UA124521C2 - Способи отримання полінуклеотидів з використанням композицій солей полівалентних катіонів - Google Patents

Способи отримання полінуклеотидів з використанням композицій солей полівалентних катіонів Download PDF

Info

Publication number
UA124521C2
UA124521C2 UAA201708890A UAA201708890A UA124521C2 UA 124521 C2 UA124521 C2 UA 124521C2 UA A201708890 A UAA201708890 A UA A201708890A UA A201708890 A UAA201708890 A UA A201708890A UA 124521 C2 UA124521 C2 UA 124521C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
polynucleotide
salt
composition
cationic counterion
polyvalent
Prior art date
Application number
UAA201708890A
Other languages
English (en)
Inventor
Премчандран Х. Рамія
Премчандран Х. Рамия
Original Assignee
Джерон Корпорейшн
Джерон Корпорэйшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Джерон Корпорейшн, Джерон Корпорэйшн filed Critical Джерон Корпорейшн
Publication of UA124521C2 publication Critical patent/UA124521C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/314—Phosphoramidates
    • C12N2310/3145—Phosphoramidates with the nitrogen in 3' or 5'-position
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Аспекти цього винаходу включають способи отримання полінуклеотиду. У деяких варіантах реалізації винаходу спосіб включає приведення в контакт першої полінуклеотидної композиції, що містить: полінуклеотид, що має послідовність з 7 або більше нуклеозидних субодиниць, де щонайменше дві з нуклеозидних субодиниць з'єднані між собою міжсубодиничним N3'→Р5' тіофосфорамідатним зв'язком; а також нецільові продукти і реагенти синтезу, з сіллю полівалентного катіона для осадження солі полінуклеотиду, що містить щонайменше один полівалентний катіонний протиіон; і відділення солі полінуклеотиду від контактуючої першої полінуклеотидної композиції для отримання другої полінуклеотидної композиції, що містить цю сіль полінуклеотиду. У деяких варіантах реалізації винаходу спосіб додатково включає приведення солі полінуклеотиду в контакт з носієм хроматографії зверненої фази; елюювання з хроматографічного носія третьої полінуклеотидної композиції, що містить цей полінуклеотид. Також запропоновано композиції, що містять сіль полінуклеотиду, що містить щонайменше один полівалентний катіонний протиіон.

Description

Аспекти цього винаходу включають способи отримання полінуклеотиду. У деяких варіантах реалізації винаходу спосіб включає приведення в контакт першої полінуклеотидної композиції, що містить: полінуклеотид, що має послідовність з 7 або більше нуклеозидних субодиниць, де щонайменше дві з нуклеозидних субодиниць з'єднані між собою міжсубодиничним М3'-Р5' тіофосфорамідатним зв'язком; а також нецільові продукти і реагенти синтезу, з сіллю полівалентного катіона для осадження солі полінуклеотиду, що містить щонайменше один полівалентний катіонний протиїіон; і відділення солі полінуклеотиду від контактуючої першої полінуклеотидної композиції для отримання другої полінуклеотидної композиції, що містить цю сіль полінуклеотиду. У деяких варіантах реалізації винаходу спосіб додатково включає приведення солі полінуклеотиду в контакт з носієм хроматографії зверненої фази; елюювання з хроматографічного носія третьої полінуклеотидної композиції, що містить цей полінуклеотид.
Також запропоновано композиції, що містять сіль полінуклеотиду, що містить щонайменше один полівалентний катіонний протиїіон.
ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕНУ ЗАЯВКУ
ІЇООО1| Згідно 35 |И.5.С. 5 119 (е), дана заявка просить пріоритет за датою подання попередньої заявки США з серійним номером 62/151891, поданої 23 квітня 2015 року, зміст якої включено в даний опис за допомогою посилання.
ВСТУП
00021 Хімія полімерів нуклеїнових кислот грає важливу роль в багатьох технологіях, що розвиваються, в області фармацевтики, діагностики та хімічного аналізу і, більш конкретно, в підгалузях антисмислових і антигенних терапевтичних засобів, комбінаторної хімії, посилення сигналів на основі розгалуженої ДНК і діагностики та хімічного аналізу на основі матриць ДНК.
Частина зазначеної хімії полімерів спрямована на поліпшення міцності зв'язування, специфічності і стійкості до дії нуклеаз природних полімерів нуклеїнових кислот, таких як ДНК.
Пептидні нуклеїнові кислоти (РМА), тіофосфатні, метілфосфонатні і фосфорамідатні межнуклеозідні зв'язки являють собою приклади деяких хімічних особливостей полімерів, які використовують відносно полінуклеотидів для отримання однієї або більше бажаних властивостей, таких як стійкість до дії нуклеаз, клітинне поглинання і розчинність.
ЇО0ОЗІ| Полінуклеотидні М3З -- Р" фосфорамідати можуть утворювати стабільні дуплекси з комплементарними ДНК і РНК ланцюгами, а також стабільні триплекси з ДНК дуплексами, і є стійкими до дії нуклеаз. Полінуклеотидні МЗ "- Ре" тіофосфорамідати знайшли застосування в якості ефективних антисмислових агентів як іп мйго, так і іп мімо. Сполуки, що містять поленуклеотіди, які пригнічують активність теломерази, можуть бути використані для лікування опосередкованих теломеразою порушень, таких як рак, оскільки ракові клітини експресують теломеразу, а нормальні соматичні клітини людини не мають теломеразної активністі біологічно значимого рівня. Таким чином, способи отримання і виділення таких полінуклеотидів становлять інтерес.
СУТЬ ВИНАХОДУ
Ї0004| Аспекти даного винаходу включають способи отримання полінуклеотида. У деяких варіантах реалізації винаходу спосіб включає контактування першої полінуклеотидної композиції, що включає: полінуклеотид, що має послідовність з 7 або більш нуклеозидних субодиниць, де щонайменше дві з нуклеозидних субодиниць, з'єднані між собою субодиничним
Зо М3 -- РУ-тіофосфорамідатной зв'язком; нецільові продукти і реагенти синтезу; полівалентную катіонну сіль для осадження солі полінуклеотида, що містить щонайменше один полівалентний катіонний протиїон; відділення солі полінуклеотида від контактуючої першої полінуклеотидної композиції для отримання другої полінуклеотидної композиції, що містить сіль полінуклеотида. У деяких варіантах реалізації винаходу спосіб додатково включає зв'язування солі полінуклеотида з носієм хроматографії зверненої фазі; елюювання з хроматографічного носія третьої полінуклеотидної композиції, що містить полінуклеотид. У деяких варіантах реалізації винаходу спосіб додатково включає контактування першої солі полінуклеотида з носієм хроматографії зверненої фазі; елюювання з хроматографічного носія третьої полінуклеотидної композиції, що містить другу сіль полінуклеотида. Також пропонуються композиції, що включають сіль полінуклеотида, що містить щонайменше один полівалентний катіонний протиїон. У деяких варіантах реалізації винаходу щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон вибраний з групи, що складається з магнію, цинку, алюмінію і кальцію.
КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
0005) Кваліфікованому фахівцю буде зрозуміло, що графічні матеріали, описані нижче, представлені тут тільки для ілюстраційних цілей. Графічні матеріали жодним чином не призначені для обмеження обсягу даного принципу.
ІО0О6Ї На фігурі 1 показані ВЕРХ хроматограми Іметелстат-Мау в 1М розчині Масі при різних значеннях рн.
І0007| На фігурі 2 показані результати елементного аналізу іметелстата натрію, обробленого різними солями.
ІЇО0О8| На фігурі З показані результати елементного аналізу іметелстата натрію, обробленого зі збільшенням еквівалентів солі хлориду магнію.
І0009| На фігурі 4 показані результати елементного аналізу іметелстата ТЕА, обробленого зі збільшенням еквівалентів солі хлориду магнію.
ВИЗНАЧЕННЯ
0010) Перш ніж більш детально описувати типові варіанти реалізації винаходу, викладені такі визначення, що ілюструють і визначають зміст і обсяг термінів, які використовуються в описі.
ІЇ0011| Наступні терміни мають наступні значення, якщо не вказано інше. Будь-які 60 невизначені терміни мають значення, прийняте в даній області техніки.
ІЇ0О012| В даному контексті терміни полінуклеотид і олігонуклеотид використовуються як взаємозамінні для позначення сполуки, що містить багато нуклеозидних субодиниць або нуклеозидних фрагментів, які пов'язані міжнуклеозидними або міжнуклеотидними зв'язками.
Кожний раз, коли полінуклеотид представлений послідовністю букв, таких як «(АТООССТО», розуміється, що нуклеотиди знаходяться в 5 '- 3' порядку зліва направо і що «А» позначає дезоксиаденозин, «С» позначає деоксіцитидин, «С» позначає дезоксигуанозин, «Т»позначає тимідин, а «ОО» позначає дезоксиуридин, якщо не вказано інше. 0013) В даному контексті "нуклеозид" включає природні нуклеозиди, включаючи 2'-дезокси і г'-гідроксильні форми, наприклад, описані в Когпрегд апа ВаКег, ДНК Керіїсайоп, 20е вид. (Ггеетап, Сан-Франциско, 1992). "Аналоги" щодо нуклеозидів включають синтетичні нуклеозиди, що мають фрагменти модифікованих основ і / або фрагменти модифікованих цукрів, наприклад, описані, в цілому, автором 5спеїї, Мисіеоїіде Апаіод5 (допп У/іеу, Нью-Йорк, 1980). Такі аналоги включають синтетичні нуклеозиди, призначені для посилення зв'язуючих властивостей, наприклад, стабільності, специфічності або т.п., такі як описані авторами
Опітапп ії Реутап (Спетіса! Кемієму5, 90: 543-584, 1990). У деяких варіантах реалізації нуклеозид або аналоги нуклеозиду містять 3'-гідроксильну групу або 3'-аміногрупу. 0014) Терміни "основа" і "азотиста основа" використані в даному контексті взаймозамінно і включають (ї) звичайні основи ДНК і РНК (урацил, тимін, аденін, гуанін і цитозин) і (ії) модифіковані основи або аналоги основ (наприклад, 5-метілцітозін 5-бромурацил або инозин).
Аналог основи представляє собою хімічну сполуку, молекулярна структура якої імітує структуру звичайної основи ДНК або РНК. 0015) В даному контексті "піримідин" означає піримідини, що зустрічаються у природних нуклеозидів, включаючи цитозин, тимін і урацил, і їх поширені аналоги, такі як аналоги, що містять окси, метил, пропініл, метокси, гідрокси, аміно, тіо, галоген і т.п . замісники. Зазначений в даному контексті термін додатково включає піримідини з приєднаними поширеними захисними групами, такими як МА -бензоілцітозін. Інші піримідинові захисні групи, що становлять інтерес, включають, але не обмежуються ними, які описані в Веаисаде апа Іуег Теїгапейдгоп 48: 2223-2311 (1992).
І0016| В даному контексті "пурин" означає пурини, що зустрічаються у природних нуклеозидів, включаючи аденін, гуанін і гіпоксантин, і їх поширені аналоги, такі як містять окси, метил, пропініл, метокси, гідрокси, аміно, тіо, галоген і т.п. заступники. Зазначений в даному контексті термін додатково включає пурини з приєднаними звичайними захисними групами, такими як М2-бензоілгуанін, М2-ізобутірілгуанін, Мб-бензоіїладенін і т.п. Інші звичайні групи захисних пуринів описані Веаисаде апа Іуег Теїгапедгоп 48: 2223-2311 (1992). В даному контексті термін "захищений" як частина хімічної назви відноситься до відомих в даній області техніки захисним групам для конкретного фрагмента сполуки, наприклад, "5'-захищений гідроксил" щодо нуклеозида включає трифенілметил (тобто тритил), п-анізілдіфенілметіл (тобто монометоксітрітіл або ММТ), ді-п-анізілфенілметіл (тобто діметоксітрітіл або ОМТ), і т.п.; і захищених азотистих основ щодо азотистої основи, що містить гетероатом з захищений групою, такою як діметіламіноформамідін (ОМЕ), бензоїл (В27), ізобутіріл і т.п. Відомі в даній області техніки захисні групи включають групи, описані в наступних посиланнях: зай, еайог,
Оіїдописієоііде 5упіпевів: А Ргасіїса! Арргоасі (ІВІ Ргев5, Охіога, 1984); Ататаїйй апа Вгоот,
Спетіса! Веміємув, 77: 183-217, 1977; Роп еї аї., Віоїесппіднев, 6: 768-775, 1988; Опізика еї аї.,
Мисівєїс Асід5 Незвагсй, 10: 6553-6570, 1982; ЕскКвіеїп, еайюг, Оіїдописіеоїідев5, апа Апаіодиев: А
Ргасіїса! Арргоасп (ІВ Ргевз5, Охіога, 1991), Стеєпе апа Му/ціїв, Ргоїесіїме Стоцурв іп Огдапіс зЗупіпезів, Зесопа Еайіоп, (Чойп УМПеу б Боп5, Мем/ Могк, 1991), Магапа, еайог, 5зупіпевів апа
Арріїсайопз ої ДНК апа РНК (Асадетіс Ргез5, Мем Хогк, 1987), Веаисаде апа Іуег Теїгапеагоп 48: 2223- 2311 (1992) і тому подібним. 0017) В даному контексті "полінуклеотидний МЗ "-- Р" тіофосфорамідат" означає олігомер, зазвичай лінійний, з нуклеозидних субодиниць, пов'язаних щонайменше одним М3'--» РБ' тіофосфорамідатним зв'язком. Загалом нуклеозидні субодиниці містять нуклеозиди або аналоги нуклеозидів, але можуть також містити більш загальні фрагменти, які мають сумісну хімію, такі як абазівні цукри і інші вуглеводневі фрагменти, і описані в наступних посиланнях: Меулоп еї аї.,
Мисівєїс Асідз Везеагсй, 21: 1155- 1162 (1993); СптійНіп еї аЇ., У. Ат. Спет. 5ос., 114: 7976-7982 (1992); УЧазснкКе еї аї., Теманпедгоп І ецегв5, 34: 301-304 (1992); Ма еї аї., Іпіетайопаї! арріїсайоп
РСТ / САЗ9З2 / 00423; 70оп вї аї., Іпіегпайіопаї! арріїсайоп РСТ / 0590 / 06630; Юигапа еї аї., Мисієїс
Асіаз Резеагси, 18: 6353-6359 (1990); ЗаІшпКне еї а!., У. Ат. Спет. 5ос., 114: 8768-8772 (1992); і тому подібних. У деяких випадках цей термін означає полінуклеотид, де всі міжнуклеозидні зв'язки замінюються М3'--» РЕ тіофосфорамідатними зв'язками. Як такий, термін включає 60 частково, а також повністю «амідіровані» олігомери. У деяких випадках цей термін означає полінуклеотид, де всі міжнуклеозидні зв'язки замінені на М3'- Ре" тіофосфорамідатні зв'язки і де нуклеозидні субодиниці є природними нуклеозидами або їх аналогами. Цей полінуклеотид
М3'- РУ" тіофосфорамідат, в якому кожний зв'язок являє собою М3 '-- Р" тіофосфорамідатний зв'язок («повністю амідірований»), може бути вбудований або приєднаний до інших олігонуклеотидів або полінуклеотидів з утворенням більшого олігомера, який «частково амідірований» . Цей полінуклеотид М3 "- РБ' тіофосфорамідат може включати будь-які відповідні З" і / або 5'-кінцеві групи. У деяких варіантах реалізації винаходу, полінуклеотид М3 "-
РУ тіофосфорамідат включає 3'-гідроксильну кінцеву групу або 3'-аміно кінцеву групу. 0018) Використані тут терміни «фосфат» і «фосфатна група» охоплюють тіофосфатні і оксофосфатні групи. 0019) Використаний тут термін «аміногрупа фосфорамідита» відноситься до аміногрупи --
МАВ», приєднаної до атому фосфору фосфорамідітної групи, а термін «фосфорамідитовий азот» відноситься до атома азоту аміногрупи фосфорамідіта.
І0020| «Алкіл» відноситься до одновалентних насичених аліфатических гідрокарбільних груп, які мають від 1 до 10 атомів вуглецю: від 1 до 6 атомів вуглецю (наприклад, «алкіл з 1-6 атомами вуглецю») або від 1 до 5 (наприклад, «алкільний від 1 до 5 атомів вуглецю ») або від 1 до 4 (наприклад,« алкіл з 1-4 атомами вуглецю ») або від 1 до З атомів вуглецю (наприклад,« алкіл з 1 до З атомами вуглецю »). Цей термін включає лінійні і розгалужені гідрокарбільні групи, такі як метил (СНз-), етил (СНзСНе-), н-пропіл (СНзСНеСнН»г-), ізопропіл. (СНз)28СН-), н-бутил (СНнСН.НоСН »-), ізобутіл (СНаз)2:СНеОН»-), втор-бутил (СНз)/СНзСНг)СН-), трет-бутил ((СНз)зО- ), н-пентил (СНЗУСНаСНоСНеСснНег-) і неопентіл (СНз)зССНе-).
І0021|) Термін «заміщений алкіл» відноситься до алкільної групи, як визначено тут, в якій один або кілька атомів вуглецю в алкільного ланцюга необов'язково заміщені гетероатомом, таким як -О-, -М-, -5-, -5 (0) «- ( де п від 0 до 2), -МВ- (де ЕК являє собою водень або алкіл) і має від 1 до 5 замісників, обраних з групи, що складається з алкоксі, заміщеного алкоксі, циклоалкіла, заміщеного циклоалкіла, циклоалкеніла, заміщеного циклоалкеніла, ацила, ациламіно, ацилокси, аміну, аміноацила, аміноацілоксіла, оксіаміноаціла, азидо, ціано, галогену, гідроксила, оксо, тіокето, карбоксилу, карбоксілалкіла, тіоарілоксі, тіогетероарілоксі, тіогетероціклооксі, тіолу, тіоалкоксі, заміщеного тіоалкоксі, арилу, арилокси, гетероарилу, гетероарілоксі, гетероциклами, гетероціклооксі, гідроксіаміно, алкоксіаміно, нітро, -50- алкила, - 5О- арилу , -50- гетероарилу, -502- алкила, -502- арилу, -502- гетероарилу і -МАВаРЄ, причому
Ваг і Р? можуть бути однаковими або різними і вибрані з водню, необов'язково заміщеного алкілу, циклоалкени, алкенілу, циклоалкеніл, алкінілу, арилу, гетероарилу і гетероциклу. У деяких випадках «заміщений алкіл» відноситься до алкільної групи, як визначено тут, має від 1 до 5 замісників, обраних з групи, що складається з алкокси, циклоалкени, циклоалкеніл, аціла, ациламіно, ацилокси, аміно, аміноацил, аміноацілоксі, оксіаміноаціла, азидо , ціано, галогену, гідроксилу, карбоксилу, карбоксілалкіла, тіолу, тіоалкоксі, арилу, арилокси, гетероарилу, гетероарилу, гетероциклу, гетероціклооксі, сульфонаміду і -МАВ2ВА?, де Ка і Б? можуть бути однаковими або різними і вибрані з водню, алкілу, циклоалкени, алкенілу, циклоалкеніл, алкінілу, арилу, гетероарилу і гетероциклу. (00221 «Алкоксі» відноситься до групи -О- алкіла, причому алкіл має значення, вказані тут.
Алкоксі включає, наприклад, метокси, етокси, н-пропокси, ізопропокси, н-бутокси, трет-бутокси, втор-бутокси, н-пентоксил тощо. Термін «алкокси» також відноситься до груп алкеніл-О-, циклоалкіл-О-, циклоалкеніл-О- і алкініл-О-, де алкеніл, циклоалкіл, циклоалкеніл і алкініл є такими, як визначено тут. 0023) Термін «заміщений алкокси» відноситься до груп заміщеного алкіл-О-, заміщеного алкеніл-О-, заміщеного циклоалкіл-О-, заміщеного циклоалкеніл-О- і заміщеного алкініл-О-, де заміщений алкіл, заміщений алкеніл, заміщений циклоалкіл, заміщений циклоалкеніл і заміщений алкініл є такими, як визначено тут. (0024) «Ацил» відноситься до груп Н-С (0) -, алкіл-С (ФО) -, заміщеного алкіл-С (0) -, алкеніл-
С (0) -, заміщеного алкеніл-С (0) -, алкініл-С ( О) -, заміщеного алкініл-С (0) -, циклоалкіл-С (0) -, заміщеного циклоалкіл-С (0) -, циклоалкеніл-С (0) -, заміщеного циклоалкеніл-С (0) -, арил-С (0) -, заміщеного арил-С (0) -, гетероарил-С (0) -, заміщеного гетероарил-С (0) -, гетероцикліл-
С (0) - і заміщеного гетероцикліл-С (0) -, причому алкіл , заміщений алкіл, алкеніл, заміщений алкеніл, алкініл, заміщений алкініл, циклоалкіл, заміщений циклоалкіл, циклоалкеніл, заміщений циклоалкеніл, арил, заміщений арил, гетероарил мул, заміщений гетероарил, гетероцикліл і заміщений гетероцикл є такими, як визначено тут. Наприклад, ацил включає «ацетильную» групу СНзС(О)-.
І0025| Термін «заміщений аміно» відноситься до групи -МКК, де кожен К незалежно бо вибраний з групи, що складається з водню, алкілу, заміщеного алкілу, циклоалкени, заміщеного циклоалкени, алкенілу, заміщеного алкенілу, циклоалкеніл, заміщеного циклоалкеніл, алкінілу, заміщеного алкінілу, арилу, гетероарилу і гетероциклу, за умови, що щонайменше один з К не є воднем. 0026) «Гало» або «галоген» відноситься до фтору, хлору, бром і йоду.
І0027| «Гідрокси» або «гідроксил» відноситься до групи -ОН. (0028) «Гетероарил» відноситься до ароматичної групи від 1 до 15 атомів вуглецю, така яка складається від 1 до 10 атомів вуглецю і від 1 до 10 гетероатомов, вибраних з групи, що складається з кисню, азоту та сірки всередині кільця. Такі гетероарільні групи можуть мати одне кільце (таке як піридиніл, імідазоліл або фурил) або кілька конденсованих кілець в кільцевій системі (наприклад, як в групах, таких як індолізініл, хіноліну, бензофуран, бензимідазоли або бензотіеніл)у, причому щонайменше одне кільце в кільцевої системі є ароматичним, за умови, що точка прикріплення проходить через атом ароматичного кільця. У деяких варіантах реалізації винаходу атом (и) азоту і/або сірчаного кільця (сірчаних кілець) гетероарільной групи необов'язково окислюється з утворенням М-оксидних (М о - 0), сульфінільних або сульфонільний залишків. Цей термін включає, наприклад, піридиніл, піроліл, индолил, тіофенів і фураніл. Якщо інше не зазначено для гетероарільного заступника, такі гетероарільні групи можуть бути опціонально заміщені від 1ї до 5 заступниками або від 1 до З замісниками, вибраними з ацилокси, гідрокси, тіолу, аціла, алкила, алкокси, алкенілу, алкінілу, циклоалкени, циклоалкеніл, заміщеного алкила, заміщеного алкокси, заміщеного алкенілу, заміщеного алкінілу, заміщеного циклоалкени, заміщеного циклоалкеніл, аміно, заміщеного аміно, аміноацил, ациламіно, Алкар, арилу, арилокси, азидо, карбоксилу, карбоксілалкіла, ціано, галогену, н Ігро, гетероарилу, гетероарілоксі, гетероциклами, гетероціклооксі, аміноацілоксі, оксіаціламіно, тіоалкоксі, заміщеного тіоалкоксі, тіоарілоксі, тіогетероарілоксі, -50-алкила, -50- заміщеного алкілу, -5О-арилу, -50-гетероарилу, -5О2-алкила, -502-заміщеного алкілу, -502- арилу і -50О2-гетероарилу і трігалогенметіла. У таких випадках гетероарільную групу, яка заміщена від ї7 до 5 заступниками (наприклад, як описано тут), згадують як «заміщений гетероарил».
І0029| «Гетероцикл», «гетероциклічний», «гетероциклоалкіл» і «гетероцикліл» відносяться до насиченою або ненасиченої групи, що має одне кільце або кілька конденсованих кілець, включаючи конденсовані мостикові і спіро-кільцеві системи та мають від З до 20 кільцевих атомів, включаючи 1-10 гетероатомів. Ці кільцеві атоми обрані з групи, що складається з азоту, сірки або кисню, де в конденсованих кільцевих системах одне або кілька кілець можуть бути ціклоалкілом, арилом або гетероарілом, за умови, що точка прикріплення проходить через неароматичне кільце. У деяких варіантах реалізації винаходу азот і / або атом (и) сірки гетероциклической групи опціонально окислюються з утворенням М-оксидних, -5 (0) - або -502- груп.
І0030| Приклади гетероциклів і гетероарілов включають, але не обмежуються, азетидин, пірол, імідазол, піразол, піридин, піразин, піримідин, піридазин, індолізін, ізоіндолів, індол, дігідроіндол, індазол, пурин, хінолізін, ізохінолін, хіноліновий, фталазін, нафтілпірідін, хіноксалін, хіназолін, цінолін, птеридина, карбазол, карболіни, фенантрідін, акридин, фенантролін, ізотіазол, феназин, ізоксазол, феноксазін, фенотіазін, імідазолідиніл, імідазолін, піперидин, піперазин, індолін, фталімід, 1,2,3,4- тетрагідроізохінолін, 4, 5,6,7-тетрагідробензо |БІ| тіофен, тіазол, тіазо Лідін, тіофен, бензо (|Б| тіофен, Морфолін, тіоморфолініл (також званий тіаморфолініл), 1,1-діоксотіоморфолініл, піперидиніл, піролідин, тетрагідрофураном тощо.
ІЇ0031| Якщо інше не зазначено для гетероциклічного замісника, такі гетероциклічні групи можуть бути опціонально заміщені від 1 до 5 або від 1 до З замісниками, вибраними з алкокси, заміщеного алкокси, циклоалкени, заміщеного циклоалкени, циклоалкеніл, заміщеного циклоалкеніл, аціла, ациламіно, ацилокси, аміно , заміщеного аміну, аміноацил, аміноацілоксі, оксіаміноаціла, азидо, ціано, галогену, гідроксилу, оксо, тіокето, карбоксилу, карбоксілалкіла, тіоарілоксі, тіогетероарілоксі, тіогетероціклооксі, тіолу, тіоалкоксі, заміщеного т оалкоксі, арилу, арилокси, гетероарилу, гетероарілоксі, гетероциклами, гетероціклооксі, гідроксіаміно, алкоксіаміно, нітро, -52О-алкила, -50-заміщеного алкілу, -5О0-арилу, -50-гетероарилу, -505- алкила, -505-заміщеного алкила, -5О2-арилу, -5О02-гетероарилу і конденсованого гетероциклу. 00321 «Нітро» відноситься до групи -МО». 0033) «Оксо» відноситься до атому (-0). (0034) «Тіол» відноситься до групи -5Н. 0035) «Тіоксо» або термін «тіокето» відноситься до атому (5). 0036) На додаток до описаного тут, термін «заміщений» при використанні для модифікації зазначеної групи або радикала також може означати, що один або кілька атомів водню 60 зазначеної групи або радикала кожен незалежно один від одного замінюється одними і тими ж або різними групами замісників, як зазначено нижче.
І0037| На додаток до груп, описаним в відношенні індивідуальних термінів тут, замісники для заміщення одного або декількох атомів водню (будь-які два атома водню одного вуглецю можуть бути замінені на: 50, МА, -М-ОВ, -М2 або -5) в зазначених групах або радикалах, якщо не вказано інше -НЄ2, гало, 0, -0О8, -5879, -МА8ОВВс, тришалометил, -СМ, -ОСМ, -5СМ, -
МО, -МО», -М2, -Мз, -502879, -5020: МУ, -5БО256ОН, -0502879, - 05020 М", -«0502087, -Р(ІФ(О- )2(МУ», -КОХОВ ЗО МУ, -Р (ОА 9)», -Ф(О)В8, -С(5)8, -С(МА 8, -Б(О0)0: МУ, -Ф(О)ОВ, -
Ф(5)ОВ, -С(О)МАВодВо, «(МАМ АВОВУ, -ОС(0)8", -0ОС(5)8, - ОС(О0)0О МУ, -ОС(ООВ, -
Оосб(5юНА, -МАС(О)В 0 -МАб(5)А,-МАбОг Ме, -МАбО»в, -МАОО()ОВ, О-
МА"С(О)МАВодВО, -МАЛС(МАА и -МАС(МА)МАВОВя, причому КО? вибраний з групи, що включає опціонально заміщений алкіл, циклоалкіл, гетероалкіл, гетероціклоалкілалкіл, ціклоалкілалкіл, арил, арилалкіл, гетероарил і гетероарілалкіл, кожен К"? незалежно являє собою водень Ко: кожен К8о незалежно являє собою КО або, альтернативно, два 89 узяті разом з атомом азоту, з яким вони пов'язані, формують 5-, 6- або 7--ленний гетероциклоалкіл, який може необов'язково включати від 1 до 4 однакових або різних додаткових гетероатомів, обраних з групи, що складається з 0, М і 5, з яких М може мати -Н або С:-Сз алкільні заміщення; і кожен М" є протівоіїном з чистим кінцевим позитивним зарядом.
Кожен М" може бути незалежно, наприклад, лужним іоном, таким як К", Ма", (іх; іоном амонію, таким як "М(Вес2);; або лужноземельних іоном, таким як |СагчЧов, (М92ов, або (Ва2чЧо5 («індекс 0,5 означає, що один з протиіїонів для таких двовалентних лужноземельних іонів може бути іонізованої формою сполуки та інший протиіїон, такий як хлорид, або дві іонізованих сполуки, описані тут, можуть служити в якості протиіонів для таких двовалентних іонів лужноземельних металів, або двічі іонізована сполука даного винаходу може служити в якості протиїбона для таких двовалентних іонів лужноземельних металів). В якості конкретньх прикладів, -МН8од8о передбачає включення -МН», -МН-алкіла, М-пирролидиніла, М-пиперазиніла, 4М-метилпиперазин-1-іл і М-морфолиніла. 0038) На додаток до описаного тут, в певному варіанті реалізації винаходу, група, яка заміщена, має 1, 2, З або 4 замісники, 1, 2 або З замісника, 1 або 2 замісника або 1 замісник.
І0039| Прийнято, що у всіх заміщених групах, визначених вище, полімери встановлюють
Зо шляхом визначення замісників з іншими замісниками на себе (наприклад, заміщений арил, який має заміщену арильну групу в якості замісника, який сам заміщений заміщенною арильною групою, який в подальшому заміщений замещінною арильною групою і т. д.) не призначені для включення тут.
У подібних випадках максимальна кількість подібних заміщень дорівнює трьом. Наприклад, послідовні заміни заміщених арильних груп, конкретно розглянутих тут, обмежені зміщенням арил- (зміщенням арил) -заміщених арилом.
І0040| Якщо не вказано інакше, номенклатура заступників, які явно не визначені тут, встановлюється шляхом найменування термінальної частини функціональності, за якою слідують суміжні функціональні можливості, до точки приєднання.
І0041| Що стосується будь-якої з описаних тут груп, які містять один або кілька заступників, зрозуміло, що такі групи не містять ніякої заміни або схеми заміщення, які є стерично непрактичними і/або синтетично нездійсненними. Крім того, зазначені сполуки включають всі стереохімічні ізомери, що виникають в результаті заміщення цих сполук.
І0042| Термін «фармацевтичні прийнятна сіль» означає сіль, прийнятну для введення пацієнтові, такому як ссавець (солі з протиюнами, що володіють прийнятною безпекою для ссавців при заданому режимі дозування) «Такі солі можуть бути отримані з фармацевтично прийнятних неорганічних або органічних основ і з фармацевтично прийнятних неорганічних або органічних кислот. «Фармацевтично прийнятна сіль» відноситься до фармацевтично прийнятних солей сполуки, солі яких отримані з різних органічних і неорганічних протиіонів, добре відомих в даній області, і включають, наприклад, тільки натрій тощо; і коли молекула містить основну функцію, солі органічних або неорганічних кислот, такі як гідрохлорид тощо.
Фармацевтично прийнятні солі, що становлять інтерес, включають, але не обмежуються, алюмінієм, амонієм, аргініном, барієм, бензатину, кальцієм, холінатом, етилендіаміном, лізин, літієм, магнієм, меглумін, прокаїном, калієм, натрієм, трометамієм, М-метилглюкамін, М, М'- дибензилетилендіамін, хлорпрокаїн, діетаноламіном, етаноламіном, піперазином, цинком, діізопропіламіном, триетиламіном, діізопропілетиламін і солями ТЕА.
І0043| Термін «сіль того» означає сполуку, утворену, коли протон кислоти замінений катіоном, таким як катіон металу або органічним катіоном і тому подібним. Де це може бути застосовано, сіль є фармацевтично прийнятною сіллю, хоча це не потрібно для солей бо проміжних сполук, які не призначені для введення пацієнту. Як приклад солі справжніх сполук включають сполуки, в яких сполуку протоновану неорганічної або органічної кислотою з утворенням катіона з кон'югованим основою неорганічної або органічної кислоти в якості аніонного компонента солі. Солі, що становлять інтерес, включають, але не обмежуються, алюмінієм, амонієм, аргініном, барієм, бензатину, кальцієм, цезієм, холінатом, етилендіаміном, літієм, магнієм, меглумін, прокаїном, М-метилглюкамін, піперазином, калієм, натрієм, трометаміна, цинком, М, М'-дибензилетилендіамін, хлорпрокаїн, діеєтаноламіном, етаноламіном, піперазином, діїзопропіламіном, триетиламіном, діїзопропілетиламін і солями ТЕА. Зрозуміло, що для будь-якої з описаних тут полінуклеотидних структур, які включають основний ланцюг межнуклеозідних зв'язків, такі полінуклеотиди можуть також включати будь-які зручні форми солі. У деяких варіантах реалізації винаходу кислотні форми межнуклеозідних зв'язків зображені для простоти. У деяких випадках сіль цільової сполуки являє собою одновалену катіонру сіль. У деяких випадках сіль цільової сполуки являє собою двовалентну сіль катіона. У деяких випадках сіль цільової сполуки являє собою тривалентну катіонну сіль.
І0044| «Сольватамі» відноситься до комплексу, утвореному комбінацією молекул розчинника з молекулами або іонами розчиненої речовини. Розчинником може бути органічна сполука, неорганічне сполуки або суміш обох. Деякі приклади розчинників включають, але не обмежуються, метанолом, М, М-диметилформамідом, тетрагідрофураном, диметилсульфоксидом і водою. Коли розчинником є вода, утворений сольват предсталяє собою гідрат. 0045) «Стереоізомер» і «стереоізомери» відносяться до сполук, які мають однакову атомну зв'язність, але розрізняються розташуванням атомів в просторі. Стереоіїзомери включають цис- транс-ізомери, ізомери Е і 7, енантіомери і діастереомери. (0046) «Таутомер» відноситься до альтернативних форм молекули, які відрізняються тільки електронним зв'язком атомів і / або в положення протона, таким як Енола-кето і імін-енаміновие таутомери, -МН-Р(-5ХОН)-О- і -«МН-Р(-О)Х5Н)-О- або таутомерні форми гетероарільних груп, що містять гетероциклічну групу -М-С(Н)-МН- кільця, таким як піразоли, імідазоли, бензімідазоли, триазоли і тетразоли. Фахівцю в даній області техніки буде зрозуміло, що можливі інші таутомерні форми описаних тут груп. Наприклад, зрозуміло, що полінуклеотид, описаний наступною структурою: н її
МК дон ! о й Ще, ї сен
Ша»; ден
Е о ек р пов! пре! пре пев прю прес пре те А
Зо Мне також включає наступну структуру, яка показує одне можливе альтернативне таутомерне розташування груп зв'язків: а
М Жоо--о ев 5 сн КУ ще А зеїчн о о р пре прю прю рве пре пр пред пр! д 7-й
І
МН; де «про» являє собою тіофосфорамідатний зв'язок (-МН--Р(-ОХ5Н)-0-- або - МН--
РІ-5БХОН)-0--), що сполучає 3'-вуглець одного нуклеозида з 5 " -вуглецем сусіднього нуклеозида. Зрозуміло, що все таутомерні форми цільової сполуки охоплюються структурою, в якій описано одне можливе таутомерне розташування груп сполуки, навіть якщо це не зазначено конкретно. Будь-яке підходяще таутомерне розташування груп досліджуваних сполук може бути використано при описі сполук.
І0047| Зрозуміло, що термін «або сіль або сольват або його стереоізомер» включає всі перестановки солей, сольватів і стереоізомерів, такі як сольват фармацевтично прийнятної солі стереоіїзомерів даної сполуки. Зрозуміло, що термін «або його сіль» призначений для включення всіх перестановок солей. Зрозуміло, що термін «або її фармацевтично прийнятна сіль» призначений для включення всіх перестановок солей. Зрозуміло, що термін «або його сольват» призначений для включення всіх перестановок сольватів. Зрозуміло, що термін «або його стереоизомер» призначений для включення всіх перестановок стереоізомерів. Зрозуміло, що термін «або його таутомер» призначений для включення всіх перестановок таутомерів. Так, наприклад, випливає, що передбачається включати сольват фармацевтично прийнятної солі таутомерів стереоіїзомеру даної сполуки.
І0048| Використаний тут термін «виділений» призначений для опису сполуки, що представляє інтерес, яка знаходиться в навколишньому середовищі, відмінному від середовища, в якій сполука знаходиться природним чином. «Виділений» передбачає включення сполук в зразках, які істотно збагачені сполукою, яка становить інтерес, і / або в яких ця сполука частково або суттєво очищена.
І0049| В даному контексті "істотно очищене" відноситься до сполуки, яка вилучена з її природного середовища і є чистою щонайменше на 6095, чистим щонайменше на 7595, чистим щонайменше на 8095, чистим щонайменше на 8195, чистим щонайменше на 8295, чистим щонайменше на 8395, чистим щонайменше на 8495, чистим щонайменше на 8595, чистим щонайменше на 8695, чистим щонайменше на 8795, чистим щонайменше на 8895, чистим щонайменше на 8995, чистим щонайменше на 9095, чистим щонайменше на 9195, чистим щонайменше н 9295, чистим щонайменше на 9395, чистим щонайменше на 9495, чистим щонайменше на 9595, чистим щонайменше на 9695, чистим щонайменше на 9795, чистим щонайменше на 9895, чистим щонайменше на 9995 або чистим більш ніж на 9995 від інших компонентів, з якими вона була пов'язана природним чином.
Зо І0О50| Термін «фізіологічні умови» охоплює ті умови, які сумісні з живими клітинами, наприклад, переважно водні умови, температура, рнН, солоності і т. д., які сумісні 3 живими клітинами. 0051) Якщо представлений діапазон величин, слід розуміти, що кожне проміжне значення, до десятої частини одиниці нижньої межі діапазону, якщо з контексту явно не випливає інше, між верхнім і нижнім межею цього інтервалу і будь-яке інше задане або проміжне значення в цьому заданому інтервалі, знаходяться в рамках винаходу. Верхній і нижній межі цих менших інтервалів можуть незалежно бути включені в менші інтервали і також знаходяться в рамках винаходу, крім будь-якого спеціально виключеного межі в заданому інтервалі. Якщо заданий інтервал включає один або обидва межі, то інтервали без одного або обох меж також включені в винахід.
І0052| Слід зазначити, що при використанні в даному документі і включеної формули винаходу форми однини включають посилання на множину, якщо з контексту явно не випливає інше. Додатково слід зазначити, що може бути складений план формули винаходу, щоб виключити будь-який необов'язковий елемент. У зв'язку з цим передбачається, що дане твердження служить в якості попереднього підстави для таких виключають термінів, як "виключно", "тільки" і тому подібних у зв'язку з перерахуванням елементів формули винаходу, або для використання "негативних" обмежень.
І0053) Інші визначення термінів можуть з'являтися у всій специфікації.
ОПИС ТИПОВИХ ВАРІАНТІВ РЕАЛІЗАЦІЇ ВИНАХОДУ
Ї0054| Як резюмоване вище, аспекти розкриття включають способи отримання полінуклеотида. У деяких варіантах реалізації винаходу спосіб включає приведення в контакт першої полінуклеотидної композиції, що містить: полінуклеотид, що має послідовність з 7 або більш нуклеозидних субодиниць, в якій щонайменше дві з нуклеозидних субодиниць з'єднані зв'язком М3 - РО" тіофосфорамідата між субодиницями; а також нецільові синтетичні продукти і реагенти; з полівалентною катіонною сіллю для осадження першої солі полінуклеотида, що містить щонайменше один полівалентний катіонний протиїон; відділення першої солі полінуклеотида від контактуючої першої полінуклеотидної композиції для отримання другої полінуклеотидної композиції, що містить першу сіль полінуклеотида. У деяких варіантах реалізації винаходу спосіб додатково включає зв'язування солі полінуклеотида з носієм бо хроматографії зверненої фазі; елюювання з хроматографічного носія третьої полінуклеотидної композиції, що містить полінуклеотид. У деяких випадках третя полінуклеотидна композиція містить другу сіль полінуклеотида. Також представлені композиції, що містять сіль полінуклеотида, що містить, щонайменше, один полівалентний катіонний протиїон. У деяких варіантах реалізації винаходу щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон вибраний з групи, що складається з магнію, цинку, алюмінію і кальцію. 0055) Перш ніж описувати різні варіанти реалізації винаходу, слід розуміти, що цей опис не обмежуються конкретними описаними варіантами здійснення і, як такі, можуть, зрозуміло, змінюватися. Слід також розуміти, що використана тут термінологія призначена тільки для опису конкретних варіантів реалізації винаходу і не призначена для обмеження, оскільки обсяг даного винаходу буде обмежений лише включеною формулою винаходу. 0056) Заголовки розділів, які використовуються тут, призначені лише для організації і не повинні тлумачитися як такі, шо обмежують предмет, описаний будь-яким чином. Хоча даний винахід описано в поєднанні з різними варіантами реалізації винаходу не передбачається, що це вчення обмежене такими варіантами здійснення. Навпаки, це вчення охоплює різні альтернативи, модифікації та еквіваленти, як буде зрозуміло фахівцям в даній області техніки.
І0057| Якщо не вказано інакше, всі технічні та наукові терміни, які використовуються тут, мають те ж значення, яке зазвичай розуміється фахівцем в даній області техніки, до якої належить даний винахід. Хоча будь-які способи і матеріали, аналогічні або еквівалентні описаним тут, також можуть бути використані в практиці або випробуваннях даного винаходу, тут описані способи і матеріали, що становлять інтерес. Всі публікації, згадані тут, включені сюди за допомогою посилання для розкриття і опису способів і / або матеріалів, в зв'язку з якими цитуються публікації. 0058) Посилання на будь-яку публікацію призначена для її опису до дати подання заявки і не повинна тлумачитися як визнання того, що данні вимоги не мають права доставити таку публікацію в силу попереднього винаходу. Крім того, дати публікації можуть відрізнятися від фактичних дат публікації, які можуть бути незалежно підтверджені.
Ї0059| Зрозуміло, що деякі особливості винаходу, які для ясності, описані в контексті окремих варіантів реалізації винаходу, також можуть бути представлені в комбінації в одному варіанті реаліалізації. | навпаки, різні ознаки винаходу, які для стислості, описані в контексті
Зо одного варіанта здійснення, також можуть бути надані окремо або в будь-якої зручної підкомбінації. Всі комбінації варіантів здійснення, що відносяться до винаходу, конкретно охоплюються цим винаходом і розкриті тут точно так же, як якщо б кожна комбінація була індивідуально і явно розкрита в тій мірі, в якій такі комбінації охоплюють предмет, який представляє собою, наприклад, сполуки, які являють собою стабільні сполуки (тобто сполуки, які можуть бути отримані, виділені, охарактеризовані й випробувані на наявності біологічної активності). Крім того, всі подкомбінації різних варіантів здійснення і їх елементів (наприклад, елементи хімічних груп, перерахованих у варіантах здійснення, що описують такі змінні), також цілеспрямовано охоплюються цим винаходом і розкриті тут точно так же, як якщо б кожна така підгрупа - комбінація була індивідуально і явно розкрита тут. 0060) Всі патенти і публікації, включаючи всі згадувані тут послідовності, описані в таких патентах і публікаціях, спеціально включені шляхом посилання.
І0О61| Надалі, описуючи даний винахід, способи отримання полінуклеотида описані спочатку більш детально. Потім розглядаються полінуклеотидні композиції, що становлять інтерес для практичних методів.
СПОСОБИ ОТРИМАННЯ
ІЇ0062| Аспекти даного опису включають способи отримання полінуклеотида. У деяких варіантах реалізації винаходу спосіб включає приведення в контакт першої полінуклеотидної композиції, що містить у собі полінуклеотид (наприклад, як описано тут), продукти і агенти нецільового синтезу, полівалентну сіль катіона для осадження солі полінуклеотида, що містить щонайменше один полівалентний протиїон. Осадження солі полінуклеотида з використанням належних методів забезпечує видалення всіх розчинних нецільових продуктів і агентів нецільового синтезу. У деяких варіантах реалізації винаходу спосіб включає відділення солі полінуклеотида від пов'язаної першої полінуклеотидної композиції для отримання другої полінуклеотидної композиції, що містить сіль полінуклеотида. У деяких варіантах реалізації винаходу перша полінуклеотидна композиція, полінуклеотидна сіль і друга полінуклеотидна композиція містять цільовий полінуклеотид, що має послідовність з 7 або більш нуклеозидних субодиниць, в якого щонайменше дві з нуклеозидних субодиниць з'єднані за допомогою М3З "--
РО тіофосфорамідатного зв'язку (наприклад, як описано тут).
І0063| Друга полінуклеотидна композиція може мати меншу кількість продуктів і агентів бо нецільового синтезу в порівнянні з першою полінуклеотидною композицією. Під меншою кількістю продуктів і агентів нецільового синтезу мається на увазі, що в другій полінуклеотидній композиції в порівнянні з першою полінуклеотидною композицією буде менше на 10 95 або більше за вагою продуктів і агентів нецільового синтезу, або менше на 15 95 або більше за вагою, або менше на 20 95 або більше за вагою, або менше на 25 95 або більше за вагою, або менше на 30 95 або більше за вагою, або менше на 35 95 або більше за вагою, або менше на 40 95 або більше за вагою, 45 95 або більше , 50 мас.95, більш як 50 мас.95, більш як 55 мас. 95, більш як 60 мас. 95, понад 65 мас. 95, більше 70 мас. 95, більш як 75 мас. 95, більш як 80 мас. 95, більш як 85 мас. 95, або менше на 90 95 або більше за вагою або менше на 95 95 або більше за вагою. Як такі, що розглядаються способи можуть забезпечувати селективне осадження цільового полінуклеотида перед нецільовими продуктами і агентами синтезу. У деяких варіантах реалізації винаходу запропоновані способи забезпечують підвищену селективність осадження в порівнянні з контрольним методом полінуклеотидного осадження з використанням органічного розчинника, такого як чистий етанол або етанольний розчин (див., Наприклад,
Стоиве У, Атогезе О (1987). "ЕІПпапої! Ргесіріїаййоп: Аттопішт Асеїаїе аз ап АйПегпаїїме о Бодійт
Асеїаїе ". Госиз 9 (2): 3-5). Під підвищеної селективність осадження мається на увазі, що 595 або більше продуктів і агентів нецільового синтезу віддаляються від другої полінуклеотидної композиції в порівнянні з контрольною композицією, або більш на 10 95 або більше за вагою, або більш на 15 95 або більше за вагою, 20 95 або більше за вагою, 25 95 або більше за вагою,
З0 95 або більше за вагою, 35 95 або більше за вагою, 40 95 або більше за вагою, 45 95 або більше за вагою, 50 95 або більше за вагою, 55 95 або більше за вагою, 60 95 або більше за вагою, 65 95 або більше за вагою, 70 95 або більше за вагою, 75 95 або більше за вагою, 80 95 або більше за вагою, 85 95 або більше за вагою, 90 95 або більше за вагою, або 95 95 або більше за вагою продуктів і агентів нецільового синтезу. Зменшена кількість продуктів і агентів нецільового синтезу в порівнянні з першою полінуклеотидною композицією може бути визначено з використанням будь-яких зручних способів, наприклад, з використанням методів
ВЕРХ.
І0064| Тут терміни «цільовий синтетичний полінуклеотид» і «цільовий полінуклеотид» використовуються як взаємозамінні і відносяться до полінуклеотиду, який має певну бажану послідовність нуклеотидів, яка синтезується на носії за допомогою будь-якого зручного
Зо поетапного способу синтезу полінуклеотидів на твердій фазі (наприклад, як описаний тут) і де полінуклеотид позбавлений будь-яких захисних груп, які використовуються виключно для цілей реалізації синтезу цільового полінуклеотида. Такі захисні групи можуть бути видалені з полінуклеотида на заключних стадіях твердофазного синтезу, наприклад, під час остаточного зняття захисту і відщеплення полінуклеотида від носія для отримання цільового полінуклеотида. Використовуваний тут термін «нецільової» відноситься до будь-якого відповідного компоненту, наприклад, до сполуки, полінуклеотиду або його похідного, агенту і т. д. або їх сумішей, які не є бажаним цільовим продуктом синтезу.
І0065| Цільовий полінуклеотид може включати будь-яку зручну кількість нуклеозидних субодиниць, наприклад від 7 до 500 нуклеозидних субодиниць, від 7 до 100 нуклеозидних субодиниць, від 7 до 75 нуклеозидних субодиниць, від 7 до 50 нуклеозидних субодиниць, від 7 до 40 нуклеозидних субодиниць, від 7 до 30 нуклеозидних субодиниць, від 7 до 20 нуклеозидних субодиниць, від 7 до 15 нуклеозидних субодиниць, від 10 до 15 нуклеозидних субодиниць або від 13 до 15 нуклеозидних субодиниць. У деяких випадках цільової полінуклеотид має від 7 до 100 нуклеозидних субодиниць, або наприклад від 7 до 50 нуклеозидних субодиниць, від 10 до нуклеозидних субодиниць, від 10 до 40 нуклеозидних субодиниць, від 10 до 30 нуклеозидних субодиниць, від 10 до 25 нуклеозидних субодиниць, від 10 до 20 нуклеозидних субодиниць, від 12 до 18 нуклеозидних субодиниць або від 12 до 16 нуклеозидних субодиниць. У деяких випадках цільової полінуклеотид має 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 або 25 нуклеозидних субодиниць. 50 І006б6| Використаний тут термін «продукти і агенти нецільового синтезу» відноситься в сукупності до безлічі нецільових компонентів, які можуть бути присутніми в сирому синтетичному продукті синтезу полінуклеотидів в твердій фазі включаючи, але не обмежуючись: нецільової полінуклеотид, продукти синтезу, такі як усічені полінуклеотиди, усічені полінуклеотидні фрагменти (тобто послідовності, які були усічені після невдалої субодиничного зв'язку), полінуклеотиди, що включають делецию (ї) (тобто відсутність одного або декількох нуклеозидних мономерів або димерів нуклеозидів, наприклад, як описано тут) і дериватизовані полінуклеотиди (наприклад, полінуклеотидні послідовності, які піддаються небажаної побічної реакції під час синтезу або розщеплення); агенти, такі як розщеплені лінкери, продукти депротекції, наприклад, віддалені продукти захисної групи, такі як продукти бо захисних груп фосфору і продукти захисної групи підстави (наприклад, продукти захисної групи екзоцікліческіх амінів), реагенти для розщеплення і / або акцептори розщеплення і залишкові синтетичні реагенти , такі як мономери, димери, сполучні, захисні або деблокуючого реагенти.
І0067| У деяких варіантах реалізації винаходу способи забезпечують виборче осадження цільового полінуклеотида перед продуктами і агентами, які не є таргетними, які включають полінуклеотиди, що мають 6 нуклеозидних субодиниць або менш, 5-менш, 4 або менше, З-менш або 2 нуклеозидних субодиниці. У деяких випадках все продукти і агенти, які не є цільовими продуктами синтезу, які не є полінуклеотидами, залишаються розчинними на стадії селективного осадження відповідно до пропонованих способами і тому можуть бути легко видалені з отриманого осаду солі полінуклеотида.
Ї0068| Розглянуті способи можуть включати осадження і відділення цільового полінуклеотида від неочищеного синтетичного препарату з отриманням полінуклеотидної композиції, яка має кілька бажаних властивостей, таких як зменшена кількість нецільових продуктів і агентів синтезу (наприклад, синтетичні реагенти, реагенти розщеплення, поглиначі, віддалені захисні групи, побічні продукти розщеплення (лінкери, захисні групи і т.д.) їі дрібні полінуклеотидні фрагменти). 0069) У деяких варіантах реалізації винаходу запропоновані способи включають осадження полінуклеотида з неочищеного синтетичного препарату у вигляді солі полівалентного катіона перед хроматографічної очищенням. У деяких випадках ці методи є методами очищення цільового полінуклеотида. Осадження неочищеної полінуклеотидної композиції з використанням солі полівалентних катіонів викликає осадження солі полінуклеотида, що містить щонайменше один полівалентний катіонний протиіон. У деяких випадках осад солі полінуклеотида містить суміш моновалентних і полівалентних катіонних протиїонов, які утворюють пари іонів з
Поліаніонна полінуклеотидним скелетом. Використовувані тут терміни «сіль полівалентного катіона» і «полівалентна сіль», коли вони застосовують у відношенні полінуклеотида, взаємозамінні для позначення солі полінуклеотида, яка включає щонайменше один полівалентний катіонний протиїон, який є іонним сполуким з анионной внутресуб'єдінічной зв'язує групою полінуклеотидного скелета. У деяких випадках сіль полівалентного катіона полінуклеотида включає суміш одновалентних і полівалентних катіонів. У деяких варіантах реалізації винаходу полівалентний катіон може забезпечувати агрегацію цільового
Зо полінуклеотида шляхом іонного спарювання з аніонними групами міжсубодиничних зв'язків двох або більше полінуклеотидних скелетів. У деяких випадках двовалентний іон-катіон з двома різними полінуклеотидами утворює димер. У деяких випадках подальша агрегація полінуклеотидів може бути досягнута додатковими полівалентними взаємодіями, опосередкованими додатковими полівалентними катіонами. Як такі, в деяких випадках дані методи можуть забезпечувати селективну агрегацію і осадження цільових полінуклеотидів перед продуктами і агентами нецільового синтезу. 0070) У деяких варіантах реалізації способу щонайменше один полівалентний катіонний протиїбон є двовалентним. У деяких варіантах реалізації винаходу щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон вибраний з групи, що складається з магнію, цинку і кальцію. У деяких варіантах реалізації винаходу щонайменше один полівалентний катіонний протиїон є тривалентним. У деяких варіантах реалізації винаходу щонайменше один полівовалентний катіон є алюміній. У деяких варіантах реалізації винаходу полінуклеотидна сіль додатково включає в себе полівалентний катіонний протиіон. У таких випадках полінуклеотидна сіль являє собою змішану сіль, наприклад сіль, яка містить два або більше різних протівоіона катіона.
І00711| Будь-які зручні способи осадження полінуклеотида можуть знайти застосування в досліджуваних методах. Стадія контактування першої полінуклеотидної композиції з полівалентною катионною сіллю для осадження солі полінуклеотида, що містить щонайменше один полівалентний катіонний протиїон, може бути досягнута з використанням будь-яких зручних способів. Будь-які відповідні полівалентні катіони і їх солі (наприклад, як описано тут) можуть бути використані на стадії контактування для отримання осаду. У деяких випадках сіль полінуклеотида, що включає щонайменше один катіонний протиіон, утворюється в фазі розчину, наприклад, шляхом додавання полівалентної катионной солі до розчину, що включає полінуклеотид. Після додавання в розчин полівалентної катионной солі може утворюватися осад. У деяких випадках на іонообмінному носії може бути утворена сіль полінуклеотида, що включає щонайменше один катіонний протиіїон. Будь-які зручні іонообмінні носії можуть бути використані на стадії контактування. У деяких випадках іонообмінний носій є сильною катіонообменной смолою. У деяких варіантах здійснення способу стадія контактування включає елюювання першої полінуклеотидної композиції з катіонообменная носія, яка включає в себе полівалентні катіонні протівоїони. Використовуваний тут термін «катіонообменная носій» 60 відноситься до носія, який сам по собі є аніонним і здатний до іонного спаровування з катіонних аналітом, таким як представляє інтерес полівалентний катіон. Будь-який відповідний елюант може бути використаний на стадії елюювання з Катіонообменная носія. У деяких випадках осад утворюється в елюаті, після того як полінуклеотидна сіль елюіруются з Катіонообменная носія.
І0072| Запропоновані методи можуть бути проведені на будь-якому зручному неочищеному синтетичному препараті цільового синтетичного полінуклеотида. У деяких випадках перша полінуклеотидна композиція являє собою неочищений синтетичний препарат цільового синтетичного полінуклеотида. У деяких варіантах реалізації винаходу перша полінуклеотидна композиція являє собою композицію, яка є продуктом відщеплення цільового полінуклеотида від носія після синтезу. Таким чином, перша полінуклеотидна композиція може включати безліч продуктів і агентів нецільового синтезу. Запропоновані способи забезпечують селективне осадження солі полінуклеотида перед нецільовими продуктами і агентами синтезу, які залишаються в розчині і, отже, можуть бути легко видалені з отриманого осаду. 0073) Будь-які відповідні способи синтезу (наприклад, описані в даному документі) можуть бути використані для синтезу цільового полінуклеотида. Після синтезу цільової полінуклеотид відщеплюєтсья від носія, на якому виконується ступінчастий синтез. Після розщеплення цільовий полінуклеотид поної довжини може бути очищений для видалення небажаних синтетичних і розщеплюють реагентів і для видалення нецільових полінуклеотидних фрагментів і їх похідних. Дані методи, що включають осадження солі полінуклеотида, що містить щонайменше один полівалентний катіонний протиіон, і можуть бути виконані на будь-якій зручній стадії отримання цільового полінуклеотида, такого як постсінтез і до очищення за допомогою хроматографії з оберненою фазою.
І0074| В даному контексті терміни «неочищений синтетичний препарат», «неочищена композиція» та «неочищений полінуклеотид» відносяться до композиції, що містить синтетичні продукти синтезу полінуклеотидів в твердій фазі, які збираються після синтезу шляхом відщеплення від підкладки твердофазного синтезу, де композиція є неочищеної, т. е. хроматографічна очищення не проводилася. Хроматографічна очищення відноситься до будь- якого відповідного способу очищення, який включає абсорбцію цільового полінуклеотида на хроматографічної підкладці з подальшим елюювання цільового полінуклеотида від нецільових полінуклеотидів. У деяких випадках хроматографічна очищення мається на увазі
Зо хроматографію з оберненою фазою. 0075) У деяких варіантах реалізації винаходу спосіб додатково включає в себе отримання першої полінуклеотидної композиції, де композицію отримують шляхом постсинтезного відщеплення від твердофазной підкладки. Будь-які додаткові стадії, такі як стадії випаровування, розведення або концентрації, також можуть бути виконані на неочищеному синтетичному препараті до використання отриманої композиції в зазначених способах. У деяких випадках спосіб додатково включає синтез цільового полінуклеотида (наприклад, як описано в даному документі на твердофазной підкладці). У деяких варіантах реалізації винаходу спосіб додатково включає відщеплення полінуклеотида від носія для отримання першої полінуклеотидної композиції.
І0076| Твердий осад, що включає сіль полінуклеотида, може бути відділений від першої полінуклеотидної композиції, яка контактує з полівалентною сіллю (тобто з контактує першої полінуклеотидною композицією) з використанням будь-якого відповідного способу. Способи поділу включають, але не обмежуються ними, центрифугування, фільтрацію, декантування тощо.
І0077)| У деяких випадках відділення осаду, що включає сіль полінуклеотида, досягається центрифугуванням, коли застосування відцентрової сили на контактує першу полінуклеотидну композицію, наприклад, в центрифузі, викликає утворення осаду, наприклад, в нижній частині контейнера. Утворення осаду шляхом центрифугування можна назвати відкручуванням осаду. У деяких варіантах реалізації винаходу спосіб відрізняється тим, що етап поділу включає центрифугування пов'язаної першої полінуклеотидної композиції для осадження солі полінуклеотида. Супернатант декантирують з трубки без порушення цілісності осаду або відбирають з контейнера, наприклад, за допомогою піпетки Пастера. Процес центрифугування може бути повторений з розчином для промивання. 0078) У деяких випадках відділення осаду, що включає сіль полінуклеотида, досягається фільтрацією. У деяких варіантах реалізації етап поділу включає фільтрацію солі полінуклеотида від пов'язаного першого полінуклеотида. У розглянутих способах можуть бути використані будь- які відповідні фільтри і фільтраційні середовища. У деяких випадках поділ досягається шляхом глибинної фільтрації з використанням фільтруючого матеріалу, обраного відповідно до цільового полінуклеотида. бо 0079 У деяких варіантах реалізації спосіб включає: контактування першої полінуклеотидної композиції, що містить: полінуклеотид, що має послідовність з 7 або більш нуклеозидних субодиниць, де щонайменше дві з нуклеозидних субодиниць, з'єднані між собою суб'єдінічной
М3 '-- РЕ" тіофосфорамідатним зв'язком; нецільові продукти і реагенти синтезу; полівалентную катіонну сіль для осадження першої солі полінуклеотида, що містить щонайменше один полівалентний катіонний протиїіон; і відділення першої солі полінуклеотида від контактуючої першої полінуклеотидної композиції для отримання другої полінуклеотидної композиції, що містить першу сіль полінуклеотида.
І0О80| Відділення осаду від контактуючої першої полінуклеотидної композиції дає другу полінуклеотидну композицію, що включає першу сіль полінуклеотида. У деяких випадках селективне осадження першої солі полінуклеотида з використанням солі полівалентного катіона за допомогою даних методів дає другу полінуклеотидну композицію, яка включає в себе зменшену кількість продуктів і агентів нецільового синтезу.
І0081| Після вибіркового осадження цільові полінуклеотидні солі потім можуть бути перетворені в розчинну сіль полінуклеотида шляхом катіонного обміну, щонайменше, одного полівалентного катіонного протівоіона від полінуклеотида і заміни на інший, що цікавить катіон (наприклад, як описано в даному документі). Розглянуті способи забезпечують оборотне створення першої солі полінуклеотида, що містить щонайменше один полівалентий катіонний протиіїон. Використані в даному контексті терміни «оборотна формація» і «оборотний обмін» використовуються як взаємозамінні і відносяться до отримання солі полінуклеотида шляхом, наприклад, селективного осадження (наприклад, як описано в даному документі), де утворилася сіль також може бути потім дисоційована для заміни по меншій принаймні однієї солі полівалентного катіона. У деяких випадках солі полінуклеотидів, які нерозчинні в будь-якому розчиннику, можуть згадуватися як незворотні солі. У деяких варіантах реалізації спосіб включає в себе обмін щонайменше одного полівалентного катіонного протівоїона першої солі полінуклеотида з отриманням розчинної другої солі полінуклеотида, де обмін включає дисоціацію полівалентного катіонного протівоїона і з отриманням іонних пар з становлять інтерес катионом розчинної солі. У деяких випадках розчинна друга полінуклеотидна сіль являє собою одновалентну сіль. У деяких випадках розчинна друга полінуклеотидна сіль являє собою натрієву сіль. У деяких випадках розчинна друга полінуклеотидна сіль являє собою сіль тріетіламмонія. У деяких випадках перший і другий полінуклеотиди відрізняються один від одного, тобто включають різні катіонні протівоіїони. Дисоціація цільових полінуклеотидних солей і обмін щонайменше одного полівалентного катіонного протівоїбна може бути досягнута з використанням будь-яких відповідних способів. У деяких випадках дисоціація досягається з використанням хроматографії з оберненою фазою, наприклад, як описано в даному документі.
У деяких випадках ионообменная хроматографія може бути використана для дисоціації. У деяких варіантах здійснення дисоціація першої солі полінуклеотида досягається розчиненням солі в розчиннику, що включає представляє інтерес катіонний протиїіон.
І0082| Після поділу додаткові стадії очищення можуть бути виконані для другої полінуклеотидної композиції. У деяких варіантах реалізації зазначений спосіб додатково включає: контактування першої солі полінуклеотида з носієм хроматографії з оберненою фазою; і елюювання з хроматографічного носія третьої полінуклеотидної композиції, що містить полінуклеотид. У деяких варіантах здійснення третя полінуклеотидна композиція включає другу сіль полінуклеотида. Для очищення солі полінуклеотида можуть бути використані будь-які відповідні способи хроматографії з оберненою фазою. Методи хроматографії на зверненої фазі, яка представляє інтерес носії включають, але не обмежуються ними, хроматографическую очистку з використанням іонно-парної хроматографії з оберненою фазою, хроматографії з оберненою фазою С18 і ті способи і носії, які описані Спеп еї аї. доигпа! ої Спготайодгарву А,
МоЇште 1288, З Мау 2013, Радев 73-81; і гіттептапп еї аї., дхоигпа! ої Спготаїюдгарну А, Моїйте 1354, 8 Айдихі 2014 року, Раде5 43-55. У деяких варіантах реалізації друга полінуклеотидна композиція завантажується безпосередньо на носій хроматографії на зверненої фазі. Під завантаженням безпосередньо на носій мається на увазі, що друга полінуклеотидна композиція, отримана з використанням даного способу, додається безпосередньо, наприклад, у вигляді ізольованого твердого осаду, на носій хроматографії з оберненою фазою. У деяких випадках носій хроматографії на зверненої фазі являє собою смолу, налаштована як колонку, і полінуклеотидна композиція додається до верхньої частини шару смоли. У деяких варіантах здійснення спосіб додатково включає розчинення другої полінуклеотидної композиції в розчиннику. Можуть бути використані будь-які зручні розчинники, включаючи, але не обмежуючись ними, водні буфери, органічні розчинники, що змішуються з водою і їх суміші. У таких випадках розчин другої полінуклеотидної композиції можна контактувати з носієм бо хроматографії на зверненої фазі для абсорбування полінуклеотида до носія перед елюювання.
Дисоціація цільових полінуклеотидних солей і обмін щонайменше одного полівалентного катіонного протівоїона може бути досягнута з використанням будь-яких відповідних способів. У деяких випадках дисоціація досягається з використанням хроматографії з оберненою фазою, наприклад, як описано в даному документі. У деяких випадках ионообменная хроматографія може бути використана для дисоціації. У деяких варіантах здійснення дисоціація першої солі полінуклеотида досягається розчиненням солі в розчиннику, що включає представляє інтерес катіонний протиїіон. 0083) У деяких випадках контактування включає в себе зв'язування полінуклеотида на носії хроматографії на зверненої фазі і подальше елюювання полінуклеотида для забезпечення високої чистоти цільового полінуклеотида з відділенням від нецільового полінуклеотида і залишкових синтетичних агентів, які присутні в композиції. Елюат, що містить цільовий полінуклеотид, збирають. Будь-які відповідні елюанти можуть бути використані для елюювання полінуклеотида від носія хроматографії на зверненої фазі. Розчин для елюції може бути обраний відповідно до різними факторами, такими як характер хроматографічного носія, цільового олігонуклеотида, конкретних бажаних солей цільового полінуклеотида і т. д. У деяких випадках принаймні один полівалентний катіонний протиїон першої солі полінуклеотида піддають іонного обміну на носії хроматографії з оберненою фазою з іншим катіоновий протиїоном, що становлять інтерес, який включений в елюант. У таких випадках, коли полінуклеотид елюіруются з носія хроматографії з оберненою фазою, він знаходиться в іншій формі солі (тобто другий солі полінуклеотида), ніж тоді, коли він був завантажений, оскільки щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон був замінений полінуклеотидом. У деяких випадках сольова форма полінуклеотида, яка елююється із носія в третій полінуклеотидній композиції, є більш водорозчинною, ніж перша полінуклеотидна сіль, що включає щонайменше один полівалентний катіонний протиїіон.
І0084| У деяких варіантах реалізації третя полінуклеотидна композиція включає в себе другу сіль полінуклеотида, яка є фармацевтично прийнятною сіллю полінуклеотида. У деяких випадках третя композиція включає в себе другу сіль полінуклеотида, яка є одновалентной катионной сіллю полінуклеотида. У деяких випадках третя композиція включає другу сіль полінуклеотида, яка представляє собою тріетіламмоніевую сіль полінуклеотида. У деяких
Зо випадках третя композиція включає другу сіль полінуклеотида, яка є натрієвої сіллю полінуклеотида. Слід розуміти, що після того, як полінуклеотид очищають за допомогою хроматографії з оберненою фазою, будь-яку кількість додаткових стадій катіонного обміну може бути виконано на солі полінуклеотида для отримання бажаної форми солі полінуклеотида. У деяких варіантах реалізації спосіб додатково включає іонообмінні катіонні протівоіїони з другої солі полінуклеотида для отримання третьої солі полінуклеотида. У деяких варіантах здійснення третя полінуклеотидна сіль являє собою фармацевтично прийнятні сіль полінуклеотида. У деяких випадках третя полінуклеотидна сіль являє собою одновалентних катіонів сіль полінуклеотида. У деяких випадках третя полінуклеотидна сіль являє собою натрієву сіль полінуклеотида (наприклад, як описано в даному документі).
Ї0085| У деяких випадках перша композиція включає одновалентну катіонну сіль полінуклеотида. У деяких випадках одновалентна катіонна сіль вибирається з групи, що складається з натрію, амонію і алкіламмонія. У деяких випадках алкіламмоній вибирають з групи, що складається з діметіламмонія, метіламмонія, етіламмонія і тріетіламмонія. У деяких випадках перша композиція включає амонійну сіль полінуклеотида. У деяких випадках перша композиція включає алкіламмоніеєвую сіль полінуклеотида. У деяких випадках перша композиція включає тріетіламмоніевую сіль полінуклеотида. У деяких випадках перша композиція включає натрієву сіль полінуклеотида. Першу полінуклеотидную композицію може бути приведена в контакт з сіллю полівалентного катіона для осадження першої солі полінуклеотида, що містить щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон. У деяких варіантах реалізації контактує перша полінуклеотидна композиція включає першу сіль полінуклеотида, що включає щонайменше один полівалентний катіонний протиїіон. 0086) Розглянуті в рамках даного винаходу варіанти реалізації будь-якого з вищезазначених варіантів способу охоплені, в разі, якщо полінуклеотид є таким, як описано в даному документі.
СПОСОБИ СИНТЕЗУ
00871 Будь-які відповідні способи, стратегії і хімічні методи синтезу полінуклеотидів можуть бути використані для отримання неочищених синтетичних полінуклеотидних композицій, які можуть знайти застосування в зазначених способах отримання. Методи і способи синтезу полінуклеотидів, які можуть бути адаптовані для використання в досліджуваних способах, включають, але не обмежуються ними, фосфорамідіт, Н-фосфонати, фосфодіефір, бо фосфотріссер, ФОСФО-триефірів. полінуклеотидні компоненти з'єднань винаходу можуть бути синтезовані шляхом адаптації будь-яких звичайних протоколів для обраного хімічного складу.
Способи, що становлять інтерес для синтезу олігонуклеотидов, що містять хімічні сполуки
М3 -- РУ" тіофосфорамідатов, включають, але не обмежуються ними, способи описані в 0.5. 5,824,793, МеСигау еї а!., (1997) Теманеагоп І ейегв, 38: 207-210; Ропдгас 5 Стуапом, (1999)
Тегапеагоп І ебег5, 49: 7661-7664; 005 6,835,826, 05 7,494,982, 05 7,485,717 105 5,684,143.
ІЇ0088| У деяких випадках представляючий інтерес полінуклеотид синтезується за допомогою послідовних приєднань, починаючи з 5'-кінця і продовжуючи до 3'-кінця цільової полінуклеотидної послідовності. У деяких випадках представляє інтерес полінуклеотид синтезують за допомогою послідовних приєднань, починаючи з 3'-кінця, і переходить до 5'-кінця цільової полінуклеотидної послідовності. У деяких варіантах реалізації полінуклеотид синтезують за допомогою послідовних приєднань мономерних фосфорамідітов до подовжує кінця полінуклеотида. 5'-кінцева Нуклеозидні субодиниці можуть бути приєднані до будь-якої зручної твердої основи за допомогою необов'язковою зв'язує групи або 5'-кінцевий групи. Після приєднання першої субодиниці до твердої підкладці з вказаною субодиниці може бути знята захист з отриманням вільної, імобілизованої 3'-кінцевої групи. Потім зв'язування субодиниці зі зростаючим олігонуклеотидним ланцюгом може бути досягнуто. У деяких випадках спосіб включає в себе зв'язування 3'-кінцевий групи з мономером 3'-захищеним-нуклеотидом-5'- фосфорамідіт. У деяких варіантах реалізації З3'-кінцева група є 3-гідроксильною групою.
У деяких варіантах реалізації 3'-кінцева група є 3'-аміногрупою. 00891 У деяких випадках спосіб синтезу полінуклеотидів включає стадії: (а) зняття захисту з захищеної 3'-аміногрупи кінцевого нуклеозида, приєднаного до твердофазной підкладці, вказане зняття захисту призводить до утворення вільної 3'-аміногрупи; (б) приведення в контакт вільної
З'-аміногрупи з мономером 3-захищений амінонуклеозід-5'і-фосфорамідіт в присутності нуклеофільного каталізатора з утворенням межнуклеозідного МЗ "- РБ' фосфорамідітного зв'язку; і (с) окислення зв'язку для отримання М3З'-- РО" тіофосфоромідатного зв'язку. У деяких варіантах здійснення спосіб включає (4) повторення етапів (а) - (с) до тих пір, до тих поки не синтезується полінуклеотид.
ІЇ0090| У деяких випадках цей спосіб включає зв'язування 3'-кінцевий групи з носієм з 3-захищеним дінуклеотід-5'-фосфорамідітним димером. Способи синтезу, що становлять інтерес, полінуклеотидів включають, але не обмежуються ними, ті методи твердофазного синтезу, які включають щонайменше одне сполуки дінуклеотідних димера, як описано в публікації РОСТ Мо. УМО2015 / 168310, заявка просить пріоритет відповідно до попередньої заявки на патент США серійний Мо 61 / 987,396. Цільова полінуклеотидна послідовність може бути синтезована за допомогою ретро-синтетичної стратегії, яка включає послідовні зв'язки як димеризованих, так і мономерних субодиниць з 3'-кінцевий групою зростаючої олігонуклеодного ланцюга. У деяких варіантах здійснення полінуклеотид синтезують з використанням способу, що включає щонайменше одне сполуки дінуклеотідних димера з вільною 3'-кінцевий групою зростаючого полінуклеотидного ланцюга. 0091 У деяких випадках спосіб синтезу полінуклеотидів включає стадії: (а) зняття захисту з захищеної 3'-аміногрупи кінцевого нуклеозида, приєднаного до твердофазной підкладці, вказане зняття захисту призводить до утворення вільної 3'-аміногрупи; (В) контактування вільної 3'- аміногрупи з 3'-захищеним амінодінуклеотідом тіофосфорамідатом або фосфорамідіт-5'- фосфорамідітним димером в присутності нуклеофільного каталізатора з утворенням межнуклеозідной МЗ "- Р" фосфорамідитного зв'язку; і (с) окислення зв'язку для отримання
М3 -- РУ" тіофосфоромідатной зв'язку. У деяких варіантах здійснення спосіб включає в себе (а) повторення стадій (а) - (с) до тих пір, поки не буде синтезований полінуклеотид, причому на стадії (б) 3-захищений димер амінодінуклеотіда тіофосфорамідат-5'і-фосфорамідіт або 3"- захищений мононуклеотид-5'-фосфорамідіт можуть бути використані.
Ї0092| У розглянутих способах можуть бути використані будь-які відповідні стратегії застосування захисних груп для захисту основ, фосфорамідіта, фосфорамідата, 5", 2" й/або
З груп полінуклеотида. Захисні групи, що становлять інтерес, включають, але не обмежуються ними, захисні групи, описані в публікації ОпКибо еї аї., Ого. Гейн., 2010 12 (11), рр 2496-2499; і
Веасисаде і Іуег, Теїгапеагоп 48: 2223-2311 (1992). 0093) У цьому контексті термін "фосфатная захисна група" відноситься до захисної групи, яка може бути приєднана до фосфоровмісних міжсубодиничного зв'язку олігонуклеотида. При її наявності, фосфатна захисна група може перешкоджати (тобто блокувати) взаємодії фосфоровмісних зв'язків в тому положенні, в якому приєднана фосфатная захисна група.
Розглядаються фосфатними захисними групами можуть бути захищені будь-які відповідні фосфорсодержащие міжсубодиничні зв'язки (наприклад, зв'язки Р (ІІ) і Р (М)), включаючи, але бо не обмежуючись ними, фосфорамідітні, оксофосфорамідатні, тіофосфорамідатні, фосфатні складноефірні, тіофосфатні складноефірні, фосфодіефірні зв'язки і т яп. Фосфатна захисна група може бути приєднана до доступного атому кисню фосфоровмісних міжсубодиничного зв'язку. Як фосфатной захисної групи можуть бути використані будь-які захисні групи. У деяких варіантах реалізації фосфатная захисна група являє собою метил або р-ціаноеєтіл.
ІЇ0094| У деяких випадках 3'-кінцева група зростаючого ланцюга полінуклеотида може включати 3'-гідроксил, 3'-аміногрупу або їх захищені версії. Під час синтезу олігонуклеотида в 3'- кінцевий групі можуть бути використані будь-які відповідні гідроксильні та / або амінозахисні групи. У деяких варіантах реалізації 3'-кінцева група є захищену 3'-аміногрупу, і вказаний спосіб включає зняття захисту або видалення захисної групи з отриманням вільної 3'-аміногрупи.
В даному контексті термін "вільна аміногрупа" щодо мономерів і димерів означає аміногрупу, здатну взаємодіяти з фосфорамідітной групою надходить мономера або димеру. У деяких варіантах реалізації вільна аміногрупа є первинний амін. Після стадії зняття захисту (наприклад, детрітілірованія) аміногруппа може бути в формі солі (наприклад, солі сполученого підстави кислоти, використаної для детрітілірованія). Зазначена сіль може бути необов'язково нейтралізована основним розчином, таким як 2 95 триетиламін або піридин в ацетонітрилі, після стадії детрітілірованія.
Ї0095| 3-захист надходячих субодиничних фосфорамідатів перешкоджає небажаній полімеризації ланцюга. У деяких варіантах реалізації З'-кінцева група є захищену 3- гідроксильну групу, і вказаний спосіб включає зняття захисту або видалення захисної групи з отриманням вільної 3'-гідроксильної групи. У деяких варіантах реалізації 3'-кінцева група є захищену 3'-аміногрупу, і вказаний спосіб включає зняття захисту або видалення захисної групи з отриманням вільної 3'-аміногрупи. Захищена 3'-аміно або 3-гідроксильна група може бути захищена трітільной захисної групою. У деяких варіантах реалізації трітільная захисна група являє собою трифенілметил (Тг або Тті, РезбС-). У деяких варіантах реалізації трітільная захисна група являє собою 4,4'-діметоксітрітіл (ОМТ). Зняття захисту з 3'-кінцевий аміно або гідроксильної групи може бути здійснено за допомогою будь-яких відповідних способів.
Способи, що становлять інтерес, включають, але не обмежуються ними, способи, описані в публікації Веаисаде і Іуег, Теігапедгоп 48: 2223-2311 (1992). У деяких випадках зняття захисту з захищеної 3'-аміногрупи кінцевого нуклеозида включає детрітілірованіє з отриманням вільної 3'-
Зо кінцевий групи, наприклад, що каталізує кислотою детрітілірованіє. У деяких випадках, димерні або мономерні суб'єдінічні фосфорамідіти містять захищену 3'-гідроксильну або 3'-аміногрупу, яка є такою ж, як 3'-кінцева група кінцевого нуклеозида, приєднаного до твердої підкладці.
І0096| У розглянутих способах синтезу полінуклеотидів можуть бути використані будь-які відповідні твердофазні підкладки. Розглянуті тверді підкладки включають, але не обмежуються ними, мікрочастинки, отримані зі скла з контрольованим розміром пір (СРС), полістиролу з високим ступенем поперечної зшивки (наприклад, МШОРІазе НІ 400 або СЕ Ргітег 350), акрилових сополімерів, целюлози, нейлону, декстрану, латексу, поліакролеїна і т.п., такі як описані в наступних ілюстративних посиланнях: (Меїй. Епгутої., Зесіоп А, радевз 11-147, моІ.44 (Асадетіс Ргез55, Мем МогК, 1976); 0.5. Раї. Мо5. 4,678,814; 4,413,070; і 4,046; 720; і Роп, Спаріег 19, іп Адгамаї, едіюг, Меїнод5 іп МоїІесшіаг Віоіоду, Мої!.20, (Нитапа Ргез5, Тоїоуа, М.., 1993)).
Додаткові підкладки, що становлять інтерес, включають полістирольні гранули; полістирол, щеплений полієтиленгліколем (наприклад, ТепіасСе! "м, Карр РоїЇутеге, Тюбінген, Німеччина); і т.п. Вибір характеристик підкладки, таких як матеріал, пористість, розмір пір, форма і т.п., і типу використовуваного зв'язує фрагмента залежить від безлічі факторів, таких як використовувані захисні групи, довжина кінцевого продукту, кількість кінцевого продукту і т.п. Ілюстративні зв'язують фрагменти описані в Роп еї аї., Віотесппідцев5, 6: 768-775 (1988); МеБр, 0.5. Раї. Мо. 4,659,774; Вагапу еї аї., Іпіегтаїйопаї раїепі арріїсайоп РСТ / 0591 / 06103; Вгоул вї аї., У. Спет.
Зос. боттип., 1989: 891-893; Сатнпа еї аї., Мисієїс Асід5 Незеагси, 18: 3813-3821 (1990); Веаціе еї аї., Сіїпіса! Спетівігу, 39: 719-722 (1993); МазКов апа бБошнет, Мисієїс Асіаз Везвагси, 20: 1679-1684 (1992); і т.п.
І0097| У деяких варіантах реалізації тверді підкладки, які знаходять застосування в розглянутих способах, включають СРО і полістирол, щеплений поліетиленгліколем і має кінцеву аміногрупу (наприклад, ТепіасеІ-МНо "М, Карр Роїутеге, Тюбінген, Німеччина). Амінопропільная група може бути використана в якості вставки між СРО і Нуклеозидні зв'язком. У деяких випадках зв'язок з 5'-гідроксилом першого нуклеозида є сукцінільную групу, яка забезпечує рухому в основних умовах складноефірний зв'язок, яка може бути розщеплена після синтезу за допомогою водного аміаку.
І0098| Після зняття захисту пов'язаний з підкладкою нуклеозид може взаємодіяти з димерним або мономірним субодиничним фосфорамідатом з утворенням межнуклеозидного 60 зв'язку. Слід розуміти, що пов'язаний з підкладкою нуклеозид може відноситися до одного залишку, приєднаному до твердій основі, або може відноситися до кінцевого залишку олігонуклеотидного ланцюга, приєднаного до підкладки. У розглянутих способах можуть бути використані будь-які відповідні хімічні прийоми зв'язування, що зв'язують реагенти і способи.
Будь-який відповідний підбір умов зв'язування, захисних груп, твердофазних підкладок, що зв'язують груп, реагентів для зняття захисту, реагентів для відщеплення продуктів від твердофазних підкладок, очищення продукту і т.п., в контексті розглянутих способів відповідно до сСаї, ейайог, ОІїдописіеоїіде Зупіпебзів: А Ргасіїса! Арргоасі (ІКГ. Ргез5, Охіога, 1984); Атагпаїн апа Вгоот, Спетіса! Неміємув, Мої. 77, рд5. 183-217 (1977); Роп еї а!., Віотесппіднев, Мої. 6, розв. 768-775 (1988); ОпізикКа еї аї., Мисієїс Асідх Везеагсі, Мої. 10, рд5. 6553-6570 (1982); ЕскКвівїп, едіюг Оїіїдописієоїіде5, апа Апаіодпев: А Ргасіїса! Арргоасі (ІВІ. Ргез55, Охіога, 1991), Стеєпе апа
Муців "Ргоїесіїме сгоирз іп Огдапіс 5упіпезів", Тпіга еайіоп, УМіеу, Мем Могк 1999 року, Магапод, еайог, зупіпезі5 апа Арріїсайоп5 ої ДНК апа РНК (Асадетіс Ргез55, Мем/ ХогК, 1987), Веаисаде апа Іуег, Темганеєдгоп 48: 2223-2311 (1992), і подібних посиланнях.
Ї0099| Після зв'язування 3'-аміногрупи зв'язаного з підложкою зростаючого ланцюга полінуклеотида, які не прореагували, можуть бути необов'язково кеповані відповідним керуючим агентом до проведення наступної стадії зняття захисту (напр., стадії детритилювання) для забезпечення їхньої інертності на наступних стадіях зв'язування. Вказана стадія кепування може покращити ВЕРХ-профиль такого отримання для полегшення очистки, а також може покращувати загальний вихід продукту. Кепуючі реагенти, які підходять для способів, що розглядаються, включають електрофільні реагенти, такі як оцтовий ангідрид та ізомасляний ангідрид, хлорангідриди кислот, такі як адамантилкарбонілхлорид, пивалоїлхлорид і т.ї., ізотіоціанати, хлорформіати тощо. Також підходять фосфорамідати в поєднанні з активатором і з наступним окисленням, а також Н-фосфонатні солі, такі як ізопропіл-Н-фосфонат триетиламмонію, що використовуються в поєднанні з хлорангідридом кислоти, таким як пивалоїлхлорид або адамантилкарбонілхлорид. 00100) У деяких варіантах реалізації спосіб включає окислення межнуклеозидного М3'-- Ро" фосфорамідатного зв'язку. В даному контексті терміни "окисляти", "окислення", "окислювальний" і т.л. щодо фосфоровмісних межнуклеозідной зв'язку означають процес або обробку для перетворення атома фосфору, що знаходиться у зазначеній зв'язку, з форми
Зо фосфору (ІП) в форму фосфору (М). Окислення межнуклеозідних зв'язків може бути здійснено в будь-який відповідний момент синтезу, із застосуванням будь-яких відповідних способів.
У деяких варіантах реалізації окислення проводять поетапно, наприклад, під час кожного циклу зв'язування. В інших варіантах реалізації окислення декількох межнуклеозідних зв'язків проводять в кінці синтезу. У деяких випадках окислення М3З - РБ5' фосфорамідітной зв'язку (наприклад, із застосуванням окисного агента на основі йоду / вод) призводить до отримання оксофосфорамідатной зв'язку. В інших випадках окислення МЗ3'-- Р5' фосфорамідитного зв'язку включає сульфування з отриманням тіофосфорамідатного зв'язку. Сульфіруванння може бути здійснено будь-якими відповідними способами. Розглянуті способи сульфирования включають способи, описані в публікації сгуа7опом еї аї.,, В УМО 2001018015 ї 05 6,114,519. Сульфируют агенти становлять інтерес включають, але не обмежуються ними, елементарну сірку, тіурамдісульфіди, такі як тетраєетілтіурамдісульфід, ацілдісульфіди, такі як фенацілдісульфід, фосфінотіоілдісульфіди, такі як 5-Тейа "мМ, ї 1,1-діоксо-3ЗІН-1,2-бензодітіол- З-он. У деяких варіантах здійснення сульфурація може бути здійснена з використанням фенілацетілдісульфіда в 2,6-лутідіні. У деяких варіантах реалізації сульфування може бути проведено із застосуванням реагенту бокаж, по способам, описаним Іуег еї аї!., У. Огдапіс Спетівігу 55: 4693-4699, 1990.
І00101| Відщеплення полінуклеотида від носія для твердофазного синтезу може бути досягнуто з використанням будь-яких відповідних способів і реагентів, які можуть бути обрані в залежності від безлічі факторів, таких як природа носія, химер лінкера і стратегія захисної групи, яка використовується під час синтезу. Вибір, зроблені в синтезі і розщепленні цільового полінуклеотида, можуть визначати природу продуктів і агентів нецільового синтезу, присутніх в першій полінуклеотидній композиції.
І00102| У деяких варіантах здійснення перед розщепленням захисні групи фосфору полінуклеотида видаляють, щоб уникнути утворення будь-яких потенційних небажаних аддуктов розщепленої захисної групи (наприклад, В-ціаноетілзащітной групи) з полінуклеотидом.
Способи, що становлять інтерес, які можуть бути адаптовані для використання в депротектірующіх і матеріалів, що розщеплюються полінуклеотидах, включають в себе ті, які описані в патенті О5 7,199,236. У деяких варіантах здійснення полінуклеотид отщепляется від носія з використанням розчину аміаку для видалення будь-яких захисних груп підстави (наприклад, екзоцікліческіх амінозащітних груп) і будь-яких залишилися захисних груп фосфору. бо Будь-які відповідні умови можуть бути використані в реакції полінуклеотидного розщеплення. У деяких випадках розщеплення проводять при температурі в діапазоні 40-60" С. У деяких випадках розщеплення виконується протягом тривалого періоду часу, такому як 12-24 години.
Після розщеплення полінуклеотида підкладку можна видалити фільтрацією і промити. Об'єднані фільтрати і розчини для полоскання, які тепер містять синтетичний препарат полінуклеотида, можуть бути використані в досліджуваних способах приготування перед переходом до подальших етапах очистки. У деяких випадках очищення розчину полінуклеотида включає препаративну звернену високоефективну рідинну хроматографію (КР-НРІ С), наприклад, з використанням Кготазії С18 при 45-55"С. У деяких випадках полінуклеотидні композиції досліджуваних способів можуть піддаватися будь-якій кількості відповідних етапів знесолення і концентрування, наприклад, з використанням апарату Тапдепіа! Біом/ Рійгайоп (ТЕР), забезпеченого мембранами з поліефірсульфона з розміром відсічення діаметра пор 1000 Да.
ПОЛІНУКЛЕОТИДНІ КОМПОЗИЦІЇ
Ї00103)| Аспекти даного опису включають композиції полінуклеотидних солей, в тому числі полівалентні катіонні протівоїбни. У деяких варіантах реалізації композиція містить: сіль полінуклеотида, що включає, щонайменше, один полівалентний катіонний протиіон, де полінуклеотид має послідовність з 7 або більш нуклеозидних субодиниць і щонайменше дві з нуклеозидних субодиниць з'єднані за допомогою суб'єдінічной МЗ - Р5б'-тіофосфорамідатной зв'язком. У деяких варіантах реалізації полінуклеотид має послідовність з 7 або більш нуклеозидних субодиниць, комплементарних РНК компоненту людської теломерази.
І00104| Полівалентні катіонні протівоіїони 00105) Будь-які відповідні полівалентні катіони можуть знайти застосування в якості протівоїбона в цільових полінуклеотидних солях. Як такий, полівалентний катіон може утворювати іонну пару з анионной частиною полінуклеотидного ланцюга в цільових полінуклеотидних композиціях. полінуклеотиди можуть включати нуклеозидні субодиниці, пов'язані фосфорвмісними міжсубодиничнимі зв'язками (наприклад, зв'язку Р (М)), такі як фосфорамідітні, тіофосфорамідатні, фосфатні складноефірні, фосфодіефірні зв'язку і т.п. Слід розуміти, що міжсубодиничні зв'язки полінуклеотида можуть бути негативно заряджені (наприклад, у водному розчині) і іон знаходиться в парі з катіонних протиїоном. Такі міжсубодиничні зв'язки можна назвати аніонними групами полінуклеотидного ланцюга.
Зо 00106) Використовуваний в цьому контексті термін «полівалентний катіон» відноситься до катиону, здатному утворювати кілька іонних пар, наприклад багатозарядний катіон, такий як двічі або тричі заряджений катіон. Будь-які зручні полівалентні катіони можуть знайти застосування в композиціях полінуклеотидних солей. У деяких варіантах здійснення полівалентний іон-катіон з'єднується з двома або більше суміжними аніонними групами полінуклеотидного скелета. У деяких варіантах реалізації полівалентний іон катіона з'єднується з однією анионной групою полінуклеотидного скелета. У деяких варіантах реалізації винаходу один полівалентний катіонний протиїон є тривалентним. Двовалентні катіонні протівоїони, що становлять інтерес, включають, але не обмежуються ними, магній, цинк і кальцій. У деяких варіантах реалізації винаходу полівалентний катіонний протиіїон є тривалентним. Тривалентні катіонні протіводни включають, але не обмежуються ними, алюміній. У деяких варіантах реалізації композиції щонайменше один полівалентний катіонний протиіон вибраний з групи, що складається з магнію, цинку, алюмінію і кальцію. У деяких варіантах здійснення композиції щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон є магній. У деяких варіантах здійснення композиції щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон є цинк. У деяких варіантах здійснення композиції щонайменше один полівалентний катіонний протиіон є алюміній. У деяких варіантах здійснення композиції щонайменше один полівалентний катіонний протиіон є кальцій.
І00107| Слід розуміти, що кількість катіоннних протиїіонів, які присутні в солі полінуклеотида, залежить від безлічі факторів, таких як довжина Поліаніонна скелета, валентність катіонів в солях, рН розчину, агрегація полінуклеотидів в композиції і т. Д. Зазначені композиції можуть включати щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон Поліаніонна полінуклеотидного скелета в цільових полінуклеотидних композиціях, таких як 2 або більше, З або більше, 4 або більше, 5 або більше, 6 або більше, 7 або більше, 8 або більше, 9 або більше, 10 мул і більше, 15 або більше, 20 або більше, 30 або більше, 40 або більше, 50 або більше, 100 або більше або навіть більше полівалентних катіонних протиіонов. У деяких варіантах здійснення полінуклеотид, що має п нуклеозидних субодиниць, може включати між 1 і (п-1) / 2 (якщо п - непарне ціле число) двовалентний катіонний протиіон (ів) або від 1 до (п-2) / 2 (якщо п являє собою парне ціле) двовалентних катіонних протиіонов. У деяких випадках полінуклеотидна сіль, яка включає щонайменше один полівалентний катіон, може додатково включати безліч інших катіонах протиіїонов, які можуть бути одновалентними, двовалентними або тривалентними. У 60 деяких випадках п знаходиться в діапазоні від 7 до 50, наприклад від 7 до 40, від 10 до 40, від
10 до 30, від 10 до 25, від 10 до 20 або від 12 до 15 нуклеозидних субодиниць. 00108) У деяких варіантах реалізації композиції полінуклеотидна сіль може включати З мол.Уо Або більше полівалентного катіонного протівоїбна щодо поліаніонній основи полінуклеотидів (тобто щодо теоретичного максимальної кількості катіонних протиіїонов до
Поліаніонна скелету), таких як 4 мол. 95 Або більше, 5 мол.9Уо Або більше, 6 мол. 95 або більше, 7 мол. 95 або більше, 8 мол. 95 або більше, 9 мол. 96 або більше, 10 мол. 95 або більше, 11 мол. 95 або більше, 12 мол. 95 або більше , 13 мол. 95 або більше, 14 мол. 95 або більше, 15 мол. 95 або більше, 16 мол. 95 або більше, 17 мол. 95 або болше, 18 мол. 95 або більше, 19 мол. 95 або більше, 20 мол. 95 або більше, 25 мол. 95 або більше, 30 мол. 95 або більше,
З5 мол 95 або більше, 40 мол. 95 або більше, 45 мол. 95 або більше, 50 мол. 95 або більше, 55 мол. У5 або більше, 60 мол. 95 або більше, або навіть більше, полівалентного катіонного протівоїбна щодо Поліаніонна скелета полінуклеотида. У деяких варіантах реалізації зазначених композицій полінуклеотид може включати 10 мол. 95 Або більше полівалентного катіонного протівоїона щодо Поліаніонна скелета полінуклеотида. Наприклад, полінуклеотидна сіль, яка включає в себе поліаніонний скелет, що складається з 10 межнуклеотидних субодиничних зв'язків, і включає один двовалентний катіонний протиіон, з'єднаний з двома зв'язками, описується як включає 20 мол. 95 Двовалентного катіонного протівоїона. Якщо один двовалентний катіонний протиїон, з'єднаний тільки з одним зв'язком замість двох, то полінуклеотидна сіль описується як включає 10 мол. 95 Двовалентного катіонного протівоіона.
Таким чином, значення мол.9о Відноситься до рівня заповнення Поліаніонна полінуклеотидного скелета полівалентними катіонними протиїонами, які присутні в солі полінуклеотида.
Наприклад, один катіон Ма в 13-членной солі полінуклеотида з 12 межнуклеотидними зв'язками має 16,7 мол.9о Основного ланцюга. Слід розуміти, що в деяких варіантах реалізації полінуклеотидна сіль може включати додаткові сайти іонного сполуки на кінцевих частинах полінуклеотида (наприклад, 5'-тіофосфатную групу), і, якщо вони присутні, такі сайти повинні бути включені в значення мол.9о сполуки. 00109) У деяких варіантах реалізації композиції полінуклеотидна сіль включає 90 мол. Фо або менше протівовалентного катіона щодо поліаніонного скелета полінуклеотида, такого як 70 мол.95 або менше, 65 мол. 95 або менше, 60 мол. 95 Або менше, 50 мол. 95 або менше , або навіть менше, від полівалентного катіонного протівоіона. 00110) У деяких варіантах реалізації композиції полінуклеотидна сіль включає від З до 90 мол.9Уо полівалентного катіонного протівоїона щодо поліаніонна скелета полінуклеотида, такого як від З до 65 мол.9о (Наприклад, від б до 50 мол. 95, Від 10 до 50 мол. 95 або від 10 до 40 мол. 95), від З до 50 мол. 905, від З до 40 мол. 90, від З до 30 мол. 90, від З до 20 мол. 95 або від
З до 15 мол. 95 полівалентного катіонного протівоїона по відношенню до Поліаніонна основному полінуклеотиду. 00111) У деяких випадках композиції полінуклеотидна сіль включає від З до 60 мол.Зо
Двовалентного катіонного протівоїона щодо Поліаніонна скелета полінуклеотида, такого як від З до 50 мол. 95 (Наприклад, від 5 до 50 мол.9бо), Від З до 40 мол. 95, від З до 30 мол. 905, від З до 20 мол. 95, від З до 15 мол. 95, наприклад від З до 12 мол. 956 двовалентного катіонного протівоіона. 00112) У деяких випадках композиції полінуклеотидна сіль включає від З до 60 мол. бо катіонного протівоїона магнію щодо Поліаніонна скелета полінуклеотида, такого як 5-50 мол.Оо, 5-40 мол.9о, 10-40 мол. 95 Або 20-40 мол. 95 катіонного протівоіїона магнію.
ЇО0О113) У деяких випадках композиції полінуклеотидна сіль включає в себе 10 до 70 мол. 95
Трівалентного катіонного протівоїона щодо Поліаніонна скелета полінуклеотида, такого як від 10 до 60 мол. 95, Від 20 до 60 мол.95, Від 20 до 50 мол.95 Або від 30 до 50 мол. трівалентного катіонного протівоіона. У деяких варіантах здійснення композиції полінуклеотидна сіль містить 0,595 або більше по масі полівалентного катіонного протівоїона (наприклад, магнію), такого як 0,6 95 або більше, 0,7 95 або більше, 0,8 95 або більше, 0,9 95 або більше,
БО 1,1 95 або більше, 1,2 95 або більше, 1,3 95 або більше, 1,4 95 або більше, 1,5 95 або більше, 1,6 95 або більше, 1,7 95 або більше, 1,8 95 або більше, 1,9 95 або більше, 2,0 95 або більше, 2,1 5 або більше, 2,2 95 або більше, 2,3 95 або більше 2,4 95 або більше, 2,5 95 або більше, 2,6 95 або більше, 2,7 95 або більше, 2,8 95 або більше, 2,9 95 або більше, 3,095 або більше по масі полівалентного катіонного протівоіона. 00114) полінуклеотидна сіль являє собою змішану сіль, яка включає суміш полівалентних і одновалентних катіонних протиіїонов. У деяких варіантах реалізації композиції полінуклеотидна сіль має співвідношення полівалентного катіонного протівоїона до моновалентному катионному протівоїони, щонайменше, 0,05 або більше по молярности, наприклад 0,10 або більше, 0,15 або більше, 0,20 або більше, 0, 25 або більше, 0,30 або більше 0,35 або більше, 0,40 або більше, 60 0,45 або більше, 0,50 або більше, 0,55 або більше, 0,60 або більше , 0,65 або більше, 0,70 або більше по молярности або навіть більше полівалентного катіонного протівоїона до моновалентного катионного протівоіона.
ЇОО115| У деяких випадках полінуклеотидна сіль включає має співвідношення полівалентного до моновалентному катіонному протівоїону 1:12 по молярности. У деяких випадках полінуклеотидна сіль включає має співвідношення полівалентного до моновалентному катионному протівоіїони 1:11 по молярности. У деяких випадках полінуклеотидна сіль включає має співвідношення полівалентного до моновалентному катионному протівоїони 1:10 по молярности. У деяких випадках полінуклеотидна сіль включає має співвідношення полівалентного до моновалентному катионному протівоїбни 1: 9 по молярности. У деяких випадках полінуклеотидна сіль включає має співвідношення полівалентного до моновалентному катионному протівоіїони 1: 8 по молярности. У деяких випадках полінуклеотидна сіль включає має співвідношення полівалентного до моновалентному катионному протівоїони 1: 7 по молярности. У деяких випадках полінуклеотидна сіль включає має співвідношення полівалентного до моновалентному катионному протівоїони 1: б по молярности. У деяких випадках полінуклеотидна сіль включає має співвідношення полівалентного до моновалентному катионному протівоїони 1: 5 по молярности. У деяких випадках полінуклеотидна сіль включає має співвідношення полівалентного до моновалентному катионному протівоїбни 1: 4 по молярности. У деяких випадках полінуклеотидна сіль включає має співвідношення полівалентного до моновалентному катионному протівоїбни 2: 9 по молярности. У деяких випадках полінуклеотидна сіль включає має співвідношення полівалентного до моновалентному катионному протівоіїони 3: 7 по молярности. У деяких випадках полінуклеотидна сіль включає має співвідношення полівалентного до моновалентному катионному протівоїони 4: 5 по молярности. У деяких випадках полінуклеотидна сіль включає має співвідношення полівалентного до моновалентному катионному протівоіони 5: З по молярности. 00116) У деяких випадках в складі змішаної солі полінуклеотида полівалентний катіонний протиїон є магній, а одновалентних катіонний протиіїон - натрій. У деяких випадках в складі змішаної солі полінуклеотида полівалентний катіонний протиіїон є магній і одновалентних катіонний протиїон - амоній. У деяких випадках в складі змішаної солі полінуклеотида полівалентний катіонний протиїон є магній, а одновалентних катіонний протиїон є тріетіламмоній. У деяких випадках в складі змішаної солі полінуклеотида полівалентний катіонний протиїон є алюміній. У деяких випадках в складі змішаної солі полінуклеотида полівалентний катіонний протиїон є цинк. У деяких випадках в складі змішаної солі полінуклеотида полівалентний катіонний протиїон є кальцій. У деяких випадках в складі змішаної солі полінуклеотида одновалентним катіонних протиіїоном є натрій. У деяких випадках в складі змішаної солі полінуклеотида одновалентним катіонних протиїоном є амоній. У деяких випадках в складі змішаної солі полінуклеотида одновалентним катіонних протиіїоном є тріетіламмоній. У деяких варіантах реалізації полінуклеотидна сіль включає один полівалентний катіонний протиіїон. У деяких варіантах реалізації винаходу полінуклеотидна сіль додатково включає в себе 2 полівалентних катіонних протівоіїона. У деяких варіантах реалізації винаходу полінуклеотидна сіль додатково включає в себе З полівалентних катіонних протівоіона. У деяких варіантах реалізації винаходу полінуклеотидна сіль додатково включає в себе 4 полівалентних катіонних протівоіїона. У деяких варіантах реалізації винаходу полінуклеотидна сіль додатково включає в себе 5 полівалентних катіонних протиїонов. У деяких варіантах реалізації винаходу полінуклеотидна сіль додатково включає в себе 6 полівалентних катіонних протиїонов. У деяких варіантах реалізації винаходу полінуклеотидна сіль додатково включає в себе 7 полівалентних катіонних протиіїонов. У деяких варіантах реалізації винаходу полінуклеотидна сіль додатково включає в себе 8 полівалентних катіонних протиіїонов. У деяких варіантах реалізації винаходу полінуклеотидна сіль додатково включає в себе 9 полівалентних катіонних протиїонов. У деяких варіантах реалізації винаходу полінуклеотидна сіль додатково включає в себе 10 полівалентних катіонних протиіонов. 00117) На додаток до цільового полінуклеотиду в процесі синтезу полінуклеотидів може бути отримано безліч продуктів синтезу нецільового полінуклеотида. Побічні продукти, які можуть бути присутніми в препаратах полінуклеотида, включають, але не обмежуються ними, продукти делеции (наприклад, продукти, що не мають одного або більше нуклеозидних залишків), продукти, які містять одну або більше захисну групу, терминировать продукти (наприклад, продукти, які містять кепірованную полінуклеотидную ланцюг), продукти, які не мають одного або більше азотистих основ, продукти, які містять частково окислені фосфорамідітні зв'язки, і продукти, які містять частково сульфовані зв'язки. 00118) Розглянуті способи забезпечують отримання композицій з поліпшеною чистотою бо цільового полінуклеотида. У деяких варіантах реалізації композиція містить 20 95 або більше по масі цільового полінуклеотида, наприклад, близько 25 95 або більше, близько 30 95 або більше, близько 35 95 або більше, близько 40 95 або більше, близько 45 95 або більше, близько 5095 або більше, близько 60 95 або більше, близько 70 95 або більше, близько 80 95 або більше, близько 90 95 або більше або навіть близько 9595 або більше по масі цільового полінуклеотида. У деяких варіантах реалізації композиція містить 50 95 або більше по масі цільового полінуклеотида. У деяких варіантах реалізації композиція містить 55595 або більше по масі цільового полінуклеотида. У деяких варіантах реалізації композиція містить 60 95 або більше по масі цільового полінуклеотида. У деяких варіантах реалізації композиція містить 65 95 або більше по масі цільового полінуклеотида. У деяких варіантах реалізації композиція містить 70 95 або більше по масі цільового полінуклеотида. У деяких варіантах реалізації композиція містить 7590 або більше по масі цільового полінуклеотида. У деяких варіантах реалізації композиція містить 80 95 або більше по масі цільового полінуклеотида. У деяких варіантах реалізації композиція містить 8595 або більше по масі цільового полінуклеотида. У деяких варіантах реалізації композиція містить 9095 або більше по масі цільового полінуклеотида. У деяких варіантах реалізації композиція містить 95 95 або більше по масі цільового полінуклеотида.
Ї0О0119| Розглянуті способи забезпечують отримання композицій, що містять знижена кількість побічних продуктів і агентів. Під зменшеною кількістю мається на увазі, що кількість по масі нецільових продуктів синтезу і агентів в композиції зменшується в порівнянні з методом контролю. У деяких варіантах здійснення пропоновані композиції включають продукти їі агенти, які не містять цільового синтезу, в кількості 50 95 або менше від загальної кількості нецільових полінуклеотидів в композиції, таких як 40 95 або менше, 30 95 або менше, 25 95 або менше, 20 95 або Проте, 15 95 або менше, 10 95 або менше або навіть 5 95 або менше нецільових продуктів синтезу і агентів.
ІЇ00120| Багато класів і типи полінуклеотидів становлять інтерес для отримання із застосуванням розглянутих способів (наприклад, описаних в даному документі). полінуклеотиди, які підходять для отримання згідно даним способам, включають, але не обмежуються ними, антисмислового полінуклеотиди, РНК полінуклеотиди, міРНК полінуклеотиди, полінуклеотиди РНК-інтерференції, ДНК аптамери, мікроРНК і т.п. 00121) У деяких варіантах реалізації полінуклеотид може бути описаний формулою (у: в
Шо н І. х а
І Ще) (в;
Б во рда 80 формула (1),
В якій: кожен В незалежно являє собою пурин, захищений пурин, піримідин або захищений пиримидин, або їх аналог; кожен Х незалежно являє собою кисень або сірку; кожен ВЗ являє собою водень, фтор, гідрокси, алкокси, заміщений алкокси або захищений гідроксил;
Ве являє собою аміно, гідроксил, захищений аміно, захищений гідрокси, -0-1-7 або-МН-Т-7; кожен Т незалежно являє собою необов'язковий лінкер; кожен 2 незалежно є Н, ліпід, підкладку, носій, олігонуклеотид, полімер, поліпептид, що виявляється мітку або маркер; і п являє собою ціле число від 1 до 1000. Слід розуміти, що деякі олігонуклеотиди, що містять субодиницю, описану формулою (І), також можуть існувати в сольовій формі. Отже,
межнуклеозідная зв'язок Формули (І) може бути в сольовій формі, яка містить будь-який відповідний протиіїон. Такі форми включені в обсяг даного опису. Зрозуміло, що можливі інші таутомерні пристрої межнуклеозідних зв'язків полінуклеотида, описані у формулі (І). Такі форми включені в обсяг даного опису. 00122) У деяких варіантах реалізації Формули (І) кожен КЗ є водень. У деяких варіантах реалізації Формули (І) кожен КЕ" є фтор. У деяких варіантах реалізації Формули (І) кожен КЗ являє собою гідроксил. У деяких варіантах реалізації Формули (І) 25 являє собою аміно. У деяких варіантах реалізації Формули (І) 29 являє собою гідроксил. У деяких варіантах реалізації
Формули (І) 7 являє собою Н. У деяких варіантах реалізації Формули (І) 7 являє собою ліпід (наприклад, як описано в даному документі) У деяких випадках липид є жирну кислоту (наприклад, як описано в даному документі). У деяких варіантах реалізації Формули (І) 7 являє собою носій. У деяких варіантах реалізації Формули (І) 7 являє собою олігонуклеотид. У деяких варіантах реалізації Формули (І) 7 являє собою полімер. У деяких випадках полімер являє собою ПЕГ. У деяких варіантах реалізації Формули (І) 7 являє собою поліпептид. У деяких варіантах реалізації Формули (І) 2 являє собою виявляємо мітку. У деяких варіантах реалізації
Формули (І) 7 являє собою маркер. У деяких варіантах реалізації Формули (І) Т відсутній. У деяких варіантах реалізації кожен В незалежно вибранийзА, С, б, Ті. 00123) У деяких варіантах реалізації Формули (І) п являє собою ціле число від 7 до 500, наприклад, від 7 до 100, від 7 до 75, від 7 до 50, від 7 до 40, від 7 до ЗО, від 7 до 20, від 7 до 15, від 10 до 15 або від 13 до 15. У деяких варіантах реалізації п являє собою ціле число від 7 до 100, наприклад, від 7 до 50, від 10 до 50, від 10 до 40, від 10 до З0, від 10 до 25, від 10 до 20, від 12 до 18 або від 12 до 16. У деяких варіантах реалізації п дорівнює 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21, 22, 23, 24 або 25. (00124) Полінуклеотиди, комплементарні РНК компоненту теломерази 00125) Аспекти даного опису включають сполуки і композиції, що містять полінуклеотиди, комплементарні РНК компоненту людської теломерази, а також способи їх отримання.
Зазначені сполуки можуть пригнічувати активність теломерази в клітинах 3з високою ефективністю, і мають характеристики клітинного поглинання. 00126) У деяких варіантах реалізації полінуклеотид містить послідовність з 7 або більш
Зо нуклеозидних субодиниць, комплементарних РНК компоненту людської теломерази, наприклад, 8 або більше, 9 або більше, 10 або більше, 11 або більше, 12 або більше, 13 або більше, 14 або більше, 15 або більше, 20 або більше, 30 або більше, 50 або більше нуклеозидних субодиниць, комплементарних РНК компоненту людської теломерази.
І00127| У деяких варіантах реалізації полінуклеотид містить від З до 50 послідовних нуклеозидних субодиниць, комплементарних РНК компоненту людської теломерази, наприклад, від 5 до 40, від 7 до 40, 10 до 40, від 10 до 30, від 10 до 25, від 10 до 20 або від 12 до 15 нуклеозидних субодиниць. У деяких варіантах реалізації полінуклеотид містить послідовність з 7 або більш нуклеозидних субодиниць, комплементарних РНК компоненту людської теломерази, наприклад 10 або більше, 11 або більше, 12 або більше, 13 або більше, 14 або більше, 15 або більше, 20 або більше, 30 або більше, 50 або більше нуклеозидних субодиниць, комплементарних РНК компоненту людської теломерази.
Ї00128| У деяких варіантах реалізації полінуклеотидна сполука може бути описана формулою:
О-(х- а де О являє собою полінуклеотид, що містить послідовність нуклеозидних субодиниць, комплементарних РНК компоненту людської теломерази, х являє собою необов'язкову лінкерних групу, Ї являє собою ліпідний фрагмент, і п являє собою ціле число від 1 до 5. В деяких випадках п дорівнює 5. У деяких випадках п дорівнює 4. У деяких варіантах реалізації п дорівнює 3. У деяких випадках п дорівнює 2. У деяких випадках п дорівнює 1. Отже, для конструювання з'єднань необхідно вибрати два елементи, О і І, а також оп Едель структурну зв'язок (-ї) між зазначеними елементами, які можуть включати необов'язкову лінкерних групу х.
ІЇ00129| У деяких варіантах реалізації полінуклеотидна сполука може бути описана формулою:
О-(х- а де О являє собою полінуклеотид, що містить послідовність нуклеозидних субодиниць, комплементарних РНК компоненту людської теломерази, х являє собою необов'язкову лінкерних групу, Ї являє собою ліпідний фрагмент, і п дорівнює 1, наприклад, полінуклеотид
Формули (І), або його сіль, при цьому в формулі (І) 7 являє собою ліпідний фрагмент, Т являє собою необов'язковий лінкер (наприклад, як описано в даному документі), і групи В відповідають послідовності нуклеозидних субодиниць, комплементарної РНК компоненту людської теломерази. 00130) полінуклеотидний компонент О може розглядатися як "еффекторний" компонент сполуки в тому відношенні, що він являє собою компонент, який впливає на інгібування ферменту теломерази за допомогою зв'язування з РНК компонентом теломерази. Таким чином, послідовність О обрана так, що вона містить область, комплементарную послідовності РНК теломерази, представленої в 5ЕО ІЮО МО: 1. На область, яка комплементарна РНК компоненту теломерази, теоретично може бути націлена будь-яка частина РНК теломерази, але певні області РНК теломерази переважно націлені на ингибирующие полінуклеотиди. Інша краща область-мішень являє собою область, що охоплює нуклеотиди 30-67 5ЕО ІЮ МО: 1, яка містить "матричну область", область з 11 нуклеотидів послідовності 5-СОАДАСССОААС-З (ЗЕО ІО МО: 21), яка охоплює нуклеотиди 46-56 5БО ІЮ МО: 1. Матрична область діє для визначення послідовності теломерна повторів, які теломераза приєднує до кінців хромосоми, і є необхідною для активності ферменту теломерази (див. Спеп еї аї., Сеї! 100: 503-514, 2000; Кіт еї аї., Ргос.
Май. Асайд. 5сі., ОБА 98 (14): 7982-7987, 2001). Таким чином, становлять інтерес сполуки, які містять полінуклеотидну частину, включаючи послідовність, комплементарную всієї або частини матричної області. Інша область-мішень являє собою область, що охоплює нуклеотиди 137-179 в ВТК (див. Ргигап еї аї, Мисі. Асід5 Кевзеагсп, 30: 559-588, 2002). В межах цієї області, послідовність охоплює 141-153 є бажаною метою. У публікації РСТ УМО 98/28442 описано застосування полінуклеотидів, що мають щонайменше 7 нуклеотидів в довжину, для пригнічення теломерази, де зазначені полінуклеотиди сконструйовані так, щоб бути комплементарними доступним областям послідовності ПТ за межами матричної області, включаючи нуклеотиди 137-196, 290- 319 і 350-380 в ТЕ. 00131) Область 0, на яку націлена послідовність ПТК, точно комплементарна відповідній послідовності ПТК. Незважаючи на те, що в деяких випадках припустимі деякі невідповідності, вони імовірно знижують специфічність і активність отриманого полінуклеотидного кон'югату. У деяких варіантах реалізації послідовність підстав полінуклеотида О обрана так, щоб вона містила послідовність із щонайменше 5 нуклеотидів, точно комплементарную РНК теломерази, і посилене інгібування теломерази може бути досягнуто при використанні більшої довжини комплементарної послідовності, наприклад, щонайменше 6, по меншій міру 7 щонайменше 8, щонайменше 10, щонайменше 12, щонайменше 13 або щонайменше 15 нуклеотидів точно комплементарні РНК теломерази. В інших варіантах реалізації послідовність полінуклеотида містить послідовність, що складається з щонайменше від 7 до 20, щонайменше від 8 до 20, щонайменше від 10 до 20 або щонайменше 10 до 15 нуклеотидів, точно комплементарних послідовності РНК теломерази. Оптимальна активність інгібування теломерази може бути досягнута в тому випадку, якщо загальна довжина полінуклеотида О обрана так, що вона комплементарна РНК теломерази. Однак необов'язково, щоб повна довжина полінуклеотидного компонента була точно комплементарна цільової послідовності, і полінуклеотидна послідовність може містити області, які некомплементарни цільової послідовності. Такі області можуть бути додані, наприклад, для забезпечення інших властивостей сполуки, наприклад, послідовності, що полегшують очищення. Якщо полінуклеотидний компонент ОО містить області, які некомплементарни цільової послідовності, такі області можуть бути розташовані на одному або обох кінцях 5 або 3. У випадках, якщо зазначена область точної комплементарності націлена на матричну область, ефективне інгібування теломерази може бути досягнуте за допомогою короткої області (5-8 нуклеотидів) точної комплементарності, з якої теломеразоподобная (з високим вмістом с) послідовність пов'язана на 5'-кінці. (00132) Ілюстративні послідовності, які комплементарні РНК людської теломерази і які можуть бути включені як частина полінуклеотидного компонента О, або які можуть бути використані в якості цілого полінуклеотидного компонента СО, включають такі: послідовності, комплементарні ПТК (області полінуклеотидної послідовності 5ЕО ІЮ МО: 1 публікації США 2012329858);
во бСсОСА авооПОоСоСссСИ осОосАОпООоСИ о оООССсССАТЛО
ІС СПААС ССПОААСОСАС ААОоОсСОБАС ососсоОасу
ЛлОСсиСсссс оСообСОоСиу лшСсОоСОоСсОс АСІЛСАССО
СОСОСААААа ссосооСсСсо ССОССТЛССА ССОТОСАТЛС
ПАСАССАААС АААлАААПИС дос аСспООс осв есвво
СсОсССОСОоСсА сСОоССоСоО СИСОоССПОСС САССССССОА АССССОССОЄ бАсоССсоСоо ППСООоСССОооо ОСІЛІСОЦССОС АОССАСССАС ПпОССАССОоСсо
ААвАОООО СПСПОМСАОС сосоовусОос ІСООбООСОА пос сАСОЛІ САОСССІДОС АСОССОСАбОО ААСАССААСО пАССОСАОЦОС ссоСсОососСоо СсСОСпАШССС ПОСАоСИОоцОЄ
САСООССАСС САСОСАСОСОС СОІСАСАСАЦЮ С (5БО ІЮ МО: І)
ССТІСТАСААТСОСААСОСОСТОСААСсОСОоССАСо 137-166 (560 1 МО: 2)
СТИСААОССООСАОС 137-151 (БЕО І МО: 6)
ССАллОСОоСОСсСАСО 137-149 (5ЕБО ІЮ МО: 7)
СТОСОАЛАСОСОССА 139-151 (5601) МО: 8)
СТОСААлООСОС 141-151 (5КО І МО: 9)
ССОИаМстТОСААСОСоСИ 141-153 (5ЕО 1 МО: 10)
АСсОаСТОоСААСОоСс 142-154 (5ЕО 1 МО: 11)
ААСОСТООАлОССОСсС 143-155 (5ЕО ІЮ МО: 12)
АТОААССОТИСААСОСОС 144-158 (5ЕО ІЮ МО: 13)
АСАТІТПТТОТТТОСТОСТАС 160-179 (560 10 МО: 14)
ТАСОСТТАСАСАА 42-54 (5ЕО І МО: 3)
СТТАСОССТТАС 46-56 (5БЕО ПО МО: 4)
ОСТТАОСОТТАСАС44-56(55015 МО: 15)
СТТАОООСТТАСАСАА 42-56 (520 І МО: 16)
ССО ТТАСАС 44-52 (5БО 1 МО: 19)
САСТТАбОИС 50-58 (5ЕО Ю МО: 20)
СССТІСТСАСТТ 54-65 (560 Ю МО: 17)
СОСССТІСТСАС 56-67 (5ЕО ІЮ МО: 18) 00133) У деяких варіантах реалізації полінуклеотид містить послідовність, вибрану з групи, що складається з: СТТАСОСТТАС (5БЕО ІЮ МО:4); ТАБОСТТАСАСАА (5ЕБЕО ІЮО МО:3); и сАааттАаа,астТтТАс (ЗЕО ІО МО:5). 00134) Вибір типу межнуклеозідних зв'язків, які використовуються для синтезу компонента
О, може бути зроблений на підставі будь-яких доступних хімічних структур полінуклеотидів, включаючи, але не обмежуючись ними, фосфодіефірні, фосфотриефірні, метілфосфонатні, РЗ "- М5' фосфорамідатні, МЗ --» Р5 фосфорамідатні, МЗ - РО" тіофосфорамідатні і тіофосфатні зв'язки. У деяких варіантах реалізації полінуклеотидний компонент О має щонайменше одну МЗ "- РУ" фосфорамідатную зв'язок. У деяких варіантах реалізації все нуклеозидні субодиниці, комплементарні РНК компоненту людської теломерази, пов'язані МЗ'-- Р5" фосфорамідатнимі міжсубодиничнимі зв'язками. У деяких випадках М3'--зРБ5 тіофосфорамідатная міжсубодиничная зв'язок має наступну структуру: 3А-МНА-Р(ІБМОН)-АО0О--5 де К являє собою водень або сіль. Слід розуміти, що для будь-яких полінуклеотидних компонентів О, описаних в даному документі, які містять зазначену міжсубодиничную зв'язок, такі полінуклеотидні компоненти О також можуть включати будь-які відповідні сольові форми зазначеного зв'язку. Таким чином, зазначена міжсубодиничная зв'язок може бути в сольовій формі, яка містить будь-який відповідний протиїіон.
Ї00135| В некоторьїх вариантах реализации, по меньшей мере, две нуклеозидньє субьєдиницьї соединеньї межсубьединичной М3' - РУ" тиофосфорамидатной связью, а другие межсубьединичньюе связи, каждая из которьїх независима, вьібраньр из М3'-з РБ' оксофосфорамидатньїх и М3' - Р5 "тиофосфорамидатньїх межсубьединительньіїх связей. В некоторьіх вариантах реализации нуклеозиднье субьединицьі соединеньї между субьединичньмми связями, каждьй из которьїх независимо вьібрана из МУ -з РБ' оксофосфорамидатньхх и МУ - Р5 тиофосфорамидатньїх межсубьединичньіїх связей. В некоторьїх вариантах реализации нуклеозиднье субьєединицьі соединеньї межсубьединичньми связями, каждая из которьїх независимо вьібрана из МУ -з Р5 оксофосфорамидатньх и
М3" - Р" тиофосфорамидатньїх межсубьединичньх связей; при условии, что по меньшей мере две из нуклеозидньх субьединиц соединеньї! межсубьединичной М3 -з Р тиофосфорамидатной связью. В некоторьїх вариантах реализации нуклеозидньюе субьединицьї соединеньії межсубьединичной МУ" -- РУ" тиофосфорамидатной связью. 00136) У деяких варіантах здійснення полінуклеотидний компонент Про має послідовність тТА,асТТАсСАСАА (5ЕО ОО МО:3), а нуклеозидні субодиниці з'єднані міжсубодиничнимі зв'язками, що містять щонайменше два зв'язки МЗ3'"-» РО" тіофосфорамідата. У деяких варіантах здійснення полінуклеотидний компонент Про має послідовність ТАОБОСТТАСАСАА (ЗЕО ОС МО: 3), а нуклеозидні субодиниці з'єднані міжсубодиничнимі зв'язками, що містять щонайменше три сполуки МЗ3 "- РЕБ тіофосфорамідатов. У деяких варіантах реалізації полінуклеотидний компонент Про має послідовність ТАОССТТАСАСАА (5БЕО ІО МО: 3), і нуклеозидні субодиниці з'єднані міжсубодиничнимі зв'язками, що містять щонайменше чотири сполуки МЗ3 "- РЕ тіофосфорамідатов. У деяких варіантах реалізації полінуклеотидний компонент Про має послідовність ТАСОСТТАСАСАА (5ЕО ІО МО: 3), і нуклеозидні субодиниці з'єднані міжсубодиничнимі зв'язками, що містять щонайменше п'ятьма зв'язків М3'--» Рб' тіофосфорамідатов. У деяких варіантах здійснення полінуклеотидний компонент Про має послідовність ТАСОСТТАСАСАА (5ЕБО ІО МО: 3), а нуклеозидні субодиниці з'єднані міжсубодиничнимі зв'язками, що містять щонайменше 6 зв'язків МЗ "- Р5' тіофосфорамідата. У деяких варіантах здійснення полінуклеотидний компонент Про має послідовність
ТАСОСТТАСАСАА (ЗЕБЕО ІЮ МО: 3), а нуклеозидні субодиниці з'єднані міжсубодиничнимі
Зо зв'язками, що містять щонайменше сім зв'язків МЗ '-- Ре" тіофосфорамідата. У деяких варіантах здійснення полінуклеотидний компонент Про має послідовність ТАОССТТАСАСАА (5ЕО ІЮО МО: 3), а нуклеозидні субодиниці з'єднані міжсубодиничнимі зв'язками, що містять щонайменше вісім зв'язків ММЗ "- РБ5 тіофосфорамідата. У деяких варіантах здійснення полінуклеотидний компонент Про має послідовність ТАСОСТТАСАСАА (ЗЕО ІО МО: 3), а нуклеозидні субодиниці з'єднані міжсубодиничнимі зв'язками, що містять щонайменше 9 зв'язків М3'-» Р тіофосфорамідата. У деяких варіантах здійснення полінуклеотидний компонент Про має послідовність ТАСОСТТАСАСАА (5ЕБО ІО МО: 3), а нуклеозидні субодиниці з'єднані міжсубодиничнимі зв'язками, що містять щонайменше десять зв'язків М3'-- Р тіофосфорамідата. У деяких варіантах здійснення полінуклеотидний компонент Про має послідовність ТАСОСТТАСАСАА (5ЕБО ІО МО: 3), а нуклеозидні субодиниці з'єднані міжсубодиничнимі зв'язками, що містять щонайменше 11 зв'язків МЗ '- Ре" тіофосфорамідата. У деяких варіантах здійснення полінуклеотидний компонент Про має послідовність тТА,ИасТТАсСАСАА (ЗЕБЕО ІЮ МО: 3), а нуклеозидні субодиниці з'єднані міжсубодиничнимі зв'язками, кожна з яких незалежно обрана з зв'язків МЗ - РО" оксофосфорамідата і М3'-- Р" тіофосфорамідата між субодиницями. У деяких варіантах реалізації полінуклеотидний компонент Про має послідовність ТАЄОСТТАСАСАА (5ЕО ІЮ МО: 3), і нуклеозидні субодиниці з'єднані міжсубодиничнимі зв'язками, кожна з яких незалежно вибраний з М3'--» Р оксофосфорамідата і М3"-- РО" тіофосфорамідатних межсуб'єдінітельних зв'язків; за умови, що щонайменше дві з нуклеозидних субодиниць з'єднані сполуким М3 "- РО" тіофосфорамідата між субодиницями. У деяких варіантах реалізації полінуклеотидний компонент Про має послідовність ТАСОСТТАСАСАА (5ЕБЕОІО МО:3), і нуклеозидні субодиниці з'єднані межсуб'єдініцей зв'язком МЗ '- РО" тіофосфорамідата. 00137) В усіх варіантах реалізації, зазначених вище і нижче, сполуки між субодиницями МЗ3 "- Ре" тіофосфорамідатов, зокрема, являють собою -МН-Р(-ОХ5Н)-О- або його таутомер або його сіль; і МЗ3'- РО" оксофосфорамідатной міжсубодиничной зв'язку, зокрема, являють собою -
МН-РІ-ОХОН)-О- або його таутомер або його сіль. Більш конкретно, у першій-ліпшій нагоді реалізації, зазначених вище і нижче, сполуки між субодиницями М3 "- Ре" тіофосфорамідатов, зокрема, являють собою -МН-Р(-О)(ЗН) -О- або його таутомер або його сіль; і МЗ з» РЕ оксофосфорамідатной міжсубодиничной зв'язку, зокрема, являють собою -МН-Р(-ОХОН)-О- або бо його таутомер або його натрієву сіль.
00138) В одному з варіантів реалізації винаходу відноситься до будь-якої з описаних тут специфічних структур, в яких одна або кілька, зокрема міжсубодиничная зв'язок М3 "з Ро" тіофосфорамідат а замінена на М3 -- РБ5 оксофосфорамідатний міжсубодиничную зв'язок.
В одному з варіантів реалізації винаходу відноситься до будь-якої з описаних тут специфічних структур, в яких одна або кілька, зокрема міжсубодиничная зв'язок М3 '--» Ре" тіофосфорамідата замінена на М3"--» РУ" оксофосфорамідатний міжсубодиничную зв'язок. 00139) У деяких випадках цільові сполуки є більш ефективними при інгібуванні теломерази в клітинах, ніж відповідні полінуклеотиди, що не кон'юговані з ліпідними компонентами. Функція ліпідного компонента Г. імовірно полягає в посиленні клітинного поглинання сполуки, зокрема, в полегшенні проходження через клітинну мембрану. Незважаючи на те, що механізм, за яким це відбувається, до сих пір не до кінця вивчений, одна з можливостей полягає в тому, що ліпідний компонент може полегшувати зв'язування сполуки з клітинної мембраною у вигляді однієї молекули або в агрегированной (міцелярної) формі, з подальшої интернализацией. Однак розуміння точного механізму не є необхідним для застосування даної сполуки. 00140) Ліпідний компонент може являти собою будь-який липид або ліпідне похідне, яке забезпечує посилене клітинне поглинання в порівнянні з немодифікованим полінуклеотидом.
Перевага ліпіди є, але не обмежені ними, вуглеводні, жири (наприклад, гліцериди, жирні кислоти і похідні жирних кислот, такі як аміди жирних кислот) і стерини. Якщо ліпідний компонент являє собою вуглеводень, то компонент Ї може бути зміщенням або незаміщених циклічним вуглеводнем, або алифатическим нерозгалуженим або розгалуженим вуглеводнем, який може бути насиченим або ненасиченим. Приклади є лінійними нерозгалужені вуглеводні, які є повністю насиченими або поліненасиченими. Довжина вуглеводневого ланцюга може варіюватися від С2 до С30, але оптимальне інгібування теломерази може бути досягнуто з застосуванням вуглецевих ланцюгів С8-С22. Приклади насичених вуглеводнів (алканів) перераховані нижче:
Систематична назва/вуглецевий ланцюг
Тетрадекан С:14«Нзо
Пентадекан Сі5Нз2
Гексадекан СтвНза
Коо) Гептадекан С17Нзв
Октадекан СівНзв
Нонадекан СіоНао
Ейкозан СгоНаг 00141) Також можуть бути обрані моно- і поліненасичені форми (алкени і поліени, такі як алкадієни і алкатріени) вуглеводнів, при цьому кращі сполуки, що мають від однієї до трьох подвійних зв'язків, хоча можуть бути використані сполуки, що мають більше подвійних зв'язків.
Також можуть бути використані Алкіни (містять одну або більше потрійних зв'язків) і алкеніни (потрійний зв'язок (-ї) і подвійний зв'язок (-Ї)). 00142) У сполуках згідно з винаходом можуть бути використані заміщені форми вуглеводнів, при цьому кращі групи заступників, які є інертними іп мімо і іп міго. У деяких випадках заступником є фтор. Ілюстративні узагальнені структури поліфторірованних вуглеводнів включають: СЕз(СЕг)п-(СН2г)т- де т дорівнює щонайменше 1, в деяких випадках щонайменше 2, і п дорівнює 1-30, наприклад, фтортрідекан: СЕзЗ(СЕг)а(СНег)з; і СНі(СНаг)а(СЕг)(СНе)с-,в яких а,
Б ї с дорівнюють незалежно один від одного 1-30. 00143) Інші відповідні ліпідні компоненти включають, але не обмежені ними, прості жирні кислоти і похідні жирних кислот, тригліцериди і більш складні ліпіди, такі як стерини, наприклад, холестерин. Жирні кислоти і їх похідні можуть бути повністю насиченими або моно-, або поліненасиченими. Довжина вуглецевого ланцюга може варіюватися від С2 до СЗ30, але оптимальне інгібування теломерази може бути досягнуто з застосуванням вуглецевих ланцюгів
С8-С22. Приклади насичених жирних кислот перераховані нижче:
Систематична назва/ГТривіальна назва/Вуглецевий ланцюг
Тетрадеканова міристинова 14:0
Гексадеканова пальмітинова 16:0
Октадеканова стеаринова 18:0
Ейкозанова арахінова 20:0 00144) Також можуть бути використані моно- і поліненасичені форми жирних кислот, при цьому кращі сполуки, що мають від однієї до трьох подвійних зв'язків, хоча можуть бути використані сполуки, що мають більше подвійних зв'язків. Приклади поширених моно- і поліненасичених жирних кислот, які можуть бути використані, включають: бо Систематична назва/Гривіальна назва/Вуглецевий ланцюг
Цис-9-гексадеканова пальмітинолейинова 16:1 (п-7)
Цис-6-октадеканова петроселінова 18:1 (п-12)
Цис-9-октадеканова олеїнова 18:1 (п-9) 9,12-октадекадиєнова лінолева 18:2 (п-б) 6,9,12-октадекатрієнова гамма-лінолева 18:3 (п-6) 9,12,15-октадекатрієнова альфа-лінолева 18:3 (п-3) 5,8,11,14-ейкозатетраєнова арахідонова 20:4 (п-б)
Ї00145| У сполуках також можуть бути використані жирні кислоти з однієї або більше потрійними зв'язками в вуглецевого ланцюга, а також розгалужені жирні кислоти. У сполуких можуть бути використані заміщені форми жирних кислот. Як і в випадку вуглеводневих груп, групи заступників є інертними іп мімо і іп міго, таких як фтор. Ілюстративні узагальнені структури поліфторірованних похідних жирних кислот, які підходять для застосування відповідно до даного винаходу, являють собою: СЕз(СЕг)А- -(СНг)тбО-- де т дорівнює 1, переважно 2, і п дорівнює від 1 до 30, і СНнз(СНг) а (СЕг)(СНг)сСО--, в яких а, Ь і с дорівнюють незалежно один від одного 1-30. 00146) У деяких випадках від одного до п'яти компонентів І. (п дорівнює 1, 2, 3, 4 або 5) ковалентно пов'язані з компонентом ОО, необов'язково через лінкер. У деяких випадках використовується одна або дві І -складові (п - 1 або 2). Якщо з компонентом О пов'язано більше одного компонента Ї,, то кожен компонент І. обраний незалежно.
І00147| Слід розуміти, що сполуки згідно з винаходом, сполуки, описані як такі, що певну жирну кислоту (з такою ж кількістю атомів вуглецю, як в зазначеному вуглеводні), є спорідненими і відрізняються за структурою тільки природою зв'язку, що з'єднує фрагмент Г. з полінуклеотидом, яка, в свою чергу, є результатом процедури синтезу, використаної для отримання сполуки. Наприклад, і як описано більш детально нижче, коли сполуки синтезуються з І-групою, кон'югованої з 3'-аміноконцом полінуклеотида (має межнуклеозідні зв'язки фосфорамідата або тіофосфорамідата), використання альдегідної форми жирної кислоти (ліпоальдегід), оскільки вихідний матеріал призводить до утворення аминной зв'язку між ліпідної ланцюгом і полінуклеотидом, так що ліпідна група проявляється у вигляді вуглеводню. Навпаки, застосування карбонової кислоти, ангідриду кислоти або хлорангідрідной форми тієї ж жирної
Зо кислоти призводить до утворення амідного зв'язку, так що ліпідна група виступає як похідне жирної кислоти, зокрема, в даному випадку як жирний амід (як зазначено в представленому вище розділі "Визначення" , для простоти термін "жирна кислота" при описі сполученої групи Ї. використаний в даному контексті в широкому сенсі і включає похідні жирних кислот, в тому числі жирні аміди). Це показано на наступних схематичних ілюстраціях, які демонструють 3'- аміноконец фосфорамідатного полінуклеотида, з'єднаний з С14 ліпідним компонентом. На схематичному зображенні А, Ї являє собою тетрадекановую кислоту (міристинову кислоту), в якій зв'язок між групами Г. і О являє собою амід. На схематичному зображенні В, І. являє собою тетрадекан, і зв'язок між групами Г. і О являє собою амін.
Схематичним А іх в о Схематичним В іх В огя ол у п и а
ІЇ00148| Зв'язок між компонентами О і Її може бути прямим зв'язком або може бути реалізован через необов'язковий лінкерних фрагмент, наприклад, х або необов'язковий лінкер Т
Формули (І). Лінкерних група може служити для полегшення хімічного синтезу сполук.
Незалежно від того, використана чи лінкерних група для опосередкування сполучення компонентів О і Ї чи ні, в олігонуклеотидном компоненті О існує кілька сайтів, з котроийе компонент (-и) Ї. можуть бути легко пов'язані. Відповідні точки зв'язування включають 5 їі 3" кінці, одне або більше цукрових кілець, межнуклеозідний скелет і азотисті основи полінуклеотида. У деяких випадках фрагмент ГІ. приєднаний до З'або 5' кінця полінуклеотида
І00149| Якщо І-компонент повинен бути приєднаний до 3'-кінця, зв'язування може бути безпосередньо з 3'-заступником, який в разі переважного поліфосфата фосфорамідата і тіофосфорамідата є 3'-аміногрупу, а в інших випадках такі як звичайні фосфодіефірні полінуклеотиди, являє собою 3-гідроксигрупу. Альтернативно фрагмент І. може бути пов'язаний через 3'-пов'язану фосфатну групу, в якій гексадекановий вуглеводень пов'язаний з 3З'і-фосфатом тіофосфорамідатного олігонуклеотида за допомогою О-алкільного лінкера. Якщо фрагмент ГІ. повинен бути пов'язаний з 5 "кінцем, він може бути приєднаний через 5'-пов'язану фосфатну групу. Приєднання до основи фрагмента О може бути здійснено через будь-який відповідний атом, наприклад, до М2 аміногруппе гуанозіна. Якщо п»1, так що до компоненту О має бути приєднано безліч ліпідних компонентів, то окремо вибрані компоненти І. можуть бути приєднані в будь-якому зручному місці (-ів). Наприклад, одна група І. може бути приєднана до кожного з кінців, різні групи Ї можуть бути приєднані до зазначених підстав, або дві або більше груп Г можуть бути приєднані до одного кінця. 00150) Необов'язковий лінкерний компонент х може бути використаний для зв'язування компонентів О і Ї. сполук. Слід розуміти, що необов'язковий лінкер (наприклад, х або Ї. в
Формулі (І)) може бути приєднаний до полінуклеотиду (наприклад, С) через кінцеву фосфатну групу, наприклад, 3'-пов'язану або 5'- пов'язану фосфатну групу. При необхідності використання лінкера його вводять в процедуру синтезу так, як описано в даному документі. Приклади відповідних лінкерних груп включають лінкери типу аміногліцеріна і О-алкілгліцеріна, які, відповідно, можуть бути зображені загальними структурами: -. СНИ" СНУ и пр т буду
ЇМ х
Кк ьЕ де К'є Н, ОН, МН»: або 5Н; У одно О, 5 або МЕ; К дорівнює Н, алкіл або заміщений алкіл; і п і т незалежно являють собою цілі числа від 1 до 18.
Приклади відповідних лінкерів є аміногліцеріновий лінкер, в якому К'ЄОН, У є О, і кожен т і п дорівнює 1: з т май
З
Оп біс-аміноглицериновий лінкер, в якому К є ОН, У є МН, і кожен т і п дорівнює 1: тр ша во хе нн нн
Он і О-алкілглицериновий лінкер, в якому К є Н: - - о соль
Он .
І00151| Ілюстративні модифіковані ліпідом олігонуклеотиди, які можуть бути отримані відповідно до розглянутих способів, включаючи сполуки, описані на фіг. 1 (наприклад, фіг. 1А- 100) в Арріїсайоп 05 20120329858 ю Стгуалпом єї аї. "Модійей оїЇїдописієоїіде5 ог їеіотегазе іппірйіоп", чий опис включено в даний документ в повному обсязі за допомогою посилання. 00152) У деяких варіантах реалізації композиція містить спокулу, описану структурою:
о
Н он І т
М - р--- І «АК ов-й-о-ї о о н ї оту тен (о) А
Щав; нй ое-еН о-- Ор пре пре пре ТпреАпроУпреА пре Спр пре | о А
МН» де "пре" представляє собою тіофосфорамідатную зв'язок (наприклад, -МН-Р(-О)(5Н)-О- або її таутомер, або її сіль), що з'єднує 3'-атом вуглецю одного нуклеозида з 5'-атомів вуглецю сусіднього нуклеозида . Слід розуміти, що сполука, описане в вищевказаною формулою, може існувати у формі солі. Такі форми, за умови можливості їх існування, включені в обсяг даного опису. У деяких варіантах реалізації композиція містить фармацевтично прийнятні сіль сполуки.
У деяких випадках композиція містить натрієву сіль сполуки. У деяких варіантах реалізації композиція містить сіль двовалентного катіона і зазначеного сполука, таку як магнієва сіль сполуки. У деяких варіантах реалізації композиція містить сіль тривалентного катіона і зазначеного сполука, таку як алюмінієва сіль сполуки. 00153) У деяких варіантах реалізації композиція містить спокулу, описану структурою:
о
Я вч - жиру б Ї мя ев 0-3 мо
Ге і і»; ММ» х ен х! дорен я жд й деки «оо баба фю ВИ
ВН Й с Ма сек ! М.
Х щі с Я у Б-бооні о НИеМН, 7 а Ї- ко а х ! мо Ж у; не й ян х ва Мен й Жак ож КЗ "чне х о Кн ю
КІ Ко мн
ЯК. Кк я : щ-й М щИ у Бей гр Мене ; й са ШИ вет, воо ге ВИ ї чесних но. в дено. ОМ О
НН, ЧИ; нн, їн дм ее
Не: с З
Мен ню І Ех девойоз г Мнетннь, оо МН чи Ме чав ШО:
І зе тв Й ій ска ни В дя з - й Мне : Мель пе 2 ! і вето -КХ Щи шо не ге ЧВ, Я; ваблоня р, Мем го, «М
У (М), де кожен Ме незалежно являє собою водень або протиіон солі, кожен х незалежно дорівнює 1, 2 або 3, і п являє собою ціле число від 5 до 13. У деяких випадках п дорівнює 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ї 13. У деяких випадках кожен х незалежно дорівнює 1, 2 або 3, а п є цілим числом від 5 до 12. У деяких випадках, п одно 13. У деяких випадках кожен х дорівнює 1. У деяких випадках кожен х незалежно дорівнює 1 або 2. В деяких випадках кожен х незалежно дорівнює 1 або 3. У деяких випадках кожен МУ є незалежно катіонних протиїоном. У деяких випадках кожен М є незалежно катіонних протиіїоном, кожен х незалежно дорівнює 1, 2 або 3, а п є цілим числом від 5 до 12. У деяких випадках кожен М незалежно являє собою водень або катіонний протиіон, кожен х незалежно являє собою 1, 2 або З і п являє собою ціле число від 5 до 12. У деяких випадках М являє собою водень. У деяких варіантах реалізації (М'є) п є (Маг) (МУ) 11. У деяких варіантах реалізації (М) п є (Маг) 2 (МУ) ». У деяких варіантах реалізації (М) з є (Мд2») з (МУ) 7.
У деяких варіантах реалізації (Ме) п є (Маг) 4 (М 7) 5. У деяких варіантах реалізації (М) п є (Маг) 5 (М 7) з. У деяких варіантах реалізації (М'є) п є (Мдг») в (М 7). У деяких варіантах реалізації (Ме) п є (Маг) (М У) 12, де протиїон Мде" може утворювати додаткову іонну пару для анионной основи іншого олігонуклеотида. У деяких варіантах реалізації (М'Є) п є (Ма) 2 (МУ) ч1, де протівоїони Мд" можуть утворювати дві додаткові пари іонів в анионной основному ланцюзі (- ях) одного або двох інших олігонуклеотидов (-ів). У деяких випадках протівоміоном М" змішаної магнієвої солі є натрій. У деяких випадках протівоміоном М" змішаної магнієвої солі є амоній. У деяких випадках протівоміоном М" змішаної магнієвої солі є тріетіламмоній.
І00154| У деяких варіантах реалізації композиція містить сполуку, описану наступною структурою, і може містити будь-які відповідні катіонні протівоіони солі: с
Бер.-О» осно
Го; ЧИ; Мн. є М. -совн ЯН є т в іе дейоО-я оз Меч
МН ди» Го ее рай і.
У ГЕ: М ме в
М чи щи
У ВавУнч с МЗМееВН, г Ша» ДИ , на г "нн у дело о, МАК, г ІЗ Що. ( не мг р ей ду МОЗМ КН,
У Ге ї- м, Ко: ій не ее "МН дЗебоо-; вМО о - Ш о кни не т чн вет. пе а у 2 МН нор є. Зо Щек си: и М» о - В
Н ви
Беб-о-в ду ММА мн.
В, «М, МН,
Щ М. я
НА УЖ г Т
Вайесня ср ММ,
СА
Вев-0- в но а Є шо Мне
Верона пк мн
Те їч 7 ІН ще й зм
Берон Ме; че е жо? о Щ
МН, 00155) У деяких варіантах реалізації композиція містить сполуку, описану структурою:
Зо ме а
Очивн перс. сожо 8 - чн,
Є Чо илшже у-он їн уж ії в-Вв рреюжуя чн су і: Що ше І НУ З
Су НК є ки у Не : М у; на с це у Б-Беья в МОВИ еЮвН
І Що ет йее . ІЕ у ко вв и Ма ни Я "І іш
У Ватесьяо ву М Мен, ( з ж- 2 а не дермн р; вевнон вн, і ша є ; Ма" нм й КН х а що
В-Робнр домо ка миття ся
М їй
Ма Ї «АК
НК МАН дерен оомеке ще Мо; мн. ді І ; і
Мн гр д-реюня А. мя м З
Мя не є т МН
Б-Р в мне, й ЗК
Ма в У Д
Веводья Ге ший во Мн.
Ма т С
Вей. в МО як у нн,
Ма" Е мн пт 8-0 іч м
ДН. ЧИМ»: МН;
Ма мн гр ве. во ММ й 5 й ма Ін, 00156) Полінуклеотиди модифіковані ліпідами
Ї00157| Для сполучення ліпідного фрагмента І з полінуклеотидом можуть бути використані різні синтетичні підходи, в залежності від природи обраної зв'язку, включаючи підходи, описані в публікаціях Міга еї аї!., (1995) Віоспетіса еї Віорпузіса Асіа, 1264: 229-237, 5пеєа єї аї. , (1990)
Мисівїс Асіа5 Нев. 18: 3777-3783, і Китр еї а!., (1998) Віосоп). Спет. 9: 341-349. Синтез сполук, в яких ліпідний фрагмент пов'язаний на 5 "або 3' кінці олігонуклеотида, може бути здійснений за допомогою відповідних функціональних груп на відповідному кінці, в деяких випадках аміногрупи або гідроксильної групи, які можуть взаємодіяти з карбоновими кислотами, хлорангидридами кислот, ангідридами і активними складними ефірами. В якості функціональних груп також можуть бути використані тіольний групи (див. Кирійаг еї аї., (2001) Віоогдапіс апа
Меадісіпа! Спетівту 9: 1241-1247). аміно- і тиол-модифікатори різної довжини ланцюга для синтезу полінуклеотидів є в продажу. полінуклеотиди мають МЗ - РеБ' тіофосфорамідатні зв'язки, містять 3'-аміногрупи (а не 3'-гідрокси, що зустрічаються в більшості звичайних хімічних структур олігонуклеотидов) і, отже, зазначені олігонуклеотиди забезпечують унікальну можливість сполучення ліпідних груп з 3'-кінцем олігонуклеотида. 00158) Різні підходи можуть бути використані для приєднання ліпідних груп до кінців полінуклеотидів з хімії М3'-РБ'-тіофосфорамідата (наприклад, сполучного пальмітоіламідо-1-0О- (4,4 "діметоксітрітіл). -2-О-сукцініллропандіола), для приєднання до З "кінця пов'язані сполуки можуть бути синтезовані за допомогою взаємодії вільної 3'-аміногрупи повністю захищеного полінуклеотида, пов'язаного з твердої підкладкою, з відповідним ангідридом кислоти з подальшим зняттям захисту за допомогою аміаку і очищенням. В альтернативному варіанті для сполучення ліпідних груп може бути використано зв'язування карбонових кислот ліпідів з вільною 3'-аміногруппой олігонуклеотида, пов'язаного з твердої підкладкою, із застосуванням зв'язуючих агентів, таких як карбодиїмідів, НВТИ (М, М, М", М'-тетраметіл- О- (1Н-бензотриазол- 1-ілу гексафторфосфат впустив) або йодид 2-хлор-1-метилпіридин можуть бути використані для кон'югації ліпідних груп. Зазначені два способи призводять до отримання амідного зв'язку між ліпідом і полінуклеотидом. Ліпіди також можуть бути приєднані до полінуклеодного ланцюга із застосуванням фосфорамідітного похідного липида, пов'язаного з полінуклеотидамі під час подовження ланцюга. Такий підхід дає фосфорамідат (наприклад, тіофосфорамідатной) зв'язку, що з'єднує липид і олігонуклеотид (наприклад, пропив-пальмітоіїловие і 2-гідроксипропіл- пальмітоїловие сполука). Інший підхід включає взаємодію вільної З3'-аміногрупи повністю захищеного полінуклеотида, пов'язаного з твердої підкладкою, з відповідним альдегідом липида, з подальшим відновленням ціаноборогідрідом натрію з отриманням амінного зв'язку.
І00159| Для приєднання до 5'-кінця полінуклеотид може бути синтезований із застосуванням модифікованої, ліпідсодержащіх твердої підкладки, з подальшим синтезом полінуклеотида в напрямку від 5'до 3", як описано в публікації Роподгасл і сгуа7пом (1999). Приклад модифікованої підкладки представлений нижче. Якщо п--14, жирна кислота являє собою пальмітинову кислоту: взаємодія З-аміно-1,2-пропандіол з пальмітоілхлорідом, з подальшим діметоксітрітілірованієм і сукцінілірованіем призводить до отримання проміжного сполука, що використовується для зв'язування з твердої підкладкою. У деяких випадках, К може являти собою довголанцюжкових алкіламіни на склі з контрольованим розміром пір. У деяких випадках К являє собою полімерну тверду підкладку. що
Ст
І
СВ, й шк о о й
Ї рови с сн. СН, а а чи
Ден») М ОМ що ій
Застосування
ІЇ00160| Способи та композиції згідно з винаходом, наприклад, описані вище, знаходять застосування в різних областях використання. Області застосування, що становлять інтерес, включають, але не обмежуються ними: терапевтичні застосування, діагностичні застосування, дослідні застосування і застосування для скринінгу, як докладніше описано нижче.
Зо 00161) Розглянуті сполука знаходять застосування в багатьох терапевтичних областях. У деяких варіантах реалізації способи отримання полінуклеотидоеє застосовують для отримання полінуклеотидів, які забезпечують терапевтичний ефект. Типи захворювань, які можна лікувати із застосуванням композицій згідно з винаходом, безмежні. Наприклад, зазначені композиції можуть бути використані для лікування ряду генетичних захворювань. У деяких варіантах реалізації розглядаються способи і композиції мають антисмислового застосування. У деяких варіантах реалізації розглядаються способи і композиції мають антигенну застосування. У деяких варіантах реалізації розглядаються способи і композиції мають застосування для інгібування теломерази, як описано в патенті США 6835826 і в публікації США 20120329858, повний опис яких включено в цей документ за допомогою посилання.
І00162| В даному описі представлені сполуки, які можуть специфічно і ефективно пригнічувати активність теломерази, і які, отже, можуть бути використані для інгібування проліферації теломераза-позитивних клітин, таких як пухлинні клітини. Показано, теломераза- позитивними є багато ракові клітини, включаючи клітини раку шкіри, сполучної тканини, жирової тканини, молочної залози, легень, стравоходу, підшлункової залози, яєчників, шийки матки, матки, нирок, сечового міхура, товстої кишки, передміхурової залози, центральної нервової системи (ЦНС), сітківки і гематологічних пухлин (таких як мієлома, лейкоз і лімфома). Цікавлять типи раку включають, але не обмежуються ними, мієлофіброз, тромбоцітемію, мієлодиспластичний синдром і мієлогенна лейкоз.
ІЇ00163| Розглянуті сполуки можуть бути використані для лікування гематологічних злоякісних утворень і мієлопроліферативних розладів, включаючи, але не обмежуючись ними, есенційну тромбоцітемію (ЕТ), поліцитемія віра (РМ), хронічний мієлогенна лейкоз (СМ), мієлофіброз (МЕ), хронічний нейтрофільний лейкоз, хронічний еозинофільний лейкоз і гострий мієлогенна лейкоз (АМІ). Розглянуті сполука можуть бути використані для лікування мієлодиспластичні синдромів, які включають такі захворювання як рефрактерная анемія, рефрактерна анемія з надлишком бластів, рефрактерна цитопенія з мультилинейной дисплазією, рефрактерна цитопенія з однолінійної дисплазією і хронічний мієломоноцитарний лейкоз (СММІ). Розглянуті сполука можуть бути використані для лікування гематологічних захворювань, таких як описані в заявці на патент РСТ Мо РСТ/О513/070437, поданої 15 листопада 2013 року, повний опис якої включено в цей документ за допомогою посилання.
І00164| Відповідно, сполуки, представлені в даному документі, підходять для лікування широкого ряду злоякісних утворень. У деяких випадках, що сполука згідно з винаходом можуть бути ефективними для лікування, що забезпечує високу диференціювання між злоякісними і нормальними клітинами, дозволяючи уникнути багатьох шкідливих побічних ефектів, що виникають при використанні більшості сучасних хіміотерапевтичних режимів, заснованих на агентах, без розбору знищують діляться клітини. Крім того, в деяких випадках сполука, модифіковані ліпідами, згідно з винаходом більш ефективним, ніж еквівалентні неспряженість олігонуклеотиди, що означає, що вони можуть бути введені в більш низьких дозах, забезпечуючи підвищену безпеку і істотне зниження вартості лікування. Інгібітори теломерази можуть бути використані в поєднанні з іншими засобами лікування раку, включаючи хірургічне видалення первинних пухлин, хіміотерапевтичні агенти і радіаційне лікування. Отже, даний винахід відноситься до сполук і композицій, представлених в даному документі, для застосування в якості лікарського засобу. Винахід відноситься також до з'єднань і композиціям, представленим в даному документі, для застосування при лікуванні або попередженні одного з злоякісних захворювань, згаданих вище.
І00165| Розглянуті сполука і способи знаходять застосування в різних діагностичних областях, включаючи, але не обмежуючись ними, розробку клінічної діагностики, наприклад, іп міго діагностики або агентів для візуалізації пухлини іп мімо. Такі застосування підходять для діагностики або підтвердження діагнозу хворобливого стану або схильності до нього. Зазначені способи також підходять для моніторингу прогресування захворювання і / або реакції на лікування у пацієнтів, у яких раніше діагностовано захворювання.
Приклади 00166) Приклад 1: Суть винаходу
І00167| Ці приклади описують експерименти з приготування різних двовалентних або тривалентних форм іметелстата, таких як Са, Ва, Ма, АЇї, Ре, Си їі 27п з форми натрієвої солі іметілстата. У цих експериментах були відзначено поліпшення чистоти з використанням способів отримання, що включають освіту і виділення солей двухдентатних або трідентатних катіонів, які можуть зв'язуватися з однією, двома або трьома фосфатними групами іметелстата.
Також вивчали розчинність і молярность отриманих сольових форм.
ІЇ00168| Було досліджено отримання солей іметелстата кальцію, іметелстата барію, іметелстата магнію, іметелстата алюмінію, іметелстата заліза (ІІ або Ії) і іметелстата міді з використанням Сасіг, Мосі», Васіг, Сисі», 7пОі», АТСіз, Гесі», и Бесі». 001691) Три способи сольового обміну були вивчені: використання сильної катіонообменной смоли (РІМЕХ МЕС 210), осадження і просте розчинення. Коли розчин іметелстата натрію пропускали через смолу, якою обмінюються з Сасі», ВаСіг і МодсСі», розчини елюата містили дрібні порошки, що вказує на те, що протівоїони натрію успішно обмінялися на основному ланцюзі від іметелстата і замінювали на протівоіони кальцію, барію або магнію. Для решти п'яти реагентів (СисСіг, 2пСіг, АІСіз, ЕесСіг, Еесіз), які були врівноважені на катіонообменной смолі, верхня частина смоли в колоні була агрегована при проходженні розчину іметелстата, що також свідчило про те, що протівоіони натрію були успішно замінені від основи іметелстата.
І00170| Методи осадження і розчинення також випробовували з використанням надлишку сольових реагентів. Коли великий надлишок сольового реагенту (наприклад, 900 еквівалентів) обробляли іметелстатом натрію, утворювався осад. Осад відокремлювали фільтруванням. бо Наступні випробування показують, що для перетворення всього іметелстата в осад потрібно від семи до п'ятдесяти еквівалентів неорганічних сольових реагентів. 00171) П'ять еквівалентів трьох неорганічних солей (Мо, Ва або Са) обробляли або сіллю типу іметелстат ТЕА (тріетіламмонія), або сіллю іметелстата натрію. Було підтверджено, що осадження не відбувалося, і розчини знесолювальних і ліофілізували. Аналіз лиофилизированного порошку Ріате АА (Айотіс АБзогріп) показав, що деякі з натрієвих протиіїонов іметелста підлягали обміну.
І00172| Було проведено додатковий експеримент з МоСі»г з використанням від 1 до 9 еквівалентів катіона магнію до солі іметелстата. Протівоїони натрію частково замінювалися на протівоїони Мод з найкращим обміном, при використанні дев'яти еквівалентів МоСі», при цьому отримані композиції показували 1,2 мас. 95 Ма і 1,1 мас. 95 Ма. 00173) Приклад 2: Матеріали і устаткування (00174) Неорганічні реагенти, органічні розчинники та інші матеріали, що використовуються для дослідження, наведені в таблиці 1. Для дослідження використовувався іметелстат натрію (САБ5 й 1007380-31-5) | ої 2 163 / І -5-13002, наданий Сегоп. Іметелстат амонію являє собою неочищену композицію, отриману з розщепленого іметелстата з підкладки для твердофазного синтезу з використанням аміаку і етанолу (наприклад, як описано Сгуалпом еї аї.
У 005 20120329858) та був отриманий із запасів виробника. Іметелстат ТЕА (вид тріетіламмонія) являє собою композицію, отриману з елюата колонки для ВЕРХ, де використовується рухома фаза, яка містить тріетіламмоній ацетат (ТЕАА) (наприклад, як описано ОСгуа7пом еї аї. В 5 20120329858) та отримана із запасів виробника. Ультрафільтрацію проводили з використанням Зійтей ОКгайнгайоп Сей (Атісоп 8400, Міййроге) з 1КО мембранами РЕЗ5.
Ліофілізацію проводили з використанням швидкісного вакуумного концентратора (5сапореєей 40, Гаросепе). (00175) Приклад 3: Методика
І00176)| Обмен на ионообменной колонке
Готували колонку з сильною катіонообменной смолою РІМЕХ МЕС 210 з об'ємом колонки 200 мл (4,6 см х 12 см) і смолу промивали 1 М Маон і водою. Потім колонку врівноважували 1М розчином кожної солі, що представляє інтерес. В цілому в цих експериментах були приготовлені і використані вісім сольових розчинів 1М (Сасі», МосСіг, Васі», Сисі», 7пОі», АТС», Еесі», і Бесі»з).
Зо До колонки додавали 50 мл розчину іметелстата натрію з концентрацією 100 мг / мл.
І00177| У разі врівноважених стовпців СисСі», 7пСіг, АІСі», ЕГесі», і РесСіз агрегація іметелстата на смолі спостерігалася у верхній частині колонки, після того, як на колонку завантажувався іметелстат натрію. 00178) Коли колонки, врівноважували Сасіг, Масіг і Васі», сольові розчини, не приводили до будь-якої агрегації іметелстата на колонці, і іметелстат був витягнутий з елюата колонки, який спостерігався в вигляді каламутності З цих елюатів за допомогою центрифугування витягували дрібні порошки (4000 об/хв, 20 хв). Після центрифугування було підтверджено, що супернатант не містив іметелстата за допомогою ВЕРХ-аналізу. Це вказує на те, що осадження і виділення солей кальцію, магнію і барію іметелстата було успішно досягнуто.
І00179| Осадження
І00180| Кристалізацію і осадження двовалентних або тривалентних форм іметелстата досліджували з використанням великого надлишку неорганічних солей, що становлять інтерес (900 еквівалентів, вагова основа). Були приготовлені 1М розчини солі Сасіг, МосСі», Васіг, Сисіг, 7пбі», А1СІ», Еесі», і РесСіз. Три типу розчинів іметелстата: неочищений розчин іметелстата (солі амонію), очищена форма солі іметелстата (сіль трієтіламмонія (ТЕА)) і сіль іметелстат натрію (сіль Ма) змішувалися з кожним сольовим розчином.
ІЇ00181| Всі змішані розчини мали осад іметелстата, які були легко віддалялися фільтруванням за допомогою фільтрувального паперу Аймапіес 2. Це вказує на те, що осадження і виділення солей кальцію, магнію і барію іметелстата було успішно досягнуто.
І00182| Розчинність преципитатов, виділених в умовах надлишку реагентів солей були спочатку досліджені з використанням наступних розчинників: води, ацетонітрилу, метанолу, етанолу, ІРА (ізопропіловий спирту), 0,1 М Маон, 0,1 М НОЇ, 1 М Масі і ММР. 00183) Для солей, обложених у великому надлишку сольового реагенту, солі іметелстата кальцію, барію і магнію розчинний и в 0,1 М Маон їі 1 М розчині Масі (див. Таблицю 2).
Дослідження розчинності осаду іметелстата, отриманого з великого надлишку магнієвої солі, проводили в 1М розчинах Масі в різних концентраціях (від 2 мг до 6 мг / мл) і при різних умовах рН рН 8, 9, 10, 11, 12) ї аналізували з допомогою ВЕРХ (див. хроматограми на фіг.1). Було виявлено, що осад іметелстата розчиняється при 6 мг / млі рН 11 до рН 12. сполука також показало стабільність до рН 12 без будь-яких опадів (рис. 1). бо І00184| Розчинність
00185) від 30 до 50 еквівалентів солей 00186) Кількість еквівалентів сольових реагентів, що становлять інтерес, які могли б досягти повного осадження іметелсата, досліджували шляхом додавання розчину солі.
Повноцінне утворення осаду спостерігалося в діапазоні від 7 до 50 еквівалентів доданого сольового реагенту для восьми солей, перерахованих в таблиці 3. У міру додавання більшої кількості еквівалентів сольових реагентів для всіх солей спостерігалася тенденція до утворення гелю з преципітатом.
І00187| Були використані три типи розчинів іметелстата: неочищений іметелстат амоній (неочищена форма), іметелстаттріетіламмоній (очищена форма солі ТЕА) і іметелстат натрію (сіль Ма) і були змішані з кожним розчином солі. Амонієвих сіль іметелстата використовували або в розчині МНАОН або у водяному розчині. Для отримання повного осадження розчини іметелстат амонію і іметелстат ТЕА було необхідно приблизно 50 еквівалентів або 30 еквівалентів реагенту Ма солі, відповідно. 00188) Розчинність преципитатов, що утворилися з розчину іметелстат ТЕА їі розчину іметелстата амонію, досліджувалася при різних умовах рН від рН 8 до рнН 12. Після виходу зі змішаних розчинів протягом б годин при кімнатній температурі розчинність преципитатов іметелстата магнію аналізували за допомогою УФ-поглинання при 260 нм . Обидва осаду, отримані з іметелстат амонію і іметелстат ТЕА, показали подібну тенденцію в тому, що більше солі іметелстата розчинялося в 1М розчині масі при високому рН (див. Таблицю 3).
І00189| Цей результат свідчить про те, що, коли контролюється кількість еквівалентів сольового реагенту, що представляє інтерес, повне осадження солі іметелстата може бути досягнуто будь-яким зручним способом для отримання осаду, який може бути повторно розчинений. (00190) 5 еквівалентів розчинів солей
І00191| Розчин іметелстата натрію (100 мг в 1 мл води) змішували з 5 еквівалентами восьми сольових реагентів, і кожен розчин знесолювальних ультрафильтрацией з використанням
Бійтей ШкКгайнганйоп Сей ї 1КО-мембрани. Потім відфільтрований розчин ліофілізували.
Отриманий порошок аналізували на вміст Ма і кожного представляє інтерес протівоїона за допомогою Біате АА (атомно-абсорбційної спектроскопії). Як показано на фігурі 2 і 3,
Зо найбільший вміст протиіонов становило 1,1 мас. 95 Для 2п, АЇ ії Мод, причому зміст Ма становило 2,6, 1,7 і 2,695 відповідно.
І001921 від 6 до 9 еквівалентів розчинів солей 00193) Додавали від 6 до 9 еквівалентів реагенту з магнієвої солі в розчин іметелстата натрію, і подальша ультрафільтрація і лиофилизация забезпечували твердий продукт, який повністю розчинявся у воді. Було проведено аналіз змісту натрію і магнію (див. Результати на фігурі 3). Додавання дев'яти еквівалентів МОоСіг до розчину іметелстата натрію давало композицію, в якій вміст протиїонов Ма і Мод становить 1,1 і 1,2 мас. 95, Відповідно.
І00194| від 1 до 10 еквівалентів розчинів солей 00195) Щоб дослідити обмін Му з ТЕА-протиіїонами в солі іметелстат ТЕА в порівнянні з сіллю іметелстат натрію, був виконаний інший експеримент. Від одного до десяти еквівалентів
МасСіг в водних розчинах змішували з розчином солі іметелстат ТЕА (чистота 590965 за допомогою ВЕРХ). Аналіз змісту протівоїбна Мо проводили після ультрафільтрації та ліофілізації. Результати показані на фігурі 4. Додавання до 10 еквівалентів реагенту МоСіг2 дає композицію, що має 1,6 95 Ма по масі.
І00196)| Приклад 4: Висновок
ІЇ00197| Було досягнуто отримання двовалентних і тривалентних сольових форм іметелстата, включаючи кальцій, магній, цинк, алюміній, барій, залізо (ІІ), залізо (ІІ) і солі міді.
Коли використовували контрольований надлишок обраних неорганічних сольових реагентів (див. Таблицю 2 і 3) для осадження полінуклеотида, утворювалися преципітати, які згодом могли бути повторно розчинені і які показали підвищену чистоту щодо швидких елюіруются домішок з використанням ВЕРХ-аналізу. 00198) Використання магнієвої солі призводило до утворення розчинної твердого осаду іметелстата після стадії іонного обміну. Отримували опади, які досягали 1,2 мас. 95 Магнієвого протівоїона щодо 1,1 мас. 95 Протівоіїона натрію.
Ї00199| Осадження іметелстата з використанням двовалентних або тривалентних солей забезпечувало видалення нецільових продуктів і реагентів синтезу, які залишалися в розчині.
Видалення таких домішок, присутніх в неочищених розчинах іметелстата, дає кілька переваг для наступних етапів очищення, таких як зниження завантаження колон, покращує роздільну здатність, зменшення кількості етапів очищення і поліпшення терміну служби бо хроматографических колонок, зниження витрат на очищення і збільшення швидкості очищення.
Таблиця 1
Неорганічні солі, органічні розчинники та інші матеріали
Формула . . СасСі»-гнНгО о
Дигідрат хлорида кальція МВ 147.01 . . МасіІо-НгО о . . ВасСі»-гнНгО о
Дигідрат хпорида барія (МВ 244.26) . СисСІ»-2гнгоО о
Дигідрат хлорида купрумац) МВ 170.48 7 пс Ге) ! с. А1СІз-НгО о . . ЕРеСіІ»-АНгО о
Тетрагідрат хлорида залізац(і!) МВ 198.81 , , ЕРесСіз-БНгО о,
Гексагідрат хлорида заліза (11!) МВ 270.30 . масі
Таблиця 2
О: Так, Х: Ні, значить не проводили й Дослідження
Натрій (форма Проходження
Ма, 100 мг/мл) в колонці х х х х х
Преципитація в
Іонообмінна розчині після елюювання смола я я
Фільтрація Х Х Х преципітатів
Розчинність 7 у ххх, 11:11.
ШТ дове (91915199 925
Ма, І00 мг/мл фільтровані 77777 7 |Розчинність"осаду)| Х | Х | Х | х | х | х | х | х
Розчинність осаду о |Мимеи|о|о|о|х|х|х|х| х ен» оешнн | Шшшен (91919199 99 о (00 ц 35 мг/мл фільтровані осаду
Розчинність осаду о |Мимшои|о|о|х|х|х|х|х| х
Постав ШАНС НС НС СТ СТ СТ НС НС в МНАОН фільтровані 77771717 |Позчинність"осаду| Х | Х | х | - | - | - | - | - "Досліджували в в ацетонітрилі, метанолі, етанолі, ІРА, воді, ММР, 1 М НОСІ, 1 М масі, 1 м Ммаон "к Досліджували в в ацетонітрилі, метанолі, етанолі, ІРА, воді, ММР, 1 М НС, 1 М масі
Таблиця З 9151121 7 | 50 | 50 | то | п
С квіваленти й Неочищений неорганічних тонн ЕН ен 1111111 роженя | 1») 11111 розчинення Ко) в воде
Розчинністьв М | Тед р'етелотат Маню рн рне рн рнії рніг
Масі (1 мл) (Після 64 годин) 280пП 310пП 700Пп 2900П 4340пП 11116 певемю б То ох ою Веб, в воді бмг (Після 6 годин 10О0П 70ПпП 170П 1110пП 377 0пП
І00200| Незалежно від прикладеної формули винаходу, винахід, викладений в даному документі, також визначається наступними пунктами: 002011 1. Спосіб отримання полінуклеотида, що включає: приведення в контакт першої полінуклеотидної композиції, що містить: полінуклеотид, що має послідовність з 7 або більш нуклеозидних субодиниць, в якому щонайменше дві з нуклеозидних субодиниць пов'язані М3'-»РЕб тіофосфорамідатним міжсубодиничним зв'язком; і нецільові синтетичні продукти і реагенти; з полівалентною катіоною сіллю для осадження першої солі полінуклеотида, що містить щонайменше один полівалентний катіонний протиїіон; і відділення першої солі полінуклеотида від контактующої першої полінуклеотидної композиції для отримання другої полінуклеотидної композиції, що містить першу сіль полінуклеотида. (00202) 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що він додатково включає:приведення в контакт першої солі полінуклеотида з носієм хроматографії зверненої фази;ї елюювання з цього хроматографічного носія третьої полінуклеотидної композиції, що містить другу сіль полінуклеотида. (00203) 3. Спосіб за будь-яким з пп. 1-2, який відрізняється тим, що полінуклеотид містить послідовність, що містить 13 або більше нуклеозидних субодиниць, комплементарних РНК- компоненту теломерази людини. (00204) 4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, який відрізняється тим, що полінуклеотид містить від 10 до 50 суміжних нуклеозидних субодиниць, комплементарних РНК-компоненту теломерази людини. 00205) 5. Спосіб за будь-яким з пп. 3-4, який відрізняється тим, що нуклеозидні субодиниці, комплементарні РНК-компоненту теломерази людини, з'єднані між собою міжсубодиничними
М3 - РЕ" тіофосфорамідатними зв'язками. (00206) 6. Спосіб за будь-яким з пп. 1-5, який відрізняється тим, що полінуклеотид містить послідовність, вибрану з групи, що складається з: СТТАСОСТТАС (5ЕО ІЮО МО: 4),
Зо тТА,астТТАСАСАА (5ЕО ІО МО: 3) і САСТТАСОСТТАС (ЗЕО ІЮ МО: 5).
І00207| 7. Спосіб за будь-яким з пп. 1-6, який відрізняється тим, що полінуклеотид кон'югований з ліпідним фрагментом через опціональний лінкер.
І00208| 8. Спосіб за будь-яким з пп. 2-7, який відрізняється тим, що друга сіль полінуклеотида має структуру:
о - ва о С
Ве. о ц Мою є КУ че ан і зі. фр мн берто ка; їж о ме М. й Ве Ю Ан, / з КУ о ); ня ре у Варто З мен, ( о - Геї
Вей.о- о, ММА МНЬ ? 5-й ( зе
Вет-о-і МО ль Чо Дике; не зр в-во; вимо воля ун : м ; й ер
Варто ож о о ' мое екн них
Верооя дух Мне
ОК 7 МН
Мн щі Ь й "М дей-0 у ще) з -ш ; МН. -- Ки ян вето о мо о Й ї
ЩА Що
Я-вин М
З Є й м,
М. че ще се
Те школ її (МУ) де кожен Ме незалежно являє собою водень або катіонний протиіон, кожен х незалежно являє собою 1, 2 або З і п являє собою ціле число від 5 до 13. (002091 9. Спосіб за будь-яким з пп. 2-8, який відрізняється тим, що друга полінуклеотидна сіль являє собою фармацевтично прийнятну сіль полінуклеотида. 00210) 10. Спосіб за будь-яким з пп. 2-9, який відрізняється тим, що друга полінуклеотидна сіль являє собою одновалентну катіонну сіль полінуклеотида. (00211) 11. Спосіб за будь-яким з пп. 2-10, який відрізняється тим, що друга полінуклеотидна сіль являє собою натрієву сіль полінуклеотида. (00212) 12. Спосіб за будь-яким з пп. 1-5, який відрізняється тим, що він додатково включає відщеплення полінуклеотида від носія для отримання першої полінуклеотидної композиції. (00213) 13. Спосіб за будь-яким з пп. 1-12, який відрізняється тим, що перша композиція містить одновалентну катіонну сіль полінуклеотида. (00214) 14. Спосіб за будь-яким з пп. 1-13, який відрізняється тим, що етап контактування включає елюювання першої полінуклеотидної композиції з катіонообмінного носія. 00215) 15. Спосіб за будь-яким з пп. 1-14, який відрізняється тим, що етап розділу включає центрифугування контактуючої першої полінуклеотидної композиції для осадження солі полінуклеотида. (00216) 16. Спосіб за будь-яким з пп. 1-15, який відрізняється тим, що етап розділу включає фільтрацію солі полінуклеотида з контактуючого першого полінуклеотида. (00217) 17. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що друга полінуклеотидна композиція завантажується безпосередньо на носій хроматографії зверненої фази.
(00218) 18. Спосіб за будь-яким з пп. 1-17, який відрізняється тим, що він додатково включає розчинення другої полінуклеотидної композиції в розчиннику. (00219) 19. Спосіб за будь-яким з пп. 1-18, який відрізняється тим, що щонайменше один полівалентний катіонний протиїон є двовалентним. (00220) 20. Спосіб за п. 19, який відрізняється тим, що щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон вибраний з групи, що складається з магнію, цинку і кальцію. (002211) 21. Спосіб за будь-яким з пп. 1-18, який відрізняється тим, що щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон є тривалентним. (00222) 22. Спосіб за п. 21, який відрізняється тим, що щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон представляє собою алюміній. (00223) 23. Спосіб за будь-яким з пп. 1-22, який відрізняється тим, що сіль полінуклеотида додатково містить одновалентний катіонний протиїіон. (00224) 24. Композиція, що містить: сіль полінуклеотида, що містить щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон;ьпричому полінуклеотид має послідовність з 7 або більш нуклеозидних субодиниць, комплементарних РНК-компоненту теломерази людини, (4 щонайменше дві з нуклеозидних субодиниць з'єднані між собою міжсубодиничним МЗ "- Ре" тіофосфорамідатним зв'язком. (00225) 25. Композиція за п. 24, яка відрізняється тим, що щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон є двовалентним. (00226) 26. Композиція за п. 25, яка відрізняється тим, що щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон вибраний з групи, що складається з магнію, цинку і кальцію. (00227) 27. Композиція за будь-яким з пп. 24-26, яка відрізняється тим, що щонайменше один полівалентний катіонний протиіон представляє собою магній. (00228) 28. Композиція за п. 24, яка відрізняється тим, що щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон є тривалентним. (00229) 29. Композиція за п. 28, яка відрізняється тим, що щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон представляє собою алюміній. (00230) 30. Композиція за будь-яким з пп. 24-29, яка відрізняється тим, що полінуклеотид містить З мол.У5 або більше полівалентного катіонного протиїона по відношенню до поліаніонного скелета полінуклеотида. (00231) 31. Композиція за будь-яким з пп. 24-29, яка відрізняється тим, що полінуклеотид містить 1,095 по масі або більше полівалентного катіонного протиїбна по відношенню до полінуклеотиду.
І00232| 32. Композиція за будь-яким з пп. 24-31, яка відрізняється тим, що композиція представляє собою осад. (00233) 33. Композиція за будь-яким з пп. 24-32, яка відрізняється тим, що полінуклеотид містить послідовність, що містить 13 або більше нуклеозидних субодиниць, комплементарних
РНК-компоненту теломерази людини. (00234) 34. Композиція за будь-яким з пп. 24-33, яка відрізняється тим, що полінуклеотид містить від 10 до 50 суміжних нуклеозидних субодиниць, комплементарних РНК-компоненту теломерази людини.
І00235| 35. Композиція за будь-яким з пп. 24-34, яка відрізняється тим, що нуклеозидні субодиниці, комплементарні до РНК-компоненту теломерази людини, з'єднані між собою міжсубодиничними М3"-- Р5' тіофосфорамідатними зв'язками. (00236) 36. Композиція за будь-яким з пп. 24-35, яка відрізняється тим, що полінуклеотид містить послідовність, вибрану з групи, що складається з: СТТАСОСТТАСс (5ЕО ІЮ МО: 4), тТА,астТТАСАСАА (5ЕО ІО МО: 3) і САСТТАСОСТТАС (ЗЕО ІЮ МО: 5). (00237) 37. Композиція за будь-яким з пп. 24-36, яка відрізняється тим, що полінуклеотид кон'югований з ліпідним фрагментом через опціональний лінкер. (00238) 38. Композиція за будь-яким з пп. 24-37, яка відрізняється тим, що полінуклеотид має структуру:
о . - ве омН
РИ Ко в-во ом а К Я МН» -В.. Кар н в ро в. м з о- ! м. ен ни роде ї і
ВР.О- зе, о к-- Е. ня рев в-в-о- о. Мен, 8-7 о й порт в-во о М -ма, ее Ду; і неотрн
Вероні ОМ зО о -- о
НА тре
Ван о мо в іч 2 Мн, мо фр во ов М о ее Лич
М. сив
ЗРиО р ММ Мн о К Я Мін» нії га
Вей:О- о. М м?
З іх ДИ: ян Сх
В-во оо
Кт рш
М мн дм
ВейоО о «Де о» ДИ
М
МН ; я в-во о, Мел ав;
ХА
Мне (М п де кожен Ме незалежно являє собою катіонний протиіон, кожен х являє собою 1, 2 або Зіп дорівнює 5 до 12.
Ї00239| Хоча вищенаведене винахід був описаний досить докладно за допомогою ілюстрацій і прикладів з метою ясності розуміння, фахівцям в даній області має бути очевидно, що в рамках ідей даного винаходу можуть бути здійснені певні зміни і модифікації без відхилення від суті і обсягу прикладеної формули винаходу.
І00240| Таким чином, наведене вище всього лише ілюструє принципи винаходу. Слід зазначити, що фахівці в даній області техніки можуть розробити різні схеми, які, хоча окремо не описані і не показані в даному документі, втілюють собою принципи винаходу і знаходяться в рамках його сутності та обсягу. Крім того, всі приклади і умовні конструкції, які використовуються в даному документі, призначені, головним чином, для того, щоб допомогти читачеві зрозуміти принципи винаходу і напрямки досліджень, в які дослідники внесли вклад для розвитку області техніки, і їх не слід тлумачити, як обмежують до таких конкретно зазначених прикладів і умов. Більш того, передбачається, що всі заявлені в даному документі принципи, аспекти та варіанти реалізації винаходу, а також конкретні їх приклади, охоплюють їх структурні і функціональні еквіваленти. Додатково передбачається, що такі еквіваленти включають як еквіваленти, відомі зараз, так і еквіваленти, які будуть розроблені в майбутньому, тобто будь-які розроблені елементи, які виконують такі ж функції, незалежно від структури. Тому передбачається, що даний винахід не обмежена ілюстративними варіантами реалізації, представленими і описаними в даному документі. Обсяг і сутність даного винаходу швидше визначається додається формулою винаходу. Всі можливі комбінації зазначених вище варіантів реалізації вважаються вхідними в обсяг даного винаходу.
ПЕВЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«ЗМО» бегоп Согрогатоп
Ватіуз, Вгешспапігап 8, «1802 СПОСОБИ ОТРИМАННЯ ПОЛІМУКЛЕОТИДІЯ З ВИКОРИСТАННЯМ
КОМПОЗИЦІЙ СОЛЕЙ ПОЛІВАЛЕНТНИХ КАТІОНІВ
«130» 1557002 «150х це в52/151, 8 «151: 7035-98-23 «60» 23 «170» КаБТЯЕО для зт версії 4,0 кі «2 431 кфійх вНК І «ії» Штучна послідовність клад» 2, «23» Синтетичний олігонуклеотид «002 дасчизсядя поЗнадаєси зоавододує дубоссацни визмаисуавє ссизасичадц 90 задпзслива Зсассойасе чишснсссс пдсзсосУдни ввисисасьой зсувиасвоса МО цасудаазаз ссикадскма ссасеносса ссачискавис завзоасвзаає зайзяазициє 380 адсчуукчвос седчмисассс смессдооа семосецсоа зисоссчоасс сзвасесссєда 24 зссссдссчу зайпоссясова зсодсссдаз ясвнсиссоа задсасссве поссвссоаса ЗО зазадциоцо сисчодисадс сЯсозадиснс нспоаасза зЗасоаводии «ауєсиниє 3650 зодссосзоЗо запазузвася паасцаисс ссосЯсосЗя сесзависсс позясиднаЗ 920 засвнюювюасс сзузасисоз сисасвсаи с 451 «10 2 «ії» 30 «12» ДУК «?іЗ» Штучна послідовність кед» Й й «аЗ» Сдимтетичний олігонуклеотид «кА г
Встстадзат заасзатоза зЗзасоосадо за «Ем З «їх 3 «412» ДИК «13» Штучна послідовність «ВІЙ» й , «223» Синтетичний олігонуклеотид «00» 3 тзвовастаза са 13 «3305 4 «211» 31 кеїї» ДНК «й13х» штучна послідовність «Вей «еа3» Синтетичний слігонуклеотид «НН» Я чесазозЗасса З 1 «2305 5 «фіїх 13 «12» ДИК й й «?іЗх штучна послідовність «ех «223» Синтетичний олігонуклевтид «АЙ» 5 скавттзЗа 55 13 «810» Б «11» 15 «12» ДНК . «РіЗ» ЩтУчна послідовність кагУ й «823» сСентатичний олігонуклеотид «400» 6 , дсдозазесо посада 15 «10» «іі» 13 «212» ДНК «йі3» Штучна послідовність «ех «г23» Синтетячняй олігонукластид «05 7 зозавасовє 399 ІЗ 2» 8 «23 13 кій» ДК «533» Штучна послідовність «Кай «223х Синтетичний олігонукластид «00» 5 псодззвадсо са із «20» З «М М «оз ДНК «813» штучна послідовність «ЗА «233» Синтетичний оліговуклаотид, «00х 9 якодзаяосЯ 95 її
Ф2Мме 30 «аїїх 13 «2312» ДНК й «аїїх Штучна послідовність кадОх «223» Синтетичний олігомуклестид «ЙО» 10 й свасудаваа са 5
«из п «231» 13 хаїй» ДНК , «ії» Штучна послідовність хвабх «223» Синтетичний олігонуклевтид «вп» асозізоаза со Аз «ЯМ 12 «їх 16 «ій» ДНК І Й «213» Штучна послідовність «вайх «йа3» Синтетичний аліганукластид «НО» 19 засада засос 16 «ЕМ» 13 «і» 18 «вій ДНК й й «813з Штучна послідовність «020» ше «?йаЗ» Синтетичний болігонуклеотид «ОО» 13 зхозасзато зааоас99 18 хіх 18 «їі» 20 к2зях ДНЕ хиїї» Штучна послідовність «ва» «223» Синтетичний олігонуклевстид «а» 14 всасєттстто сЕсдстссад 29 «М 19 «її» 13 «812» ДНК «2і3» Штучна послідовність каб» «йй3» Синтетичний олігонуклевтид «400» 35 Щ тазцоцІїзЗа сда 13 «10» 16 «іх 1 «212» ДИК «Рії» Штучна послідовність «вах Й «823» Сяктетичняи олігочуклаватид «400» 16 І зетацуаста а ка «Мі» 17 «їі 13
«212м ДНК й , «ії» Штучна послідовність «820» й «23» Синтетичний олігоцуклевтид «НЮ» 19 й чісаозвіта пас 13 «ій» 16 «гії» 15 «122 ДНК , й «Кі3» Штучна послідовність «квеО» «ВИЗ» Синтетичний олігонуклеотид «НИ» 18 ястадзоїса дакай їв «2» 18 чиї» «210» ДНК «213» штучма васлідовність «0» , «233» смитетичний олігонуклеотид «ак 15 кесЕкстсац ТЕ п «ах 20 «М» 2 «й12» ДНК , «ійх Штучна послідовність «0» й «Ве3» Синтетичний олігонуклеотид «ай» 59 сасссттстк 85 13 ка» 21 «і» З «212» ДНК й «213» Штучна поспідовність «80» , «243» Синтетичний олігонуклвотид «0» 21 чозставдаєс З «а» 24 «и» Я «З1ійх ДНК . «213» Штучна послідовність «а «223у Синтетичний злігонуклейтид «ВО» 22 саоєхаЗоЯ З «2302 33 «21і» 1Х «Кфй» НК І І «233» Штучна послідовність «2202 «243» Синтетичний олігонуклеотид «4005 23 совассєрва с 1

Claims (40)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб отримання полінуклеотиду, що включає: а) приведення в контакт першої полінуклеотидної композиції з полівалентною катіонною сіллю для осадження першої солі полінуклеотиду; і р) відділення першої солі полінуклеотиду від згаданої першої полінуклеотидної композиції для отримання другої полінуклеотидної композиції, що містить першу сіль полінуклеотиду; причому згадана полінуклеотидна композиція містить: () полінуклеотид, що має послідовність з 7 або більше нуклеозидних субодиниць, при цьому щонайменше дві з цих нуклеозидних субодиниць зв'язані М3'-Р5 тіофосфорамідатним міжсубодиничним зв'язком; і (ії) розчинні нецільові синтетичні продукти і реагенти; с) приведення в контакт другої полінуклеотидної композиції з етапу Б) з носієм хроматографії з оберненою фазою; і 4) елюювання з цього носія хроматографії з оберненою фазою третьої полінуклеотидної композиції, що містить другу розчинну сіль полінуклеотиду.
2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що нуклеозидні субодиниці з'єднані між собою міжсубодиничними зв'язками, кожний з яких незалежно вибраний з М3'-Р5' міжсубодиничних тіофосфорамідатних зв'язків та М3'-РО" міжсубодиничних фосфорамідатних зв'язків.
3. Спосіб за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що полінуклеотид описаний формулою (1): шко, Сов; нм в чи 4 ра о В (о) НІ МО ві (0) де: кожен В незалежно являє собою пурин, захищений пурин, піримідин або захищений піримідин, або їх аналог; кожен Х незалежно являє собою кисень або сірку; кожен КЗ незалежно являє собою водень, фтор, гідроксил, алкокси, заміщений алкокси або захищений гідроксил; Ве являє собою аміно, гідроксил, захищений аміно, захищений гідроксил, -0О-1-2 або -МН-Т-27; кожен Т незалежно являє собою необов'язковий лінкер; кожен 2 незалежно являє собою Н, ліпід, носій, олігонуклеотид, полімер, поліпептид, мітку, що виявляється, або маркер; і п являє собою ціле число від 7 до 100.
4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, який відрізняється тим, що полінуклеотид містить послідовність, що містить 13 або більше нуклеозидних субодиниць, комплементарних РНК- компоненту теломерази людини.
5. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, який відрізняється тим, що полінуклеотид містить від 10 до 50 суміжних нуклеозидних субодиниць, комплементарних РНК-компоненту теломерази людини.
6. Спосіб за будь-яким з пп. 1-5, який відрізняється тим, що нуклеозидні субодиниці з'єднані між собою М3'-Р5' міжсубодиничними тіофосфорамідатними зв'язками.
7. Спосіб за будь-яким з пп. 1-6, який відрізняється тим, що полінуклеотид містить послідовність, вибрану з групи, що складається з: СТТАСОоСТТАС (5БЕО ІЮО МО4), ТАСОСТТАСАСАА (5ЕО ІО МО:3) Її САСТТАСОСТТАС (5ЕО ІО МО:5).
8. Спосіб за будь-яким з пп. 1-7, який відрізняється тим, що полінуклеотид кон'югований з ліпідним фрагментом через необов'язковий лінкер.
9. Спосіб за будь-яким з пп. 1-8, який відрізняється тим, що друга сіль полінуклеотиду має структуру: рен в - кни дей-о-у фр о -е8 ; мне у МК. нь -он ВН ик 2 баг О їй м Щк 8 і: кн йк 2: тя с т ше В; ни ет що м Верес др МОЗМ ВНУ г о р» З У Меч ; Зейооу ву МОЮ. у аз окули о ні могнн ; Бей-сюя б ин, : ин г З 5-й у не 7ф ще Ятямя остео о К- Шк Ні ни шк дяк ОВО в - ММ
М. обу а ЗВ
Ваг. до З й о ; я ям «ї Гм КН г) МзщеьмНн. а Мч Мей що ср Шемосья що М, а Дек а ЧК Бя мн Ех Дав г стае У, Че МА. ща дин ес гої К- диеці чн ноту яр доме в я й іх й (М), де кожен МУ незалежно являє собою водень або катіонний протиїон, кожен х незалежно являє собою 1, 2 або З і п являє собою ціле число від 5 до 13.
10. Спосіб за будь-яким з пп. 1-9, який відрізняється тим, що після етапу 4) елюювання друга сіль полінуклеотиду являє собою фармацевтично прийнятну сіль полінуклеотиду.
11. Спосіб за будь-яким з пп. 1-10, який відрізняється тим, що після етапу 4) елюювання друга сіль полінуклеотиду являє собою одновалентну катіонну сіль полінуклеотиду.
12. Спосіб за будь-яким з пп. 1-11, який відрізняється тим, що після етапу 4) елюювання друга сіль полінуклеотиду являє собою натрієву сіль полінуклеотиду.
13. Спосіб за будь-яким з пп. 1-12, який відрізняється тим, що він додатково включає, перед етапом а) приведення в контакт, відщеплення полінуклеотиду від підкладки твердофазного синтезу для отримання першої полінуклеотидної композиції як неочищеного синтетичного препарату полінуклеотиду.
14. Спосіб за будь-яким з пп. 1-13, який відрізняється тим, що перед етапом а) приведення в контакт перша полінуклеотидна композиція містить одновалентну катіонну сіль полінуклеотиду.
15. Спосіб за будь-яким з пп. 1-14, який відрізняється тим, що етап а) приведення в контакт включає завантаження та елюювання першої полінуклеотидної композиції з катіонообмінного носія.
16. Спосіб за будь-яким з пп. 1-15, який відрізняється тим, що етап Б) відділення включає центрифугування контактуючої першої полінуклеотидної композиції для осадження осаду першої солі полінуклеотиду.
17. Спосіб за будь-яким з пп. 1-16, який відрізняється тим, що етап Б) відділення включає фільтрацію першої солі полінуклеотиду з контактуючої першої полінуклеотидної композиції.
18. Спосіб за будь-яким з пп. 1-17, який відрізняється тим, що друга полінуклеотидна композиція етапу р) завантажується безпосередньо на носій хроматографії з оберненою фазою.
19. Спосіб за будь-яким з пп. 1-18, який відрізняється тим, що він додатково включає, перед етапом с) приведення в контакт, розчинення другої полінуклеотидної композиції в розчиннику.
20. Спосіб за будь-яким з пп. 1-19, який відрізняється тим, що щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон є двовалентним.
21. Спосіб за п. 20, який відрізняється тим, що щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон вибраний з групи, що складається з магнію, цинку і кальцію.
22. Спосіб за будь-яким з пп. 1-19, який відрізняється тим, що щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон є тривалентним.
23. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон являє собою алюміній.
24. Спосіб за будь-яким з пп. 1-23, який відрізняється тим, що перша сіль полінуклеотиду додатково містить одновалентний катіонний протиїіон.
25. Композиція, що містить: осад солі полінуклеотиду, що містить щонайменше один полівалентний катіонний протиїіон; причому полінуклеотид має послідовність з 7 або більше нуклеозидних субодиниць, і щонайменше дві з цих нуклеозидних субодиниць з'єднані між собою М3'-Р5"' міжсубодиничним тіофосфорамідатним зв'язком.
26. Композиція за п. 25, яка відрізняється тим, що щонайменше один полівалентний катіонний протиїон є двовалентним.
27. Композиція за п. 26, яка відрізняється тим, що щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон вибраний з групи, що складається з магнію, цинку і кальцію.
28. Композиція за будь-яким з пп. 25-27, яка відрізняється тим, що щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон являє собою магній.
29. Композиція за п. 25, яка відрізняється тим, що щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон є тривалентним.
30. Композиція за п. 29, яка відрізняється тим, що щонайменше один полівалентний катіонний протиіїон являє собою алюміній.
31. Композиція за будь-яким з пп. 25-30, яка відрізняється тим, що сіль полінуклеотиду містить З мол. 95 або більше полівалентного катіонного протиїіона.
32. Композиція за будь-яким з пп. 25-30, яка відрізняється тим, що сіль полінуклеотиду містить 1,0 95 по масі або більше полівалентного катіонного протиіона.
33. Композиція за будь-яким з пп. 25-32, яка відрізняється тим, що композиція являє собою осад.
34. Композиція за будь-яким з пп. 25-33, яка відрізняється тим, що полінуклеотид описаний формулою (1):
шко, о З Ко х 2 та о в о в " КО р (0) в якій: кожен В незалежно являє собою пурин, захищений пурин, піримідин або захищений піримідин, або їх аналог; кожен Х незалежно являє собою кисень або сірку; кожен КЗ незалежно являє собою водень, фтор, гідроксил, алкокси, заміщений алкокси або захищений гідроксил; Ве являє собою аміно, гідроксил, захищений аміно, захищений гідроксил, -О-1-72 або -МН-Т-7; кожен Т незалежно являє собою необов'язковий лінкер; кожен 2 незалежно являє собою Н, ліпід, носій, олігонуклеотид, полімер, поліпептид, мітку, що виявляється, або маркер; і п являє собою ціле число від 7 до 100.
35. Композиція за будь-яким з пп. 25-34, яка відрізняється тим, що полінуклеотид містить послідовність, що містить 13 або більше нуклеозидних субодиниць, комплементарних РНК- компоненту теломерази людини.
36. Композиція за будь-яким з пп. 25-35, яка відрізняється тим, що полінуклеотид містить від 10 до 50 суміжних нуклеозидних субодиниць, комплементарних РНК-компоненту теломерази людини.
37. Композиція за будь-яким з пп. 25-36, яка відрізняється тим, що нуклеозидні субодиниці з'єднані між собою М3'-Р5' міжсубодиничними тіофосфорамідатними зв'язками.
38. Композиція за будь-яким з пп. 25-37, яка відрізняється тим, що полінуклеотид містить послідовність, вибрану з групи, що складається 3з: СТТАСОСТТАс (5БО ІЮ МО:4), ТАСОСТТАСАСАА (5ЕО ІЮ МО:3) і САСТТАОСОСТТАС (5ЕО ІЮО МО:5).
39. Композиція за будь-яким з пп. 25-38, яка відрізняється тим, що 5- або 3'-кінець полінуклеотиду кон'югований з ліпідним фрагментом через необов'язковий лінкер.
40. Композиція за будь-яким з пп. 25-39, яка відрізняється тим, що полінуклеотид має структуру:
з - «Км С І й дет; дих о п. МН Ей Щщ М Як Мора не - ще і: в и у Бей до МЕН, нн ЛИ; У ойОся ду Мне юн, ( воду 5 « ня г ем ( дейоні о, Мн, ЕІ Й ні Га ( ї зн у не трон дерякя домо Ка: С Шк г неї нм п
Веб. ас по ге Се іх Мн. вн ие Вйесня ВМО 7 сонна че Ф Ку м. Ак не З ЩІ бе. о МНН. ре із 7 Мн ЩА М ла в Є й і тих, М мн, ї; Як: воли
Шк. о а га Се к Ме. 1 щі мн ЕОР баром З Ки: НД са - й мн, КЕ Мом що Мне (Му де кожен М незалежно являє собою катіонний протиїон, кожен х являє собою 1, 2 або Зі п дорівнює від 5 до 12.
UAA201708890A 2015-04-23 2016-04-21 Способи отримання полінуклеотидів з використанням композицій солей полівалентних катіонів UA124521C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562151891P 2015-04-23 2015-04-23
PCT/US2016/028657 WO2016172346A1 (en) 2015-04-23 2016-04-21 Methods of polynucleotide preparation using multivalent cation salt compositions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA124521C2 true UA124521C2 (uk) 2021-10-05

Family

ID=55911083

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201708890A UA124521C2 (uk) 2015-04-23 2016-04-21 Способи отримання полінуклеотидів з використанням композицій солей полівалентних катіонів

Country Status (36)

Country Link
US (2) US10745687B2 (uk)
EP (1) EP3286203B1 (uk)
JP (4) JP2018513127A (uk)
KR (1) KR102401252B1 (uk)
CN (2) CN107429247B (uk)
AU (2) AU2016250576C1 (uk)
BR (1) BR112017019627B1 (uk)
CA (1) CA2978191C (uk)
CL (1) CL2017002314A1 (uk)
CO (1) CO2017009217A2 (uk)
CY (1) CY1123197T1 (uk)
DK (1) DK3286203T3 (uk)
EA (1) EA035885B1 (uk)
ES (1) ES2798270T3 (uk)
HR (1) HRP20201218T1 (uk)
HU (1) HUE051148T2 (uk)
IL (1) IL254222A0 (uk)
LT (1) LT3286203T (uk)
MA (2) MA42569B1 (uk)
MD (1) MD3286203T2 (uk)
ME (1) ME03811B (uk)
MX (1) MX383293B (uk)
MY (1) MY187804A (uk)
PE (2) PE20221275A1 (uk)
PH (1) PH12017501927B1 (uk)
PT (1) PT3286203T (uk)
RS (1) RS60645B1 (uk)
SA (1) SA517390103B1 (uk)
SG (2) SG10201909816PA (uk)
SI (1) SI3286203T1 (uk)
SM (1) SMT202000389T1 (uk)
TN (1) TN2017000411A1 (uk)
TW (1) TWI736532B (uk)
UA (1) UA124521C2 (uk)
WO (1) WO2016172346A1 (uk)
ZA (1) ZA201706041B (uk)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2016250576C1 (en) 2015-04-23 2021-05-06 Geron Corporation Methods of polynucleotide preparation using multivalent cation salt compositions
EP3364949A4 (en) 2015-10-22 2019-07-31 ModernaTX, Inc. CANCER VACCINES
WO2018111967A1 (en) 2016-12-13 2018-06-21 Modernatx, Inc. Rna affinity purification
EP3554556B1 (en) 2016-12-19 2022-03-09 Ventana Medical Systems, Inc. Peptide nucleic acid conjugates
WO2019036683A1 (en) * 2017-08-18 2019-02-21 Modernatx, Inc. ANALYTICAL METHODS BY HPLC
WO2019060522A2 (en) * 2017-09-22 2019-03-28 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate OLIGONUCLEOTIDES THIOMORPHOLINO FOR THE TREATMENT OF MUSCLE DYSTROPHY
CN111491667A (zh) * 2017-12-18 2020-08-04 文塔纳医疗系统公司 肽核酸缀合物

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4046720A (en) 1974-01-17 1977-09-06 California Institute Of Technology Crosslinked, porous, polyacrylate beads
US4413070A (en) 1981-03-30 1983-11-01 California Institute Of Technology Polyacrolein microspheres
US4678814A (en) 1981-03-30 1987-07-07 California Institute Of Technology Polyacrolein microspheres
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US4659774A (en) 1985-11-01 1987-04-21 American Hoechst Corporation Support for solid-phase oligonucleotide synthesis
DE69120821T2 (de) 1990-08-31 1997-01-23 The Regents Of The University Of Minnesota, Minneapolis, Minn. Polyethylenglykol-Derivate für Festphasenanwendungen
US5281701A (en) 1991-07-12 1994-01-25 Applied Biosystems, Inc. Process and compounds for RNA synthesis
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
HUT76094A (en) 1994-03-18 1997-06-30 Lynx Therapeutics Oligonucleotide n3'-p5' phosphoramidates: synthesis and compounds; hybridization and nuclease resistance properties
US5599922A (en) 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
US5726297A (en) 1994-03-18 1998-03-10 Lynx Therapeutics, Inc. Oligodeoxyribonucleotide N3' P5' phosphoramidates
US5684143A (en) 1996-02-21 1997-11-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligo-2'-fluoronucleotide N3'->P5' phosphoramidates
US5859233A (en) 1996-02-21 1999-01-12 Lynx Therapeutics, Inc. Synthons for synthesis of oligonucleotide N3-P5 phosphoramidates
AU733610B2 (en) 1996-12-20 2001-05-17 Geron Corporation Methods for detecting and inhibiting the RNA component of telomerase
US5998604A (en) 1997-09-15 1999-12-07 The Perkin-Elmer Corporation Polynucleotide purification method
US6114519A (en) 1997-10-15 2000-09-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of sulfurized oligonucleotides
US6465628B1 (en) 1999-02-04 2002-10-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
CN1317291C (zh) 1999-09-10 2007-05-23 杰龙公司 寡核苷酸n3′→p5′硫代氨基磷酸酯,其合成及应用
JP2002060341A (ja) * 2000-08-21 2002-02-26 Terumo Corp 止血剤
AU2002245717A1 (en) 2001-03-23 2002-10-08 Geron Corporation Oligonucleotide conjugates
US7563618B2 (en) 2001-03-23 2009-07-21 Geron Corporation Oligonucleotide conjugates
US20120329858A1 (en) 2010-08-04 2012-12-27 Geron Corporation Modified oligonucleotides for telomerase inhibition
CN100393209C (zh) * 2003-09-09 2008-06-11 杰龙公司 用于端粒酶抑制的改性寡核苷酸
TW200540180A (en) 2004-05-28 2005-12-16 Sankyo Co Telomerase inhibitor ena oligonucleotide
ME02933B (me) 2004-07-02 2018-04-20 Geron Corp Sinteza zaštićenih 3'-amino nukleozionih monomera
EP2458011B1 (en) * 2005-10-03 2013-07-24 Life Technologies Corporation Compositions, methods, and kits for amplifying nucleic acids
WO2008127305A2 (en) 2006-11-01 2008-10-23 Biogen Idec Ma Inc. Method of isolating biomacromolecules using low ph and divalent cations
BR112013003875B1 (pt) * 2010-08-20 2021-10-05 Replicor Inc Composições farmacêuticas compreendendo complexo de quelato de oligonucleotídeo, formulação de oligonucleotídeo, e usos
US9106103B2 (en) 2011-09-23 2015-08-11 Eaton Corporation Unintteruptible power supply systems and methods employing on-demand energy storage
US9006630B2 (en) 2012-01-13 2015-04-14 Altasens, Inc. Quality of optically black reference pixels in CMOS iSoCs
AR091065A1 (es) 2012-05-18 2014-12-30 Replicor Inc Una formulacion farmaceutica que comprende un quelato de oligonucleotidos antiviral para el tratamiento de una infeccion antiviral
KR20210072137A (ko) * 2012-06-14 2021-06-16 라이프 테크놀로지스 코포레이션 폴리머라제 연쇄 반응 (pcr)을 위한 신규 조성물, 방법 및 키트
UA128370C2 (uk) * 2012-12-07 2024-06-26 Джерон Корпорейшн Використання інгібітора теломерази для лікування мієлопроліферативних неоплазм
JOP20200257A1 (ar) 2014-05-01 2017-06-16 Geron Corp تركيبات أوليجو نوكليوتيد وطرق لتحضيرها
AU2016250576C1 (en) 2015-04-23 2021-05-06 Geron Corporation Methods of polynucleotide preparation using multivalent cation salt compositions

Also Published As

Publication number Publication date
PH12017501927B1 (en) 2022-09-02
ES2798270T3 (es) 2020-12-10
SG10201909816PA (en) 2019-11-28
SA517390103B1 (ar) 2021-07-14
AU2016250576B2 (en) 2021-02-04
MX2017011642A (es) 2017-11-02
HK1251234A1 (en) 2019-01-25
DK3286203T3 (da) 2020-06-02
HRP20201218T1 (hr) 2020-12-11
US20200339975A1 (en) 2020-10-29
TWI736532B (zh) 2021-08-21
NZ735042A (en) 2021-11-26
CN107429247A (zh) 2017-12-01
BR112017019627A2 (pt) 2018-05-15
US20160312227A1 (en) 2016-10-27
EA201791753A1 (ru) 2018-04-30
TW201706284A (zh) 2017-02-16
RS60645B1 (sr) 2020-09-30
MY187804A (en) 2021-10-26
US11441144B2 (en) 2022-09-13
US10745687B2 (en) 2020-08-18
CA2978191C (en) 2022-10-04
PH12017501927A1 (en) 2018-03-05
SMT202000389T1 (it) 2020-09-10
PE20171785A1 (es) 2017-12-27
LT3286203T (lt) 2020-07-27
JP2022168017A (ja) 2022-11-04
JP2021152079A (ja) 2021-09-30
KR102401252B1 (ko) 2022-05-24
MX383293B (es) 2025-03-13
MA42569B1 (fr) 2020-08-31
PE20221275A1 (es) 2022-09-01
ZA201706041B (en) 2020-11-25
CL2017002314A1 (es) 2018-05-04
HUE051148T2 (hu) 2021-03-01
AU2016250576A1 (en) 2017-09-21
BR112017019627B1 (pt) 2022-11-29
SG11201707893RA (en) 2017-11-29
PT3286203T (pt) 2020-07-08
CA2978191A1 (en) 2016-10-27
CN113564168B (zh) 2024-10-25
WO2016172346A1 (en) 2016-10-27
AU2016250576C1 (en) 2021-05-06
JP2025061848A (ja) 2025-04-11
EP3286203A1 (en) 2018-02-28
JP2018513127A (ja) 2018-05-24
IL254222A0 (en) 2017-10-31
KR20170138399A (ko) 2017-12-15
CN107429247B (zh) 2021-08-13
TN2017000411A1 (en) 2019-01-16
SI3286203T1 (sl) 2020-10-30
ME03811B (me) 2021-04-20
MD3286203T2 (ro) 2020-08-31
AU2021202803A1 (en) 2021-06-03
CN113564168A (zh) 2021-10-29
EP3286203B1 (en) 2020-05-06
CY1123197T1 (el) 2021-10-29
MA42157A (fr) 2018-02-28
CO2017009217A2 (es) 2018-02-20
EA035885B1 (ru) 2020-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA124521C2 (uk) Способи отримання полінуклеотидів з використанням композицій солей полівалентних катіонів
JP2021500311A (ja) オリゴヌクレオチド調製のための技術
IL185569A (en) Cyclic acid and analogues of nucleotide nucleotides and oligonucleotides
CN106459134B (zh) 寡核苷酸组合物及其制备方法
CN118685411B (zh) 抑制agt基因表达的双链寡核苷酸、其缀合物及用途
HK1251234B (en) Methods of polynucleotide preparation using multivalent cation salt compositions
TWI900022B (zh) GalNAc化合物、綴合物、組合物以及它們的用途
HK1242377A1 (en) Methods of polynucleotide preparation using multivalent cation salt compositions
NZ735042B2 (en) Methods of polynucleotide preparation using multivalent cation salt compositions
OA18769A (en) Methods of polynucleotide preparation using multivalent cation salt compositions.