTG GCG CGC CTC GAG 456

Ala Leu lie Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu 100 105 110 GTC CCG GGC TAC GAG GCG GAC GAC GTC CTG GCC AGC CTG GCC AAG AAG 504

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys 115 120 125 -56- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） —,—·—»---批衣------訂------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 528802 A7 B7 五、發明説明（54 ) GCG GAA AAG GAG GGC TAC GAG GTC CGC ATC CTC ACC GCC GAC AAA GAC 552

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg lie Leu Thr Ala Asp Lys Asp 130 135 * 140 CTT TAC CAG CTC CTT TCC GAC CGC ATC CAC GTC CTC CAC CCC GAG GGG 600

Leu Tyr Gin Leu Leu Ser Asp Arg lie His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160 TAC CTC ATC ACC CCG GCC TGG CTT TGG GAA AAG TAC GGC CTG AGG CCC 648

Tyr Leu lie Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro 165 170 175 GAC CAG TGG GCC GAC TAC CGG GCC CTG ACC GGG GAC GAG TCC GAC AAC 696

Asp Gin Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn 180 185 190 CTT CCC GGG GTC AAG GGC ATC GGG GAG AAG ACG GCG AGG AAG CTT CTG 744

Leu Pro Gly Val Lys Gly lie Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu 195 200 205 GAG GAG TGG GGG AGC CTG GAA GCC CTC CTC AAG AAC CTG GAC CGG CTG 792

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu 210 215 220 AAG CCC GCC ATC CGG GAG AAG ATC CTG GCC CAC ATG GAC GAT CTG AAG 840

Lys Pro Ala He Arg Glu Lys He Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240 CTC TCC TGG GAC CTG GCC AAG GTG CGC ACC GAC CTG CCC CTG GAG GTG 888

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 GAC TTC GCC AAA AGG CGG GAG CCC GAC CGG GAG AGG CTT AGG GCC TTT 936

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe 260 265 270 CTG GAG AGG CTT GAG TTT GGC AGC CTC CTC CAC GAG TTC GGC CTT CTG 984

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 GAA AGC CCC AAG GCC CTG GAG GAG GCC CCC TGG CCC CCG CCG GAA GGG 1032

Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 290 295 300 GCC TTC GTG GGC TTT GTG CTT TCC CGC AAG GAG CCC ATG TGG GCC GAT 1080

Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 305^ 310 315 320 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) CTT CTG GCC CTG GCC GCC GCC AGG GGG GGC CGG GTC CAC CGG GCC CCC 1128

Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro 325 330 335 GAG CCT TAT AAA GCC CTC AGG GAC CTG AAG GAG GCG CGG GGG CTT CTC 1176

Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu 340 345 350 GCC AAA GAC CTG AGC GTT CTG GCC CTG AGG GAA. GGC CTT GGC CTC CCG 1224

Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro 355 360 365 CCC GGC GAC GAC CCC ATG CTC CTC GCC TAC CTC CTG GAC CCT TCC AAC 1272

Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leii Asp Pro Ser Asn 370 375 380 -57- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 528802 A7 B7 五、發明説明（55 ) ACC ACC CCC GAG GGG GTG GCC CGG CGC TAC GGC GGG GAG TGG ACG GAG Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 385 390 395 400 GAG GCG GGG GAG CGG GCC GCC CTT TCC GAG AGG CTC TTC GCC AAC CTG Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu 405 410 415 TGG GGG AGG CTT GAG GGG GAG GAG AGG CTC CTT TGG CTT TAC CGG GAG Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 420 425 430 GTG GAG AGG CCC CTT TCC GCT GTC CTG GCC CAC ATG GAG GCC ACG GGG Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 GTG CGC CTG GAC GTG GCC TAT CTC AGG GCC TTG TCC CTG GAG GTG GCC Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 450 455 460 1320 1368 1416 1464 1512 請閲讀背面之注意事項再經濟部 t矣標準局員工消費合作社印製 GAG GAG ATC GCC CGC CTC GAG GCC GAG GTC TTC CGC CTG GCC GGC CAC Glu Glu 工 le Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 465 470 475 480 CCC TTC AAC CTC AAC TCC CGG GAC CAG CTG GAA AGG GTC CTC TTT GAC Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gin Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495 GAG CTA GGG CTT CCC GCC ATC GGC AAG ACG GAG AAG ACC GGC AAG CGC Glu Leu Gly Leu Pro Ala lie Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 TCC ACC AGC GCC GCC GTC CTG GAG GCC CTC CGC GAG GCC CAC CCC ATC Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro lie 515 520 525 · GTG GAG AAG ATC CTG CAG TAC CGG GAG CTC ACC AAG CTG AAG AGC ACC Val Glu Lys lie Leu Gin Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 530 535 540 TAC ATT GAC CCC TTG CCG GAC CTC ATC CAC CCC AGG ACG GGC CGC CTC Tyr lie Asp Pro Leu Pro Asp Leu lie His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560 CAC ACC CGC TTC AAC CAG ACG GCC ACG GCC ACG GGC AGG CTA AGT AGC His Thr Arg Phe Asn Gin Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 TCC GAT CCC AAC CTC CAG AAC ATC CCC GTC CGC ACC CCG CTT GGG CAG Ser Asp Pro Asn Leu Gin Asn lie Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gin 580 585 590 AGG ATC CGC CGG GCC TTC ATC GCC GAG GAG GGG TGG CTA TTG GTG GCC Arg lie Arg Arg Ala Phe lie Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala 595 600 605 CTG GAC TAT AGC CAG ATA GGG CTC AGG GTG CTG GCC CAC CTC TCC GGC Leu Asp Tyr Ser Gin lie Gly Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 610 615 620 GAC GAG AAC CTG ATC CGG GTC TTC CAG GAG GGG CGG GAC ATC CAC ACG Asp Glu Asn Leu lie Arg Val Phe Gin Glu Gly Arg Asp lie. His Thr 625 630 635 640 1560 1608 1656 1704 1752 1800 1848 1896 1944 1992 2040 寫本頁 -58 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）

GAG ACC GCC AGC TGG ATG TTC GGC GTC CCC CGG GAG GCC GTG GAC CCC Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 CTG ATG CGC CGG GCG GCC AAG ACC ATC AAC TTC GGG GTC CTC TAC GGC Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr lie Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 ATG TCG GCC CAC CGC CTC TCC CAG GAG CTA GCC ATC CCT TAC GAG GAG Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gin Glu Leu Ala lie Pro Tyr Glu Glu 675 680 685 GCC CAG GCC TTC ATT GAG CGC TAC TTT CAG AGC TTC CCC AAG GTG CGG Ala Gin Ala Phe lie Glu Arg Tyr Phe Gin Ser Phe Pro Lys Val Arg 690 695 700 GCC TGG ATT GAG AAG ACC CTG GAG GAG GGC AGG AGG CGG GGG TAC GTG Ala Trp lie Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 705 710 715 720 GAG ACC CTC TTC GGC CGC CGC CGC TAC GTG CCA GAC CTA GAG GCC CGG Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg 725 730 735 GTG AAG AGC GTG CGG GAG GCG GCC GAG CGC ATG GCC TTC AAC ATG CCC Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 GTC CAG GGC ACC GCC GCC GAC CTC ATG AAG CTG GCT ATG GTG AAG CTC Val Gin Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765 * TTC CCC AGG CTG GAG GAA ATG GGG GCC AGG ATG CTC CTT CAG GTC CAC Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gin Val His 770 775 780 GAC GAG CTG GTC CTC GAG GCC CCA AAA GAG AGG GCG GAG GCC GTG GCC Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 785 790 795 800 CGG CTG GCC AAG GAG GTC ATG GAG GGG GTG TAT CCC CTG GCC GTG CCC Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 CTG GAG GTG GAG GTG GGG ATA GGG GAG GAC TGG CTC TCC GCC AAG GAG Leu Glu Val Glu Val Gly lie Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 830 TGATACCACC 528802 A7 B7 五、發明説明（56 ) 2088 2136 2184 2232 2280 2328 2376 2424 2472 2520 2568 2616 2626 (2)序列編號：8之相關資料： ⑴序列性質： (A)長度：832個胺基酸 _ - 59 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----f-------^^裝------^ 訂------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製 528802 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製五、發明説明（57 ) (B)類型··胺基酸 (D)位相幾何學：線性 (ii)分子類型：蛋白質 (xi)序列描述：序列編號：8 :

Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 15 10 15

Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30

Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gin Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45

Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val lie Val 50 55 60

Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80

Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gin Leu 85 90 95

Ala Leu lie Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu 100 105 110

Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys 115 120 125

Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg lie Leu Thr Ala Asp Lys Asp 130 135 140 ^

Leu Tyr Gin Leu Leu Ser Asp Arg lie His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160

Tyr Leu lie Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro 165 170 175

Asp Gin Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn 180 185 190

Leu Pro Gly Val Lys Gly lie Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu 195 200 205

Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu 210 215 220

Lys Pro Ala lie Arg Glu Lys lie Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240

Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255

Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe 260 265 270 -60- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ----η —11^^--------IT----- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 528802 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（58 )

Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285

Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 290 295 300

Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 305 310 315 320

Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro 325 330 335

Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu 340 345 350

Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro 355 360 365

Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 370 375 380

Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 385 390 395 4〇〇

Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu 405 410 415

Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Ara Glu 420 425 430 s

Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445

Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 450 455 460

Glu Glu lie Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 465 470 475 480

Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gin Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495

Glu Leu Gly Leu Pro Ala lie Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 •Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro He 515 520 525

Val Glu Lys lie Leu Gin Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 530 535 540

Tyr He Asp Pro Leu Pro Asp Leu He His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560

His Thr Arg Phe Asn Gin Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575

Ser Asp Pro Asn Leu Gin Asn He Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gin 580 585 590

Arg lie Arg Arg Ala Phe lie Ala Glu Glu Gly Trp· Leu Leu Val Ala 595 600 605 -61 -

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐I (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂豐_ 528802 A7 B7 五、發明説明（59 )

Leu Asp Tyr Ser Gin lie Gly Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 610 615 620

Asp Glu Asn Leu lie Arg Val Phe Gin Glu Gly Arg Asp lie His Thr 625 630 635 640

Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655

Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr lie Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670

Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gin Glu Leu Ala 工le Pro Tyr Glu Glu 675 680 685

Ala Gin Ala Phe lie Glu Arg Tyr Phe Gin Ser Phe Pro Lys Val Arg 690 695 700

Ala Tirp lie Glu Lys Thr· Leu Glu Glu Gly Arg Axg Airo Gly Tyr Val 7〇5 710 715 720

Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arq 725 730 735

Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750

Val Gin Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765

Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gin Val His 770 775 780

Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 785 790 795 800

Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815

Leu Glu Val Glu Val Gly lie Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 830 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝_ 訂豐_ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -62- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格(210X297公釐）

Claims

528802第086110793號專利申請案 B8 no 中文申請專利範圍替換本(92年2月）^

六、申請專利範圍u。日正丨 1. 一種重組熱穩定D.NA聚合酶，其為熱穩定屬 DNA聚合酶之突變型，其中該熱穩定屬DNA聚合酶具有一包含胺基酸基序SerGlnlleGluLeuArgXaa(序列編號：2 )之胺基酸序列，其中在該序列基序之第7位置之Xaa為一纈胺酸殘基（Val)或一異白胺酸殘基（lie); 其中該突變型已被修飾為在該序列基序的第4位置含有非麩胺酸（Glu)之胺基酸；及其中該突變形與該熱穩定屬DNA聚合酶相比，對引進之特殊核替具有降低的排斥性。 2. —種核酸序列，其係編碼根據申請專利範圍第1項之重組熱穩定DNA聚合酶。 3. 根據申請專利範圍第1項之重組熱穩定DNA聚合酶，其進一步特徵為該聚合酶併入一特殊核答酸之能力，相對於該對應天然型聚合酶併入特殊核甞酸之能力，係增加至少2 0倍。 4. 根據申請專利範圍第3項之重組熱穩定DNA聚合酶，其進一步特徵為該聚合酶具有足夠用於DNA定序反應之活性，該反應所包含特殊核甞酸與相應的一般核甞酸之比例為1 : 1或更少。 5. 根據申請專利範圍第4項之重組熱穩定DNA聚合酶，其中該非一般核替酸為一核酷核替三鱗酸。 6. 根據申請專利範圍第5項之熱穩定DNA聚合酶，其中該核醣核甞三磷酸之濃度為低於約100 # Μ及該相應之一般核甞酸之濃度為大於約100/ΖΜ。本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 528802 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 7. 根據申請專利範圍第6項之熱穩定DNA聚合酶，其中該天然存在DNA聚合酶係選自下列群組： aquaticus ^ Thermus caldophilus f Thermus chliarophilus ? Thermus filiformis，Thermus flavus，Thermus oshimai ， Thermus ruber f Thermus scotoductus，Thermus silvanus ， ThermusMjZQ5，Thermus及/Thermus thermophilus之 DNA聚合酶。 8. 根據申請專利範圍第6項之熱穩定DNA聚合酶，其中該熱穩定r/zemws屬DNA聚合酶包含胺基酸序列 LeuAspTyrSerGlnlleGluLeuArgValLeuAlaHisLeuSer(序列編號：5 )。 9. 根據申請專利範圍第2項之核酸序列，其中該重組熱穩定DNA聚合酶具有足夠用於DNA定序反應之活性。 10. 根據申請專利範圍第9項之核酸序列，其中該DNA定序反應所包含特殊核甞酸與相應的一般核苷酸之比例為 1 : 1或更少。 11. 根據申請專利範圍第1 0項之核酸序列，其中該特殊核甞酸為核醣核甞三磷酸。 12. 根據申請專利範圍第1 0項之核酸序列，其中該熱穩定屬 DNA聚合酶包含胺基酸序列 LeuAspTyrSerGlnneGluLeuArgValLeuAlaHisLeuSer(序列編號：5)。 13· —種用於DNA定序反應之組合物，該組合物包含··核酸模版；與該模版互補的寡核苷酸引子；根據申請專 -2- 裝訂本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) A B CD 528802 夂、申請專利範圍利範圍第5項之重組熱穩sDNA聚合酶，一般dNTpy々混合物’及至少一種特殊核苷酸，其中該特殊核苷酸為核醣核菩酸及其中該特硃核苷酸與該相應的一般核苷酸的比例為1:1或更少。 14.根據申請專利範圍第1 3項之組合物，其中該核糖核苷酸之濃度為低於約1〇〇 # M，及其相應之一般核苷酸之濃度為大於約100 # Μ。 15·根據申請專利範圍第1 4項之組合物，其進一步之特徵為該特殊核菩酸係未經標定。 16. —種定序核酸標的之方法，該方法包含下列步騾： (a) 在DNA定序反應中加入特殊核甞酸與相應之一般核荅酸，其中該特殊核苷酸與其相應一般核菩酸的比例小於約1:1，其中DNA定序反應含有根據申請專利範圍第1項之重組熱穩定DNA聚合酶； (b) 在延展引子之條件下，處理步驟⑷反應以產生包含該特殊核甞酸的引子延展產物； (c) 在水解違引子延展產物之條件下，處理步驟（乜) 之引子延展反應產物； (d) 自步騾（c)中解離反應產物，並 (e) 決定核酸標的的序列。 17. 根據申請專利範圍第16項之方法，其中該特殊核嘗酸為核醋核菩酸。 18. 根f申請專利範圍第17項之方法，其中該核醣核嘗酸之濃度為約0.1 //M至100/zΜ。 -3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇χ297公釐) 8 8 8 8 A B c D 528802 六、申請專利範圍 19. 根據申請專利範圍第1 8項之方法，其中該相應之一般核甞酸之濃度為約50 #Μ至5 00 #Μ。 20. —種用於定序核酸之套組，其包含根據申請專利範圍第1項之重組熱穩定DNA聚合酶及一般dNTPs及至少一種特殊核甞酸之混合物，其中該特殊核苷酸與該相應的一般核嘗酸之比例小於1。 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)