TWI250020B

TWI250020B - Neurotoxin implant

Info

Publication number: TWI250020B
Application number: TW090112093A
Authority: TW
Inventors: Stephen Donovan; Daniel G Brady
Original assignee: Allergan Sales Llc
Priority date: 2000-06-02
Filing date: 2001-05-21
Publication date: 2006-03-01
Also published as: CN1446081A; AU2001272927B2; US6585993B2; EP1289504B1; DE60118550T2; WO2001093890A2; NZ522611A; ATE322251T1; AU2001265043A1; AR028669A1; US6383509B1; JP2003535117A; US20020028216A1; JP2012067144A; KR100732810B1; DE60118550D1; WO2001093890A3; ES2259665T3; US6312708B1; CN100536915C

Description

1250020

經濟部中央標準局員工消費合作社印製背景本發明是有關控制釋出之藥物遞送系統。特言之明疋有關控制釋出之神經毒素遞送系統。控制釋出系統指可在特定時期中以預内遞送藥物。一舻而丄雜山、古t，义千万、右月丘夕 I而a，釋出速率由系統設計而決定，且大多和如pH之環境條件無關。可在數年期間遞送藥物之控制釋出系統是已知的。相反的’持續釋出系統通常以24小時以下之時間遞送藥物，且環境因素會影響釋出速率。因此，藥物自植入的控制釋出系（”植入物”）之釋出速率是载劑植入物質及藥物本身物化特性之函數關係典型而s，植入物係由惰性物質所製成，其少或不會謗生宿主反應。控制釋出系統可包括納入載劑中，之具生物活性之藥物。载劑則可爲聚合物或生物陶瓷材質。控制釋出系統可注射’嵌入或植入病人身體所選定之處，並駐留長時間，在此藥物以可提供欲求治療效力之方式及濃度下由植入物所釋出。聚合材質可由於擴散，化學反應或溶劑活化作用而釋出藥物，以及可受磁性，超音波或溫度變化等因素之影響。擴散可始自貯存槽或基質。化學控制可因聚合物降解或藥物自聚合物中解離所致。溶劑活化則涉及聚合物之泡脹或等滲作用。見如Science 249 ; 1527-1533 : 1990 〇膜或貯存槽式植入物依生物活性劑穿越聚合物膜之擴散 -4 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） ——— 1250020 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（2) 而定。基質植入物含有聚合基質，其中生物活性劑係均勻地分佈其中。泡漲·控制之釋出系統通常以親水性質且呈玻璃狀聚合物爲基礎，其在生物流體中或在某些環境刺激存在下會泡漲。較好，所使用的植入物質是實質上無毒，無致癌性，且無免疫原性的。適合的植入物材質包括聚合物，如聚（2 -羥基乙基異丁烯酸酯）（p_HEMA)，聚（N·乙烯基吡咯啶酮（p-NVP)+，聚（乙烯醇）（Pva)，聚（N·丙烯酸）（PAA)，聚二甲基矽氧烷類（PDMS )，乙烯-醋酸乙缔酯共聚物（eVAc)，聚乙晞峨咯啶酮/異丁烯酸酯共聚物，聚甲基異丁烯酸酯 (PMMA)，聚（乳酸）（PLA)，聚（乙醇酸）（PGA)，聚酐類，聚（原酸醋），膠原蛋白及纖維質衍生物及生物陶瓷類，如經嶙灰石（ΗΡΑ)，磷酸三鋁（TCP)及磷酸鋁鈣（ALcap)。乳酸’乙醇酸及膠原蛋白可用來製作具生物可降解性質之植入物。含有使治療性藥物可延長遞送之聚合物之控制釋出系統是已知的。例如，含有非生物可降解聚合物之皮下貯存槽式植入物，可用來釋放出避孕類固醇，如黃體製劑，劑量爲25-30毫克/天高達六個月（及N〇rplant®植入物）。另外，葡聚酷（分子量約2百萬）也可自植入物聚合物中釋出。植入物材質可以是生物可降解的或生物可侵蝕的。生物可侵餘的植入物之優點是其勿需自病人中移出。生物可侵蝕的植入物可以生物活性物質之膜或基質釋出爲據。自 PLA_PGA中製成之生物可降解的微球已知可供皮下=肌内 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-5- 1250020 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（）投藥。可降解之植入物在其控制釋出的整個期間内較好保持其結構完整性，如此若欲求或在正常要求下移去是可移去的。若納入之藥下降至治療水平以下後，可生物降解之植入物可完全降解而不保留任何藥物，其可在更長期間以低水平釋出。由可降解材料製成之皮下植入物及可注射的微球，如乳酸-乙醇酸共聚物，聚己内酮及膽固醇，以遞送類固醇，是已知的。蛋白質植入物用於大分子，如蛋白質，之控制釋出系統是已知的。因此，其中納有高分子量蛋白質之生物可相容的聚合團塊，已被植入並示出在超過100天之長時期下可使蛋白質連續地釋出。各種不安定的，高分子量酵素/如驗性磷酸酶，分子量88 kD，及催化酶，分子量250 kD)已被納入生物相容之聚合植入物内，並有長期且連續釋出之特性。一般而言，增加澆鑄溶液中聚合物濃度會降低蛋白質自植入物釋出之最初速率。Nature 263 ; 797-800 : 1976。另外，白蛋白可自EVAc植入物中釋出，且聚賴胺酸可自膠原蛋白爲基礎之微球中釋出。Mallapragada S.K. et al., 在 p431，chp27, Von Recum，A.F. Handbook of Biomaterials Evaluation, second edition, Taylor & Francis ( 1999) 0 另外，也有人研究破傷風類毒素自微球之釋出，同上，在 432。多孔的EVAc共聚物皮下嵌入也已示出可在長達100 天期間釋放胰島素。同上在433。 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^ 、 Γ 良 • m in i n -1 n I ·ϋ ϋ ϋ« I 0 ·ϋ ϋ ϋ ϋ ϋ- n n I 、· 1 n ·ϋ n ·ϋ i·— 1_1 I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250020 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（）再者，已知將蛋白質如人類生長激素（hGH)(分子量約26 kD)包膠至聚合基質内，其當植入時可令人類生長激素於活體内釋出達約一週。美國專利案No. 5,667,808。控制釋出系統（即’’植入物ff)使蛋白質之釋放呈現高的最初爆發，繼之以最低之釋出。不幸地，由於在控制釋出基質内高濃度的蛋白質使其分子易於凝集且易形成變性的，具免疫原性的，蛋白質濃縮物。脈動式釋出植入物水凝膠已被用來構築單脈衝及多脈衝之藥物遞送植入物。單脈衝植入物可等滲地控制或溶化地控制。Doelker E., Cellulose Derivatives, Adv Polym. Sci 107 ； 199-265 : 1993。已知某些物質自植入物之多重脈衝可由反應環境變化而達成，環境變化變數如溫度（Mater Res Soc Symp Proc， 331 ； 211-216 ： 1994 ; J. Contr Rel 15 ; 141-152 : 1991)， pH 値（Mater Res Soc Symp Proc，33 1 ; 199-204 : 1994)，離子強度（React Polym，25 ; 127-137 : 1995)，磁場（J.

Biomed. Mater Res, 21 ; 1367-1373 : 1987)或超音波。不幸地，由非可生物降解之聚合物所製成之皮下可植入式藥物團塊，具有需外科植入及移除之缺點。使用生物可相容且生物可侵蚀之植入物可克服非生物可降解之植入物之明顯缺點。生物可降解之植入物可以長時間釋出藥物，並可同時或接續地將聚合物降解在組織内或組份，由是避免移除植入物的任何需求。如見，Drug Development and Industrial Pharmacy 24(12) ; 1129·1138 : 1998 0 -7- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----------I----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂--------線· l25〇〇2〇五、發明說明（ 5 可降解的聚合物可以是表面塊或均質妝的取人μ 1又蝕心聚泛物，和呈現團々聚$物相反。表面可侵ϋ之聚人你π 表面隆鉉，rxt U又蚀'^灰合物僅自其外宁 Q此藥物之釋出和聚人物合的此臂人私 f㈣口物知蝕速率成比例。適 7此灰合物可以是聚酐。訂素厭氧肉肉毒梭菌可產生強力”肽神經毒嶽^素，其可在人類及動物令造成神經麻痺性病 ^冉（馬肉毒毒素病。肉毒梭菌之胞子見於土壤中，並豕用罐頭工廠之不適當滅菌及熔封之食品容器中生長，此爲許多肉毒毒素病的病因。肉毒毒素病之作用通常在吃下受肉毒梭菌培養物或胞子感染之食品後18至36小時後出現。很顯然地，肉毒毒素可未減毒地通過腸遒内襯，並侵犯周邊運動神經元。肉毒毒素中毒之症狀，可由難以行走’吞識及説話發展成呼吸肌肉之麻痒及死亡。線經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A型肉母毒素已知是人類最致命的天然生物作用劑。約 5 〇微微克商品化之A型肉毒毒素（純化之神經毒素複合物）疋老鼠之LD5〇(即1單位）。1單位的BOTOX®含有約5 0微微克（約56原子）的A型$毒毒素複合物。令人感興趣的，在莫耳濃度基礎上，A型肉毒毒素之致命率均爲破傷風的ls 十億倍，爲氰化鈉的約600百萬倍，爲眼鏡蛇毒素的約3 0 百萬倍’及傷寒的約1 2百萬倍。Singh，Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins，p63_84 (ch4) of Natural Toxins II， edited by B. R. Singh et al., Plenum Press, New York (1996) (其中所陳述的A型肉毒毒素0.3毫微克LD 5〇相當於1單 -8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250020 A7 B7 五、發明說明（6 ) 位’是約0.05耄微克BOTOX®相當於1單位之事實之校正）。1單位（u)的肉毒毒素定義爲於腹膜内注入重各18_ 2 0克之雌的Swiss Webster -老鼠時之LD 5。値）。已鑑定出七種免疫學上不同的肉毒神經毒素，分別爲 A , B，Ci，D，E，F及G血清型之肉毒神經毒素，其各自由型特異抗體之中和作用可予以區別。不同的肉毒毒素血清型因動物種類而異，其可影響所謗生之麻痒現象及其嚴重度和作用期。例如，已決定知A型肉毒毒素和B型比較下，以在大鼠身上造成之麻痺速率來測度，前者強5〇〇倍以上。另外，B型肉毒毒素在48〇單位/公斤之劑量下，於靈長類中是無毒的，此是A型靈長類中LD5〇之約12倍。很顯然，肉毒毒素以高親和力結合至膽鹼能運動神經元，其可轉位至神經元並阻斷乙醯膽驗之釋出。估不論血清型，毒素中毒之分子機制似乎是相似的，且至少涉及三個步驟或階段。在第一個步驟中，毒素經由重鏈，Η鏈，及細胞表面受體間特異的交互作用而可與標的神經j之突觸前膜結合；受體對各型肉毒毒素及破傷風毒素而言被視爲是不同的。H鏈之羧基末端片段，Η。，對於將毒素對準在細胞表面上似乎是重要的。在第二步驟中，毒素可穿越已中毒細胞之漿膜。毒素先經由受體-調介之細胞攝粒作用而爲細胞所吸入，再形成含有母素心内囊胞。毒素再自内囊胞中逃出進入細胞之胞質内。此步驟被視爲由Η鏈之胺基末端片段，Hn，所調介，其可因反應pH値約5.5以下而啓動毒素之構型變化。已知 -9 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格⑵G x 297公釐） ---------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) !25〇〇2〇 A7 _______B7 五、發明説明（7 ) 内囊胞具有質子泵，其可減低内囊胞内之pH値。構型之移動會曝露出毒素之疏水性殘基’此令毒素本身包埋在内囊胞膜内。毒素（或最少是輕鏈）再轉位經由内囊胞膜至胞質内。肉毒毒素活性機制的最後步驟似乎涉及連接重鏈（Η鏈）及輕鏈（L鏈）之雙硫鍵之還原。肉毒及破傷風毒素之完整的毒性是包含在完全毒素之L鏈上，· L鏈是一種鋅（Ζη++)肽鏈内切酶，其所選擇性解離之蛋白質是具有漿膜之胞質表面之含神經遞質小囊在確認及停泊上，以及囊與漿膜融合上所必要之蛋白質。破傷風神經毒素，及Β，d，F及G型肉毒毒素可造成突觸短素（Synapt〇brevin)(也稱爲與囊有關之膜蛋白質（VAMP))之降解，其爲一種突觸體膜蛋白質。出現在突觸囊胞質表面的大多數VAMP，可因這些解離事件任一者之結果而被移去。A及E血清型可解離SNAP-2 5。山血清型最早被認爲可解離桑塔素（syntaxin)，但發現其可解離桑％素及SNAP- 25。各毒素可特異地解離不同的鍵 (除了破傷風及B型係解離相同的鍵）。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 肉毒毒素在臨床定位上已被用於治療特徵在於過度活躍之骨骼肌之神經肌肉失調症上。A型肉毒毒素已爲FDA在 1989許可應用於治療臉痙攣，斜視及半面痙攣。非a型肉毒毒素血清型和A型比較下，前者顯然有較低之強度及/或較短的活性期。A型肉毒毒素周邊肌内之臨床作用，通常可在注射1週内看得到。由於A型肉毒毒素單一劑肌内注射而獲致之症狀舒緩典型作用期平均約3個月。 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公羡） 1250020 A7 B7 五、發明説明（8 ) 雖然所有的肉毒毒素血清型很明顯的可抑制神經肌肉接合點處神經遞質乙醯膽鹼之釋出，其係經由影響不同的神經分泌性蛋白質及/或在不同部位解離這些蛋白質而如此進行。例如，A及E型肉毒毒素可解離25 kD突觸體相關的蛋白質（SNAP - 2 5 )，但其係對準此蛋白質内不同的胺基酸序列。B，D，F及G型肉毒毒素作用在與囊一相關的蛋白質 (VAMP，也稱爲突觸短素），且各血清型解離不同位置之蛋白質。最後，Ci型肉毒毒素已示出可解離桑塔素及 SNAP - 25。這些在作用機制上之差異可影響各種肉毒毒素血清型之相對強度及/或作用期。很明顯的，肉毒毒素之受質可見於各種不同的細胞型式中。見如Biochem，J. 1 ; 339 (pt 1) : 159-65 : 1999，及 Mov Disord，10(3) : 376 : 1995 (胰臟小島B細胞含有至少SNAP - 2 5及突觸短素）。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 肉毒毒素蛋白質分子之分子量，對七種已知之肉毒毒素血清型而言是約150 kD。令人感興趣的，肉毒毒素係以複合物型式由梭菌所釋出，其中包括150 kD肉毒毒素蛋白質分子，加上相關之非毒素蛋白質。因此，A型肉毒毒素複合物可以900 kD，500 kD及300 kD型式由梭菌產生。B及 Ci型肉毒毒素很明顯的僅以700 kD或500 kD複合物型式產生。D型肉毒毒素則以300 kD及500 kD複合物型式產生。最後，E及F型肉毒毒素則僅以約300 kD複合物型式產生。複合物（即分子量大於約150 kD)咸信含有非毒素血球凝集素蛋白質，及非毒素及無毒性的非血球凝集素蛋白質。此二非毒素蛋白質（其加上肉毒毒素分子包括相關的神經毒素 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） 1250020 A7 B7 五、發明説明（9 ) 複合物）其可對肉毒毒素分子之變性提供穩定性，且當毒素被攝入時可保護免於消化性酸素之作用。另外，也可能較大的（大於約150 kD分子量）肉毒毒素複合物將使得肉毒毒素由肌内注射位置處之擴散速率減緩。試管内研究已示出，肉毒毒素可抑制由钾陽離子所謗導的乙醯膽驗及正腎上腺素自腦幹組織及初級細胞培養物中之釋出。另外有報告指出，肉毒毒素可抑制脊柱神經之初級培養物中甘胺酸及穀胺醯胺唤起的釋出，且在腦突觸體製劑中肉毒毒素可抑制神經遞質乙醯膽鹼，多巴胺，正腎上腺素各自之釋出（Habermann E.，et al_, Tetanus Toxin and Botulinum A 及 C Neurotoxins Inhibit Noradrenaline Release From Cultured Mouse Brain, J. Neurochem 51(2) ； 552-527 ： 1998)CGRP，P物質及穀胺醯胺亦然（Sanchez-Prieto, J·，et al·, Botulinum Toxin A Blocks Glutamate Exocytosis From Guinea Pig Cerebral Cortical Synaptosomes, Eur J. Biochem. 165 ; 675-681 : 1987。因此，當使用適度濃度，大多數神經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經遞質之刺激·謗生之釋出可爲肉毒毒素所阻斷。見Pearce, L. B., Pharmacologic Characterization of Botulinum Toxin For Basic Science and Medicine，Toxicon 35(9) ; 1373-1412 ，在 1393 (1997) ; Bigalke H·，et al·，Botulinum A

Neurotoxin Inhibits Non-Cholinergic Synaptic Transmission in Mouse Spinal Cord Neurons in Culture, Brain Research 360 ; 3 18-324 ： 1985 ; Habermann E., Inhibition by Tetanus and Botulinum A Toxin of the Release of [3 H ] Noradrenaline -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1250020 A7 B7 五、發明説明（Λ and [3 H] GABA From Rat Brain Homogenate, Experientia 44 ; 224-226 : 1988，Bigalke H·，et al·，Tetanus Toxin and

Botulinum A Toxin Inhibit Release and Uptake of Various Transmitters, as Studied with Particulate Preparations From Rat Brain and Spinal Cord, Naunyn-Schmiedeberg’s Arch Pharmacol 316 ； 244-251 : 1981，及；Jankovic J. et al·，

Therapy With Botulinum Toxin，Marcel Dekker，Inc·，（1994)， p5 0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A型肉毒毒素之獲得，可在醱酵槽中確立及培養肉毒梭菌培養物，再依已知步驟回收及純化已醱酵之混合物。所有的肉毒毒素血清型最初均以無活性之單鏈蛋白質型式合成，其必需爲蛋白酶所解離或弄缺口才成爲具神經活性。可製備A及G血清型之菌株具有内源的蛋白酶，因此A及G 型可主要以其具活性之型式自細菌培養中回收。相反的， Ci，D及E血清型由無蛋白水解之菌株合成，因此通常以非活化型式自培養物中回收。B及F血清型可由蛋白水解及非蛋白水解菌株所產生，因此可以活性型式或無活性型式回收。然而，即使是蛋白水解菌株，所產生之B型肉毒毒素對所產生之毒素也僅可部份解離。有缺口與無缺口分子之確實比例依培養之長度及溫度而定。因此，B型肉毒毒素任何製劑之特定比例似乎是無活性的，可能歸因於已知和A型比較下，b型肉毒毒素之強度顯然較低些。臨床製劑中無活性肉毒毒素分子之存在，可造成製劑整體的蛋白質負單，其和增加之抗原性有關，非歸因於其臨床效力。另 -13- ^紙張尺度適用中國國家系準（CNS ) A4規格（210/297公瘦1 1250020 A7 B7 五、發明説明（11 ) 外，已知B型肉毒毒素一旦肌内注射，具有較短的活性期，在相同劑量下和A型比較，也不如A型強力。

高品質之晶形A型肉毒毒素可產自肉毒梭菌之Hall A菌株，特性是23 X 107單位/毫克A26〇/A 2 7 8少於0.60，且在凝膠電泳上有明顯的帶狀型式。已知的Shantz過程可用來獲得晶形 A 型肉毒毒素，如 Shantz，E. J.，et al，Properties and Use of Botulinum Toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine，Microbiol Rev· 56 ; 80-99 : 1992。一般而言，A 型肉毒毒素複合物可由培養A型肉毒梭菌於適合的培養基，再自厭氧醱酵中分離及純化。一旦分出非毒素蛋白質，也可使用已知製程獲得純的肉毒毒素，如：純化的A 型肉毒毒素，具約150 kD分子量，及1-2 X 108 LD50單位/ 毫克以上之比強度；純化的B型肉毒毒素，具有約156 kD 分子量，1 - 2 X 1 0 8 LD5G單位/毫克以上之比強度；及經純化的F型肉毒毒素，約155 kD分子量，1-2 X 107 LD50單位 /毫克以上之比強度。經濟部中央標準局員工消费合作社印裝 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 肉毒毒素及/或肉毒毒素複合物可得自List Biological Laboratories, Inc., Campbell, California ; the Cantre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, U.K., Wako (Osaka，Japan)，Metabiologics (Madison，Wisconsin)以及 Sigma Chemicals of St. Louis，Missouri 0 純的肉毒毒素也是不安定的，其通常不用來製備藥學組成物。再者，肉毒毒素複合物，如A型也極易感受由於表面變性，熱及鹼性條件下之變性作用。無活性之毒素可形 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1250020 A7 B7 1? 五、發明説明（）成類毒素蛋白質，其可能具免疫原性。生成之抗體使病人變得難耐毒素之注射。至於酵素，大體而言肉毒毒素之生物活性（其是細胞内肽酶）至少部份是和其三度空間構型有關。因此，A型肉毒毒素可以加熱，各種化學物質之表面拉引及表面乾燥而予以解毒。另外，已知將以已知之培養，醱酵及純化而得之毒素複合物稀釋至藥學組成調和物所使用之十分十分低毒素濃度時，除非存在有適合的穩定劑，會造成毒素快速的解毒作用。將毒素由毫克的量稀釋至每毫升毫微克之溶液會出現難處，因爲在此大量稀釋下會快速流失比毒性。另外，一旦調和成含毒素之藥學組成物，則毒素可使用數月或數年之久。顯然的，已知毒素在製造及混合過程，以及在貯存間可經由穩定劑之使用而穩定之，如白蛋白及明膠。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 含有商品化肉毒毒素之藥學組成物，以商品名BOTOX® 出售（可購自 Allergan，Inc.，of Irvine，California)。BOTOX® 含有經純化的A型肉毒毒素複合物，白蛋白及氯化鈉包裝在無菌且眞空-乾燥型式下。A型肉毒毒素由培養在含有N-Z胺及酵母浸膏之培養基之肉毒梭菌Hall菌株培養物所製成。A型肉毒毒素複合物以一系列酸沉澱法純化自培養溶液，生成由活性且高分子量毒素蛋白質及相關的血球凝集素蛋白質組成之晶狀複合物。晶狀複合物再溶解於含有食鹽水及白蛋白之溶液中，於眞空乾燥前再無菌過濾（0.2微米）。經眞空-乾燥之產物再貯於-5 Ό以下或冷凍中。 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 1250020

五、發明說明（經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 BOTOX⑧可以無菌，無保藏劑之食鹽水在肌内注射前重組〈。BOTOX、小瓶内含有約！⑼單位的由a型肉毒梭菌純化而^來炙神經毒素複合物，〇5亳克人類血清白蛋白，及〇’94克氣化鈉，於無菌且無保藏劑之眞空乾燥型式下。 #爲了重組經眞空-乾燥之Β0Τ0χ⑬，可使用無保藏劑之無菌生理食鹽水（〇 9%注射用氣化鈉），係在適當大小之注射器中吸取適量之稀釋劑。由於Β〇τ〇χ®可因通入汽泡或類似的劇烈攪動而變性，通常是將稀釋劑緩緩注入小瓶内。基於無菌理由，Β0Τ0Χ@較好在自冰箱移出且重組後4小時内投予。在此4小時内，經重組之Β〇τ〇χ®貯於約2 π至約8 1之冰箱中。經重組，冷藏之Β〇τ〇χ®保育其強度達至少二週。Neurology 48 ·· 249-53 ： 1997 〇已有報告指出，A型肉毒毒素臨床定位如下： (1) 約75- 125單位的BOTOX®每劑肌内注射（多重肌肉）可治療頸張力障礙； (2) 5_1〇單位B0T0X@每劑肌内注射可治療眉間紋（眉溝）（5單位肌内注入突肌，且10單位肌内注入各皺狀上肌）； (3) 約3 0-80單位BOTC〇^可治療便秘，係由括約肌内注入恥骨肛門肌； (4) 每條肌肉約1-5單位B0T0X@肌内注射以治療瞼麻痺’係注入上眼險之側險板前輪狀肌及下險之側險板前之輪狀肌。 (5) 爲治療斜視，眼外肌肉由肌内注入約丨巧單位的 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------訂---------線"1^" (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 125〇〇2〇 A 7 經濟部中央榡準局員工消費合作社印製

^~*——_______ B7 發明説明（14^ 。、X /主射量依欲注射之肌肉大小及欲求之肌肉麻痒私度而走（即欲求校正之屈光度量）。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ()爲/口療中風後上肢麻痒，可肌内注射Β〇τ〇χ@至五處不同的上肢屈肌： (a) 屈指深肌：7.5單位至30單位 (b) 屈指淺肌：7.5單位至30單位 (c )尺側屈腕肌〇單位至4 〇單位 (d)橈側屈腕肌：15單位至6〇單位、（e)肱二頭肌：50單位至200單位。五種肌肉在相同治療期間時汪射’如此由肌内注射在各治療期間，病人可在上肢屈肌共接受由90單位至360單位之ΒΟΤΟχ®。 (7)爲治療偏頭痛，25單位BOTOX®顱周注入（對稱地注入眉間，額及顳肌）已示出對偏頭痛之預防性治療有顯著的奴處’此係與溶媒比較而言，並由偏頭痛頻率之減少，最大嚴重度’相關之嘔吐及在投予2 5單位注射的3個月期間急性藥物使用減少等測知。已知A型肉毒毒素之效力可長達12個月（Eur〇peaji j

Neurology 6 (Supp 4) : S111-S1150 : 1999),且在某些狀況下可長達 27 個月（The Laryngoscope 109 : 1344-1346 ·· 1999)。然而，B0T0X®肌内注射的一般注射期約3至4個 A型肉毒毒素成功地治療各種臨床狀況，引發起對其他肉毒毒素血清型之興趣。因此進行二種商品化A型肉毒毒 ~一繼……丨… -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1250020 五___I_ 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A7 B7 發明説明（15)

Wako Chemicals，Japan)之研究以決定局部肌肉耗弱效力，安全性及抗原性潛力之研究。將肉毒毒素製劑注入右腓腸肌頭部（0.5-200.0單位/公斤），再利用老鼠趾外展計分分析 (DAS)評估肌肉之虛弱。ED50値由劑量反應曲線中計算出來。另外的老鼠給予肌内注射以決定L D 5 〇劑量。以L D 5 〇 / E D 5 〇値算出治療指數。不同的組別，或接受BOTOX®後肢注射（5·0· 10.0單位/公斤）或B型肉毒毒素（50.0_400.0單位/ 公斤），並測試肌肉虛弱性及增加之水耗量，後者是口乾之假想模式。抗原性強度由兔子每月肌内注射而評估（1.5或 6.5毫微克/公斤於Β型肉毒毒素，或0.15毫微克/公斤於 BOTOX®)。所有血清型，其肌肉虛弱之高峰及作用期均和劑量有關。DAS ED5〇値（單位/公斤）如下：BOTOX® : 6.7， Dysport® : 24.7，B 型肉毒毒素：27.0-244.0，F 型：4.3。 BOTOX®有較B或F型更長之作用期。治療指數値如下： BOTOX® : 10.5，Dysport® : 6.3。B 型肉毒毒素：3.2，注入B型之耗水量大於BOTOX®，然而在肌肉虛弱效力上B型效率較低些。4個月注射後，4隻中2隻（以1.5毫微克/公斤處理組）及4隻中4隻（以6.5毫微克/公斤處理組）兔子會發展出抗B型肉毒毒素之抗體。在另一研究中，以BOTOX®處理之兔子中9隻無一隻會生成抗A型之抗體。DAS結果顯示A 型之強度峰相當於F型，且F型又大於B型。關於作用期， A型肉毒毒素大於B型，B型作用期大於F型。如治療指數値所示，二個商品化之A型肉毒毒素製劑（BOTOX®及 Dysport®)是不同的。後肢注入B型肉毒毒素後觀察到之耗 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250020 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣五、發明說明（）水行爲增加顯示，此血清型有相當大量在臨床上會進入鼠之全身循環。結果也顯示，爲了達到比得上A型之效率，必須增加其他受檢血清型之劑量。增加之劑量包括安全性。再者，在兔子中，B型之抗原性甚於BOTOX®，可能是因爲爲了達成B型之有效劑量，而有較高之蛋白質負擔所 S文。Eur J Neurol 1999 Nov ; 6 (Suppl 4) : S3-S10 〇除了在周邊有藥理作用外，肉毒毒素在中樞神經系也會呈現失神經作用。Wiegand et al，Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. 1976 ; 292，161_165 及 Habermann，

Naunyn-Schmiedeberg?s Arch. Pharmacol. 1974 ; 281，47-56 報告，肉毒毒素也可經逆行運送上昇至脊柱區域。如此，如在周邊部位肌内注入肉毒毒素，有可能可逆行運送至脊柱。美國專利案No. 5,989,545揭示一種經修飾之梭菌神經毒素或其片段，較好是肉毒毒素，化學共軛或重組地稠合至特殊標的部份，由投予至脊柱可用來治療疼痛。乙醯膽鹼通常在哺乳動物神,系統中，各神經元型式僅釋出單一型式之小分子神經遞質。神經遞質乙醯膽鹼由腦中許多區域之神經元所分泌，但通常是運動皮質大的錐體細胞，基礎神經節中許多不同的神經元，神經支配至骨骼肌之運動神經元，自主神經系之神經節前神經元（交感及副交感均有），副交感神經系之神經節後神經元，交感神經系中某些神經節後神經元等。基本上，僅有至汗腺，豎毛肌及一些 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） — — — — —------樣—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —訂---------線- 1250020 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 17 --' 五、發明說明（）血管之神經節後交感神經纖維是膽鹼能的，因爲交感神經系大多數的神經節後神經元分泌的神經遞質是正腎上腺素。在大多數例子中，乙醯膽鹼具興奮作用。然而，已知乙醯膽鹼在某些周邊副交感神經末端具有抑制作用，如由迷走神經對心跳速率之抑制。自主神經系之傳出訊號係經由交感神經系或副交感神經系轉送至身體。交感神經系之神經節前神經元，由位在脊柱中間及外侧角之神經節前交感神經元細胞體延伸。神經卽削文感神經纖維，由細胞體延伸，與位於脊柱側交感神經神經節或在脊柱前神經節之神經節後神經元胞突接合。由於交感及副交感神經系之神經節前神經元是膽鹼能的，在神經節上應用乙醯膽驗可刺激交感及副交感神經節後神經元。乙酸膽驗可活化二型受體，蕈毒鹼及菸鹼受體。蕈毒鹼受體見於由神經節後交感神經系神經元所刺激的所有效應物細胞中’以及由交感神經系之神經節後膽鹼能神經元所刺激者。於驗受體見於腎上腺髓質，以及在自主神經節内’其係在神經節後彳中經元之細胞表面上，在交感及副交感神經系之神經節前及神經節後神經元之胞突上。菸鹼受體也見於許多非自主神經末端，如在神經肌肉接合處之骨骼肌肉纖維膜上。當小的’澄清的細胞内小囊與突觸前神經元細胞膜稠合下’乙醯膽驗可自膽驗能神經元中釋出。各種的非-神經元分泌細胞’如腎上腺髓質（以及PC 12細胞株）及胰臟蘭氏小 -20- 本紙張尺度適用中_家標準（CNS)A4規格（21ϋ x 297公髮） -------------—------訂---------線 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 1250020 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 18 五、發明說明（）島細胞’可自大的，稠密核心囊中分別釋出兒茶酚胺及副甲狀腺激素。p c 1 2細胞爲大鼠嗜鉻細胞瘤細胞之純系，被充份用於研究交感腎上腺發展之組織培養模式。肉毒毒素可於試管内抑制二種化合物自二種細胞型式中之釋出，經由穿透（如以電泳脈動）或將毒素直接注入失去神經之細胞内。也已知肉毒毒素可阻斷神經遞質穀胺醯胺自皮質突觸體細胞培養之釋出。骨骼肌中神經肌肉接合之形成是將軸突與肌肉細胞趨近。訊號經由神經系統傳送，可在末端軸突造成作用電勢’離子道之活化及使神經遞質自神經元内突觸囊中釋出，例如在神經肌肉接合之運動終板處。乙醯膽鹼穿越細胞外S間與在肌肉終板表面之乙醯膽鹼受體蛋白質結合。一旦發生充份的結合，肌肉細胞之作用電勢可造成特異的膜離子道變化，造成肌肉細胞之收縮。乙醯膽鹼再自肌肉細胞中釋出，並由細胞外空間之乙醯膽鹼所代謝。代謝物再循彡衣回到末端轴突’以再處理成進一步的乙酿膽驗。因此’需要有一種具生物相容性，無免疫原性，非生物可降解之植入物，其，將治療上有效之神經毒素長期不斷地釋出之人體内。發明要點本發明符合此需求，且提出一種具生物相容性，無免疫原性，非生物可降解之植入物，其可令神經毒素可長期，不斷地釋放至人體内。吾等發現提出一種神經毒素植入物，其克服與重覆快速 -21 _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 125〇〇2〇

發明說明（或皮下注射神經毒素有關之已知問題，困難及缺失， '肉毒毒素，可治療苦痛如移動失調症，包括肌肉痙攣。 C括在：發明範園内之控制釋出系統包括一種聚合基、士_及疋里位於聚合基質内之神經毒素，其巾分次量之 ?經毒素可在長時期間自聚合基質·中釋出。申、工母素可g #實質上連續或單相方式自聚合基質中出，且神經毒素自聚合基質釋出之長時期可由ι〇天至約 6年之久。聚合基質可由實質上非生物可降解之物質所製成，且神經毒素可以是—種多肽。料，神經毒素可以是突觸前神經毒素’如梭菌神經毒素。再者，神經毒素可以是肉毒毒素，如選自下列包括Α，Τ5 Ρ ^ ^ <㈡「/j匕從八，；6，（：1，；〇，£;，17及〇型肉毒毒素。以A型爲較佳。聚合基質中所包括之聚合物可選自下列包括：異丁晞酸醋Lb各淀酮’乙缔醇’丙缔酸，聚參氧燒類，醋酸乙烯酉曰，乳酸，乙醇酸，膠原蛋白，及生物陶瓷聚合物及其共聚物。由植入物可单握之仲經毒素劑量在約1單位及約, 〇〇〇單位肉毒毒素之間，且較好是由約1至約5〇,0〇〇單位的肉毒毒素。因此神經毒素之劑量，於A型肉毒毒素時可在由約 1 0單位及約2,000單位之間，於B型時則在約1〇〇單位及约 30,000單位之間。神經毒素可以是肉毒毒素，其自植入物中釋出之量足以有效造成鄰近植入系四周，或在該處之肌肉或肌肉群之較 -22 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------------¾ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂--------線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250020 A7 ----------Β7_____ 五、發明說明（20 ) 弱的肌肉麻痺。本發明詳細之具體實例可以是一種控制釋出系統，其中含有聚合基質，及约10單位及約2〇〇〇〇單位間之肉毒毒素在聚合基質内，其中分次量之肉毒毒素以由約2個月至約5 年之長時間自聚合基質中釋出。· 製備本發明範園内之控制釋出系統之方法有以下步驟·· U)將聚合物溶於溶劑中以形成聚合物溶液；將神經毒 2混合或分散在聚合物溶液中，以形成聚合物_神經毒素混合物’及；（C)令聚合物_神經毒素混合物沉降。由是製成控制釋出系統。在混合步驟後也可有蒸發溶劑之步驟。另外，本發明範圍内連續釋出系統之用法包括注射或植入控制釋出系，其中包括有聚合基質，由是可治療移動失调症或由於膽鹼能失神經作用所影響之失調症。最後，形成金屬陽離子_複合之神經毒素之方法包括··（a) 形成t有神經毒素之溶液；（b)分散多價金屬陽離子組份與神經毒素溶液，在適合多價金屬陽離子及神經毒素複合之 pH値條件下，由是形成金屬陽離子_複合的神經毒素懸浮液，其中金屬陽離子蜱份與神經毒素之莫耳濃度比例在約 4 ·· 1至約1〇〇 ·_ ；1間，及（(〇乾燥該懸浮液以形成金屬陽離子-複合的神經毒素。以本發明範圍内之連續釋出系統，在特定期間可投予之神經毒素劑量可在約10-3單位/公斤及約35單位/公斤於A 型肉母母素，及高達約2〇〇單位/公斤於b型等。35單位/公斤或200單位/公斤是上限，因爲此接近某些神經毒素之致 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------^---------^ i^w— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250020

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製死劑量，如分別是A型及B型。較好，在特定期間内由連續釋出系統所投予之神經毒素劑量是約1〇.2單位/公斤及β Μ位/公斤之間。又㈣’所投予之神經毒素劑量是= 單位/公斤及約15單位/公斤之間。又最好，投予之神經毒素在約i單位/公斤及約10單位/公斤之間。在許多你子中，投予約4位至約500單位神經毒素，如A型，可揭供有效且長期的治療舒缓。較好，可使用由約5單位至 300單位的神經毒素，如a型，且更好是由約1()單位至約 200單位，可局部投予至標的组織，而有有效的結果。在本發明特佳之具體實例中，由約1單位至約1〇〇單位之肉毒毒素’如A型，可局部投予至標的組織，並有治療上有效之結果。神經毒素可由梭菌製成，如經由肉毒梭菌，丁酸梭菌，貝拉弟梭菌（C· Beratti)或破傷風梭菌。另外，神經毒素可以是經修飾的神經毒素，即其胺基酸至少一個可被刪除，修飾或取代，和天然的或野生型神經毒素比較而言。再者，神經毒素可以是重組產製之神經毒素或其衍生物或片段。 — 神經毒素可以是肉毒毒素，如血清型之一。較好是Α型。顯然’肉毒毒素可經由安置肉毒毒素植入物而經由皮下植入方式投予。肉毒毒素投予至肌肉之量在約丨單位及約 10,000單位之間。當投予的是A型時，劑量爲約1單位及乾 100單位之間。 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------1---------^. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250020 A7 B7 ^___ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制农 22 發明說明（）値得注意，有報告指出以肉毒毒素處理腺體組織，可顯不注射後所減低之分泌活性可長達2 7個月。Laryngoscope 1999 ; 1〇9 : 1344-1346，Laryngoscope 1998 ; 108 : 381- 384 〇吾等的發明是有關植入物以控制神經毒素之釋出，以及此植入物之製法及用法。植入物包括含有神經毒素之聚合物基質。植入物之設計是在投予後，如肌内，硬膜外或皮下投予以治療各種疾病狀況，神經毒素可以有效水平長期投予。本發明進一步是有關組成物，及其製法及用法，用於控制具生物活性且穩定之神經毒素。本發明之控制釋出组成物可包括生物相容的聚合物基質及分散在其内之具生物活性且穩定的神經毒素。定義以下定義應用於此。生物相谷的”表示使用植入物在植入位置幾乎無發炎反應。生物上具活性的化合物”表示化合物在所投予之個體中可達成有益變化。 ”有效劑量”如應用至生物活性化合物表示大體上足以達成個體中欲求變化之化合物劑量。例如，當欲求作用是虚弱的肌肉麻痺時，有效劑量是可造成欲求肌肉至少實質上麻痺但相鄰肌肉不致有實質麻痒，且麻痺在此肌肉是非欲求的’但不致造成顯著的全身毒性反應之劑量。 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） !.!1·------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂--------線· 1250020 Α7 Β7 五、發明説明（23) 有效劑量”應用至非活性組份（如用來形成基質之聚合物或塗佈組成物）指足以正面影響生物活性作用物以欲求速率在欲求時間内釋出之非活性組份之劑量。例如，當欲求作用是利用單一植入物使肌肉麻痺，則”有效劑量，，指有助使釋出期介於約6 0天及6年間之劑量。此”有效劑量，，可依本説明書及技藝中一般常識爲基礎而決定之。 ”有效劑量”當應用至植入物表面積之劑量，是足以達成生物活性化合物流動之植入物表面積劑量，如此可達成欲求作用，如肌肉麻痺。所必要之面積可由直接偵測以特殊活性化合物可彳于之釋出而予以決定及調整。植入物或其塗層之表面積是欲完全包膠生物活性化合物所必要之膜量。表面積依植入物之幾何學而定。較好，儘可能將表面積減至取小’以減小植入物尺寸。 π植入物π表示控制釋出之藥物遞送系統。植入物含有生物活性聚合物或陶瓷物質，其含有或可作爲具生物活性之分子之障壁。植入物可注射，嵌入或植入人體内。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ”局邵投予”表示生物活性化合物之直接投予，如治療性藥物經由非全身性路徑投予至組織。因此局部投予包括：皮下，肌内，脊柱内（及鞘内及硬膜外），顱内，及腺體内投藥。局部投藥排除全身路徑，如口服或靜脈内投藥。 ”神經毒素”表示作用物其可干擾神經衝動穿越神經肌肉或神經腺體接合處之傳送，阻斷或減少神經遞質之神經元分泌作用，或可改變神經元鈉道電壓窄門之作用電勢。神經毒素之實例包括肉毒毒素，破傷風毒素，蛤蚌毒素及河 -26 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 24 1250020 五、發明説明（豚毒素。 "治療"表示哺乳動物中疾病的任何處理法，且避免疾病再發生，或（ii)抑制疾病，即遏止並發展· u) 舒缓疾病，即減少疾病症狀之發生或造成消退。Λ 5 (11〇製備本發明範園内之植入物，以控制神經毒素釋法包括，將具生物相容性之聚合物溶解在聚合物溶劑=万以形成聚合物溶液，分散生物活性且穩定的神經二於聚合物溶液中，再固化聚合物以形成含有神素= 之分散相之聚合基質。京心子利用本發明範園内之植入物之方法，以形成控 :經毒素：方法包括經在病人體内植入植入物，可長時J 在病人中提供生物活性神經毒素治療上有效之水平。、β 説明本發明以下列發現爲基礎77有生物相容的，降解的或生物可降解的聚合物之連續釋出型植人物，可Ζ 現神經毒素治療劑量於活體内長期之釋出。主 ::明範圍内之植入物可以外科方式嵌入，經由 =切開(即以減少肌肉之瘦攣），或植入物可利用中空經濟部中央標準局員工消費合作杜印製内投予’如美國專利ν〇 4,474,572所揭-疋』式。針頭之直徑可調整以相當於所使用植入物之 :寸。再者，在本發明範圍内之植入物可採顱内植入方式，以便神經毒素之治療劑量在標的腦组 =旦植入物已耗盡，則勿需移出本發明之非解（植入物，因爲植入物是由生物上相容且無免疫原性之 27- 本紙張尺度適财國國家標準（⑽）Α4規格（21Qx297公缝）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ^25〇〇2q r-—_J：_ 五、發明說明（25) -— 才才質所組成的。爲了％、疋神經毒素，不論是使神經毒素可與適合的聚合昆合形成植入物基質之型式（即粉末狀之神經毒素，並已東乾燥），以及神經毒素存在於或納人所選用聚合物之基 :内’均可使用各種的藥學賦形劑。適合的賦形劑包括：，粉，纖維素，滑石，葡萄糖，乳糖1糖，明膠，麥米，麵粉’白要’砂膠，硬脂酸鎂，硬脂酸納，甘油早硬脂酸酯，氣化鈉及乾之脱脂牛奶。植入物之厚度可用來控制水之吸收，及因此可控制神哩毒素自組成物中之釋出速率，而較厚之植人物以較緩率釋出多肽。植入物在第一期可快速地釋出次於最大之神經毒素量，即爆發期。爆發期通常持續不到24小時，且經常延長達植入後1小時左右。之後由植入物釋出之神經毒素量快速下降，並以較減少且顯然相當固定（即零級動力學）之釋放水平穩定地釋出神經毒素。此第二之延長釋出期可延伸約工年至、，々5或6年之久。第二期之最初部份可稱之爲補足期。在爆發期及補足期巧，神經毒素釋放之加成劑量較好相當於神經毒素之最佳量，如此可治療特殊之失調症或侵害。補足期之暫時程度通常較整時期爲差，在此期終了神經毒素之最佳投予顯示出顯著較差之效力。例如，於治療上肢痙攣時，A型肉毒毒素肌内之最佳劑量可爲約9 〇單位注入肱二頭肌内。典型而言，以快速濃注在丨_7天内如此謗生之較弱麻痺，可在約3個月後實質地消耗。本發明範 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------^---------線 i^w. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250020 A7 ^---------B7___ 五、發明說明（26 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 圍内之皮下神經毒素植入物，可予以構型以在植入後立即可釋出約6 0單位的肉毒毒素（即在爆發期）。此次於最佳之神經毒素劑量可提供快速且實質的舒緩。在第2期中，植入物可每天連續釋出約〇·4單位的神經毒素，如A型，如此在約7 5天後，9 0單位之最佳劑量可由植入物釋出至標的組織。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製可供肉母母素呈現南且特異親和力之突觸前神經元受體，尚未被鑑知。對於所評估之肉毒毒素長的神經元内半衰期也無可接受之機制可知。然而，已知一種動態過程，其可能由未阻斷，再出現，再合成及/或肉毒毒素受體之再活化，或出現新的神經萌生，或二者，使發生及造成麻痺作用之逐漸消耗，而此始自肉毒毒素之投予。因此，在上實例中可花75天使最佳量（共9〇單位）的肉毒毒素爲植入物所釋出，此是因肉毒毒素作用減弱之動力學本質之故，接下來毒素之釋出（即超過75天）不會造成非欲.求或過度區域之麻痺。因此可預期在此實例中，在第76天由植入物所釋出之毒素將可與因第1天左右植入物所釋出之毒素造成失神經作用而形成之新孝體及/或形成之神經芽結合。此失神經過程之滚動本質表示’並非造成過量毒素，其可全身擴散或造成非欲求之麻痒’在補足期末了後連續釋出之毒素，單純地在相同欲求之肌肉處再次失神經化之而已。因此，假設失神經作用是球體型式並使其他因素保持固定，爆發之釋出所失神經之組織球體直徑約爲欲失神經化組織團塊最佳尺寸之約2/3。在補足期及接下來釋出之神經毒 •29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1250020 A7 B7 五、發明説明（27) 素’可提供最適宜的或欲求的組織失神經化程度，且提供的神、纟二母素量在標的組織内近來再有神經分配之位置上可重新失神經化之。已知險痙攣可由肌内注射約5單位（在2 _ 4個月間隔下重覆之）的A型肉毒毒素至側瞼板前輪形肌而治療之。顯然，本發明範園内之單一植入物可用來治療瞼痙攣，歷約1年期。針對神經毒素植入物釋出治療，在此痛苦以及所選擇 < 一年期下，並使用1 5 %爆發特性聚合物，在植入物内填加之神經毒素總量可爲2 〇單位。在爆發期間先釋出3單位的毒素（在植入後24小時内），繼之每天連續釋出約〇〇467 單位（即每天釋出約2 3微微克的Βοτοχ®)。因此，於4 2天中，約5單位之總神經毒素經釋出，在此實例中釋出率 (15%爆發，其餘85%歷364天）是0.234%/天。在此實例中，於第1天病人接受20單位的植入物且1年後病人移出耗盡的植入物，再嵌入另20單位的植入物。因此，365天投予25單位，包括在第365天的第二劑植入物之作用。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Φ II (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 由於1莫耳A型肉毒毒素複合物含有約9χΐ〇5克，因此1 微微克的A型肉毒毒素複合物是約1 1 X 1 〇 _ 18 μ。因此，總納入神經毒素每天約0.234%之欲求釋出，相當於每天約 2·53 X 10 18Μ之釋出。在一年的治療期，2〇0/〇爆發，繼以 80%歷364天，可造成約〇·22% /天或0.044單位/天或2.2微微克/天或約2·42 X 1〇-18Μ/天之控制釋出。自2〇單位之 2 0 %爆發可在植入後前2 4小時提供4單位的神經毒素。一般而言，植入物之表面積，對各y公分2植入物表面積而 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X 297公釐） 1250020 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（28) 言，相當於X單位釋出毒素/天。不同的狀況以每劑由約5單位至约100單位之肉毒毒素注射治療。在以A型25單位爲最佳快速濃注劑量，且歷一年期之條件下’典型之植入物可填加以1〇〇單位的A型肉毒毒素複合物。爆發可爲2 〇 %繼以g 〇〇/。364天，此相當於 0.22% /天或0.22單位/天或丨丨微微克/天或約121 X 1 〇 -1 /天。對五年治療斯中，即2〇劑25單位快速濃注，第一次注射是在零時’而第20次注射在第57個月，共500單位之注射總量。相反的’在吾等之發明中，對可反應2 5單位肉毒毒素之狀況所採用5年植入物，如a型肉毒毒素，可採用填有 500毒素單位之植入物，其特色爲2 〇單位之爆發（4 %爆發），繼以約480單位在1736天内釋出，此相當於植入物 0.267單位/天或5·56Χ ΙΟ·4。/。/天或13 35微微克/天之釋出。基質植入物之製備係將所選定之聚合物溶於適合的溶劑中。在此澆鑄溶液中，混合以欲求量之冷凍乾燥且成粉末之神經毒素（即神經毒素總欲求量，如非可重組之 BOTOX® ’在治療期叼釋出）。此方法可用來製成有塗佈之植入物團塊’其中的修飾在於用於本發明具體實例中之塗料是生物可侵蚀之聚合物，其係神經毒素不可穿透的。因此，除非塗料降解，否則神經毒素不會擴散出基質進入周邊組織。其中欲混合以肉毒毒素之澆鑄或其他溶液之pH値維持在 pH 4.2-6.8下’因爲在pH 7以上時，已穩定之非毒素蛋白 -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------訂---------線 i^w. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250020 五、發明說明（29 貝曰自肉毒毒素中解離，造成毒素逐漸喪失。較好pH値維持在約5 - 6之間。再者，混合物/溶液之溫度應不超過約3 5 ^ ’因爲當溶液/混合物超過4 0 °C時毒素易解毒。在本發明範圍内適合的植入物，於活體内控制神經毒素 =釋出，如肉毒毒素，可予以設計製備以使神經毒素以連績的或脈衝方式釋出。”連續釋出，，表示在最初爆發期之 =，j實質上單相方式釋出。連續釋出可有一個屈折點，但非高原期。連續釋出勿需每單位時間以類似劑量自植入中釋出。脈衝式釋出之植入物，可以二相或多相方式釋、神、％母素。因此，脈衝式釋出之植入物可有相當短之最、秀導（爆發）期，之後期間少或無神經毒素被釋出。具生物活性之神經毒素之控制釋出，是使具生物活性之神經毒素錄直接投予神經毒素水溶液所得之更長時期 7，以治療有效（加上幾乎可乎略之血清水平）水平釋出較好控制釋出是指約6個月以上，且較好約一年以上時内神經毒素之釋出。触：本發明範園内4適合的植入物，於控制神經毒素之他 :::出，如肉毒毒，’可呈現神經毒素之連續釋出或脈降二：_。另夕卜’植入物可含有非可生物降解的或可生物非可物質、。顯著地，吾等的發明包括：⑴連續釋出主n經毒素植人物；（2)連續釋出可生物降解名母素植人物；（3)脈衝賴出非生物可降解之神經 =入^及⑷脈衝式釋出可生物降解之植人物，且此四 …植入物，各自可調和成各樣的構型，適合皮下注射訂間活毒線本紙張尺度適財關家鮮 32- 30 v 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1250020 發明説明（或植入，如團塊’小盤狀，微球，薄膜，柱狀及管自可有-層以上的塗料㈣存槽或基質結構上。在本發明範圍内之植入物，也可調和成供注射用之縣劑。此懸液劑可以藥學技藝中已知之—般技術製造，= :内交醋/多肽混合物於超速離心粉碎機中粉碎，機器中：有通合的師網，如120號孔篩，再將已磨碎過浮在注射用溶财m料當地加人傳統的黏= :強劑或助懸劑，油類’或其他已知適合的注射用液態：經包膠之神經毒素，在3rc體溫及長時間下之變性作用，可因以下方式穩定而減少：以白蛋白冷束乾燥之酸性溶液中料乾燥，自低濕度含量溶液中冷純使用非可重組之B0T0X⑧，此三準則可符合A型肉(毒：素），以及使用特異的聚合物基質組成物。主較好，具生物活性之神經毒素於活體内之釋出，在神經毒素之釋出期間應不致造成顯著的免疫系統反應。基質穩定的神經毒素吾等發現，經穩定的神經毒素可包括具生物活性，非可聚集的神經毒素，其並與至少一型電價+2或以上的多價金屬陽離子複合。、適泛的夕^貝金屬陽離子包括含於生物可相容之金屬陽離子組份之金屬陽離子。若陽離子組份對受者而言是無毒的，則金屬陽離子組份是生物可相容的（此指在所使用之劑量下），且對受者之身體無顯著的有害或不佳作用，如 ----------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁} 、^1 -33- 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 1250020 A7 _____ B7 五、發明説明（31 ) 射位置之免疫反應。較好，金屬陽離子組份與神經毒素之比例，其中金屬陽離子係用來穩定神經毒素，介於约4 : 1至約1 〇〇 ·· i之間，較好約4 : 1至約10 : i。用來穩定神經毒素之較佳的金屬陽離子是Zn+ +。以二價辞陽離子爲較佳，因爲已知肉毒毒素是二價鋅之肽内酶。在較佳具體實例中，金屬陽離子組份（含有Zn+ +陽離子）與神經毒素之莫耳濃度比例是約6 : 1。穩足神經毒素之金屬陽離子，其適用性可由精藝者進行各種穩定顯示技術而決定，如：聚丙烯醯胺凝膠電泳，等電焦距，逆相層析，HPLC，及在含有金屬陽離子之神經毒素冷凍乾燥粒子上之強度試驗，以決定神經毒素在冷凍乾燥後之強度，以及其自微粒子中釋出之作用期。在穩定神經毒素中’神經毒素於活體内水合中可於微粒子内凝集之傾向，及或由於水合作用或形成控制釋出組成物之過程，或由於控制釋出組成物之化學特性而喪失生物活性或強度’可由複合至少一種金屬陽離子與神經毒素，再將神經母素與聚合物溶液接觸，前者之傾向即可減少。在吾等的發明中，經穩定的神經毒素是用來對抗控制釋出期間顯著的活體内凝集作用。顯著的凝集作用定義爲凝集之量造成聚合物包膠的或聚合物基質納入之神經毒素有約15%或以上凝集作用。較好，凝集作用維持在約5%以下之神經毒素。較好，凝集作用維持在存在於聚合物之°神經毒素約2 %以下。 ^ -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁}

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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在神經母素控制釋出έ & 、、、成物中之神經毒素也可混合以並他的賦形劑，如塡充濟丨$ 2 t A、…外的穩定基，如緩衝溶液以在令/東乾燥中矛忍足神經毒素。填充劑通常含有惰性铷皙 AA 物貝通合的填充劑是精藝者已知的0 適用於本發明板制釋出組成物之聚合物或聚合基質，必 :疋生物相#的。右聚合物及其任何降解產物對受者是無母的’且對個體益顧签古金々、*7»、 μ·、，員著有害或不艮作用，如在注射位置之免疫反應，則聚合物是可生物相容的。神經毒素控制釋出组成物之聚合物可由生物彳降解的物質所製成。生物可降解的，如此中㈣義的，表示組成物可於活體内降解或侵蚀以形成較小的化學物質。降解可因酵素，化學及物理過程所致。適合的生物相容的，生物可降解的聚合物，包括如：聚 €内又酯），聚（乙交酯），聚（内交酯·共乙交酯卜聚（乳聚（乙醇叙）’聚（乳酸_共_乙醇酸），聚己内酉旨，聚碳酸酯，聚酯醯胺，聚酐類，聚（胺基酸），聚原酸酯，聚氯基丙烯酸酯，聚（對位厂二嘮烷酮），聚（單酸烷撑二酯），可生物降解之聚胺酯類，其掺合物及共聚物。再者，聚合物之末端官能性可予以修飾。例如，聚酯類可予以阻斷，未阻斷或是二者聚合物之混合。經阻斷之聚合物在技藝中有典型的定義，特別是具有經阻斷之羧基末端基團。一般而言，阻斷基衍自聚合化作用之起啓物，卫通常是烷基。未阻斷之聚合物通常有游離態之羧基末端。 35- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -------I-------------訂---------· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250020 A7 B7 五、發明說明經濟部智慧財產局員工消費合作社印製用於本發明之可生物降解之聚合物，其可接受之分子量可由精藝者考慮以下因素而決定，如··欲求之聚合物降解速率，物理特性如機械強度，及聚合物在溶劑中之溶解速率。典型而言，分子量可接受之範園在約2,〇〇〇遒耳呑至約 2,000,〇〇〇道耳呑。在較佳具體實例中，聚合物是生物可降解的聚合物或共聚物。在較佳的具體實例中，聚合物是聚 (内交酯-共乙交酯）（下文稱爲” PLGA”），二者比例爲約 1 : 1，且分子量爲約5,000道耳呑至約70 000遒耳呑。在甚至較佳炙具體實例中，用於本發明之pLGA，具有約6，㈧〇至約31,〇〇〇道耳吞之分子量。 ’ 神經毒素之劑量，其係含於控制釋出微粒子之劑型中，或在不同控制釋出系統中，含有生物活性之已穩定的神經毒素粒子是治療或預防上有效之劑量，可由精藝者在考慮以下因素下決定，如體重，欲治療之狀況，所應用之聚合物型式，及聚合物中之釋出速率。在一個具體實例中，神經毒素控制釋出組成物含有由約 10 %(w/w)至約1%(W/W)的生物活性且經穩定之神經毒素。此神經毒素之用*依神姮毒素欲求之作用，所計劃之釋出水平，神經毒素被釋出之時間，神經毒素釋出所花之時間等而變化。神經毒素粒子填加之較佳範圍是約10_4% (w/w)至約〇.i%(w/w)神經毒素粒子。神經毒素填加之較佳範圍是約神經毒素。具生物活性且經穩定之神經毒素粒子，其最佳填料是約1〇_2% (w/w) 0 •36- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公蓳）請先閱讀背之注意事項再填寫本頁鮝訂線 1250020

經濟部中央標準局員工消費合作社印製在另-具is實例中’神經毒素控制釋出組成物也本有第二金屬陽離子組份，其並不含於經狀之神經毒^粒子中，且係分散在聚合物中。第二金屬陽離子組份較好含有相同的金屬陽離子，如含於經穩定之神經毒素一般。另外，第二金屬陽離子組份可含有一種以上不同的金屬陽離子。第一至屬陽離子組份作用是調控神經毒素自控制釋出組伤聚合基負中足釋出，如作爲金屬陽離子之貯存槽，以進一步加長神經毒素爲金屬離子穩定之時間，並用以加強神經毒素在組成物中之穩定性。用於調控釋出之金屬陽離子組份，通常含有至少一型多價金屬陽離子。適用於調控神經毒素釋出之第二金屬陽離子、、且伤實例，包括或含有下列如：Mg(〇H)2，如 4MgC〇3Mg(OH)25H2〇)，ZnC〇3(如 3Zn(〇H)22ZnC〇3)，

CaC03 ’ Zn3(C6H5〇7)2，Mg(〇Ac)2，MgS〇4，Ζη(〇Αα， ZnS04，ZnCl2，MgCl2&Mg3(C6H5〇7)2。第二金屬陽離子組份對一聚合物之適合比例是介於約1 ^ 9 9至約1 : 2按重計。最佳比例依所選用之聚合物及第二金屬陽離子組份而定0 本發明的神經毒素控制釋出組合物可製成各種型式，如薄膜’團塊，柱狀，小盤狀或微粒。微粒，如此中所定義的，包括聚合、组份其直徑少於約丨毫米，且其中分散有經穩足的神經毒素粒子。微粒可具球體，非球體或不規則形狀。較好此微粒是一種微球。典型而言，微粒應是適於注 -37- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1250020 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（35) 射之尺寸。微粒之較佳尺寸範圍是由約1至約i 8〇微米直徑。在本發明形成組成物以控制具生物活性且未凝集之神經毒素釋出之方法中，在聚合物溶液中分散適量的具生物活係且經穩定神經毒素之粒子。適合的聚合物溶液含有約l%(w/w)及約3 0%(w/w)適合的生物可相容的聚合物，其中生物相容的聚合物溶於適合的聚合物溶劑中。較好，聚合物溶液含有約2%(w/v)至約 20%(w/v)聚合物。以含有5%至約^。/。（界/界）聚合物爲最佳。適合的聚合物溶劑，如此中所定義，是其中聚合物可溶的溶劑，但其中經穩定之神經毒素粒子實質上是不溶且無反應性的。適合的聚合物溶劑包括極性有機液體，如二氯甲烷，氣仿，乙酸乙酯及丙酮。爲製備具生物活性且穩定的神經毒素，神經毒素混合在適合的水溶劑中，並加上至少一種適合的金屬陽離子組份，在適於形成金屬陽離子及神經毒素複合物之pH條件下。典型而言，複合的神經毒素係呈混濁沉殿物型式，其可懸浮在溶劑中。然而，複合的神經毒素也可在溶液中。在甚至較佳之具體實例中，神經毒素係與Ζ η + +複合。形成神經毒素複合物之適合的pH條件通常包括介於約5.0 及約6.9間之pH値。適合的PH値通常經由缓衝水溶液之使用而達成，如碳酸氯鈉。適合的溶劑爲其中神經毒素及金屬陽離子組份各自至少 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1· I I H ϋ I I ϋ I I I I · I — — — — — — 一I n I ϋ ϋ I- I I I I I n I I hi ϋ I l· — III— — — — —— — — — — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 125〇〇2〇五 _ ___ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 〜 36 發明說明（）略溶者，如在碳酸氫鈉水性緩衝溶液中。於水溶劑例時，所使用的水較好是去離子水或注射用水（WFI)。神經毒素也可呈固體或溶解狀態，此指在與金屬陽離子組份接觸之前。另外，金屬陽離子組份可爲固體或溶解狀態，此指與神經毒素接觸之前。在較佳的具體實例中，神經毒素之緩衝水溶液混合以金屬陽離子組份之水溶液。典型而言，複合的神經毒素可呈混沌的沉澱物型式，其係懸浮在溶劑中。然而，複合的神經毒素也可在溶液中。在較佳具體實例中，神經毒素係與Ζ η + +複合。 Ζη + +複合的神經毒素再乾燥，如利用冷凍乾燥，以形成經穩定的神經毒素微粒。Ζη + +複合之神經毒素，其懸浮或在溶液中，可被大團地冷凍乾燥，或可分成小份再冷來乾燥。在較佳具體實例中，Ζη + +複合的神經毒素懸二= 碎，如利用超音波噴嘴，再冷束乾燥或穩定之神子。冷凍乾燥Ζη + +複合之神經毒素混合物之可接受方法包括技藝中已知的。較好，經穩定之神經毒素粒子直徑是介於約i至約6微米之間。神經毒素粒子可分別成片段，另外，神經毒素粒子可在加至聚合物溶液後成片段，如利用超音波探針或超音波噴嘴。曰在另外的具體實例中，不含於經穩定神經毒素粒子中之第二金屬陽離子組份，也分散在聚合物溶液内。應了解，第二金屬陽離子組份及經穩定的神經毒素，可依序，呈相反次序，間歇地，分別地或經由同時:添加而 -39- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --；--、丨-----------------訂---------線- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ϊ25〇〇2〇 A7 分散至聚合物溶液中。另外，聚，份，及經穩定之神經毒素，α 、口物，第二金屬陽離子麵分別地或經由同時之添加而’呈相反次序，間歇，在此方法中，聚合物溶劑再：化:物溶劑中。經毒素粒子分散相之聚合基質。乂形成含有經穩定的神自聚合物溶液中形成法是溶劑蒸發方法，、f^呈、空1]釋出組成物之適合方 $万决，述於美國專 3,523,906，· 3,691，_ ;及4 3 ^Ν〇· _ 3,737,337 ’ 神經毒素控制釋出微粒之方法。，° /谷劑蒸發可充作形成在溶劑蒸發方法中，含有經穩 =溶液:混合於或擾動在連續相; 二:：形成乳劑。連續相通常是水溶劑。乳化時：：：：：續相中以穩定乳劑。聚合物溶劑再於數小 ▲上瘵發，由是固化聚合物形成其中含有經穩定之神經毒素粒子分散相之聚合基質。自聚合物溶液中形成神經毒素控制釋出微粒之較佳方法迷於美國專利案5，G19,4GG中。此微球形成法，和其他方法比較下，如相分離’可另外減少產生控制釋出組成物(有特殊< 神經毒素含量）所必需之神經毒素含量。在此方法中，含有經穩定的神經毒素粒子分散相之聚合物溶液，經處理可產生小滴狀，其中至少有相當部份之小滴，含有聚合物溶液及經穩定之神經毒素粒子。這些小滴再利用適於形成微粒之方法冷凍之。處理聚合物溶液分散相形成小滴之方法實例包括經由超音波噴嘴，壓力嘴嘴， -40- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐 -1 ^--Γ ^--.---------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂-----

ϋ ϋ n I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250020 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制取 A7 B7 38 五、發明說明（）

Rayleigh噴口或其他自溶液生成小滴之已知方法。適合冷凍小滴以形成微粒之方法包括令小滴進入或接近液化氣體，如液態氬及液態氮以形成冷凍微滴，其再自液態氣體中分出來。冷凍之微滴再曝於液態非溶劑中，如乙醇，或乙醇混合以己烷或戊烷。於冷凍微滴中之溶劑予以萃取，如固體及/或液體，萃取至非溶劑中’以形成含有穩定神經毒素之微粒。混合乙醇與其他非溶劑，如己烷或戊烷，可增加溶劑自某些聚合物中之萃取，如聚（内交酯·共-乙交酯）聚合物，超過以乙醇單獨時所達成的。變化小滴之大小可製成各種尺寸之神經毒素控制釋出微粒’如利用變化超音波噴嘴之直徑。若欲求極大之微粒，微粒可經由注射器直接擠壓至冷的液體中。增加聚合物溶液之黏度，也可增加微粒大小。以此方法產生之微粒大小，可在大於約1000至約！微米直徑範圍。又自聚合物溶液中形成神經毒素控制釋出組成物之另一方法包括膜的澆鑄，如在模型中形成薄膜或某形狀。例如，在將含有經穩定之神經毒素粒子之分散相之聚合物溶液置於模型後，再利用技藝中已知方法移去聚合物溶劑，或減低聚合物溶液之溫度，直到獲得有一致的乾重之薄膜或形狀爲止。在生物可相容之聚合物植入物例子中，因聚合物之降解而釋出神經毒素。降解速率可由變化聚合物特性而控制，其係可影響聚合物之水合作用速率。這些特性包括如：聚 -41 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -,¾ ^-Γον » n ϋ n n n ϋ I «ϋ -ϋ n n ϋ ϋ ϋ I n I n ϋ ϋ n n - 1250020 Μ Β7

發明説明（3a) 合物中所含之不同單體之比例，如内交酯及乙交酯；使用單體之L·異構體而非外消旋混合物；及聚合物之分子量。這些特性可影響親水性及結晶度，其控制聚合物之水合作用速率。也可納入親水性賦形劑，如鹽類，碳水化合物及界面活性劑以增加水合作用，且其可改變聚合物之侵蝕速〇經由改變生物可降解聚合物之特性，擴散的貢獻及/或聚合物降解至神經毒素釋出均可予以控制。例如，增加聚（内交酯·共-乙交酯）聚合物中乙交酯含量及減少聚合物之分子量可加強聚合物之水解作用，因此使神經毒素自聚合物侵蝕中之釋出可增加。此外，聚合物之水解速率在非·中性 pH値下會增加。因此，在聚合物溶液中可加入酸性或鹼性賦形劑，用以形成微球，以改變聚合物侵蚀速率。本發明的組成物可利用任何非全身性投藥方式投予至人類或其他動物’利用如植入方式（如皮下，肌内，顱内，陰道内及皮内）以提供以已知變性爲據之欲求的神經毒素劑量，以治療各種醫學狀況。經由植入物適於投藥的特殊劑量，可由精藝者依上文討論之因素而容易地決定。劑量也可依欲治療或切除神經之組織團塊大小，及毒素之商品化製劑而定。另外，在人體中適合劑量之估計，可由其他組織有效失神經作用所需之肉毒毒素劑量決定値之外插中而來。因此，欲注射之A型肉毒毒素劑量，和欲治療之組織團塊及活性水平成比例。一般而言，約0.01單位/公斤至約35單位/公斤病人體重間 42- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250020 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

之肉毒毒素，如A型，可爲本植入物在每單位時間内釋出 (即歷一段時間，或每2_4個月一次）以有效地達成欲求的 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 肌肉麻痒。低於約0.01單位/公斤之肉毒毒素對肌肉並無顧著的治療作用，而35單位/公斤以上則趨近神經毒素之中 2 =量，如A型。小心地製備及植入物之安置，可避免顯著量的肉毒毒素全身出現。較佳的劑量範園是由約〇單位/公斤至約25單位/公斤肉毒毒素，如調和物Β〇τ〇χ@。投予肉毒毒素之確實劑量（單位/公斤）依以下因素而定，如欲治療組織之程度（團塊）及活性水平，及所選用之投徑。Α型肉毒毒素是可用於本發明方法中之較佳肉毒毒素。較好，用來實行本發明範圍内方法之神經毒素是肉毒毒素，如血清型A，B，C，D，E，肉毒毒素之一。較好，所使用的肉毒毒素是八型，因爲其在人體中有高強度、’易取知，且已知是安全且有效地可用於治療骨骼肌及平滑肌失調症，此當以肌内注射局部投藥時。么本發明在其範圍内包括任何神經毒素之用法，其當用來 ❺療和動失凋症或爲膽鹼能失神經作用所影響之痛苦時， =有j期的治療作用。例如，由產毒素菌株，如梭菌如肉母梭菌’丁酸梭菌及Cberatti任一者製成之神經毒素均可 ^於或使通用於本發明方法中。另外，肉毒毒素A，B，一 D E，F及G可有益地用於實行本發明，然而以a型爲較佳，如上文所解釋的。本發明之實行可提供有效的舒緩，由約1個月至約5或6年。 -43-

本紙張尺度適财ϋ國家標準（CNS ) ( 21〇χ2^^

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1250020 五、發明說明（41 〜發明範圍内包括以下：（a)神經毒素複合物，以及以細囷=養，毒素萃取，濃縮，保藏，冷凍乾燥及/或重組方法獲侍或處理之純神經毒素；（b)經修飾或重組的神經毒素，及神經毒素其一個以上之胺基酸或胺基酸序列被故意地刪除，修飾或取代，經由已知的化學./生化胺基酸修飾步驟，或π由已知宿主細胞/重組載體重組體技術之使用，以及如此製成之神經毒素之衍生物或片段，且包括黏附有一種以上標的部份之神經毒素，此針對存在於細胞上之細胞表面受體而言。口依據本發明可使用之肉毒毒素，可以冷凍乾燥或眞空乾燥型式貯於眞空壓力下之容器内。在冷凍乾燥前，肉毒毒素可混合以藥學上可接受之賦形劑，穩定劑及/或載劑，如白蛋白。經冷凍乾燥或眞空乾燥之物質可以食鹽水或水重組。吾等的發明範園中也包括經植入之控制釋出複合物之用法，如此可對慢性失調症（如運動失調症）提供治療性舒緩。因此，神經毒素可包埋，吸收，或攜於適合的聚合物基貝中’再植入或包莩在下以提供欲求標的組織，神經毒素有數年以上延緩及受控之釋出。可植入的聚合物，其令多肤藥物有控制性釋出是已知的，且可用來製成適於嵌入或皮下黏附之肉毒毒素植入物。如見：pain 1999 ; 82(1): 49-55 ; Biomaterials 1994 ； 15(5) ： 383-9 ; Brain Res 1990 ; 515 (1·2) : 309-11，及美國專利案6,〇22,554 ; 6,011，〇ll ; 6,007,843 ; 5,667,808 及 5,980,945。 -44- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） —--------------^---------^ i^w— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1250020 B7________ 42 五、發明說明（）決定適合的投藥路徑及劑量之方法，通常依各病例而由主治醫師決定。此決定是精藝者例常工作（如見Harrison’s Principles of Internal Medicine (1998)，由 Anthony Fauci et al 出版，1 41 h 版，McGraw Hill 發行）。實例以下實例示出本發明包涵之特殊具體實例及方法，且不欲限制本發明範圍。實例1 形成Ζ η + +穩定之神經毒素 100單位的神經毒素，如未重組的Botox®，溶於碳酸氫鈉缓衝溶液中（pH 6.0)以形成神經毒素溶液。Zn + +溶液製備自去離子水及醋酸鋅二水合物，再於緩和混合下加至神經毒素溶液中以形成Zn + +神經毒素複合物。Zn + +神經毒素複合物之pH値再加1%醋酸調至pH 6.5及6.9之間。可沉澱出沉澱懸液，其中含有不溶的Zn + +穩定的神經.毒素。由是製成神經毒素（如A型肉毒毒素）複合物，可穩定地拮抗接下來納入聚合植入物基質時顯著的凝集作用。秦實例2 #經毒素控制釋出圍媿適於納入聚合物或可聚合的溶液中之神經毒素爲A型肉毒毒素（如Botox®)，其以冷凍乾燥型式買得到。另外，可混合各種聚合物及其共聚物，並貯於乾處，對最終植入物 <作用並無影響。例如，丙烯酸酯共聚物使用11¥熟化的啓動者。神經毒素可與Zn + +複合，如實例1所示。經zn + +穩 -45- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 χ 297公釐） --------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7

1250020 43 五、發明說明（）走的神經毒素複合物再混合以未熟化之丙缔酸酯共聚物， UV啓動者及酸（PH在5.5及6.8之間）。混合物置於玻璃或澄清的塑質團塊模型内，此可令UV光穿透。模型再置20。〇之溫控水浴中。團塊以UV光熟化約5〇秒，包裝再滅菌。 U V熟化之時間及強度爲如此，使神經毒素被瓦解或變性之量幾可忽略。依欲求之應用定義出團塊大小及包埋在其内神經毒素之濃度及含量。當團塊被植入時，團塊可在體内水解，使神經毒素自植入物内部之最初爆發略爲延緩。在團塊外側以神經毒素欲求之最初爆發濃度一部份塗覆可消除此延緩情形。在此實例中，團塊之效力約持續4至約6個月。實例3 神經毒素控制釋出調和物爲了增加團塊有效遞送神經毒素之時間，可使用多重物質層。因此，較内層可由聚乙烯吡咯啶酮/甲基異丁烯酸酯共聚物製成。此物質可支持高濃度的神經毒素複合物。適量的神經毒素複合以Zn + +，如實例1所示，此複合物再混合以未熟化之共聚物，低溫啓動劑及酸（pH在5.5及6.8之間）。混合物置玻璃或塑質團塊模型中。模型置入約3 5 t 之溫控水浴中，介於約6小時及約8小時之間。此形成延長且受控釋出所需之神經毒素貯存槽。爲了延長神經毒素之釋出，再於最初團塊四週熟化第二層物質。此物質針對高分子密度及生物相容性而選擇。聚甲基異丁烯酸酯（PMMA)是具有此特性之物質實例。（上述） -46- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 χ 297公釐） --------^---------^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1250020

五、發明說明（ 44 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣團塊置於模型中（嵌人模型），其中並有未熟化之PMMA/低溫啓動劑。第二層的未熟化PMMA可能是必要的以確保團塊有均勻的塗層。較好，pMMA厚度爲〇 5毫米。在成形後，團塊外側塗覆以神經毒素欲求的最初爆發濃度。 PMMA層有足夠的厚度使神經毒素在貯存槽中有延遲作用 (夕達3個月）。*神經毒素到達植入物表面，可得神經毒素第二次大的爆發。此二次爆發後是約3個月緩缓減低之神經毒素釋出率。在此實例中，團塊效力可高達約7至約9個實例4 毒素控制釋出植入物經由利用多層-高密度聚合物/低密度聚合物w/神經毒素_ •神經毒素之暫時控制釋出程度可增加，但植入物之大小也可增加。當植入物之大小增加，神經毒素在體内分散之面積愈大，此降低植入物之效力。爲了避免此點，植入物包覆以不可通透物質，如鈦。保持一個小開口使神經毒素可經由包覆之團塊集中地釋出。此效率使植入物有顯著不同的釋出特性。基本上，如此也令聚合物之較厚部份可通過，有效地增加神經毒素釋出之作用期。此内層物質可由如聚乙烯吡咯啶酮/甲基異丁缔酸酯共聚物之材質製成。·此物質可支持高濃度的神經毒素複合物。神經毒素與Ζ η複合。複合物再混合以未熟化之共聚物，低溫啓動劑及酸（pH 5.5及6.8之間）。混合物置玻璃或塑質團塊模型中。模型再置35°C溫控水浴中，介於約6及約8小 -47- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） n n ϋ ·ϋ ϋ ϋ ϋ n ϋ ^1 ^1 0 ϋ -ϋ ϋ n —.1 ί n I n I I n ί> ϋ n I _ (請先閱讀背面之注咅心事項再填寫本頁) 1250020 五 _ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 45 發明說明（）時之間。此形成延長控制釋出所必要之神經毒素貯存槽。爲了延長神經毒素之釋出，再於最初團塊上熟化第二層材料。團塊（上文）置入模型内（嵌入模型），並加有未熟化之PMMA /低溫啓動劑。未熟化之PMMA之第二層是必要的，以確保團塊有均勻之塗覆。理想上PMMA厚度是0.5毫米。爲形成多層，相同的嵌入模鑄技術也如上述般應用。當欲應用最後一層高密度聚合物時，以鈥團塊爲模型。團塊置鈦團塊之内侧，其中並加有未熟化之PMMA。團塊之蓋封好’團塊再置3 5 C強制通風烘箱中約6至約8小時。團塊之蓋有一個2 2號針頭開口，令神經毒素可釋出。在此實例中，團塊效力可爲約1 〇個月至約2 4個月。實例5 皇層管柱之神經毒素植入物爲了可長期持續釋出，另一方式是將高密度聚合物/低密度聚合物w/神經毒素層，置入上述之鈦團塊之内。熟化在 3 5 C左右之強制通風烘箱中進行，各層約6小時至約8小時之間。團塊之直徑是神經毒素施加量之關鑑決定因素。層數可用來決定植入物特續有效之時間有多長。PMMA層各層的厚度約〇·5亳米，且低密度聚合物w/神經毒素約〇 3毫米。對加入的各層，可得到效力約3個月之增加。增加植入物之長度至約6·4毫米加上鈦杳尺寸橫剖面約1毫米，共約7.4#t:米可製成有2年壽命之植入物。依據此中揭示之本發明的組成物及方法，具有許多優點，包括下列： -48- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）丨；--.1,--<--------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1250020 A7

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五、發明說明（ 47 接續地經由植入物投予，以提供輔神經毒素前快速的失神經化㈣，“^強的或在展現其治療作用。 A母母素，以可開始吾：的發明在範圍内也包括神經毒素，如肉毒毒素，在 J成藥物上之用途，如控制釋出之植入物，可治療移動失口周症，及/或因歧能失神經作賴影響之失調症，經由神經毒素植入物之局部投予。因此’以下申請專利範圍之精神及範疇應不致限制上示較佳具體實例之説明。 T . • .^1 _ϋ Βϋ n 1__1 n Ml 1 ，0 mmm mmm mmm wmm mmm _ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -50- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims

、申請專利範園 L種用於治療行動失調症或由膽失調症之可注射或可植入之控耧此失神經作用所影響 (a) _種聚合基質；及出系統，其中包括·· (b) —定量的神經毒素位在聚合量之神經毒素可以長時期自 ^之内，其中分次經毒素是肉毒毒素。 ^ 中釋出，其中該神 2·根據申請專利範圍第!項之控。素以實質上連續或單相方式自户八出系、為’其中的神經毒 3·根據申請專利範圍第土質中釋出。自聚合基質之釋出長期間，系統’其中神經毒素 4·根據申請專利範圍第!項之控制釋二天延長至約6年。質係由實質上非可生物降解之物=，其中的聚合基 5·根據申請專利範圍第！項之控玄且、的。素包括多肽。睪出系統，其中的神經毒 6.根據申請專利範圍第丨項之控制夸ϋA A 釋出系統，其中的神經毒素疋選自包括A，B，Cl，D，p T HI工母經毒素。，F及G型肉毒毒素之神 7·根據申請專利範圍第丨項之# 素是A型肉毒毒素。 4釋出系統’其中的神經毒 8· 請專利範圍第1項之控制釋出系統，其所包括之聚合基質係選自下列 σν» .. 』匕括·異丁締fel酯，乙晞比咯哫酮，乙烯醇，丙烯醇， ^ p ^ 氷甲基異丁烯酸酯，聚矽㈣類’醋酸乙晞酉旨，乳酸，乙醇酸，膠原蛋白，及生 A8 B8 C8 D8

1250020 六、申請專利範圍物陶瓷聚合物及其共.聚物。 9·報據申請專利範圍第丨項之控制釋出系統，其中神妒毒素之量在約1單位及約50,000單位肉毒毒素之間。、，二母’、 10·根據申請專利範圍第i項之控制釋出系統，其中神經毒素之量在約10單位及約2,000單位A型肉毒毒素之間。、 11·根據申請專利範圍第i項之控制釋出系統，其中胃神經毒素之量在約100單位及約30,000單位B型肉毒毒素之間二。母” 12·根據申請專利範圍第1項之控制釋出系統，其中的神經毒素疋肉毒毒素，其可在植入系統處或四周釋出可造成肌肉或肌肉群虛弱的肌肉麻痒之有效劑量。 13· —種用於治療行動失調症或由膽鹼能失神經作用所影響失調症之可注射或可植入之控制釋出系統，其中包括 (a) —種聚合基質；及 (b) 在聚合基質内有介於約1〇單位及約2〇,〇〇〇單位的肉毒毒素，其中分次量的肉毒毒素可自聚合基質中長時間釋出，歷約2個月至約5年。 14· 一種製備金屬陽離子-複舍的神經毒素之方法，此方法包括以下步驟： (a) 形成含有神經毒素之溶液； (b) 混合多價金屬陽離子組份與神經毒素溶液，以複合多價金屬陽離子與神經毒素，由是形成金屬陽離子-複合的神經毒素懸浮液，及； (Ο乾燥該懸浮液以形成金屬陽離子_複合的神經毒素，其中孩神經毒素係肉毒毒素，且該多價金屬陽離子

8 8 8 8 A B c D 1250020 六、申請專利範圍係二價鋅陽離子。 3 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）