BRPI1012910A2

BRPI1012910A2 - Uso de um agente que leva a atividade de lcat ou eleva o nível de plasma do lcat ou ambos e composição farmacêutica compreendendo tal agente

Info

Publication number: BRPI1012910A2
Application number: BRPI1012910-3A
Authority: BR
Inventors: Auerbach Bruce; Krause Brian; Homan Reynold
Original assignee: Alphacore Pharma Llc
Priority date: 2009-06-12
Filing date: 2010-06-14
Publication date: 2020-06-02
Also published as: AU2010259875A1; US20140023631A1; RU2576838C2; US8492108B2; CN102802659A; JP2012530070A; CN102802659B; RU2012100778A; WO2010144904A1; ES2552654T3; JP5759988B2; UA112151C2; HK1179168A1; US20120107298A1; CA2764189A1; EP2440240A1; MX2011013065A; JP2015199751A; EP2440240B1; NZ596639A

Abstract

uso de um agente que eleva a atividade de lcat ou eleva o nível de plasma do lcat ou ambos e composição farmacêutica compreendendo tal agente a presente invenção refere-se a métodos para tratar condições caracterizadas pela anemia ou disfunção de glóbulos vermelhos pela administração de um agente que eleva o nível de atividade de lcat ou lcat endógeno. adicionalmente, são descritos métodos de tratamento de condições em que os glóbulos vermelhos reduziram a função em relação à deformabilidade, oxigenação, adesão e agregabilidade elevada, função de óxido nítrico reduzida ou duração de vida diminuída, colesterol livre elevado ou teor de fosfolipídeo anormal. também são descritos métodos para tratamento de condições caracterizadas por concentração anormal de colesterol livre em glóbulos vermelhos e métodos para normalizar o teor de colesterol livre dos glóbulos vermelhos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para USO DE UM AGENTE QUE ELEVA A ATIVIDADE DE LCAT OU ELEVA O NÍVEL DE PLASMA DO LCAT OU AMBOS E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO TAL AGENTE.

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica a prioridade para o Pedido Provisório N° de Série US 61/186.668 depositado em 12 de junho de 2009, e Pedido Provisório N° de Série US. 61/241.223 depositado em 9 de setembro de 2010. Todo o conteúdo do Pedido Provisório N° de Série US 61/186.668 e Pedido Provisório N° de Série US 61/241.223 é incorporado aqui por referência. CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se geralmente ao campo da medicina, e em especial, ao tratamento de doenças caracterizadas por anemia e/ou glóbulos vermelhos que têm função anormal em termos de deformabilidade, oxigenação, agregação, metabolismo de óxido nítrico ou duração. ANTECEDENTES

A qualidade e a quantidade dos glóbulos vermelhos (RBC) na corrente sanguínea é frequentemente degradado durante os períodos de maior estresse físico, resultando em anemia e riscos aumentados de morbidade e mortalidade. Os estresses físicos que foram ligados ao desenvolvimento da anemia incluem doenças autoimunes, cirurgia, trauma, doenças infecciosas, câncer, doença crítica, diabetes, doenças do fígado, doença renal, insuficiência cardíaca e doenças parasitárias. A inflamação sistêmica é uma característica comum a todas essas situações, como evidenciado pela presença de níveis aumentados de citocinas inflamatórias na circulação. Mesmo em pessoas predispostas a anemia por causa de uma hemoglobinopatia, por exemplo, anemina falciforme ou talassemia, níveis de citocinas inflamatórias frequentemente são elevados e podem agravar os sintomas da doença, especialmente durante os episódios de crise.

Uma consequência de níveis de citocinas inflamatórias elevados é uma redução na produção hepática da enzima lecitina: colesterol aciltransferase (LCAT). Normalmente, LCAT é liberado para o plasma a partir do fígado para facilitar a circulação de lipídios no plasma e manter o equilíbrio do

2/27 colesterol e fosfolipidos no sangue e tecidos respingados pelo sangue. O excesso de colesterol é removido dos tecidos, tais como artérias, e entregue para o fígado para excreção na bile por um processo conhecido como transporte reverso do colesterol (RCT). Na primeira etapa do RCT, o colesterol passa a partir das células do tecido para lipoproteínas de alta densidade (HDL) na circulação. Na segunda etapa, a enzima LCAT aumenta a capacidade de transporte de colesterol das HDL, pela catálise da transesterificação de um ácido graxo de fosfatidilcolina (PC) (também conhecido como lecitina), para o colesterol para formar ésteres de colesterol (CE). O produto de CE acumula-se no interior das HDL até que seja removido em receptores de HDL no fígado. O CE entregue ao fígado pela HDL é convertido em colesterol e ácidos biliares que são excretados na bile.

As consequências para a saúde da atividade de LCAT do plasma diminuída são mais evidentes em pessoas com Deficiência de LCAT Familiar (FLD), uma doença genética rara em que a atividade de LCAT do plasma está ausente. A ausência da atividade de LCAT resulta em níveis de CE do plasma grandemente diminuídos, refletidos na diminuição de HDL e lipoproteína de baixa densidade, e no acúmulo do substrato LCAT em excesso no plasma. As principais consequências para a saúde da FLD são visão reduzida resultantes de um acúmulo difuso de lipídios nas córneas, insuficiência renal eventual devido ao acúmulo de lipídios renal (glomeruloesclerose) e anemia hemolítica.

Distorções nas composições de lipídios da lipoproteína do plasma devido a distúrbios metabólicos de lipídios, como as que resultam da baixa atividade de LCAT têm sido associadas a alterações no teor de lipídios do RBC. Um deslocamento nos lipídios de RBC em resposta a alterações de lipídios do plasma pode alterar o desempenho de RBC e sobrevivência uma vez que essas propriedades são dependentes do teor de lipídios celular. Os tipos de alterações de lipídios RBC que podem ocorrer são evidentes em indivíduos FLD onde as RBC são enriquecidas em colesterol e PC e diminuídas em teor de esfingomielina (SM). A prova de que estas anormalidades de lipídios RBC dependem de perturbações em lipídios da lipoproteína do

3/27 plasma como resultado de uma deficiência de LCAT foi obtido em um experimento foi uma normalização temporária do teor de colesterol RBC ocorrida após a infusão de plasma normal em um indivíduo FID (Muryama et al. Am. J. Hemata 16:129 - 137. 1984). Esta normalização temporária dos lipídios 5 RBC podería ser devido à reconstituição de LCAT, HDL, apolipoproteína A-l ou outros fatores de plasma que estão ausentes ou bastante reduzidos em pacientes com FLD.

Nenhuma ligação entre a anemia e atividade de LCAT é vista em casos menos graves da atividade de LCAT do plasma diminuída. Por exem10 pio, pacientes com doença de olho de peixe, uma forma mais suave da deficiência de LCAT, apresentam menos de 30% da atividade de LCAT do plasma normal, mas têm hemoglobina normal e hematócrito (Rousset et al. Cum. Opin. Endocrinol. Diabetes tubes. 16:163-171, 2009). Da mesma forma, estudos em indivíduos com doença do fígado não tiveram correlação 15 entre atividade de LCAT reduzida e anemia (LW Powell et al. (1975) Aust.

N.Z. J. Med. 5:101-107), ou entre a atividade de LCAT e anormalidades do lipídio RBC. (RA Cooper et al. (1972) J. Din. Invest. 51:3182-3192).

Embora haja evidências de alterações íipídicas deletérias em RBC em pessoas sob estresse físico que são semelhantes às detectadas 20 em pacientes FLD, não há nenhuma relação aparente entre os níveis de LCAT e RBC ou lipídios. Exemplos da composição de lipídios de RBC anômala incluem relatos de maior razão de PC/SM em RBC a partir de pessoas com doença hepática e em pessoas com dislipidemia devido à deficiência da lipoproteína lipase ou doença de Tangier. Nós (figura I) e outros também 25 encontraram um aumento na razão de PC/SM em RBC a partir de pacientes com anemina falciforme, que não estão em crise. Aíém disso, há relatos de enriquecimento de colesterol em RBC a partir de pessoas com diabetes, doenças cardíacas (incluindo síndromes coronariana agudas), hipercolesterolemia, anemia falciforme e em pessoas depois de vôo espacial.

As consequências da composição de lipídios de RBC modificada não são totalmente conhecidas, mas em caso de colesterol RBC elevados há prova de que as atividades das proteínas de membrana se tornam anor4/27 mais. O RBC enriquecido em colesteroi a partir de pacientes de doença hepática exibe atividades reduzidas de Mg++-ATPase e esterase de acetilcolina. O enriquecimento de coiesterol tem sido associado a maior transferência de fosfatidilserina a partir do interior para a superfície da membrana extracelular, que é um sinal para a liberação aprimorada de RBC pelo sistema reticulo endotelial. O coiesterol RBC aumentado pode reduzir a deformabilidade de RBC e induzir morfologias de RBC anormais, ambos os quais podem prejudicar o trânsito de RBC através dos capilares. A troca gasosa da transmembrana, uma função de RBC essencial, também é afetada pela elevação do coiesterol.

A atual evidência sugere que composições de lipídios de RBC anormais podem ter um efeito prejudicial sobre a função das glóbulos vermelhos e, portanto, há uma necessidade por métodos para normalizar a composição de RBC de lipídios e métodos para tratar a disfunção de glóbulos vermelhos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Não existe consenso na literatura como para a correlação entre o HDL-C e a atividade de LCAT endógena. Fizemos a descoberta surpreendente de que um aumento nos níveis de LCAT no plasma por injeção de LCAT humana recombinante rapidamente resulta em uma remoção de colesteroi dos tecidos. Além disso, a HDL-C foi aumentada rapidamente. Tendo em conta o equilíbrio que existe entre a HDL e RBCs, estes resultados surpreendentes indicam que a infusão de LCAT podería também ser usada para rapidamente conter anormalidades lipídicas do glóbulo vermelho e melhorar a função das células do sangue.

Os níveis de HDL-C no plasma são frequentemente relatados por serem reduzidos nos casos de estresse físico, por exemplo: doenças autoimunes, principais cirurgia, traumas, doenças infecciosas, câncer, doença crítica, diabetes, doenças do fígado, doença renal, insuficiência cardíaca e doenças parasitárias e pode ser um fator importante para a distorção do teor de lipídios de RBC, a luz da troca lipídica direto entre RBC e lipoproteínas. A anemia é altamente prevalente em casos onde o HDL é reduzido.

5/27

A presente descrição refere-se aos métodos de modulação do teor de lipídios das membranas de glóbulos vermelhos pelo aumento da concentração de LCAT e/ou atividade acima da concentração de LCAT humana normal e/ou atividade pela administração de uma dose terapeuticamente eficaz de LCAT.

Uma modalidade da descrição é um método para tratar um paciente tendo uma condição caracterizada por disfunção de glóbulos vermelhos compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT.

Outra modalidade é um método de tratar um paciente tendo uma condição caracterizada por anemia ou glóbulos vermelhos com deformabilidade reduzida, oxigenação reduzida, função de óxido nítrico reduzida, maior aderência e/ou agregação ou ciclo de vida diminuído, ou qualquer combinação dos mesmos compreendendo a administração aos pacientes em necessidade da mesma de uma quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT.

Em outra modalidade, o método de tratamento de um paciente tendo uma condição caracterizada por anemia ou glóbulos vermelhos com deformabilidade reduzida, oxigenação reduzida, função de óxido nítrico reduzida, maior aderência e/ou agregação ou ciclo de vida diminuído, ou qualquer combinação dos mesmos compreende determinar uma deformabilidade da linha de base de RBC ou oxigenação de RBC ou agregação ou aderência de RBC ou ciclo de vida de RBC; administrar aos pacientes em necessidade da mesma uma quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT; e determinar as alterações após a administração de LCAT sendo que um aumento na deformabilidade de RBC ou oxigenação de RBC ou agregação ou aderência de RBC diminuída ou ciclo de vida de RBC aumentado indica uma melhoria na condição.

Em algumas modalidades, a condição tratada é a anemina falciforme, diabetes, talassemia, doença reumatoide, doença autoimune, artrite, doenças do fígado, cirrose, hepatite, acantositose, sepsia, demência, anemia ou transtornos microvascular, desordens inflamatórias, doença parasitária, disfunção erétil, câncer, pré-eclampsia, doença crítica ou trauma.

6/27

Outra modalidade é um método de tratamento de um paciente tendo uma condição caracterizada por um elevado nível de FC nas membranas de RBC compreendendo a administração ao indivíduo, em necessidade da mesma, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT. Outra modalidade é um método de tratamento de um paciente tendo uma condição caracterizada por um elevado nível de FC nas membranas de RBC compreendendo a determinação de uma razão de linha de base de FC para PL; administração ao indivíduo, em necessidade da mesma, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT; e determinação da razão entre FC a PL após a administração de LCAT sendo que uma diminuição na razão de FC para PL indica uma melhoria na condição. Outra modalidade da descrição é um método de redução do teor de FC de um glóbulo vermelho em um paciente compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT.

Outra modalidade é um método de tratamento de um paciente tendo uma condição caracterizada por uma razão de PC/SM aumentada nas membranas de RBC compreendendo a administração ao indivíduo, em necessidade da mesma, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT. Outra modalidade é um método de tratamento de um paciente tendo uma condição caracterizada por um aumento na razão de PC/SM nas membranas de RBC compreendendo a determinação de uma razão de linha de base de PC para SM; administração ao indivíduo, em necessidade da mesma, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT; e determinação da razão entre PC a SM após a administração de LCAT sendo que uma diminuição na razão de PC para SM indica uma melhoria na condição. Outra modalidade da descrição é um método de redução da razão de PC/SM de umo glóbulo vermelho em um paciente compreendendo a administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 mostra a composição fosfolipídica de RBC a partir de indivíduos normais e de indivíduos com Anemina falciforme.

A figura 2 é um gráfico mostrando o aumento no HOLs C no

7/27 plasma em camundongos transgênicos ApoA-l humanos após injeção com LCAT,

A figura 3 mostra o conteúdo de colesterol dos tecidos a partir dos camundongos transgênicos de nocaute de LCAT/apolipoproteína A-1 após injeção com LCAT humana recombinante.

DESCRIÇÃO DETALHADA

O termo quantidade terapeuticamente eficaz, como usado aqui, significa a quantidade de LCAT que irá extrair o efeito terapêutico pretendido ou resposta quando administrada de acordo com o regime de tratamento desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz preferida é uma quantidade de LCAT que aumenta o nível de LCAT no plasma para níveis acima do normal.

Como usado aqui nível de LCAT refere-se à concentração plasmática de LCAT.

Como usado aqui, um nível normal de LCAT representa a concentração plasmática de LCAT que está presente em indivíduos não tratados saudável da média não atualmente em qualquer medicamento que possa alterar os níveis de LCAT. Nível normal e nível endógeno são usados alternadamente neste documento.

Para evitar dúvidas, referências neste documento a tratamento ou tratando incluem tratamento curativo, paliativo e profilático.

Indivíduo e Paciente são sinônimos.

Entre como usado neste documento com referência a quantidade de dose eficaz ou dose unitária é inclusive, por exemplo, entre 1 mg e 5000 mg inclui 1 mg e 5000 mg.

De como usado neste documento com referência a quantidade eficaz ou dose unitária é inclusive, por exemplo, de 1 mg a 5000 mg inclui 1 mg e 5000 mg.

FC é uma abreviação para colesterol livre e neste documento significa colesterol não esterificado.

Função de óxido nitrico significa processos mediados por RBC que são dependentes de óxido nitrico, incluindo a produção de óxido nitrico,

8/27 entrega de óxido nítrico para a microvasculatura, inibição da aderência de plaquetas e de leucócitos, vasodilatação, deformabilidade de RBC e sobrevivência de RBC.

PC é uma abreviação para fosfatidilcolina.

SM é uma abreviação para esfingomielina

Deformabildade de RBC significa a capacidade das células de adaptarem seu formato às condições de fluxo dinamicamente em modificação, a fim de minimizar a sua resistência ao fiuxo e para permitir sua passagem através de pequenos vasos sanguíneos. A deformabilidade reduzida equivale à maior rigidez.

Um vetor de terapia genética é um agente que é usado para incorporar e expressar ativamente um gene de interesse nos cromossomos nas células de tecidos parenquimatosos. Por exemplo, um adenovirus projetado para transportar o gene de LCAT humano.

Fragilidade osmótica significa a sensibilidade de uma célula à ruptura devido a alterações na pressão osmótica adjacente.

Agregabilidade RBC significa a capacidade de formar agregados multicelulares, normalmente em forma de rolo, na presença de proteínas de plasma ou outras macromoléculas.

LCAT é usado como sinônimo de lecitina-colesterol aciltransferase.

LCAT ou polipeptídeo LCAT, quando utilizados aqui, englobam a sequência nativa de LCAT, variantes de LCAT, LCAT modificado e LCAT quimérico. Ao especificar posições de aminoácidos na sequência de

LCAT, é feita referência à SEQ ID N°: 1

LCAT humano SEQ ID N°: (Genbank N° de Adesão AAB34898) FWLLKVLFP1? HTTPKAELÊN HTRPVXLVPG CLGNQLEAiiL· DKPOWNWMC XRJCTEPFFTI Wr.DLNMFI.CL GVDCWIEáWa WYNRSSGLV SNAPGVQIRV PGFGKTYSVE YLDSSKLAGY ΙιΗΪΊ,νΟΗΙΛΝ WGYVRDSTVR AAPYDWRtEP GQQXEYYRKL AGLVEEMHM. YGKPVFLIGK SLGCLBLX.YF LLRQPQAWKD RFIDGFISDG APWGGSIKPH LVLASGDIIQG IPIMSSlKbK ESQRITTTSP WMFPSEMÁWP EDHVFISTPS rNYTGRDFQR FFADLHFEEG WYMWLQSRDI. LAGLPAPGVE VYCLYGVGLP TPHTYIYDHG FPYTDPVGVL· YEDGDOWiT RSTELCGLWQ GRQPQPVHLL PLHGIQHLNM VFSHJVELEilI HAIbLGAYRQ GPPASPTASP ÉPPPPE

Aminoácidos específicos na sequência da proteína de LCAT

9/27 humano nativo são descritos utilizando uma designação de aminoácidos de letra única, seguida da posição na sequência da proteína, por exemplo, W2 indica que a posição 2 é um triptofano. Para representar uma substituição em uma posição específica, o aminoácido substituído segue a posição, por exemplo, W2Y indica que o triptofano na posição 2 é substituído por uma tirosina.

Um LCAT de sequência nativa compreende um polipeptídeo tendo a mesma sequência de aminoácidos que um LCAT derivado da natureza. Assim, um LCAT de sequência nativa engloba especificamente formas truncadas de ocorrência natural de LCAT, e variantes alélicas de ocorrência natural de LCAT, formas variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas alternadamente emendadas). O LCAT de sequência nativa preferido é um LCAT de sequência nativa madura.

LCAT modificado significa um polipeptídeo em que um ou mais aminoácidos no polipeptídeo de LCAT nativo é substituído por outro aminoácido, ou um ou mais aminoácidos é adicionado a uma porção do polipeptídeo nativo, incluindo, mas não limitado ao aminoácido de N-terminal ou Cterminal. Por exemplo, e sem limitação, o LCAT modificado pode ser uma proteína de LCAT modificada, como descrito no Pedido de Patente N° U.S. 12/179.815. Em outras modalidades, um ou mais aminoácidos são substituídos por uma substituição conservadora. Substituições conservadoras exemplares não limitantes são fornecidas na tabela 2. Em outras modalidades, um ou mais aminoácidos são substituídos por um aminoácido não natural. Além disso, polipeptídeos de LCAT modificados incluem derivados de LCAT ou LCAT modificado. Esses derivados podem, por exemplo, melhorar a solubilidade, absorção, meia-vida biológica, dos polipeptídeos. Derivados de polipeptídeos são bem conhecidos na técnica. Aquele versado na técnica sabería como derivatizar polipeptídeos para melhorar as suas propriedades farmacológicas.

10/27

TABELA 2
Resíduo original	Substituições conservadoras exemplares
A	G, S
R	K
N	Q, H
D	E
C	S
Q	N
E	D
G	A, P
H	N, Q
I	L, V
L	I, V
L	R, Q, E
M	L, Y, I
F	M, L, Y
S	T
T	s
W	Y
Tyr	W, F
Vai	I, L

A presente descrição é direcionada a métodos de tratar pacientes com uma condição caracterizada por anemia ou disfunção das células vermelhas do sangue, compreendendo administrar a um paciente em neces5 sidade do mesmo, um agente que aumenta a atividade de 1-CAT ou aumenta o nível plasmático de LCAT, ou ambos. O nível de LCAT e/ou de atividade de LCAT pode ser aumentado por quaisquer meios disponíveis. Isto inclui, sem limitação, administração direta de LCAT, expressão de LCAT através de terapia genética e regulação ascendente de LCAT endógeno através da ad10 ministração de drogas.

Em uma modalidade, o nível de LCAT e/ou atividade é aumentado pela administração direta de LCAT. De preferência, o LCAT administrado nos métodos de acordo com a descrição é LCAT humano produzido recombinantemente (por exemplo, usando animais, céluías de mamíferos, fun11/27 gos, células de insetos, ou plantas como um sistema de expressão de proteínas recombinantes). Métodos de produção de proteínas recombinantes são bem conhecidos na técnica. LCAT também pode ser obtido por qualquer método adequado, por exemplo, isolamento do plasma humano. LCAT pode ser preparado em formas estáveis a granel ou de dose única. Em uma modalidade, o nível de atividade de LCAT é aumentado através do uso de terapia genética. Como usado aqui, terapia genética se refere à transferência e, de preferência, à integração estável de nova informação genética em células em um indivíduo. Métodos de aumentar os níveis de atividade de LCAT por terapia genética envolvem a transfecção de células com um ácido nucleico que compreende uma sequência de ácidos nucleicos de codificação para a expressão de LCAT. As células transfectadas expressam LCAT e secretamno no plasma do indivíduo. As células são transfectadas em número suficiente, ou para uma expressão tão elevada de LCAT que aumenta a quantidade de LCAT a um nível terapeuticamente eficaz. Genes de codificação de LCAT podem ser introduzidos no indivíduo por quaíquer método adequado. Em uma modalidade, os genes são introduzidos nas células do indivíduo in vivo por meio de vetores de expressão. Em outra modalidade, os genes são introduzidos em células ex vivo, e células transfectadas que expressam e secretam LCAT são administradas ao indivíduo. Nas abordagens in vivo, as células do fígado são alvos úteis para a transfecção. Células do fígado produzem LCAT, portanto, elas possuem o maquinário de processamento para fazer a enzima recombinantemente. Além disso, os vetores injetados na corrente sanguínea rapidamente passam pelo fígado, então as células do fígado são rapidamente expostas aos vetores. Células-tronco hematopoiéticas também são aívos úteis para a terapia genética, porque elas se multiplicam rapidamente, criando assim mais células capazes de produzir LCAT. Abordagens ex vivo também são atraentes, porque permitem mais controle sobre o processo de transfecção. Por exemplo, células transfectadas podem ser testadas e as que expressam LCAT em maiores quantidades podem ser selecionadas. Células-tronco hematopoiéticas podem tiradas do indivíduo, transfectadas ex vivo e reintroduzidas no indivíduo. Portanto, em uma moda12/27 lidade as células são células do indivíduo. Métodos de transfectar genes em células de mamíferos, tanto in vivo quanto ex vivo, e obter sua expressão são bem conhecidos na técnica.

A presente descrição relaciona-se a métodos de modulação o teor lipídico das membranas dos glóbulos vermelhos aumentando os níveis de LCAT e/ou atividade acima do normal dos níveis de LCAT humano. Uma modalidade de descrição é um método de tratar um paciente tendo uma condição caracterizada por disfunção dos glóbulos vermelhos do sangue que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT. Outra modalidade de descrição é um método de tratar um paciente tendo uma condição caracterizada por disfunção dos glóbulos vermelhos compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma droga que aumenta a produção endógena de LCAT, ou aumenta a atividade de LCAT. Em modalidades particulares, a droga é um agente terapêutico de pequenas moléculas.

Algumas modalidades são direcionadas aos métodos de normalização do teor de FC das membranas celulares RBC através do aumento de LCAT, ou do aumento da atividade de LCAT em um indivíduo que dele necessite. Uma modalidade de acordo com a presente descrição é um método de tratar um paciente tendo uma condição que se caracteriza por ter RBC com teor de FC aumentado pela administração de uma dose terapeuticamente eficaz de LCAT a um paciente em necessidade do mesmo. Aumentar os níveis de LCAT rapidamente causa a transferência líquida de FC de RBC para IIDL, alterando assim a composição da membrana RBC para um estado mais fluido. Esta ação aumenta a oxigenação de RBC, melhora a reologia (aumenta a deformabilidade, o fluxo, diminui a externalização de fosfatidilserina, diminuir a propensão à adesão e agregação) diminui a anemia (diminui o estresse mecânico e a destruição associada com a diminuição da deformabilidade, aumentando a vida útil de RBC) e aumentar a capacidade de RBC de oxigenar o tecido, especialmente tecidos periféricos. Em aígumas modalidades a eritropoiese é aumentada após a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT. Em algumas modalidades a

13/27 função do óxido nítrico é aumentada após a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT. Há muitas circunstâncias em que as membranas celulares de RBC têm níveis aumentados de FC em relação aos níveis de fosfolipídios. O aumento do teor de FC nas membranas das células do sangue está presente em vários estados de doença, incluindo, mas não limitado a, anemia falciforme, diabetes, talassemia, doença reumatoide, doença autoimune, artrite, doenças do fígado, cirrose, hepatite, acantositose, sepsia, demência, anemia, ou distúrbios microvasculares, doenças inflamatórias, doenças parasitárias, disfunção erétil, câncer, pré-eclampsia, doença crítica, ou trauma.

Embora não seja uma patologia primária nestas doenças, a mudança na composição e função de RBC leva à exacerbação da morbidade das doenças subjacentes. Assim, uma modalidade da presente descrição é um método de tratar um paciente com anemia falciforme, diabetes, talassemia, doença reumatoide, doença autoimune, artrite, doenças do fígado, cirrose, hepatite, acantositose, sepsia, demência, anemia, ou distúrbios microvasculares, doenças inflamatórias, doenças parasitárias, disfunção erétil, câncer, pré-eclampsia, doença crítica, ou trauma pela administração de uma dose terapeuticamente eficaz de LCAT a um paciente em necessidade do mesmo.

Mutações do gene da hemoglobina, como na anemina falciforme (SCD), talassemias e hemoglobina E (HbE) podem resultar em uma variedade de patologias que diminuem a deformabilidade de RBC e a capacidade de transportar/liberar oxigênio. Como exemplo, SCD é uma desordem hereditária, causada por uma substituição de um único aminoácido na subunidade beta-globulina da hemoglobina (HbS). Em condições de baixo oxigênio, HbS polimeriza (agrega), levando a mudanças na forma dos glóbulos vermelhos, de côncava normal para em forma de foice. A formação de polímeros de HbS rígidos diminui a elasticidade ou a deformação de RBC, que é prejudicial à sua função, já que eles têm que ser capazes de passar repetidamente através de capilares quatro vezes menores que seu próprio tamanho para oxigenar os tecidos. Portanto, a falcização leva à doença vaso oclusiva, de14/27 vido à oclusão de vênulas pós-capilares de todos os tamanhos e fragilidade de RBC aumentada, levando à lise e anemia hemolítica. Apesar da falcização sob condições de baixo oxigênio provocar crises agudas e os principais problemas associados à doença, os glóbulos vermelhos de pacientes que não são falciformes, sob condições normais de oxigênio, possuem membranas mais rígidas com deformabilidade diminuída e agregabilidade aumentada. A análise química das membranas de eritrócitos do SCD também demonstra o teor do PC aumentado. Além disso, esses pacientes costumam ter HDL baixo com um teor de CE diminuído, inferindo uma atividade de LCAT menor, ou deficiência de LCAT funcional. De fato, em um estudo a atividade LCAT mostrou-se diminuída em 30% em pacientes com SCD, portanto, uma modalidade da presente descrição é um método de tratar um paciente com doença da célula falciforme através da administração a um paciente em necessidade do mesmo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT.

Injetar altos níveis de LCAT, por exemplo, uma quantidade que resulta em uma duplicação da atividade endógena em 1.000 vezes a atividade endógena de LCAT em pacientes com SCD, forçaria um movimento de PC de RBC e o aumento concomitante dos níveis de HDL-C. Uma redução do teor de PC de RBC levaria a um aumento na capacidade de RBC em deformar e melhorar a taxa de troca O2. A função melhorada de RBC pode diminuir os eventos oclusivos, devido a propriedades de fluxo melhores do sangue e diminuição da taxa de falcização (devido a uma melhor reoxigenação de RBC). Em outra modalidade, a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT a um paciente em necessidade do mesmo aumenta a deformabilidade e a oxigenação de RBC. Em algumas modalidades, o tempo de vida de RBC é aumentado após a administração de LCAT.

Na doença do fígado o colesterol RBC é aumentado e anemia ocorre frequentemente. A terapia com LCAT irá normalizar o colesterol RBC, restaurar forma e a função normais dos RBCs, diminuindo a destruição de RBC, aumentando o tempo de vida, reduzindo a propensão à anemia. Portanto, outra modalidade é um método de tratar um paciente com anemia pela

15/27 administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT.

Anemia de célula-alvo e célula espiculada (acantocitose): Células-alvo e espiculadas têm um teor de FC aumentado, levando à diminuição da função e ao aumento da hemólise e anemia.

Em condições como a sepsia, doenças reumáticas e doenças inflamatórias (incluindo anemia de inflamação), há grande quantidade de patologias, tais como diminuição da deformabilidade de RBC e reologia anormal, que levam a outras complicações. Danos aos tecidos e sistemas de órgãos devido à diminuição da oxigenação e ao aumento da agregação de RBC levam a um aumento da morbidade e mortalidade do insulto inflamatório inicial. Assim, outra modalidade é um método de redução da agregabilidade de RBC pela administração, a um paciente em necessidade do mesmo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT. LCAT também pode atuar sobre fosfolipidios oxidados gerados durante a inflamação. Os lipídios oxidados são muito reativos, e podem aumentar os danos às células e sistemas de órgãos. Normalizar os lipídios da membrana RBC melhoraria o fluxo e a oxigenação dos tecidos e diminuiría a concentração de lipídios oxidados reativos. Isso será útil no pós-operatório, onde as infecções ocultas podem diminuir a função de RBC, aumentando o tempo de cicatrização.

Distúrbios microvasculares podem ocorrer quando há um aumento no FC de RBC, causando assim rigidez, aderência aumentada e agregabilidade dos RBCs. Estas mudanças são ampliadas no fluxo de baixa (ou baixa pressão) encontrado em capilares e vênulas. Quando os RBCs não são capazes de deformar adequadamente, seu trânsito é diminuído em maior medida nestes pequenos vasos. Com o aumento da propensão para a agregação e adesão, há uma maior chance de bloqueios nos vasos periféricos. Em órgãos onde a microvasculatura é fundamental para o funcionamento normal (por exemplo, olhos, orelhas, cérebro, rins, pênis, pulmões), eventos isquêmicos repetidos nestes vasos poderíam levar à perda de função (por exemplo, cegueira, surdez, insuficiência renal, doença do cérebro microvascular isquêmica (por exemplo, demência, mal de Alzheimer), disfun16/27 ção erétii). O tratamento com LCAT diminuiría o FC de RBC, melhorando a reologia de RBC, diminuindo o risco de bloqueios adicionais e danos em órgãos finais.

Como demonstrado no exemplo 1 da presente descrição, camundongos com aproximadamente 30 vezes o nível normal de atividade de LCAT tiveram aumento da massa de RBC em comparação com camundongos normais, demonstrando que a atividade de LCAT é um fator importante na regulação da massa de RBC, e pode ser taxa limitante neste aspecto.

Assim, a administração de uma dose alta de LCAT, por exemplo, de 1 a 1.000 vezes o nível endógeno de LCAT, ou de 1 a 500 vezes o nível endógeno de LCAT, ou de 1 a 100 vezes o nível endógeno de LCAT a um paciente tendo uma condição caracterizada pela teologia anormal (anemia, diminuição da deformabilidade, aumento da agregação, diminuição do fluxo, diminuição do tempo de vida de RBC) resultaria em uma melhoria da condição.

Assim, outra modalidade é um método de tratar um paciente com anemia falciforme, diabetes, talassemia, doença reumatoide, doença autoimune, artrite, doenças do fígado, cirrose, hepatite, acantositose, sepsia, demência, anemia, ou distúrbios microvasculares, doenças inflamatórias, doenças parasitárias, disfunção erétii, câncer, pré-eclampsia, doença crítica, ou trauma pela administração de uma dose terapeuticamente eficaz de LCAT. Outra modalidade da presente descrição é um método de tratar um paciente com anemia falciforme, diabetes, talassemia, doença reumatoide, doença autoimune, artrite, doenças do fígado, cirrose, hepatite, acantositose, sepsia, demência, anemia, ou distúrbios microvasculares, doenças inflamatórias, doenças parasitárias, disfunção erétii, câncer, pré-eclampsia, doença crítica, ou trauma pela administração de uma droga que aumenta a atividade ou o nível de LCAT. Em modalidades preferidas a droga é uma terapêutica de pequena molécula. Em outra modalidade o nível de LCAT e/ou a atividade de LCAT é aumentada através da terapia genética.

Outra modalidade é um método de tratamento de um paciente com uma demência relacionada ao Alzheimer pela administração de uma

17/27 dose terapeuticamente eficaz de LCAT. Outra modalidade, é um método de tratamento de um paciente com anemina falciforme, diabetes, talassemia, doença reumatoide, doença autoimune, artrite, doença do fígado, cirrose, hepatite, acantocitose, sepsia, demência, anemia ou desordens microvasculares, desordens inflamatórias, doença parasitária, disfunção erétil, câncer, pré-eclampsia, doença crítica ou trauma pela administração de uma dose terapeuticamente eficaz de um LCAT modificado. Em algumas modalidades, o LCAT modificado compreende uma substituição de aminoácido conservante. Em uma modalidade o LCAT modificado compreende uma substituição na posição Fl, L3, L4, N5. L7, C31, N384 ou E416. Em várias modalidades o LCAT modificado compreende uma substituição de aminoácido na posição 31. Em outras modalidades o LCAT modificado compreende uma substituição de C31Y e uma substituição em um ou mais resíduos de aminoácido Fl, L4, L32 ou N34. Em outra modalidade o LCAT modificado compreende uma substituição de C31Y e uma ou mais das seguintes substituições: F1S, F1W, L4M, L4K, N34S, L32F ou L32H. Em várias modalidades o LCAT modificado compreende uma ou mais das seguintes susbstituições: F1A, FIG, F1I, F1L, F1M, F1P, F1V, F1Y, F1T, F1Q, F1N, F1H, F1D, L3I, L3F, L3C, L3W, L3Y, L4A, L4I, L4M. L4F, L4V, L4W, L4Y, L4T, L4Q, L4R, N5A, N5M, N5H, N5K, N5D, N5E, L7M, L7R, L7E, C31A, 0311, C31M, C31F, C31V, C31W, C31Y, C31T, C31R, C31H, N384C, N384Q ou E416C. Em outras modalidades o nível de LCAT no paciente é elevado pelo uso de técnicas de terapia de gene. Em outra modalidade a expressão de LCAT é regulada para cima através de administração de droga.

Nos métodos de acordo com a presente revelação, o LCAT geralmente é administrado para o sujeito em uma composição farmacêutica compreendendo um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável. Uma composição farmacêutica pode ser formulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para a rota escolhida de administração, ou seja, oralmente, via parenteral, rotas intravenosa, intramuscular ou subcutânea.

Composições farmacêuticas adequadas para entrega dos com18/27 postos da presente revelação e métodos para sua preparação serão prontamente aparentes para aqueles versados na técnica. Tais composições e métodos para sua preparação podem ser encontrados, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, 19^a edição (Mack Publishing Company, 1995).

As composições podem tomar tais formas como suspensões, soluções ou emulsões em óleo ou veículos aquosos, e podem conter agentes formuladores tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar na forma de pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril livre de pirógeno, antes do uso. Normalmente tais composições são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. As composições podem ser um contentor hermeticamente selado tal como uma ampola, seringa ou frasco com ou sem um conservante adicionado.

Um transportador líquido ou veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão líquido compreendendo, por exemplo, água, etanol, um poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicóis líquidos, óleos vegetais, ésteres de gliceril atóxicos e suas misturas adequadas. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pela formação dos lipossomas, pela manutenção do tamanho da partícula exigido no caso de dispersões ou pelo uso de surfactantes. A prevenção da ação dos microrganismos pode ser trazida por vários agentes antibacterianos e antifungais, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e outros. Em muitos casos, será preferencial incluir agentes isotônicos, por exemplo, açucares, tampões ou cloreto de sódio. Absorção prolongada das composições injetáveis podem ser trazidas pelo uso nas composições dos agentes de absorção retardada, por exemplo, alumínio monoestearato e gelatina.

De acordo com a presente revelação, LCAT pode ser utilizado sozinho ou em terapia de combinação com outras drogas usadas para tratar as condições anteriores. Tais terapias incluem, mas não estão limitadas à administração simultânea ou sequencial das drogas envolvidas. Por exemplo, formulações de LCAT podem ser administradas com drogas que são

19/27 usadas comumente como um padrão de cuidado para uma condição particular. Por exemplo, LCAT pode ser administrado em combinação com agentes estimulantes de eritropoiese (ESA) tais como eritropoietina, metoxipolietileno-glicol-epetina-beta, darbepoetina-α, romiplostima e epoetina-α para o tratamento de anemia. Ou, por exemplo, LCAT pode ser administrado em combinação com hidroxiurea, hidroxicarhamida, deeltabina ou butirato para o tratamento de anemina falciforme.

Em uma modalidade a quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT é administrada por injeção subcutânea. Em outra modalidade a quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT é administrada por injeção intramuscular. Em outra modalidade a quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT é administrada por injeção intravenosa ou infusão. Em algumas modalidades a quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT é de 1 mg a 5.000 mg ou de 1 mg a 2.000 mg, ou de 10 mg a 5.000 mg ou de 10 mg a 1.000 mg ou de 10 mg a 500 mg ou de 5 mg a 100 mg.

Em algumas modalidades a quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT é de 1 a 1.000 vezes, de 25 a 1.000 vezes, de 50 a 1.000 vezes, de 1 a 100 vezes, de 50 a 500 vezes ou de 1 a 500 vezes o nivel endógeno de LCAT.

A dosagem especifica usada pode variar. Por exemplo, a dosagem pode depender de um número de fatores incluindo, mas não limitado à frequência de doagem, a atividade especifica da enzima de LCAT recombinante, o peso corporal do paciente, exigências especiais do paciente, condições especiais do paciente (por exemplo, função renal ou hepática anormal), a condição sendo tratada, etc. a frequência de dosagem e quantidade pode, à critério do médico, recair fora do intervalo normal dado aqui. Essas dosagens são baseadas no sujeito humano médio com um peso de cerca de 60kg a 70kg. A determinação de dosagens ótimas para um paciente particular é bem conhecida daqueles versados na técnica. O médico será prontamente capaz de determinar doses para os sujeitos cujo peso recaiam fora desse intervalo, tal como crianças e idosos.

Dependendo da desordem e do paciente sendo tratado, alguém

20/27 versado na técnica (ou seja, um médico) podería determinar que uma dose inicial que é maior do que as doses seguintes é adequada. Por exemplo, a um paciente apresentando anemina falciforme de estado de crise deverá ser administrada uma dose inicial de 30 vezes o nível normal. Uma vez que o nível de oxigenação de RBC do paciente atinge o nível desejado a dose seria reduzida, por exemplo, para 3 vezes o nível normal.

A eficácia de uma dose particular pode ser testada por referência aos marcadores biológicos ou melhora em certos parâmetros fisiológicos. Marcadores biológicos adequados incluem, mas não estão limitados à razão de FC para PL, FC para proteína de membrana, PC para SM ou níveis de HDL-C. Parâmetros fisiológicos adequados incluem, mas não estão limitados à anemia, reologia aprimorada conforme medido por uma aumento nos RBCs, deformabilidade de RBC, fluxo sanguíneo e/ou agregabilidade de RBC, fragilidade osmótica ou nível de oxigenação de RBC; um aumento em qualquer um desses parâmetros indica melhoria. Medida de níveis de marcadores biológicos e parâmetros descritos acima podem ser medidos usando métodos que são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, anemia reduzida pode ser medida por hematócrito elevado ou hemoglobina ou produtos de degradação de hemoglobina (por exemplo, bilirubina não conjugada) medidos com técnicas clínicas bem estabelecidas padrão. Deformabilidade pode ser medida por filtragem, viscometria, ectacitometria e pelo uso de micropipetas. A agregação pode ser medida por uma variedade de instrumentos incluindo ectacitômetros e agregometros. A oxigenação de RBC pode ser medida por oximetria de pulso padrão e análise de gás sanguíneo; oxigenação de tecido pode ser medida com sondas direcionadas com tonômetros sialasticos com sensores de oxigênio. Alguém versado na técnica entendería os significados dos resultados e podería escolher ajustar a dose com base nos testes tais como os descritos acima.

Conforme descrito no exemplo 4 e mostrado na figura 2, após a administração de LCAT ao camundongo transgênico de A-1 apolípoproteína humana, níveis de HDL-C de plasma elevaram. O aumento foi surpreendentemente rápido; os níveis de HDL.C de plasma elevaram por cerca de 70%

21/27 do controle em 4horas e por cerca de 120% por 24 horas, Consequentemente, outra modalidade da revelação é um método de tratamento de um paciente com uma condição caracterizada por anemia ou disfunção de glóbulo vermelho compreendendo administração a um sujeito em necessidade de, uma quantidade terapeuticamente eficaz de LCAT em que o nível de HDL-C de plasma no sujeito é rapidamente elevado após a administração do LCAT. Em uma modalidade particular, o nível de HDL-C no sujeito 4 horas após a administração de LCAT é elevado por pelo menos 30% ou por pelo menos 40% ou por pelo menos 50%, ou por pelo menos 70% ou por pelo menos 80% do nível de HDL-C de plasma antes da administração de LCAT. Ainda em outra modalidade o nível de HDL-C de plasma no sujeito 12 horas após a administração de LCAT é elevado por pelo menos 40%, ou por pelo menos 50% ou por pelo menos 60% ou por pelo menos 70% ou por pelo menos 80%, ou por pelo menos 90% ou por pelo menos 100%, ou por pelo menos 110%, ou por pelo menos 120% do nível de HDL-C de plasma antes da administração de LCAT. Ainda em outra modalidade □ nível de HDL-C de plasma no sujeito 24 horas após a administração de LCAT é elevado por pelo menos 40%, ou por pelo menos 50% ou por pelo menos 60% ou por pelo menos 70% ou por pelo menos 80%, ou por pelo menos 90% ou por pelo menos 100%, ou por pelo menos 110%, ou por pelo menos 120%, ou por pelo menos 130%, ou por pelo menos 140%, ou por pelo menos 150% do nível de HDL-C de plasma antes da administração de LCAT.

Conforme descrito no exemplo 5, e mostrado na figura 3, a administração de LCAT para camundongos transgênicos de nocaute de LCAT/apolipoproteina A-l resultou em uma elevação no colesterol de tecido, uma elevação nos níveis de colesterol de tecido e colesterol no plasma (aorta e fígado). Os dados combinados dos exemplos 4 e 5 demonstram que a injeção de LCAT redistribui rapidamente lipídios dos tecidos para o HDL de plasma. Devido o efeito da injeção de LCAT no teor de colesterol do fígado e aorta é esperado que uma alteração similar seja rapidamente observada na células vermelhas do sangue.

Uma transferência de FC de RBC para HDL, deve alterar a com22/27 posição da membrana de RBC para um estado mais normal. Essa ação elevará a oxigenação do REC, melhorará a teologia (eleva deformabilidade, fluxo, diminui a propensão para adesão e agregação) diminuirá anemia (diminui o estresse mecânico e destruição associada com a deformabilidade diminuída, elevando a vida do RBC), e elevará a habilidade de RBC em oxigenar tecido, especialmente tecidos periféricos.

Em algumas modalidades o LCAT é administrado pelo próprio paciente seja por injeção subcutânea ou intramuscular. Auto administração é uma modalidade preferencial para tratamento crônico, incluindo, mas não limitado aos pacientes que sofrem com anemina falciforme, diabetes, doença reumatoide ou hepatite.

Exemplo 1

Efeito do nível de LCAT no hematócrito em camundonqos

O sangue foi amostrado de 3 grupos de camundongo; deficiente em LCAT (LCAT-KO), transgênico de super expressão de LCAT (-30x a atividade de normal de LCAT), e camundongos de C57/b6 de controle. Membranas de RBC foram isoladas da amostra de sangue, e colinas contendo fosfolipídeos foram medidas (Wako Phospholipids B, Richmond) como um substituto para massa de RBC ou hematócrito. A massa de RBC foi significantemente menor no camundongo deficiente em LCAT quando comparado ao sangue total do camundongo normal (402±22.0 uWml do total de sangue vs. 486+25.7 RWm), respectivamente). A anemia no camundongo deficiente em LCAT demonstrou aqui ser similar à extensão da anemia observada nos paciente de FLD. Surpreendentemente a massa de RBC foi elevada significativamente em camundongos transgênicos que super expressam LCAT quando comparados ao total de sangue dos camundongos com atividade normal de LCAT (556+20.1 RWml do total de sangue vs. 486±25.7 RWm), respectivamente). Esses resultados mostram que há um relacionamento positivo entre níveis de LCAT e hematócrito. Adicionalmente, e de modo mais importante, níveis supra-normais de LCAT podem elevar hematócrito em animais não considerados anêmicos. Estes estudos mostram que elevar níveis é uma opção terapêutica viável para pacientes com anemia devido a

23/27 uma variedade de causas, mesmo em pacientes com atividade normal de LCAT.

Exemplo 2

Composição de fosfolipídeo de Membranas de fantasma de RBC Preparadas a partir de Sujeitos Normais e SCD (não em crise).

Amostras de RBC lavadas em tampão fosfato salina foram preparadas a partir de sangue fresco coletado de sujeitos normais (n=7) e pacientes de SCD (n=6). 50 alíquotas de microtitulação de RBC empacotado foram suspensas em 0.95 ml de salina tamponada com fosfato. Lipídeos foram extraídos pela combinação de alíquotas de 0.4 ml de cada suspensão de RBC com 20 μΙ de uma solução de 1 mg/ml de 1-eicosanol em acetato de etila:acetona (2:1) (padrão interno) e 2 ml de acetato de etila:acetona:metanot (6:3:1) em tubos de vidro. Os tubos tampados foram agitados durante 2 minutos e, então, centrifugados em 2.000 rpm durante 5 min. A fase orgânica superior foi transferida para frascos de HPLC de 12x32mm. O solvente foi evaporado dos frascos sob uma corrente de N2 seguida por pelo menos 1hr do vácuo alto. Os lipídeos secos foram reconstituídos em 200 μΙ de trimetilpentano:metanol:tetrahidrofurano (95:5:2). Lipídios de membrana foram ehromatografados por cromatografia líquida de alto desempenho em uma coluna de silica. Fosfatidilcolina (PC) e sfingomielina (SM) foram detectadas e quantificadas com um detector de dispersão da luz evaporativo. Os resultados mostram que os lipídios de RBC nos pacientes de SCD são enriquecidos em PC e diminuídos em teor de SM, comparado aos sujeitos normais (figura 1), resultando em uma elevação na razão de PC/SM de 0,67 a 0,98 para controle e SCD, respectivamente. O RBC de SCD analisado neste estudo exibe um padrão de composição fosfolipídica que é distinto de RBC normal. A composição lipídica de RBC de SCD é análoga àquela relatada para RBC em outros casos de atividade baixa de LCAT de plasma.

Exemplo 3

Preparação de LCAT humano recombinante

O pCMV6-XL4/LCAT de plasmídeo que codifica proteína de

24/27

LCAT humano foi adquirido da Orígene Technologies (Rockville, MD) e ligado ao pcDNA3.1/Hygro (Invitrogen, Carlsbad, CA). O vetor de pcDNA3.1 foi r transfectado nas células HEK293f. Células transfectadas de modo estável foram selecionadas com 200 g/ml de higromicina B e cultivadas em meio 5 livre de soro Freestyle 293 (invitrogen) em frascos de agitação de10L durante 4 dias. O rhLCAT foi isolado do meio de cultura pela precipitação com cloreto de zinco por captura em lote e eluição com fenilsefarose.

Exemplo 4

Elevação de Colesterol HDL Camundongos Transgênicos de Apolipoproteí10 na A-l humana Injetados com LCAT

Camundongos transgênicos machos expressando o gene de apolipoproteina humana A-l (Jackson Laboratory) foram mantidos em uma dieta chinesa normal, ad libitum. Aos camundongos foi dada uma injeção intravenosa única de salina ou LCAT humano recombinante em salina (4 15 mgfl:g) através do seio retro-orbital. Sangue foi coletado no plexus orbital nos animais anestesiados por isoflurano em 0, 1,4, 24, 48 e 72 horas após a injeção. Concentração de colesterol de plasma foi determinada com kits comerciais de ensaio enzimático. A quantidade de colesterol em HDL (HDL-C) foi determinada por eletroforese por gel de agarose com o sistema SPIFE 20 dos laboratórios Helena. A figura 2 mostra que os camundongos que foram administrados com LCAT mostraram uma elevação significativa nos níveis de HDL-C de plasma por tanto quanto 120% de controle. O nível de HDL-C permaneceu em níveis elevados durante a duração do experimento (72 horas). O crescimento no HDL de plasma foi surpreendentemente rápido mos25 trando elevação de cerca de 70% do controle em 4 horas e cerca de 120% por 24 horas.

Exemplo 5

Efeito de Injeção de LCAT sobre o Teor de Colesterol em Tecidos de Camundongos Transgênicos de nocaute de LCAT/Apolipoproteína A-l.

Camundongos transgênicos expressando apolipoproteína A-1 humana (Jackson Laboratory) foram cruzados com camundongos LCAT-KO para obter camundongos LCAT-KO/apoA-l-Tg. Os camundongos LCAT25/27

KO/apoA-l-Tg foram mantidos em dieta normal chinesa para roedores, ad libitum, injeções intravenosas (IV) de saline ou 0.4 mg de LCAT foram realizadas diariamente durante 4 dias através de seio retro-orbitral. Animais foram sacrificados no dia 5. Animais foram anestesiados e exsanguinados por perfusão com salina heparinizada. Um lobo hepático e a aorta foram removidos de cada animal e extraídos com uma solução de clorofórmio e metanol. O colesterol nos lipídios recuperados dos tecidos extraídos foi medido com um kit comercial de ensaio enzimático.

A figura 3 mostra o teor de colesterol de (A) fígado, (B) aorta e (C) plasma para camundongos injetados com salina (Ctrl) ou LCAT (Exp). O tratamento com LCAT reduziu significativamente os níveis de colesterol no fígado e aorta e aumentou significativamente o nível de colesterol no plasma. Os dados combinados dos exemplos 4 e 5 demonstram que a injeção de LCAT redistribui rapidamente iipídeos dos tecidos para o HDL de plasma. Devido o efeito da injeção de LCAT sobre o teor de colesterol do fígado e aorta é esperado que uma alteração similar seja observada nos glóbulos vermelhos.

Exemplo 6

Uma criança (30 kg) em crise falciforme é admitida no hospital. Junto com o padrão de tratamento de cuidado, ela é infundida com 5 mg/kg de LCAT humano recombinante (rhLCAT) durante um período de 1 hora em um total de 100 ml de salina. Após o tratamento, níveis de oxigênio sanguíneo foram medidos e melhoraram. Assim que a crise é abatida, a morfologia dos glóbulos vermelhos e características físicas (deformabilidade de RBC, agregabilidade de RBC e fragilidade osmótica) são medidas e os resultados são comparados aos resultados da amostra sanguínea depois da admissão. Melhorias nas características físicas de RBC e oxigenação são mantidas com injeções subcutâneas semanais de rhLCAT em uma dose de 0,5 mg/kg. Exemplo 7

Uma mulher de 35 anos de idade (55 kg) apresentada com artrite reumatoide tem anemia com um nível de hemoglobina de 9 g/dl (intervalo normal 12-14 g/dl). É tirada uma amostra de sangue e demonstra que os

26/27 glóbulos vermelhos dela são menos deformáveis e agregam mais facilmente do que o normal. À paciente é prescrito injeções semanais de rhLCAT em uma dose de 1 mg/kg a serem administradas por via subcutânea. Hematócrito e níveis de hemoglobina são medidos após as injeções 6 semanas e são encontrado com elevação de 20%. Após 6 meses de tratamento, hemoglobina é 14 g/dl. O médico decide manter a paciente sobre rhLCAT em uma dose de 1 mg/kg injetada hi-semanalmente.

Exemplo 8

Um homem de 65 anos de idade (80 kg) é agendado para cirurgia de bypass quádruplo. O paciente é avisado para parar de tomar clopidogrel cinco dias antes da cirurgia para reduzir a chance de sangramento pósoperatório. Para reduzir o risco de ativação de plaquetas, trombose ou agregação de RBC, o paciente é trazido para o consultório médico para uma infusão de 1 mg/kg de rhLCAT cinco dias antes da cirurgia. O paciente é infundido com 1 mg/kg de rhLCAT diretamente após a cirurgia, 7 dias após a cirurgia, e 14 dias após a cirurgia. Após a recuperação (21 dias após a cirurgia), o paciente é retornado para o tratamento de clopidogrel crônico. Exemplo 9

Tranferência de Gene para super expressão de LCAT

Um paciente apresentado com artrite reumatoide acompanhada por anemia crônica. Ao paciente é administrada uma dose de 4 x 10¹² de partículas de adenoviral (AdrLCAT)Zkg por injeção através de um catéter intraportal. Níveis de LCAT são monitorados semanalmente pós-tratamento. Em quatro semanas após tratamento os pacientes possuem níveis de LCAT de 10 mg/L, ou aproximadamente duas vezes mais do que a concentração em um sujeito não artrítico. Após 8 semanas após o tratamento o paciente é monitorado mensalmente. Se o nível de LCAT do paciente cai abaixo de 5 mg/L o procedimento é repetido.

Exemplo 10

Uma criança (30 kg) em crise falciforme é admitida no hospintal. Junto com o padrão de tratamento de cuidado ela é infundida com 5 mg/kg de LCAT humano recombinante (rhLCAT) durante um período de 1 hora em

27/27 um total de 100 ml de salina. Após o tratamento, níveis de oxigênio de sangue são medidos e melhoraram. Na medida em que a crise abate, a morfologia de glóbulo vermelho e características físicas (deformabilidade de RBC, agregabilidade de RBC, e fragilidade osmótica) são medidos e os resultados 5 são comparados aos resultados da amostra de sangue tirada depois da admissão. O paciente, então, tem um procedimento em que um dispositivo médico é colocado sob a pele. O dispositivo médico compreende células de mamíferos fabricadas para secretar LCAT ativo. LCAT suficiente é liberado pelas células para crescer a atividade de LCAT endógeno por mais do que 10 100% dos níveis de LCAT normais.

Deve ser apreciado que o escopo desta invenção deve ser definido pelas reivindicações e não ser limitado pelas modalidades especificamente descritas e exemplos aqui.

Claims

1. Uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente que eleva a atividade de LCAT ou eleva o nível de plasma do LCAT ou ambos, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de um paciente com uma condição de anemia ou disfunção de glóbulos vermelhos.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente é LCAT.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente é uma droga que eleva a atividade ou nível de LCAT endógeno.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o agente é um vetor de terapia de gene.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a quantidade de LCAT é uma quantidade que aumenta a concentração de LCAT para acima dos níveis de LCAT normais ou atividade de LCAT para acima da atividade de LCAT normal.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a condição é tem por característica glóbulos vermelhos com habilidade reduzida para deformar, oxigenação reduzida, agregação e adesão elevadas, função de óxido nítrico reduzida, duração de vida diminuída ou qualquer combinação deles.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a condição é anemia.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a condição é anemia falciforme, diabetes, talassemia, doença reumatoide, doença autoimune, artrite, doença do fígado, cirrose, hepatite, acantocitose, sepsia, demência, anemia ou desordens microvasculares, desordens inflamatórias, doença parasitária, disfunção erétil, câncer, préeclampsia, doença crítica ou trauma.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que dita condição é selecionada do grupo consistindo em anemina

2/2 falciforme ou doença talassêmica.

10. Composição farmacêutica para o tratamento de um paciente com uma condição de anemia ou disfunção de glóbulos vermelhos, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente efi5 caz de um agente que eleva a atividade de LCAT ou eleva o nível de plasma do LCAT ou ambos e um diluente ou carreador farmaceuticamente aceitável.