TWI867066B - 靶向flt3之抗體及其用途 - Google Patents

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TWI867066B TW109135527A TW109135527A TWI867066B TW I867066 B TWI867066 B TW I867066B TW 109135527 A TW109135527 A TW 109135527A TW 109135527 A TW109135527 A TW 109135527A TW I867066 B TWI867066 B TW I867066B
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Abstract

本文揭示具有抗體重鏈及輕鏈可變結構域之蛋白質，該等可變結構域可配對以形成靶向細胞上的FLT3之抗原結合位點；包含此等蛋白質之醫藥組合物；及使用此等蛋白質及醫藥組合物之治療方法，包括用於治療癌症。

Description

靶向FLT3之抗體及其用途
本發明提供具有抗體重鏈及輕鏈可變結構域之蛋白質，該等可變結構域可配對以形成靶向細胞上的FLT3之抗原結合位點；包含此等蛋白質之醫藥組合物；及使用此等蛋白質及醫藥組合物之治療方法，包括用於治療癌症。
儘管文獻中已報導大量的用於治療癌症之研究成果和科學進展，但此疾病仍係重大的健康問題。在成人中最常診斷出之一些癌症包括前列腺癌、乳癌及肺癌。血液惡性病雖然不如實體癌症常見，但其存活率較低。目前對該等癌症之治療選擇並非對所有患者均有效且/或可具有顯著不良副作用。使用現有治療選擇治療其他類型之癌症亦仍具有挑戰性。
Fms相關之酪胺酸激酶3 (FLT3)亦稱為FLK2、STK1或CD135，其係III類受體酪胺酸激酶。FLT3係跨膜蛋白質，其在細胞外區中包括5個免疫球蛋白樣結構域。FLT3可藉由結合FLT3LG而活化，其誘導FLT3同二聚化及自磷酸化。經活化之FLT3隨後使諸如Akt、Erk及mTOR等多種細胞質效應分子磷酸化並活化，藉此促進細胞增殖且減少細胞凋亡。已在急性骨髓性白血病及急性淋巴母細胞性白血病中觀察到導致FLT3之組成型活化之突變。
儘管結合FLT3之抗體正在開發中，但該領域中仍需要新的及可用的用於FLT3相關癌症之治療。
本發明提供結合人類FLT3且視情況結合食蟹猴FLT3之抗原結合位點。該等抗原結合位點結合FLT3之細胞外結構域中之各種抗原決定基，且其中一些不與FLT3配位體(FLT3L)競爭此結合。與此項技術中之一或多種已知抗FLT3抗體所靶向之抗原決定基相比，本文所揭示之一些抗原結合位點結合獨特的抗原決定基。含有此等抗原結合位點之蛋白質及蛋白質偶聯物如抗體、抗體-藥物偶聯物、雙特異性T細胞銜接體(BiTE)及免疫細胞介素以及表現含有此一抗原結合位點之蛋白質(例如嵌合抗原受體(CAR))之免疫效應細胞(例如T細胞)可用於治療FLT3相關之疾病，諸如癌症。
因此，在一態樣中，本發明提供結合FLT3之抗原結合位點，其包含： (a) 重鏈可變結構域(VH)，其包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及55之胺基酸序列之互補決定區1 (CDR1)、互補決定區2 (CDR2)及互補決定區3 (CDR3)；及 (b) 輕鏈可變結構域(VL)，其包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在某些實施例中，該VH之CDR3包含SEQ ID NO:5之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH之CDR3包含SEQ ID NO:50之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含與SEQ ID NO:37至少90%一致之胺基酸序列，且該VL包含與SEQ ID NO:38至少90%一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含SEQ ID NO:53之胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO:42之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 9及10；13及10；17及10；9及22；9及26；9及30；9及34；37及38；41及42；45及42；或49及42之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供結合FLT3之抗原結合位點，其包含： (a) VH，其包含有分別包含SEQ ID NO: 59、63及54之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及 (b) VL，其包含有分別包含SEQ ID NO: 86、66及67之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在某些實施例中，該VH分別包含SEQ ID NO: 78、63、79之CDR1、CDR2及CDR3，且該VL分別包含SEQ ID NO: 80、66、67之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VH分別包含SEQ ID NO: 62、63、64之CDR1、CDR2及CDR3，且該VL分別包含SEQ ID NO: 65、66、67之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VH包含與SEQ ID NO:76至少90%一致之胺基酸序列，且該VL包含與SEQ ID NO:77至少90%一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含SEQ ID NO:29之胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO:84之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH及該VL分別包含SEQ ID NO: 68及69；72及73；或76及77之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供結合FLT3之抗原結合位點，其包含： (a) VH，其包含有分別包含SEQ ID NO: 87、88及89之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及 (b) VL，其包含有分別包含SEQ ID NO: 91、92及93之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在另一態樣中，本發明提供結合FLT3之抗原結合位點，其包含： (a) VH，其包含有分別包含SEQ ID NO: 97、99及100之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及 (b) VL，其包含有分別包含SEQ ID NO: 101、102及103之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在另一態樣中，本發明提供結合FLT3之抗原結合位點，其包含： (a) VH，其包含有分別包含SEQ ID NO: 87、98及89之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及 (b) VL，其包含有分別包含SEQ ID NO: 106、92及93之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在另一態樣中，本發明提供結合FLT3之抗原結合位點，其包含： (a) VH，其包含有分別包含SEQ ID NO: 109、110及111之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及 (b) VL，其包含有分別包含SEQ ID NO: 112、113及114之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在另一態樣中，本發明提供結合FLT3之抗原結合位點，其包含： (a) VH，其包含有分別包含SEQ ID NO: 117、118及119之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及 (b) VL，其包含有分別包含SEQ ID NO: 120、121及122之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在另一態樣中，本發明提供結合FLT3之抗原結合位點，其包含： (a) VH，其包含有分別包含SEQ ID NO: 87、98及89之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及 (b) VL，其包含有分別包含SEQ ID NO: 106、92及93之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在另一態樣中，本發明提供結合FLT3之抗原結合位點，其包含： (a) VH，其包含有分別包含SEQ ID NO: 62、33及127之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及 (b) VL，其包含有分別包含SEQ ID NO: 128、129及130之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在另一態樣中，本發明提供結合FLT3之抗原結合位點，其包含： (a) VH，其包含有分別包含SEQ ID NO: 132、133及134之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及 (b) VL，其包含有分別包含SEQ ID NO: 65、66及46之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在另一態樣中，本發明提供與上文所揭示之抗原結合位點競爭之抗原結合位點。
在前述態樣之某些實施例中，如藉由表面電漿子共振(SPR)所量測，抗原結合位點以小於或等於20 nM之解離常數(KD )結合人類FLT3。在某些實施例中，如藉由SPR所量測，抗原結合位點以小於或等於10 nM之KD 結合人類FLT3。在某些實施例中，抗原結合位點結合包含SEQ ID NO:25之胺基酸序列之人類FLT3變異體。在某些實施例中，抗原結合位點結合包含SEQ ID NO:18之胺基酸序列之人類FLT3變異體。在某些實施例中，抗原結合位點結合食蟹猴FLT3。在某些實施例中，抗原結合位點不與FLT3L競爭結合FLT3。
在某些實施例中，抗原結合位點係以單鏈可變區片段(scFv)形式存在。在某些實施例中，該scFv包含選自SEQ ID NO: 3、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、70、71、74、75、81及82之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供包含本文所揭示之抗原結合位點之蛋白質。在某些實施例中，該蛋白質進一步包含抗體重鏈恆定區。在某些實施例中，抗體重鏈恆定區係人類IgG重鏈恆定區。在某些實施例中，抗體重鏈恆定區係人類IgG1重鏈恆定區。在某些實施例中，抗體重鏈恆定區之每一多肽鏈包含與SEQ ID NO:21至少90%一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，抗體重鏈恆定區之至少一條多肽鏈相對於SEQ ID NO:21在一或多個選自Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411及K439之位置處包含一或多個突變，該等位置係根據EU編號系統進行編號。在某些實施例中，抗體重鏈恆定區之至少一條多肽鏈相對於SEQ ID NO:21包含一或多個選自Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D及K439E之突變，該等突變係根據EU編號系統進行編號。在某些實施例中，抗體重鏈恆定區之一條多肽鏈相對於SEQ ID NO:21在一或多個選自Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411及K439之位置處包含一或多個突變；且抗體重鏈恆定區之另一條多肽鏈相對於SEQ ID NO:21在一或多個選自Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、D401、F405、Y407、K409、T411及K439之位置處包含一或多個突變，該等位置係根據EU編號系統進行編號。在某些實施例中，抗體重鏈恆定區之一條多肽鏈相對於SEQ ID NO:21包含K360E及K409W取代；且抗體重鏈恆定區之另一條多肽鏈相對於SEQ ID NO:21包含Q347R、D399V及F405T取代，該等取代係根據EU編號系統進行編號。在某些實施例中，抗體重鏈恆定區之一條多肽鏈相對於SEQ ID NO:21包含Y349C取代；且抗體重鏈恆定區之另一條多肽鏈相對於SEQ ID NO:21包含S354C取代，該等取代係根據EU編號系統進行編號。
在另一態樣中，本發明提供抗體-藥物偶聯物，其包含本文所揭示之蛋白質及藥物部分。在某些實施例中，藥物部分係選自由以下組成之群：奧裡斯他汀(auristatin)、N-乙醯基-γ卡奇黴素(N-acetyl-γ calicheamicin)、類美登素(maytansinoid)、吡咯并苯并二氮呯及SN-38。
在另一態樣中，本發明提供免疫細胞介素，其包含本文所揭示之抗原結合位點及細胞介素。在某些實施例中，細胞介素係選自由以下組成之群：IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、TNF及IFNα。
在另一態樣中，本發明提供雙特異性T細胞銜接體，其包含本文所揭示之抗原結合位點及結合CD3之抗原結合位點。
在另一態樣中，本發明提供嵌合抗原受體(CAR)，其包含： (a) 本文所揭示之抗原結合位點； (b) 跨膜結構域；及 (c) 細胞內信號傳導結構域。
在某些實施例中，跨膜結構域係選自T細胞受體CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、FLT3、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152及CD154之α、β或ζ鏈之跨膜區。在某些實施例中，細胞內信號傳導結構域包含初級信號傳導結構域，該初級信號傳導結構域包含CD3 ζ、常見FcR γ (FCER1G)、Fc γ RIIa、FcR β (Fc ε R1b)、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD79a、CD79b、DAP10及DAP12之功能性信號傳導結構域。在某些實施例中，細胞內信號傳導結構域進一步包含共刺激信號傳導結構域，該共刺激信號傳導結構域包含共刺激受體之功能性信號傳導結構域。在某些實施例中，共刺激受體係選自由以下組成之群：OX40、CD27、CD28、CD30、CD40、PD-1、CD2、CD7、CD258、NKG2C、B7-H3、結合至CD83之配位體、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、ICOS及4-1BB (CD137)或其任一組合。
在另一態樣中，本發明提供編碼本文所揭示之CAR之經分離核酸。
在另一態樣中，本發明提供包含本文所揭示之經分離核酸之表現載體。
在另一態樣中，本發明提供包含本文所揭示之核酸或表現載體之免疫效應細胞。
在另一態樣中，本發明提供表現本文所揭示之CAR之免疫效應細胞。在某些實施例中，免疫效應細胞係T細胞。在某些實施例中，T細胞係CD8+ T細胞、CD4+ T細胞或NKT細胞。在某些實施例中，免疫效應細胞係NK細胞。
在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含本文所揭示之蛋白質、抗體-藥物偶聯物、免疫細胞介素、雙特異性T細胞銜接體或免疫效應細胞；及醫藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中，本發明提供治療癌症之方法，該方法包括向有需要之個體投與有效量之本文所揭示之蛋白質、抗體-藥物偶聯物、免疫細胞介素、雙特異性T細胞銜接體、免疫效應細胞或醫藥組合物。
在某些實施例中，癌症係血液惡性病。在某些實施例中，血液惡性病係白血病。在某些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、骨髓發育不良、急性T淋巴母細胞性白血病及急性前骨髓細胞性白血病。在某些實施例中，癌症表現FLT3。
本發明之該等及其他態樣及優點由以下各圖、詳細說明及申請專利範圍來闡明。
本申請案主張於2019年10月15日提出申請之美國臨時申請案第62/915,120號之優先權，該臨時申請案之全部內容係以引用的方式併入本文中。 序列表
本申請案以全文引用的方式併入呈ASCII文本格式之序列表之電腦可讀形式(CRF)。該序列表文本檔案之標題為「14247-473-888_SEQ_LISTING」，其於2020年10月5日創建且大小為152,327個位元組。
本發明提供結合人類FLT3且視情況結合食蟹猴FLT3之抗原結合位點。該等抗原結合位點結合FLT3細胞外結構域中之各種抗原決定基，且該等抗原結合位點中有一些不與FLT3配位體(FLT3L)競爭此結合。含有此等抗原結合位點之蛋白質及蛋白質偶聯物如抗體、抗體-藥物偶聯物、雙特異性T細胞銜接體(BiTE)及免疫細胞介素以及表現含有此一抗原結合位點之蛋白質(例如嵌合抗原受體(CAR))之免疫效應細胞(例如T細胞)可用於治療FLT3相關之疾病，諸如癌症。
本發明提供結合癌細胞上之FLT3之抗原結合蛋白及包含此等蛋白質之醫藥組合物以及使用此等蛋白質及醫藥組合物之治療方法，包括用於治療癌症。下文部分中陳述本發明之各個態樣；然而，不應將在一個特定部分中所闡述的本發明之態樣限於任何特定部分。
為有助於理解本發明，下文定義多條術語及片語。
如本文所用之術語「一(a及an)」意指「一或多種」，且除非上下文不合適，否則包括複數。
如本文所用，術語「抗原結合位點」係指免疫球蛋白分子中參與抗原結合之部分。在人類抗體中，抗原結合位點係由重(「H」)及輕(「L」)鏈之N末端可變(「V」)區之胺基酸殘基形成。重鏈及輕鏈之V區內的三個高度趨異區段(stretch)稱為「超變區」，其插入在稱為「框架區」或「FR」之更保守的側翼區段之間。因此，術語「FR」係指天然存在於免疫球蛋白中之超變區之間及其附近之胺基酸序列。在人類抗體分子中，輕鏈之三個超變區及重鏈之三個超變區相對於彼此佈置於三維空間中以形成抗原結合表面。抗原結合表面與所結合抗原之三維表面互補，且重鏈及輕鏈中之每一者之三個超變區稱為「互補決定區」或「CDR」。在某些動物(諸如駱駝及軟骨魚類)中，抗原結合位點係由提供「單一結構域抗體」之單一抗體鏈形成。抗原結合位點可存在於完整抗體中、存在於抗體中保留抗原結合表面之抗原結合片段中或存在於使用肽連接體將重鏈可變結構域連結至單一多肽中之輕鏈可變結構域之重組多肽(諸如scFv)中。本文所揭示之重鏈或輕鏈可變區中之所有胺基酸位置均係根據Kabat編號進行編號。
抗原結合位點之CDR可藉由Kabat等人，J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977)及Kabat等人，Sequences of protein of immunological interest. (1991)、Chothia等人，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)及MacCallum等人，J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)中所闡述之方法來確定。根據該等定義確定之CDR在彼此進行比較時通常包括重疊胺基酸殘基或胺基酸殘基之子集。在某些實施例中，術語「CDR」係如由MacCallum等人，J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)及Martin A., Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains, Antibody Engineering，Kontermann及Dubel編輯，第31章，第422-439頁，Springer-Verlag, Berlin (2001)所定義之CDR。在某些實施例中，術語「CDR」係如由Kabat等人，J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977)及Kabat等人，Sequences of protein of immunological interest. (1991)所定義之CDR。在某些實施例中，使用不同慣例定義抗體之重鏈CDR及輕鏈CDR。舉例而言，在某些實施例中，重鏈CDR係根據MacCallum (上文文獻)來定義，且輕鏈CDR係根據Kabat (上文文獻)來定義。CDRH1、CDRH2及CDRH3表示重鏈CDR，且CDRL1、CDRL2及CDRL3表示輕鏈CDR。
如本文所用，術語「個體」及「患者」係指欲藉由本文所闡述之方法及組合物進行治療之生物體。此等生物體較佳包括(但不限於)哺乳動物(例如鼠類、猿猴、馬、牛、豬、犬、貓及諸如此類)，且更佳包括人類。
如本文所用，術語「有效量」係指化合物(例如本發明之化合物)足以產生有益或期望結果之量。有效量可以一或多次投與、施加或劑量來投與，且不意欲限於特定調配物或投與途徑。如本文所用，術語「治療」包括任何效應，例如減輕、減少、調節、改善或消除，其使得疾患、疾病、病症及諸如此類得以改良或其症狀得以改善。
如本文所用，術語「醫藥組合物」係指活性劑與惰性或活性載劑之組合，其使得組合物尤其適於活體內或離體之診斷或治療用途。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」係指任何標準醫藥載劑，諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)及各種類型之潤濕劑。組合物亦可包括穩定劑及防腐劑。關於載劑、穩定劑及佐劑之實例，參見(例如) Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences，第15版，Mack Publ. Co., Easton, PA [1975]。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受之鹽」係指本發明化合物之任何醫藥學上可接受之鹽(例如酸或鹼)，其在投與給個體後能夠提供本發明之化合物或其活性代謝物或殘餘物。如熟習此項技術者所已知，本發明化合物之「鹽」可源自無機或有機酸及鹼。例示性酸包括(但不限於)鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、過氯酸、富馬酸、馬來酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、柳酸、琥珀酸、甲苯對磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸及諸如此類。其他酸(諸如草酸)雖然自身不係醫藥學上可接受的，但可用於製備可用作獲得本發明化合物及其醫藥學上可接受之酸加成鹽之中間體之鹽。
例示性鹼包括(但不限於)鹼金屬(例如鈉)氫氧化物、鹼土金屬(例如鎂)氫氧化物、氨及式NW4 + 化合物(其中W係C1-4 烷基)及諸如此類。
例示性鹽包括(但不限於)：乙酸鹽、己二酸鹽、海藻酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡萄糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚酸鹽(flucoheptanoate)、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、已酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽及諸如此類。鹽之其他實例包括本發明化合物之陰離子與諸如Na+ 、NH4 + 及NW4 + (其中W係C1-4 烷基)及諸如此類等適宜陽離子之複合物。
對於治療用途，經審慎考慮，本發明化合物之鹽係醫藥學上可接受的。然而，非醫藥學上可接受之酸及鹼之鹽亦可用於(例如)醫藥學上可接受之化合物之製備或純化中。
如本文所用，「FLT3」(亦稱為FLK2、STK1或CD135)係指Uniprot登錄號P36888之蛋白質及相關同種型。
如本文所用，「FLT3L」(亦稱為FLT3配位體)係指Uniprot登錄號P49771之蛋白質及相關同種型。
在整個本說明書中，倘若將組合物闡述為具有、包括或包含特定組分或倘若將製程及方法闡述為具有、包括或包含特定步驟，則經審慎考慮，另外存在基本上由所列舉之組分組成或由其組成的本發明組合物且存在基本上由所列舉之處理步驟組成或由其組成的本發明製程及方法。
一般而言，除非另外規定，否則指定百分比之組合物係以重量計。此外，若變數不伴有定義，則以該變數之先前定義為準。
下文更詳細地論述本發明之各個特徵及態樣。I. 抗原結合位點
在一態樣中，本發明提供結合人類FLT3之抗原結合位點。例示性抗原結合位點之VH、VL、CDR及scFv序列列示於表1中。根據Chothia編號方案鑑別CDR序列。 表1：結合FLT3之例示性抗原結合位點之序列
純系 VH VL
12H10.G7 EVQLQESGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTRYVMHWVKQRPGQGLEWIGFINPYNDDTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTLTVSS [SEQ ID NO:1] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] NIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRSDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEEPWTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO:2] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB87/GB95 (VH及VL中之回復突變加下劃線) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITS DTSASTAYMELSSLRSEDTAVYH CARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:9] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPA SLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSR TDFTLTISSLQAEDA AT YYCQQNNEEPWTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:10] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]   
人類化12H10.G7 GB87/GB95之scFv GB87 (VH-VL)： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:3] GB95 (VL-VH)： DIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:12]
人類化12H10.G7 GB88/GB96 (VH及VL中之回復突變加下劃線) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYH CARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:13] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPA SLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSR TDFTLTISSLQAEDA AT YYCQQNNEEPWTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:10] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB88/GB96之scFv GB88 (VH-VL)： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:15] GB96 (VL-VH)： DIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:16]
人類化12H10.G7 GB89/GB97 (VH及VL中之回復突變加下劃線) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITS DTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:17] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPA SLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSR TDFTLTISSLQAEDA AT YYCQQNNEEPWTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:10] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB89/GB97之scFv GB89 (VH-VL)： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:19] GB97 (VL-VH)： DIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:20]
人類化12H10.G7 GB90/GB98 (VH及VL中之回復突變加下劃線) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITS DTSASTAYMELSSLRSEDTAVYH CARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:9] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSR TDFTLTISSLQAEDA AT YYCQQNNEEPWTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:22]    CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB90/GB98之scFv GB90 (VH-VL)： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:23] GB98 (VL-VH)： DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:24]
人類化12H10.G7 GB91/GB99 (VH及VL中之回復突變加下劃線) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITS DTSASTAYMELSSLRSEDTAVYH CARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:9] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPA SLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDA AT YYCQQNNEEPWTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:26]    CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB91/GB99之scFv GB91 (VH-VL)： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:27]    GB99 (VL-VH)： DIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDAATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:28]
人類化12H10.G7 GB92/GB100 (VH及VL中之回復突變加下劃線) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITS DTSASTAYMELSSLRSEDTAVYH CARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:9] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPA SLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSR TDFTLTISSLQAEDVAT YYCQQNNEEPWTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:30] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB92/GB100之scFv GB92 (VH-VL)： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDVATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:31] GB100 (VL-VH)： DIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDVATYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTV [SEQ ID NO:32]
人類化12H10.G7 GB93/GB101 (VH及VL中之回復突變加下劃線) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITS DTSASTAYMELSSLRSEDTAVYH CARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:9] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPA SLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSR TDFTLTISSLQAEDA AVYYCQQNNEEPWTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:34] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB93/GB101之scFv GB93 (VH-VL)： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDAAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:35] GB101 (VL-VH)： DIVMTQSPASLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSRTDFTLTISSLQAEDAAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITSDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYHCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:36]
人類化12H10.G7 GB94/GB102    QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:37] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:38] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB94/GB102之scFv GB94 (VH-VL)： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:39] GB102 (VL-VH)： DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:40]
人類化12H10.G7 GB102 D101E QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLESWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:41] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:42] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB102 D101E之scFv VH-VL：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLESWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:43] VL-VH： DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLESWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:44]
人類化12H10.G7 GB102 M34I QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVIHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:45] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:42] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB102 M34I之scFv VH-VL： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVIHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:47] VL-VH：DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVIHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:48]
人類化12H10.G7 GB102 M34I/D101E QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVIHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLESWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:49] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLES [SEQ ID NO:50] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:42] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7 GB102 M34I/D101E之scFv VH-VL： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVIHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLESWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:51] VL-VH：DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVIHWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLESWGQGTTVTVSS [SEQ ID NO:52]
人類化12H10.G7一致1 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVX1 HWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLX2 SWGQGTTVTVSS 其中X1 係M或I，且X2 係E或D [SEQ ID NO:53] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLXS，其中X係E或D [SEQ ID NO:55] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:42] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]   
人類化12H10.G7一致2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVMHWVRQAPGQRLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITX1 DTSASTAYMELSSLRSEDTAVYX2 CARWRQLGSLDSWGQGTTVTVSS 其中X1 係S或R，且X2 係Y或H [SEQ ID NO:56] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLDS [SEQ ID NO:5] DIVMTQSPX1 SLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSX2 TDFTLTISSLQAEDX3 AX4 YYCQQNNEEPWTFGGGTKVEIK 其中X1 係A或D, X2 係R或G，且X3 係A或V，且X4 係T或V [SEQ ID NO:57] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
人類化12H10.G7一致3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYVX1 HWVRQAPGQCLEWMGFINPYNDDTKYNEKFKGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWRQLGSLX2 SWGQGTTVTVSS 其中X1 係M或I，且X2 係E或D [SEQ ID NO:58] CDR1：GYTFTRY [SEQ ID NO:11] CDR2：NPYNDD [SEQ ID NO:4] CDR3：WRQLGSLXS，其中X係E或D [SEQ ID NO:55] DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVDTYGSSFVHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEEPWTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:42] CDR1：RASESVDTYGSSFVH [SEQ ID NO:6] CDR2：LASNLES [SEQ ID NO:7] CDR3：QQNNEEPWT [SEQ ID NO:8]
14A5.E8 EVQLQESGAELVQPGASVRLSCKASGYTFTSYWINWVKQRPGQGLEWIGNIYPGSSIINYNENFKNRATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYYCARRVVYLYFDYWGQGTTLTVSS [SEQ ID NO:60] CDR1：GYTFTSY [SEQ ID NO:62] CDR2：YPGSSI [SEQ ID NO:63] CDR3：RVVYLYFDY [SEQ ID NO:64] QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWTSKSPTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO:61] CDR1：SASSSVSYMH [SEQ ID NO:65] CDR2：DTSKLAS [SEQ ID NO:66] CDR3：QQWTSKSPT [SEQ ID NO:67]
人類化14A5.E8 1551/1552 (VH及VL中之回復突變加下劃線) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFTSYWINWVRQR PGKGLEWMGNIYPGSSIINYNENFKNRVTMTV DTSS DTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRVVYLYFDYWGQGTLVTVSS [SEQ ID NO:68] CDR1：GYTFTSY [SEQ ID NO:62] CDR2：YPGSSI [SEQ ID NO:63] CDR3：RVVYLYFDY [SEQ ID NO:64] EIVLTQSPATLSLSPGEK ATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTS FTLTISSLEPEDA AVYYCQQWTSKSPTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:69] CDR1：SASSSVSYMH [SEQ ID NO:65] CDR2：DTSKLAS [SEQ ID NO:66] CDR3：QQWTSKSPT [SEQ ID NO:67]
人類化14A5.E8 1551/1552之scFv 1551 (VH-VL)： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFTSYWINWVRQRPGKCLEWMGNIYPGSSIINYNENFKNRVTMTVDTSSDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRVVYLYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGEKATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTSFTLTISSLEPEDAAVYYCQQWTSKSPTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:70] 1552 (VL-VH)： EIVLTQSPATLSLSPGEKATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTSFTLTISSLEPEDAAVYYCQQWTSKSPTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFTSYWINWVRQRPGKCLEWMGNIYPGSSIINYNENFKNRVTMTVDTSSDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRVVYLYFDYWGQGTLVTVSS [SEQ ID NO:71]
人類化14A5.E8 1553/1554 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFTSYWINWVRQAPGKGLEWMGNIYPGSSIINYNENFKNRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRVVYLYFDYWGQGTLVTVSS [SEQ ID NO:72] CDR1：GYTFTSY [SEQ ID NO:62] CDR2：YPGSSI [SEQ ID NO:63] CDR3：RVVYLYFDY [SEQ ID NO:64] EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWTSKSPTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:73] CDR1：SASSSVSYMH [SEQ ID NO:65] CDR2：DTSKLAS [SEQ ID NO:66] CDR3：QQWTSKSPT [SEQ ID NO:67]
人類化14A5.E8 1553/1554之scFv 1553 (VH-VL)： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFTSYWINWVRQAPGKCLEWMGNIYPGSSIINYNENFKNRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRVVYLYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWTSKSPTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:74]    1554 (VL-VH)： EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWTSKSPTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFTSYWINWVRQAPGKCLEWMGNIYPGSSIINYNENFKNRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRVVYLYFDYWGQGTLVTVSS [SEQ ID NO:75]
人類化14A5.E8 1689 (自1553親和力成熟) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFPYYWINWVRQAPGKGLEWMGNIYPGSSIINYNENFKNRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRNVYLTFDYWGQGTLVTVSS [SEQ ID NO:76] CDR1：GYTFPYY [SEQ ID NO:78] CDR2：YPGSSI [SEQ ID NO:63] CDR3：RNVYLTFDY [SEQ ID NO:79] EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYIHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWTSKSPTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:77] CDR1：SASSSVSYIH [SEQ ID NO:80] CDR2：DTSKLAS [SEQ ID NO:66] CDR3：QQWTSKSPT [SEQ ID NO:67]
人類化14A5.E8 1689 (自1553親和力成熟)之scFv VH-VL： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFPYYWINWVRQAPGKCLEWMGNIYPGSSIINYNENFKNRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRNVYLTFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYIHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWTSKSPTFGCGTKVEIK [SEQ ID NO:81] VL-VH： EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYIHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWTSKSPTFGCGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFPYYWINWVRQAPGKCLEWMGNIYPGSSIINYNENFKNRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRNVYLTFDYWGQGTLVTVSS [SEQ ID NO:82]
人類化14A5.E8一致 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFX1 X2 YWINWVRQX3 PGKX4 LEWMGNIYPGSSIINYNENFKNRVTMTX5 DTSX6 DTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRX7 VYLX8 FDYWGQGTLVTVSS 其中X1 係P或T，X2 係S或Y，X3 係A或R，X4 係C或G，X5 係V或E，X6 係S或T，X7 係N或V，且X8 係T或Y [SEQ ID NO:29] CDR1：GYTFX1 X2 Y，其中X1係P或T，且X2 係S或Y [SEQ ID NO:59] CDR2：YPGSSI [SEQ ID NO:63] CDR3：RX1 VYLX2 FDY，其中X1 係N或V，且X2 係T或Y [SEQ ID NO:54] EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSYXHWYQQKPGQAPRLLIYDTSKLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWTSKSPTFGGGTKVEIK 其中X係M或I [SEQ ID NO:84] CDR1：SASSSVSYXH，其中X係M或I [SEQ ID NO:86] CDR2：DTSKLAS [SEQ ID NO:66] CDR3：QQWTSKSPT [SEQ ID NO:67]
11F4.B9 EVQLQESGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYYIHWVKQGPEKSLEWIGEIIPSTGSTIYNQKFKAKATLTVDKSSSTAYLQLKSLTSEDSAVYYCERWGDYYGRDYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO:85] CDR1：GYSFTGY [SEQ ID NO:87] CDR2：IPSTGS [SEQ ID NO:88] CDR3：WGDYYGRDY [SEQ ID NO:89] DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDIYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDPRTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO:90] CDR1：RASESVDIYGNSFMH [SEQ ID NO:91] CDR2：RASNLES [SEQ ID NO:92] CDR3：QQSNEDPRT [SEQ ID NO:93]
人類化11F4.B9 (回復突變加下劃線) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYYIHWVRQG PGQGLEWMGEIIPSTGSTIYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCE RWGDYYGRDYWGQGTLVTVSS [SEQ ID NO:14] CDR1：GYSFTGY [SEQ ID NO:87] CDR2：IPSTGS [SEQ ID NO:88] CDR3：WGDYYGRDY [SEQ ID NO:89] DIVMTQSPA SLAVSLGERATINCRASESVDIYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGVPDRFSGSGSR TDFTLTIN SLQAEDVAT YYCQQSNEDPRTFGGGTKVEIK [SEQ ID NO:94] CDR1：RASESVDIYGNSFMH [SEQ ID NO:91] CDR2：RASNLES [SEQ ID NO:92] CDR3：QQSNEDPRT [SEQ ID NO:93]
4A4.A3 QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLTTYGMGVGWIRQPSGKGLEWLANIWFNDNKYYNSTLKSRLTISKDTSNNQVFLKISSVDTTDTATYYCAQITTVVGTFDYWGQGSPLTVSP [SEQ ID NO:95] CDR1：GFSLTTYGM [SEQ ID NO:97] CDR2：WFNDN [SEQ ID NO:99] CDR3：ITTVVGTFDY [SEQ ID NO:100] RIVMTQSPTTMAASPGEKITITCSASSSISSIYLHWYQQKPGFSPKLLIFRTSDLASGVPPRFGGSGSGTSYSLTIGTMEAEDVATYYCQQGSSFPRTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO:96] CDR1：SASSSISSIYLH [SEQ ID NO:101] CDR2：RTSDLAS [SEQ ID NO:102] CDR3：QQGSSFPRT [SEQ ID NO:103]
4A4.H7 EVQLQESGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYYIHWVKQSPEESLEWIGEIYPNTGITTYNQKFTAKATLTVDKSSNTAYMQLKSLTSEDSAVYYCTRWGDYYGRDYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO:104] CDR1：GYSFTGY [SEQ ID NO:87] CDR2：YPNTGI [SEQ ID NO:98] CDR3：WGDYYGRDY [SEQ ID NO:89] DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASETVDTHGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDPRTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO:105] CDR1：RASETVDTHGNSFMH [SEQ ID NO:106] CDR2：RASNLES [SEQ ID NO:92] CDR3：QQSNEDPRT [SEQ ID NO:93]
15A11.C8 EVQLQESGGGLVKTGGSRKLSCAASGFTFSDYGMHWVRHTPEKGLEWVVYISSGGNTIFYTDTVKGRFTISRDNAKNTLFLQMTSLRSEDTAVYFCVRQGYYYAMDYWGQGASVTVSS [SEQ ID NO:107] CDR1：GFTFSDY [SEQ ID NO:109] CDR2：SSGGNT [SEQ ID NO:110] CDR3：QGYYYAMDY [SEQ ID NO:111] DIQMTQTTSSLSASLGDRVTIRCRASQDITNYLNWYQQKPDGAVKLLISYTSILQSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQGDVATYFCQQGSSLPWTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO:108] CDR1：RASQDITNYLN [SEQ ID NO:112] CDR2：YTSILQS [SEQ ID NO:113] CDR3：QQGSSLPWT [SEQ ID NO:114]
12C9.E5 EVQLQESGAELVRPGASVKLSCKASGYIFTDYEIHWVKQTPVHGLEWIGAIDPETGITAYSQKFKGKATLTTDTSSSTAYMEFRSLTSEDSAVYYCTRGGLLYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO:115] CDR1：GYIFTDY [SEQ ID NO:117] CDR2：DPETGI [SEQ ID NO:118] CDR3：GGLLY [SEQ ID NO:119] DVVMTQTPLSLSVTIGQPASISCKSSQSLLYSDGETYLNWLQQRPGQSPKRLMYQVSKLDPGIPDRFSGSGSETDFTLKISRVEAEDLGIYYCLQGTFYPHTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO:116] CDR1：KSSQSLLYSDGETYLN [SEQ ID NO:120] CDR2：QVSKLDP [SEQ ID NO:121] CDR3：LQGTFYPHT [SEQ ID NO:122]
1A2.A3 EVQLQESGPELVKPGASVKISCKASGYSFTGYYIHWVKQSPEESLEWIGEIYPNTGITTYNQKFTAKATLTVDKSSNTAYMQLKSLTSEDSAVYYCTRWGDYYGRDYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO:123] CDR1：GYSFTGY [SEQ ID NO:87] CDR2：YPNTGI [SEQ ID NO:98] CDR3：WGDYYGRDY [SEQ ID NO:89] DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASETVDTHGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYYCQQSNEDPRTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO:124] CDR1：RASETVDTHGNSFMH [SEQ ID NO:106] CDR2：RASNLES [SEQ ID NO:92] CDR3：QQSNEDPRT [SEQ ID NO:93]
4H2.E3 EVQLQESGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYLMHWMKQKPGQGLEWIGYINPYSDGIKYNEKFRDKATLTSDKSSNTAYMELSSLTSEDSAVYYCAHSSGYVGYAMDYWGQGTSVTVSS [SEQ ID NO:125] CDR1：GYTFTSY [SEQ ID NO:62] CDR2：NPYSDG [SEQ ID NO:33] CDR3：SSGYVGYAMDY [SEQ ID NO:127] GIVMTQTTPSVPVTPGESVSISCRSSKSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTTFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIK [SEQ ID NO:126] CDR1：RSSKSLLHSNGNTYLY [SEQ ID NO:128] CDR2：RMSNLAS [SEQ ID NO:129] CDR3：MQHLEYPFT [SEQ ID NO:130]
14H8.E7 EVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTNYWINWLKQRPGQGLEWIGNIYPGSTIINYNEKFKNKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSDDSAVYYCARRVVYLYFDSWGQGTTLTVSS [SEQ ID NO:131] CDR1：GYTFTNY [SEQ ID NO:132] CDR2：YPGSTI [SEQ ID NO:133] CDR3：RVVYLYFDS [SEQ ID NO:134] QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIFDTSKLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTITNMETEDAATYYCQQWSSKSPTFGGGTKLEIK [SEQ ID NO:83] CDR1：SASSSVSYMH [SEQ ID NO:65] CDR2：DTSKLAS [SEQ ID NO:66] CDR3：QQWSSKSPT [SEQ ID NO:46]
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含抗體重鏈可變結構域(VH)，該VH包含與表1中所揭示抗體之VH至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及抗體輕鏈可變結構域(VL)，該VL包含與表1中所揭示之同一抗體之VL至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該抗原結合位點包含表1中所揭示抗體之VH及VL序列之重鏈CDR1、CDR2及CDR3及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3，其係根據Kabat (參見Kabat等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，NIH出版號91-3242，Bethesda)、Chothia (例如，參見Chothia C及Lesk A M, (1987)，J Mol Biol 196: 901-917)、MacCallum (參見MacCallum R M等人(1996) J Mol Biol 262: 732-745)或此項技術中已知之任何其他CDR確定方法確定。在某些實施例中，該抗原結合位點包含表1中所揭示抗體之重鏈CDR1、CDR2及CDR3及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與12H10.G7有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:1之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:2至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與GB87或GB95有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:10至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點係以scFv形式存在，其中該scFv包含與SEQ ID NO: 3或12至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與GB88或GB96有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:13之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:10至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點係以scFv形式存在，其中該scFv包含與SEQ ID NO: 15或16至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與GB89或GB97有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:17之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:10至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點係以scFv形式存在，其中該scFv包含與SEQ ID NO: 19或20至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與GB90及GB98有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:22至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點係以scFv形式存在，其中該scFv包含與SEQ ID NO: 23或24至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與GB91及GB99有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:26至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點係以scFv形式存在，其中該scFv包含與SEQ ID NO: 27或28至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與GB92或GB100有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:30至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點係以scFv形式存在，其中該scFv包含與SEQ ID NO: 31或32至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與GB93或GB101有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:34至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點係以scFv形式存在，其中該scFv包含與SEQ ID NO: 35或36至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與GB94或GB102有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:37之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:38至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點係以scFv形式存在，其中該scFv包含與SEQ ID NO: 39或40至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與GB102 D101E有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:41之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:42至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點係以scFv形式存在，其中該scFv包含與SEQ ID NO: 43或44至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與GB102 M34I有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:45之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:42至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點係以scFv形式存在，其中該scFv包含與SEQ ID NO: 47或48至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與GB102 M34I/D101E有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:49之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:42至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及50之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及50之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點係以scFv形式存在，其中該scFv包含與SEQ ID NO: 51或52至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與人類化12H10.G7有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:53之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:42至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及55之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及55之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與人類化12H10.G7有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:56之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:57至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與人類化12H10.G7有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:58之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:42至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及55之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 11、4及55之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與14A5.E8有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:60之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:61至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 62、63及64之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 65、66及67之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 62、63及64之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO:65、66及67之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與mAb 1551或1552有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:68之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:69至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 62、63及64之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 65、66及67之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 62、63及64之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO:65、66及67之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點係以scFv形式存在，其中該scFv包含與SEQ ID NO: 70或71至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與mAb 1553或1554有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:72之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:73至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 62、63及64之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 65、66及67之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 62、63及64之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO:65、66及67之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點係以scFv形式存在，其中該scFv包含與SEQ ID NO: 74或75至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與mAb 1689有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:76之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:77至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 78、63及79之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 80、66及67之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 78、63及79之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 80、66及67之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點係以scFv形式存在，其中該scFv包含與SEQ ID NO: 81或82至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與人類化14A5.E8有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:29之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:84至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 59、63及54之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 86、66及67之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 59、63及54之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 86、66及67之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與11F4.B9有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:85之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:90至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 87、88及89之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 91、92及93之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 87、88及89之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 91、92及93之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與人類化11F4.B9有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:14之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:94至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 87、88及89之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 91、92及93之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 87、88及89之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 91、92及93之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與4A4.A3有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:95之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:96至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 97、99及100之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 101、102及103之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 97、99及100之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 101、102及103之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與4A4.H7有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:104之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:105至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 87、98及89之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 106、92及93之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 87、98及89之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 106、92及93之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與15A11.C8有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:107之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:108至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 109、110及111之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 112、113及114之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 109、110及111之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 112、113及114之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與12C9.E5有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:115之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:116至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 117、118及119之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 120、121及122之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 117、118及119之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 120、121及122之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與1A2.A3有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:123之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:124至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 87、98、89之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 106、92、93之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 87、98、89之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 106、92、93之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與4H2.E3有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:125之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:126至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 62、33及127之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 128、129及130之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 62、33及127之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 128、129及130之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與14H8.E7有關。舉例而言，在某些實施例中，本發明之抗原結合位點包含VH，該VH包含與SEQ ID NO:131之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及VL，該VL包含與SEQ ID NO:83至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 132、133及134之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 65、66及46之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。在某些實施例中，該抗原結合位點包含(a) VH，該VH包含有分別包含SEQ ID NO: 132、133及134之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b) VL，該VL包含有分別包含SEQ ID NO: 65、66及46之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
在前述實施例中之每一者中，經審慎考慮，一起結合FLT3之VH及/或VL序列可在VH及/或VL之框架區中含有胺基酸改變(例如至少1、2、3、4、5或10個胺基酸取代、缺失或增加)，而不顯著地影響其結合至FLT3之能力。
在某些實施例中，如藉由表面電漿子共振(SPR) (例如使用下文實例1中所闡述之方法)或藉由生物層干涉術(BLI)所量測，本發明之抗原結合位點以1 nM或更低、5 nM或更低、或10 nM或更低、15 nM或更低或20 nM或更低之KD (亦即解離常數)結合FLT3 (例如人類FLT3)，及/或結合來自個體之體液、組織及/或細胞之FLT3。在某些實施例中，如藉由SPR (例如使用下文實例1中所闡述之方法)或藉由BLI所量測，前述經分離抗體中之任一者之Kd (亦即解離速率，亦稱為K解離 )等於或低於1 × 10-5 1/s、1 × 10-4 1/s、1 × 10-3 1/s、5 × 10-3 1/s、0.01 1/s、0.02 1/s或0.05 1/s。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點(例如與上文所揭示之12H10.G7、GB87、GB88、GB89、GB90、GB91、GB92、GB93、GB94、GB95、GB96、GB97、GB98、GB99、GB100、GB101、GB102、GB102 M34I、GB102 D101E、GB102 M34I/D101E或人類化12H10.G7有關之抗原結合位點)結合具有T227M突變之人類FLT3變異體或其細胞外區。hFLT3-T227M之細胞外區之胺基酸序列係NQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSESPEDLGCALRPQSSGTVYEAAAVEVDVSASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQPHFDLQNRGVVSMVILKMTETQAGEYLLFIQSEATNYTILFTVSIRNTLLYTLRRPYFRKMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHELFGMDIRCCARNELGRECTRLFTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELENKALEEGNYFEMSTYSTNRTMIRILFAFVSSVARNDTGYYTCSSSKHPSQSALVTIVEKGFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKFCNHKHQPGEYIFHAENDDAQFTKMFTLNIRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWTWKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFGQWVSSSTLNMSEAIKGFLVKCCAYNSLGTSCETILLNSPGPFPFIQDNIS (SEQ ID NO:25)。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點(例如與上文所揭示之12H10.G7、GB87、GB88、GB89、GB90、GB91、GB92、GB93、GB94、GB95、GB96、GB97、GB98、GB99、GB100、GB101、GB102、GB102 M34I、GB102 D101E、GB102 M34I/D101E或人類化12H10.G7有關之抗原結合位點)結合具有ITD突變之人類FLT3變異體或其細胞外區。hFLT3-ITD之細胞外區之胺基酸序列係NQDLPVIKCVLINHKNNDSSVGKSSSYPMVSESPEDLGCALRPQSSGTVYEAAAVEVDVSASITLQVLVDAPGNISCLWVFKHSSLNCQPHFDLQNRGVVSMVILKMTETQAGEYLLFIQSEATNYTILFTVSIRNTLLYTLRRPYFRKMENQDALVCISESVPEPIVEWVLCDSQGESCKEESPAVVKKEEKVLHELFGTDIRCCARNELGRECTRLFTIDLNQTPQTTLPQLFLKVGEPLWIRCKAVHVNHGFGLTWELENKALEEGNYFEMSTYSTNRTMIRILFAFVSSVARNDTGYYTCSSSKHPSQSALVTIVEKGFINATNSSEDYEIDQYEEFCFSVRFKAYPQIRCTWTFSRKSFPCEQKGLDNGYSISKFCNHKHQPGEYIFHAENDDAQFTKMFTLNIRRKPQVLAEASASQASCFSDGYPLPSWTWKKCSDKSPNCTEEITEGVWNRKANRKVFGQWVSSSTLNMSEAIKGFLVKCCAYNSLGTSCETILLNSPGPFPFIQDNIS (SEQ ID NO:18)。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點(例如與上文所揭示之12H10.G7、GB87、GB88、GB89、GB90、GB91、GB92、GB93、GB94、GB95、GB96、GB97、GB98、GB99、GB100、GB101、GB102、GB102 M34I、GB102 D101E、GB102 M34I/D101E、人類化12H10.G7、14A5.E8、1551、1552、1553、1554、1689、人類化14A5.E8、11F4.B9、4A4.A3、4A4.H7、15A11.C8、1A2.A3、4H2.E3或14H8.E7有關之抗原結合位點)結合食蟹猴FLT3。
在某些實施例中，本發明之抗原結合位點(例如與上文所揭示之12H10.G7、GB87、GB88、GB89、GB90、GB91、GB92、GB93、GB94、GB95、GB96、GB97、GB98、GB99、GB100、GB101、GB102、GB102 M34I、GB102 D101E、GB102 M34I/D101E、人類化12H10.G7、14A5.E8、1551、1552、1553、1554、1689、人類化14A5.E8、11F4.B9、4A4.A3、4A4.H7、12C9.E5、1A2.A3、4H2.E3或14H8.E7有關之抗原結合位點)不與FLT3L競爭結合FLT3。
在另一態樣中，本發明提供與上文所闡述之抗原結合位點競爭結合至FLT3 (例如人類FLT3、食蟹猴FLT3)之抗原結合位點。在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與上文所揭示之與1A2.A3有關之抗原結合位點競爭結合至FLT3。在一個實施例中，該抗原結合位點與1A2.A3競爭結合至FLT3。在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與上文所揭示之與4A4.A3有關之抗原結合位點競爭結合至FLT3。在一個實施例中，該抗原結合位點與4A4.A3競爭結合至FLT3。在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與上文所揭示之與4H2.E3有關之抗原結合位點競爭結合至FLT3。在一個實施例中，該抗原結合位點與4H2.E3競爭結合至FLT3。在某些實施例中，本發明之抗原結合位點與上文所揭示之與11F4.B9有關之抗原結合位點競爭結合至FLT3。在一個實施例中，該抗原結合位點與11F4.B9競爭結合至FLT3。 具有抗原結合位點之蛋白質
本文所揭示之抗原結合位點可存在於抗體或其抗原結合片段中。抗體可為單株抗體、嵌合抗體、雙價抗體、Fab片段、Fab’片段或F(ab’)2 片段、Fv、雙特異性抗體、雙特異性Fab2、雙特異性(mab)2、人類化抗體、人工產生之人類抗體、雙特異性T細胞銜接體、雙特異性NK細胞銜接體、單鏈抗體(例如單鏈Fv片段或scFv)、triomab、具有常見輕鏈之杵臼結構(kih) IgG、crossmab、正交Fab IgG、DVD-Ig、2合1-IgG、IgG-scFv、sdFv2-Fc、雙特異性奈米抗體(bi-nanobody)、tandAb、雙親和力重靶向抗體(DART)、DART-Fc、scFv-HSA-scFv (其中HSA =人類血清白蛋白)或對接及鎖定(dock-and-lock, DNL)-Fab3。
在某些實施例中，本文所揭示之抗原結合位點連接至與抗體恆定區(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD及IgE之重鏈恆定區；特定而言，選自例如IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之(例如人類)重鏈恆定區)至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在另一實施例中，本文所揭示之抗原結合位點可連接至選自例如κ或λ之(例如人類)輕鏈恆定區之輕鏈恆定區。恆定區可經改變(例如經突變)以修改抗體之性質(例如增加或減少以下中之一或多者：Fc受體結合、抗體糖基化、半胱胺酸殘基數、效應細胞功能及/或補體功能)。在一個實施例中，抗體具有效應功能且可固定補體。在其他實施例中，抗體不募集效應細胞或固定補體。在另一實施例中，抗體具有降低的或不具有結合Fc受體之能力。舉例而言，抗體為同型或亞型、片段或其他突變體，其並不支持與Fc受體之結合，例如其具有誘變或缺失之Fc受體結合區。
在某些實施例中，抗原結合位點連接至包括鉸鏈、CH2及CH3結構域、具有或不具有CH1結構域之IgG恆定區。在一些實施例中，恆定區之胺基酸序列與諸如人類IgG1恆定區、人類IgG2恆定區、人類IgG3恆定區或人類IgG4恆定區等人類抗體恆定區至少90% (例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致。在一個實施例中，抗體Fc結構域或其足以結合CD16之部分包含與野生型人類IgG1 Fc序列DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:21)至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在一些其他實施例中，恆定區之胺基酸序列與來自諸如兔、狗、貓、小鼠或馬等另一哺乳動物之抗體恆定區至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致。與人類IgG1恆定區相比，可將一或多個突變併入至恆定區中，例如在Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411及/或K439處。例示性取代包括(例如) Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、T350V、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、T394W、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I 、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D及K439E。
在某些實施例中，抗原結合位點連接至抗體Fc結構域中足以結合CD16之部分。在Fc結構域內，藉由鉸鏈區及CH2結構域調介CD16結合。舉例而言，在人類IgG1內，與CD16之相互作用主要集中在CH2結構域中之胺基酸殘基Asp 265 - Glu 269、Asn 297 - Thr 299、Ala 327 - Ile 332、Leu 234 - Ser 239及碳水化合物殘基N-乙醯基-D-葡糖胺上(參見，Sondermann等人，Nature, 406 (6793):267-273)。基於已知結構域，可選擇突變以增強或降低與CD16之結合親和力，諸如藉由使用噬菌體展示文庫或酵母表面展示cDNA文庫，或可基於相互作用之已知三維結構設計突變。
在某些實施例中，可併入至人類IgG1恆定區之CH1中之突變可在胺基酸V125、F126、P127、T135、T139、A140、F170、P171及/或V173處。在某些實施例中，可併入至人類IgG1恆定區之Cκ中之突變可在胺基酸E123、F116、S176、V163、S174及/或T164處。
在一些實施例中，抗體恆定結構域包含IgG抗體(例如人類IgG1抗體)之CH2結構域及CH3結構域。在一些實施例中，在抗體恆定結構域中引入突變以使得能夠與另一抗體恆定結構域異二聚化。舉例而言，若抗體恆定結構域源自人類IgG1之恆定結構域，則該抗體恆定結構域可包含與人類IgG1抗體之胺基酸234-332至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列，且在一或多個選自由Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411及K439組成之群之位置處有所不同。本文所揭示之Fc結構域或鉸鏈區中之所有胺基酸位置均係根據EU編號進行編號。
為有助於不對稱蛋白質之形成，審慎考慮Fc結構域異二聚化。Fc結構域中促進異二聚化之突變(例如胺基酸取代)闡述於(例如)國際申請公開案第WO2019157366號中，該公開案未以引用的方式併入本文中。
上文所闡述之蛋白質可使用熟習此項技術者所熟知之重組DNA技術來製得。舉例而言，可將編碼第一免疫球蛋白重鏈之第一核酸序列選殖至第一表現載體中；可將編碼第二免疫球蛋白重鏈之第二核酸序列選殖至第二表現載體中；可將編碼第一免疫球蛋白輕鏈之第三核酸序列選殖至第三表現載體中；可將編碼第二免疫球蛋白輕鏈之第四核酸序列選殖至第四表現載體中；可將該等第一、第二、第三及第四表現載體一起穩定地轉染至宿主細胞中以產生多聚蛋白質。
為達成蛋白質之最高產率，可探索不同比率之第一、第二、第三及第四表現載體以確定用於轉染至宿主細胞中之最佳比率。轉染後，可使用此項技術中已知之方法(諸如有限稀釋、ELISA、FACS、顯微鏡術或Clonepix)分離出單一純系以供產生細胞庫。
純系可在適於生物反應器放大且維持包含本文所揭示之抗原結合位點的蛋白質之表現之條件下培養。可使用此項技術中已知之方法分離並純化蛋白質，該等方法包括離心、深層過濾、細胞溶解、均質化、冷凍-解凍、親和純化、凝膠過濾、離子交換層析、疏水相互作用交換層析及混合模式層析。
因此，在另一態樣中，本發明提供一或多種經分離核酸，其包含編碼前述抗體中之任一者之免疫球蛋白重鏈及/或免疫球蛋白輕鏈可變區之序列。本發明提供一或多種表現載體，其表現前述抗體中之任一者之免疫球蛋白重鏈及/或免疫球蛋白輕鏈可變區。類似地，本發明提供宿主細胞，其包含前述表現載體及/或經分離核酸中之一或多者。
在某些實施例中，如使用標準結合分析(例如表面電漿子共振或生物層干涉術)所量測，抗體以20 nM、15 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、2 nM、1 nM或更低之KD 結合FLT3。在某些實施例中，抗體結合來自個體體液、組織及/或細胞之EBI3。
確定一種抗體是否與所揭示抗體結合至相同抗原決定基或是否與所揭示抗體競爭結合之競爭分析為此項技術中所已知。例示性競爭分析包括免疫分析(例如ELISA分析、RIA分析)、表面電漿子共振(例如BIAcore分析)、生物層干涉術及流式細胞術。
通常，競爭分析涉及使用結合至固體表面或在細胞表面上表現之抗原(例如人類FLT3蛋白或其片段)、測試FLT3結合抗體及參考抗體。參考抗體經標記且測試抗體未經標記。藉由測定在測試抗體存在下結合至固體表面或細胞的經標記之參考抗體之量來量測競爭性抑制。通常，測試抗體過量存在(例如1×、5×、10×、20×或100×)。藉由競爭分析所鑑別之抗體(例如競爭性抗體)包括與參考抗體結合至相同抗原決定基或相似(例如重疊)抗原決定基之抗體，及因出現立體阻礙而結合至足夠靠近參考抗體所結合的抗原決定基之毗鄰抗原決定基之抗體。
可在兩個方向上進行競爭分析以確保標記之存在不會干擾或以其他方式抑制結合。舉例而言，在第一方向上，參考抗體經標記且測試抗體未經標記，且在第二方向上，測試抗體經標記且參考抗體未經標記。
若過量之一種抗體(例如1×、5×、10×、20×或100×)抑制另一抗體之結合(例如，如在競爭性結合分析中所量測抑制至少50%、75%、90%、95%或99%)，則測試抗體與參考抗體競爭特異性結合至抗原。
若抗原中降低或消除一種抗體之結合的基本上所有之胺基酸突變降低或消除另一抗體之結合，則可確定該兩種抗體結合至相同的抗原決定基。若降低或消除一種抗體之結合的胺基酸突變中僅有一個子集降低或消除另一抗體之結合，則可確定該兩種抗體結合至重疊抗原決定基。
本文所揭示之抗體可經進一步最佳化(例如親和力成熟)以改良生物化學特徵(包括親和力及/或特異性)、改良生物物理性質(包括聚集、穩定性、沈澱及/或非特異性相互作用)及/或降低免疫原性。親和力成熟程序為熟習此項技術者所已知。舉例而言，可藉由DNA改組、鏈改組、CDR改組、隨機誘變及/或位點特異性誘變將多樣性引入至免疫球蛋白重鏈及/或免疫球蛋白輕鏈中。
在某些實施例中，經分離之人類抗體含有一或多種體細胞突變。在該等情形中，可將抗體修飾成人類生殖系序列以使抗體最佳化(例如藉由稱為生殖系化之過程)。
通常，最佳化抗體與其所源自之非最佳化(或親代)抗體對抗原具有至少相同或實質上相同之親和力。較佳地，當與親代抗體相比時，最佳化抗體對抗原具有更高之親和力。
若抗體用作治療劑，則可使用標準活體外結合化學使其結合至諸如小分子毒素或放射性核種等效應劑。若效應劑係多肽，則可使抗體化學偶聯至效應物或與效應物連接為融合蛋白。融合蛋白之構築為熟習此項技術者所已知。
可使用標準活體外結合化學使抗體結合至諸如小分子毒素或放射性核種等效應部分。若效應部分係多肽，則可使抗體化學偶聯至效應物或與效應物連接為融合蛋白。融合蛋白之構築為熟習此項技術者所已知。
在某些實施例中，本揭示案之蛋白質(例如抗體)並未實質上由FLT3表現細胞內化。低水準之內化可改良蛋白質之藥物動力學，藉此降低使表現FLT3之靶細胞與效應細胞(例如NK細胞)接合所需之劑量。可藉由此項技術中已知之任何方法來量測內化，例如本揭示案之實例7中所闡述之方法。舉例而言，在某些實施例中，如藉由本文所揭示之方法所評價，在2小時培育後，ROH或EOL-1細胞對蛋白質之內化低於10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%。 CAR T 細胞、 FLT3/CD3 定向之雙特異性 T 細胞銜接體、免疫細胞介素、 抗體 - 藥物偶聯物及免疫毒素
本發明之另一態樣提供包含如本文所揭示之結合FLT3之抗原結合位點之分子或複合物。例示性分子或複合物包括(但不限於)嵌合抗原受體(CAR)、T細胞銜接體(例如FLT3/CD3定向之雙特異性T細胞銜接體)、免疫細胞介素、抗體-藥物偶聯物及免疫毒素。
可使用如本文所揭示之結合FLT3之任何抗原結合位點。在某些實施例中，結合FLT3之抗原結合位點之VH、VL及/或CDR序列提供於表1中。在某些實施例中，結合FLT3之抗原結合位點係scFv。在某些實施例中，該scFv包含與選自SEQ ID NO: 3、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、70、71、74、75、81及82之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該scFv包含選自SEQ ID NO: 3、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、70、71、74、75、81及82之胺基酸序列。
在某些實施例中，結合FLT3之抗原結合位點包含重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含分別由SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列表示之CDR1、CDR2及CDR3序列；及輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域包含分別由SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列表示之CDR1、CDR2及CDR3序列。在某些實施例中，抗原結合位點包含重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:37之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:38之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，抗原結合位點包含scFv，該scFv包含與SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:39至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。 嵌合抗原受體 (CAR)
在某些實施例中，本發明提供FLT3靶向CAR，其包含如本文所揭示之結合FLT3之抗原結合位點(例如，參見表1)。該FLT3靶向CAR可包含Fab片段或scFv。
術語「嵌合抗原受體」或替代地「CAR」係指至少包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域之重組多肽構築體，該細胞內信號傳導結構域包含源自刺激分子之功能性信號傳導結構域(在本文中亦稱為「初級信號傳導結構域」)。
因此，在某些實施例中，CAR包含如本文所揭示之結合FLT3之細胞外抗原結合位點、跨膜結構域及包含初級信號傳導結構域之細胞內信號傳導結構域。在某些實施例中，CAR進一步包含一或多個源自至少一種共刺激分子之功能性信號傳導結構域(亦稱為「共刺激信號傳導結構域」)。
在一個實施例中，CAR包含有包含以下之嵌合融合蛋白：作為細胞外抗原結合結構域之FLT3結合結構域(例如結合FLT3之scFv結構域)，其包含表1中所列示之重鏈可變結構域之CDR1、CDR2及CDR3以及輕鏈可變結構域之CDR1、CDR2及CDR3；跨膜結構域；及細胞內信號傳導結構域，其包含初級信號傳導結構域。在一個實施例中，CAR包含有包含以下之嵌合融合蛋白：作為細胞外抗原結合結構域之FLT3結合結構域(例如結合FLT3之scFv結構域)，其包含表1中所列示之重鏈可變結構域之CDR1、CDR2及CDR3以及輕鏈可變結構域之CDR1、CDR2及CDR3；跨膜結構域；及細胞內信號傳導結構域，其包含共刺激信號傳導結構域及初級信號傳導結構域。在一態樣中，CAR包含有包含以下之嵌合融合蛋白：作為細胞外抗原結合結構域之FLT3結合結構域(例如結合FLT3之scFv結構域)，其包含表1中所列示之重鏈可變結構域之CDR1、CDR2及CDR3以及輕鏈可變結構域之CDR1、CDR2及CDR3；跨膜結構域；及細胞內信號傳導結構域，其包含兩個共刺激信號傳導結構域及一個初級信號傳導結構域。在一個實施例中，CAR包含有包含以下之嵌合融合蛋白：作為細胞外抗原結合結構域之FLT3結合結構域，其包含表1中所列示之重鏈可變結構域之CDR1、CDR2及CDR3以及輕鏈可變結構域之CDR1、CDR2及CDR3；跨膜結構域；及細胞內信號傳導結構域，其包含至少兩個共刺激信號傳導結構域及一個初級信號傳導結構域。
舉例而言，在某些實施例中，細胞外抗原結合結構域構成包含以下之抗原結合位點(例如scFv)：重鏈可變結構域，其包含分別由SEQ ID NO: 11、4及5之胺基酸序列表示之CDR1、CDR2及CDR3序列；及輕鏈可變結構域，其包含分別由SEQ ID NO: 6、7及8之胺基酸序列表示之CDR1、CDR2及CDR3序列。在某些實施例中，抗原結合位點包含重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:37之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列；及輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:38之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，抗原結合位點包含scFv，該scFv包含與SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:39至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。
關於跨膜結構域，在各個實施例中，CAR經設計以包含與CAR之細胞外結構域融合之跨膜結構域。在一個實施例中，跨膜結構域係天然地與CAR中之該等結構域中之一者締合的結構域。在一些情況下，可藉由胺基酸取代來選擇或修飾跨膜結構域，以避免此等結構域與相同或不同表面膜蛋白質之跨膜結構域結合，從而使與受體複合物之其他成員的相互作用最小化。在另一實施例中，跨膜結構域能夠與CAR T細胞表面上之另一CAR同二聚化。在另一實施例中，跨膜結構域之胺基酸序列可經修飾或取代，以使與存在於同一CAR T細胞中的天然結合搭配物之結合結構域的相互作用最小化。
跨膜結構域可源自任何天然膜結合蛋白質或跨膜蛋白質。在一個實施例中，每當CAR已結合至靶標，跨膜區即能夠信號傳導至細胞內結構域。在一些實施例中，跨膜結構域包含選自由以下組成之群的一或多種蛋白質之跨膜區：TCR α鏈、TCR β鏈、TCR ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、FLT3、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在一些實施例中，跨膜結構域包含選自由以下組成之群的一或多種蛋白質之跨膜區：KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1 (CD11a、CD18)、ICOS (CD278)、4-1BB (CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D及NKG2C。
細胞外FLT3結合結構域(例如結合FLT3之scFv結構域)結構域可藉由鉸鏈區連結至跨膜結構域。可採用多種鉸鏈，包括(但不限於)人類Ig (免疫球蛋白)鉸鏈(例如IgG4鉸鏈、IgD鉸鏈)、Gly-Ser連接體、(G4 S)4 連接體、KIR2DS2鉸鏈及CD8α鉸鏈。
本發明CAR之細胞內信號傳導結構域負責CAR所置於其中的免疫細胞之專門功能中之至少一者的活化(例如T細胞之細胞溶解活性或輔助活性，包括細胞介素之分泌)。因此，如本文所用，術語「細胞內信號傳導結構域」係指轉導效應功能信號且引導細胞實施專門功能之蛋白質部分。儘管通常可採用整個細胞內信號傳導結構域，但在許多情形下無需使用整條鏈。就使用細胞內信號傳導結構域之截短部分而言，可使用此截短部分來替代完整鏈，只要其轉導效應功能信號即可。因此，術語細胞內信號傳導結構域意欲包括細胞內信號傳導結構域中足以轉導效應功能信號之任何截短部分。
CAR之細胞內信號傳導結構域包含初級信號傳導結構域(亦即源自刺激分子之功能性信號傳導結構域)及一或多個共刺激信號傳導結構域(亦即源自至少一種共刺激分子之功能性信號傳導結構域)。
如本文所用，術語「刺激分子」係指由提供細胞質信號傳導序列之免疫細胞(例如T細胞、NK細胞或B細胞)表現之分子，該(等)細胞質信號傳導序列以刺激免疫細胞信號傳導路徑之至少一些態樣的方式來調控免疫細胞之活化。在一個實施例中，信號係藉由例如TCR/CD3複合物與負載有肽之MHC分子結合起始之初級信號，且此可調介T細胞反應，包括(但不限於)增殖、活化、分化及諸如此類。
以刺激方式起作用之初級信號傳導結構域可含有信號傳導基元，該等信號傳導基元稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或ITAM。在本發明中具有特定用途之含有ITAM之細胞質信號傳導序列之實例包括源自以下之彼等序列：CD3ζ、共有FcRγ (FCER1G)、Fc γ RIIa、FcR β (Fc ε R1b)、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD79a、CD79b、DAP10及DAP12。在一個實施例中，本發明之任一或多個CAR中之初級信號傳導結構域包含源自CD3-ζ之細胞質信號傳導序列。
在一些實施例中，初級信號傳導結構域係TCR ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、4-1BB及/或CD3-ζ之功能性信號傳導結構域。在一實施例中，細胞內信號傳導結構域包含CD3 ζ、共有FcR γ (FCER1G)、Fc γ RIIa、FcR β (Fc ε R1b)、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD79a、CD79b、DAP10及/或DAP12之功能性信號傳導結構域。在特定實施例中，初級信號傳導結構域係與T細胞受體複合物締合之ζ鏈之功能性信號傳導結構域。
如本文所用，術語「共刺激分子」係指在T細胞上與共刺激配位體特異性結合，藉此調介T細胞之共刺激反應(諸如(但不限於)增殖)之同源結合搭配物。共刺激分子係淋巴球對抗原之有效反應所需的除抗原受體或其配位體以外之細胞表面分子。此等分子之實例包括CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1、CD11a/CD18)、CD2、CD7、CD258 (LIGHT)、NKG2C、B7-H3及與CD83特異性結合之配位體及諸如此類。此等共刺激分子之其他實例包括CD5、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、CD69、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp及與CD83特異性結合之配位體。在一些實施例中，CAR之共刺激信號傳導結構域係本文所闡述之共刺激分子之功能性信號傳導結構域，例如OX40、CD27、CD28、CD30、CD40、PD-1、CD2、CD7、CD258、NKG2C、B7-H3、結合至CD83之配位體、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、ICOS及4-1BB (CD137)或其任一組合。
如本文所用，術語「信號傳導結構域」係指蛋白質之功能部分，其藉由在細胞內傳送資訊以經由所定義之信號傳導路徑藉由產生第二信使或藉由因應此等信使發揮效應作用調控細胞活性而起作用。
在本發明之CAR之細胞質信號傳導部分內的細胞質信號傳導序列可以隨機或指定之次序彼此連接。視情況，長度例如介於2個與10個胺基酸之間的短寡肽或多肽連接體可形成鍵聯。
本發明之另一態樣提供編碼本文所揭示之FLT3靶向CAR之核酸。藉由將核酸引入至細胞，該核酸可用於在效應細胞(例如T細胞)中表現該CAR。
可在序列中進行修飾以產生本發明之等效或經改良之變異體，例如藉由根據密碼子簡併性表改變該等密碼子中之一或多者來實施。DNA密碼子簡併性表提供於表2中。
表2. 胺基酸密碼子
胺基酸 單字母代碼 三字母代碼 密碼子
丙胺酸 A Ala GCA GCC GCG GCU
半胱胺酸 C Cys UGC UGU
天冬胺酸 D Asp GAC GAU
麩胺酸 E Glu GAA GAG
苯丙胺酸 F Phe UUC UUU
甘胺酸 G Gly GGA GGC GGG GGU
組胺酸 H His CAC CAU
異白胺酸 I Iso AUA AUC AUU
離胺酸 K Lys AAA AAG
白胺酸 L Leu UUA UUG CUA CUC CUG CUU
甲硫胺酸 M Met AUG
天冬醯胺 N Asn AAC AAU
脯胺酸 P Pro CCA CCC CCG CCU
麩醯胺酸 Q Gln CAA CAG
精胺酸 R Arg AGA AGG CGA CGC CGG CGU
絲胺酸 S Ser AGC AGU UCA UCC UCG UCU
蘇胺酸 T Thr ACA ACC ACG ACU
纈胺酸 V Val GUA GUC GUG GUU
色胺酸 W Trp UGG
酪胺酸 Y Tyr UAC UAU
在某些實施例中，該核酸係DNA分子(例如cDNA分子)。在某些實施例中，該核酸進一步包含可操作地連接至CAR編碼序列之表現控制序列(例如啟動子及/或增強子)。在某些實施例中，本發明提供包含該核酸之載體。該載體可為病毒載體(例如AAV載體、慢病毒載體或腺病毒載體)或非病毒載體(例如質體)。
在某些實施例中，該核酸係RNA分子(例如mRNA分子)。產生用於轉染的mRNA之方法可涉及利用專門設計之引子在活體外轉錄模板，之後添加聚A，以產生長度通常為50-2000個鹼基的含有以下各項之RNA構築體：3'及5'未轉譯序列、5'帽及/或內部核糖體進入位點(IRES)、欲表現之核酸及聚A尾。可進一步修飾RNA分子以提高轉譯效率及/或穩定性，例如如美國專利第8,278,036號、第8,883,506號及第8,716,465號中所揭示。如此產生之RNA分子可有效地轉染不同種類之細胞。
在一個實施例中，該核酸編碼在CAR之胺基末端處包含信號肽之胺基酸序列。此信號肽在效應細胞中表現時可有助於CAR之細胞表面定位，且其在細胞處理期間自CAR裂解。在一個實施例中，該核酸編碼在細胞外FLT3結合結構域(例如結合FLT3之scFv結構域)之N末端處包含信號肽之胺基酸序列。
可使用多種不同方法(例如市售方法)中之任一者將RNA或DNA引入至靶細胞中，該等方法包括(但不限於)電穿孔、使用脂轉染之陽離子脂質體介導之轉染、聚合物囊封、肽介導之轉染或生物彈射粒子遞送系統(諸如「基因槍」) (例如，參見Nishikawa等人，Hum Gene Ther., 12(8):861-70 (2001))。
本發明之另一態樣提供表現FLT3靶向CAR之免疫效應細胞。亦提供包含編碼該FLT3靶向CAR之核酸之免疫效應細胞。該等免疫效應細胞包括(但不限於) T細胞及NK細胞。在某些實施例中，T細胞係選自CD8+ T細胞、CD4+ T細胞及NKT細胞。T細胞或NK細胞可為原代細胞或細胞株。
藉由此項技術中已知之方法，可自多種來源獲得免疫效應細胞，該等來源包括外周血單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、胸膜滲出液、脾組織及腫瘤。免疫效應細胞亦可在活體外自多潛能或多能細胞(例如造血幹細胞)分化。在一些實施例中，本發明提供表現FLT3靶向CAR (例如在質膜上表現CAR)或包含本文所揭示核酸之多潛能或多能細胞(例如造血幹細胞)。
在某些實施例中，免疫效應細胞經分離及/或純化。舉例而言，可使用CD25結合配位體自T細胞群體中去除調控性T細胞。可藉由類似方法去除表現檢查點蛋白(例如PD-1、LAG-3或TIM-3)之效應細胞。在某些實施例中，藉由正向選擇步驟分離效應細胞。舉例而言，藉由與抗CD3/抗CD28結合珠粒一起培育來分離T細胞群體。諸如IFN-7、TNF-α、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、顆粒酶B及穿孔蛋白等其他細胞表面標記物亦可用於正向選擇。
通常可使用此項技術中已知之方法使免疫效應細胞活化並擴增，該等方法例如如美國專利第6,352,694號；第6,534,055號；第6,905,680號；第6,692,964號；第5,858,358號；第6,887,466號；第6,905,681號；第7,144,575號；第7,067,318號；第7,172,869號；第7,232,566號；第7,175,843號；第5,883,223號；第6,905,874號；第6,797,514號；第6,867,041號；及美國專利申請公開案第2006/0121005號及第2016/0340406號中所闡述。舉例而言，在某些實施例中，可在適於刺激T細胞增殖之條件下，藉由與抗CD3抗體及抗CD28抗體接觸使T細胞擴增及/或活化。可使細胞在培養物中擴增若干小時(例如約2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、15小時、18小時、21小時)至約14天(例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天)之時段。在一個實施例中，使細胞擴增4天至9天之時段。對於延長之細胞培養(例如培養60天或更長時段)，多個刺激週期可為合意的。在某些實施例中，細胞培養物包含血清(例如胎牛或人類血清)、介白素-2 (IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ、TNF-α或其組合。熟習此項技術者已知之用於細胞生長之其他添加劑(例如表面活性劑、人血漿蛋白粉及諸如N-乙醯基-半胱胺酸及2-巰基乙醇等還原劑)亦可包括在細胞培養物中。在某些實施例中，本發明之免疫效應細胞係自活體外擴增獲得之細胞。
FLT3靶向CAR (例如可調控CAR)、編碼該CAR之核酸及表現該CAR或包含該核酸之效應細胞之其他實施例提供於美國專利第7,446,190號及第9,181,527號、美國專利申請公開案第2016/0340406號及第2017/0049819號以及國際專利申請公開案第WO2018/140725號中。 FLT3/CD3 定向之雙特異性 T 細胞銜接體
在某些實施例中，本發明提供FLT3/CD3定向之雙特異性T細胞銜接體，其包含本文所揭示之結合FLT3之抗原結合位點。在某些實施例中，該FLT3/CD3定向之雙特異性T細胞銜接體包含與選自SEQ ID NO: 3、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、70、71、74、75、81及82之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，細胞介素直接地或經由連接體連結至Fc結構域。
在某些實施例中，該FLT3/CD3定向之雙特異性T細胞銜接體進一步包含結合CD3之抗原結合位點。結合CD3之例示性抗原結合位點揭示於國際專利申請公開案第WO2014/051433號及第WO2017/097723號中。
本發明之另一態樣提供編碼FLT3/CD3定向之雙特異性T細胞銜接體之至少一種多肽之核酸，其中該多肽包含結合FLT3之抗原結合位點。在某些實施例中，該核酸進一步包含編碼信號肽之核苷酸序列，該信號肽在表現時係在該FLT3/CD3定向之雙特異性T細胞銜接體之一或多種多肽之N末端處。亦提供包含該核酸之載體(例如病毒載體)、包含該核酸或載體之生產細胞及表現該FLT3/CD3定向之雙特異性T細胞銜接體之生產細胞。 免疫細胞介素
在某些實施例中，本發明提供免疫細胞介素，其包含本文所揭示之結合FLT3之抗原結合位點及細胞介素。可使用此項技術中已知之任何細胞介素(例如促發炎細胞介素)，包括(但不限於) IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、TNF、IFNα、IFNγ及GM-CSF。更多的例示性細胞介素揭示於美國專利第9,567,399號中。在某些實施例中，抗原結合位點藉由化學偶聯(例如共價或非共價化學偶聯)連結至細胞介素。在某些實施例中，抗原結合位點藉由多肽之融合連結至細胞介素。該免疫細胞介素可進一步包含連結至結合FLT3之抗原結合位點之Fc結構域。在某些實施例中，該免疫細胞介素包含與選自SEQ ID NO: 3、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、70、71、74、75、81及82之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，細胞介素直接地或經由連接體連結至Fc結構域。
本發明之另一態樣提供編碼免疫細胞介素之至少一種多肽之核酸，其中該多肽包含結合FLT3之抗原結合位點。在某些實施例中，該核酸進一步包含編碼信號肽之核苷酸序列，該信號肽在表現時係在該免疫細胞介素之一或多種多肽之N末端處。亦提供包含該核酸之載體(例如病毒載體)、包含該核酸或載體之生產細胞及表現該免疫細胞介素之生產細胞。 抗體 - 藥物偶聯物
在某些實施例中，本發明提供抗體-藥物偶聯物，其包含本文所揭示之結合FLT3之抗原結合位點及細胞毒性藥物部分。例示性細胞毒性藥物部分揭示於國際專利申請公開案第WO2014/160160號及第WO2015/143382號中。在某些實施例中，細胞毒性藥物部分係選自奧裡斯他汀、N-乙醯基-γ卡奇黴素、類美登素、吡咯并苯并二氮呯及SN-38。抗原結合位點可藉由化學偶聯(例如共價或非共價化學偶聯)連結至細胞毒性藥物部分。在某些實施例中，該抗體-藥物偶聯物進一步包含連結至結合FLT3之抗原結合位點之Fc結構域。在某些實施例中，該抗體-藥物偶聯物包含與選自SEQ ID NO: 3、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、70、71、74、75、81及82之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，細胞毒性藥物部分直接地或經由連接體連結至Fc結構域。 免疫毒素
在某些實施例中，本發明提供免疫毒素，其包含本文所揭示之結合FLT3之抗原結合位點及細胞毒性肽部分。可使用此項技術中已知之任何細胞毒性肽部分，包括(但不限於)蓖麻毒蛋白、白喉毒素(Diphtheria toxin)及假單胞菌外毒素A (Pseudomonas exotoxin A)。更多的例示性細胞毒性肽揭示於國際專利申請公開案第WO2012/154530號及第WO2014/164680號中。在某些實施例中，細胞毒性肽部分藉由化學偶聯(例如共價或非共價化學偶聯)連結至蛋白質。在某些實施例中，細胞毒性肽部分藉由多肽之融合連結至蛋白質。該免疫毒素可進一步包含連結至結合FLT3之抗原結合位點之Fc結構域。在某些實施例中，該免疫毒素包含與選自SEQ ID NO: 3、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、70、71、74、75、81及82之胺基酸序列至少90% (例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，細胞毒性肽部分直接地或經由連接體連結至Fc結構域。
本發明之另一態樣提供編碼免疫毒素之至少一種多肽之核酸，其中該多肽包含結合FLT3之抗原結合位點。在某些實施例中，該核酸進一步包含編碼信號肽之核苷酸序列，該信號肽在表現時係在該免疫毒素之一或多種多肽之N末端處。亦提供包含該核酸之載體(例如病毒載體)、包含該核酸或載體之生產細胞及表現該免疫毒素之生產細胞。II. 治療性組合物及其用途
本發明提供使用包含本文所揭示之抗原結合位點之蛋白質、偶聯物或細胞及/或本文所闡述之醫藥組合物治療癌症之方法。該等方法可用於治療表現FLT3之多種癌症，其係藉由向有需要之患者投與治療有效量之包含本文所揭示之抗原結合位點之蛋白質、偶聯物或細胞來實施。
治療方法可根據欲治療之癌症來表徵。舉例而言，在某些實施例中，癌症係血液惡性病或白血病。在某些實施例中，癌症係急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、骨髓發育不良、骨髓發育不良症候群、急性T淋巴母細胞性白血病或急性前骨髓細胞性白血病、慢性骨髓單核球性白血病或慢性骨髓性白血病之骨髓樣原始細胞危象。
在某些實施例中，AML係微量殘存疾病(MRD)。在某些實施例中，MRD之特徵在於存在或不存在選自以下之突變：FLT3-ITD ((Fms樣酪胺酸激酶3)-內部串聯重複(ITD))、NPM1 (核仁磷酸蛋白1)、DNMT3A (DNA甲基轉移酶基因DNMT3A)及IDH (異檸檬酸去氫酶1及2 (IDH1及IDH2))。在某些實施例中，MDS係選自MDS伴多系發育不良(MDS-MLD)、MDS伴單系發育不良(MDS-SLD)、MDS伴環形鐵粒幼紅血球(MDS-RS)、MDS伴原始細胞增多(MDS-EB)、MDS伴孤立之del(5q)及不可歸類之MDS (MDS-U)。在某些實施例中，MDS係原發性MDS或繼發性MDS。
在某些實施例中，ALL係選自B細胞急性淋巴母細胞性白血病(B-ALL)及T細胞急性淋巴母細胞性白血病(T-ALL)。在某些實施例中，MPN係選自真性紅血球增多症、原發性血小板過多症(ET)及骨髓纖維化。在某些實施例中，非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)係選自B細胞淋巴瘤及T細胞淋巴瘤。在某些實施例中，淋巴瘤係選自慢性淋巴球性白血病(CLL)、淋巴母細胞性淋巴瘤(LPL)、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、柏基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma, BL)、原發性縱膈大B細胞淋巴瘤(PMBL)、濾泡性淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、毛細胞白血病、漿細胞骨髓瘤(PCM)或多發性骨髓瘤(MM)、成熟T/NK贅瘤及組織細胞性贅瘤。
在某些實施例中，癌症係實體腫瘤。在某些其他實施例中，癌症係腦癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食管癌、白血病、肺癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌、直腸癌、腎癌、胃癌、睪丸癌或子宮癌。在其他實施例中，癌症係血管化腫瘤、鱗狀細胞癌、腺癌、小細胞癌、黑色素瘤、膠質瘤、神經胚細胞瘤、肉瘤(例如血管肉瘤或軟骨肉瘤)、喉癌、腮腺癌、膽道癌、甲狀腺癌、肢端著色斑性黑色素瘤、光化性角化病、急性淋巴球性白血病、急性骨髓性白血病、腺樣囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鱗狀癌、肛管癌、肛門癌、肛門直腸癌、星形細胞瘤、前庭大腺癌、基底細胞癌、膽管癌、骨癌、骨髓癌、支氣管癌、支氣管腺癌、類癌、膽道癌、軟骨肉瘤、脈絡叢乳頭狀瘤/癌、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓性白血病、透明細胞癌、結締組織癌、囊腺瘤、消化系統癌症、十二指腸癌、內分泌系統癌症、內胚竇瘤、子宮內膜增生、子宮內膜間質肉瘤、子宮內膜樣腺癌、內皮細胞癌、室管膜癌、上皮細胞癌、尤恩氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、眼及眼眶癌、女性生殖器癌症、局灶性結節性增生、膽囊癌、胃竇癌、胃底癌、胃泌素瘤、神經膠母細胞瘤、升糖素瘤、心臟癌、血管母細胞瘤、血管內皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝膽管癌、肝細胞癌、霍奇金氏病、迴腸癌、胰島素瘤、上皮內贅瘤形成、上皮間鱗狀細胞贅瘤形成、肝內膽管癌、侵襲性鱗狀細胞癌、空腸癌、關節癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、盆腔癌、大細胞癌、大腸癌、平滑肌肉瘤、惡性雀斑樣黑色素瘤、淋巴瘤、男性生殖器癌症、惡性黑色素瘤、惡性間皮瘤、髓母細胞瘤、髓上皮瘤、腦膜癌、間皮癌、轉移性癌、口癌、黏液表皮樣癌、多發性骨髓瘤、肌肉癌、鼻道癌、神經系統癌症、神經上皮腺癌結節性黑色素瘤、非上皮皮膚癌、非霍奇金氏淋巴瘤、燕麥細胞癌、寡樹突膠質細胞癌、口腔癌、骨肉瘤、乳頭狀漿液性腺癌、陰莖癌、咽癌、垂體瘤、漿細胞瘤、假肉瘤、肺母細胞瘤、直腸癌、腎細胞癌、呼吸系統癌症、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、漿液性癌、竇癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、平滑肌癌、軟組織癌、體抑素分泌性腫瘤、脊柱癌、鱗狀細胞癌、橫紋肌癌、間皮下癌、表淺性擴散性黑色素瘤、T細胞白血病、舌癌、未分化癌、輸尿管癌、尿道癌、膀胱癌、泌尿系統癌症、子宮頸癌、子宮體癌、眼色素層黑色素瘤、陰道癌、疣狀癌、血管活性腸肽瘤(VIPoma)、外陰癌、高度分化癌或威爾姆氏瘤(Wilms tumor)。
在某些其他實施例中，癌症係非霍奇金氏淋巴瘤，諸如B細胞淋巴瘤或T細胞淋巴瘤。在某些實施例中，非霍奇金氏淋巴瘤係B細胞淋巴瘤，諸如瀰漫性大B細胞淋巴瘤、原發性縱膈B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、小淋巴球性淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、邊緣區B細胞淋巴瘤、淋巴結外邊緣區B細胞淋巴瘤、淋巴結邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區B細胞淋巴瘤、柏基特淋巴瘤、淋巴漿細胞淋巴瘤、毛細胞白血病或原發性中樞神經系統(CNS)淋巴瘤。在某些其他實施例中，非霍奇金氏淋巴瘤係T細胞淋巴瘤，諸如前體T淋巴母細胞性淋巴瘤、外周T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤、淋巴結外天然殺手/T細胞淋巴瘤、腸病變型T細胞淋巴瘤、皮下脂膜炎樣T細胞淋巴瘤、間變性大細胞淋巴瘤或外周T細胞淋巴瘤。
欲治療之癌症可根據在癌細胞表面上表現的特定抗原之存在來表徵。在某些實施例中，除FLT3以外，癌細胞亦可表現以下中之一或多者：CD2、CD19、CD20、CD30、CD38、CD40、CD52、CD70、EGFR/ERBB1、IGF1R、HER3/ERBB3、HER4/ERBB4、MUC1、TROP2、cMET、SLAMF7、PSCA、MICA、MICB、TRAILR1、TRAILR2、MAGE-A3、B7.1、B7.2、CTLA4及PD1。
在本發明之實施例中，欲治療之癌症係選自急性骨髓性白血病(AML)、骨髓發育不良症候群(MDS)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、骨髓增殖性贅瘤(MPN)、淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤及經典型霍奇金氏淋巴瘤。
在本發明之一些實施例中，欲治療之癌症係AML。在本發明之一些實施例中，AML係選自未分化型急性骨髓母細胞性白血病、急性骨髓母細胞性白血病伴微量成熟、急性骨髓母細胞性白血病伴成熟、急性前骨髓細胞性白血病(APL)、急性骨髓單核球性白血病、急性骨髓單核球性白血病伴嗜酸性球增多症、急性單核球性白血病、急性紅白血病、急性巨核母細胞性白血病(AMKL)、急性嗜鹼性球性白血病、急性全骨髓增生伴纖維化及母細胞性漿細胞樣樹突細胞贅瘤(BPDCN)。在本發明之一些實施例中，AML之特徵在於在AML白血病幹細胞(LSC)上表現CLL-1。在本發明之一些實施例中，AML個體中之LSC進一步表現選自CD34、CD38、CD123、TIM3、CD25、CD32及CD96之膜標記物。在本發明之一些實施例中，AML之特徵為微量殘存疾病(MRD)。在本發明之一些實施例中，AML之MRD之特徵在於存在或不存在選自以下之突變：FLT3-ITD ((Fms樣酪胺酸激酶3)-內部串聯重複(ITD))、NPM1 (核仁磷酸蛋白1)、DNMT3A (DNA甲基轉移酶基因DNMT3A)及IDH (異檸檬酸去氫酶1及2 (IDH1及IDH2))。
在本發明之某些實施例中，癌症係選自以下之MDS：MDS伴多系發育不良(MDS-MLD)、MDS伴單系發育不良(MDS-SLD)、MDS伴環形鐵粒幼紅血球(MDS-RS)、MDS伴原始細胞增多(MDS-EB)、MDS伴孤立之del(5q)及不可歸類之MDS (MDS-U)。
經審慎考慮，本揭示案之蛋白質、偶聯物、細胞及/或醫藥組合物可用於治療多種癌症，而不限於其中癌細胞表現FLT3之癌症。舉例而言，在某些實施例中，本文所揭示之蛋白質、偶聯物、細胞及/或醫藥組合物可用於治療與表現FLT3之免疫細胞相關之癌症。FLT3在多種髓系上表現，且腫瘤浸潤性骨髓樣細胞(例如腫瘤相關巨噬細胞)可有助於癌症進展及轉移。因此，本文所揭示之方法可用於治療多種其中表現FLT3之癌症，無論是在癌細胞上還是在免疫細胞上表現。III. 組合療法
本發明之另一態樣提供組合療法。包含本文所闡述之抗原結合位點之蛋白質、偶聯物及細胞可與額外治療劑組合使用以治療癌症。
可用作治療癌症之組合療法的一部分之例示性治療劑包括(例如)輻射、絲裂黴素、維A酸(tretinoin)、瑞博姆汀(ribomustin)、吉西他濱(gemcitabine)、長春新鹼(vincristine)、依託泊苷(etoposide)、克拉屈濱(cladribine)、二溴甘露醇、胺甲喋呤(methotrexate)、多柔比星(doxorubicin)、卡波醌(carboquone)、噴司他汀(pentostatin)、二胺硝吖啶(nitracrine)、淨司他汀(zinostatin)、西曲瑞克(cetrorelix)、來曲唑(letrozole)、雷替曲塞(raltitrexed)、道諾黴素(daunorubicin)、法曲唑(fadrozole)、福莫司汀(fotemustine)、胸腺法新(thymalfasin)、索布佐生(sobuzoxane)、奈達鉑(nedaplatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、比卡魯胺(bicalutamide)、長春瑞濱(vinorelbine)、維納啉酮(vesnarinone)、胺魯米特(aminoglutethimide)、安吖啶(amsacrine)、丙麩胺(proglumide)、依利醋銨(elliptinium acetate)、酮色林(ketanserin)、去氧氟尿苷、依曲替酯(etretinate)、異維A酸(isotretinoin)、鏈脲黴素(streptozocin)、尼莫司汀(nimustine)、長春地辛(vindesine)、氟他胺(flutamide)、佐吉能(drogenil)、布縮宮素(butocin)、卡莫氟(carmofur)、雷佐生(razoxane)、裂襇多糖(sizofilan)、卡鉑(carboplatin)、二溴衛矛醇、替加氟(tegafur)、異環磷醯胺、潑尼莫司汀(prednimustine)、溶鏈菌素(picibanil)、左旋咪唑(levamisole)、替尼泊苷(teniposide)、英丙舒凡(improsulfan)、依諾他濱(enocitabine)、麥角乙脲(lisuride)、羥甲烯龍(oxymetholone)、他莫昔芬(tamoxifen)、助孕酮(progesterone)、美雄烷(mepitiostane)、環硫雄醇(epitiostanol)、福美坦(formestane)、干擾素-α、干擾素-2α、干擾素-β、干擾素-γ、群落刺激因子-1、群落刺激因子-2、地尼白介素(denileukin diftitox)、介白素-2、黃體促素釋放因子及可能展現與其同源受體之差異結合以及延長或縮短的血清半衰期之上文所提及劑之變化形式。
可用作治療癌症之組合療法的一部分之另一類劑係免疫檢查點抑制劑。例示性免疫檢查點抑制劑包括抑制以下中之一或多者之劑：(i)細胞毒性T淋巴球相關抗原4 (CTLA4)、(ii)程式性細胞死亡蛋白1 (PD1)、(iii) PDL1、(iv) LAG3、(v) B7-H3、(vi) B7-H4及(vii) TIM3。CTLA4抑制劑伊匹單抗(ipilimumab)已經美國食品藥品管理局(United States Food and Drug Administration)批准用於治療黑色素瘤。
可用作治療癌症之組合療法的一部分之其他劑係靶向非檢查點靶標之單株抗體劑(例如賀癌平(herceptin))及非細胞毒性劑(例如酪胺酸激酶抑制劑)。
抗癌劑之其他類別包括(例如)：(i)選自ALK抑制劑、ATR抑制劑、A2A拮抗劑、鹼基切除修復抑制劑、Bcr-Abl酪胺酸激酶抑制劑、布魯頓氏酪胺酸激酶抑制劑(Bruton's Tyrosine Kinase Inhibitor)、CDC7抑制劑、CHK1抑制劑、週期蛋白依賴性激酶抑制劑、DNA-PK抑制劑、DNA-PK及mTOR二者之抑制劑、DNMT1抑制劑、DNMT1抑制劑加2-氯-去氧腺苷、HDAC抑制劑、Hedgehog信號傳導路徑抑制劑、IDO抑制劑、JAK抑制劑、mTOR抑制劑、MEK抑制劑、MELK抑制劑、MTH1抑制劑、PARP抑制劑、磷酸肌醇3-激酶抑制劑、PARP1及DHODH二者之抑制劑、蛋白酶體抑制劑、拓撲異構酶-II抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、VEGFR抑制劑及WEE1抑制劑之抑制劑；(ii) OX40、CD137、CD40、GITR、CD27、HVEM、TNFRSF25或ICOS之促效劑；及(iii)選自IL-12、IL-15、GM-CSF及G-CSF之細胞介素。
本發明之蛋白質亦可用作手術去除原發性病灶之輔助。
可選擇本文所揭示之蛋白質、偶聯物或細胞及額外治療劑之量以及相對投與時間以達成期望之組合治療效應。舉例而言，在向需要此投與之患者投與組合療法時，組合中之治療劑或包含該等治療劑之一或多種醫藥組合物可以任何次序來投與，諸如依序、並行、一起、同時及諸如此類。此外，舉例而言，本文所揭示之蛋白質、偶聯物或細胞可在額外治療劑發揮其預防性或治療效應之時期期間投與，或反之亦然。IV. 醫藥組合物
本揭示案亦係關於含有治療有效量之本文所闡述蛋白質之醫藥組合物。該組合物可經調配以用於多種藥物遞送系統中。該組合物中亦可包括一或多種生理學上可接受之賦形劑或載劑用於適當調配。用於本揭示案中之適宜調配物參見Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa.，第17版，1985。關於藥物遞送方法之簡短綜述，參見(例如) Langer (Science 249:1527-1533, 1990)。
在一態樣中，本揭示案提供蛋白質之調配物，其含有本文所闡述之FLT3結合位點及醫藥學上可接受之載劑。
在某些實施例中，該醫藥組合物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:1之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:2之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:10之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:13之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:10之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:17之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:10之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:22之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:26之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:30之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:9之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:34之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:37之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:38之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:41之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:42之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:45之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:42之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:49之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:42之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:60之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:61之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:68之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:69之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:72之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:73之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:76之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:77之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:85之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:90之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:14之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:94之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:95之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:96之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:104之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:105之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:107之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:108之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:115之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:116之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:123之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:124之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:125之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:126之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該調配物包括有包括抗原結合位點之蛋白質，該抗原結合位點含有重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:131之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列，且含有輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域具有與SEQ ID NO:83之胺基酸序列至少90% (例如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)一致之胺基酸序列。
該組合物可經調配以用於多種藥物遞送系統中。該組合物中可包括一或多種生理學上可接受之賦形劑或載劑用於適當調配。用於本揭示案中之適宜調配物參見Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa.，第17版，1985。關於藥物遞送方法之簡短綜述，參見(例如) Langer (Science 249:1527-1533, 1990)。
舉例而言，本揭示案可以水性醫藥調配物存在，該水性醫藥調配物在形成調配物之緩衝溶液中包括治療有效量之蛋白質。水性載劑可包括注射用無菌水(SWFI)、注射用抑菌水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。在某些實施例中，製備在pH緩衝溶液中包括本文所揭示蛋白質之水性調配物。製劑之pH通常將介於3與11之間，更佳介於5與9之間或介於6與8之間，且最佳介於7與8之間，諸如7至7.5。在以上所列舉pH中間之範圍亦意欲為本揭示案之一部分。舉例而言，意欲包括使用以上所列舉值中之任一者之組合作為上限及/或下限之值的範圍。將pH控制在此範圍內之緩衝液之實例包括乙酸鹽(例如乙酸鈉)、琥珀酸鹽(諸如琥珀酸鈉)、葡萄糖酸鹽、組胺酸、檸檬酸鹽及其他有機酸緩衝液。在某些實施例中，緩衝系統包括檸檬酸一水合物、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉二水合物及/或磷酸二氫鈉二水合物。在某些實施例中，緩衝系統包括約1.3 mg/mL檸檬酸(例如1.305 mg/mL)、約0.3 mg/mL檸檬酸鈉(例如0.305 mg/mL)、約1.5 mg/mL磷酸氫二鈉二水合物(例如1.53 mg/mL)、約0.9 mg/mL磷酸二氫鈉二水合物(例如0.86)及約6.2 mg/mL氯化鈉(例如6.165 mg/mL)。在某些實施例中，緩衝系統包括1-1.5 mg/mL檸檬酸、0.25至0.5 mg/mL檸檬酸鈉、1.25至1.75 mg/ml磷酸氫二鈉二水合物、0.7至1.1 mg/mL磷酸二氫鈉二水合物及6.0至6.4 mg/mL氯化鈉。可藉由添加醫藥學上可接受之酸及/或鹼來設定液體調配物之pH。在某些實施例中，醫藥學上可接受之酸可為鹽酸。在某些實施例中，鹼可為氫氧化鈉。
在一些實施例中，該調配物包括水性載劑，其在醫藥學上可接受(對於投與給人類而言安全且無毒)且可用於製備液體調配物。說明性載劑包括注射用無菌水(SWFI)、注射用抑菌水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。
調配物中亦可包括用作張力調節劑(tonicifier)且可穩定抗體之多元醇。將多元醇添加至調配物，其量可相對於調配物之期望等滲性而變化。在某些實施例中，水性調配物可為等滲的。所添加多元醇之量亦可相對於多元醇之分子量而改變。舉例而言，與二糖(諸如海藻糖)相比，可添加較低量之單糖(例如甘露醇)。在某些實施例中，可作為張力劑用於調配物中之多元醇係甘露醇。在某些實施例中，甘露醇濃度可為約5 mg/mL至約20 mg/mL。在某些實施例中，甘露醇之濃度可為約7.5 mg/mL至約15 mg/mL。在某些實施例中，甘露醇之濃度可為約10 mg/mL至約14 mg/mL。在某些實施例中，甘露醇之濃度可為約12 mg/mL。在某些實施例中，多元醇山梨醇可包括在調配物中。
亦可將清潔劑或表面活性劑添加至調配物中。例示性清潔劑包括非離子性清潔劑，諸如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20、80等)或泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188)。所添加清潔劑之量使得所調配抗體之聚集降低及/或使調配物中微粒之形成最小化及/或降低吸附。在某些實施例中，調配物可包括表面活性劑，其係聚山梨醇酯。在某些實施例中，調配物可含有清潔劑聚山梨醇酯80或Tween 80。Tween 80係用以描述聚氧乙烯(20)去水山梨醇單油酸酯之術語(參見Fiedler, Lexikon der Hilfsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf，第4版，1996)。在某些實施例中，調配物可含有介於約0.1 mg/mL與約10 mg/mL之間或介於約0.5 mg/mL與約5 mg/mL之間的聚山梨醇酯80。在某些實施例中，可將約0.1%聚山梨醇酯80添加於調配物中。
在某些實施例中，可將本揭示案之液體調配物製備為與穩定水準之糖組合的10 mg/mL濃度溶液。在某些實施例中，可在水性載劑中製備液體調配物。在某些實施例中，可以不大於可能造成黏度不期望或不適於靜脈內投與之量添加穩定劑。在某些實施例中，糖可為二糖，例如蔗糖。在某些實施例中，液體調配物亦可包括緩衝劑、表面活性劑及防腐劑中之一或多者，其添加至本文調配物中以減少細菌作用。添加防腐劑可(例如)有助於產生多用途(多劑量)調配物。
在一些實施例中，本揭示案提供具有延長儲放壽命之調配物，其包括本揭示案之蛋白質與甘露醇、檸檬酸一水合物、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉二水合物、磷酸二氫鈉二水合物、氯化鈉、聚山梨醇酯80、水及氫氧化鈉之組合。
去醯胺係肽及蛋白質之常見產物變異體，其可在發酵、收穫/細胞澄清、純化、原料藥/藥物產品儲存期間及樣品分析期間發生。去醯胺係自蛋白質損失NH3，從而形成琥珀醯亞胺中間體，其可經歷水解。琥珀醯亞胺中間體使得母體肽之質量減少17道耳頓。隨後之水解使得質量增加18道耳頓。由於在水性條件下不穩定，故難以分離琥珀醯亞胺中間體。因此，去醯胺通常可根據1道耳頓質量增加而偵測到。天冬醯胺之去醯胺產生天冬胺酸或異天冬胺酸。影響去醯胺速率之參數包括pH、溫度、溶劑介電常數、離子強度、一級序列、局部多肽構形及三級結構。肽鏈中毗鄰Asn之胺基酸殘基影響去醯胺速率。蛋白質序列中Asn後之Gly及Ser使得更易於發生去醯胺。在某些實施例中，本揭示案之液體調配物可在防止蛋白質產品去醯胺之pH及濕度條件下保藏。
在一些實施例中，調配物係凍乾調配物。在某些實施例中，調配物經冷凍乾燥(凍乾)且含於約12至60個小瓶中。在某些實施例中，調配物經冷凍乾燥，且45 mg之冷凍乾燥調配物可含於一個小瓶中。在某些實施例中，約40 mg至約100 mg之冷凍乾燥調配物含於一個小瓶中。在某些實施例中，將來自12個、27個或45個小瓶之冷凍乾燥調配物合併以在靜脈內藥物調配物中獲得治療劑量之蛋白質。調配物可為液體調配物。在一些實施例中，液體調配物以約250 mg/小瓶至約1000 mg/小瓶儲存。在某些實施例中，液體調配物以約600 mg/小瓶儲存。在某些實施例中，液體調配物以約250 mg/小瓶儲存。
在一些實施例中，凍乾調配物包括本文所闡述之蛋白質及凍乾保護劑。凍乾保護劑可為糖，例如二糖。在某些實施例中，凍乾保護劑可為蔗糖或麥芽糖。凍乾調配物亦可包括緩衝劑、表面活性劑、增積劑及/或防腐劑中之一或多者。可用於穩定凍乾藥物產品之蔗糖或麥芽糖的量可為至少1:2之蛋白質對蔗糖或麥芽糖之重量比。在某些實施例中，蛋白質對蔗糖或麥芽糖之重量比可為1:2至1:5。
在某些實施例中，在凍乾之前，可藉由添加醫藥學上可接受之酸及/或鹼來設定調配物之pH。在某些實施例中，醫藥學上可接受之酸可為鹽酸。在某些實施例中，醫藥學上可接受之鹼可為氫氧化鈉。在凍乾之前，可將含有本揭示案之蛋白質之溶液pH調整為介於6至8之間。在某些實施例中，凍乾藥物產品之pH範圍可為7至約8。
在某些實施例中，可添加「增積劑」。「增積劑」係增加凍乾混合物之質量且促成凍乾餅之物理結構(例如有助於產生維持開孔結構的基本上均勻之凍乾餅)之化合物。說明性增積劑包括甘露醇、甘胺酸、聚乙二醇及山梨醇。本發明之凍乾調配物可含有此等增積劑。
在某些實施例中，利用水性載劑組構凍乾之蛋白質產品。本文之相關水性載劑係在醫藥學上可接受(例如對於投與給人類而言安全且無毒)且在凍乾後可用於製備液體調配物者。說明性稀釋劑包括注射用無菌水(SWFI)、注射用抑菌水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。在某些實施例中，利用注射用無菌水USP (SWFI)或0.9%氯化鈉注射液USP重構本揭示案之凍乾藥物產品。在重構期間，將凍乾粉末溶解至溶液中。在某些實施例中，將本揭示案之凍乾蛋白質產品組構至約4.5 mL注射用水中且用0.9%鹽水溶液(氯化鈉溶液)稀釋。
蛋白質組合物可藉由習用滅菌技術來滅菌，或可經無菌過濾。所得水溶液可經包裝以按原樣使用或凍乾，在投與之前將凍乾製劑與無菌水性載劑合併。可將呈固體形式之所得組合物包裝於多個單一劑量單元中，每一單元含有固定量之上文所提及之一或多種劑。亦可將呈固體形式之組合物包裝於容器中以獲得靈活量。
可改變本發明之醫藥組合物中活性成分之實際劑量水準，以獲得對於特定患者、組合物及投與模式有效達成期望治療反應而對患者無毒性之活性成分量。
具體劑量可為用於每一患者之統一劑量，例如50-5000 mg蛋白質。或者，可針對患者之近似體重或表面積調整患者之劑量。確定適當劑量之其他因素可包括欲治療或預防之疾病或疾患、疾病之嚴重程度、投與途徑以及患者之年齡、性別及醫學狀況。熟習此項技術者以常規方式、尤其根據本文所揭示之劑量資訊及分析對為確定用於治療之適當劑量所必需的計算進行進一步精緻化(refinement)。亦可經由使用與適當劑量-反應資料結合使用的確定劑量之已知分析來確定劑量。可在監測疾病之進展時調整個別患者之劑量。可量測患者中可靶向構築體或複合物之血液水準，以瞭解是否需要調整劑量以達到或維持有效濃度。可使用藥物基因體學來確定哪些可靶向構築體及/或複合物及其劑量最有可能對給定個體有效(Schmitz等人，Clinica.  Chimica. Acta. 308: 43-53, 2001；Steimer等人，Clinica. Chimica. Acta. 308: 33-41, 2001)。
一般而言，基於體重之劑量為約0.01 μg/kg體重至約100 mg/kg體重，諸如約0.01 μg/kg體重至約100 mg/kg體重、約0.01 μg/kg體重至約50 mg/kg體重、約0.01 μg/kg體重至約10 mg/kg體重、約0.01 μg/kg體重至約1 mg/kg體重、約0.01 μg/kg體重至約100 μg/kg體重、約0.01 μg/kg體重至約 50 μg/kg體重、約0.01 μg/kg體重至約10 μg/kg體重、約0.01 μg/kg體重至約1 μg/kg體重、約0.01 μg/kg體重至約0.1 μg/kg體重、約0.1 μg/kg體重至約100 mg/kg體重、約 0.1 μg/kg體重至約50 mg/kg體重、約0.1 μg/kg體重至約10 mg/kg體重、約0.1 μg/kg體重至約1 mg/kg體重、約0.1 μg/kg體重至約100 μg/kg體重、約0.1 μg/kg體重至約10 μg/kg體重、約0.1 μg/kg體重至約1 μg/kg體重、約1 μg/kg體重至約100 mg/kg體重、約1 μg/kg體重至約50 mg/kg體重、約1 μg/kg體重至約10 mg/kg體重、約1 μg/kg體重至約1 mg/kg體重、約1 μg/kg體重至約100 μg/kg體重、約1 μg/kg體重至約50 μg/kg體重、約1 μg/kg體重至約10 μg/kg體重、約10 μg/kg體重至約100 mg/kg體重、約10 μg/kg體重至約50 mg/kg體重、約10 μg/kg體重至約10 mg/kg體重、約10 μg/kg體重至約1 mg/kg體重、約10 μg/kg體重至約100 μg/kg體重、約10 μg/kg體重至約50 μg/kg體重、約50 μg/kg體重至約100 mg/kg體重、約50 μg/kg體重至約50 mg/kg體重、約50 μg/kg體重至約10 mg/kg體重、約50 μg/kg體重至約1 mg/kg體重、約50 μg/kg體重至約100 μg/kg體重、約100 μg/kg體重至約100 mg/kg體重、約100 μg/kg體重至約50 mg/kg體重、約100 μg/kg體重至約10 mg/kg體重、約100 μg/kg體重至約1 mg/kg體重、約1 mg/kg體重至約100 mg/kg體重、約1 mg/kg體重至約50 mg/kg體重、約1 mg/kg體重至約10 mg/kg體重、約10 mg/kg體重至約100 mg/kg體重、約10 mg/kg體重至約50 mg/kg體重、約50 mg/kg體重至約100 mg/kg體重。 劑量可每天、每週、每月或每年給予一次或多次，或甚至每2至20年給予一次。熟習此項技術者基於所量測之可靶向構築體或複合物在體液或組織中之滯留時間及濃度可容易地估計投藥之重複率。本發明之投與可為靜脈內、動脈內、腹膜內、肌內、皮下、胸膜內、鞘內、腔內、藉由經由導管灌注或藉由直接病灶內注射。此可每天投與一次或多次、每週投與一次或多次、每月投與一次或多次且每年投與一次或多次。
上述說明闡述本發明之多個態樣及實施例。本專利申請案明確地審慎考慮該等態樣及實施例之所有組合及排列。
在整個本說明書中，倘若將組合物闡述為具有、包括或包含特定組分或倘若將製程及方法闡述為具有、包括或包含特定步驟，則經審慎考慮，另外存在基本上由所列舉之組分組成或由其組成的本發明組合物且存在基本上由所列舉之處理步驟組成或由其組成的本發明製程及方法。
在本申請案中，倘若稱要素或組分包括在所列舉之要素或組分之列表中及/或選自其中，則應理解，該要素或組分可為所列舉要素或組分中之任一者，或該要素或組分可選自由所列舉之要素或組分中之兩者或更多者組成之群。
此外，應理解，在不背離本發明之精神及範圍的情形下，本文所闡述之組合物或方法之要素及/或特徵可以多種方式組合，無論其在本文中係明確的還是隱含的。舉例而言，在提及特定化合物之情形下，除非自上下文中另有理解，否則該化合物可用於本發明之組合物之各個實施例及/或本發明之方法中。換言之，在本申請案內，已以能夠寫出並繪製清晰且簡明申請案之方式闡述並繪示實施例，但意欲且應瞭解的是，可在不脫離本教示及一或多個發明之情形下對實施例進行各種組合或分離。舉例而言，應瞭解，本文所闡述並繪示之所有特徵均可適用於本文所闡述並繪示之該(等)發明之所有態樣。
應理解，除非自上下文及使用中另有理解，否則表述「……中之至少一者」個別地包括在該表述之後的所列舉對象中之每一者及所列舉對象中之兩者或更多者之各種組合。除非自上下文中另有理解，否則連接三種或更多種所列舉對象之表述「及/或」應理解為具有相同含義。
除非自上下文中另有明確說明或理解，否則使用術語「包括(include、includes、including)」、「具有(have、has、having)」、「含有(contain、contains或containing)」、包括其文法等效形式應通常理解為開放式的及非限制性的，例如不排除其他未列舉之要素或步驟。
除非另有明確說明，否則倘若在定量值前面使用術語「約」，則本發明亦包括該具體定量值自身。除非另有指示或推斷，否則如本文所用，術語「約」係指自標稱值之±10%變化。
應理解，只要本發明保持可操作，則各步驟之次序或執行某些動作之次序並不重要。此外，可同時進行兩個或更多個步驟或動作。
本文中使用任何及所有實例或例示性語言(例如「諸如」或「包括」)僅意欲更佳地闡明本發明，且除非主張，否則不對本發明之範圍加以限制。本說明書中之語言均不應解釋為指示任何未主張之要素對於本發明之實踐係必不可少的。 實例
以下實例僅為說明性的且不意欲以任何方式限制本發明之範圍或內容。實例 1. 對所選雜交瘤純系上清液之表徵
藉由利用hFLT3-His融合蛋白對小鼠實施免疫來產生FLT3特異性抗體。藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)評價228種雜交瘤之上清液的FLT3結合，且96種雜交瘤非共價地結合至hFLT3-His蛋白質。基於初步生物層干涉術(BLI)結合親和力估計、與表現FLT3之人類及食蟹猴細胞之結合及抗原決定基之多樣性選擇11種純系。藉由高解析度表面電漿子共振(SPR)進一步分析該11種純系結合hFLT3-His之能力。使用Biacore 8K儀器在37℃下實施實驗以模擬生理溫度。Biacore感測圖及動力學參數呈現於表4中且原始資料及擬合示於圖 1 中。11種雜交瘤中有7種以小於10 nM之KD 結合，且5種展示緩慢解離速率常數(k d ＜5 × 10-4 s-1 )。
由BLI使用OctetRed384 (ForteBio)實施雜交瘤融合物與參考mAb之分倉。簡言之，將雜交瘤上清液裝載至抗小鼠IgG捕獲感測器尖端上達15分鐘且於PBSF中平衡5分鐘。將感測器浸入200 nM hFLT3-His中且使其締合180秒，之後浸入100 nM對照IgG或200 nM FTL3配位體溶液中。反應單位之增加指示雜交瘤不為參考mAb之競爭者，而信號不增加則指示雜交瘤確實與參考mAb競爭。FL23 (Amgen)及FL39 (Amgen)結合至結構域1。EB10 (ImClone)係已知之FLT3配位體阻斷劑，其結合至結構域3。FL61 (Amgen)亦結合至結構域3，但不為FLT3配位體阻斷劑。4G8 (Synimmune)結合至結構域4。NC7 (Imclone)結合至結構域5。該等參考抗體之VH及VL序列提供於表3中。 表3. 參考抗體
α-FLT3 mAb VH VL
4G8 (Synimmune)，揭示於美國申請公開案第2015/0119555A1號中 QVQLQQPGAELVKPGASLKLSCKSSGYTFTSYWMHWVRQRPGHGLEWIGEIDPSDSYKDYNQKFKDKATLTVDRSSNTAYMHLSSLTSDDSAVYYCARAITTTPFDFWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:135) DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGVYFCQQSNTWPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO:136)
EB10 (ImClone/Lilly)，揭示於美國申請公開案第2011/0008355A1號中 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGVGAHDAFDIWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:137) DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGNNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSDTDFTLQISRVEAEDVGVYYCMQGTHPAISFGQGTRLEIK (SEQ ID NO:138)
NC7 (Imclone/Lilly)，揭示於美國申請公開案第2011/0008355A1號中 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATFALFGFREQAFDIWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:139) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDLATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK (SEQ ID NO:140)
FL23 (Amgen)，揭示於美國申請公開案第2017/0037149A1號中 QVTLKESGPALVKPTETLTLTCTVSGFSFRNARMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSNDEKSYSTSLKSRLTISKDTSKSQVVLTLTNMDPVDTATYFCARMPEYSSGWSGAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:141) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGYDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLIISSLQPEDFATYYCLQHNSFPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:142)
FL39 (Amgen)，揭示於美國申請公開案第2017/0037149A1號中 QVTLKESGPTLVKPTETLTLTCTLSGFSLNNARMGVSWIRQPPGKCLEWLAHIFSNDEKSYSTSLKNRLTISKDSSKTQVVLTMTNVDPVDTATYYCARIVGYGSGWYGFFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:143) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPLTFGCGTKVEIK (SEQ ID NO:144)
FL61 (Amgen)，揭示於美國申請公開案第2017/0037149A1號中 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNEFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGEITMVRGVIGYYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:145) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPLTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:146)
據觀察，自五種雜交瘤(亦即4A4、11F4、1A2、4H2及13C9)產生之抗體不與任一參考抗體競爭結合至hFLT3-His。藉由量測抗體與表現cFLT3之同基因型RMA細胞之結合評估與食蟹猴FLT3 (cFLT3)之交叉反應性。
簡言之，利用編碼cFLT3或人類FLT3 (hFLT3)之反轉錄病毒載體轉導RMA細胞。如下實施來自粗製雜交瘤收穫物之α-FLT3 mAb與hFLT3或cFLT3同基因型細胞株以及FLT3+癌細胞株之結合。在96孔圓底板之每孔中添加100,000個RMA、REH或SEM細胞。使細胞旋轉沈降且藉由渦旋使團粒輕輕解離。在每孔中添加50 µL Zombie活/死染料(PBS + 1:2000染料)且在室溫下於黑暗中培育20分鐘。用200 µL FACS緩衝液(PBS + 2% FBS)洗滌細胞。將50 µL雜交瘤上清液添加至經洗滌細胞中，且使混合物在冰上於黑暗中培育30分鐘。將細胞洗滌一次，且接著添加50 µL抗小鼠Fc-PE二級試劑(1:200稀釋)並在冰上於黑暗中培育20分鐘。洗滌細胞並用50 µL之4%多聚甲醛在冰上固定15分鐘。再次洗滌細胞，且接著重新懸浮於200 µL FACS緩衝液中並在4℃下儲存直至準備採集。在裝配有HTS (高通量進樣器)之BD FACSCelesta上運行樣品。
亦量測雜交瘤上清液與REH癌細胞(ATCC目錄號CRL-8286，一種據報導表現FLT3之人類ALL細胞株)之結合親和力。如表4中所示，大多數純系展示與表現hFLT3之癌細胞之結合親和力及與cFLT3之交叉反應性。未收集14A5及15A11之食蟹猴FLT3結合資料。表 4. FLT3-His 與自候選雜交瘤所產生抗體之結合動力學參數及親和力
檢品 分倉特性 在37℃ 下之SPR 細胞結合MFI
k a (1/Ms) k d (1/s) KD (nM) RMA-hFLT3 RMA-cFLT3 REH
4A4 獨特 3.38 × 105 3.35 × 10-4 1.0 1493 2002 2002
11F4 獨特 1.73 × 105 1.88 × 10-4 1.1 305 495 495
12H10 4G8 1.74 × 105 3.43 × 10-4 2.0 544 696 696
15A11 EB10 4.99 × 105 1.17 × 10-4 2.3 332 n/a n/a
12C9 FL23 5.67 × 104 3.11 × 10-4 5.4 1020 3937 664
1A2 獨特 1.14 × 105 7.49 × 10-4 6.5 238 461 461
14A5 FL23 1.70 × 105 1.49 × 10-3 8.7 1005 n/a 2071
4H2 獨特 8.05 × 104 9.18 × 10-4 11 570 1017 1017
13C9 獨特 2.12 × 105 3.02 × 10-3 14 546 834 834
8F02 FL23 1.67 × 105 2.80 × 10-3 17 829 2729 2271
14H08 FL23 1.29 × 105 2.40 × 10-3 19 959 3074 1776
實例 2. 對經純化之抗 FLT3 鼠類抗體之分析
基於上文所呈現之分析，選擇8種雜交瘤(4A4、11F4、12H10、15A11、12C09、1A2、14A5、4H2)用於亞選殖及測序。自每一親代雜交瘤產生兩種亞純系並對其進行分析。確定來自每一雜交瘤之序列係唯一的。自雜交瘤培養物純化每一亞純系，且如圖 2 中所示藉由SPR確認與hFLT3-His之結合。hFLT3與經純化之鼠類亞選殖mAb之動力學常數及結合親和力示於表5中。使用實例1中所闡述之方法進行與參考抗體之分倉，且四種抗體(亦即4A4.A3、11F4.B9、1A2.A3及4H2.E3)不與任一參考抗體競爭結合至hFLT3-His。表 5 ： hFLT3 與經純化之鼠類亞純系之結合動力學參數及親和力
檢品 k a (1/Ms) k d (1/s) KD ，(nM)
1A2.A3 1.1 × 105 8.9 × 10-4 8.5
4A4.A3 1.1 × 105 8.2 × 10-4 7.3
4H2.E3 5.7 × 104 1.0 × 10-3 17.6
11F4.B9 1.5 × 105 2.5 × 10-4 1.7
12C9.E5 3.4 × 104 6.3 × 10-4 18.7
12H10.G7 1.0 × 105 5.5 × 10-4 5.4
14A5.E8 1.3 × 105 1.9 × 10-3 15.1
15A11.C8 4.5 × 104 4.8 × 10-4 10.5
利用表現人類及食蟹猴FLT3之同基因型RMA細胞株確認經純化之亞選殖mAb之細胞結合。除12C9.E5外，所有純系均結合至細胞表面表現之人類及食蟹猴FLT3 (表6)。類似地，所有亞純系均以高親和力結合至SEM (DSMZ目錄號ACC 546，一種據報導表現FLT3之人類ALL細胞株)。表 6 ：經純化之小鼠 mAb 與人類及食蟹猴 FLT3 RMA 細胞株之細胞結合確認
檢品 RMA-hFLT3 EC50 (nM) RMA-hFLT3 最大MFI RMA-cFLT3 EC50 (nM) RMA-cFLT3 最大MFI SEM EC50 (nM) SEM 最大MFI
1A2.A3 0.80 499 1.82 2834 5.47 1361
4A4.A3 0.72 1021 1.07 5566 3.29 2352
4H2.E3 0.66 696 1.56 3454 7.57 1510
11F4.B9 0.53 493 1.23 2589 2.43 1141
12C9.E5 NB* NB NB NB NB NB
12H10.G7 0.36 1136 0.94 5262 3.20 2831
14A5.E8 約2.07 415 1.25 1779 約1.07 1956
15A11.C8 0.41 1406 0.82 6512 約1.13 3861
實例 3. 所選抗 FLT3 鼠類抗體之配位體阻斷性質
此實例經設計以表徵所選抗FLT3鼠類抗體阻斷FLT3與FLT3配位體之相互作用之能力。在添加飽和濃度之可溶性FLT3配位體之前及之後測試α-FLT3 mAb結合表現FLT3之EOL-1癌細胞(DSMZ目錄號ACC 386)之能力。對於每一抗體，將其配位體阻斷值百分比計算為相對於在不存在所指示FLT3配位體之情形下所獲得的mAb結合信號，在存在FLT3配位體之情形下所獲得的mAb結合信號之降低。使用已知FLT3配位體阻斷劑EB10 mAb作為陽性對照。如圖 3 中所示，12H10.G7、11F4.B9及4A4.A3、14A5.E8抗體不干擾FLT3與FLT3配位體之結合，而15A11.C8抗體則阻斷FLT3配位體與FLT3之結合。實例 4. 假定序列不利因素分析
檢查12H10.G7、11F4.B9及4A4.A3、14A5.E8抗體之CDR (根據Chothia鑑別)中之潛在序列不利因素。考慮以下潛在不利因素：M (潛在氧化位點)；NG、NS及NT序列基元(潛在去醯胺位點)；DG、DS及DT序列基元(潛在異構化位點)；DP序列基元(化學水解之潛在位點)。結果彙總於表7中。表 7. 所選鼠類 mAb 之 CDR 中之假定序列不利因素
純系ID 潛在序列不利因素基元 序列不利因素基元之位置
12H10.G7 DS (異構化位點) CDRH3
14A5.E8 M (氧化位點) CDRL1
11F4.B9    M (氧化位點)、NS (去醯胺) CDRL1
DP (化學水解) CDRL3
4A4.A3 無   
另外，亦鑑別出根據Kabat屬於12H10.G7之CDRH1內的M34處之假定序列不利因素。設計該等抗體之變異體以去除假定序列不利因素基元。實例 5. 人類化及親和力成熟
基於所收集的關於重組hFLT3蛋白之動力學及親和力、與表現人類及食蟹猴FLT3之細胞株之結合、與不同AML及ALL癌細胞之結合、分倉特性以及不抑制人類FLT3配位體結合之資料，選擇四種小鼠雜交瘤亞純系(亦即12H10.G7、11F4.B9、4A4.A3及14A5.E8)進行人類化。儘管4A4.A3及14A5.E8顯示對hFLT3之親和力略低於12H10.G7及11F4.B9，但該等抗體似乎分別結合至獨特抗原決定基(不與參考抗體交叉阻斷)及FLT3之結構域1，且因此對其進一步分析以探索抗原決定基多樣性。
使12H10.G7抗體人類化以產生如上文所闡述之GB94及GB102，其共有相同之VH及VL序列。將回復突變引入框架區中以產生變異體GB87至GB93及GB95至GB101。
使11F4.B9抗體人類化以產生如上文所闡述之1153及1154，其共有相同之VH及VL序列。將回復突變引入框架區中以產生變異體1151及1152。亦使1153抗體經受親和力成熟。簡言之，設計針對1553 FLT3 scFv之CDR之文庫且在酵母表面上展示。藉由使酵母與生物素化之人類FLT3-His抗原一起培育實施兩次FACS選擇。將FACS富集之輸出樣品與其他CDR突變體合併以得到第二文庫。藉由利用生物素化之人類FLT3-His自100 nM滴定至1 nM再實施兩輪FACS選擇。在10 nM下實施分選，其中與親代相比，觀察到文庫之信號明顯增加。將經分選之酵母純系平鋪並進行篩選。實例 6. 抗體與表現人類癌症抗原之細胞的結合之評價
使用異位表現人類及食蟹猴FLT3之同基因型細胞株評價人類與食蟹猴FLT3之間的交叉反應性。使用表現hFLT3或cFLT3之人類癌細胞株RMA評價FLT3結合抗體之腫瘤抗原結合。使用人類AML細胞株MOLM-13及MV4-11以及人類ALL細胞株REH評價抗體之結合能力。特定而言，使用表現FLT3-T227M之MOLM-13細胞評價抗FLT3抗體結合突變FLT3之能力。
將1158 mAb (呈人類IgG1形式的自12H10.G7人類化之單株抗體)稀釋且與各別細胞一起培育。接著使細胞與螢光團結合之抗人類IgG二級抗體一起培育且藉由流式細胞術進行分析。針對僅二級抗體對照對平均螢光強度(MFI)值進行正規化，以獲得背景倍數(FOB)值。
如圖 4A 及圖 4B 中所示，1158 mAb以等效功效結合異位表現人類及食蟹猴FLT3之RMA細胞。如圖 4C 中所示，1158 mAb結合REH細胞，該等細胞係人類ALL細胞。如圖 5 中所示，1158 mAb結合MOLM-13細胞，該等細胞表現FLT3-T227M。
亦使用類似方法，使用表現FLT3-ITD之MV4-11細胞評價抗FLT3抗體結合突變FLT3之能力。據觀察，源自1158 mAb之含有呈scFv形式的抗原結合位點之雙特異性抗體結合MV4-11細胞。實例 7. 抗體內化之評價
使用源自嗜酸性球性白血病之EOL-1人類癌細胞株評價在與1158 mAb一起培育後對FLT3之內化。使一式兩份板中之EOL-1細胞與1158 mAb或hIgG1同型對照抗體一起在37℃下培育2小時。培育後，洗滌細胞且使用非競爭性抗FLT3抗體對總FLT3進行染色。如下計算FLT3之內化： 內化%= (1-(2小時樣品MFI /2小時hIgG1同型MFI)) × 100%
如使用上述方法所量測，在與1158 mAb一起培育後，REH細胞對FLT3之內化為約8.27%。如使用上述方法所量測，在與1158 mAb一起培育後，EOL-1細胞對FLT3之內化為約8.30%。實例 8. 原代人類 NK 細胞細胞毒性分析
藉由DELFIA細胞毒性分析量測靶細胞之溶解。簡言之，自培養物中收穫表現FLT3之人類癌細胞株，用HBS洗滌，且以106 /mL重新懸浮於生長培養基中以用BATDA試劑(Perkin Elmer C136-100)進行標記。遵循製造商說明書來標記靶細胞。標記後，將細胞用HBS洗滌三次，且以0.5-1.0×105 /mL重新懸浮於培養基中。將100 µl BATDA標記之細胞添加至96孔板之每一孔中。於培養基中稀釋1158 mAb，且將50 µl經稀釋之mAb添加至每一孔中。
為製備NK細胞，使用密度梯度離心自人類外周血膚色血球層中分離PBMC，洗滌且準備用於NK細胞分離。利用磁珠使用負向選擇技術分離NK細胞。所分離之NK細胞之純度通常＞90% CD3-CD56+。使經分離之NK細胞靜置隔夜且自培養物中收穫。接著將該等細胞洗滌且以105 -2.0×106 /mL之濃度重新懸浮於培養基中以達到5:1之效應物對靶標(E:T)比率。將50 µl NK細胞添加至板之每一孔中以達到總計200 µl之培養體積。使板在37℃及5% CO2 下培育2-3小時。
培育後，將板自培育器中移除且藉由在200 ×g下離心5分鐘使細胞團粒化。將20 µl培養上清液轉移至清潔微量板中，且將200 µl室溫銪溶液(Perkin Elmer C135-100)添加至每一孔中。使板避光且在板振盪器上以250 rpm培育15分鐘，接著使用SpectraMax i3X儀器讀取。
在不存在NK細胞之情形下培育的靶細胞中量測與銪形成螢光螯合物之物質之自發釋放。在經1% Triton-X溶解之靶細胞中量測此物質之最大釋放。如下計算特異性溶解%： 特異性溶解%= ((實驗釋放- 自發釋放) / (最大釋放-自發釋放)) * 100%。
圖 6A 至圖 6D 顯示1158 mAb增強原代NK細胞介導之殺死人類AML或ALL細胞株EOL-1 (圖 6A )、Reh (圖 6B )、RS4-11 (圖 6C )及MV4-11 (圖 6D )之活性。1158 mAb以劑量依賴性方式提高NK細胞殺死靶細胞之能力。實例 9. TriNKET 或 mAb 與全人類血之結合之評價
評價1158 mAb結合不同類型的血球之能力。簡言之，使人類全血與1158 mAb或人類IgG1同型對照抗體一起培育。藉由流式細胞術分析血球且使用螢光團結合之抗人類IgG二級抗體偵測1158 mAb或同型對照抗體之結合。
未觀察到1158 mAb 與血液中之顆粒球、單核球、B細胞、NK細胞、CD8+ T細胞及CD4+ T細胞之顯著結合。實例 10. FLT3 信號傳導之活化
藉由pFLT3 ELISA (R&D Systems DYC368)量測FLT3之磷酸化，其為FLT3信號傳導之標誌。將EOL-1細胞平鋪於96孔圓底板中。添加1158 mAb及/或FLT3L。使樣品在室溫下培育5分鐘且立即在300 ×g下團粒化5分鐘。將細胞用PBS洗滌兩次。使細胞團粒重新懸浮於200 µL 9號溶解緩衝液中且在冰上培育15分鐘。使樣品在2000 ×g下團粒化5分鐘，且將上清液轉移至清潔試管中。使用BCA總蛋白質分析對蛋白質濃度進行量化。若適當，將樣品稀釋於12號IC稀釋劑中。根據製造商之說明書量測溶解物。藉由自所導出之標準曲線中內插值確定每一樣品中之pFLT3濃度。將已知標準品之光學密度值對其各別濃度進行作圖且將數據擬合至線性回歸模型。
如圖 7A 中所示，FLT3L使pFLT3水準增加至3倍，而1158 mAb不誘導顯著之FLT3磷酸化。圖 7B 顯示，當使細胞同1158 mAb與FLT3L之組合一起培育時，1158 mAb不抑制FLT3L誘導之FLT3磷酸化。該等結果與1158 mAb不與FLT3L競爭結合FLT3之觀察結果一致。 以引用方式併入
除非說明相反情形，否則本文所提及之每一專利文件及科學論文之全部揭示內容出於所有目的均係以引用的方式併入。 等效內容
在不背離本發明之精神或基本特徵之情形下，本發明可以其他具體形式體現。因此，應在所有方面將前述實施例視為說明性而非限制本文所闡述之本發明。本發明之範圍由此由隨附申請專利範圍而非由前述說明來指示，且本發明意欲囊括歸屬於申請專利範圍之等效內容的含義及範圍內之所有變化。
參考以下圖式可更全面地理解本發明。
圖 1 係一組感測圖，其顯示自與hFLT3結合之鼠類雜交瘤上清液收集的抗體之SPR譜。圖 2 係一組感測圖，其顯示自與hFLT3結合之鼠類mAb亞純系收集的抗體之SPR譜。圖 3 係條形圖，其繪示飽和濃度之可溶性FLT3配位體降低候選抗體結合表現FLT3之EOL-1癌細胞之能力。圖 4A 至圖 4C 係線形圖，其顯示抗FLT3抗體1158與表現FLT3之細胞株RMA-hFLT3 (圖 4A )、RMA-cFLT3 (圖 4B )及REH (圖 4C )之結合。圖 5 係線形圖，其顯示抗FLT3抗體1158與表現帶有T227M突變的FLT3之MOLM-13細胞之結合。圖 6A 至圖 6D 係條形圖，其顯示在TriNKET F3’-1158及其親代單株抗體存在下，NK細胞介導的對表現FLT3之癌細胞株EOL-1 (圖 6A )、REH (圖 6B )、RS4-11 (圖 6C )及MV4-11 (圖 6D )之溶解。圖 7A 至圖 7B 係條形圖，其顯示在FLT3配位體不存在(圖 7A )或存在(圖 7B )下，TriNKET F3’-1158及其親代單株抗體所引起之FLT3磷酸化。圖7A中之FLT3配位體樣品用作陽性對照。
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Claims (41)

  1. 一種結合FLT3之抗原結合位點，其包含：(a)重鏈可變結構域(VH)，其包含：分別包含SEQ ID NO：11、4及55之胺基酸序列之互補決定區1(CDR1)、互補決定區2(CDR2)及互補決定區3(CDR3)；及(b)輕鏈可變結構域(VL)，其包含：分別包含SEQ ID NO：6、7及8之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
  2. 如請求項1之抗原結合位點，其中該VH之該CDR3包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
  3. 如請求項1之抗原結合位點，其中：(i)該VH包含與SEQ ID NO：37至少90%一致之胺基酸序列，且該VL包含與SEQ ID NO：38至少90%一致之胺基酸序列；或(ii)該VH包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列。
  4. 如請求項3之抗原結合位點，其中該VH及該VL分別包含SEQ ID NO：9及10；13及10；17及10；9及22；9及26；9及30；9及34；37及38；41及42；45及42；或49及42之胺基酸序列。
  5. 一種結合FLT3之抗原結合位點，其包含：(a)VH，其包含：分別包含SEQ ID NO：59、63及54之胺基酸序 列之CDR1、CDR2及CDR3；及(b)VL，其包含：分別包含SEQ ID NO：86、66及67之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
  6. 如請求項5之抗原結合位點，其中(i)該VH分別包含SEQ ID NO：78、63、79之CDR1、CDR2及CDR3，且該VL分別包含SEQ ID NO：80、66、67之CDR1、CDR2及CDR3；(ii)該VH分別包含SEQ ID NO：62、63、64之CDR1、CDR2及CDR3，且該VL分別包含SEQ ID NO：65、66、67之CDR1、CDR2及CDR3；或(iii)該VH包含與SEQ ID NO：76至少90%一致之胺基酸序列，且該VL包含與SEQ ID NO：77至少90%一致之胺基酸序列。
  7. 如請求項5之抗原結合位點，其中該VH包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列，且該VL包含SEQ ID NO：84之胺基酸序列。
  8. 如請求項7之抗原結合位點，其中該VH及該VL分別包含SEQ ID NO：68及69；72及73；或76及77之胺基酸序列。
  9. 一種結合FLT3之抗原結合位點，其包含：(i)VH，其包含：分別包含SEQ ID NO：87、88及89之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及VL，其包含：分別包含SEQ ID NO：91、92及93之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；或 (ii)VH，其包含：分別包含SEQ ID NO：97、99及100之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3；及VL，其包含：分別包含SEQ ID NO：101、102及103之胺基酸序列之CDR1、CDR2及CDR3。
  10. 一種抗原結合位點，其與如請求項9之抗原結合位點競爭。
  11. 如請求項1之抗原結合位點，其中如藉由表面電漿子共振(SPR)所量測，該抗原結合位點以小於或等於20nM之解離常數(KD)結合人類FLT3。
  12. 如請求項1之抗原結合位點，其中藉由SPR所量測，該抗原結合位點以小於或等於10nM之KD結合人類FLT3。
  13. 如請求項1之抗原結合位點，其中該抗原結合位點結合包含SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：25之胺基酸序列之人類FLT3變異體。
  14. 如請求項1之抗原結合位點，其中該抗原結合位點結合食蟹猴FLT3。
  15. 如請求項1之抗原結合位點，其中該抗原結合位點係以單鏈可變區片段(scFv)形式存在。
  16. 如請求項15之抗原結合位點，其中該scFv包含選自SEQ ID NO：3、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、70、71、74、75、81及82之胺基酸序列。
  17. 一種蛋白質，其包含如請求項1-16中任一項之抗原結合位點。
  18. 如請求項17之蛋白質，其進一步包含抗體重鏈恆定區。
  19. 如請求項18之蛋白質，其中該抗體重鏈恆定區係人類IgG重鏈恆定區。
  20. 如請求項19之蛋白質，其中(i)該抗體重鏈恆定區之每一多肽鏈包含與SEQ ID NO：21至少90%一致之胺基酸序列；(ii)該抗體重鏈恆定區之至少一條多肽鏈相對於SEQ ID NO：21在一或多個選自Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411及K439之位置處包含一或多個突變，該等位置係根據EU編號系統進行編號；(iii)該抗體重鏈恆定區之至少一條多肽鏈相對於SEQ ID NO：21包含一或多個選自Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、 K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D及K439E之突變，該等突變係根據EU編號系統進行編號；或(iv)該抗體重鏈恆定區之一條多肽鏈相對於SEQ ID NO：21在一或多個選自Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411及K439之位置處包含一或多個突變；且該抗體重鏈恆定區之另一條多肽鏈相對於SEQ ID NO：21在一或多個選自Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、D401、F405、Y407、K409、T411及K439之位置處包含一或多個突變，該等位置係根據EU編號系統進行編號。
  21. 如請求項20之蛋白質，其中該抗體重鏈恆定區之一條多肽鏈相對於SEQ ID NO：21包含K360E及K409W取代；且該抗體重鏈恆定區之另一條多肽鏈相對於SEQ ID NO：21包含Q347R、D399V及F405T取代，該等取代係根據EU編號系統進行編號。
  22. 如請求項20之蛋白質，其中該抗體重鏈恆定區之一條多肽鏈相對於SEQ ID NO：21包含Y349C取代；且該抗體重鏈恆定區之另一條多肽鏈相對於SEQ ID NO：21包含S354C取代，該等取代係根據EU編號系統進行編號。
  23. 一種抗體-藥物偶聯物，其包含如請求項17之蛋白質及藥物部分。
  24. 如請求項23之抗體-藥物偶聯物，其中該藥物部分係選自由以下組成之群：奧裡斯他汀(auristatin)、N-乙醯基-γ卡奇黴素(N-acetyl-γ calicheamicin)、類美登素(maytansinoid)、吡咯并苯并二氮呼及SN-38。
  25. 一種免疫細胞介素，其包含如請求項1至16中任一項之抗原結合位點及細胞介素。
  26. 如請求項25之免疫細胞介素，其中該細胞介素係選自由以下組成之群：IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、TNF及IFNα。
  27. 一種雙特異性T細胞銜接體，其包含如請求項1至16中任一項之抗原結合位點及結合CD3之抗原結合位點。
  28. 一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含：(a)如請求項1至16中任一項之抗原結合位點；(b)跨膜結構域；及(c)細胞內信號傳導結構域。
  29. 如請求項28之CAR，其中(i)該跨膜結構域係選自T細胞受體CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、FLT3、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152及CD154之α、β或ζ鏈之跨膜區；(ii)該細胞內信號傳導結構域包含初級信號傳導結構域，該初級信號傳導結構域包含CD3ζ、常見FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(Fc εR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10及DAP12之功能性信號傳導結構域；或(iii)該細胞內信號傳導結構域進一步包含共刺激信號傳導結構域，該共刺激信號傳導結構域包含共刺激受體之功能性信號傳導結構域。
  30. 如請求項29之CAR，其中該共刺激受體係選自由以下組成之群：OX40、CD27、CD28、CD30、CD40、PD-1、CD2、CD7、CD258、NKG2C、B7-H3、結合至CD83之配位體、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS及4-1BB(CD137)或其任一組合。
  31. 一種經分離核酸，其編碼如請求項28之CAR。
  32. 一種表現載體，其包含如請求項31之經分離核酸。
  33. 一種免疫效應細胞，(i)其包含如請求項31之經分離核酸或如請求項32之表現載體；或(ii)其表現如請求項28之CAR。
  34. 如請求項33之免疫效應細胞，其中該免疫效應細胞係T細胞或NK細胞。
  35. 一種醫藥組合物，其包含如請求項17之蛋白質、如請求項23之抗體-藥物偶聯物、如請求項25之免疫細胞介素、如請求項27之雙特異性T細胞銜接體或如請求項33之免疫效應細胞及醫藥學上可接受之載劑。
  36. 一種如請求項17之蛋白質、如請求項23之抗體-藥物偶聯物、如請求項25之免疫細胞介素、如請求項27之雙特異性T細胞銜接體、如請求項33之免疫效應細胞或如請求項35之醫藥組合物之用途，其係用於製備治療癌症之藥劑。
  37. 如請求項36之用途，其中該癌症係血液惡性病。
  38. 如請求項37之用途，其中該血液惡性病係白血病。
  39. 如請求項37之用途，其中該癌症係選自由以下組成之群：急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、骨髓發育不良、急性T淋巴母細胞性白血病及急性前骨髓細胞性白血病。
  40. 如請求項36之用途，其中該癌症表現FLT3。
  41. 一種生產如請求項17之蛋白質或如請求項35之醫藥組合物之體外(in vitro)或離體(ex vivo)方法，該方法包括：(a)引入編碼如請求項17之蛋白質之聚核苷酸；及(b)培養細胞足夠的時間以表現該蛋白質。
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