TWI295672B - Antibodies against interleukin-1 receptor and uses thereof - Google Patents

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1295672 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於對抗介白素-1受體（IL-1R)之抗體、該等抗 體之製備方法、含該等抗體之醫藥組合物及其用途。 【先前技術】 由於IL-1在治療發炎疾病中扮演重要作用，且其與類風 濕性關節炎引起之炎症及關節損傷有關，故前發炎性細胞 素介白素- l(IL-la及IL-1/3)活化之信號轉導途徑已成爲衆 人關注之焦點。 些蛋白貝業經揭示會參與轉錄因子核因子kappaB(NF_ kappaB)後-受體活化作用及壓力活化之蛋白激酶（例如，p38 絲裂原活化蛋白激酶（mitogen_activated pe〇tein kinase ; MAPK))，介白素-1 受體（il-1R，Swiss Prot. P14778, CD 121a) 係該信號系統（其係先天免疫及炎症反應之重要決定因素） 之一員。治療類風濕性關節炎之方法在近幾年已經歷重大 革命性變革，部分係因對該疾病之嚴重性逐漸瞭解，而部 分則係因對細胞因子在治療該疾病之免疫病理方面之重要 作用之理解已有相當之進展。主要焦點係以TNFa&IL_1為 目標之基本原理。近來發表之研究證實使用一些以1^17〇：為 目標之生物藥劑可持續改善類風濕性疾病之症狀及病徵， 而且TNFa;阻斷物可保護關節免遭結構性損傷。阿那白滯素 (Anakmra)係一介白素q受體拮抗劑（]x_lra)，其可阻斷經 IL-1介導之作用。 美國專利申請案第6,511，665號專利請求一種可專一性鍵 95715.doc 1295672 結至人類IL-1受體上並阻斷IL·〗鍵結至江-丨受體上之單株 抗體。 本發明目的係提供對抗江“尺之新穎抗體，其係治療類似 類風濕性關節炎之發炎性疾病之有效方法。 【發明内容】 吾人驚異地發現存在對抗IL_1R之抗體，其對抑制（人類 胚胎肺臟纖維母細胞，例如MRC-5細胞）經IL-1介導之IL-8 分泌之IC50值爲35 pM或更低。 該等根據本發明抗體對天然及變性IL_1R均具有IL_1R抗 原決定部位專一性，且可抑制鍵結至IL_1R及隨後之信 號轉導作用。該等抗體係鍵結至醣基化形式之IL-1 r之可溶 區域，並具300 pM(KD)之親和力，較佳為200 PM或更低。 對鍵結至去醣基化IL-1R而言，該等抗體具有明顯降低之親 和力。 該等根據本發明抗體可於活體外及活體内抑制IL- 1鍵結 至IL-1R，並藉此抑制形成由IL-1、IL-1R及IL-1 Racp(介白 素-1受體附助蛋白；Q9NPH3)所組成之三元複合物。 本發明包括一可鍵結至人類IL-1R並可抑制人類IL-1鍵 結至IL-1R之抗體，其特徵在於該抗體包含作爲CDRs之SEQ ID ΝΟ:1 之可變重鏈區 CDRl(aa 45-54)、CDR2(aa 69-84)及 CDR3(aa 117-123)及 SEQ ID NO:2 之可變輕鏈區 CDRl(aa 43-57)、CDR2(aa 73-79)及 CDR3(aa 112-120)，或為一嵌合、 - 人源化或缺失T細胞抗原決定部位之抗體變體或為該抗體 之片段，其對抑制人類纖維母細胞MRC5(ATCC CCL 171) 95715.doc 1295672 中經IL-1介導之IL-8分泌之IC-50值為35 pM或更低。 CDR編號及定義，包括信號序列，係如Kabat，E.(參見 Johnson，G.及 Wu，Τ· T.，Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218)所述。 該等根據本發明抗體較佳地不具效應子功能（ADCC及 CDC)，且因此為IgG4同型物，特佳者係絲胺酸228突變成 脯胺酸（Angal，S.等人，Mol. Immunol. 30 (1993) 105-108)。 或者，該等抗體係IgGl同型物，且較佳地在CH1與CH2間約 aa 220-240處之絞鏈區内及/或在CH2與CH3間約aa 330處之 第二間域（inter-domain)區内經修飾（編號係如Kabat所述， 例如，參見Johnson G·及 Wu，T.T·，Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218)，以避免效應子功能。藉由將抗體之不變 重鏈及輕鏈換成所欲抗體種類（例如IgGi或IgG4)之重鏈及 輕鏈即可輕易地進行IgG種類轉換。該等方法已爲熟諳此項 技術者所熟知。 該等根據本發明抗體對需要消炎治療之患者很有益處。 該等根據本發明抗體具有新穎及創意特性，其對患此疾病 之患者（特別是患類風濕性關節炎者）很有益處。該等根據本 發明抗體具有上述性質之特徵。 另外較佳者是該抗體為大鼠來源，且包含如Kabat所述之 大鼠抗體之抗體序列架構。較佳地，在Kabat序列中，胺基 酸10(絲胺酸）自VL鏈上刪除（DEL10)及/或將VH鏈之胺基 酸26(甘胺酸）替換成榖胺酸（G26E)。較佳地，該抗體係使用 如WO 98/08097所述方法之缺失T細胞抗原決定部位之抗 95715.doc 1295672 體。 另外較佳者係當IL-1R拮抗劑濃度高達100 μΜ時，IL-1R 拮抗劑（Arend W.P·，J. Clin. Invest. 88 (1991) 1445-1451)不 會抑制IL-lR(l〇 nM)鍵結至根據本發明經固定抗體上，換 言之，根據本發明抗體與IL-1R之鍵結不受IL-1R拮抗劑抑 制。 按照Kabat，E.所述（見下文），不變區較佳係人類IgG1* 人類IgG4不變區。較佳不變區如圖14、15及16所示。 本發明亦包括經核酸編碼之抗體。經編碼之多肽能分別 與上述界定的其他抗體鏈組合在一起。 較佳地，該核酸編碼一多肽，該多肽為由SEq ID no: 1 可變區所組成之重鏈（VH)及由SEQ ID NO:2可變區所組成 之輕鏈（VL)。 該抗體較佳係單株抗體，且除此之外為嵌合抗體（人類不 麦鏈）、人源化抗體，及特佳者係缺失τ細胞抗原決定部位 之抗體。 该抗體與具有SEQ ID NOS:l-2可變鏈特徵之抗體競爭鍵 結至人類IL-1R上。 該抗體之進一步特徵在於其親和力爲3〇〇 pM或低於該數 值，較佳者係200 PM (KD)或更低，且更佳者係約7〇-2〇〇 pM。 本發明藉此亦包含多肽及編碼核酸，其係選自由根據本 發明IL-1R抗體之重鏈CDR1、CDR2、CDR3及輕鏈、 CDR2、CDR3所組成之上述群組者。 較佳者亦指所有可組合自可變區（示於圖7至1〇)及不變 區（不於14至16中）之抗體，且其對抑制人類纖維母細胞 95715.doc 1295672 MRC5(ATCC CCL 171)中經 IL-1 介導之 IL-8 分泌之 IC_50 值 為35 pM或更低。該等序列係修飾抗體2D8所得之序列實 例，以得到仍保有抗體2D8之IC50及/或抗原決定部位特徵 之優良特性。在該等抗體中，係由圖7及8(缺失T細胞抗原 決定部位）或圖9及1〇(人源化）中之輕鏈及重鏈與圖14及圖 15或16所示之不變區組合而成。尤佳者係抗體dei5/7、 DEI4/7、DEI2/4、DEI5/4、DEI4/5、DEI5/5、HUM2/2、 HUM2/3、DEIl/8、DEI2/8、DEI2/9、DEI4/9、DEI5/8ADEI5/9。 本發明進一步提供一種方法，其係用以鑑定及/或製造具 有根據本發明改良特性之對抗IL-1R之抗體。在該方法中， 係以突變、刪除或增加胺基酸方法修飾抗體2D8之多肽序 列’以便當該抗體投與人類時具有更低之免疫原性。一般 吕之，為降低免疫原性，在可變重鏈及輕鏈中至多可修飾 高達約50個胺基酸。藉由比較2D8之多肽序列及Kabat(前述） 所提供的人類抗體序列及/或鑑定及去除可變鏈中τ細胞抗 原決定部位即可完成該修飾作用。該等修飾之實例如圖 7-10所示。藉由改變該等圖式中框内胺基酸中一或多處即 可産生有用之抗體。較佳地可變鏈之框内區中約2〇_5〇個胺 基酸經修飾。 本發明藉此可提供製備根據本發明抗體之方法，其特徵 在於：在抗體2D8之可變區序列中，在如圖'1〇所示框内個 別胺基酸處經突變、刪除或增加一或多個胺基酸；製備含 有可編碼一連貫順讀架構之該經修飾抗體可變區及較佳如 圖14至16所示之額外人類不變區之核酸之表達載體；在宿 95715.doc -10- 1295672 主細胞中進行表達；及將該經重組製備之抗體之輕鏈及重 鏈一起組合成本發明抗體。 本毛明it #提供編碼此等抗體之核酸、含有該等核酸 之表達載體及含有該等載體之宿主細胞，以便以重組方式 製備該等抗體。 本發明進-步提供以重組方式製備該等抗體之方法。 本發明進-步提供治療類風濕性關節炎及/或骨關節炎 之方法，其包含投與經診斷患有類風濕性關節炎（且因此需 要此一治療）之患者有效量之根據本發明對抗ir之拮抗 性抗體。該抗體較佳係以醫藥組合物形式投與。 本發明進一步包含根據本發明抗體之用途，其係用於治 療類風濕性關節炎及製備根據本發明醫藥組合物。此外， 本發明包含製備根據本發明醫藥組合物之方法。 本發明進一步包含醫藥組合物，其含有醫藥有效量之根 據本發明抗體，視情況還含有對調配用於醫藥目的之抗體 很有用之缓衝劑及/或另外之賦形劑。 本發明進一步提供包含併與醫藥上可接受載劑中之此等 抗體之醫藥組合物。在一個具體實施例中，該醫藥組合物 可包含於産品或套組物件中。 本發明進步包含含有根據本發明核酸之載體，其能在 原核或真核宿主細胞中表達該核酸。 本發明進一步包含含有根據本發明載體之原核或真核宿 主細胞。 本發明進一步包含製備根據本發明重組人類抗體之方 95715.doc -11 - 1295672 法’其特徵在於在原核或真核宿主細胞中表達根據本發明 核酸’並自該細胞中回收該抗體。本發明進一步包含以此 重組方法可獲得之抗體。 【實施方式】 術語π抗體’’包含各種形式之抗體，其包括（但不限於）完整 抗體、抗體片段、人源化抗體、嵌合抗體、缺失了細胞抗原 決定部位之抗體、及進一步以遺傳工程構建之抗體，只要 彼專抗體保留本發明之特性即可。 π抗體片段’’包含全長抗體之一部分，一般言之，至少包 合其抗原結合部位或其可變區。抗體片段之實例包括由抗 體片段形成之雙抗體、單鏈抗體分子、免疫毒素及多專一 性抗體。另外，抗體片段包含具有VH鏈特徵（即能與一VL 鏈組合在一起者）或具有能與IL-1R結合之VL鏈特徵（即能 與VH鍵一起組合成功能性抗體結合袋中）之單鏈多肽，且其 藉此能提供抑制IL-1鍵結至il- 1R之特性。 本文所用術語”單株抗體”或”單株抗體組合物，，意指具單 純剎一 fe基酸組合之抗體分子之製備物。術語"嵌合抗體，， 意指含有源自大鼠可變區（即鍵結區）及至少一部分衍生自 不同來源或物種之不變區之單株抗體，其通常係以重組 DNA技術製備之。含有大鼠可變區及人類不變區之嵌合抗 -己仏此寺大乳/人類嵌合抗體係為免疫球蛋白基因（包含 編碼大鼠免疫球蛋白可變區之DN A片段及編碼人類免疫球 蛋白不夂區之DNA片段）所表達之產物。本發明所涵蓋之其 他幵y式之肷合抗體”係彼等源自原始抗體者之經修飾或變 95715.doc -12 - 1295672 換之類別或亞類別。此類f’嵌合”抗體亦被稱做π類別轉換之 抗體’’。製備嵌合抗體之方法包括已爲熟諳此項技術者所熟 知之常規重組DNΑ及基因轉染技術。例如，參見Morrison，S. L.等人，Proc· Natl· Acad Sci. USA 81 (1984) 6851-6855 ; 美國專利第5,202,238號及第5,204,244號。 術語H人源化抗體”意指彼等抗體中之架構或"互補決定 區"（CDR)修飾成包含與親本免疫球蛋白相比具不同專一性 之免疫球蛋白之CDR之抗體。在一較佳具體實施例中，係 將大鼠之CDR移植至人類抗體之架構區中，以製備該”人源 化抗體’’。舉例而言，參見Riechmann L.等人（Nature 332 (1988) 323-327)及 Neuberger，M.S·等人（Nature 314 (1985) 268-270)。對於嵌合及雙功能抗體，特佳之CDRs係對應於 彼等可識別上述所提之抗原代表序列。根據本發明之人源 化抗體之實例如圖9及10所示。 術語，，缺失T細胞抗原決定部位之抗體π意指藉由移除人 類Τ細胞抗原決定部位（蛋白内能與MHC II類分子結合之肽 序列）將其修飾成去除或降低免疫原性之抗體。藉由該方 法，可確定肽之胺基酸侧鏈與帶有MHC II類鍵結溝之專一 性結合袋間之相互作用。經確定之免疫原區經突變可消除 免疫原性。該等方法之一般闡釋可參考（例如）wo 98/52976。具有用可變區及根據本發明缺失T細胞抗原決定 部位之抗體之貫例如圖7及8所不。 本文所用”鍵結’’意指抗體可以親和力約爲3〇〇 pM或低於 該數值與IL-1R鍵結，較佳約200 pM或更低（KD)，且更佳約 95715.doc -13- 1295672 70-200 pM ° 本文所用術語’’核酸分子n意欲包括DNA及RNA分子。核 酸分子為單股或雙股，但較佳係雙股DNA。 本文所用”可變區π(輕鏈之可變區（VL)、重鏈之可變區 (VH))代表每一對直接參與抗體及抗原鍵結之輕鏈及重 鏈。可變輕鏈及重鏈結構域有相同之通用結構，且每一結 構域包含四個高度保守序列之架構（FR)區，FR區經由三個 ’’超變區’’（或互補決定區，CDRs)連接。架構區係為/3-片層 結構，而CDRs則形成能連接/?-片層結構之迴環（loop)。每 一鏈中之CDRs係藉由架構區保持其三級結構，並與另一鏈 中之CDRs —起形成抗原結合部位。抗體重鏈及輕鏈之 CDR3區在根據本發明抗體之鍵結專一性/親和性方面扮演 特別重要的作用，且其藉此可提供本發明之另一目的。 本文所用術語’’超變區”或π抗體之抗原結合部位’’意指抗 體中負責與抗原結合之胺基酸殘基。超變區包含”互補決定 區’’或”CDRsn之胺基酸殘基。本文所用’’架構n4’’FRn區係彼 等除了超變區殘基之外的可變結構域區。故，抗體之輕鏈 及重鏈從N-端至C-端包含結構域FiU、CDRb FR2、CDR2、 FR3、CDR3及FR4。尤其重鏈之CDR3是貢獻抗原結合最大 之區域。CDR及FR區係根據Kabat等人（Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th ed·，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD (1991)) 之標準定義及/或彼等”超變迴環（hypervariable loop)11中之 殘基決定。 95715.doc -14- 1295672 本文所用術語π鍵結至IL-1R"意指在活體外ELISA分析 (較佳係使用經生物素化人類IL-1R及鏈黴抗生物素之塗布 微量滴定盤之鍵結分析）中，抗體鍵結至IL-1R之親和力。 鍵結至IL-1R之親和力亦可藉由Biacore(生物感測器）分析 法（Biacore AB，Uppsala，Sweden)測試。鍵結親和力係藉由 術語k。〆與抗體/抗原複合物中之抗體相結合之速率常 數）、k〇ff(解離常數）及Kodn/koff)界定。根據本發明抗體之 KD為3 00 pM或更低，較佳者200 pM或更低，且更佳者7〇_2〇〇 pM，本發明抗體可抑制IL-1鍵結至IL-1R上，且較佳地其係 鍵結至與IL-1相同位置之IL-1R上。 術語nIL-1R表達細胞，，意指此等可表達IL_丨受體之細胞。 舉例而言，該等細胞係類似MRC5之人類纖雄母細胞。 根據本發明抗體具有鍵結至與抗體2D8相同之IL-1R之抗 原決定部位，或本發明抗體鍵結至比一尺會因空間鍵結障礙 受到抑制。鍵結抑制可藉由使用經固定之IL_丨尺及抗體2D8 之競爭性分析法檢測之。信號減低5〇%或以上則顯示該抗 體可與抗體2D8競爭。 術語”抗原決定部位"意指能與抗體專一性鍵結之蛋白決 定子。抗原決定部位通常由分子之化學活性表面基團（例 如，胺基酸或醣之侧鏈）組成，且其通常具有特異性的三級 結構特徵及特異電荷特徵。構象―加咖嶋收非構象 抗（n〇n-conf〇rmati〇nal)原決定部位之不同在於當變性溶劑 存在時，與構象抗原決定部位之鍵結會喪失，而與非構象 抗原決定部位之鍵結則不會喪失。藉由根據本發明抗體對 95715.doc -15- 1295672 天然及變性IL-1R二者之鍵結可辨識出與根據本發明抗體 專一性鍵結之IL-1R之抗原決定部位。根據本發明抗體鍵結 至人類IL-1R(醣基化，可溶性胞外結構域）比鍵結至經去醣 基化IL-1R(以N-醣苷酶F處理後，藉由西方墨潰法分析測量） 至少約50倍強，較佳地至少約100倍強。故，根據本發明抗 體對鍵結至去醣基化IL-1R而言具有明顯降低之親和力。 另外，根據本發明抗體包括彼等具”保守序列修飾”（核苷 酸及胺基酸序列修飾）之抗體，該等修飾不影響或改變根據 本發明抗體之上述特徵。可使用熟諳此項技術者所熟知之 標準技術來引入該等修飾作用，例如定點突變、PCR介導 的突Μ。保守胺基酸取代包括彼等以具有類似側鏈之胺基 酸殘基取代该胺基酸殘基之取代作用。在此項技術中已界 定出具有類似側鏈之胺基酸殘基類別。該等類別包括帶驗 性側鏈之胺基酸（例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸）、帶酸性 側鏈之胺基酸（例如，天冬胺酸、穀胺酸）、具不帶電荷的極 性側鏈之胺基酸（例如，甘胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺、絲 胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸）、具非極性侧 鏈之胺基酸（例如，丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、 脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸）、具/3-分支側鏈之胺基酸（例 如，蘇胺酸、綠胺酸、異白胺酸）及具芳族側鏈之胺基酸（例 如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸）。故，人類抗_I]L_1R 抗體中預期之非必需胺基酸殘基較佳以相同側鏈類別中之 ^ 另一胺基酸殘基取代。 1 胺基酸取代可以 Riechmann，L·等人（Nature 332 (1988) 95715.doc -16- 1295672 323-327)及 Queen，C.等人（Pr〇c. Natl Acad % 仍人 ％ (1989) 10029-10033)所述之分子模型為基礎之突變作用達 成。 根據本發明抗體在活體内（獼猴或人）具有至少約$天之 血清半衰期，較佳地為8-15天。 根據本發明抗體較佳地係以重組方法製備。此等方法已 爲熟諳此項技術者所熟知，且該方法包含在原核及真核細 胞中表達蛋白，隨後分離該抗體多肽，並通常將其純化至 醫藥上可接受之純度。爲表達蛋白質，編碼輕鏈及重鏈或 其片段之核酸可以標準方法插入至表達載體中，在合適之 原核或真核宿主細胞（例如CHO細胞、NS0細胞、SP2/〇細 胞、HEK293細胞、COS細胞、酵母細胞或大腸桿菌細胞） 中進行表達’並自細胞（>谷囷後之上清液或細胞）中回收該抗 體。 以重組方法製備抗體已爲熟諳此項技術者所熟知且其闡 釋於’舉例而言，Makrides，S.C.(Protein Expi\ 17 (1999) 183-202)、Geisse，S·等人（Protein Expr· Purif· 8 (1996) 271-282)^ Kaufman, R.J.(Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151- 161)、Werner，R.G.(Drug Res. 48 (1998) 870-880)等之評論 性文章中。 抗體可存在於整個細胞、細胞溶解產物中，或以部分純 化或實質純化之形式存在。可藉由標準技術（包括鹼/SDS處 -理、CsCl分離紋帶法、管柱層析法、瓊脂醣凝勝電泳及其 他已爲熟諳此項技術者所熟知之方法）進行純化，以排除其 95715.doc -17- 1295672 他細胞成分或其他雜質，例如，其他細胞核酸或蛋白質。 參見，Ausubel，F.等人（ed. Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)) 〇 在NSO細胞中之表達（例如）揭示於Barnes，L.M.等人 (Cytotechnology 32 (2000) 109-123)及 Barnes，L.M.等人 (Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270)。瞬時表達（例如）揭示 於 Durocher，Υ·等人（Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9)。可變 結構域之選殖揭示於Orlandi，R_等人（Proc. Natl. Acad. Sci_ USA 86 (1989) 3833-3837)、Carter, P.等人（Proc· Natl· Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289)及 Norderhaug，L.等人（J· Immunol. Methods 204 (1997) 77-87)。一較佳之瞬時表達系 統（HEK293)揭示於 Schlaeger， E，J·及 Christensen， K.(Cytotechnology 30 (1999) 71-83)及 Schlaeger，Ε·- J.(J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199) ο 適於原核生物之控制序列（例如）包括啓動子、視情況操 縱子序列及核醣體鍵結位點。吾人已知真核細胞可利用啓 動子、增強子及聚腺苷酸化信號。 當核酸放置在與另一核酸序列具有功能關係時，該核酸 係為”可以操作方式連接的#。舉例而言，若前序列或分泌 前導序列之DNA經表達後可爲參與分泌多肽之前蛋白，則 該前序列或分泌前導序列之DNA與該多肽之DNA即為可以 操作方式連接的；啓動子或增強子若可影響編碼序列之轉 錄作用，則該啟動子或增強子與該序列即為可以操作方式 95715.doc -18- 1295672 連接的m請體鍵結位點經與編碼序列定位後可促進 轉譯作用’則該核醣體結合點即為可以操作方式連接的。 -般言之，”可以操作方式連接的”意指與其所連接的dna 序列鄰接’以分泌前導序列之狀況而言，其既鄰接亦處於 順讀架構；然巾，增強子則無須鄰接。利用習知限制酶位 點之接合可完成連接。若該等限制酶位點不存在，則可根 據習知操作使用合成性寡核苷酸接頭或連接子。 單株抗體適於以習知免疫球蛋白純化程序（例如，蛋白A_ 瓊脂醣凝膠、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親和 層析法）自培養基中分離出來。使用習知程序可迅速分離並 測序可編碼單株抗體之DNA及RNA。融合瘤細胞可作爲此 DNA及RNA的來源。一旦分離，可將該DNA插入至表達載 體中，然後將其轉染至另外不産生免疫球蛋白之宿主細胞 (例如HEK 293細胞、CHO細胞或骨髓瘤細胞）中，以便在宿 主細胞中合成重組性單株抗體。 藉由將適當核苷酸改變體引入至該抗體DNA中，或藉由 月太合成作用可製備出人類IL-1R抗體之胺基酸序列變體。然 而’僅可在極有限範圍（例如，如上所述者）内進行此等修飾 作用。舉例而言，該等修飾作用不可改變上述抗體特徵， 例如，IgG同型物及抗原決定部位之鍵結，但其可提高重組 産物量、蛋白質穩定性或促進純化。 任何不參與維持抗-IL-1R抗體之正確構象之半胱胺酸殘 基亦可被取代（一般係用絲胺酸取代），以提高分子之氧化穩 疋性並阻止異常交聯。相反地，抗體中可加上半脱胺酸鍵 95715.doc -19 - 1295672 結，以提高其穩定性（特定言之’該抗體係抗體片段，例如， 片段）。 另一類抗體之胺基酸變體係改變抗體之原初醣基化形 式。改變意指刪除一或多個存在於抗體中之碳水化合物部 分’及/或增加一或多個在抗體中原本不存在之醣基化位 點。抗體之醣基化作用一般係N_連接的。N_連接意指碳水 化合物部分與天冬醯胺殘基之側鏈相結合。三肽序列之天 冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺蘇胺酸（其中χ係除脯胺酸 外之任何胺基酸）係該碳水化合物部分與該天冬醯胺側鏈 酶促結合之識別序列。故，多肽中存在該等任一種三肽序 列均可産生潛在性醣基化位點。通常係藉由改變胺基酸序 列以使抗體中含有一或多個上述三肽序列（作爲Ν-連接的 醣基化位點處），而將醣基化位點輕易地加入至抗體中。 可藉由各種已爲熟諳此項技術者所熟知之方法製備編碼 抗-IL-1R抗體之胺基酸序列變體之核酸分子。該等方法包 括（仁不限於）刀離自天然來源者（在天然存在胺基酸序列變 體之狀況下），或以寡核苷酸介導之突變（或定點突變）、pcR 突變及序列盒突變進行人源化或缺失了細胞抗原部位之抗 -IL-1R抗體之早期製備變體或非變體製備之。 另一類型之共價修飾作用係與以化學方式或酵素方式將 膽普偶聯至抗體上有關。該等程序很有益處，因其不需要 在具有NH連接絲化作用之醣基化能力之μ細胞中 產生抗體。取決於所用偶聯模式，醣類可結合至⑷精胺酸 及組胺酸、(b)游離竣基、⑷游離疏基(例如彼等半胱胺酸 95715.doc -20- 1295672 者）、（d)游離羥基（例如彼等絲胺酸、蘇胺酸或 者）、（e)芳族殘基（例如彼等苯丙胺酸、酪胺酸或色^按酸者） 或（f)穀胺醯胺之醯胺基上。該等方法闡釋於w〇 87/〇533〇 及 Aplin，J.D^Wriston，j C Jr，CRC 灿細 4(1981) 259-306 中。 移除任何存在於抗體中之碳水化合物部分可以化學或酵 素方法完成。以化學方法進行去醣基化作用需要將抗體暴 露於化合物三氟甲磺酸或等效化合物中，此處理會切除連 接醣（N-乙醯胺基葡萄，醣或N_乙醯半乳醣胺）以外大部分或 全部的醣類，而保留完整的抗體。以化學方法進行去醣基 化作用揭示於 Sojahr，H.T·及 Bahl，〇.P.(Arch· Bi〇chem

Biophys· 259 (1987) 52-57)及 Edge，A.s·等人（Anal. Biochem. 1 18 (1981) 131-137)。以酵素方法切除抗體上碳水 化曰物σΡ刀則可藉由使用各種如Th〇takura，N.R.及Bahl， 〇.P，（Meth· Enzymol. 138 (1987) 350-359)所述之内切及外 切醣苷酶來達成。 抗體之另一類型之共價修飾作用包含將該抗體以美國專 利第 4,640,835 號、第 4,496,689 號、第 4,301，144 號、第 4,670,417號、第4,791，192號或第4，179,337號中所述之方法 連接至各種非蛋白質聚合物中任一種上，例如，聚乙二醇、 聚丙二醇或聚氧化稀煙。 本發明較佳包含可編碼一可鍵結至IL_1R之之核酸片 段，據此該多肽可抑制IL-1鍵結至IL-1R，該多肽係選自由 SEQ ID N0:1之可變區所組成之重鏈（VH)及由seq ID NO:2 95715.doc -21 - 1295672 之可變區所組成之輕鏈（VL)。 將重新構築之重鏈及輕鏈可變區與啓動子、轉譯起始 區、不變區、3,非轉譯區、聚腺苦酸化作用及轉錄終止區之 序列相組合，以形成表達載體構築體。重鏈及輕鏈表達構 築體可組合至單-載體中，經共轉染、連續轉染或分別轉 染至f主細胞中，然後將該等宿主細胞融合成可表達兩條 鍵之早一伯主細胞。 故，本發明提供製備根據本發明重組人類抗體之方法， 其特徵在於在原核或真核宿主細胞巾表達可編碼由卿出 ΝΟ:1之可變區所組成之重鏈（VH)及由seq ι〇 Ν〇··2之可變 區所組成之輕鏈（VL)及人類輕鏈不變區（CL)之核酸，且可 自該細胞中回收該抗體。

本發明進一步包含根據本發明抗體在活體外鑑定IL_1R 之應用，較佳地係以免疫分析法測定樣品中之z L _丨r與根據 本發明抗體間之鍵結。 另一方面，本發明提供一組合物（例如，醫藥上可接受袓 合物）。’其含有併與醫藥上可接受載劑調配之根據本發明之 一種單株抗體或組合，或其抗原結合部位。 ^文所用"醫藥上可接受之载劑"意指任何及所有生理上 相谷之/谷劑、分散介質、塗布劑、抗細菌劑及抗真菌劑、 等滲劑及吸收延遲劑等。_較佳適於經靜脈内、經肌内、 經皮下、非經腸、經脊髓或經表皮投與（例如，經注射或經 輸注投與）。 ’’醫藥上可接受之鹽”意指可保留抗體所需生物活性且不 95715.doc -22- 1295672 π來任何不良之毒物學效應之鹽（例如，參見Berge，SM•等 人，J· Pharm· Sci· 66 (1977) 1_19)。該等鹽包括於本發明 中。该等鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包 括彼等衍生自無毒性無機酸者，例如氫氯酸鹽。 本發明組合物可以熟諳此項技術者所熟知之各種方法投 與。熟諳此項技術者應瞭解，投與路徑及/或投與方式會因 所期望之結果而異。 爲以某一投藥路徑投與本發明化合物，有必要使用一材 料塗覆該化合物或將該化合物與該材料共投與，以避免本 發明化合物失去活性。舉例而言’該化合物可於合適载劑 (例如’脂質體或稀釋劑)中投與患者。醫藥上可接受之稀釋 wJ包括鹽水及水緩衝溶液。 商藥上可接x之載劑包括無菌水溶液或分散液，及臨時 配製無菌注射用溶液或分散液所用之無菌粉末。將該等介 質及試劑用於醫藥活性物質已爲熟諳此項技術者所熟知。 本文所用短語，，非經腸投與"及，，以非經腸方式投盘"音才t 以經腸及局部投與料之其他投與方式，通常係注^ 式，且其包括（不受限制）經靜脈内、經肌内、經動脈内、姐 勒内、經英膜内、經眼寫内、經心臟内、經皮内、經腹： 腔内、經氣管、經皮下、經表皮下'經關節内、經囊下、 經=膜下、經脊柱内、硬膜外及經胸骨内注射及輸注。 该寻組合物亦可包含賦形劑，例如㈣劑、_ 化劑及分散齊]。ά W 1 ^ 久錄^ 1 序或無菌生產條件及‘藉由加入 α几'，.田劑及抗真菌劑（例如，對氧苯甲酸醋、氯丁醇、 95715.doc •23· 1295672 笨酚、山梨酸及類似物）可確保防止微生物的存在。該組合 物中亦可加入等滲劑，例如醣類、氯化鈉及類似物。另外， 藉由加入硓延緩吸收之試劑（例如，單硬脂酸鋁及明膠）可製 備長效吸收型之可注射醫藥形式。 不s所選擇之投與路徑為何，本發明化合物可以合適之 水口形式及/或本發明醫藥組合物形式使用，藉由已爲熟諳 此項技術者所熟知之方法，將其調配成醫藥上可接受之給 藥形式。 本發明醫藥組合物中活性成分之實際劑量可加以變化， 以獲付針對特定患者、組合物及投與方式所欲達到治療效 果且不使患者中毒之活性成分量。所選擇之劑量端視各種 酉藥動力予因子而冑’該等因子包括本發明所用特定組合 物或其s旨、其鹽或其醯胺之活性、投與路徑、投與時間、 所用特定化合物之分泌速率、治療持㈣間、其他與所用 特定組合物-起使用之藥物、化合物及/或材料、待治療患 者之年齡/生別、體重、身體狀況、健康狀況及先前病史 及其他已爲醫學技術中所熟知之因子。 該組合物必須係無菌狀態，且係可以注射器傳送之、、， 體。除水外，_可為等渗緩衝鹽水溶液、乙醇、多元: 例而言，甘油、丙二醇及液態聚乙二醇及類 二 之混合物。 ，、口逦 (舉例而言）藉由使用塗布_如㈣si)、在分& 下維持所需粒度及㈣表面活性劑可維持料之 在許多狀況下’較佳者係在組合物中加入等渗劑（例如 95715.doc -24- 1295672 類）、多元醇（例如甘露醇或山梨醇）及氯化鈉。藉由在組合 物中加入一能延緩吸收之藥劑（例如單硬脂酸紹或明膠）來 達成對可注射組合物之長期吸收。 當如上所述該活性化合物經適當保護後，則該化合物可 經口投與，例如與惰性稀釋劑或可吸收的食用載劑一起。 根據本發明之抗體可用於治療患有類風濕性關節炎且需 要此治療之患者。故，本發明白人、么處虫士此 +〜月包3冶療患有類風濕性關節 炎之患者之方法。 本發明進一步可提供用於製備包含有效量之本發明抗體 及醫藥上可接受載劑之醫藥組合物之方法，並提供本發明 抗體於此一方法中之應用。 提供下述貫例、參考文獻及序列表以幫助理解本發明， 其實際範圍闡釋於附屬申請專利範圍中。當然，可在操作 中實施修飾而不背離本發明之主旨。 實例 實例1 産生對抗h-IL-lR之大鼠單株抗鱧 培養融含瘤 經產生之大鼠單株抗體於37。0：及5% C〇2下在PRMi 164〇 及不含血清之10% Hyclone培養基（Bi〇whittaker)中培養。 免疫程序及融合瘤發展 以在SF9昆蟲細胞中所製備之重組人類JL-1R免疫5隻 Sprague Dawley大鼠。經腹膜腔内方式以完4Freund氏佐劑 進行首次免疫接種（10 0微克蛋白質），所有其他免疫接種則 95715.doc -25- 1295672 係以不完全Freund氏佐劑進行。藉由融合NSO細胞與大鼠 之脾細胞可産生單株抗體。 實例2

IL-1R專一性 ELISA 藉由抗原專一性ELISA測定經免疫小鼠血清中抗-IL-1R 效價或培養基上清液中之抗體。將溶於PBSBSA(PBS/1% BSA)中濃度爲0.125微克/毫升之可溶性生物素化h-IL-lR於 室溫下在振蕩器上塗布至96孔盤上1小時（該96孔盤事先已 使用鏈黴抗生物素塗布）。其後於室溫下使用PBSBSA阻斷 30分鐘。血清事先在PBSBSA中稀釋至1/100，並系列稀釋 至高達1/6400。經計算將上清液在PBSBSA中稀釋自1/100 至1/10000之範圍。將經稀釋之血清或上清液加至盤孔中， 並於室溫下在振蕩器上培養2小時。接種前之血清或培養基 作為陰性對照。125微克/毫升大鼠抗人類IL-1R抗體（選殖 2D8)作為陽性對照。隨後，用PBS/0.05% Tween20沖洗盤孔 3次，並與和辣根過氧化物酶（HRP)-共軛的兔-抗-大鼠-IgG(Bethyl Laboratories 公司）（其於 PBSBSA 中稀釋至 1:187:50)於室溫下在振蕩器上一起培養1小時。用 PBS/0.05% Tween20沖洗盤孔4次，並將樣品於室溫下黑暗 處在振蕩器上用新配製的TM Blue® (Intergen公司）之溶液 顯色15-20分鐘。於370奈米下測量吸光值，並以492奈米爲 參照波長。另一選擇是在每一盤孔中加入20微升1 M H2S04 終止呈色反應；在該情況下，係於450奈米處進行量測，並 以690奈米爲參照波長。結果如圖1所示。 95715.doc -26- 1295672 實例3 測定抗-hIL_lR之鍵結特性 使用CM5晶片在BIACORE® 3000上進行測定。偶聯係以 胺偶聯形式為之。所用緩衝液係PBST(PBS+0.05% Tween)，pH 7.4，25°C。 a) 測定抗_hIL-lR抗體與IL_1R之親和性 爲測量親和性，將抗-Fey抗體（兔-抗-人類）偶聯至該晶片 之表面，以展現對抗IL-1R之抗體。抗-IL-1R抗體可鍵結至 抗-Fey抗體上，並加入溶於溶液中之各種濃度之重組人類 IL-1R胞外結構域。藉由灌注IL-1R 60秒鐘來測量鍵結，藉 由用緩衝液洗滌晶片表面3分鐘來測量解離。抗體之親和常 為：

抗體 2D8 100 pM

嵌合抗體 2D8(IgGl) 93 pM

嵌合抗體 2D8(IgG4) 105 pM 所有抗體之所有量測數據範圍介於70-120 pM之間，故這 三個抗體之親和性應在同一範圍中。

b) 抗-hIL-lR抗體與配位體IL_1鍵結至IL_1R之競爭性 爲獲得該等量測值，使用與a)中相同之方法。若hIL-lR 與抗-hIL-lR抗體2D8鍵結，則hIL-1不會鍵結至該受體上， 該抗體阻斷該受體上hIL-Ι之鍵結位點。 c) 藉由抗-hIL-lR抗體2D8抑制三元複合物hIL-1/ hIL-lR/hIL-lR AcP構築體 爲檢測三元複合物，將多株抗-IgG抗體偶聯至晶片表 95715.doc -27- 1295672 面，以展現融合蛋白 Fc/hIL-lR AcP(Swiss Prot Q9NPH3; R&D Sytems)。在溶液中可檢測hIL-1/ hIL-lR複合物鍵結至 經固定之hIL-lR AcP。當抗-hlL-lR 2D8抗體與hIL-lR—起 培養時，該抗體會抑制該三元複合物hIL-1/hIL-lR/hIL-lR AcP之生成（圖4)。 實例4 a) 抑制MRC-5細胞中經IL_1誘導的IL-8之產生 抑制人類纖維母細胞中經IL-1誘導的IL-8之產生係以細 胞生物分析法測定之。用hIL-l]8刺激人類胚胎肺臟纖維母 細胞MRC-5，且以單一步驟ELISA測定IL-8之產生。添加抗 -h-IL-lR抗體可抑制刺激作用證實該抗體之阻斷功能。 根據下述分析步驟進行生物分析法： 第1天，將MRC-5細胞以100微升培養基（10% FBS)中含有 2.5x10s細胞之密度接種於每一盤孔中，並在培養箱中培養 24小時。 第2天，移除培養基，且加入50微升置於分析培養基（1% FBS)(當湏4試經純化抗體時）或Hybidoma-Medium SF(當測 試融合瘤上清液時）之樣品。融合瘤上清液之最佳稀釋度介 於1:1000及1:1，000,000之間。在培養箱中培養30分鐘。隨 4* 後，每一盤孔加入50微升溶於分析培養基（1% FBS)之 h-IL-l/3(2倍濃度！）（若測試融合瘤上清液時，則分析培養 基含2% FBS)，使得FBS最終濃度爲1%。於37°C下再培養7 小時，並將上清液（80微升）轉移至另96孔盤中。

b) h-IL-8-ELISA 95715.doc -28- 1295672 根據製造商的步驟（R&D Systems，USA)用未經稀釋之上 清液進行分析（Miller，M.D 及 Krangel，M.S·，Crit· Rev. Immunol. 12 (1992) 17-46)(用於血液及腦脊髓之液態樣品 之步驟）。刺激之最大值（不含抗體之對照組）約750皮克/毫 升IL-8。被抗體抑制IL-8分泌之IC50示於圖5，且其為： 抗體2D8 7.2 pM( 1.08奈克/毫升） 嵌合 2D8(IgGl) 4.7 ρΜ(0·71 奈克/毫升） 嵌合 2D8(IgG4) 5.1 ρΜ(0·77奈克/毫升） 根據本發明抗體之所有實驗範圍介於4.0-35.0 ρΜ之間。 在此MRC-5生物分析法中，2D8與市售對抗IL-1R之抗體 之比較結果示於表1 : 表1 : 製造商 目錄 編號 選殖 宿主 IgG 類別 抗原 中和* IC-50 2D8 大鼠 IgG2a 是 1.08奈克 /毫升 Antigenix MC260020 Rll 大鼠 IgG2a CD121a 是 > 100 奈 克/毫升 Antigenix MC261020 R12 大鼠 IgG2a CD121a 否 〉100 奈 克/毫升 PBL Biomedical Laboratories 21808-1 RMH1R-1 大鼠 IgG2a CD121a 是 33奈克/ 毫升 PBL Biomedical Laboratories 21809-1 RMH1R-2 大鼠 IgG2a CD121a 否 > 100 奈 克/毫升 Cell Sciences CM2028 RMHL-1 大鼠 IgG2a CD121a 是 > 100 奈 克/毫升 R&D Systems MAB269 35730 小鼠 IgGl s-IL-lRI 未知 > 100 奈 克/毫升 BD Pharmingen 551388 HIL1R- M1 小鼠 IgGl kappa CD121a 未知 > 100 奈 克/毫升 Biotrend 0100- 0242 49/20 小鼠 IgGl s-IL-lRI 是 > 100 奈 克/毫升 95715.doc -29- 1295672 根據圖7-10之胺基酸序列，以突變作用構建一系列人源 化及缺失T細胞抗原決定部位之抗體’並以h -1L - 8 - E LIS A分 析IC50。與抗體2D8(1.0)相比，結果示於表2。 所用縮寫之說明： HUM: 圖9及10序列之組合 DEI: 圖7及8序列之組合 HUM2/2: HURHuVHv2及 HURHuVKv2序列之組合

DEI 1/8: HURDIVHvl 及 HURDIVKv8序列之組合 表2 : 抗體 生物分i 斤法 第1次實驗 第2次實驗 平均值 2D8 - - 1.0 DEI5/7 3.4 1.2 2.3 DEI4/7 3.4 3.5 3.5 DEI2/4 2.5 2.0 2.3 DEI5/4 3.1 1.9 2.5 DEI4/5 1.5 4.5 3.0 DEI5/5 5.2 3.9 4.6 HUM2/2 0.9 1.0 1.0 HUM2/3 0.8 1.5 1.2 DEI1/8 3.2 0.7 2.0 DEI2/8 3.3 1.4 2.4 DEI2/9 2.7 2.8 2.8 DEI4/9 5.2 4.1 4.7 DEI5/8 1.7 2.2 2.0 DEI5/9 1.6 2.8 2.2

e)以ELISA測定免疫活性 與2D8抗體相比，抗體之相對免疫活性可以ELISA測定。 於室溫下，在96孔盤（事先用鏈黴抗生物素塗布）上塗布可溶 性生物素化之人類IL-1R 1小時。經BSA阻斷後，稀釋該抗 體，並將其加至盤孔中，且於室溫下培養2小時。洗滌盤孔 95715.doc -30- 1295672 :至下與和辣根過氧化物酶（POD)-共輛之兔-抗- 大鼠-1=一起培養1小時。進一步洗滌後，藉由添加 TM Blue及測定37〇奈米處吸光值，可測定經鍵結之抗體含 量。 結果示於表3。

實例5 抑制人類血液中經江-1誘導的IL-8之μ 爲估汁杬體2D8抑制人類血液中經比」誘導比_8產生之 阻斷月匕力’進行生物分析法。使用肝素^9單位/毫升）收集 人類血液I 1 〇奈克/毫升h-IL 1 刺激，且以單一步驟 ISA測疋IL.8之產生。藉由加入抗hir抗體之抑制刺 激作用已證實該抗體在料活樣品分析法之阻斷功能。根 據實例4之_進行生物分析法，除了在有或/無該抗體狀 95715.doc 1295672 況下與IL-1 一起於37QC培養16小時，且根據製造商的步驟 (R&D Systems，USA)測試經！ ：5稀釋樣品中是否存在IL_8。 派度爲100奈克/毫升之2D8抗體會抑制人類血液中〜5〇%經 IL-1誘導IL-8之分泌（參見圖6)。 · 實例6 產生重組抗體 業已構築能表達嵌合抗體之載體，其由與鼠可變區相連 的人不變區組成。已構築兩個嵌合重鏈表達載體，其係由 抗-IL 1R之大鼠VH(其連結至表達載體pSVgpt中人類IgG1 及人類IgG4不變區）所組成。已構築一嵌合輕鏈表達載體， 其係由抗-IL 1R之大鼠VK(其連結至表達載體pSvhyg中人 類Kappa鏈不變區）所組成。使用載體vh-PCRI及VK_PCR1 爲模板引入5側端序列（其包括前導信號肽、前導内含子及 鼠免疫球蛋白啓動子）及3側端序列（其包括剪接位點及内含 子序列）。在嵌合表達載體中VH及VK，已證實DNA序列係 正確的。藉由電穿孔法，將重鏈及輕鏈表達載體共轉染至 NS0細胞（ECACC No 851 10503，不産生免疫球蛋白之大鼠 骨髓瘤細胞）中。藉由針對人類IgG之ELISA，篩選出可產生 人類抗體之經轉染細胞選殖。 實例7 IL-1R之去醣基化作用 純化自經轉型SF9昆蟲細胞上清液之5微克可溶性重組人 類1型IL-1受體（IL-1R，胺基酸序列參見圖11)於37°C下分別 與 3 mU神經胺酸酶（N)(R〇che Diagnostics GmbH， DE ;第 95715.doc -32- 1295672 269611 號）、0.3U N-醣苷酶 F(Roche Diagnostics GmbH， DE;第 1365185號）及 0.15 mU U 0-醣苷酶（Roche Diagnostics GmbH，DE ;第1347101號）一起培養17小時。離心後用 SDS-PAGE分析樣品。 SDS-PAGE分析（圖12)顯示IL-1R(泳道1)之分子量在其與 N-醣苷酶F(泳道3)—起培養後降低約9 kDa，而在其與神經 胺酸酶（泳道2)及0-醣苷酶（泳道4)一起培養後分子量無明 顯變化。N-醣苷酶F及神經胺酸酶之組合物（泳道5)、N-醣 苷酶F及0-醣苷酶之組合物（泳道6)或所有三種物質之組合 物（泳道8)未導致任何進一步之碳水化合物側鏈之切割。神 經胺酸酶及0-醣苷酶之組合物不會移除任何碳水化合物側 鏈（泳道7)。 數據顯示IL-1R係在一或多個潛在N-醣基化作用位點經 醣基化，而且與N-連接的醣基化可藉由與N-醣苷酶F—起培 養後完全移除。未檢測到與〇-連接的醣基化作用。 2D8抗體之西方墨潰法結果示於圖13(泳道如圖12所示）。 實例8 測定抗原決定部位 藉由墨潰法及肽掃描分析測定抗原分子上之抗體結合區 (抗原決定部位）。 以墨潰分析而言，天然或變性之重組、可溶性人類 IL-lR(recombinant，soluble human IL-1R ; rshIL_lR)樣品直 接沾點在膜上，與抗-hIL-lR抗體一起培養，並藉由化學螢 光檢測用抗-FC γ-POD抗體檢測之。另外，rshIL-lR用N-醣 95715.doc -33 - 1295672 芽進行去醣基化’且以還原變性條件下之sdS_page將 醣基化及去醣基化rshIL-lR分離。將蛋白質沾點於pVDF膜 上，與抗-hIL-lR抗體一起培養，並藉由化學螢光檢測以抗 -FC7-P〇D抗體檢測之。 墨點墨潰分析法顯示根據本發明抗體在天然及變性條件 下可專一性地鍵結至rshIL-1R上。最終，西方墨潰分析顯示 根據本發明抗體僅能識別醣基化rshIL 1 r(天然或經變性）。 去醣基化hIL 1R不能以西方墨潰分析法偵測到。其他醣基化 蛋白質（例如，紅細胞生成素、羧肽酶γ)不會被根據本發明 抗體識別，因此醣基化rshIL-1R之識別具有高度專一性。 另外，合成可代表rshILlR之額外細胞結構域之經生物素 化肽（20個胺基酸），以作為抗_IL_丨R/rshIL_丨R肽掃描分析之 用。該等肽重疊10個胺基酸，且其含有一惰性冰端生物素 化的間隔子。經生物素化肽可偶聯至塗布鏈黴抗生物素之 <放里滴疋盤上，將其與抗-hIL 1R抗體一起培養，並用抗 抗體偵測之。經鍵結之肽即代表IL-1R之被識別序列抗原決 定部位。 實例9 2D8及DEI5/8於IL-1R拮抗劑存在下與1[_1尺之鍵結 使用Biacore(生物感測器）3000系統，以表面電漿共振分 析抗-IL_1R抗體與lL_1R之蛋白-蛋白相互作用。持續兩分鐘 灌注來測定結合速率；以持續三分鐘之洗滌步驟量測解離 速率。原始曲線中減去陰性對照之數據，以修正系統内部 基線漂移及降低干擾信號。在該研究中使用兩種將抗體及 95715.doc -34- 1295672 IL-1R固定至晶片表面之分析格式。 . a) 藉由胺偶聯作用，將抗-IL_1R抗體2D8以共價鍵結方式 固定在晶片表面（CM5)。在質量傳遞條件下，注射濃度為ι〇 nM之IL-1R，以測定用於抑制研究中之參照值之最大信 號。將IL-1R事先與濃度漸增（〇.78_1〇〇 nM)2iL_iR拮抗 劑、IL-1 /5或DEI5/8培養（在HBS_p緩衝液中於室溫下至少培 養20分鐘）可測定IL_1R(1〇 nM)之鍵結抑制作用。隨後，將 樣品注射至流動池中，並測定其與經固定之2D8抗體間之相 互作用。 b) 藉由胺偶聯，將IL_1/5以共價鍵結方式固定在晶片表面 (CM5)。在質量傳遞條件下，注射濃度為1〇 nM之il_ir，以 測定作為參照值之最大信號。將乩“尺事先與濃度漸增 (0·78·100 nM)之 IL_1R拮抗劑、rhIL-li3 或 DEI5/8培養可測定 rshIL-lR(l〇 nM)之鍵結抑制作用。隨後，將樣品注射至流 動池中，並測定其與經固定2rhIL-ljS間之相互作用。 在第一次分析中，濃度為100μm之IL-1R拮抗劑顯示沒有 IL-1R鍵結抑制作用。iL_ljS顯示濃度8 nM時具有一半最大 抑制作用（IC50)，DEI5/8顯示濃度2 nM時具有一半最大抑 制作用。在第二次分析中，IL—1R拮抗劑所顯示之抑制活性 (IC50)為 4 nM，DEI5/8為 2 nM，而 2D8為 2 nM。 因為IL-1R拮抗劑在濃度高達100 時仍不會抑制IL_1R 與2D8之鍵結，則可推斷2D8與IL-1R拮抗劑不是以競爭方 式鍵結至IL-1R上。2D8—旦與IL-1R鍵結可立即誘導化心化 之構象改變，該IL-1R之構象改變不再允許IL_1Iut抗劑鍵 95715.doc -35- 1295672 結至受體上。2D8及DEI5/8相對IL-1R拮抗劑在鍵結至受體 上方面具有異位性抑制作用（alioteric inhibition)。IL-1/3會 抑制IL-1R鍵結至2D8上，此表示IL-1/3與2D8會競爭鍵結至 IL-1R。 【圖式簡單說明】 圖1針對2D8抗體之ELISA鍵結分析 圖2測定2D8抗體與IL-1R之親和力 圖3 2D8抗體與配位體IL-1鍵結至IL-1R之競爭性 圖4 2D8抗體抑制三元複合物構築體hIL-l/hIL-lR/

hIL-lR AcP 上線：hIL-1/hIL-lR 鍵結至 hIL_lRAcp 下線：加入抗體2 D 8

圖5抑制MRC5細胞中經IL-1介導的IL-8之産生 圖6抑制人類血液中經IL -1介導的IL _ 8之產生 圖7缺失T細胞抗原決定部位之重鏈可變區之胺基酸序列 圖8缺失T細胞抗原決定部位之輕鏈可變區之胺基酸序列 圖9人源化重鏈可變區之胺基酸序列 圖10人源化輕鏈可變區之胺基酸序列 圖11 IL-1R之胺基酸序列 粗體字N :潛在之醣基化位點 圖12醣基化IL-1R及經醣苷酶處理後之SDS PAGE分析 圖13西方墨潰分析，與醣基化及去醣基化IL-1R鍵結之 2D8 圖14輕鍵之不變區 95715.doc -36- 1295672 圖15重鏈之不變區（IgG4) 圖16重鏈之不變區（IgGl) 圖17 DEI 5/8之完整序列 序列說明 SEQ ID NO:l 大鼠2D8之重鏈可變區；大鼠來源之aa 1-19信號序列、20-134可變區、135-139 終止片段 SEQ ID NO:2 大鼠2D8之輕鏈可變區；大鼠來源之aa 1-20信號序列、21-129可變區、130-138 終止片段 SEQ ID NO:3 2D8嵌合Η鏈（大鼠/人類）（IgGl)之胺基酸 序列 SEQ ID NO:4 2D8嵌合Η鏈（大鼠/人類）（IgG4)之胺基酸 序列 SEQ ID NO:5 2D8嵌合L鏈（大鼠/人類）之胺基酸序列 參考文獻表

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Claims (1)

1. 外年月+曰修(勤正本 ?Sl27418號專利申請案 文申請專利範圍替換本(96年10月） 十、申請專利範圍： 1· 一種抗體，其可鍵結至人類IL-1R並抑制人類IL-1鍵結至 IL_1R，其特徵在於該抗體包含作爲CDRs之SEQ ID ΝΟ:1 之可變重鏈區 CDRl(aa 45-54)、CDR2(aa 69-84)及 CDR3(aa 117-123)及 SEQ ID NO:2 之可變輕鏈區 CDRl(aa 43-57)、CDR2(aa 73-79)及 CDR3(aa 112-120)，或為該抗 體之嵌合、人源化或缺失T細胞抗原決定部位之抗體變體 或為該抗體之片段，其對抑制人類纖維母細胞 MRC5(ATCC CCL 171)中經 IL-1 介導之 IL-8 分泌之 IC50 值 為35 pM或更低。 2·如請求項1之抗體，其特徵在於該抗體包含SEQ ID ΝΟ:1 之可變區（VH)及SEQ ID NO:2之可變區（VL)。 3. 如請求項1或2之抗體，其特徵在於該抗體係IgG4同型物 或IgGl同型物，其改變在CH1與CH2之間aa 220-240處之 絞鏈區及/或在CH2與CH3之間aa 330處之第二間域區（按 照Kabat的編號）。 4. 如請求項1之抗體，其特徵在於該抗體顯示選自SEQ ID NOs:6-27及29-31之可變區及不變區。 5. 如請求項卜2及4中任一項之抗體，其特徵在於親和力（KD) 約300 pM或低於該數值。 6. 如請求項1、2及4中任一項之抗體，其特徵在於該抗體係 鼠源。 7. —種如請求項1、2及4中任一項抗體之用途，其係用於製 備一用於治療炎症性疾病之醫藥組合物。 95715-961004.doc 1295672 8. —種製備治療炎症性疾病之醫藥組合物之方法，其係使用 醫藥有效量之如請求項1、2及4中任一項之抗體。 9· 一種核酸’其可編碼一能與下列定義之各別其他抗體鏈組 合在一起之多肽，而該多肽係： a) 一抗體重鏈’其包含作爲CDRs之SEQ ID NO: 1之 CDR1(aa 45-54)、CDR2(aa 69-84)及 CDR3(aa 117-123)，或 b) 一抗體輕鏈，其包含作爲CDRs之SEQ ID Ν0··2之 CDRl(aa 43_57)、CDR2(aa 73-79)及 CDR3(aa 112-120)。 1〇· —種包含一如請求項9之核酸之表達載體，其能在一原核 或真核宿主細胞中表達該核酸。 11 · 一種原核或真核宿主細胞，其包含如請求項丨〇之載體。 12· 一種用於製備一可鍵結至IL-1R及可抑制IL-1鍵結至 之夕肤之方法’其特徵在於··在一原核或真核宿主 細胞中表達如請求項9之可編碼重鏈之核酸及可編碼輕鏈 之核酸並可自該細胞中回收該多肽。 13· —種用於治療一需要消炎治療之患者之醫藥組合物，其包 含一醫藥有效量之如請求項丨、2及4中任一項之抗體。 14· 一種用於製備如請求項丨、2及4中任一項之抗體之方法， 其特徵在於：在具有如SEQ ID N〇:1&SEQ m N〇:2之抗 體2D8之可變區之序列中，在圖7-10中SEQ ID N〇s:6_27 所示框内各別胺基酸處經突變、刪除或增加一或多個胺基 酸；製備一含有可編碼一連貫順讀架構之該經修飾抗體可 變區及如SEQ ID N〇s:29_31所示之額外人類不變區之核 95715-961004.doc 1295672 酸之表現載體；在一宿主細胞中進行表現；及將重組方式 製備之抗體輕鏈及重鏈一起組合成如請求項1、2及4中任 一項之抗體。 95715-961004.doc