UA112151C2 - Використання лхат для лікування анемії й дисфункції червоних кров'яних клітин - Google Patents

Abstract

Винахід стосується лікування анемії або дисфункції червоних кров'яних клітин пацієнта, який має стан, що характеризується анемією або дисфункцією червоних кров'яних клітин, де вказаний стан вибраний з групи, яка складається з серповидноклітинної хвороби, діабету, таласемії, ревматоїдної хвороби, аутоімунного захворювання, артриту, захворювання печінки, цирозу, гепатиту, акантоцитозу, сепсису, деменції, мікросудинного порушення, запального захворювання, паразитарної хвороби, еректильної дисфункції, раку, прееклампсії, критичного захворювання або травми, який включає введення пацієнтові терапевтично ефективної кількості лецитин-холестерин ацилтрансферази (ЛХАТ). Винахід також стосується способу оцінки поліпшення стану, щохарактеризується одним або більше з таких: анемія, червоні кров'яні клітини зі зниженою здатністю до деформації, знижена оксигенація ККК, підвищена агрегація або адгезія ККК, знижена функція оксиду азоту, знижена тривалість життя ККК, одним з етапів якого є введення пацієнту, який цього потребує, терапевтично ефективної кількості агента, який збільшує активність ЛХАТ, або збільшує рівень ЛХАТ в плазмі, або виробляє обидва ефекти.

Description

ІО00О1) Дана заявка заявляє про пріоритет відповідно до Попередньої заявки на патент США, серійний номер 61/186,668, поданої 12 червня 2009, і Попередньої заявки на патент США, серійний номер 61/241,223, поданої 9 вересня 2010. Повний зміст Попередньої заявки на патент

США, серійний номер 61/186,668 і Попередньої заявки на патент США, серійний номер 61/241,223 включено в цей документ шляхом посилання.

ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ

І0002| Даний винахід у цілому стосується сфери медицини й, зокрема, лікування хвороб, що характеризуються анемією й/або червоними кров'яними клітинами, що мають аномальні функції у відношенні деформованості, оксігенації, агрегації, метаболізму оксиду азоту або тривалості життя.

РІВЕНЬ ТЕХНІКИ

0003) Якість або кількість червоних кров'яних клітин (ЧКК), що знаходяться у кровотоці, часто знижується в періоди збільшеного фізичного навантаження, що веде до анемії й зростання ризику захворюваності й смертності. Фізичні навантаження, які пов'язані з розвитком анемії, включають автоїмунні захворювання, великі оперативні втручання, травми, інфекційні хвороби, рак, критичні захворювання, діабет, хвороби печінки, хвороби нирок, серцеву недостатність і паразитарні хвороби. Системне запалення, про яке свідчать підвищені рівні запальних цитокінів у кровотоці є характерною загальною рисою всіх цих станів. Навіть у людях, схильних до анемії через гемоглобінопатію, наприклад, до серповидноклітинної хвороби або таласемії, рівень запальних цитокінів часто збільшений і може загострювати симптоми хвороби, особливо під час кризових епізодів.

І0004| Одним з наслідків підвищеного рівня запальних цитокінів є скорочення виробництва печінкою ферменту лецітин- холестерин ацилтрансферази (ЛХАТ). У нормі, ЛХАТ виділяється в плазму з печінки, щоб полегшити кругообіг ліпідів у плазмі й забезпечити баланс холестерину й фосфоліпідів у крові й тканинах, омиваних кров'ю. Надлишковий холестерин видаляється із тканин, таких як артерії, і доставляється в печінку для екскреції в складі жовчі за допомогою процесу, відомого як зворотний транспорт холестерину (З3ТХ). На першому етапі ЗТХ холестерин переходить із тканинних клітин у ліпопротеїни високої щільності (ЛВЩ) у кровотоці.

На другому етапі фермент ЛХАТ збільшує здатність ЛВЩ до переносу холестерину шляхом

Зо каталізу трансестерифікації жирної кислоти від фосфатиділхоліну (ФХ) (також відомого як лецітин) до холестерину з формуванням холестеринового ефіру (ХЕ). Вироблений ХЕ накопичується в ядрі ЛВІЩ доти, поки не видаляється ЛВіІЦ-рецепторами печінки. ХЕ, доставлений ЛВЩ у печінку, перетворюється в холестерин і жовчні кислоти, які виділяються в складі жовчі. 0005) Наслідки для здоров'я, викликані зменшенням активності ЛХАТ у плазмі, найбільш очевидні в людей із сімейним дефіцитом ЛХАТ (СДЛ), рідким генетичним захворюванням, при якому активність ЛХАТ у плазмі відсутня. Відсутність активності ЛХАТ у плазмі веде до значного зниження вмісту в плазмі ХЕ, що відбивається на зниженні ЛВЩ і ліпопротеїну низкою щільності й в акумуляції надлишкового субстрату ЛХАТ у плазмі. Головні наслідки СДЛ для здоров'я полягають у погіршенні зору в результаті дифузійного накопичення ліпідів у роговиці, можливому розладі нирок через акумуляцію ліпідів у нирках (гломерулосклероз) і гемолітичної анемії.

І0006) Відхилення в ліпідному складі ліпопротеїнів плазми через порушення ліпідного обміну такі як ті, що є результатом низької активності ЛХАТ, пов'язані зі змінами в вмісті ліпідів у ЧКК.

Зміна ліпідів у ЧКК у відповідь на зміни ліпідів у плазмі, може змінити функціональність і виживаність ЧКК, тому що ці властивості залежать від вмісту ліпідів у клітині. Типи змін ліпідів

ЧКК, які можуть мати місце, виявляються в пацієнтів, що страждають СДЛ, у яких ЧКК збагачені холестерином і ФХ і збіднені вмістом сфінгомієлином (СМ). Свідчення того, що ці аномалії ліпідів ЧКК залежать від ліпідних і ліпопротеїнових порушень у плазмі, що є результатом дефіциту ЛХАТ, було отримано в експерименті, де тимчасова нормалізація вмісту холестерину в ЧКК відбулася після переливання хворому СДЛ нормальної плазми (Мигуата еї аїЇ., Амер.ж-л.

Гематол. 16:129-137,1984). Ця тимчасова нормалізація ліпідів ЧКК могла відбутися через поповнення ЛХАТ, ЛВЩ, аполіпопротеїну А-1 або інших факторів плазми, які відсутні або значно знижені у пацієнтів із СДЛ.

ІЇ0007| У менш важких випадках зменшення активності ЛХАТ в плазмі не спостерігається зв'язку між анемією й активністю ЛХАТ. Наприклад, пацієнти із захворюванням «риб'яче око», м'якої форми дефіциту ЛХАТ, проявляють активність ЛХАТ, що складає менш 3095 від нормальної активності ЛХАТ у плазмі, але мають нормальний гемоглобін і гематокрит (Коивзеї еї а. Загальновизнані думки в галузі імунології, Діабет, ожиріння й обмін речовин, 16:163-171, бо 2009). Подібним чином, при вивченні пацієнтів із захворюваннями печінки не знайдено кореляції між зниженою активністю ЛХАТ і анемією (Г.М/У. РомеїЇ еї аїЇ. (1975) Австралійський і

Новозеландський медичний журнал, 5:101-107) або між активністю ЛХАТ і аномаліями ліпідів

ЧКК (КА Соорег еї а!. (1972) Журнал клінічних досліджень, 51;3182-3192). 0008) Хоча спостерігаються шкідливі зміни ліпідів ЧКК у тих, хто піддається фізичному стресу, подібні з тими, які виявляються в пацієнтів із СДЛ, явний зв'язок між ЛХАТ і рівнем ліпідів У ЧКК відсутній. Приклади аномальної композиції ліпідів ЧКК включають повідомлення про збільшене відношення ФХ/СМ у ЧКК, виділених з організму з пацієнтів із захворюванням печінки й пацієнтів з дисліпідемією внаслідок дефіциту ліпопротеїнової ліпази або хворобою

Танжера. Ми і інші (Фіг.1) також виявили збільшення відношення ФХ/СМ у ЧКК пацієнтів із серповидноклітинною хворобою, що не перебувають у кризі. Крім того, є повідомлення про збільшення вмісту холестерину в ЧКК в осіб, що страждають діабетом, хворобами серця (включаючи гострі коронарні синдроми), гіперхолестеринемією, серповидноклітинною анемією, і в осіб після космічного польоту.

І0009)| Наслідки модифікації ліпідної композиції ЧКК не до кінця відомі, але у випадку росту вмісту в ЧКК холестерину доведено, що активність мембранних протеїнів стає аномальною.

Збагачені холестерином ЧКК пацієнтів із захворюваннями печінки показують знижену активність

Муж-- Атфази й ацетилхолінестерази. Збагачення холестерином пов'язане з підвищеним переносом фосфатиділсерину від внутрішньої сторони клітинної мембрани до зовнішньої, що є сигналом для збільшення кліренсу ЧКК ретикулоендотеліальною системою. Збільшення холестерину ЧКК може знизити деформованість ЧКК і стати причиною аномальної морфології

ЧКК, при цьому обоє явища можуть погіршити проходження еритроцитів через капіляри.

Трансмембранний обмін газів, сутнісна функція ЧКК, також піддається впливу підвищення холестерину. 0010) Сучасні дані говорять про те, що аномальна ліпідна композиція ЧКК може мати шкідливий вплив на функцію червоних кров'яних клітин і, отже, є потреба в способах нормалізації ліпідної композиції ЧКК і лікування дисфункції червоних кров'яних клітин.

СУТНІСТЬ ВИНАХОДУ

0011) У літературі немає єдності щодо кореляції між ЛВЩ -Х (холестерином ліпопротеїнів високої щільності) і ендогенною активністю ЛХАТ. Ми зробили несподіване відкриття, що

Зо збільшення рівня ЛХАТ у плазмі шляхом ін'єкції рекомбінантної людської ЛХАТ викликає швидке видалення холестерину із тканин. Додатково, швидко збільшувався вміст ЛВЩ-Х. Обумовлені рівновагою, що існує між ЛВЩ і ЧКК, ці несподівані результати означають, що інфузія ЛХАТ також може бути використана для швидкої корекції ліпідних аномалій кров'яних клітин і поліпшити функцію кров'яних клітин. 0012) Часто повідомляється, що рівні ЛВЩ-Х у плазмі зменшуються у випадках фізичного стресу, наприклад: автоїмунних захворювань, великих оперативних втручань, травм, інфекційних хвороб, раку, критичних захворювань, діабету, хвороб печінки, хвороб нирок, серцевої недостатності й паразитарних хвороб, і можуть бути важливим фактором у виникненні відхилень ліпідної композиції ЧКК, у світлі прямого ліпідного обміну між ЧКК і ліпопротеїнами.

Анемія широко поширена у випадках, де спостерігається зменшення ЛВЩ. 0013) Даний винахід стосується способів модуляції вмісту ліпідів у мембранах червоних кров'яних клітин шляхом збільшення концентрації ЛХАТ і/або активності до рівнів, що перевищують нормальну концентрацію й/або активність ЛХАТ в організмі людини шляхом введення терапевтично ефективних доз ЛХАТ.

І0014| Одним з варіантів втілення винаходу є спосіб лікування пацієнта, що має стан, що характеризується дисфункцією червоних кров'яних клітин, шляхом введення йому терапевтично ефективної кількості ЛХАТ. 0015) Іншим варіантом втілення винаходу є спосіб лікування пацієнта, що має стан, що характеризується анемією або червоними кров'яними клітинами зі зниженою деформованістю, зниженою оксігенацією, зниженою функцією оксиду азоту, збільшеною адгезією й/або агрегацією або зменшеним часом життя, або будь-якою комбінацією цих станів, шляхом введення пацієнтові, що потребує цього, терапевтично ефективної кількості ЛХАТ. 0016) В іншому варіанті втілення винаходу спосіб лікування пацієнта, що має стан, що характеризується анемією або червоними кров'яними клітинами зі зниженою деформованістю, зниженою оксігенацією, зниженою функцією оксиду азоту, збільшеною адгезією й/або агрегацією або зменшеною тривалістю життя, будь-якою комбінацією цих станів, включаючи визначення вихідної деформованості ЧКК або оксігенації ЧКК або агрегації ЧКК або адгезії ЧКК або тривалості життя ЧКК, шляхом введення пацієнтові, що потребує цього, терапевтично ефективної кількості ЛХАТ,при цьому визначають зміни, викликані введенням ЛХАТ, за яких збільшення деформованості ЧКК або оксігенації ЧКК або зменшення агрегації або адгезії ЧКК або збільшення тривалості життя ЧКК указує на поліпшення стану.

ЇО017| У деяких варіантах стан, при якому проводиться лікування, являє собою серповидноклітинну хворобу, діабет, таласемію, ревматоїдну хворобу, автоіїмунне захворювання, артрит, хворобу печінки, цироз, гепатит, акантоцитоз, сепсис, слабоуиствоанемію або мікросудинні розлади, запальні захворювання, паразитарне захворювання, еректильну дисфункцію, рак, прееклампсію, критичне захворювання або травму.

І0018| Інший варіант втілення винаходу є спосіб лікування пацієнта, що має стан, що характеризується високим рівнем ФХ у мембранах ЧКК, що включає введення пацієнтові, якщо буде потреба в цьому, терапевтично ефективної кількості ЛХАТ. Інший варіант втілення винаходу являє собою спосіб лікування пацієнта, що має стан, що характеризується високим рівнем ФХ у мембранах ЧКК, включаючи визначення вихідного відношення ФХ до ФЛ, шляхом введення пацієнтові, якщо буде потреба в цьому, терапевтично ефективної кількості ЛХАТ та визначення співвідношення ФХ до ФЛ, що має місце після введення ЛХАТ, при цьому зменшення відношення ФХ до ФЛ указує на поліпшення стану. Інший варіант втілення винаходу являє собою спосіб зменшення вмісту ФХ у кров'яних клітинах пацієнта, що включає в себе призначення пацієнтові терапевтично ефективної кількості ЛХАТ. 0019) Інший варіант втілення винаходу являє собою спосіб лікування пацієнта, що має стан, що характеризується збільшенням співвідношення ФХ/СМ у мембранах ЧКК, що включає введення пацієнтові, якщо буде потреба в цьому, терапевтично ефективної кількості ЛХАТ.

Інший варіант втілення винаходу являє собою спосіб лікування пацієнта, що має стан, що характеризується збільшенням співвідношення ФХ/СМ у мембранах ЧКК, що включає визначення вихідного співвідношення ФХ/СМ, шляхом введення пацієнтові, якщо буде потреба в цьому, терапевтично ефективного кількості ЛХАТ і визначення співвідношення ФХ/СМ після введення ЛХАТ, при цьому зменшення відношення ФХ до СМ указує на поліпшення стану.

Інший варіант втілення винаходу являє собою спосіб зменшення співвідношення ФХ/СМ кров'яних клітин пацієнта, що включає введення пацієнтові терапевтично ефективної кількості

ЛХАТ.

КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР

Зо (0020 Фігура 1 показує фосфоліпідну композицію ЧКК нормальних пацієнтів і пацієнтів із серповидноклітинною хворобою.

І0021| Фігура 2 являє собою графік, що зображує збільшення рівня ЛВІЦ-Х у плазмі трансгенних мишей з геном, що кодує людський аполіпопротеїн А-1, після ін'єкції ЛХАТ. 00221 Фігура З зображує вміст холестерину в тканинах трансгенних мишей гібридної лінії, у яких сполучається нокаут гена ЛХАТ і експресія аполіпопротеїна А-1, після ін'єкції рекомбінантної людської ЛХАТ.

ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

І0023)| Термін «терапевтично ефективна кількість», використовуваний у даному документі, означає кількість ЛХАТ, введену відповідно до бажаного режиму лікування, при якому буде виявлено бажаний терапевтичний ефект або відгук. Краще терапевтично ефективна кількість являє собою таку кількість ЛХАТ, що збільшує рівень значень ЛХАТ у плазмі до значень, що перевищують нормальні. (0024) Використовуваний у даному документі термін «рівень ЛХАТ» стосується концентрації

ЛХАТ у плазмі.

І0025| Використовуваний у даному документі термін «нормальний рівень» ЛХАТ означає концентрацію ЛХАТ у плазмі, що має середньо здоровий суб'єкт, що не проходив лікування, що не одержує в цей момент ніяких медикаментів, які могли б змінити рівні ЛХАТ. «Нормальний рівень» і «ендогенний рівень» використовуються тут взаємозамінним чином.

І0026| Щоб уникнути сумніву, наявні посилання на «лікування» і «спосіб лікування» включають в даному документі цілюще, паліативне й профілактичне лікування.

І0027| «Суб'єкт» і «Пацієнт» використовуються взаємозамінним чином. (0028) «Між» використовується в даному документі з посиланням на ефективну кількість або об'єднану дозу, включно, наприклад, «між 1 мг ії 5000 мг» включає 1 мг і 5000 мг. 0029 «Від» використовується в даному документі з посиланням на ефективну кількість або єдину дозу, включно, наприклад, «від їмг до 5000 мг» включає 1 мг і 5000 мг.

І0030| «ВХ» є абревіатурою для вільного холестерину, і у використовуваному в даному документі значенні означає не-етерифікований холестерин.

І0ОЗ31) «Функція оксиду азоту» означає процеси, у яких ЧКК відіграють роль посередника, і які залежать від оксиду азоту, включаючи виробництво оксиду азоту, доставку оксиду азоту в мікросудини, інгібування адгезії тромбоцитів і лейкоцитів, вазодилатацію, деформованість ЧКК і виживаність ЧКК. 00321) «ФХ» є абревіатурою для фосфатиділхоліну. 00331) «СМ» є абревіатурою для сфінгомієліну.

І0034| «Деформованість ЧКК» означає здатність клітин адаптувати свою форму до динамічно мінливих умов потоку в напрямку мінімізації їхнього опору потокові й забезпечення їхнього проходу крізь просвіт дрібних кровоносних посудин. Знижена деформованість прирівнюється до збільшеної твердості. 0035) «Вектор генної терапії» означає агент, що використовується для впровадження й активізації експресії цільового гену в хромосомах клітин паренхімної тканини. Наприклад, аденовірус, перебудований, щоб нести ген ЛХАТ людини.

ЇОО3б| «Осмотична крихкість» означає чутливість клітин до розриву через зміни навколишнього осмотичного тиску. (0037) «Агрегованість ЧКК» означає здатність формувати багатоклітинні агрегати, звичайно у формі монетних стовпчиків, у присутності білків плазми або інших макромолекул.

Ї0038| «ЛХАТ» використовується взаємозамінним чином 3 « лецитин-холестерин ацилтрансферазою». 0039) «ЛХАТ» або «ЛХАТ поліпептид», як використовуються в даному документі, включають нативну послідовність ЛХАТ, варіанти ЛХАТ, модифіковану ЛХАТ і химерну ЛХАТ. Щоб точно визначити позиції амінокислот у послідовності ЛХАТ, виконується посилання на послідовність

ЗЕОІЮО МО: 1

Людська ЛХАТ 5ЕО ІЮ МО: 1 (Код доступу Генбанку Мо ААВ34898) яжБоМовиве ТТЛ ЧТЕІ СУВО СЬОМА

КРУ УМиМС ЗБЕтТЕВеКТІ МОСС, ЗУССИХОВЕВ

УУчниОоЗОБУ ЗНА ІВУ ВОРОКТУВУЮ ТКА шИТОчУОМОоУК МеУуКОоБІУВ МАРУСНКСВ ОС ВУУВК

ЩО ДМК БУЛО тема кинуте мером БОНУСИ РЕЗУСОМ

КЕНЕ МЕМ. есе АТКИ Су

ТЕТ ІКОНО ВРЕТПРУСУ. ТВО КТУАТ вот ко пог ВОНО ТОНОММ ТЕБЕ НІ МАТ ВО 0040) Специфічні амінокислоти в білковій послідовності нативної людської ЛХАТ записані з використанням однобуквених позначень амінокислот, що слідують одна за одною у білковій послідовності, наприклад УМУ2 означає, що позицію 2 займає триптофан. Щоб представити заміщення в конкретній позиції, що заміщає амінокислота ставиться наступною в цю же позицію,

Зо наприклад УМ2У означає, що триптофан у позиції 2 заміщений тирозином.

Ї0041| «Нативна послідовність ЛХАТ» включає поліпептид, що має амінокислотну послідовність, однакову із ЛХАТ, виділеної із природного об'єкта. Так, нативна послідовність

ЛХАТ специфічно містить у собі усічені форми, що зустрічаються в природних умовах, ЛХАТ, що зустрічаються в природних умовах алельні варіанти ЛХАТ, а також різні форми (наприклад, форми, що походять від альтернативного сплайсинга). Краща нативна послідовність ЛХАТ - зріла нативна послідовність ЛХАТ.

І0042| «Модифікована ЛХАТ» означає поліпептид, де одна або більше амінокислота в нативному поліпептиді ЛХАТ заміщена іншою амінокислотою, або одна або більше амінокислот додані до частини нативного поліпептиду, включаючи, не обмежуючись ними, М-кінцеві й С - кінцеві амінокислоти. Як необмежуючий приклад модифікована ЛХАТ може бути представлена модифікованим білком ЛХАТ, описаним у попередній заявці на патент США Мо 12/179,815. В інших варіантах втілення винаходу одна або більше амінокислот заміщені шляхом консервативного заміщення. Не-обмежуючі приклади консервативних заміщень наведені в

Таблиці 2. В інших варіантах втілення винаходу одна або більше амінокислот заміщені амінокислотою, що не зустрічається в природних умовах. Додатково, модифіковані поліпептиди

ЛХАТ включають похідні ЛХАТ або модифіковану ЛХАТ. Ці похідні можуть, наприклад, поліпшувати розчинність, абсорбцію, біологічну тривалість напівжиття поліпептидів. Похідні поліпептидів добре відомі фахівцям в даній галузі . Отже фахівцюв дані галузі буде відомо,, як змінити поліпептиди, щоб поліпшити їхні фармакологічні властивості.

ТАБЛИЦЯ 2

Вихідний залишок Зразкові консервативні заміщення пк в нн шинпнинпншшшшишшшш нини ншшшшш пннннннннннинннниншишшшишшшшш

І0043| Даний винахід спрямований на способи лікування пацієнтів, що мають стани, що характеризуються анемією або дисфункцією червоних кров'яних клітин, введенням пацієнтові, що потребує цього, агенту, що збільшує активність ЛХАТ або збільшує рівень ЛХАТ у плазмі, або виконує обидва ефекти. Рівень ЛХАТ і/або активність ЛХАТ можуть бути збільшені будь- якими доступними способами. Це включає, без обмеження, пряме введення ЛХАТ, експресію

ЛХАТ за допомогою генної терапії й спрямовану на підвищення рівня регуляцію ендогенної

ЛХАТ за допомогою введення ліків.

І0044| В одному із прикладів рівень ЛХАТ і/або активність ЛХАТ збільшується прямим введенням ЛХАТ. Переважно, ЛХАТ, що вводять у способах згідно з цим винаходом, являє собою продуковану рекомбінантним шляхом людську ЛХАТ (наприклад, з використанням тварин, клітин ссавців, грибів, клітин комах або рослин як системи для експресії рекомбінантного білка). Способи виробництва білків рекомбінантним шляхом добре відомі фахівцям. ЛХАТ також може бути отримана будь-яким підходящим способом, наприклад, шляхом виділення з людської плазми. ЛХАТ може бути підготовлена у формах постійного об'єму або єдиної дози. В одному з варіантів рівень активності ЛХАТ збільшується шляхом використання генної терапії. Використовуваний тут термін «генна терапія» стосується переносу й, переважно, стійкої інтеграції нової генетичної інформації в клітини суб'єкта. Способи збільшення рівнів активності ЛХАТ шляхом генної терапії мають на увазі трансфіковані клітини з нуклеїновою кислотою, що містить послідовність нуклеїнової кислоти , що кодує експресію

ЛХАТ. Трансфіковані клітини здійснюють експресію ЛХАТ і виділяють її в плазму суб'єкта.

Клітини трансфікуються у достатній кількості або такій, щоб забезпечити експресію ЛХАТ, достатню для збільшення кількості ЛХАТ до терапевтично ефективного рівня. Гени, що кодують

ЛХАТ, можуть бути введені суб'єктові будь-яким підходящим способом. В одному з варіантів втілення винаходу гени впроваджуються в клітини індивіда іп-мімо за допомогою векторів експресії. В іншому варіанті втілення винаходу гени вводяться в клітини ех-мімо, і трансфіковані клітини, які здійснюють експресію й секрецію ЛХАТ, вводяться суб'єктові. У підходах іп-мімо мішенями трансфекції є клітини печінки. Клітини печінки продукують ЛХАТ, тому що вони мають можливості для вироблення рекомбінантного білку. Крім того, вектори, ін'єковані в кровоток, швидко проходять крізь печінку, так що клітини печінки швидше інших піддаються впливові векторів. Кровотворні стовбурні клітини також використовуються як мішені для генної терапії, тому що вони швидко розмножуються, тим самим створюючи більшу кількість клітин, здатних продукувати ЛХАТ. Підходи ех-мімо також привабливі, тому що вони допускають більший контроль над процесом трансфекції. Наприклад, трансфіковані клітини можуть бути протестовані й вибрані ті, які здійснюють експресію ЛХАТ у найбільш високих кількостях.

Кровотворні стовбурні клітини можуть бути взяті в суб'єкта, трансфікуються ех-мімо і повторно вводяться пацієнтові. Тому, в одному з варіантів втілення винаходу клітини являють собою клітини суб'єкта. Способи трансфікування генів в клітини ссавців, як іп-мімо, так і ех-мімо, і досягання їхньої експресії добре відомі фахівцям в даній галузі.

Ї0045| Даний винахід стосується способів модуляції вмісту ліпідів мембран червоних кров'яних клітин шляхом підвищення рівнів вмісту або активності ЛХАТ понад нормальні рівні вмісту ЛХАТ у людському організмі. Одним з варіантів втілення винаходу є спосіб лікування пацієнта, що має стан, що характеризується дисфункцією червоних кров'яних клітин, що включає в себе введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості ЛХАТ. Іншим варіантом втілення є спосіб лікування пацієнта, що має стан, що характеризується дисфункцією червоних кров'яних клітин, що включає введення суб'єктові терапевтично ефективної кількості ліків, що збільшують ендогенне продукування ЛХАТ або збільшують активність ЛХАТ. В особливих варіантах втілення винаходу ліки являють собою маленьку молекулу терапевтичного агента.

І0046| Деякі варіанти втілення винаходу спрямовані на способи нормалізації вмісту ВХ клітинних мембран ЧКК шляхом збільшення рівнів ЛХАТ або активності ЛХАТ в організмі пацієнта, що має потребу в цьому. Один з варіантів згідно із цим винаходом являє собою спосіб лікування пацієнта, що має стан, що характеризується наявністю ЧКК зі збільшеним вмістом ВХ, шляхом введення терапевтично ефективної дози ЛХАТ пацієнтові, що цього потребує.

Збільшення рівнів ЛХАТ швидко викликає чистий перехід ВХ із ЧКК у ЛВЩ, у такий спосіб змінюючи композицію мембрани ЧКК у напрямку більш текучого стану. Ця дія збільшує оксігенацію ЧКК, поліпшує реологію (збільшує деформованість, плинність, зменшує екстерналізацію фосфатиділсерину, зменшує схильність до адгезії й агрегації), зменшує анемію

Зо (зменшує механічний стрес і деструкцію, зв'язані зі зниженням деформованості, збільшує тривалість життя ЧКК) і збільшує здатність ЧКК до оксігенації тканин, особливо периферичних тканин. У деяких варіантах втілення винаходу еритропоез збільшується внаслідок введення терапевтично ефективної кількості ЛХАТ. У деяких варіантах втілення винаходу функція оксиду азоту збільшується після введення терапевтично ефективної кількості ЛХАТ. Існує багато станів, за яких клітинні мембрани ЧКК мають підвищені рівні ВХ стосовно рівнів вмісту фосфоліпідів. Збільшення вмісту ВХ у мембранах кров'яних клітин присутня в ряді хворобливих станів, включаючи, не обмежуючись ними, серповидноклітинну хворобу, діабет, таласемію, ревматоїдну хвороба, автоїмунне захворювання, артрит, захворювання печінки, цироз, гепатит, акантоцитоз, сепсис, деменцію, анемію або мікросудинні порушення, запальні захворювання, паразитарні хвороби, еректильну дисфункцію, рак, прееклампсію, критичне захворювання або травму.

І0047| Незважаючи на відсутність у цих захворюваннях первинної патології, зміна композиції й функції ЧКК веде до загострення захворюваності підлеглими розладами. Таким чином, одним з варіантів втілення винаходу є спосіб лікування пацієнта із серповидноклітинною хворобою, діабетом, таласемією, ревматоїдною хворобою, автоїмунним захворюванням, артритом, захворюванням печінки, цирозом, гепатитом, акантацитозом, сепсисом, деменцією, анемією або мікросудинними порушеннями, запальними захворюваннями, паразитарними хворобами, еректильною дисфункцією, раком, пре еклампсією, критичним захворюванням або травмою шляхом введення терапевтично ефективної дози ЛХАТ пацієнтові, що потребує цього. (0048) Мутації гена гемоглобіну, такі, як спостережувані при серповидноклітинній хворобі (СКХ), таласеміях і формуванні гемоглобіну Е (Гб Е), можуть виразитися у ряді патологій, які зменшують деформованість ЧКК і їхню здатність переносити/доставляти кисень. Наприклад,

СКХ являє собою спадкоємний розлад, викликуваний одиночним заміщенням амінокислоти в субодиниці бета-глобуліну або гемоглобіну (Гб ІЗ). В умовах низького вмісту кисню Гбс полімеризується (піддається агрегації), що призводить до зміни форми ЧКК із нормальної ввігнутої в «серповидну». Формування твердих полімерів Гбс зменшує еластичність або деформованість ЧКК, що шкодить їхній функції, тому що для оксігенації тканин вони повинні бути здатні багаторазово проходити крізь капіляри, у чотири рази менше їхнього власного розміру. Отже, серповидна форма веде до вазооклюзивного розладу через оклюзію бо посткапілярних венул всіх розмірів і збільшує крихкість ЧКК, призводячи до їхнього лізису й гемолітичної анемії. Хоча вироблення серповидноклітинних еритроцитів при низькому вмісті кисню викликає гостру кризу і головні проблеми, пов'язані із цим захворюванням, не піддані серповидноклітинній деформації ЧКК пацієнтів, при нормальному вмісті кисню, мають більш тверді мембрани зі зниженою деформованістю й підвищеною здатністю до агрегації. Хімічний аналіз мембран еритроцитів пацієнтів із СКХ також показує збільшення вмісту ВХ. Додатково ці пацієнти мають низький рівень ЛВІЩ зі зниженим вмістом холестеринового ефіру (ЛЕ), що припускає знижену активність ЛХАТ або функціональний дефіцит ЛХАТ. Фактично, в одному з досліджень було показане зменшення на 3095 активності ЛХАТ у пацієнтів зі СКХ. Відповідно, один 3 варіантів втілення винаходу представляє спосіб лікування пацієнта, що має серповидноклітинну хворобу, введенням пацієнтові, що цього потребує, терапевтично ефективної кількості ЛХАТ. 0049) Ін'єкування високих рівнів ЛХАТ, наприклад, кількості, що приводить до збільшення ендогенної активності ЛХАТ від двохразового до 1000-разового в пацієнтів зі СКХ, викликало б вихід ВХ із ЧКК і супутнє збільшення рівнів ЛВЩ-Х у плазмі. Зниження вмісту ВХ у ЧКК привело б до збільшення деформованості ЧКК і поліпшило б рівень кисневого обміну. Поліпшена функція ЧКК може зменшити випадки оклюзії, як через поліпшену здатність крові до потоку, так і через знижений рівень вироблення серповидноклітинних еритроцитів (завдяки кращій ре- оксігенації ЧКК). В іншому варіанті втілення винаходу введення терапевтично ефективної кількості ЛХАТ пацієнтові, що потребує цього, збільшує деформованість ЧКК і оксігенацію ЧКК.

У деяких варіантах втілення винаходу тривалість життя ЧКК збільшується внаслідок введення

ЛХАТ. 0050) У випадку захворювання печінки вміст холестерину в ЧКК зростає і часто виникає анемія. Терапія ЛХАТ буде нормалізувати вміст холестерину в ЧКК, відновлювати нормальну форму й функцію, підданих впливу ЧКК, знижувати деструкцію ЧКК, збільшувати тривалість їхнього життя, тим самим зменшуючи схильність до анемії. Таким чином, ще одним варіантом втілення винаходу є спосіб лікування пацієнта, що страждає анемією, шляхом введення пацієнтові терапевтично ефективної кількості ЛХАТ.

Ї0051| Анемія мішеневидних клітин і шпоровидних клітин (акантоцитоз). Шпоровидні клітини й мішеневидні клітини мають збільшений вміст ВХ, що веде до зниження функції й збільшення

Зо гемолізу й анемії. 0052) У станах таких, як сепсис, ревматичні хвороби й запальні захворювання (включаючи анемію запалення) існує безліч патологій, таких, як зниження деформованості ЧКК і аномальна реологія, які ведуть до подальших ускладнень. Шкода, нанесена системам тканин і органів через знижену оксігенацію й збільшену агрегацію ЧКК, веде до росту захворюваності й смертності, починаючи з ініціального запального удару. Отже, ще один варіант втілення винаходу є спосіб зменшення агрегованості ЧКК шляхом введення пацієнтові, що потребує цього, терапевтично ефективної кількості ЛХАТ. ЛХАТ може також впливати на окислені фосфоліпіди, що з'являються в період запалення. Окислені ліпіди дуже реактивні й можуть збільшити шкоду, що наноситься клітинам і системам органів. Нормалізація ліпідів мембран ЧКК поліпшила б поток крові й оксігенацію тканин і зменшила б концентрацію реактивних окислених ліпідів. Це було б корисно після оперативних втручань, де сховані інфекції можуть знижувати функцію ЧКК, збільшуючи час загоєння ран. 0053) Мікросудинні розлади можуть траплятися, коли збільшується вміст ВХ у ЧКК, таким чином викликаючи твердість, збільшуючи адгезію й агрегованість ЧКК. Ці зміни збільшуються при слабкому потоці (або низькому тиску) крові, що виявляється в капілярах і венулах. Коли ЧКК не здатні деформуватися правильно, їхнє проходження істотно вповільнюється в цих дрібних судинах. Зі збільшенням схильності до агрегації й адгезії з'являється висока ймовірність блокади периферичних судин. В органах, де мікросудини є критичними для нормального функціонування (наприклад, очах, вухах, мозку, нирках, пенісі, легенів), повторні ішемічні події в цих судинах можуть призвести до втрати функції (наприклад, сліпоти, втрати слуху, ниркової недостатності, ішемічної мікросудинної поразки мозку (наприклад, деменції, хвороби

Альцгеймера), еректильної дисфункції). Лікування ЛХАТ зменшило б вміст ВХ у ЧКК, поліпшило реологію ЧКК, знизило б ризик подальшого виникнення судинних блокад і припинило б ушкодження органів.

ІЇ0054| Як показано в Прикладі 1 даного винаходу, миші із приблизно З30-кратним нормальним рівнем активності ЛХАТ мали збільшену масу ЧКК у порівнянні з нормальними мишами, що показує, що активність ЛХАТ є головним чинником у регуляції маси ЧКК, і у зв'язку із цим може лімітувати її рівень. 0055) Таким чином, введення високої дози ЛХАТ, наприклад, у діапазоні від 1-кратної до 60 1000-кратної від ендогенного рівня ЛХАТ або від 1-кратної до 500-кратної від ендогенного рівня

ЛХАТ або від 1-кратної до 100-кратної від ендогенного рівня ЛХАТ пацієнтові, що має стан, що характеризується аномальною реологією (анемія, знижена деформованість, збільшена агрегація, знижена плинність, зменшена тривалість життя ЧКК) привело б до поліпшення стану.

Ї0056| Таким чином, ще один варіант втілення винаходу представляє спосіб лікування пацієнта із серповидноклітинною хворобою, діабетом, таласемією, ревматоїдною хворобою, автоїмунним захворюванням, артритом , захворюванням печінки, цирозом, гепатитом, акантоцитозом, сепсисом, деменцією, анемією або мікросудинним розладом, запальним захворюванням, паразитарною хворобою, еректильною дисфункцією, раком, прееклампсією, критичним захворюванням або травмою шляхом введення терапевтично ефективної дози

ЛХАТ. Ще одним варіантом втілення даного винаходу є спосіб лікування пацієнта із серповидноклітинню хворобою, таласемією, ревматоїдною хворобою, автоіїмунним захворюванням, артритом, захворюванням печінки, цирозом, гепатитом, акантоцитозом, сепсисом, деменцією, анемією або мікросудинним розладом, запальним захворюванням, паразитарною хворобою, еректильною дисфункцією, раком, прееклампсією, критичним захворюванням або травмою шляхом введення ліків, що збільшує активність ЛХАТ або рівень її вмісту. У кращих варіантах втілення даного винаходу ліки являють собою маленьку молекулу, що володіє терапевтичною дією. В іншому варіанті втілення даного винаходу рівень ЛХАТ та/або активність ЛХАТ збільшуються за допомогою генної терапії.

І0057| Ще один варіант втілення даного винаходу являє собою спосіб лікування пацієнта, що страждає деменцією, пов'язаною із хворобою Альцгеймера, шляхом введення терапевтично ефективної дози ЛХАТ. Інший варіант являє собою спосіб лікування пацієнта із серповидноклітинною хворобою, діабетом, таласемією, ревматоїдною хворобою, автоїмунним захворюванням, аритритом, захворюванням печінки, цирозом, гепатитом, акантоцитозом, сепсисом, деменцією, анемією або мікросудинним розладом, запальним захворюванням, паразитарною хворобою, еректильною дисфункцією, раком, прееклампсією, критичним захворюванням або травмою шляхом введення терапевтично ефективної дози модифікованої

ЛХАТ. У деяких варіантах втілення даного винаходу модифікована ЛХАТ містить консервативну амінокислотну заміну. У деяких варіантах втілення даного винаходу модифікована ЛХАТ містить заміщення в позиції Е1, 3, М5, 17, С31, М384 або Е416. У різних варіантах втілення даного

Зо винаходу модифікована ЛХАТ містить амінокислотне заміщення в позиції 31. В інших варіантах втілення даного винаходу модифікована ЛХАТ містить СЗ1У заміщення й заміщення одного або більше амінокислотних залишків НЕ1, 14, 132, М34. У іншому варіанті втілення даного винаходу модифікована ЛХАТ містить заміщення СЗ1У та одне або більше із наступних заміщень : Е15,

ЕТМУ, 14М, І4К, М345, 132 або 1І32Н. У різних варіантах втілення даного винаходу модифікована ЛХАТ містить одне або більше з наступних заміщень: ЕТА, Е16, ЕІ, ЕТ, Е1М,

ЕР, РІМ, ЕТ1М, Е1Т, ЕТО, ЕРІМ, ЕТН, Е10, ІЗІ, І ЗЕ, 130,1 ЗМ, 1 ЗМ, 1 4А, 141, 14М, ТАБ, 14М, І АМУ,

І4У,14Т,140О, 1 АВ, МБА, МОМ, МОН, МОК, М5О, МОЕ, І 7М, 178, І17Е, СЗТА, СЗ1І, СЗ1М, СЗ1Е,

СЗ1М, СЗ1МУ, С31М, С31Т, СЗІК, СЗ1Н, М384С, М3840 або Е416с. В інших варіантах втілення даного винаходу рівень ЛХАТ у пацієнта збільшується з використанням техніки генної терапії. В інших варіантах втілення даного винаходу експресія ЛХАТ підвищується за допомогою введення ліків. 0058) У способах, згідно з даним винаходом, ЛХАТ звичайно вводиться суб'єктові в складі фармацевтичної композиції, що включає фармацевтично прийнятний носій або розріджувач.

Фармацевтична композиція може бути створена відповідно до звичайних методик, як фармацевтична композиція, адаптована до вибраного шляху введення препарату, тобто пероральним, парентеральним, внутрішньовенним, внутрім'язовим або підшкірним шляхом.

І0059| Фармацевтичні композиції, що підходять для доставки сполук згідно до даного винаходу, і способи їхнього виготовлення легко можуть бути знайдені фахівцями в даній галузі.

Такі композиції й способи їхнього виготовлення можуть бути знайдені, наприклад, у написаній

Ремінгтоном книзі "Фармацевтичні науки", 19-те видання (Маск Рибіїзпіпд Сотрапу, 1995). 0060) Композиції можуть мати такі форми як суспензії, розчини, емульсії з масляним або водним носієм і можуть містити спеціальні агенти, такі як суспендувальні агенти, стабілізатори і або диспергатори. Як альтернатива активна речовина може мати вигляд порошку для сполуки перед використанням з підходящим носієм, наприклад, стерильною апірогенною водою.

Звичайно такі композиції являють собою розчини в стерильному ізотонічному водному буфері.

Композиції можуть являти собою герметично закупорений контейнер, такий як ампула, шприц або флакон, з додаванням або без додавання консерванту.

ІЇ0ОО61| Рідкий носій може являти собою розчинник або рідке дисперсійне середовище, включаючи, наприклад, воду, етанол, поліол (наприклад, гліцерин, пропіленгліколь, рідкі бо поліетиленгліколі й т.п.), рослинні масла, нетоксичні гліцерилові ефіри або підходящі суміші цих речовин. Потрібна рухливість може бути досягнута, наприклад, шляхом формування ліпосом, створення необхідного розміру часток у випадку дисперсії або шляхом використання поверхнево- активних речовин. Запобігання впливу мікроорганізмів може бути досягнуто використанням різних антибактеріальних і протигрибкових засобів, наприклад, парабенів, хлоробутанолу, фенолу, сорбінової кислоти, тімеросалу й т.п. У багатьох випадках було б переважно включати ізотонічні агенти, наприклад, цукри, буфери або хлорид натрію.

Пролонгована абсорбція композицій для ін'єкцій може бути створена шляхом використання в якості інгредієнтів агентів, що затримують абсорбцію, наприклад, алюмінію моностеарату й желатину. 00621 Згідно із даним винаходом, ЛХАТ може бути використана окремо або в комбінованій терапії з іншими ліками, використовуваними для лікування при вищевказаних станах. Така терапія включає, не обмежуючись ними, одночасне або послідовне застосування підібраних ліків. Наприклад, ЛХАТ може бути введена разом з ліками, які звичайно використовуються у конкретному стані. Наприклад, ЛХАТ може вводитися разом з агентами-стимуляторами еритропоеза (АСЕ), такими як еритропоетин, метоксіполіетилен- гліколь -епоетин бета, дарбепоетин альфа, роміплостим і епоетин альфа для лікування анемії. Або наприклад, ЛХАТ може бути введена в сполученні з гідроксімочевиною, гідроксікарбамідом, децитабином або бутиратом для лікування серповидноклітинної хвороби.

І0063| В одному з варіантів втілення винаходу терапевтично активна кількість ЛХАТ вводиться у вигляді підшкірної ін'єкції. В іншому варіанті втілення винаходу терапевтично ефективна кількість ЛХАТ вводиться у вигляді внутрім'язової ін'єкції. В іншому варіанті втілення винаходу терапевтично ефективна кількість ЛХАТ вводиться у вигляді внутрішньовенної ін'єкції або інфузії. У деяких варіантах втілення винаходу терапевтично ефективна кількість ЛХАТ становить від 1 мг до 5000 мг, або від 1 мг до 2000 мг, або від 10 мг до 5000 мг або від 10 мг до 100Омг, або від 10 мг до 500 мг, або від 5 мг до 100 мг.

І0064| У деяких варіантах втілення винаходу терапевтично ефективна кількість ЛХАТ знаходиться в діапазоні від 1- до 1000-кратного, від 25- до 1000-кратного, від 50- до 1000- кратного, від 1-до 100-кратного, від 50- до 500-кратного, від 1-до 500-кратного від ендогенного рівня ЛХАТ.

Зо І0065| Використовуване специфічне дозування може змінюватися. Наприклад, дозування може залежати від ряду факторів, включаючи, не обмежуючись ними, частоту дозування, специфічну активність рекомбінантного ензиму ЛХАТ, масу тіла пацієнта, особливі вимоги пацієнта, особливі стани пацієнта (наприклад, аномальні функції нирок або печінки), стан, що піддається лікуванню й т.д. Частота й сума дозування можуть, по розсуду лікаря, вийти за межі звичайного діапазону, наведеного в даному документі. Ці дози розраховані на середнього людського суб'єкта, що має вагу близько 60-70 кг. Способи визначення оптимальних доз для конкретного пацієнта добре відомі фахівцям. Лікар буде здатний легко визначити дози суб'єктам, чия вага виходить за зазначені межі, такі як діти й люди похилого віку.

І0066| Залежно від розладу й пацієнта, що піддається лікуванню, фахівець (тобто лікар) може встановити, що підходящою є початкова доза, що вище, ніж наступні дози. Наприклад, пацієнтові із серповидноклітинною хворобою, що перебуває в стані кризи, може бути введена початкова доза, що в 30 разів перевищує «нормальний» рівень. Як тільки рівень оксігенації ЧКК пацієнта досягає бажаного рівня, доза може бути зменшена, наприклад, до З-кратного «нормального» рівня.

І0067| Ефективність особливої дози може бути визначена посиланням на біомаркери або поліпшення окремих фізіологічних параметрів. Підходящі біомаркери включають, не обмежуючись ними, відношення ЕС до РІ, ЕС до мембранного білку, ФХ до СМ або рівні ЛВЩ-

Х. Підходящі фізіологічні параметри включають, не обмежуючись ними, зменшення анемії, поліпшення реології, вимірюване як збільшення деформованості ЧКК, плинності крові й/або агрегованості ЧКК, осмотичну крихкість або рівень оксігенації ЧКК, причому збільшення кожного із цих параметрів свідчить про поліпшення. Вимір рівнів біомаркерів і параметрів, описаних вище, може бути зроблене з використанням способів, добре відомих у науці. Наприклад, зменшення анемії може бути обмірюване за збільшенням гематокриту або гемоглобіну або продуктів розпаду гемоглобіну (наприклад, некон'югованого білірубіну), обмірюваних стандартними, добре обгрунтованими клінічними методами. Деформованість може бути обмірювана шляхом фільтрації, віскозиметрії, ектацитометрії й шляхом застосування мікропіпеток. Агрегація може бути обмірювана за допомогою різних інструментів, включаючи ектацитометри й агрегометри. Оксігенація ЧКК може бути обмірювана шляхом стандартної пульсоксіметрії або аналізу газів крові. Оксігенація тканин може бути обмірювана прямим бо зондуванням з використанням тонометрів із сиеластика, з кисневими сенсорами. Фахівець зрозуміє значення результатів і зможе вибрати дозу, відрегульовану на підставі визначень, таких, як описані вище.

І0068| Як описано в Прикладі 4 і показано на фігурі 2, в результаті введення ЛХАТ трансгенним мишам, в організмі яких присутній ген людського апополіпротеїна А-1, збільшилися рівні ЛІВ-Х у плазмі. Збільшення відбулися зненацька швидко; рівні ЛПВ-Х в плазмізбільшилися приблизно на 7095 від контролю за 4 години й приблизно на 12095 за 24 години. Таким чином, іншим варіантом втілення винаходу є спосіб лікування пацієнта, що має стан, що характеризується анемією або дисфункцією червоних кров'яних клітин, включаючи введення суб'єктові, що потребує цього, терапевтично ефективної кількості ЛХАТ, коли рівні

ЛПИПВ-Х у плазмі суб'єкта швидко збільшуються після введення ЛХАТ. В особливому варіанті рівень ЛІПВ-Х у плазмі суб'єкта через 4 години після введення ЛХАТ збільшується щонайменше на 3095, або щонайменше на 4095, або щонайменше на 5095, або щонайменше на 7095сабо щонайменше на 8095 у порівнянні з рівнем ЛВІЩ-Х перед введенням ЛХАТ. У ще одному варіанті втілення винаходу рівень ЛВЩ-Х у плазмі суб'єкта через 12 годин після введення ЛХАТ збільшується, щонайменше, на 4095 або, щонайменше, на 5095 або, щонайменше, на 6095 або, щонайменше, на 7095 або, щонайменше, на 8095 або, щонайменше, на 9095 або, щонайменше, на 10095 або, щонайменше, на 11095 або, щонайменше, на 12095 у порівнянні з рівнем ЛВЩ-Х у плазмі перед введенням ЛХАТ. У ще одному варіанті втілення винаходу рівень ЛВЩ-Х у плазмі суб'єкта через 24 години після введення ЛХАТ збільшується, щонайменше, на 4095 або, щонайменше на 5095, або щонайменше на 5095, або щонайменше на 6095, або щонайменше, на 7095 або, щонайменше, на 8095 або, щонайменше, на 9095 або, щонайменше, на 10095 або, щонайменше, на 11095 або, щонайменше, на 12095 або, щонайменше, на 13095 або, щонайменше, на 14095 або, щонайменше, на 15095 у порівнянні з рівнем ЛВЩ-Х у плазмі перед введенням ЛХАТ. 0069) Як описано в прикладі 5 і показано на фігурі 3, введення ЛХАТ трансгенним мишам з геном аполіпопротеїну А-1 і нокаутом гена ЛХАТ, приводить до збільшення вмісту холестерину в тканинах (аорти й печінки) і збільшенню рівнів холестерину в плазмі. Зведені дані прикладів 4 і 5 показують, що ін'єкція ЛХАТ швидко перерозподіляє ліпіди із тканин у ЛІПВ плазми. За умови впливу ін'єкції ЛХАТ на вміст холестерину в печінці й аорті можна очікувати, що подібна зміна швидко відбудеться в червоних кров'яних клітинах. 0070) Перехід ФХ із ЧКК до ЛВЩ повинен змінити композицію мембрани ЧКК убік більш нормального стану. Ця дія збільшить оксігенацію ЧКК, поліпшить реологію (збільшить деформованість, плинність, зменшить схильність до адгезії й агрегації), зменшить анемію (зменшить механічний стрес і деструкцію, зв'язану зі зниженням деформованості, збільшить час життя ЧКК) і збільшить здатність ЧКК оксігенувати тканини, особливо периферичні тканини.

ІЇ0071| У деяких варіантах введення ЛХАТ здійснюється пацієнтом самостійно шляхом підшкірної або внутрім'язової ін'єкції. Самостійне введення є кращим варіантом для лікування хронічних захворювань, включаючи, не обмежуючись ними, пацієнтів, що страждають серповидноклітинною хворобою, діабетом, ревматоїдним захворюванням або гепатитом.

Приклад 1

Вплив ЛХАТ на гематокрит у мишей.

І0072| Були взяті проби крові в трьох груп мишей: з дефіцитом ЛХАТ ( ЛХАТ-ДО), з викликаною трансгенним шляхом надлишковою експресією ЛХАТ (що перевищує приблизно в 30 разів нормальну активність ЛХАТ) і контрольні С57/06 миші. Із проб крові були виділені мембрани ЧКК і обмірювано рівень фосфоліпідів, що містять холін (Вако фосфоліпіди Б,

Ричмонд) як замінник маси ЧКК або гематокриту. Маса ЧКК у Лхат-дефіцитних мишей була значно нижче, ніж у нормальних мишей (402:222.0 мкг/мл всієї крові проти 486225.7 мкг/мл всієї крові, відповідно). Показана тут анемія у Лхат-Дефіцитних мишей подібна по ступеню з анемією, що спостерігається у пацієнтів зі СДЛ. Зненацька, маса ЧКК була істотно підвищеною у трансгенних мишей з надлишковою експресією ЛХАТ у порівнянні з мишами з нормальною активністю ЛХАТ (556:220.1 мкг/л всієї крові проти 486225.7 мкг/мл всієї крові, відповідно). Ці результати показують наявність позитивного взаємозв'язку між рівнями ЛХАТ і гематокритом.

Додатково й найбільше важливо, що рівні ЛХАТ, що перевершують нормальні, можуть збільшувати гематокрит у тварин, що не рахуються як анемічні. Ці дослідження показують, що підвищені рівні є можливим варіантом вибору в терапії пацієнтів з анемією, викликаною різними причинами, навіть пацієнтів з нормальною активністю ЛХАТ.

Приклад 2

Фосфоліпідна композиція зовнішніх мембран ЧКК, виділених з організму нормальних і страждаючих СКХ пацієнтів (не в стані кризи)

І0073| Зразки відмитих ЧКК у фосфатному сольовому буфері були приготовлені зі свіжої крові, узятої в нормальних суб'єктів (п-7) і пацієнтів із СКХ (п-6б). Аліквоти об'ємом п'ятдесят мікролітрів зібраних ЧКК були суспендовані в 0,95 мл фосфатного сольового буфера. Ліпіди були екстраговані шляхом з'єднання 0,4 мл аліквоти кожної суспензії ЧКК із 20 мкл розчину, що містить ТІмг/мл 1-ейкосанола в суміші етил-ацетат:ацетон (2:1) (внутрішній стандарт)і 2 мл суміші етил-ацетат:ацетон:метанол (6:3:1) у скляних пробірках. Закриті пробірки струшували протягом 2 хвилин і потім центрифугували при 2000 об./хв протягом 5 хвилин. Верхня органічна фаза була перенесена в пухирці 12х32 мм для ВЕРХ. Випар розчинника здійснювався з пухирців під потоком азоту й за наступного застосування протягом, принаймні, 1 години сильного вакууму. Висушені ліпіди були відновлені в 200 мкл суміші триметилпентан: метанол: тетрагідрофуран (95:5:2). Мембранні ліпіди були хроматографовані способом високоефективної рідинної хроматографії із силікатною колонкою. Виявлення й визначення кількості фосфатиділхоліну (ФХ) і сфінгомієліну (СМ) зроблено за допомогою випарного детектора розсіяного світла. Результати показують, що ліпіди ЧКК у пацієнтів зі СКХ збагачені ФХ при зменшеному вмісті СМ, у порівнянні з нормальними суб'єктами (ФІГ.1), що приводить до збільшення відношення ФХ/СМ із 0.67 до 0.98 для контрольної групи й пацієнтів зі СКХ, відповідно. ЧКК пацієнтів зі СКХ, проаналізовані в цьому дослідженні, виявили характер фосфоліпідної композиції, що відрізняється від композиції нормальних ЧКК. Композиція ліпідів

ЧКК при СКХ аналогічна тому, про що повідомляється в інших випадках низької активності ЛХАТ у плазмі.

Приклад З

Виготовлення рекомбінантної людської ЛХАТ

І0074| Плазміда рСММб6-ХІ 4/ САТ, що кодує білок людської ЛХАТ, була придбана в Ориген

Технолоджис (Роквілл, Меріленд) і вбудована в рсормМАЗ.1/Нупго (Инвитроген, Карлебад,

Каліфорнія). Вектор рсОМАЗ.1 був трансфікований у клітини НЕК29З3ї. Стабільно трансфіковані клітини були вибрані за допомогою розчину, що містить 200 мкг/мл гідромицина Б, і вирощені в безсироватковому середовищі ЕгеевіуЇе 293 (Інітроген) у струшуються флаконах, що, ємністю 10 л протягом 4 днів. Рекомбінантна людська ЛХАТ була виділена з культурального середовища шляхом осадження з хлоридом цинку, з наступним захопленняя й елюціює з фенілсефарозою.

Приклад 4

Збільшення ЛІПВ-Х в організмі трансгенних мишей з людським аполіпопротеїном А!, ін'єкованих ЛХАТ

І0075) Самці трансгенних мишей, що здійснюють експресію гена людського аполіпопротеїну

А-1 (лабораторія Джексона), утримувалися на звичайному раціоні, без обмежень. Миші одержали ооднократну ін'єкцію через ретро-орбітальний синус сольового розчину або рекомбінантної людської ЛХАТ у сольовому розчині (4 мг/кг). Кров відбирали у тварин, анестезованих ізофлураном через орбітальний плексус , через 0, 1, 4, 24, 48 і 72 години після ін'єкції. Концентрація холестерину в плазмі була визначена за допомогою комерційного комплекту ферментативного аналізу. Кількість холестерину у ЛВЩ ( ЛВЩ-Х) було визначено методом гель-електрофорезу з агарозою, використовуючи ЗРІРЕ систему від лабораторій

Хелена (Неїепа І абрз.). Фігура 2 доводить, що миші, яким була введена ЛХАТ, показали значне збільшення рівнів ЛВЩ-Х у плазмі, порядку 12095 від контролю. Рівень ЛВІЩЩ-Х залишається підвищеним протягом усього строку експерименту (72 години). Підвищення ЛВЩ у плазмі було дивно швидким, показавши близько 7095 від контролю через 4 години й близько 12095 від контролю через 24 години.

Приклад 5

Вплив ін'єкції ЛХАТ на вміст холестерину в тканинах трансгенних мишей з нокаутом гена

ЛХАТ/експресією гена аполіпопротеїну А-1

І0076| Трансгенні миші, що здійснюють експресію людського аполіпопротеїна А-1 (лабораторія Джексона) були схрещені з | САТ-КО мишами для одержання І САТ-КО/аро-А1-Та мишей (з нокаутом гена ЛХАТ і експресією гена аполіпопротеїна А-1). Миші лінії Ї САТ-КО/аро-

А-1--д утримувалися на звичайному для гризунів раціоні, без обмежень. Внутрішньовенні ін'єкції (ВІ) сольового розчину або 0.4 мг ЛХАТ вироблялися щодня протягом 4 днів через ретроорбітальний синус. Тварини були піддані дослідженню на п'ятий день. Тварини були анестезовані й знекровлені шляхом перфузії гепаринізованого сольового розчину. У кожної тварини були вилучені частка печінки й аорта й піддані екстракції розчином хлороформу й метанолу. Холестерин у ліпідах, отриманих з екстрагованих тканин, був обмірюваний за допомогою комерційного комплекту ферментативного аналізу.

І0077| Фігура З показує вміст холестерину в (А) печінки, (В) аорті й (3) плазмі мишей, бо ін'єкованих сольовим розчином (Контроль) або ЛХАТ (Дослід). Лікування ЛХАТ значно зменшує рівні холестерину в печінці й аорті й значно підвищує рівень холестерину в плазмі. Зведені дані прикладів 4 і 5 показують, що ін'єкція ЛХАТ швидко перерозподіляє ліпіди із тканин до ЛІВ плазми. Даний вплив ін'єкції ЛХАТ на вміст холестерину в печінці й аорті дозволяє очікувати, що подібна зміна можна була б спостерігати в червоних кров'яних клітинах.

Приклад 6 0078) Дитина (ЗОкг) із серповидноклітинною хворобою потрапляє у лікарню в стані кризи.

Поряд зі стандартним лікуванням, йому роблять інфузію рекомбінантної людської ЛХАТ (рлЛХАТ) у кількості 5мг/кг, протягом години, при загальній кількості сольового розчину 100 мл.

Після лікування вимірюють рівні кисню в крові й спостерігають поліпшення. Коли криза стихає, виміряються морфологія червоних кров'яних клітин і їхні фізичні характеристики (деформованість ЧКК, агрегованість ЧКК і осмотична крихкість) і результати зіставляються з результатами дослідження проб крові, узятих при потраплянні. Поліпшення фізичних характеристик і оксігенації ЧКК досягаються при щотижневих підшкірних ін'єкціях рллЛХАТ у дозі 0,5 мг/кг.

Приклад 7 0079) З5-літня жінка (55 кг), що страждає ревматоїдним артритом, має анемію з рівнем гемоглобіну 9г/дл (нормальний рівень 12-14 г/дл). Узято пробу крові, що показує, що її червоні кров'яні клітини менш здатні до деформації й легше агрегуються, ніж нормальні червоні кров'яні клітини. Пацієнтці прописані щотижневі ін'єкції рлЛХАТ у дозі 1мг/кг для введення підшкірно.

Після б щотижневих ін'єкцій виміряються рівні гемоглобіну і гематокриту, і виявляється збільшення на 2095. Після б місяців лікування гемоглобін досягає 14 г/дл. Лікар вирішує підтримувати пацієнтку на рлЛлХАТ у дозі 1мг/кг, що вводиться раз у два тижні.

Приклад 8

І0О80| б5-літній чоловік (80 кг) запланований на четверне шунтування. Пацієнтові рекомендується припинити прийом клопідогрелу за п'ять днів до операції, щоб зменшити ймовірність післяопераційної кровотечі. Для того, щоб знизити ризик активації тромбоцитів, тромбозу або агрегації ЧКК, пацієнта приводять у кабінет лікаря для інфузії рллЛХАТ у дозі мг/кг за 5 днів до операції. Пацієнтові вводять 1мг/кг рлЛХАТ прямо після операції, через 7 днів після операції й через 14 днів після операції. По закінченні відновного періоду (через 21 день після

Зо операції) пацієнт повертається до постійного лікування клопідогрелом.

Приклад 9

Трансфер генів для специфічної надлишкової експресії ЛХАТ у печінці

І0081| Є пацієнт із ревматоїдним артритом, що супроводжується хронічною анемією.

Пацієнтові вводиться доза 4х10!2 аденовірусних часток (АдрЛХАТ)/кг шляхом ін'єкції через інтрапортальний катетер. Виконується щотижневий моніторинг рівнів ЛХАТ після лікування.

Через 4 тижні після лікування пацієнт має рівень концентрації ЛХАТ 10 мг/л, або приблизно у два рази більший, ніж у суб'єкта, у якого немає артриту. Через 8 тижнів після лікування моніторинг виконується щомісяця. Якщо рівень ЛХАТ у пацієнта падає нижче 5мг/л, процедуру повторюють.

Приклад 10 (00821) Дитина (ЗОкг) із серповидноклинною хворобою в стані кризи потрапляє у лікарню.

Поряд зі стандартним лікуванням, йому зроблена інфузія рекомбінантної людської ЛХАТ (рллЛХАТ) у дозі 5мг/кг протягом 1 години при загальному об'ємі сольового розчину 100 мл.

Після лікування вимірялися рівні кисню в крові, і знайдене поліпшення. Коли криза стихає, виміряються морфологія червоних кров'яних клітин і їхні фізичні характеристики (деформованість ЧКК, агрегованість ЧКК і осмотична крихкість) і результати зіставляються з результатами дослідження проб крові, узятих при надходженні. Потім пацієнту виконують процедуру, при якій під шкіру поміщають медичний пристрій. Медичний пристрій містить у собі клітини ссавців, підготовлені шляхом клітинної інженерії для секреції активної ЛХАТ, ЛХАТ, виділюваної клітинами, у достатній кількості, щоб підняти ендогенну активність ЛХАТ до рівня, що становить більше 10095 від нормального. (0083) Необхідно взяти до уваги, що обсяг цього винаходу визначається його формулою й не обмежується варіантами й прикладами, конкретно описаними в даному документі.

, ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВКОСТЕЙ «її0» Арнасоке РБасюй, ЦО

Диекраси, Вкчсе 7,

Кхайзе, Вгізп й.

Номап, Явупоїй «1205 ВИКОВИСТАННЯ ЛХдАТ ДЛЯ ЛІКУВАННЯ АНЕМІЇ й ДИСФУНКЦИИ ЧЕРВОНИХ КРОВ'ЯВИХ кЛІУйН У «ІЗож 22533 оИ0оо0 «УБОх 517186, 566 «51» 2959-05-14 «Іа» 61/241, 223 «1515 2008а508- щі кувах 1 «1Л0» патентна вереоія. 3.5 «2107» 1 ки115 416 «дій» білок «213» людина «а0йм 1

Рпе тур оре» рез деп о Уаї цей Рпе рго Рко Нія Та Тих о Бго Був дів 1 5 12 і5 був бвоа бех Ава нів Тех дк бро Маї ЇХе меру Чаї бро біу Суб дез 25 . Зо сіу вБпП бій Без обі» Атїа цув пе дар був о Бхо АвроУаї Маї АбзпотЕр

Мо4х

Мес був Тух Аху Був ЖЕ ІЗ Ав оБйе Бе ТВ Хз3е Тер оей двроьеу

Зо 55 0

АзпоМеї Бе мей о Сув очей піу Уаї АвроСувз Тер оїів Авр о Ав Твж Ах 70 т5 во

Узі Уаї Тут Авп Ак Бек Бек піу Бей Ме1ї бек авподіа буо сьу Ууді 85 Зо З5 був ї16 Бгу Чаї Ехо сіу Ре бі Буз ТБ Тут беж Маї біо Тук о Беюв оо 125 116

Авр Бех Бек груз Гей Аїа бІу Тух ген Нів отТвК Бен Ма1і біпоАво Бер 115 120 1275 туаї Авц оАвпобіу Тук Маї Ат йвробіо Та кі Агу Діва Ага Бе Тув 130 135 1560

Азр Ттр Ах йейп бій Рго 51у біб бів біз п1й Туг Тук АхгЯ був ей 145 150 155 156

Аїа біу без уаї бра ста Меє Ні Аза Ате Тук Зіу Був Бкй уві Ве 165 170 у

Пец ї1їє біу Ні Зеє Пей біу Сув цер они ес Гей Тук о БВе їжа Бех 189 185 180

Акз піп о рхко сіп Аза Тер цу АвроАку рпє лі Авробіу Бе отІіє Бех 195 220 2058 цуез о біу Аа Рго Тер о Бьфу 5Му бех І1їе Був Ркго Ме5 ей оУа1ї Ппею Вів 219 215 225

Вел біу дво два біб З1у 118 Ро с3За Мес бек Зех 116 ук ем Буз 236 35 тло

Зіз біз бів Ак Бі Ту Твпу о Тбх Бех реє Ткр о Меб Рре Рко Бех ДкФ 248: 250 255

Меє ва Тпо орто З1ію Авроцлв Маї Ве тре Бек тТбх БкбоЗек Рие Ав 253 285 239

Тук ТКк біу аку Вр Бе ска Ака Рке Рйе Аїз Ввр о Гем о БІВ Ре СІ я 289 285. сій біу тТЕр Тух Мек Ткв цеч біпобБех Ату Авробей пе діа ЗІіу цем 250 235 за

Рто Віа Рко бу Маї біс Узі тук Сув цен Тут 5іїіу Маї біу бу вхо

З 319 ЗУБ За тІйх орто Ака Твх Тух тів тТухк АБО НУ Су РБе го Тук Тйх Азр РКО 325 330 35

Уві б1у ак ей тук 10 Ар о сіу Авр о Авротах Хаї дія Тв Ак век 340 345 350

ТвЕкобіз Бей Суз бсіу Ве» Тгробів біу дку іп ко ба БК Ууаї ВУ 350 355 їви їви Рко цей На5'сіу їЗМе біб Нія Гео АвлоМес Узі Ре Бех Авп

За 375 380 без ТВхІ їз біз Нуз Їїв Авп Аіа 116 пцейп Пе біу Аіа тує Ага бів 385 зво 335 409 су Рго Рко с Ата Бех Рго Тит А1їа бет бо б3Мй рко Его бко Рко бі 405 10 чу

Claims (12)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб лікування анемії або дисфункції червоних кров'яних клітин у пацієнта, який має стан, що характеризується анемією або дисфункцією червоних кров'яних клітин, де вказаний стан вибраний з групи, яка складається з серповидноклітинної хвороби, діабету, таласемії, ревматоїдної хвороби, аутоїмунного захворювання, артриту, захворювання печінки, цирозу, гепатиту, акантоцитозу, сепсису, деменції, мікросудинного порушення, запального захворювання, паразитарної хвороби, еректильної дисфункції, раку, прееклампсії, критичного захворювання або травми, який включає введення пацієнтові терапевтично ефективної кількості лецитин-холестерин ацилтрансферази (ЛХАТ).

2. Спосіб за п. 1, де стан характеризується зниженим гематокритом, зниженим рівнем гемоглобіну, червоними кров'яними клітинами (ЧКК) із зниженою здатністю до деформації, зниженою оксигенацією, підвищеною агрегацією і адгезією, зниженою функцією оксиду азоту, зменшеною тривалістю життя або будь-якою комбінацією перерахованих явищ.

3. Спосіб за п. 1, де запальне захворювання являє собою сепсис, ревматоїдну хворобу, анемію запалення, запалення після оперативного втручання, мікросудинне порушення являє собою деменцію або ретинопатію, паразитарна хвороба являє собою малярію, сонну хворобу, філяріатоз або лейшманіоз, або стан являє собою деменцію, пов'язану з хворобою Альцгеймера.

4. Спосіб за п. 1, де стан являє собою серповидноклітинну хворобу, захворювання печінки, паразитарну хворобу або запальне захворювання.

5. Спосіб за п. 1, де кількість ЛХАТ являє собою таку кількість, яка збільшує концентрацію ЛХАТ до рівня, що перевищує нормальний рівень ЛХАТ, або збільшує активність ЛХАТ до рівня, що перевищує нормальну активність ЛХАТ.

6. Спосіб за п. 1, де кількість ЛХАТ, що вводиться, становить від приблизно 10 мг до приблизно 5000 мг.

7. Спосіб за п. 1, де кількість ЛХАТ, що вводиться, становить від 1-кратного до 1000-кратного нормального рівня ЛХАТ.

8. Спосіб за п. 4, де стан є серповидноклітинною хворобою.

9. Спосіб за п. 4, де стан є анемією запалення.

10. Спосіб за п. 6, де кількість ЛХАТ, що вводиться, становить від приблизно 10 мг до приблизно 1000 мг.

11. Спосіб оцінки поліпшення стану, що характеризується одним або більше з таких: анемія, червоні кров'яні клітини зі зниженою здатністю до деформації, знижена оксигенація ЧКК, підвищена агрегація або адгезія ЧКК, знижена функція оксиду азоту, знижена тривалість життя ЧКК, який включає: а) одержання вихідного значення одного або більше параметрів з наступних: рівня гемоглобіну, рівня гематокриту, деформованості ЧКК, оксигенації ЧКК, агрегації і адгезії ЧКК або тривалості життя ЧКК; р) введення пацієнту, який цього потребує, терапевтично ефективної кількості агента, який збільшує активність ЛХАТ або збільшує рівень ЛХАТ в плазмі, або виробляє обидва ефекти; с) отримання значення після лікування одного або більше параметрів з наступних: рівня гемоглобіну, рівня гематокриту, деформованості ЧКК, оксигенації ЧКК, агрегації і адгезії ЧКК або тривалості життя ЧКК; в) порівняння вихідного значення параметрів зі значенням після лікування, де знаходження Зо одного або більше явищ з наступних: збільшення рівня гемоглобіну, рівня гематокриту, збільшення деформованості ЧКК, збільшення оксигенації ЧКК, зменшення агрегації і адгезії ЧКК або збільшення тривалості життя ЧКК, вказує на поліпшення в стані, де стан являє собою серповидноклітинну хворобу, діабет, таласемію, ревматоїдну хворобу, аутоїмунне захворювання, артрит, захворювання печінки, цироз, гепатит, акантоцитоз, сепсис, деменцію, анемію або мікросудинний розлад, запальне захворювання, паразитарну хворобу, еректильну дисфункцію, рак, прееклампсію, критичне захворювання або травму, і де терапевтично ефективна кількість агента являє собою терапевтично ефективну кількість ЛХАТ.

12. Спосіб за п. 11, де кількість ЛХАТ являє собою таку кількість, яка збільшує концентрацію ЛХАТ до рівня, що перевищує нормальний рівень ЛХАТ, або збільшує активність ЛХАТ до рівня, що перевищує нормальну активність ЛХАТ. ІГРА ся Ц ие Бормальні клітини ще : ШОУ Серпоподібніюінни БОЖЕ ї ши ше ши ши шиї ШЕ с Ще Я ши й вх см