UA112860C2 - Спосіб одержання prrsv у комерційному масштабі - Google Patents

Abstract

Винахід належить до способу одержання в комерційному масштабі вірусу репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (PRRSV), який полягає в тому, що: а) паралельно засівають в біореактор середовище для великомасштабного культивування лінії клітин ссавців, пермісивних до зараження PRRSV, і заражають клітини ссавців PRRSV; б) розмножують вірус протягом 5-7 днів після зараження; в) здійснюють першу стадію збору шляхом видалення середовища з біореактора і виділення з нього одержаного в результаті розмноження вірусу; г) поповнюють середовище в біореакторі і розмножують вірус протягом 1-4 днів; д) здійснюють другу стадію збору шляхом видалення середовища з біореактора і виділення з неї одержаного в результаті розмноження вірусу; є) поповнюють середовище в біореакторі і розмножують вірус протягом 1-4 днів; і ж) здійснюють третю стадію збору шляхом видалення середовища з біореактора і виділення з неї одержаного в результаті розмноження вірусу.

Description

Фіг. і

Підготовка 300 л біореактора згідно БОР 295-089 !

Внесення 270-280 я нотннннннттін-я« у овредовища у біорвеактов; п п

Й Внесення ІЕ85 у біореактор і. : (5 об: 55 середовища)

Регуплювапльні. параметри діт біореакторафь: те! Збір АК МА-104-клітин З б, ттемпература: 360.51 пні » роплер-фпаконів потік тазу: ЗО ЗЕРМ "Внесення АКОМА-04- перемішування Зб об/хв клітин в Біореактор | | Й я | іст 2 « « - т ше ши "Внесення вірусу у Внасення 7,000 / Розрахунок об'єму п біореактор АК МА-ЛОФ клітин в вірусу й ! додатковий флакон на основі заданої : величини МОЇ ГО

Додавання в Ї Розмноження вірусу | тт 000 додатковий протягом 5-7 днів, потім збір флакон (1-й збір)

Ще

Піпдживлення внесення 27020 л середовища: в біорвактор

Внесення КВ в біореяактор (5:06. середовища)

Ї

Розмноження вірусу протягом 1-4 днів; вотім збі е-й збір (ражим моніторингу БО)

Ї Повторне підживлення внесення 2705280 п середовища плюс

Бу ВО у біорвактор шо .

Розмноження вірусу протягом 1-4 днів, потім збір (3-й збір) режим монітерингу ОО)

Галузь техніки, до якої належить винахід

Даний винахід належить до одержання в комерційному масштабі живого ослабленого вірусу репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (РКАКЗМУ), який можна застосовувати для виробництва вакцин на його основі і використовувати їх для лікування свиней.

Передумови створення винаходу

Репродуктивно-респіраторний синдром свиней (РЕК5) розглядається багатьма фахівцями як найбільш важливе захворювання, яке в даний час завдає шкоди свинарству в усьому світі.

Синдром був описаний вперше в 1987 р. в Сполучених Штатах як "загадкова хвороба свиней" і він швидко поширився по всьому світу. Цей синдром викликає значні репродуктивні втрати, він асоційований з підвищеним рівнем смертності від вторинних інфекцій і пов'язаний зі зниженням конверсії корму та середнього добового приросту маси. На жаль, виявилося, що здійснення контролю вірусу, що викликає РЕКК5, є важким.

Вірус РКК5 (РКК5М) являє собою покритий оболонкою одноланцюговий РНК-овий вірус, який згідно з класифікацією належить до сімейства Агіегімігідае (Самапацчодй, 1997). Він викликає широко поширене захворювання свиней, яке було вперше описано в США в 1987 р. як "загадкова хвороба свиней" (НІЇЇ, 1990). Хвороба проявляється у формі респіраторного захворювання у всіх вікових групах свиней, приводячи до загибелі деяких більш молодих свиней і до серйозних проблем, пов'язаних з репродуктивною здатністю у самок случного віку.

Передача РКЕКЗМ може відбуватися і часто відбувається шляхом безпосереднього контакту між інфікованими і сприйнятливими свинями. Перенесення вірусу може відбуватися також по повітрю на дуже короткі відстані або разом зі спермою. Після зараження вірус може зберігатися в крові дорослих тварин протягом приблизно двох тижнів, а в організмі заражених молодих свиней протягом одного-двох місяців або більше. Заражені кнури можуть передавати вірус зі спермою протягом більш ніж 100 днів. Такий тривалий період віремії значно підвищує можливість трансмісії захворювання. Крім того, вірус РККЗ може проникати через плаценту протягом останньої третини періоду вагітності, заражаючи поросят в матці і приводячи до народження мертвих або ослаблених поросят.

Вірус РКК5 може заражати стада всіх типів і розмірів, включаючи стада, що характеризуються високим або звичайним статусом здоров'я, а також утримуються в закритих

Зо приміщеннях або на відкритому повітрі. У заражених стадах можуть мати місце значні втрати репродуктивності, а також підвищені рівні поствід'ємної пневмонії, що супроводжується слабким зростанням. Репродуктивна фаза, як правило, триває протягом двох-трьох місяців; однак проблеми в поствід'ємний період часто набувають ендемічний характер. Репродуктивне захворювання характеризується спалахом викиднів, що вражає як свиноматок, так і підсвинок на останньому триместрі вагітності. Мають місце передчасні опороси в період приблизно з 109 по 112 день вагітності. Зростає кількість мертвонароджених плодів і випадків народження ослаблених поросят, що призводить до значного збільшення смертності в передвід'ємний період.

Традиційно респіраторна фаза спостерігалася в розплідниках, насамперед у розплідниках з безперервно-потокової системою виробництва. Однак респіраторні проблеми, викликані вірусом

РЕКК5, можуть виявлятися також у свиней на завершальному періоді відгодівлі у формі компонента респіраторного симптомо-комплексу свиней (РКОС). Може мати місце зниження швидкості росту, збільшення відсотка нетоварних свиней і підвищення поствід'ємної смертності.

Результати діагностичних досліджень свідчать про високі рівнях пневмонії, асоційованої з вірусом РКК5 а також з широким розмаїттям інших мікроорганізмів, які зазвичай виступають у ролі вторинних збудників інфекції. Бактеріальні ізоляти можуть включати серед іншого зігеріососсив 5ці5, НаеторНпйи5 5иців, Асіїпорасійй5 рієешторпешйтопіає, Асііпобрасійй5 в5иї5,

Мусоріазта Нуорпештопіає і Равівшейа тийпосіда. Зазвичай виявленими в цьому випадку вірусними агентами є вірус свинячого грипу і респіраторний коронавірус свиней. Уражені свині рідко дають відповідь на застосовувані у високих дозах лікарські засоби і захворювання не вдається контролювати за допомогою систем одночасного заповнення приміщення тваринами і одночасного їх видалення.

Вірус РККЗМ існує у вигляді двох генотипів, позначених як "Об-тип" - Її "ЕО-тип", що характеризуються приблизно 50 95-ною гомологією послідовностей (Оеа 5. та ін, Агойп Мігої! 145, 2000, сс. 659-688). Ці два генотипу можна розрізняти також по їх імунологічних властивостях.

Найбільший обсяг інформації при секвенуванні різних ізолятів отримують на основі структурних білків, а саме, оболонкового білка СР, на частку якого припадає лише приблизно 4 95 вірусного генома, в той час як про неструктурні білки (п5р) є дуже мало відомостей. Виділення РЕКЗМ та одержання вакцин описано в численних публікаціях (М/О 92/21375, УМО 93/06211, УМО93/03760, (510) МО 93/07898, МО 96/36356, ЕР 0 676 467, ЕР 0 732 340, ЕР 0 835 930).

Вакцинація являє собою метод зниження пов'язаного з РКЕК5 навантаження який має вирішальне значення, оскільки у свиней, які одужали після РККЗ-інфекції, повинна розвинутися імунна відповідь, яка в звичайних умовах має захищати їх від повторного зараження тим же штамом вірусу. Проте вірус РКК5 має здатність змінюватися з високою швидкістю в результаті мутації, яка часто має місце в РНК-ових одноланцюгових з позитивною полярністю вірусах; і, отже, можуть виникати нові вірусні штами. У таких випадках може не мати місце перехресний захист від різних штамів і на фермах, які були інфіковані раніше, можуть відбуватися нові спалахи захворювання. Таким чином, все ще існує необхідність у розробці додаткових вакцин.

Найбільш часто вживаний метод одержання ослабленої вакцини з живим вірусом полягає у здійсненні серійного пересіву вірусу в субстрат (як правило, представляє собою клітинну культуру з клітинною лінією, пермісивною для вірусу (сприйнятливі до вірусу клітини, здатні забезпечувати його репродукцію)), відмінний від виявленого в природних умовах господаря (5), до тих пір, поки не відбудеться достатнє ослаблення вірусу (тобто зниження вірулентності або здатності викликати хворобу) для того, щоб його можна було застосовувати в якості вакцини.

Під час першого пасажу клітинну культури заражають відібраних інокулятом. Після одержання чіткого доказу реплікації вірусу (наприклад, шляхом оцінки індукованого вірусом цитопатичної дії

ІЦПДІ в інфікованих клітинах), аліквоту середовища для культури клітин або заражених клітин, або і те, й інше використовують для зараження другої культури клітин. Процес повторюють до виникнення однієї або декількох мутацій, які мають вирішальне значення у вірусному геномі, які викликають достатнє ослаблення, в результаті чого застосування вірусу у вакцині може ставати безпечним. Ступінь ослаблення, як правило, визначають емпірично, оцінюючи вплив на господаря, який зустрічається в природних умовах (5) вірусу, одержаного після постійно зростаючої кількості пасажів.

Описана вище процедура має фундаментальне значення і її з успіхом застосовували для розробки численних вакцин для людини і для застосування у ветеринарії. Однак при переході до виробництва в промисловому масштабі залишається потреба в розробці ефективного і економічного методу одержання РЕКЗУ.

Короткий виклад суті винаходу

Даний винахід належить до нового способу одержання живого вірусу РКК5, призначеного для застосування при одержанні зазначених вакцин. Способи, представлені в даному описі, можна застосовувати для великомасштабного одержання будь-якого вірусу РКК5, включаючи (але, не обмежуючись лише ними) штам РККЗМ 94881, де штам РКК5БМ 94881 депонований відповідно до Будапештського договору в Європейській колекції клітинних культур (ЕСАСС) під реєстраційними номерами ЕСАСС 11012501 ії ЕСАСС 11012502, кожен 25 січня 2011 р., чи будь-яке потомство або покоління будь-якого із зазначених вище штамів.

Більш конкретно даний винахід належить до способу одержання в комерційному масштабі вірусу репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (РКК5ЗМУ), що полягає в тому, що: а) паралельно засівають в біореакторі середовище для великомасштабного культивування лінією клітин ссавців, пермісивних до зараження РЕКЗУ, і заражають клітини ссавців РКЕКЗУ, б) розмножують вірус протягом 5-7 днів, після зараження; в) здійснюють першу стадію збору шляхом видалення середовища з біореактора і виділення з неї одержаного в результаті розмноження вірусу; г) поповнюють середовище в біореакторі і розмножують вірус протягом 1-4 днів; д) здійснюють другу стадію збору шляхом видалення середовища з біореактора і виділення з неї одержаного в результаті розмноження вірусу; е) поповнюють середовище в біореакторі і розмножують вірус протягом 1-4 днів; і ж) здійснюють третю стадію збору шляхом видалення середовища з біореактора і виділення з неї одержаного в результаті розмноження вірусу.

У деяких варіантах здійснення винаходу спосіб може додатково полягати в тому, що здійснюють після третьої стадії збору щонайменше одну стадію підживлення і стадію збору, які полягають в тому, що поповнюють середовище в біореакторі і розмножують вірус протягом 1-4 днів, і здійснюють четверту стадію збору шляхом видалення середовища з біореактора і виділення з нього одержаного в результаті розмноження вірусу.

Бажано в способі одержання задана множинність зараження (МОЇ) становить від 0,01 до 0,30 і клітини ссавців висівають з густиною приблизно від 7 х 108 до 1,0 х 109 на 300-літровий біореактор. Більш конкретно клітини ссавців висівають з густиною приблизно 1,0 х 109 на 300- літровий біореактор. У конкретних варіантах здійснення винаходу МОЇ становить 7 х 108 вірусних частинок.

Спосіб може полягати в тому, що здійснюють моніторинг концентрації глюкози в середовищі, бо при цьому першу стадію збору здійснюють у перший день, коли концентрація глюкози в середовищі знижується до рівня, що становить менш ніж 0,1 г/л.

У способі одержання в комерційному масштабі другий збір здійснюють бажано через 1 або 2 дні після підживлення середовищем, а третій збір здійснюють через 1-4 дні після другого підживлення середовищем.

У конкретних варіантах здійснення винаходу культуральне середовище додають в біореактор за день до або в той же день, коли додають клітинну лінію ссавців і РКК5. Бажано культуральне середовище додають в біореактор за один день до додавання клітинної лінії ссавців і РЕКБМУ. Температуру біореактора встановлюють на рівні 3490-3890.

У конкретних варіантах здійснення винаходу середовище містить 5 об.95 опроміненої фетальної бичачої сироватки.

Спосіб можна застосовувати для одержання в комерційному масштабі будь-якого РЕКЗУ, включаючи (але, не обмежуючись лише ними) РКК5МУ, вибраний з групи, що включає штам

РЕКЗМ 94881, депонований відповідно до Будапештського договору в Європейській колекції клітинних культур (ЕСАСС) під реєстраційними номерами ЕСАСС 11012501 ії ЕСАСС 11012502, кожен 25 січня 2011 р., МК 2332, вірусний штам І еіузїай (агент І еїустай (СОІ-МІ -2.91) або інші штами, наприклад, депоновані під реєстраційними номерами ЕСАСС 04102703, ЕСАСС 04102702, ЕСАСС 04102704, реєстраційним номером СМСМ 1І-1140, СМОМ І-1387, СМОМ 1І-1388,

АТСС МК 2332, МК 2385, У 2386, МК 2429, МЕ 2474 і МА 2402; СМОМ 1-1102, СМОМ 1-1140,

СМСОМ 1І-1387, СМОМ І-1388 або ЕСАСС У93070108; АТСС-депозит МК-2332, АТОС-депозит МЕ- 2368; АТО МА-2495; АТСС МК 2385, АТСС МК 2386, АТСС УК 2429, АТСС МУК 2474 і АТОС УВ 2402, або будь-яке потомство або покоління будь-якого із зазначених вище штамів.

Під обсяг винаходу підпадає також спосіб одержання РКЕ5М в комерційному масштабі, що полягає в тому, що а. паралельно засівають як клітини ссавців, пермісивні до зараження РККЗ5ЗУ, так і РКК5М в біореактор, який містить середовище, придатне для вирощування клітин; і б. здійснюють три послідовні стадії збору, під час яких збирають РЕКЗУ, при цьому після кожної першої і другої стадії збору середовище поповнюють, і при цьому:

І. перший збір здійснюють у перший день, коли концентрація глюкози у середовищі знижується до рівня, що становить менш ніж 0,1 г/л;

Зо І. другий збір здійснюють у день 1 або 2 після додавання середовища після першого збору; і

І. третій збір здійснюють між 1 і 4 вдень після додавання середовища після другого збору.

Можна застосовувати також альтернативний спосіб, в якому застосовують паралельний процес у ролер-флаконах, що еквівалентно описаному вище процесу в біореакторі.

Більш конкретно, даний винахід належить до способу одержання в комерційному масштабі вірусу репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (РКК5БМУ), що полягає в тому, що: а) паралельно засівають в ролер-флаконі середовище для великомасштабного культивування лінією клітин ссавців, пермісивних до зараження РКК5БУ, і заражають клітини ссавців РЕКЗМУ, б) розмножують вірус впродовж 5-7 днів після зараження; в) здійснюють першу стадію збору шляхом видалення середовища з ролер-флакона і виділення з неї одержаного в результаті розмноження вірусу; г) поповнюють середовище в ролер-флаконі і розмножують вірус протягом приблизно 2 днів; д) здійснюють другу стадію збору шляхом видалення середовища з ролер-флакона і виділення з неї одержаного в результаті розмноження вірусу; е) поповнюють середовище в ролер-флаконі і розмножують вірус протягом приблизно 2 днів; і ж) здійснюють третю стадію збору шляхом видалення середовища з ролер-флакона і виділення з неї одержаного в результаті розмноження вірусу.

Іншим об'єктом винаходу є МІ М РЕКЗМ (модифікована жива вакцина на основі РЕКЗМУ), яка містить РКАКЗМ, одержаний згідно з описаними вище варіантами способу, приготована в поєднанні з прийнятним ад'ювантом або носієм для введення свині.

Короткий опис деяких аспектів креслень

На кресленнях показано: на фіг. 1 - паралельний процес великомасштабного одержання РКН5БМУ; на фіг. 2 - опис та часові параметри паралельного процесу для 300-літрових біореакторів; на фіг. З - титри вірусу і профілі декстрози у трьох паралельних прогонах в 300-літрових біореакторах; на фіг. 4 - титри вірусу і профілі глутаміну в трьох паралельних прогонах в 300-літрових біореакторах; бо на фіг. 5 - титри вірусу і профілі розчиненого кисню (00) у трьох паралельних прогонах в

З00-літрових біореакторах; на фіг. 6 - результати ОТ-ПЛР у реальному часі, виражені у вигляді 9о віремії у тварин, вакцинованих РКЕКЗМ 94881; на фіг. 7 - паралельний процес одержання РЕК5ЗМ 94881 в ролер-флаконі; на фіг. 8 - опис та часові параметри паралельного процесу для ролер-флакону.

Детальний опис винаходу

Даний винахід належить до способів великомасштабного одержання вірусу репродуктивно- респіраторного синдрому свиней (РЕКЗМ), призначеного для застосування для виробництва вакцин та інших композицій. У загальноприйнятих методах виробництва вірус вирощують на клітинній лінії, пермісивній до зараження РКК5ЗМ. Однак у таких звичайних методах клітинну лінію вирощують до конфлюентності або до стану, близького до конфлюентності, перед зараженням РККБМ. При створенні даного винаходу неочікувано було встановлено, що клітинну лінію не потрібно висівати і вирощувати перед зараженням РКЕЗМ, а можна паралельно вносити РКК5ЗМ і клітинну лінію в процесі культивування клітин. Таким чином, важливою перевагою даного винаходу є економія часу, вартості та матеріалів, при цьому можна отримувати масу вірусу в комерційних масштабах. Поняття комерційний масштаб належить до обсягів клітинних культур, які перевищують 10 л. Наприклад, комерційний масштаб належить до масштабу виробництва від 10 до 3000 л живого РЕКБЗМ. У більш конкретних варіантах здійснення винаходу обсяг становить від 30 до приблизно 300 л.

Способи, запропоновані в даному винаході, можна застосовувати для одержання будь-якого штаму РКК5БУ, включаючи (але, не обмежуючись лише ними) штам РКК5У, депонований під реєстраційним номером АТСС УМ 2332, УК 2385, У 2386, У 2429, МЕ 2474 і МК 2402; СМСМ

І-11102, СМОМ 1-1140, СМОМ 1-1387, СМОМ 1І-1388 або ЕСАСС М93070108. У найбільш бажаних варіантах здійснення винаходу способи, пропоновані у винаході, використовують для одержання штаму РККЗМ 94881, депонованого фірмою Віозсгееп зтбБН, Мепае!5ігаззе 11, 48149, Мюнстер, Німеччина, в Європейській колекції клітинних культур (ЕСАСС), Портон Даун,

Солеобері, 30, графство Уїлтшир, 5Р4 0), Великобританія, під реєстраційними номерами

ЕСАСС 11012501 (батьківський штам) і ЕСАСС 11012502 (ослаблений вихідний вакцинний вірус (М5МУ), одержаний після великої кількості пересівань), кожен з яких депонований 25 січня 2011

Ко) відповідно до Будапештського договору, або будь-якого потомства або покоління будь-якого із зазначених вище штамів. Вирощені віруси можуть являти собою будь-які з перерахованих вище вірусів в ослабленій формі. Альтернативно цьому, вірус може бути генетично модифікований таким чином, що він містить одну або кілька гетерологичних нуклеїнових кислот, які кодують додаткові антигенні детермінанти, з якими асоційовані одна або кілька хвороб свиней.

Фахівцеві в даній галузі повинно бути очевидно, що існує ряд клітинних ліній, пермісивних до зараження РККЗУ. Прикладами клітин є клітини альвеолярних макрофагів свиней, наприклад, виведені з МАКС-145-клітин. Інші клітини, які можна інфікувати РКЕК5М, включають МА-104- клітини; клітини нирки дитинчати хом'яка (ВНК); клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО) і клітини зеленої африканської мавпи, відмінні від МА-104-клітин або МАКС-145-клітин, такі як клітини МЕКО, трансфекцію яких здійснюють. Крім того, клітини можуть являти собою первинні клітини, одержані зі свиней, які адаптовані до тривалого вирощування в культурі. Найбільш прийнятними клітинами-господарями є мавпячі клітини лінії МА-104, клітини Мего або альвеолярнімакрофаги свиней. РЕК5БМ бажано вирощують в альвеолярних легеневих макрофагах (УМепзмоогі та ін, 1991). Кілька інших клітинних ліній, таких як СІ 2621, і інші клітинні лінії, клоновані з клітинної лінії нирки мавп МА-104 (Веппйеїйй та ін, 1992; СоїІйп5 та ін, 1992; Кіт та ін, 1993), також мають чутливість до вірусу, і їх можна застосовувати в представлених у даному описі способах великомасштабного одержання.

У наведеному в якості прикладу способі, який запропоновано в даному винаході, який описано нижче у прикладі 1, представлений паралельний процес одержання ММ РКК5ЗМ 94881. Хоча ця процедура описана на прикладі ММ РККЗМ 9488, фахівцеві в даній галузі повинно бути очевидно, що для цієї процедури можна застосовувати будь-який РКК5У, для якого потрібно одержання в промисловому масштабі.

Віруси, одержані за допомогою способу одержання, який запропоновано у винаході, можна використовувати для будь-яких варіантів застосування, відомих у даний час для РЕК5БМ. У конкретному варіанті здійснення винаходу вірус, одержаний за допомогою способів, представлених у даному описі, застосовують для приготування МІ М на основі РКЕК5МУ.

Штами вірусу, вирощені згідно способу, пропонованому у винаході, можуть являти собою вірулентні РКК5-віруси, ослаблені РКК5З-віруси або істинні РККЗ-віруси, модифіковані з метою надання їм додаткових необхідних властивостей. Для досягнення цього можна використовувати 60 класичні методи розмноження та селекції, наприклад, тривале розмноження в прийнятних клітинах-господарях до досягнення ослабленого фенотипу. Альтернативно цього, штами можна генетично модифікувати за допомогою спрямованої мутації нуклеотидної послідовності генома цих штамів з використанням прийнятних методів генетичної інженерії. Геном РКК5ЗМ повністю або частково секвенований (Соп7еїтапп ін, 1993; Мешепбрегуд та ін, 1993а, Мигпйтацонй та ін, 1995), і кодує крім РНК-залежної РНК-полімерази (ОРС Та і 15), шість структурних білків, з яких чотири являють собою оболонкові глікопротеїни, позначені як СР2 (ОРС2), ОРЗ (ОРСЗ), СР4А (ОРС4) і СР5 (ОРС5), неглікозильовані мембранний білок М (ОРСб) і нуклеокапсидний білок М (ОРС7) (Мешепрбего та ін, 1995, 1996; мап Міешиувзіайі та ін., 1996). Імунологічна характеризація і нуклеотидне секвенування штамів РЕК5БМ європейського та Бб-генотипу дозволили ідентифікувати мінорні відмінності в антигенах між штамами РКК5У, локалізовані в структурних білках вірусів (Ме!І5оп та ін, 1993; МУепзмоогі та ін, 1992; Мипацой та ін., 1995).

Фактично, прикладом вірусу, який вирощується згідно з винаходом, є вірус РЕКЗМ 94881.

Коли вирощують ослаблений штам за допомогою способів, представлених у даному описі, то вірус може являти собою просто вірус РКК5М 94881, перетворений на химерний вірус, в якому каркас вірусу РЕКБЗМ 94881, депонований в ЕСАСС під реєстраційним Мо 11012502 або істинний батьківський штам, депонований в ЕСАСС під реєстраційним Ме 11012501, модифікований для заміни ендогенної послідовності однієї або декількох з ОРС Та, ОРС 16, ОРС 2, ОРС 3, ОРС 4,

ОРС 5, ОРС 6 або ОРС 7 відповідної ОРС з іншого штаму РККЗ-вірусу. Наприклад, інший штам

РАВ5-вірусу може являти собою інший європейський штам, такий як штам вірусу І еІузїай (агент

Ї еізузіад. (СОІ-МІ -2.91), або інші штами, які депоновані під реєстраційними номерами ЕСАСС 04102703, ЕСАСС 04102702, ЕСАСС 04102704, СМСМ, який має реєстраційний Мо. І-1140,

СМСМ, який має реєстраційний Мо. І-1387, СМОМ, який має реєстраційний Мо. І-1388, АТСОС УА 2332, МА 2385, МК 2386, МК 2429, МК 2474 і МА 2402; СМСМ 1І-1102, СМОМ 1І-1140, СМОМ І-1387,

СМОМ І-1388 або ЕСАСС М93070108, або фактично може представляти собою штам И5- генотипу, такий як Північноамериканський штам РЕККзЗ-вірусу, рГ7/Р129А; депозит АТС МК- 2332, депозит АТСС МК-2368; АТОС УА-2495; АТС УВА 2385, АТОС МА 2386, АТОС МВ 2429,

АТСС МА 2474 і АТСС МК 2402.

Методи рекомбінації, призначені для одержання модифікованих послідовностей, добре відомі фахівцям в даній галузі, і їх, як правило, застосовують для конструювання

Зо повнорозмірних ДНК-копій (інфекційні клони) вірусного генома, які потім можна модифікувати за допомогою методів рекомбінації і маніпуляції з ДНК (типу сайтнаправленного мутагенезу і т.д.).

Таким шляхом, наприклад, можна модифікувати антигенні сайти або ферментативні властивості вірусних білків. Інфекційні клони штамів РЕВ5-вірусу європейського та північноамериканського генотипу описані в літературі і їх можна вирощувати за допомогою способів, запропонованих у винаході.

Бажано вакцини, запропоновані в даному винаході, являють собою модифіковані живі вакцини, що містять один або кілька живих зазначених штамів в прийнятному носії, але можна застосовувати також інактивований вірус для приготування убитої вакцини (КМ). МІМ, як правило, готують таким чином, щоб можна було вводити від 10' до 107 вірусних частинок на дозу, краще від 103 до 105 частинок на дозу, більш переважно від 107 до 105 частинок на дозу (4,0-5,0 Іюдто ТСІОво). КМ можна готувати на основі попередньо інактивованих вірусних частинок з титром проти 103 до 1079 на дозу. Вакцина може містити фармацевтично прийнятний носій, наприклад, фізіологічний соляний розчин. Вакцина може містити або не містити ад'ювант.

Прикладом прийнятного ад'юванта є а-токоферолацетат, який можна отримувати, наприклад, у вигляді продукту під товарним знаком ЮОйимас Рогіе Ф. Альтернативно цьому, наприклад, можна застосовувати ад'ювант на основі квасців.

Свиней можна заражати РКК5М ороназальним шляхом. Вірус в легенях поглинається легеневими альвеолярними макрофагами і в цих клітинах реплікація РКК5М закінчується протягом 9 год. РККЗМ переміщається з легенів в легеневі лімфатичні вузли протягом 12 год. і периферичні лімфатичні вузли, кістковий мозок і селезінку протягом З днів. У цих областях лише невелика кількість клітин дають позитивну щодо вірусного антигену забарвлення. Вірус присутній у крові щонайменше протягом 21 дня і часто набагато довше. Через 7 днів у крові виявляють антитіла до РКК5МУ. Одночасна присутність вірусу і антитіла в організмі інфікованих

РАЕКЗ свиней свідчить про те, що вірусна інфекція може зберігатися протягом тривалого періоду часу, хоча і на низькому рівні, незважаючи на присутність антитіла. Протягом щонайменше 7 тижнів популяція альвеолярних клітин у легенях відрізняється від популяції в здорових вільних від патогенів (5РЕ) легень.

Вакцина може перебувати у формі висушеного виморожуванням препарату живого вірусу, її можна відновлювати в розчиннику з одержанням розчину для ін'єкцій. Таким чином, після стадій бо збору, пропонованих в даному винаході, вірус можна об'єднувати і піддавати сушці виморожуванням. Розчинник може являти собою, наприклад, воду, фізіологічний розчин або буфер, або розчинник, що представляє собою ад'ювант. Розчинник може містити ад'юванти, наприклад, а-токоферолу ацетат. Відновлену вакцину можна потім ін'єктувати свині, наприклад, шляхом внутрішньом'язової або внутрішньошкірної ін'єкції в шию. Для внутрішньом'язової ін'єкції можна застосовувати об'єм 2 мл, для внутрішньошкірної ін'єкції, як правило, застосовують обсяг 0,2 мл. Таким чином, наступним об'єктом даного винаходу є продукт у вигляді вакцини, який містить в різних контейнерах висушену виморожуванням композицію, що включає вірус, і розчинник для відновлення і необов'язково додатково містить листівку або етикетку, що включає інструкції по застосуванню.

Вакцина, приготовлена з вірусу, який отримували способом, запропонованим у винаході, може містити не тільки один чи декілька з вищезазначених штамів, але може включати також і інші компоненти, які мають активність щодо РЕКЗ або інших вірусних або бактеріальних хвороб свиней, типу цирковірус свиней або класичного вірусу свинячого грипу. Крім того, винахід також стосується зазначеної вакцини, що відрізняється тим, що вона містить щонайменше один додатковий антиген, активний відносно хвороби свиней, відмінної від РЕКЗ. Крім того, вакцина може містити певні застосовувані у фармацевтиці або ветеринарії ад'юванти. Одним з таких ад'ювантів є а-токоферол. Таким чином, нові композиції вакцин, зокрема, вакцин, що містять

РАВ5-вірус, такий як РЕКЗМ 94881, можна додатково покращувати, додаючи ад'юванти. Такі поліпшення передбачають приготування вакцин в поєднанні з ад'ювантами, що підвищують ефективність вакцини, в результаті чого отримують кращу клінічну відповідь / результат при введенні в поєднанні ад'юванта і вакцини в порівнянні з застосуванням тільки вакцини.

Наприклад, композиції вакцин, пропоновані у винаході, можуть містити вакцину на основі вірусу

РЕКЗМ 94881 і ад'ювант, вибраний з групи, що включає МСР-1, фракції Наеторнійй5 зоптив,

Саграро! "М та їх комбінації. У деяких варіантах здійснення винаходу вірусна вакцина являє собою вакцину на основі вірусу РКЕКЗМ 94881, яка може містити рекомбіновану суб'одиничну вакцину або в альтернативному варіанті може являти собою вакцину на основі живого ослабленого вірусу. Прикладом відомої живої вакцини є Іпдеїмас Є РКК5 МІУ, ї на основі

РЕКЗМ 94881 можна приготовляти форму методом, аналогічним методом, застосовуваним для одержання ІпдеїммасюР Ки МІ М.

Зо Крім того, композиції вакцин можуть містити інші інгредієнти, якщо інші інгредієнти не впливають на властивості ад'ювантів, таких як МСР-1, фракції Наеторпій5 зоптив, Саграрої м або інший карбомер, або що лежить в основі композиції вірусної вакцини. Такі інші інгредієнти включають, наприклад, сполучні речовини, барвники, десиканти, антисептики, агенти, які змочують, стабілізатори, наповнювачі, адгезиви, пластифікатори, прилипачі, розпушувачі, матеріали пластирів, мазеві основи, речовини для видалення кератину, основні субстанції, підсилювачі абсорбції, жирні кислоти, ефір жирної кислоти, вищі спирти, поверхнево-активні речовини, воду і забуферюючі агенти. Кращими додатковими інгредієнтами є забуферюючі агенти, мазеві основи, жирні кислоти, антисептики, основні субстанції або поверхнево-активні речовини.

Вміст або кількість ад'ювантів, застосовуваних згідно винаходу, можна варіювати і його можна визначати, беручи до уваги, наприклад, властивості застосовуваної вакцини на основі

РЕКФЗМ і форму лікарського засобу. Компонент, що представляє собою ад'ювант, може містити, наприклад, від 1 до 100 мас. 95. Композиції на основі РККЗМ 94881, пропоновані у винаході, отримують шляхом змішування компонента, що представляє собою ад'ювант, і компонента, що представляє собою вірусну вакцину, або індивідуально, або в поєднанні з різними іншими інгредієнтами. Композиції можуть являти собою такі композиції, в яких вірусна вакцина і ад'ювант присутні в складі однієї препаративної форми, або в альтернативному варіанті ад'ювант і вакцина присутні в складі окремих препаративних форм, які можна вводити одночасно або послідовно.

Так, при введенні в організм тварин компонент, що представляє собою ад'ювант, запропонованих у винаході імуногенних композицій можна вводити окремо від вірусної вакцини.

В альтернативному варіанті ад'ювант, застосовуваний відповідно до винаходу, можна вводити спільно з вірусною вакциною у формі єдиної композиції вакцини. Вірусна вакцина може являти собою будь-яку вірусну вакцину. У більш конкретних варіантах здійснення винаходу пропонується застосовувати вакцину на основі вірусу РКК5, що містить РКЕКЗМ 94881. Крім того, таку вакцину можна об'єднувати з іншими вакцинами, такими як МІ М РКЕЗ5 ІпдеїЇмас Ф та / або Рогсіїї5 Ф. Це є лише одним із прикладів комбінованої вакцини на основі вірусу РЕН5Б, можна легко приготовляти та інші подібні комбінації вакцин.

Імуногенні композиції, представлені в даному описі, найбільш доцільно застосовувати для бо індукції гуморальної імунної відповіді на РКК5-вірус. Зокрема, при створенні даного винаходу встановлено, що застосування зазначених специфічних ад'ювантів, і зокрема МОСР-1, підвищує імунну відповідь на РАВ5-вірус при спільному введенні ад'юванта і вакцини на основі РЕКЗ- вірусу в порівнянні з введенням тільки вакцини. Встановлено, що при такому застосуванні відбувається зменшення серйозності клінічних симптомів, таких як легеневі ушкодження, анорексія, знебарвлення шкіри, загальмованість, респіраторні симптоми, муміфікація поросят, кашель, діарея та їх комбінації, які асоційовані з зараженням РЕК5М. Фактично при застосуванні комбінації вакцини та ад'юванта виявлено більш значне зниження серйозності клінічних симптомів, асоційованих із зараженням вірусом РЕКЗ5, порівняно зі зниженням серйозності зазначених симптомів при введенні тільки вакцини у відсутності зазначеного ад'юванта.

У результаті композиції істотно поліпшують клінічний результат у хворої тварини в порівнянні з результатом при введенні тільки вакцини на основі РКЕК5-вірусу. У конкретних варіантах здійснення винаходу покращений клінічний результат являє собою зниження відсотка легеневих ушкоджень в порівнянні з тваринами, яким не вводили імуногенну композицію в поєднанні з вказаним ад'ювантом. В інших варіантах здійснення винаходу покращений клінічний результат являє собою зниження рівня віремії у тварин в порівнянні з тваринами, яким не вводили імуногенну композицію в поєднанні з вказаним ад'ювантом.

Таким чином, одним з об'єктів винаходу є покращена вакцина, більш конкретно поліпшена вакцина на основі РЕКЗ-вірусу, де удосконалення включає змішання з вірусною вакциною ад'юванта, вибраного з групи, що включає МСР-1, фракції Наеторпіїи5 зопіти5, карбапол та їх комбінації. Композиція вакцини, запропонованої у винаході може включати також фармацевтично прийнятний носій. Крім того, вакцини можуть містити інші діючі речовини, включаючи Н5, ОРС 5, ІМЕ-альфа, полі ІСІ С, 1-12, для додаткового посилення функції вакцини проти РЕКФ5Б. Зазначені ад'юванти можна вводити індивідуально або в поєднанні з МСР-1.

Композиції вакцин, пропоновані у винаході, можна приготувати за допомогою будь-якого методу, відомого в області приготування препаративних форм, наприклад, у вигляді, рідких препаратів, суспензій, мазей, порошків, лосьйонів, М/ / О-емульсій, О / М/-емульсій, емульсій, кремів, катаплазм, пластирів і гелів, і їх переважно застосовують як лікарських засобів. Таким чином, іншим об'єктом даного винаходу є фармацевтична композиція, що містить вищевказану

Зо композицію вакцини. Композиція вакцини, пропонована в даному винаході, при її шкірному введенні може істотно індукувати вироблення антитіл. Таким чином, в іншому кращому варіанті здійснення даного винаходу композиція вакцини може перебувати у формі трансдермального препарату.

На додаток до описаного вище, вірус і ад'ювант, запропоновані в даному винаході, можна вводити в організм разом у вигляді однієї композиції вакцини або у вигляді препарату ад'юванта, окремого і відмінного від антигенного компонента вакцини, що представляє собою

РАВ5-вірус, при цьому дія ад'юванта полягає в тому, що титр антитіл, що виробляються в організмі у відповідь на введення вакцини на основі РКК5-вірусу, може істотно зростати в порівнянні з введенням тільки вакцини на основі РЕКзЗ-вірусу. Таким чином, ще одним об'єктом даного винаходу є спосіб підвищення титру антитіл проти РКК5З-вірусу, що полягає в тому, що вводять в організм одночасно або послідовно в імунологічно ефективній кількості вакцину на основі РЕК5-вірусу і ад'ювант, вибраний з МСР-1, фракцій Наєторнійи5 зоптив, Карбопол та їх комбінацій, або індивідуально, або в поєднанні з додатковим компонентом, вибраним з групи, що включає Н5, ОРС 5, ІМЕ-альфа, полі ІСІ С, 1-12 та їх комбінації, в кількості, ефективній в якості імуноадьювантів. Коли ад'ювант і вакцину на основі РКК5-вірусу вводять в організм, то клінічний результат у тварини поліпшується. Ефективну кількість ад'юванта і імунологічно ефективну кількість вакцини на основі РККЗ-вірусу може легко визначати звичайний фахівець у даній галузі з урахуванням, наприклад, типу і властивостей антигенної субстанції, виду організму, віку, ваги тіла, серйозності захворювань, типу захворювань, часу введення і методу введення, а також використовуючи як показника титр антитіла, що утворився проти антигенної субстанції в організмі.

Вакцину на основі РКЕКзЗ-вірусу, ад'ювант чи комбінацію можна вводити в організм будь- яким прийнятним методом, вибраним, наприклад, залежно від стану пацієнтів та особливостей захворювань. Прикладами таких методів є внутрішньоочеревинне введення, шкірне введення (наприклад, підшкірна ін'єкція, внутрішньом'язова ін'єкція, внутрішньошкірна ін'єкція. і застосування пластирів), назальні введення, оральне введення, нанесення на слизову оболонку (наприклад, ректальне введення, вагінальне введення і введення в рогівку). Кращим є внутрішньом'язове введення.

Прикладом терапевтичної дози МІ М РКК5МУ є доза об'ємом приблизно два мілілітри (2 мл). бо Фахівцям у цій галузі має бути очевидно, що кількість дози може змінюватись в залежності від породи, розміру та інших фізичних факторів індивідуума, в також від специфічної форми МІ М

РЕКЗМУ і шляху введення. Краще МІ М РКК5М вводять у вигляді одноразової дози; однак можна застосовувати додаткові дози. | в цьому випадку фахівцеві в області, до якої належить даний винахід, має бути очевидно, що на дозу і кількість доз впливає вік і фізичний стан конкретної свині, а також інші загальновідомі в промисловості обставини і специфічні умови введення МІ М

РАВ5У.

У деяких інших варіантах здійснення винаходу вакцина може являти собою мультивалентну вакцину, яка містить два або більшу кількість РЕКЗ-вірусів, з яких щонайменше один з РЕКЗ- вірусів являє собою ослаблений штам 94881 вірусу, депонований в ЕСАСС під реєстраційним

Мо 11012502. Інші РКК5-віруси можуть являти собою один або кілька вірусів, вибраних з групи, що включає штам РКК5ЗМУ, депонований під реєстраційними номерами вірусного штаму І! еїухїай (агент І езуєтай (СОІ-МІ -2.91)), або інші штами, такі як депоновані під реєстраційними номерами

ЕСАСС 04102703, ЕСАСС 04102702, ЕСАСС 04102704, реєстраційним номером СМСМ 1-1140, реєстраційним номером СМСМ 1-1387, реєстраційним номером СМСМ 1І-1388, АТС МА 2332,

МК 2385, МК 2386, МК 2429, МК 2474 і МК 2402; СМСМ 1-1102, СМОМ 1І-1140, СМОМ 1-1387,

СМОМ І-1388 або ЕСАСС М93070108, або також можуть являти собою О5З-штам, такий як північноамериканський РКК5-вірус, рТ7Р129А; АТСС-депозит МК-2332, АТОС-депозит МК-2368;

АТО УВ-2495; АТОСС УА 2385, АТОС УА 2386, АТО УВА 2429, АТОСС УВ 2474 і АТСС МЕ 2402.

Вакцини на основі РКЕКЗ-вірусів можна застосовувати для вакцинації, як поросят, так і свиноматок. В одному з об'єктів винаходу конкретний режим введення доз вибирають на основі віку свиню та антигену, відібраного для введення. Можна обробляти свиней будь-якого віку найбільш ефективною дозою з урахуванням одержаних при створенні винаходу даних про те, що зараження РКН5БМУ (як при впливі вірусом дикого типу, так і при вакцинації) є істотно більш швидким у разі тварин старшого віку. Так, в деяких аспектах кращою є вакцинація тварин старшого віку, але вакцинація білош молодих свиней, включаючи тварин віком три тижні і менше, сприяє індукції активного імунітету і також є дуже цінною. Вік тварин може являти собою важливий фактор при контролі РЕКЗ і може являти собою фактор, що впливає на вакцинацію і розвиток ефективної імунної відповіді. Таким чином, вік, план лікування захворювання, тваринницьке господарство, вроджений і активний імунітет є важливими, і їх слід розглядати

Зо при створенні стратегій контролю.

Вакцину на основі РКК5М 94881 можна вводити будь-яким загальноприйнятим чином і в деяких бажаних методах її вводять назально. Краще, щоб введення одноразової дози вакцини на основі РККЗМ забезпечувало сприятливі впливи щодо лікування або зниження серйозності або частоті виявлення інфекції, спричиненої РККЗМ, як це має місце у випадку Іпдеїмасф), однак, якщо вибирають інші антигени або комбінації, або мультивалентні вакцини, то має бути очевидно, що їх можна вводити прийнятим для них чином, який може передбачати застосування однієї або декількох бустерних доз після початкового введення. Фахівці в даній галузі можуть визначати відповідні рівні доз залежно від вибраної вакцини на основі РЕК5М і вікового діапазону тварин, яким слід вводити антиген.

Приклад 1:

Приклад підвищення масштабу виробництва МІ М РКНЗМ 94881

Підвищення масштабу процесу одержання РКЕК5БМ 94881 з використанням МА104-клітин, які були піддані 64-84 пасажів, здійснювали в З0О0-літровому біореакторі. Зазначені клітини розмножували в ролер-флаконах площею 850 см (фірма Согпіпд). Клітини культивували паралельно із зараженням вірусом в З0О0-літрових ерліфтних біореакторах. У процесі культивування здійснювали моніторинг концентрацій (в г / л) декстрози / лактози в середовищі.

При зборі рідини відкидали, а зразки з вірусом зберігали.

Склад середовища представлений у наведеній нижче таблиці: гамма-випромінюванням червоного

Готували суміш, що містить середовище МЕМ без фенолового червоного, неоміцин і1,4 г/л бікарбонату натрію, і фільтрували. Водночас із внесенням до біореактор в середовище додавали ЕВ5. Кількість доданого неоміцину розраховували згідно з такою формулою: об. (Л) х

ЗО мг / л я концентрація (мг / г основи).

Паралельний процес вирощування РКЕКЗМ 94881 включав внесення АК МАТ104-клітин в біореактор і одночасне зараження клітин за допомогою посіву вірусу РЕКЗМ 94881. На фіг. 1 представлена схема паралельного процесу. На фіг. 2 наведені часові параметри паралельного процесу, представленого на фіг. 1.

При здійсненні паралельного процесу середовище обсягом 270 л стерилізували фільтрацією в біореакторі. Середовище додавали в посудину в той же день, коли додавали клітини і сироватку, або за день до цього. Якщо середовище додають в біореактор за 1 день до додавання клітин і сироватки, то рекомендується активувати контроль температури для того, щоб забезпечити підтримку температури середовища на рівні 35 г С, здійснюючи при цьому контроль значення рН, підтримуючи його на рівні 7,25:0,1, і здійснювати моніторинг рівня СО і перемішування зі швидкістю 35 об / хв. У день додавання клітин і опроміненої фетальної бичачої сироватки (ІЕВ5) пристрій для контролю температури налаштовували на 36 г С. ІРВ5 вносили в біореактор після додавання середовища і перед посівом клітин. Необхідна концентрація ІЕВ5 становила 5 об. 95, Тобто на обсяг 270 л середовища в біореакторі додавали 14,0 л ІЕВ5.

Здійснювали три прогони в 300-літровому біореакторі. Використовували наступні параметри біореактора: температура - 36 2 С, рнН-7,25 в режимі контролю, моніторинг рівня БО і перемішування при 35 об / хв. У таблицях 3, 4 і 5 представлені дані реєстрації рівнів БО (95) на основі індукційного часу окислення (ОТ), декстрози і лактату на основі аналізу фірми У5Іі рН і

ІЇ-глутаміну на основі аналізу фірми МОМА. РО-титри дані тільки для порівняння. ОС-титри представляють собою офіційні титри.

Таблиця 3:

Результати прогону партії ООІРО-Х в 300-літровому біоректорі рН О 0095 | Декстроза Лактат Сіп Коментар г/л г/л мольлл | РО Її ОС 111118 уві | МОМА |тСіОю|тТсю| ( середовище

ОРІ! 72 92 | МА | МА | МА | МА | МА | МА бРІ|Ї725 30 | 0011 | 0902 | 0,74 | 638 | 6,7 | опрозорий//

І 7РІ|Ї724| 30 | 0 | 0855 | 049 | 740 | 74 | мутнийЙ/

У таблиці З представлені результати для партії 001РО-Х, одержані протягом 7 днів після зараження. Зразки відбирали щодня і прогін закінчували в день 7РІ (після зараження). Значення рН було встановлено на 7,25, і воно знаходилося на постійному рівні протягом прогону за винятком дня 4РІ, коли воно впало нижче 7,0. У день 4Р рівень глюкози знизився до 0,4 з рівня 0,74, який мав місце за 1 день до цього, починалося поглинання глутаміну і вихідний титр зростав приблизно на 1 Ібсд. Величина титру досягала піку в день 5РІ, коли мало місце повне поглинання глюкози (х 0,1 г / л). Крім того, в день 5РІ рівень БО знижувався до 30 95, і в цей момент часу починали його контроль для того, щоб уникнути падіння рівня БО до нуля протягом ночі. У день 6РІ титр знижувався, а потім зростав до 7,4 в день 7РІ. Зразок ставав каламутним на день 7РІ.

Таблиця 4:

Результати прогону партії 002РО-Х у 300-літровому біоректорі

ВС ПО ол с БОС МЕН ож пеня НОЙ г/л г/л мольлл| РО | ОС 17111118 | БІ | МОМА тСібю|тТсОю| 77777771 середовища

ГГ ект клітин/сироватки/посів вірусу

ЗР Щ|724| 70 | 0762 | 0223 | 141 | 593 | 6 | МА ( .4РІ |719| 60 | 0409 | 0561| ї25 | 662 | 65 | МА 5РІ |721| 30 | 005 | 0881 | 09 679 | 75 | (Зм збі підживлення

ВІРІ 689) 116 | 0247 | 0,726 | 138 | 713 | 75 | МА ( етери пере шелеви знизився до нуля вЗРІ |713| 116 | 00 | 0865| 066 | 669 | 75 | прозорий о ваРІ |713| 116 | 00 | 0819 | бі | 752 | 75 | прозорий

І вБРІ |7и3| 116 | 00 | МА | 01 | 7 | 73 | деякепомутніння:С

У таблиці 4 представлені результати для партії 002РО-Х (ВОРІ - момент часу, коли виробляли підживлення культури). З урахуванням титрів, одержаних для партії 001РО-Х, в якості дня збору вибирали день 5РІ. Для партії 002РО-Х дні з 1РІ до 5РІ відповідали днях для партії 001РО-Х. Здійснювали збір вмісту біореактора і потім проводили підживлення в день 5РІ.

Будували криву зростання для визначення моменту для збору-іІ. Зразки відбирали щоденно протягом 5 днів. Повне поглинання глюкози сталося до дня КОРІ (день 2 після підживлення).

Було встановлено, що титр перебував на піковому рівні протягом 5 днів (варіації на рівні 0,5 Ід знаходилися в межах похибки методу). Повне поглинання глутаміну сталося до дня КОРІ. Після підживлення БО в пробі був відсутній. Рівень БО не вдалося виміряти (найбільш ймовірно він близький до нуля). У день КАРІ клітини все ще знаходилися в прикріпленому стані, оскільки зразок у посудині був прозорим. У день КБРІ у зразку в посудині виявлена деяке помутніння, яке свідчить про те, що клітини могли починати від'єднуватися від спіралі (носія).

Таблиця 5:

Результати прогону партії О0ОЗРО-Х у 300-літровому біоректорі тер реетове ре р г/л г/л моль/л РО (2.8; 01771111 м8І | МІ 0 МОМА |ТСіОю|тТСіЮю!| 4: Ф "

ОРІ 1749) 78 | МА | МА | МА | МА | МА | МА / 1РІ 7,25 0,987 0,078 2,05 4,38 4,7 моніторинг ро /контроль значення рн еРІ |723| 66 | 0935 | 0107 1,9 | 51з| 57 | МА

ЗРІ |722| 60 | 0783 | бі 171 | 62 | 65 | МА .4РІ 729| 53 | 0453 | 0519 145 | 636 | 66 | МА підживлення ро ваРІ |723| 7 | 00 |0,917 | 182 | 685 | 75 | збір підживлення

Таблиця 5:

Результати прогону партії О0ОЗРО-Х у 300-літровому біоректорі пил Я Бо са БИ ПВА ВЗ Піна г/л г/л моль/л РО (2.8; на рівні 10 95 сере рр я тр ре ро рівня ОО евнбРІ |722| 62 | МА | МА | 006 | 65 | 70 | мутність

І 2в7РІ |724| 68 | МА | МА | 004 | 6,36 | 62 | »мутність

У таблиці 5 представлені результати для партії О0ОЗРО-Х. З урахуванням титрів, одержаних для партії О02РО-Х, в якості дня збору-ІЇ можна було вибирати день 1РІ або 2РІ. Було вирішено збирати рідини на день 2РІ для додання гнучкості процесу одержання. Будували криву зростання за 7 днів для визначення моменту для збору-ІЇї. Зразки відбирали щодня. Повне поглинання глюкози сталося до дня 2Ка2РІ. Титр зберігався на піковому рівні протягом 4 днів, а потім знижувався до 7,0 протягом 2 днів (варіації на рівні 0,5 Ісд знаходилися в межах похибки методу), після чого знижувався до 6,2 в день 7РІ. Повне поглинання глутаміну сталося до дня 2К5РІ. БО контролювали в день 2К2РІ для моніторингу загибелі клітин.

Фаза збору-І при розмноженні вірусу в З00-літровому масштабі:

За кривою зростання для збору-І (партія 001РО-Х) видно, що кількість вірусних частинок продовжувала збільшуватися до дня 7РІ, незважаючи на повне поглинання глюкози («х 0,1 г / л) до дня 5РІ. Поглинання глутаміну починалося, коли концентрація декстроза становила приблизно половину від початкової концентрації 1 г / л (день 4РІ), а потім після поглинання глюкози глутамін, ймовірно, ставав основним джерелом енергії. Нестабільність даних для глутаміну для перших 2-3 днів могла бути пов'язана з флуктуаціями, характерними для влаштування МОМА, оскільки його концентрація в середовищі становила тільки 2 моль / л.

Зниження рівня БО узгоджувалося з процесом метаболізму глюкози / глутаміну і рівнем розмноження вірусу.

На основі кінетики розмноження вірусу було зроблено припущення про те, що вірус слід збирати у дні 5-7РІ. Варіація в ОС-титрах між днем 4РІ ії 7РІ знаходилася в межах похибки методу (ж 0,71 Іод / мл). Критерієм для здійснення збору-І був момент часу, коли відбувалося повне поглинання глюкози (х 0,1 г / лу, що узгоджувалося з даними, одержаними в З0-літровому масштабі (досвід Мо 6127-1310-09К-198). Таким чином, для відстеження рівнів глюкози було необхідно періодично здійснювати вимірювання рівня декстрози, починаючи з дня 4РІ. У таблиці

З продемонстровано, що вірус РКК5М 94881 зберігав стабільність протягом З днів (дні 5-7РІ) в

З00-літровому біореакторі після виснаження декстрози. Однак, якщо здійснювати другий збір на основі результатів, представлених в таблицях 4 і 5, то слід рекомендувати здійснювати збір-ї в перший день, коли концентрація глюкози досягне рівня «0, І г / л (за даними У5І-вимірювань),

Зо для гарантії того, що забезпечується клітинна адгезія на спіралях (носіях) в біореакторі.

Фаза збору-ІІ при розмноженні вірусу в 300-літровому масштабі:

Для партій 002РО-Х і О00ЗРО-Х після збору-їІ, який здійснювали в день 5РІ, додавали свіже середовище і 5 95 сироватки для одержання придатних для другого збору рідин, які містять вірус (таблиці 4 і 5). Середовище МЕМ (270-280 л), доповнене ІЕВ5 (5 об. 95), вносили в біореактор з використанням таких же процедур, які описані для першого збору продукту.

Будували криву зростання для збору-їЇ протягом 5 днів для партії О02РО-Х, і при цьому титр досягав пікового значення в день 1 після підживлення (див. таблицю 4). Титр залишався стабільним протягом 4 днів. Титр вірусу в день 1 після підживлення виявився порівнянним з титром при першому зборі (таблиця 3). Декстроза повністю поглиналася на день 2РІ. Період часу, що включає чотири дні після підживлення, можна використовувати в якості критерію другого збору. Проте здійснення другого збору в день 4РІ може впливати на третій збір, оскільки в зразках рідини, відібраних в день 4РІ, виявлено деяке помутніння, що свідчить про клітинну загибель або про відкріплення клітин від спіралей. З цієї причини для партії О0ОЗРО-Х збір-їЇ здійснювали в день 2РІ. Грунтуючись на даних, одержаних для партії ООЗРО-Х, рекомендується в якості цільових днів для збору-їЇ розглядати результати 1-2РІ в тому випадку, якщо планується здійснювати друге підживлення і третій збір.

Фаза збору-ІІЇ при розмноженні вірусу в З00-літровому масштабі:

Для партії О0ЗРО-Х (таблиця 5) після збору-ІЇ, який здійснювали в день 2РІ, в посудину вносили додаткову партію середовища та сироватки для одержання придатних для третього збору рідин, які містять вірус (таблиця 5). Середовище МЕМ (270-280 л), доповнене ІЕВ5 (5 об. 95), вносили в біореактор з використанням таких же процедур, які описані для першого збору продукту. Будували криву зростання для збору-ІІ протягом 7 днів, в цьому випадку титр досягав пікового значення в день 1 після підживлення (див. таблицю 5). Титр залишався стабільним протягом 4 днів. Титр вірусу в день 1 після підживлення виявився порівнянним з титром при другому зборі (таблиці 4 і 5). Декстроза повністю поглиналася на день 1РІ. Період часу, що включає чотири дні після підживлення, можна використовувати в якості критерію третього збору.

На трьох представлених нижче графіках наведені профілі декстрози, глутаміну і БО, а також титри для трьох прогонів, здійснюваних у З300-літровому біореакторі. Метою побудови цих графіків була демонстрація порівнянності даних, одержаних в трьох прогонах.

На фіг. З представлено узагальнення результатів для всіх трьох прогонів, здійснюваних у

З00-літровому масштабі, що стосуються поглинання глюкози і вірусних титрів. Профіль збору-Ї для трьох прогонів виявилися повністю зіставними, декстроза повністю поглиналася (х 01 г / л) до дня 5РІ, і це збігалося з піком титру в трьох проведених прогонах. Після першого підживлення рівень глюкози був нижче 0,3 г / л у партіях 002РО і 00З3РО на день 1РІ, а титр вже досягав піку. У день 2РІ декстроза повністю поглиналася, а титр вірусу зберігався па піковому рівні. Для збору-Ш в партії 00З3РО, коли здійснювали другу підживлення в день КаРІ, концентрація глюкози знижувалася до дня 2КІ1РІ до рівня нижче ніж 0,1 г / л, а титр перебував на піковому рівні.

На фіг. 4 представлено узагальнення результатів для всіх трьох прогонів, здійснюваних у

З00-літровому масштабі, що стосуються поглинання глутаміну і вірусних титрів. Як видно для профілю для збору-І, результати, одержані для трьох прогонів, були дуже подібними. Рівень глутаміну знижувався до половини від його початкової концентрації 2 моль / л до дня 5РІ, і це

Зо збігалося з піком титру в трьох проведених прогонах. Після першого підживлення рівень глутаміну знижувався до половини від початкової концентрації до дня 2РІ в партіях 002РО і 00ОЗРО, а титр досягав піку вже в день 1РІ. Для збору-ПІ в партії 00ОЗРО, коли здійснювали другу підживлення в день КОРІ, відбувалося повільне поглинання глутаміну, починаючи з дня 0 до дня 5РІ, при цьому титри вірусу зберігалися, а потім клітини починали гинути і титр знижувався до дня 7РІ.

Як видно з профілю для збору-І, у всіх трьох прогонах були отримані дуже подібні результати, рівень БО знижувався до 30 95 до дня 5РІ, і це збігалося з піками титрів в трьох проведених прогонах. Після першого підживлення для партії 002РО-Х в пробі не вдалося виявити СО, тому дані не були отримані, для партії Ф0ОЗРО-Х рівень БО знижувався на день 1РІ, що збігалося з піком титру. Для збору-П в партії ООЗРО, коли здійснювали друге підживлення в день КОРІ, рівень БО швидко знижувався аж до дня ЗРІ, коли починалася загибель клітин, і БО був поглинений повністю (до 0) до дня 5РІ, при цьому титри вірусу зберігалися, а потім клітини починали гинути і титр знижувався до дня 7РІ.

Таблиця 6:

Узагальнення умов і результатів прогонів паралельного процесу в 300-літровому біореакторі 7 х задані умови (0,1МОЇ, 7,0 х 109 клітин в цілому на 3З00-літровий біореактор, рН 7,25 і 362С) (НТ): Означає перший збір в днях після зараження. (Н2): Означає другий збір в днях після зараження. (НЗ): Означає третій збір в днях після зараження.

Рідини, які містять вірус з партії 001РО-Х знезаражували і відкидали. Один літр збору-Ї з партії 002РО-Х зберігали для вивчення і додавали 505 (25 об. 95), Решту рідини знезаражували і відкидали. Два літри збору-ІЇ з партії ООЗРО-Х витримували в замороженому вигляді для концентрування, решта рідини знезаражували і відкидали.

Діапазон густини посіву клітин (РОСОЮ) для 300-літрового масштабу:

Задана густина посіву клітин (РСОЮ) становила в цілому 7,0 х 109 клітин на З0О0-літровий біореактор з робочим об'ємом 270-280 л. На основі результатів звіту про кінцевий процес перенесення з З0-літрового біореактора (6127-1310-09К-198), діапазон загальної кількості клітин, які засіваються, становив от 7,0 х 108 - 1,0 х 109 на З0-літровий біореактор. Через обмеження за часом оцінювали тільки задану густина посіву клітин.

Діапазон множинності зараження (МОЇ) для 300-літрового масштабу:

Задана величина МОЇ, яка становить 0,1, є ідеальною для розмноження РККЗМ 94881 у зазначеній системі вирощування. Нижчу і вищу величину МОЇ, які становлять відповідно 0,01 і 0,3, оцінювали в З0-літрових біореакторах.

Аналіз ризику: Рекомендовані параметри паралельного процесу, здійснюваного в З300- літровому біореакторі, викладені в таблиці 7. Тестували тільки задані параметри і вирішували питання про те, чи мають вони чи не мають вирішальне значення для процесу. Для оцінки діапазонів використовували З30-літровий масштаб. Використовували такі визначення: - параметри, які мають вирішальне значення (критичні) представляють собою ті параметри, які мають вирішальне значення для якості кінцевого продукту; - параметри, які не мають вирішального значення (некритичні) представляють собою ті параметри, які або можна безпосередньо контролювати в певному діапазоні, або які мають широкий операційний діапазон, тому відхилення від встановленого значення не має вирішального значення. Не мають вирішального значення параметри дозволяють контролювати мають вирішальне значення параметри в певному діапазоні; "наведені тільки для інформації" параметри являють собою параметри, моніторинг яких здійснюють для отримання додаткової інформації про процес, але які не перебувають у прямій кореляції з властивостями кінцевого продукту.

Таблиця 7:

Узагальнення даних про параметри паралельного процесу в 300-літровому біореакторі для ММ РЕКЗМ 94881 опе жди недомн ЛДУ" | Же ниття,

Параметр протестована протестована діапазон заданий Інекритичний межа межа діапазон от 7,0 х 108

Густина посіву 7,0 х 109 клітин То х 105 клітин до 10х То х 109 Мо"

КЛІТИН клітин Ж 109 клітин клІТИН час 1-ого збору зараження) ша | жо ф|жееюно| з еннни (дні після день 1 день 5 день 1 - день 4 1-2 критичний" підживлення) ее | жо фінеюн| о | ен (дні після день 1 день 7 день 1 - день 4 1-4 критичний підживлення т Не є критичним в межах оцінюваного діапазону при вивченні в З0-літровому масштабі. ях Критерієм першого збору є час повного поглинання глюкози в межах 5-7 днів РІ. Однак якщо передбачається здійснювати другий збір, то збір-І слід здійснювати в перший день, коли рівень глюкози становить 0,1 г/л. жк Рідини є стабільними протягом 5 днів. Однак якщо передбачається здійснювати третій збір, то збір слід здійснювати між днями 1 2,

Ж На основі даних, одержаних у 30-літровому масштабі.

Зо Висновок і рекомендації щодо здійснення процесу: При створенні винаходу успішно здійснений перехід від паралельного процесу, здійснюваного в З0-літровому біореакторі, до процесу в 300-літровому біореакторі. Час збору (у днях) і титр для збір-І знаходилися в межах,

встановлених для ЗО0-літрового біореактора. Збір-ІЇ також можна успішно здійснювати при титрах, порівнянних з титрами, встановленими для збору-Ї. Титр, при якому здійснювали 2-ий збір, був стабільним протягом 4 днів. Додатковий (третій) збір здійснювали при титрах, порівнянними з титрами для збору-!і і ІІ. Титр, при якому здійснювали 3-ої збір, був стабільним протягом щонайменше 4 днів.

Рекомендації щодо здійснення кращого паралельного процесу одержання ММ РЕКЗМ 94881 в 300-літровому біореакторі полягають у наступному:

Розмноження вірусу, збір-І: До складу середовища входило середовище МЕМ без фенолового червоного, неоміцин у кількості 30 мг / л і бікарбонат натрію в кількості 1,4 г / л.

Клітини лінії МА104 висівали із густиною 7 х 1095/3000 л в біореактор з носієм спіральної форми в 270 - 280 л середовища, доповненого 14,0 л фетальної бичачої сироватки (5 об. 95) (діапазон: їх 109-1 х 1019 /300-літровий біореактор з носієм спіральної форми). Температуру біореактора контролювали на рівні 36:11 2 С. Для БО регулювальний параметр встановлювали на "Режим

Моніторингу". Активували контроль СО на рівні 10 9о, коли рівень БО знижувався до 10-30 95.

Значення рН підтримували на рівні 7,2, встановлюючи регулювальний параметр на "Режим

Контролю". Прочитувані параметри (РІО-параметри), застосовуються при високому значенні рН (додавання СО»), були наступними:

Приріст 300,00

Час перезапуску (хв) на повтор 2,20

Швидкість, хв 0,50

Клапан тонкого регулювання, крок в одиницях рН 0,03

Клапан тонкого регулювання, СМ-межа 5 У

Швидкість потоку повітря встановлювали на рівні 2,0 5І РМ (стандартні літри в хвилину); швидкість потоку СО» встановлювали на рівні 2,0 5І РМ; швидкість потоку Ог2 встановлювали на рівні 2,0 5І РМ; швидкість потоку М2 встановлювали на рівні 2,0 5І РМ, і загальна швидкість застосовуваного для барботування газу повинна становити 2,0 5І РМ.

Задана величина МОЇ становила 0,1 (діапазон 7 х 108-1 х 109 вірусних частинок/300- літровий біореактор з носієм спіральної форми).

Згідно з критерієм для збору-І здійснювали періодичний відбір зразків для вимірювання рівня глюкози, починаючи з дня 4РІ. Тренд рівня БО можна використовувати як індикатор. Збір-І слід здійснювати, коли рівень глюкози х 0,1 г / л (діапазон ж / -2 дні), що, як правило, відбувається між днями 5-7РІ. Однак якщо передбачається здійснювати другий збір, то збір- рекомендується проводити в перший день, коли концентрація глюкози становить 20,1 г/л.

Перше підживлення - збір -ІЇ: Після першого збору здійснювали підживлення біореактора,

Зо використовуючи 270-280 л середовища, до складу якого входило середовище МЕМ без фенолового червоного, неоміцин і бікарбонат натрію в кількості 1,4 г / л. доповненого 14,0 л фетальної бичачої сироватки (5 об. 95). Підживлення здійснювали в таких же умовах, що й умови, встановлені для середовища для першого збору (див. зазначені вище параметри для першого збору). Контроль значення рН залишали на встановленому рівні 7,2. РІО-параметри, що застосовуються при високому значенні рН (додавання СоОз), були наступними:

Приріст 300,00

Час перезапуску (хв) на повтор 2,20

Швидкість, хв 0,50

Клапан тонкого регулювання, крок в одиницях рН 0,03

Клапан тонкого регулювання, СМ-межа 5 о.

Здійснювали контроль температури, підтримуючи її на рівні 36-17 С. Для контролю ОО регулювальний параметр встановлювали на "Режим Моніторингу".

Друге підживлення - збір-Ш: Відразу після другого збору здійснювали підживлення біореактора, використовуючи 270-280 л середовища, до складу якої входила середу МЕМ без фенолового червоного, неоміцин і бікарбонат натрію в кількості 1,4 г / л. доповненої 14,0 л фетальної бичачої сироватки (5 об. 95). Підживлення здійснювали в таких же умовах, що й умови, встановлені для середовища для першого збору (див. зазначені вище параметри для першого збору). Контроль значення рН залишали на встановленому рівні 7,2. РІО-параметри, що застосовуються при високому значенні рН (додавання СоОз), були наступними:

Приріст 300,00

Час перезапуску (хв) на повтор 2,20

Швидкість, хв 0,50

Клапан тонкого регулювання, крок в одиницях рН 0,03

Клапан тонкого регулювання, СМ-межа. 5 о

Контроль температури залишали на рівні 3б-1 " С. Для контролю БО регулювальний параметр встановлювали на "Режим Моніторингу". Результати, одержані при створенні даного винаходу, продемонстрували, що оптимальним для третього збору містить вірус рідини є час у період між днями 1-4 після підживлення.

Слід розуміти, що представлений вище процес наведено як приклад, і його можна додатково модифікувати щодо збільшення виходу продукту та / або зниження вартості прогонів біологічного процесу. Наприклад, зміни параметрів можуть включати (але, не обмежуючись лише ними): зниження концентрації сироватки для другого і третього зборів, зменшення густини посіву клітин, додавання клітин і посівного матеріалу в ту ж посудину і надання їм можливості перемішуватися, в результаті чого можна вкорочувати проміжок часу розмноження вірусу до здійснення збору-І. Крім того, вихід вірусу можна додатково підвищувати за допомогою ще одного підживлення для забезпечення можливості здійснення збору-ІМ. Для підживлення можна використовувати такі компоненти середовища, які витрачаються, як (але, не обмежуючись лише ними) глюкоза і глутамін.

Приклад 2

У конкретному прикладі РКК5М 94881, одержаний згідно описаному вище способу, застосовували для визначення ефективності РККЗМ 94881 при вакцинації свиней. У цьому досвіді поросят віком 4-13 тижнів вакцинували внутрішньом'язово композицією, яка містить 1076

ТСІЮвбо в 2 мл (день 0 досліду). У день 13 здійснювали відбирання поросят і проводили моніторинг різних параметрів хвороби до дня 90. Досліджувані параметри включали моніторинг віремії, присутність вірусу в тканинах і секретах, клінічні обстеження, оцінку пошкодження легень і приріст маси.

Кожну з досвідчених груп: вакцинованих, сентинел-тварин (тварини, що поміщаються в умови, де ризик зараження найбільш високий) і контрольних тварин зважували в дні досліду 0, 14, 28, 56 і 90. Зразки крові відбирали через кожен день в період з дня 0 по день 14 і один раз на тиждень аж до дня 90 як в вакцинованій групі, так і у сентинел-тварин і один раз на тиждень протягом усього періоду досвіду у контрольних тварин аж до дня 90.

Брали мазки з носа, рота і фекалій через день в період з дня 0 по день 14 і один раз на тиждень аж до дня 56 як в вакцинованій групі, так і у сентинел-тварин, і один раз на тиждень протягом усього періоду досвіду у контрольних тварин аж до дня 56.

Зо Для аутопсії в вакцинованій групі відбирали по дві свині через день в період з дня 0 по день 14 і один раз на тиждень з дня 14 до 90, а аутопсію решти свиней здійснювали в день 90. У групі сентинел-тварин здійснювали аутопсію 5 свиней в день 56, а аутопсію тварин, що залишилися, здійснювали в день 90. У контрольній групі відбирали по 2 свині через день в період від дня 0 до дня 14, один раз на тиждень між удень 14 і вдень 56, а аутопсію решти свиней здійснювали в день 90.

Клінічні обстеження проводили кожен день.

З використанням специфічних для європейського РККЗМ праймерів здійснювали кількісну

ОТ-ПЛР зразків крові, мазків з рота, фекалій і мазків носа, а також промивні рідини легенів.

Отримані в цьому досліді дані продемонстрували, що поросята мали нормальний стан здоров'я за винятком кількох кульгавих свиней. За даними посмертного обстеження при аутопсії не виявлено ніяких аномалій за винятком того, що у 1-2 тварин виявлені ознаки помірного збільшення пахових лімфатичних вузлів. Важливо відзначити, що в групі вакцинованих тваринах не виявлено пошкодження легень.

На фіг. 6 представлені дані про відсоток тварин які мають віремію у групі сентинел-тварин порівняно з групою, вакцинованою композицією, яка містила ослаблений штам вірусу РЕК5Б, депонований в ЕСАСС під реєстраційним Ме 11012502, які свідчать про ефективність вірусу

РЕКЗБ, одержаного згідно способів, запропонованих у винаході, щодо забезпечення захисного імунітету у свиней.

Приклад З

Для розробки паралельного процесу одержання БОШ РЕК5 94881 в ролер-флаконах використовували наступне обладнання і реагенти (таблиця 8):

Таблиця 8:

Обладнання

Підтримання клітин МА104 (пасажі Підтримку і збільшення кількості 850 сме роллер- 58-78) І АК-МА104 (пасажі 64-84). згідно з протоколами процесів флакони (фірма

Одна і та ж лінія клітин, різні пасажі ВРЕ-777 і ВРЕ-778 СОВМІМО 850 см? роллер- флакони (фірма

СОВМІМО)

Зараження Платформа, яка обертається та

Одержання вірусу інкубатор

Визначення концентрації декстрози/лактату в г/л У5І 2700 (варіабельність аналізу 5 5 95

Середовище МЕМ з феноловим червоним і 1,4 г / л бікарбонату натрію одержували від фірми ЗАБС. У таблиці 9 представлено склад середовища і концентрація сироватки. Це середовище використовували для розмноження вірусу, включаючи всі підживлення ролер- флаконів.

Таблиця 9:

Склад МЕМ-середовища. партії роллер-флакон фетальна бичача сироватка, яка 700754 була піддана гама-опромінення, 100837 20 мл (5 об. 95)

США

Паралельний процес із здійсненням трьох зборів:

При здійсненні паралельного процесу додавали в контейнер середовище з сироваткою, клітини АК-МА104 і посівний матеріал вірусу БО РКК5 94881. Потім вміст контейнера перемішували і вносили в ролер-флакони (ТОЇ відповідає нулю днів РР). На фіг. 7 проілюстрований спосіб здійснення паралельного процесу, а на фіг. 8 представлені опис та часові параметри процесу.

Застосовувані ролер-флакони і приготування середовища:

Представлений в даному описі експеримент здійснювали з використанням партії, що включає 5 ролер-флаконів. Фактичний розмір партії може змінюватись.

В асептичних умовах вносили в контейнер 2000 мл середовища МЕМ і 100 мл опроміненій фетальній бичачій сироватки. Потім додавали 5 х 107 клітин АК-МА104 і посівний матеріал, що представляє собою вірус БОШ РЕК5 з величиною МОЇ, становить 0,1. Зазначені продукти перемішували і в асептичних умовах вносили приблизно по 400 мл у ролер-флакон площею 850 см? фірми Согпіпд. Потім ролер-флакони інкубували при 37 г С на поворотній платформі зі швидкістю 0,5 об / хв. Здійснювали аж до трьох зборів з двома підживлення середовищем.

Критерії збору і прийнятної ефективності:

Критерії збору для ролер-флаконів засновані на заставлених / заданих що мають вирішальне значення параметрах, підтверджених для процесу в 300-літровому біореакторі, описаного в прикладах 1 і 2, і представлених нижче в таблиці 10.

Збір-І здійснювали в дні 5-7РІ т при рівні глюкози х 0,1 г / л. Збір-ІЇ здійснювали в день 2РІ після підживлення, а збір-ІІІ в день 2РІ після другого підживлення.

Зо Ефективність всіх трьох зборів вмісту ролер-флаконів повинна становити 2 1055 ТСІЮво/мл.

Таблиця 10:

Критерії збору / прийнятна ефективність МЕМ БО РЕКЗ 94881 час 1-ого збору (дні після зараження) дні 5-7 РІ рівень декстрози в момент першого збору час 2-ого збору (дні після підживлення) час 3-ого збору (дні після підживлення) » 1055 ТС1Ово/мл 7" мають вирішальне значення (критичні) параметри представляють собою ті параметри, які мають вирішальне значення для якості кінцевого продукту

Прогони в ролер-флаконах (Р-Ф)

Таблиця 11:

Початковий експеримент, проведений при розробці паралельного процесу одержання ЄЮ РЕК 94881 в ролер-флаконах, і одержані титри

Код Густина МОЇ н-! Декстроза ТС о Н-Ї ТОЇ; во Н-П ТОЇ; во роллер- посіву - (г/л) на мл - на мл | остаточний на мл флакону клітин підживлення підживлення на Р-Ф

А 3,5 01 5РІ 0,304 5,5 7ТРІ 6,5 6,0 х106 3,5 х 01 0,048 6,5 1ОРІ 5,7 106

ІФ; 3,5 х 01 7ТРІ 0,006 5,5 6,3 11РІ 6,7 106 нти 106 106

Е 3,5 х 0,005 7ТРІ 5,5 5,5 11РІ 5,5 106 нини 0066 | 66 | 7РІ | 69 | РІ | «63 но | 7хло| 01 | РІ | 0009 | 65 | 8РІ | 73 | ОРІ 177 | 7хло| о | 7 | 0 | 5:62 | Р | 70 | пР | 66 нЬнІ"ЙИИиИинТнТТТнннншнн 0,095 | 69 | 7РІ | 6,6 | 9РІЛОРІ | «б,3/6б,7

Ко |тхло; ол | 6Р ЇЇ 0 | 73 | РІ | 75 | лЛОРІЛЯРІ | 65/6,6 1 | тхло; ол | 7РІ ЇЇ 7707 77 | РІ | 555 | лп1РІЛ2РІ | 72/66 нІнІІЕЗИИО«ЮНИТИКИКІНІНКККІИИНИНИІПОВОВІВІИІИННИИТТНИННИНИЙНИНИНИНВИВТВОВИВВВВВН 0,005 ол18 | «56 | 7РІ | 75 | РІ | «60 0,005 | бРІ | 0014 | 70 | 8РІ | 67 | щ ОРІ о | 1х10|0005| УР | 0 | 67 | РІ | 73 | тпРІ нн

Контрольний експеримент: Загальноприйнятий процес одержання БЮ РКК5 94881 в роллер-флаконах

Код Густина ТОЇ МОЇ н-! ТС о Н-Ї ТОЇ; во Н-П ТОЇ; во роллер- посіву - на мл - на мл | остаточний На мл флакону клітин підживлення підживлення на Р-Ф

Р | 2х107| Здня | 0005 | зРІ! | 67 | 6РІ | 74 | РІ | 69 0 |2х10'| Здня | 0,005 1ОРІ

А |2х107|Здня | 0005 | 5РІ | 70 | 8РІ, | 72 | пРІ | 66

Через З дня визначали МО! в Р"ФР, Сі В

У таблиці 11 представлені характеристики первісного експерименту, проведеного при розробці паралельного процесу в ролер-флаконах на основі параметрів процесу, описаного в прикладах 1 і 2, і даних про робочі характеристики посівного матеріалу вірусу, представлених нижче в таблиці 12а.

Таблиця 12а:

Параметри, які оцінювали при розробці паралельного процесу в ролер-флаконах густина посіву -Й07-- - - клітин на 850- " на кількість клітин /мл

У 15 ролер-флаконів висівали МА-104 клітини, використовуючи густину посіву клітин, що становила від 3,5 х 105 до 1 х 107 (див. таблицю 11, стовпець 2). Ролер-флакони мітили в алфавітному порядку. Групи, які з трьох ролер-флаконів, мали однакову густину посіву клітин і однакову величину МОЇ, що становила від 0,005 до 0,1 (таблиця 11, третій стовпець).

Оцінювали три густини посіву клітин і дві величини МОЇ (таблиця 12). Групи з трьох ролер- флаконів мали однакову густину посіву клітин і однакову величину МОЇ (таблиця 4, стовпець 1).

Ролер-флакони групували згідно з номерами ролер-флаконів і складу середовища, описаному вище, і інкубували на платформі, яка обертається зі швидкістю 0,5 об / хв при температурі в інкубаторі, встановленої на 3796.

У ролер-флаконах А, 0, с, У ії М збір-І здійснювали в день 5РІ, а потім здійснювали їх підживлення і інкубували протягом двох днів. Потім здійснювали ЦН-ЇЇ, в ролер-флакони вносили підживлення і інкубували, а третій і остаточний збір здійснювали через 2 дні.

У ролер-флаконах В, Е, Н, К і М збір НІ здійснювали в день 6бРІ, а потім вносили в них підживлення і інкубували протягом двох днів. Потім здійснювали Н-ІІ; в ролер-флакони ще раз вносили підживлення і повторно інкубували. Третій і остаточний збір здійснювали через два дні.

І, нарешті, в ролер-флаконах С, Е, І, Ї і О збір НІ здійснювали в день 7РІ, а потім вносили в них підживлення і інкубували протягом двох днів. Потім здійснювали Н-ЇЇ, в ролер-флакони вносили підживлення і повторно інкубували, а третій і остаточний збір здійснювали через два дні.

В якості контролю в цьому експерименті здійснювали стандартний процес у ролер-флаконах (ролер-флакони Р, ОО, К і 5). Цей процес передбачав здійснення двох зборів. У цих експериментах до зазначеного процесу додавали третій збір, а також діапазон часу збору-Ї подовжували до 5 днів після РІ.

Клітини МА104 висівали в 850-см2 ролер-флакони з густиною 2 х 107 і інкубували протягом З днів (ролер-флакони Р, 0, К і 5). Через три дні вміст ролер-флакона 5 обробляли трипсином і підраховували кількість клітин за допомогою пристрою Мі-сеїІ. На основі підрахованої кількості клітин розраховували величини МОЇ! вірусу для Р-Ф Р, 0 і К. Розраховану кількість вірусу

Зо додавали в ролер-флакони, які інкубували при 37 г С на платформі, яка обертається. Через З дні здійснювали збір-І в ролер-флаконі Р, в який потім вносили підживлення і інкубували при 37 о Сб. Через З дні здійснювали другий збір і здійснювали другу підживлення і інкубували протягом ще З днів до здійснення третього і остаточного збору.

Після НІ ролер-флакони С і К піддавали аналогічній процедури в день 4РІ для Р-ФОЇ в день 5РІ для Р-Ф К.

Стандартний процес у ролер-флаконах був більш тривалим, ніж паралельний процес, описаний у прикладах 1 і 2, і був більш трудомістким, оскільки було необхідно вирощувати клітини протягом З днів перед зараженням їх вірусом. Крім того, для цього процесу була потрібна подвоєна густина посіву клітин в порівнянні з паралельним процесом, але більш низька величина МОЇ. Цей процес дозволяв отримувати узгоджені у високому ступені титри для трьох зборів.

При створенні винаходу було прийнято рішення про те, що час збору НІ (ТОН) для паралельного процесу має бути засноване тільки на заданих днів і не повинно залежати від поглинання глюкози. У дні збору відбирали зразки для оцінки рівня глюкози та титру.

У ролер-флаконах А, В, С, О, Е ї Е для зборів І, Ії ії ІП виявлені титри, що не відповідають критеріям прийнятного з точки зору ефективності титру (таблиця 10).

У ролер-флаконах с, Н і І, в яких густина посіву клітин становила 7 х105 і задана величина

МОЇ становила 0,1, рівень глюкози при першому зборі відповідав заданій величині х 0,1 г / л.

Титри, виявлені в ролер-флаконах с і Н, виявилися прийнятними. У зборі-ІІ у всіх ролер- флаконах С, Н і І виявлені титри, що перевищують 6, і більш низькі ніж 7 Ід. У зборі-НП в ролер- флаконах с і Н виявлені прийнятні титри, що складали 6,6 і 6,5 відповідно. Більшість зборів у групі С, Н і | виявилися прийнятними.

Експериментальна група .), К і Її виявилася найбільш перспективною з позицій титрів.

Декстроза була поглинена до моменту НІ у всіх Р-Ф і титри відповідали критеріям прийнятності, зазначеним у таблиці 10. Титри в другому і третьому зборах також задовольняли критеріям, зазначеним у таблиці 3, за винятком титрів у двох ролер-флаконах. У зборі Н-І, який у Р-Ф У, К і Ї продовжили ще на один день, титри все ще залишалися на прийнятному рівні (таблиця 11).

В останніх ролер-флаконах М, М і О, які мали високу густину посіву клітин та низьку величину МОЇ, титри відповідали титрам, виявленим в ролер-флаконах М і 0.

Таблиця 126:

Порівняння параметрів для паралельного процесу в ролер-флаконах та в біореакторі

З00-літровий Роллер-флакон, група ./, сироватки в мл

Згідно таблиці 10, для ролер-флаконів У, К і Ї результати визначення ТСіІЮво/мл, представлені в таблиці 11, задовольняли критерії для зборів І, ІІ ї ПІ. Густина посіву клітин на мл в ролер-флаконах ., К і Ї еквівалентна густині посіву клітин на мл в біореакторі (таблиця 6) у перерахунку на 300 л. На основі цих даних вибрані параметри для ролер-флаконів У, К і Ї. для здійснення підкріплювального отримані результати прогону (таблиця 13).

Таблиця 13:

Паралельний процес у ролер-флаконах, розроблений для підтвердження результатів описаних вище прогонів і концентрація глюкози в момент збору - . Збір | Декстроза Н-ї Н-н, підживлення ТОН підживлення збір 41111771 хлої 10117711 5РІ | 0080 | 2 -7РІ | ОР 792 | 1х107 1011 5РІ | 0128 | 7РІ | ОР 793 | хо 1011 5РІ | 0066 | 7РІ | Р 794 .| хо 1011 5РІ | 0076 | 7РІ | Р 795 | 1х107 1011 5РІ | 0128 | 7РІ | Р

Кк хлої 101177 6РІ | 037 | 8РІ | лоР ка | т1хлої 1011 6РІ | 0058 | 2 щ 8РІ | ОР

Кк | хо 1011 6РІ | лоб | 8РІ | лоРІ ка | хо 1011 6РІ | 0088 | 2 8РІ | ОР 7Кк5 | хо 1011 6РІ | 0087 | 8РІ | ОР 7 хлої 10117711 7РІ | 0005 | Р | Р 112 | 1хлої 10117 7РІ | 0006 | Р | Р 13 7 1хлої 1011771 7РІ | 00 | Р | лір 7171щ | т1хлої 1011 7РІ | 0013 | Р | лір 115 | т1хлої 1011 7РІ | 0004 | Р | лір

У таблиці 13 представлені результати підтверджуючого прогону вибраного паралельного процесу, для оцінки якого використовували показники, зазначені в таблиці 10.

В цілому, для здійснення зазначеного експерименту використовували 15 ролер-флаконів, густина посіву клітин у кожному з яких становила 1 х 107 на 400 мл середовища з сироваткою, і вносили вихідний вакцинний вірус М5Мж4 БО РККЗ 94881 з величиною МОЇ, що становить 0,1.

Ролер-флакони поділяли на З групи по 5 флаконів у кожній. Збір-І здійснювали в день 5РІ для Р-

Ф 01-95, в день 6РІ для К1-К5 і в день 7РІ для 11-15. У кожному ролер-флаконі визначали рівень глюкози. Потім збори об'єднували і відбирали зразки для визначення титрів. Потім здійснювали підживлення та збір-ІІ і остаточний збір-ПІ.

У момент збору-І у всіх 15 ролер-флаконах рівень глюкози в середньому відповідав критеріям збору х 0,1 г / л, встановленим для процесу в біореакторі (таблиця 3), ці дані підтверджують, що процес відповідав процесу в ролер-флаконах.

Таблиця 14:

Узагальнення умов паралельного процесу в ролер-флаконах та результатів визначення ТСІЮзо

Партія (група із 5 Декстроза | ТСІЮво/ ТСІОБо/МЛ ТСІОво/мл ролле- РСО МОЇ | ТОНІ | г/л втон!1 мл тона2г но тОонЗ нЗ флаконов) НІ 12241111 фпомогр ом | БРІ | 0092 | 65 | 7РІ | 73 | РІ | 65 117 Кк 7 фпомолром | бРІ | 0084 | 6,7 | 8РІ | 76 | ОРІ | 67 17777771 бохо | РІ | боб | 65 | оРІ | 77 | ПР | 74

У таблиці 14 узагальнені дані про умовах паралельного процесу в ролер-флаконах, пропонованого в даному винаході, і вірусних титрах (в ТСІЮво/мл) для групи роллер-флаконів .,

К и Г, одержаних при здійсненні Н-І, Н-П ї Н-Ш.

Для імітації процесу в ролер-флаконах зразки з кожного індивідуального ролер-флакону з групи У (таблиця 13) об'єднували і визначали титр в об'єднаному зразку. Аналогічну процедуру застосовували для ролер-флаконів К і І. при здійсненні НІ, Н- ї Н-ПІ.

Рівень глюкози в зборі Н-1 в згрупованих зразках становивО,О г/ лв У, К і Ї. Титри в зборах

НІ, Н-Ї ї Н-ІЇ знаходилися в межах від 6,5 до 7,7, що можна порівняти з титрами, одержаними при здійсненні процесу в 300-літровому біореакторі (таблиця 15).

Таблиця 15:

Узагальнення умов і результатів визначення

ТСІО»о паралельного валідованого процесу в 300-літровому БР " 0,0 75 | 78 | 75 | Р | 67 ОЗО11ОРО | 72109 01 | бРІ | 0,0 73 | 8РІ | 74 | ЛОРІ| 74 0,0 7.5 | 9РІ | 67 | МР | 74 х Зразки містили 505 як стабілізатор

У таблиці 15 представлені параметри і титри «у ТСІОво/мл) для трьох валідованих прогонів, здійснених в умовах, відповідних сучасної належної клінічної практики (СОМР). Всі три партії мали однакову густину посіву клітин, однакову величину МОЇ. Рівень глюкози становивО,О г/л у момент збору-І у всіх трьох партіях. При всіх зборах отримані результати, що відповідають критеріям.

Діапазон густини посіву клітин (РОСОЮ) для ролер-флакону:

Задана густина посіву клітин (РОСОЮ) становила 1,0 х 107 клітин в цілому на ролер-флакон з робочим об'ємом 400 мл. Оцінювали також нижню межу 7 х 105 (таблиця 4), при цьому були одержані прийнятні титри. Верхню межу діапазону оцінювали при здійсненні

Зо загальноприйнятого процесу (таблиця 11).

Діапазон величини множинного зараження (МОЇ) для ролер-флакону:

Задана величина МОЇ, становить 0,1, була ідеальною для розмноження ЄЮ РКК 94881 в даній системі вирощування. Низьку і високу величину МОЇ, складову 0,01 ї 0,3 відповідно, оцінювали в 30-літрових біореакторах. У ролер-флаконі через обмеження за часом оцінювали тільки задану величину МОЇ, яка становила 0,1, а також МОЇ, яка становила 0,005 (таблиця 10).

Аналіз

Рекомендовані параметри паралельного процесу в роллер- флаконах представлені в таблиці 16. Оцінювали тільки задані параметри і вирішували питання про те, чи мають вони чи не мають вирішальне значення для процесу. Використовували такі визначення: параметри, які мають вирішальне значення (критичні) представляють собою ті параметри, які мають вирішальне значення для якості кінцевого продукту, а параметри, які не мають вирішального значення (некритичні), представляють собою ті параметри, які або можна безпосередньо контролювати в певному діапазоні, або які мають широкий операційний діапазон, тому відхилення від встановленого значення не має вирішального значення. Не мають вирішального значення параметри дозволяють здійснювати контроль мають вирішальне значення параметрів в певному діапазоні.

Таблиця 16:

Узагальнення параметрів паралельного процесу в ролер-флаконах для ММ ЄО РКНК5З 94881.

ОТ У МОМ |, (ееннннетення

Прийнятний Задане - - вивчена вивчена : Критичний/некритичний діапазон значення межа межа 7777171717171717.7.ю.юИ.| 0005 | обл | 0005-0538 00 | М от 7х 105 7х 106 2,0х 107 клітин до 1х 107 Ме клітин клітин Ж 2,0х 107 клітин клітин

Час 1-ого збору ми день 5 - день день 5- я жк зараження)

Час 2-ого збору (дні після день 2 день 2 МТ 2 критичний підживлення)

Час 3-ого збору (дні після день 2 день 2 2-3 2 критичний підживлення) «5 - за критерій першого збору брали час повного поглинання глюкози в межах періоду часу, що складає 5-7 днів Рі; я - на основі традиційного процесу в ролер-флаконах; (Ф - вивчено в масштабі З0-літрового, З00-літрового біореактора і в ролер-флаконі; 8 - вивчено в масштабі З0-літрового біореактора.

Висновок

Успішно розроблений паралельний процес у ролер-флаконі, і встановлено, що він еквівалентний описаному вище процесу в біореакторі з позицій ефективності, оціненої в

ТСІО5О/мл. Задані параметри які мають вирішальне значення для НІ, Н-Ї ї Н-ІП були з успіхом відтворені при здійсненні паралельного процесу в ролер-флаконі.

У бажаних варіантах здійснення паралельного процесу в ролер-флаконі для МІ М ЄО РЕК5 94881 використовували наступні параметри для розмноження вірусу:

Збір-І: склад середовища: МЕМ з 1,4 г / л бікарбонату натрію; густина посіву клітин 1 х107/850-сме ролер-флакон фірми Согпіпд, що містить 400 мл середовища, доповненої 20 мл фетальної бичачої сироватки (5 06.95) (діапазон: 7х106-2х10"7/роллер-флакон); контроль температури на рівні 361 2 С; швидкість обертання платформи з ролер-флаконом 0,5 об / хв; і задана величина МОЇ 0,1.

Для задоволення критерієм збору-І починали відбір зразків для оцінки рівня глюкози в день

Б5РІ. Збір-І слід було здійснювати, коли рівень глюкози становив «х 0,1 г / л, що, як правило, відбувалося між днями 5-7РІ. Однак, якщо передбачалося здійснювати другий збір, то збір-ЇЇ слід здійснювати після першого підживлення.

ІІ. Перше підживлення - збір-|Ї

Для підживлення застосовували 400 мл середовища, що містить МЕМ і 1,4 г / л бікарбонату натрію, доповненого 20 мл фетальної бичачої сироватки (5 об. 95). Здійснювали підживлення в тих же умовах, які описані для середовища, що застосовується для першого збору (див. вище

Зо параметри для першого збору). Контролювали температуру, підтримуючи її на рівні Зба1 9 с.

Швидкість обертання платформи з ролер-флаконом становила 0,5 об / хв. Другий збір рідин, які містять вірус здійснювали в день 2 після підживлення.

ІП. Друге підживлення - збір-ПЇ

Для підживлення застосовували 400 мл середовища, що містить МЕМ, неоміцині14 г/ л бікарбонату натрію, доповненого 20 мл опроміненої фетальної бичачої сироватки (5 об. Об).

Здійснювали підживлення в тих же умовах, які описані для середовища, що застосовується для першого збору (див. вище параметри для другого збору). Контролювали температуру, підтримуючи її на рівні 36.41 2 С. Швидкість обертання платформи з ролер-флаконом становила 0,5 об / хв. Третій збір рідин які містять вірус здійснювали в день 2 після підживлення.

Claims (2)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб одержання в комерційному масштабі вірусу репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (РКК5У), який полягає в тому, що: а) паралельно засівають в біореактор середовище для великомасштабного культивування лінії клітин ссавців, пермісивних до зараження РЕКК5У, і заражають клітини ссавців РККЗМ, б) розмножують вірус протягом 5-7 днів після зараження; в) здійснюють першу стадію збору шляхом видалення середовища з біореактора і виділення з нього одержаного в результаті розмноження вірусу; г) поповнюють середовище в біореакторі і розмножують вірус протягом 1-4 днів; д) здійснюють другу стадію збору шляхом видалення середовища з біореактора і виділення з неї одержаного в результаті розмноження вірусу; є) поповнюють середовище в біореакторі і розмножують вірус протягом 1-4 днів; і ж) здійснюють третю стадію збору шляхом видалення середовища з біореактора і виділення з неї одержаного в результаті розмноження вірусу.

2. Спосіб за п. 1, який додатково полягає в тому, що здійснюють щонайменше одне підживлення і стадію збору після третьої стадії збору, що включає поповнення середовища в зазначеному біореакторі і розмноження вірусу протягом 1-4 днів і здійснення четвертої стадії збору шляхом видалення середовища з біореактора і виділення з нього одержаного у результаті розмноження вірусу.

3. Спосіб за п. 1, в якому задають множинність зараження (МОЇ), що становить від 0,01 до 0,30.

4. Спосіб за п. 1, в якому зазначені клітини ссавців висівають з густиною приблизно від 7х109 до 1,0х109 на 300-літровий біореактор.

5. Спосіб за п. 4, в якому зазначені клітини висівають з густиною приблизно 1,0х109 на 300- літровий біореактор.

6. Спосіб за п. 5, в якому зазначене зараження становить приблизно 7х108 вірусних частинок на З00-літровий біореактор. 7, Спосіб за п. 1, що полягає в тому, що здійснюють моніторинг концентрації глюкози у вказаному середовищі, при цьому вказану першу стадію збору здійснюють у перший день, коли концентрація глюкози в середовищі знижується до рівня, нижчого ніж 0,1 г/л.

8. Спосіб за п. 1, в якому зазначений другий збір здійснюють через 1 або 2 дні після підживлення середовищем.

9. Спосіб за п. 1, в якому зазначений третій збір здійснюють через 1-4 дні після другого підживлення середовищем.

10. Спосіб за п. 1, в якому культуральне середовище додають в біореактор за 1 день до або в той же самий день, але перед додаванням зазначеної клітинної лінії ссавців і зазначеного вірусу РАВ5.

11. Спосіб за п. 1, в якому культуральне середовище додають в біореактор за 1 день до додавання зазначеною клітинною лінією ссавців і зазначеного вірусу РЕКЗ5.

12. Спосіб за п. 1, в якому температуру в зазначеному біореакторі встановлюють на рівні від 34 "С до 38 С.

13. Спосіб за п. 1, в якому зазначене середовище містить опромінену фетальну бичачу сироватку в кількості 5 об. 95.

14. Спосіб за п. 1, в якому зазначений РКАЗМ вибирають з групи, що складається зі штаму РАВ5М - ЕСАСС 11012501, ЕСАСС 11012502, МК2332, штаму вірусу І еіузіай (агент І еїузіай (С0ОІ-МІ-2.91) або інших штамів, таких як депоновані під реєстраційними номерами ЕСАСС 04102703, ЕСАСС 04102702, ЕСАСС 04102704, реєстраційним номером СМСМ М140, реєстраційним номером СМСМ 1І-1387, реєстраційним номером СМОСМ І-1388, АТСС МК 2332, МК 2385, МК 2386, МК 2429, МК 2474 і МК 2402; СМСМ 1-1102, СМОМ 1-1140, СМСМ 1-1387, СМСМ І-1388 або ЕСАСС М93070108; АТСС-депозит МК-2332, АТСС-депозит МК-2368; АТОоС 60 МВА-2495; АТСС МК 2385, АТСС УР 2386, АТСС МК 2429, АТСС МУК 2474 і АТСС МК 2402.

15. Спосіб одержання в комерційному масштабі РКК5ЗУ, який полягає в тому, що: а) паралельно засівають як клітини ссавців, пермісивні до зараження РКК5ЗУ, так і РКК5М в біореактор, що містить середовище, придатне для вирощування клітин; і б) здійснюють три послідовні стадії збору, під час яких збирають РКЕ5БУ, при цьому після кожної першої та другої стадій збору середовище поповнюють, і при цьому: І) перший збір здійснюють у перший день, коли концентрація глюкози в середовищі знижується до рівня, нижчого ніж 0,1 г/л; І) другий збір здійснюють у 1 або 2 день після додавання середовища після першого збору; і ІП) третій збір здійснюють між 1 і 4 днем після додавання середовища після другого збору.

16. Спосіб одержання в комерційному масштабі вірусу репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (РКК5У), який полягає в тому, що: а) паралельно засівають в ролер-флакони середовище для великомасштабного культивування лінії клітин ссавців, пермісивних до зараження РКК5У, і заражають клітини ссавців РКЕК5М; б) розмножують вірус протягом 5-7 днів після зараження; в) здійснюють першу стадію збору шляхом видалення середовища із зазначеного ролер- флакона і виділення з нього одержаного у результаті розмноження вірусу; г) поповнюють середовище в зазначеному ролер-флаконі і розмножують вірус протягом приблизно 2 днів; д) здійснюють другу стадію збору шляхом видалення середовища із зазначеного ролер- флакона і виділення з нього одержаного у результаті розмноження вірусу; є) поповнюють середовище в зазначеному ролер-флаконі і розмножують вірус протягом приблизно 2 днів; і ж) здійснюють третю стадію збору шляхом видалення середовища із зазначеного ролер- флакона і виділення з нього одержаного у результаті розмноження вірусу. Фі Підготовка 300. л бісреактора згідно ОР 285-098 ОА ВИНИ Внесення 270-280 п сет - Я 1 свредовища у біорвактор Й Внесення ІРВ5 у бюрезктор: е (5 06.25 середовища) Регупюзаньні. лараметомй - - біорвактора: рН: 7,55 ж Збір АК МА-104-кпітин з: 0,1температура: 36,0 51 ропер-флаконів потік газу: го БМ фнесення ЛК-МА- НК яеремішування 35 об/хв кдітин в біореактор ! - іс Понтттттттт ще я ! влесоция вірусу у Внесення 7,00х30 Ї Розрахунок обєму! біорезктор АКМАЛОвклітИНЕ вірусу МН додатковий флакон нассновізаданої вепичини МО, Гі с- Додавання в | Розмноження вірусу додатковий ; протягом 5-7 днів; потім збір фазкон | т-й збір) і Підживлення внесення 2705280 п середовища. в біорезктар. Енесення ІБ в бюрвахтор (5 об. середовища) ПОВИ ЧОЛО І Возмноження вірусу протягом 1-3 днів. І латім збір (2-й збір) іІрежим моніторингу БО). ак мин Повторне підживлення вкасення 270-280 л середовища. те БУв ІРВО. у біоргактор патім збір (3-й збір) (режим кошторингу 2О)

Фіг. 7 чачнаиннннннажнннннннаинтннннннинниниииинлааннитиюттья 74 Посів і зараження й р клеїтин лінії АК МАТО4 - сіння й І і : Перібд після зараження і . Відповідає періоду часу між 1 н зараженням і збором 1 Н , Н і Е ! Й : ' : Н : 5-7 днів | Н ї рстютнтт Ії ї 4-х збір І і Відповідає моменту часу після ' ; зараження, ' : у який здійснюють збір антигену ї ! жо нини ; і Розмноження | один нен Я ; вірусу і / Підживлення (КЕ) ; Я : Відповідає періоду часу | З : міжзарвженням і здійсненням г пит, й ! збору й : ! виш 1-4 дні й Н ла ШИ ЧИ й І 8-11 днів і ка 2-й збір Шк ! т сннтннян Момент часу, в-який здійсніють ) ї :

к. збір ліспя підживлення й ! Е пон по ПИ Ин : 8-епідживпнення (ВЕ) . : Відповідає перюду часу між Н : зараженням їди : Ездійсненням збору З Ше . : оОтиБднв і І | : й НИ инших нини : І : г Момент часу в який р печянх : і збирають амтиган після З Я чи, ЗВІЙСНення 2то піджиалення и Фіг 3 І певннвнн НОАНВ О ОО Н н х і В Аг. ний ща ту п бу іх -, пн БИ нин нина Ли аа аа р енянивиня «КЕ М я пока пи гої нд сети додають С обіджтнеттттттттекнужн оо Снеки солв х т Ще птоттяттт т тт ! ві Го --декстрозаст тва ЗА аа чн потее « Е ! -ж--декстроза г/л у КЗ 4 Е, ОдоРО. (з т ч сот декстроза тп т 8 х боро Я

Я. да пон а ННиня сно «жор Об оРО ка щу. ебаслютвасоюРі | г ч у «« ж-ритр.ОС ЗВО | 8 ве вн и Во Пр | оленя Поп укуко з й В х Ї ба ен нн пен кН нина пк на а а о АН А ;

Олі. кляті иккнк тий Не: І Ї хі у щи плин ВЕН ших ! і Й рення ятки нтннянякатттттрттни я досл Вундт У ЕЕ Я в я В ОБ Б 5 ЕЕ 5 5 5 6 КЕ є шин ши ши ши ши ши 5 є б я Е 3 шко Ж рей В і бе. Е- ДНІ ніспя зараження фіг. 4 з жо водив ше І І ; Кч ве ще ! пня ВЕ фронтит Вт утрат жи й я й т й що ! о і | 5 т . що т по- . : Й Н ше що кед Й ВД фснноняинтту сен знав но м З о Мне во нн Вин 5 й пики или те о рити : Ці кі і плн тій і Бор КМ ее В Зо йо Б Ди жар дю тво НІ ШК Е і Се н І ше ї ох . Й Чи Ж титр ЗДО 002вО. й й іч : я 7 Руфтнтроєоозво 5 Е - ся ва М в нь чинни чі шин нин р плиток - | З 1 вилпллях п птн фен кореню х пяти т тенти ння 2 двояке вт Бк Б 5 БЕ 5 5555 по : ше шин и ше З и с В В З ЗИ

Но . я й Де ие он и КУ нен Е Е ту ще що двілісля зараження

Фіг. 5. іі патент рек ван шк я нене а нн ОВ БЕ те ие кн ес Кона в екв ЕВ Й ПД реа вв но по о А и и нн ВИН Я ник не вт т ней ин нн НН 4 ни и в Не Нм питне и Б о зу оре ою ТО ох х з втЖ у у их т ся ПИЛИ ик парлут тить чо дово їх ме ни ння Мн ння ни и нан тиву Б чо ни м ни ані винна : хо оЯ0; и Кан ВЖЕ ПО ово осо 21 а в А и в В ВИС Поле нні ше КАЄ ноу БЕ УТІИЖІТя сон он МК Гі ві її сш и УНН в,

сві. пт З п сетфутет тин Мт я Но я Мод пе З пух : у не шне КИТ, г шин а и І р в НН - пЕлі ля Ох й прийми лів рн дея 5: Вова и ПИВ ох Ох п Во ЕМВ тв ов В я о ни КН о о Бе ОО й я й рн нн и и и АН МОВУ т ек Ж я ен ше Ул а о ту ? ї ща п я пе ДЕ ЗПрлстей ВИ МОшУМіІ Пи 00000 двілюля зараження Ен о

Фіг. 6 Г Разультати ОТ-ПЛР в реальному часі і 95 тварин з віремісю

100.00 пет тт ВІрітенттетннннярі ! Кос ши ши не ши нн оон ше ни ше шо: нн ! : ЛО ОД р-ні нн --М Я шенню -- В. КВ н-- ! Я Я ї І осн шк ше ше шим шк шен Й в БОЮ дення ше шен ше; ШОВ -- ТЕЙ або шш и ші ти що о І. Ще ЗО претттттес В-ВЕ - ВЕ-Е-- - - с Ід кі КА в ле ТК ! 20.00. тет | ш що шщ щ що шив 138 в ло ра ля м | в Ї Всентлнея 000, 0.00 | 13:33 | 5833 867 867 53338000 8000 6333 Ми 000 000 Ваза 965 вв 588 лібосо| теве | 836 75.

фіг. 7 В'асетичних умовах додаються стерильний контейнер середовище МЕМ плюсів (Б об й середовища), лотім додають клітини лінії АК-МАЛТОЯ.

Розраховують об'єм вірусу ва основі заданої валичини МОЇ, що складає 0,7. Додають в контейнер.

С підт СЛІД ТТ Кожен ролер-флакон змішують і вносять іповинен містити приблизної ртттявриблизно ло 00 мл. на їе107 клітин і вірус в | ролер-фнлакон фірми кількості; відповідній МОЇ Согвіпо (850 см) і Чи Інкубація: Температура: ЗТ Струшувавня ролер- й 7 Розмножують вірус протягом 5-7. днів, потім збираютьсі-й збір) миши Підживлення Додають у ролер-флакон 300 го зр середовища МЕМ плюс плюсієВ5 (5 об, да ОО ВИ ункубаців протагом 2 днів: Температура: 3705126 Струшування ролер-флаконів: сети ПВИ ОВ ЕК с. во ЗА Збір рідин (2-й збір) Х Повторне підживлення.

Додають у ролар-флакси 400 ми середовища МЕМ плюс плюс Інкубація протягом 2. Днів: Температура: 37,0 196 Струшування ролер-флпаконів Збір рідин (3-й остаточний збір)

Фіг. 8 дл Висівання клітин ліннАКАМАЇОЯ її таїх зараження Х ї ді свенет ко Ку Е пт тн Н Й Н 1 : ! Період піспя зараження: і Е ! являє собою періюд часу від і Е моменту зараження до збору ' : І 1 Й і ! - 5-7 днів! Е З-йзбір: Відповідає и 1 ! моменту часу і Е І піспя зараження, Н : і у-який здійснюють. збір ' ! і антигену ' В удеттннн | : розмноження.

ПОПОВ Н : вірусу Підживлення (БЕХ; і Я Відповідає періоду часу між а Ї ші звраженням пяти : Ї ізбором'ї Н : - лі дбдні 7-9 днів : і 2-й збір.Момент часу, в'який : ї ї збирають антиген після : Н ! підживваення | : На ВИН | ! ! 2-е підживлення (ВЕ); ; Е ! Відповідає перюду часу між Й : зараженням і збором З її ! ЗВ 1 вм днів ше і З-й збір: ' і і Моментчасу, в'який збирають Е антиген зееаквиню паж НТК після 2-го підживлення