UA126960C2 - Похідна глюкагону - Google Patents

Abstract

Винахід стосується похідної глюкагону, яка має покращені фізичні властивості внаслідок зміни ізоелектричної точки (рI), зберігає активність на рецептори глюкагону, та може покращувати сприйнятливість пацієнта, коли застосовується як гіпоглікемічний агент, та також прийнятна для введення в комбінації з іншими агентами проти ожиріння. Відповідно, похідна глюкагону може бути ефективно застосована для профілактики та лікування гіпоглікемії та ожиріння.

Description

Галузь техніки

Представлений винахід стосується нових похідних глюкагону, які мають покращені фізичні властивості внаслідок зміни ізоелектричної точки (рі), та композиції для профілактики або лікування гіпоглікемії та ожиріння, що містять таку ж саму речовину, як активний інгредієнт.

Попередній рівень техніки

Недавні економічні успіхи та зміни способу життя супроводжувалися великими змінами дієтичних звичок. Зокрема, зайняті люди сьогодні мають надмірну вагу та ожиріння через висококалорійні дієти та недостатню фізичну навантаження. Всесвітня організація охорони здоров'я (ВООЗ) повідомила, що понад мільярд дорослих людей мають надмірну вагу у всьому світі, з них більше трьох мільйонів мають клінічно діагностоване важке ожиріння, та щорічно 25 000 людей помирає з надмірною вагою або ожирінням (Всесвітня організація охорони здоров'я,

Спіоба! сігагеду оп Оієї, Ріузіса! Асіїміу апа Неайн, 2004).

Надмірна вага та ожиріння є відповідальними за підвищення кров'яного тиску та рівня холестерину, та викликають або погіршують різні захворювання, такі як серцеві захворювання, діабет, артрит та інші. Крім того, проблема ожиріння також стає основною причиною збільшення випадків атеросклерозу, гіпертонії, гіперліпідемії або серцевих захворювань у дітей та підлітків, а також у дорослих. Однак, ожиріння нелегко лікувати, тому що це складне захворювання, пов'язане з механізмами контролю апетиту та енергетичного обміну речовин. Відповідно, лікування ожиріння вимагає не лише власних зусиль пацієнта, але також способу, здатного лікувати аномальні механізми, пов'язані з контролем апетиту та енергетичного обміну речовин.

Таким чином, були зроблені зусилля для розробки лікарських засобів для лікування аномальних механізмів.

В результаті цих зусиль були розроблені лікарські засоби, такі як римонабант (Запоїї-

Амепії5), сібутрамін (АбБрої), контрав (Такеда) та орлістат (Коспе), але вони мають недоліки щодо серйозних побічних ефектів або дуже слабких ефектів проти ожиріння. Наприклад, відповідно до повідомлень, римонабант виявив побічний ефект щодо розладу центральної нервової системи, сібутрамін та контрав виявили серцево-судинні побічні ефекти, та орлістат показав тільки приблизно 4 кг втрати ваги, коли приймали протягом 1 року. Відповідно, не існує терапевтичних агентів для лікування ожиріння, які можна було б безпечно призначити пацієнтам

Зо із ожирінням.

Багато широкомасштабних досліджень було зроблено для розробки нових терапевтичних агентів для лікування ожиріння, які можуть вирішити проблеми традиційних лікарських засобів проти ожиріння. Останнім часом велику увагу приділяється похідним глюкагону. Глюкагон виробляється підшлунковою залозою, коли рівні глюкози в крові знижується в результаті інших лікарських препаратів або захворювань, або дефіциту гормонів або ферментів. Глюкагон стимулює розщеплення глікогену в печінці та полегшує вивільнення глюкози, щоб підвищити рівні глюкози в крові до нормального діапазону. На додаток до ефекту підвищення рівнів глюкози в крові, глюкагон пригнічує апетит та активує гормоночутливу ліпазу адипоцитів для полегшення ліполізу, тим самим демонструючи ефект проти ожиріння. Проте, застосування глюкагону, як терапевтичного агента, було обмежено через його низьку розчинність та властивість осадження при нейтральному рн.

Одна з похідних глюкагону, глюкагону подібного до пептиду-! (СІ Р-1), розробляється як терапевтичний агент для лікування гіперглікемії у хворих на цукровий діабет. СІ Р-1 має функції стимулювання синтезу та секреції інсуліну, пригнічення секреції глюкагону, уповільнення спорожнення шлунка, збільшення споживання глюкози та пригнічення споживання їжі.

Ексендин-4, отриманий з отрути ящірки та який має гомологію амінокислот приблизно 5090 до СІ Р-1, також як повідомлялось, активує рецептор СІР-1ї, тим самим зменшуючи гіперглікемію у пацієнтів з цукровим діабетом. Однак, лікарські засоби проти ожиріння, що містять СІ Р-1, як повідомляється, показують побічні ефекти, такі як блювота та нудота.

Тому, як альтернатива Сі Р-1, велика увага була зосереджена на оксинтомодуліні, який може зв'язуватися з обома рецепторами двох пептидів, СІ Р-1 та глюкагону. Оксинтомодулін представляє собою пептид, отриманий з попередника глюкагону, пре-глюкагону, та має функції пригнічення споживання їжі та підвищує насиченість СІ Р-1, та має ліполітичну активність, як глюкагон, тим самим підвищуючи його ефективність в терапії проти ожиріння.

Однак, оксінтомодулін або його похідні мають серйозний недолік, оскільки для лікування ожиріння слід щоденно вводити надмірну кількість лікарського засобу, оскільки вони мають низьку ефективність та короткий період напіввиведення іп мімо.

Крім того, коли обидві активності СІ Р-1 та глюкагону є присутніми в одному пептиді, співвідношення його активність стає фіксованим, та, таким чином, важко застосовувати 60 подвійний агоніст з різними співвідношеннями. Відповідно, комбінована терапія, здатна застосовувати різні співвідношення активності шляхом регулювання вмісту С Р-1 та глюкагону, може бути більш ефективною.

Проте для комбінованої терапії необхідним є покращити фізичні характеристики глюкагону, який агрегатується при нейтральному рН та осідає з часом, таким чином, показуючи погану розчинність.

При даних обставинах автори представленого винаходу розробили похідні глюкагону з частковою модифікацією амінокислотної послідовності глюкагону для покращення терапевтичних ефектів глюкагону на гіпоглікемію та ожиріння шляхом покращення фізичних властивостей глюкагону, та виявили, що дані похідні глюкагону мають покращену розчинність та більш високу стабільність при нейтральному рН, таким чином, здійснюючі представлений винахід.

Розкриття

Технічна проблема

Метою представленого винаходу є створення нової похідної глюкагону з покращеними фізичними властивостями.

Ще однією метою представленого винаходу є створення композиції для профілактики або лікування гіпоглікемія, яка містить похідну глюкагону як активний інгредієнт.

Ще однією метою представленого винаходу є створення композиції для профілактики або лікування ожиріння, яка містить похідну глюкагону як активний інгредієнт.

Технічне рішення

Для досягнення зазначеної вище мети, в одному аспекті, представлений винахід передбачає нову похідну глюкагону, яка включає амінокислотну послідовність наступної загальної формули 1 та має ізоелектричну точку (рі), яка не є такою самою, як, тобто, відрізняється від, ізоелектричної точки нативного глюкагону: х1-хХ2-ОСТЕ-Х7-50и5-Х12-Х13-Х14-Х15-Х16-Х17-Х18-Х19-Х20-Х21-Е-Х23-Х24-М1-І -Х27-

Х28-Т (Загальна формула 1) де, в загальній формулі 1,

Х1 є гістидином, дезаміно-гістидином, М-диметил-гістидином, р-гідроксімідазопропіоновою кислотою, 4-імідазооцтовою кислотою, рВ-карбоксіїімідазопропіоновою кислотою, триптофаном, тирозином, або є видаленим;

Х2 є а-метил-глутаміновою кислотою, аміноїзомасляною кислотою (АВ), ЮО-аланіном, гліцином, Заг(М-метилгліцином), серином, або Ю-серином;

Х7 є треоніном або валіном;

Х12 є лізином або цистеїном;

Х13 є тирозином або цистеїном;

Х14 є лейцином або цистеїном;

Х15 є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою або цистеїном;

Х16 є глутаміновою кислотою, аспарагіновою кислотою, серином, а-метил-глутаміновою кислотою або цистеїном;

Х17 є аспарагіновою кислотою, глутаміном, глутаміновою кислотою, лізином, аргінін лізином,, серин лізином,, валін лізином, або цистеїн лізином,;

Х18 є аспарагіновою кислотою, глутаміном, глутаміновою кислотою, аргінін ом або цистеїном;

Х19 є аланіном або цистеїном;

Х20 є лізином, глутаміновою кислотою, глутаміном, аспарагіновою кислотою, лізин ом або цистеїном;

Х21 є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою, валіном або цистеїном;

Х23 є валіном або аргініном;

Х24 є валіном, лейцином, глутаміном або аргініном;

БО Х27 є ізолейцином або метіоніном; та

Х28 є аргініном або аспарагіном (за умови, що виключеним є, якщо амінокислотна послідовність загальної формули 1 є ідентичною 5ЕО ІЮ МО: 1).

Похідна глюкагону за винаходом включає пептид, похідну пептида, або міметик пептида, який має покращені фізичні властивості маючи відмінний рі від того, який має нативний глюкагон, шляхом модифікування частини амінокислоти() нативного глюкагону.

Як застосовано в даному документі, термін "нативний глюкагон" стосується нативного людського глюкагону, який має послідовність Нібз-Зег-С1Іп-СПу- Гпи-Ріпе-ТНі-Зег-Авр-Туг-Зег-Г ув-

Туг-Геи-А5р-5ег-Агу-Агу-Аіа-Сіп-Авр-РПпе-Ма!-СсИп-Ттр-Геш-Меї-Авп-ТНг (ЗЕО ІО МО: 1).

Посилаючись на послідовність загальної формули 1 відповідно винаходу, амінокислоти виходять з М-кінця ліворуч до С-кінця праворуч відповідно до загальноприйнятого способу запису. Відповідно, коли "положення" будь-якого конкретного залишку згадується в послідовності загальної формули 1, вона повинна тлумачитися так само, як коли йдеться про будь-яке положення в нативному глюкагоні або інших молекулах.

Протягом всього опису винаходу не тільки звичайні одно-літерні або три-літерні коди для амінокислот, які зустрічаються в природі, але також дані три-літерні коди, як правило, дозволяється застосовувати для інших амінокислот, таких як с-аміноїзомасляна кислота (АЇб), за(ц(М-метилгліцин), та а-метилглутамінова кислота.

Крім того, амінокислоти, зазначені в даному документі, скорочуються відповідно до правил номенклатури ІОРАС-ІШВ наступним чином: дланік А Деінін їз делаванн КЕ епарайнова кислота. ГИ

Цистеїн 0; Глутамічсова киспота КЕ

Глутамін С: Гувцин С

Петидин ІН ізавейцин Е

Пейцьн ЕН Піза К

Метіови М аевілеазавін ЕК

Пролін ре берин ХУ

Траеснін т Тригптневан УК

Тарозинм ЖІ та Загін У.

Як застосовано в даному документі, термін "пептид" стосується сполуки з двох або більше нативних та ненативних амінокислот або похідних амінокислот, таких як а-амінокислоти, зв'язані пептидним зв'язком. Як застосовано в даному документі, термін "похідна глюкагону" стосується пептида, який включає послідовність загальної формули 1 або її похідну, аналога, або його модифікованого продукту. Пептид відповідно до винаходу включає пептидоміметики, які мають змінену рі, у порівнянні з нативним глюкагоном, за рахунок модифікування частини амінокислоти!) глюкагону у формі заміщення, тощо. В ілюстративному варіанті здійснення винаходу, похідна глюкагону має ізоелектричну точку відмінну від тієї, що у нативного глюкагона при збереженні активності рецептора глюкагону. В більш конкретному ілюстративному варіанті здійснення винаходу, похідна глюкагону стосується пептида з поліпшеною розчинністю нативного глюкагона при фізіологічному рН, при цьому зберігаючи активність глюкагонового рецептора.

Як застосовано в даному документі, термін "рі"? або "ізоелектрична точка" стосується значення рН, при якому макромолекула, така як поліпептид, не має чистого заряду (0)... У випадку поліпептиду з різними зарядженими функціональними групами чистий заряд загальної поліпептиду становить "0" в точці, де значення рН є таким самим, як і значення рі. Чистий заряд поліпептиду при рН більш високому, ніж рі буде негативним, тоді як чистий заряд поліпептиду при рН більш низькому, ніж рі буде позитивним.

Значення рі можуть вимірювати або оцінювати з допомогою звичайного способу, який застосовано в даній галузі. Наприклад, значення рі можуть вимірювати на іммобілізованому градієнтному гелі рН, який складається з поліакриламіду, крохмалю або агарози, застосовуючи ізоелектричний електрофорез, або, наприклад, можуть оцінювати з амінокислотної послідовності, застосовуючи інструмент рі/МУМУ (пер:/ехразу.огуЛоої5/рі ТооїІ.піті; Савіеїдег еї а!.,, 2003) на сервері ЕХРА5У.

В конкретному варіанті здійснення винаходу, похідна глюкагону, яка містить амінокислотну послідовність загальної формули 1, охоплює будь-який пептид, який одержують заміщенням, додаванням, делецією або пост-трансляційною модифікацією (наприклад, метилюванням, ацилюванням, убіквітинуванням, або внутрішньомолекулярним ковалентним зв'язуванням) амінокислотид0) в амінокислотній послідовності нативного глюкагон, представленого 5ЕО ІЮ МО: 1, який демонструє підвищену розчинність відповідно до рН розчину через відмінність його рі від нативного глюкагон, при цьому зберігаючи активності рецепторів глюкагону, оскільки вони, таким чином, мають покращену іп мімо хімічну стабільність.

Під час заміщення або додавання амінокислот можуть застосовуватися не тільки 20 амінокислот, які зазвичай зустрічаються у білках людини, але також атипові або не природні амінокислоти та їх похідні. Комерційні джерела атипових амінокислот можуть включати 5ідта-

Аїагісп, СпетрРер Іпс., зеплуте РІаптасецшііса!5, тощо. Пептиди, включаючи дані амінокислоти та атипові пептидні послідовності, можуть бути синтезовані та придбані у комерційних постачальників, наприклад, Атегісап Реріїде Сотрапу, Васпет (ОА), або Апудеп (Когеа).

Амінокислотні похідні, наприклад, дезаміно-гістидин, В-гідроксімідазопропіонова кислота, 4- імідазооцтова кислота, або р-карбоксіїмідазопропіонова кислота, можуть бути отримані таким самим способом.

Оскільки глюкагон має рН приблизно 7, він є нерозчинним у розчині, що має рН від 6 до 8 та має тенденцію до осадження при нейтральному рН. У водному розчині з рН З або нижче глюкагон розчиняється на початковій стадії але осаджується протягом однієї години, утворюючи гель. Оскільки желеподібний глюкагон переважно складається з фібрил ВД-листів, введення таким чином осадженого глюкагону із застосуванням ін'єкційної голки або внутрішньовенної ін'єкції блокує кров'яні судини та, тому, не є прийнятним для застосування як ін'єкційний агент. Для затримки процесу осадження, як правило, застосовують кислотні (рН від 2 до 4) композиції, та, таким чином, глюкагон може зберігатися в відносно не агрегованому стані протягом короткого періоду часу. Проте глюкагон може утворювати фібрили дуже швидко при низькому рН, та, таким чином, дані кислотні композиції слід вводити ін'єкцією одразу після приготування.

Широко відомим в даній галузі є те, що розчинність, активність та стабільність білка в розчині можуть варіюватися в залежності від рі (Зпаму, К. Ії. еї а!., Ргоївіп 5сіепсе 10, рр 1206- 1215, 2001).

Таким чином, винахідники розробили похідні глюкагону з підвищеною стабільністю та функціональними ефектами шляхом модифікування послідовності нативного глюкагону, тим самим змінюючи його рі. Похідні глюкагону за винаходом, які мають змінену рі у порівнянні з нативним глюкагоном, характеризуються тим, що вони мають покращену розчинність та стабільність відповідно до рН даного розчину в порівнянні з нативним глюкагоном.

В конкретному варіанті здійснення винаходу, похідна глюкагону може представляти собою пептид, в якому, в амінокислотній послідовності загальної формули 1,

Х1 є гістидином або триптофаном, тирозином, або є видаленим;

Х2 є серином або аміноїзомасляною кислотою (АЇб);

Х7 є треоніном або валіном;

Х12 є лізином або цистеїном;

Х13 є тирозином або цистеїном;

Х14 є лейцином або цистеїном;

Х15 є аспарагіновою кислотою або цистеїном;

Х16 є глутаміновою кислотою, аспарагіновою кислотою, серин ом або цистеїном;

Х17 є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою, лізином, аргініном, валіном або цистеїном;

Х18 є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою, аргініном або цистеїном;

Х19 є аланіном або цистеїном;

Хг0 є лізином, глутаміновою кислотою, глутаміном, аспарагіновою кислотою, лізин ом або цистеїном;

Х21 є аспарагіновою кислотою, глутаміновою кислотою, валіном або цистеїном;

Х23 є валіном або аргініном;

Х24 є валіном, лейцином або глутаміном;

Х27 є ізолейцином або метіоніном; та

Х28 є аргініном або аспарагіном (за умови, що виключеним є, коли амінокислотна послідовність загальної формули 1 є ідентичною ЗЕО ІЮО МО: 1).

Більш переважно, похідна глюкагону за винаходу може представляти собою пептид, який включає будь-яку одну амінокислотну послідовність серед амінокислотних послідовностей, представлених ЗЕО ІЮО МО: 2 - 34.

Пептид, який включає похідну глюкагону за винаходом, можуть отримувати, застосовуючи стандартний спосіб синтезу, рекомбінантну експресійну систему, або будь-який інший спосіб у даній галузі. Відповідно, аналог глюкагону відповідно до винаходу може бути синтезований багатьма способами, включаючи способи, описані нижче:

(а) спосіб синтезу пептиду, застосовуючи стадію твердо-фазного або рідко-фазного способу або застосовуючи збирання фрагментів, з подальшим виділенням та очищенням кінцевого пептидного продукту; або (Б) спосіб експресування конструкту нуклеїнової кислоти, що кодує пептид у клітині-хазяїні та виділення продукту експресії з культури клітини-хазяїна; або (с) спосіб здійснення іп міго безклітинної експресії конструкта нуклеїнової кислоти, що кодує пептид, та виділення продукту експресії з нього; або (а) спосіб одержання пептидних фрагментів будь-якою комбінацією способів (а), (Б), та (с), одержання пептиду шляхом зв'язування пептидних фрагментів, та потім відновлення пептиду.

В ілюстративному аспекті винаходу, було підтверджено, що похідна глюкагону згідно з винаходом має інший рі у порівнянні з нативним глюкагоном (дивіться таблицю 1). Як наслідок, похідна глюкагону згідно з винаходом має покращену розчинність та більш високу стабільність відповідно до рН даного розчину, в порівнянні з нативним глюкагоном. Відповідно, похідна глюкагону згідно з винаходом може підвищити сприйнятливість пацієнта при застосуванні як гіпоглікемічного агента, та також є прийнятною для комбінованого введення, щоб вводитись в комбінації з іншими агентами проти ожиріння, та, таким чином, може ефективно застосовуватись для профілактики та лікування гіпоглікемії та ожиріння.

У зв'язку з цим, похідна глюкагону згідно з винаходом може забезпечити привабливий терапевтичний вибір щодо лікування гіпоглікемії, ожиріння, або захворювань, пов'язаних з ними.

Наприклад, похідна глюкагону згідно з винаходом є основним гормоном, що контролює інсулінову відповідь, та може ефективно застосовуватись для лікування важкої гіпоглікемії у хворих на цукровий діабет.

Крім того, похідна глюкагону згідно з винаходом може застосовуватись як фармацевтичний лікарський засіб не тільки для профілактики збільшення маси тіла, сприяння зменшенню маси тіла, зменшення надмірної ваги та ожиріння, включаючи, але не обмежуючись цим, хворобливе ожиріння (наприклад, шляхом контролю апетиту, споживання, раціону харчування, споживання калорій, та/або витраті енергії), але також для лікування запального процесу, пов'язаного з ожирінням захворювання жовчного міхура, та викликаного ожирінням апное сну, та може застосовуватись для лікування пов'язаних з цим захворювань або станів здоров'я. Похідна глюкагону згідно з винаходом також може застосовуватись для лікування станів здоров'я, які можуть бути пов'язаними з ожирінням, таких як метаболічний синдром, гіпертензія, викликана атеросклерозом дисліпідемія, атеросклероз, артеріальний хрероз, ішемічна хвороба серця, інсульти, тощо. Однак, ефекти похідної глюкагону відповідно до винаходу можуть бути опосередковані повністю або частково через пов'язані з масою тіла ефекти, описані вище, або можуть бути незалежними від одного і того самого.

Тим часом, для покращення терапевтичного ефекту похідної глюкагону згідно з винаходом, похідна глюкагону може бути модифікованою, застосовуючи типові методики в даній галузі, включаючи модифікацію з полімерами, такими як поліетиленгліколь (ПЕГ) та цукрові ланцюги, або злиття з альбуміном, трансферином, жирною кислотою, та імуноглобуліном, тощо.

Наприклад, щонайменше один амінокислотний побічний ланцюг в межах сполук за винаходом може бути приєднаний до полімеру для того, щоб збільшити їх розчинність іп мімо та/або період напіввиведення, та/або збільшити біодоступність. Дані модифікації, як відомо, знижують кліренс терапевтичних білків та пептидів.

Для даних полімерів доцільними є розчинні (амфіпатичні або гідрофільні), нетоксичні та фармацевтично інертні полімери, та, переважно, вони можуть включати ПЕГ, гомополімери або співполімери ПЕГ, монометилзаміщені полімери (мПЕГ, та поліамінокислоти, такі як полілізин, поліаспарагінова кислота та поліглутамінова кислота.

Варіанти похідної глюкагону, як описано вище, також належать до обсягу винаходу.

В іншому аспекті винаходом передбачено полінуклеотиди, які кодують похідні глюкагону, описані вище.

Термін "гомологія", як застосовано в даному документі для полінуклеотиду, вказує на ступінь подібності з немутантного типу амінокислотною послідовністю та немутантного типу послідовністю нуклеїнової кислоти, та включає генну послідовність, яка є на 7595 або більше, переважно на 8595 або більше, більш переважно на 9095 або більше, та ще більш переважно на 9595 або більше ідентичною до полінуклеотидної послідовності, яка кодує похідну глюкагону.

Оцінка гомології може бути зроблена неозброєним оком або застосовуючи комерційно доступної програми. Застосовуючи комерційно доступну комп'ютерну програму, гомологія між двома або більше послідовностями може бути виражена у відсотках (95), та може оцінюватись гомологія (95) між суміжними послідовностями. Полінуклеотид, який кодує похідні глюкагону,

може бути вставлений у вектор та експресований для того, щоб отримати велику кількість похідних глюкагону.

Для даних рекомбінантних експресій, полінуклеотиди за винаходом, як правило, вставляють у відповідні вектори для конструювання векторів клонування або рекомбінантних векторів, які містять дані полінуклеотиди, та дані вектори також належать до обсягу винаходу.

Як застосовано в даному документі, термін "рекомбінантний вектор" стосується. ДНК конструкта, який включає послідовність полінуклеотиду, який кодує пептид-мішень, який є функціонально зв'язаним з відповідною регуляторною послідовністю, що дозволяє експресію пептида-мішені, наприклад, похідної глюкагону, в клітині-хазяїні. Регуляторна послідовність включає промотор, здатний ініціювати транскрипцію, будь-яку операторну послідовність для регулювання транскрипції, послідовність, яка кодує відповідний домен, зв'язуючий рибосом

МРНК, та послідовність, яка регулює припинення транскрипції та трансляції. Рекомбінантний вектор після трансформації у відповідну клітину-хазяїн може бути реплікованим або функціонувати незалежно від генома хазяїна, або може бути інтегрованим в геном хазяїна самостійно.

Рекомбінантний вектор, який застосовано в представленому винаході може бути особливо не обмеженим за умови, що вектор є здатним до реплікації в клітині-хазяїні, та він може бути сконструйованим із застосуванням будь-якого вектора, відомого в даній галузі. Приклади вектора можуть включати природні або рекомбінантні плазміди, косміди, віруси та бактеріофаги.

Наприклад, як фаговий вектор або космідний вектор може застосовуватись РУУЕ15, М13, МВІ З,

МВІ 4, ІХІЇ, АЗНІЇ, АРІЇ, 10, 41, Спагоп4А, Спагоп21А, тощо; та як плазмідний вектор може застосовуватись вектор на основі рВК, рос, рВішпезсгірнІ, РОЕМ, рт, ре, рЕТ, тощо. Вектори, які можуть бути застосовано в представленому винаході, не є особливо обмеженими, але застосовуватись може будь-який відомий вектор експресії.

Рекомбінантний вектор застосовано для трансформації клітини-хазяїна для одержання похідних глюкагону за винаходом. Крім того, дані трансформовані клітини, як частина винаходу, може застосовуватись для ампліфікації фрагментів та векторів нуклеїнової кислоту, або можуть бути культивованими клітинами або клітинними лініями, які засмтосовано в рекомбінантному виробництві похідних глюкагону за винаходом.

Зо Як застосовано в даному документі, термін "трансформація" стосується процесу введення рекомбінантного вектора, що включає полінуклеотид, який кодує цільовий білок в клітині-хазяїні, тим самим забезпечуючи експресію полінуклеотиду, який кодується білком в клітині-хазяїні.

Для трансформованого полінуклеотиду не має значення, чи вводиться він в хромосому клітини- хазяїна та знаходиться в ній або знаходиться поза хромосомою за умови, що він може експресуватися в клітині-хазяїні, та включеними є обидва випадки.

Крім того, полінуклеотид включає ДНК та РНК, які кодують цільовий білок. Полінуклеотид може бути вставлений в будь-якій формі, оскільки він може бути введений в клітину-хазяїн та експресований в ній. Наприклад, полінуклеотид може бути введений в клітину-хазяїн в формі касети експресії. Касета експресії може традиційно включати промотор функціонально зв'язаний з полінуклеотидом, сигнал завершення транскрипції, домен зв'язування рибосоми, та сигнал завершення трансляції. Касета експресії може бути у формі вектора експресії, здатного до самореплікації. Крім того, полінуклеотид може бути введений в клітину-хазяїн, оскільки він є функціонально зв'язаним з послідовністю, необхідною для його експресії в клітині-хазяїні, але не обмежується цим. Крім того, як застосовано в даному документі, термін "функціонально зв'язаний" стосується функціонального зв'язку між промоторною послідовністю, яка ініціює та опосередковує транскрипцію полінуклеотиду, який кодує цільовий білок за винаходом, та вказану вище генну послідовність.

Відповідний хазяїн, буде застосовуватися в представленому винаході, не може бути особливо обмеженим за умови, що він може експресувати полінуклеотид за винаходом.

Приклади відповідного хазяїна можуть включати бактерії, які належать до роду ЕвсНегіспіа, такі як Е. сої, бактерії, які належать до роду Васійш5, такі як Васійив 5и,ибБійї5, бактерії, які належать до роду Рзепдотопав, такі як Рзендотопавх риїйда, дріжджі, такі як Рісніа разюгі5, Зхасспаготусев сегемівзіає, та Зспігозасспаготусез ротрбе, клітини комах, такі як 5родорієга пидірегаа (519), та клітини тварин, такі як СНО, СО5, та В5С.

В іншому аспекті, представлений винахід передбачає фармацевтичну композицію для профілактики або лікування гіпоглікемії або ожиріння, яка містить похідні глюкагону.

Як застосовано в даному документі, термін "профілактики" стосується будь-якої дії, яка в результаті призводить до пригнічення або затримки початку ожиріння шляхом введення похідної глюкагону або фармацевтичної композиції, та термін "лікування" стосується будь-якої дії, яка в результаті призводить до покращення в симптомах ожиріння або сприятливої альтерації шляхом введення похідних глюкагону або фармацевтичної композиції.

Як застосовано в даному документі, термін "введення" стосується введення конкретного матеріалу пацієнту відповідним чином, та композицію може вводитись будь-яким із загальноприйнятих шляхів за умови, що композиція може надходити до тканини-мішені.

Наприклад, введення може проводитись внутрішньочеревно, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, підшкірно, інтрадермально, перорально, місцево інтраназально, інтрапульмонально, інтраректально, тощо.

Як застосовано в даному документі, термін "гіпоглікемія" стосується гострого симптому цукрового діабету, при якому рівень глюкози в крові нижче, ніж у нормальних людей, та загалом, стосується стану, коли рівень глюкози в крові становить 50 мг/дл або менше. Гіпоглікемія часто виникає, коли людина, яка приймає пероральний гіпоглікемічний препарат, їла менше, ніж зазвичай, або здійснювала активності або фізичні вправи більше, ніж звичайно. Крім того, гіпоглікемія може спостерігатися за рахунок застосування лікарських засобів, які знижують рівень глюкози, важких фізичних захворювань, дефіциту гормонів, таких як адренокортикальні гормони та глюкагон, пухлини підшлункової залози, яка продукує інсулін, аутоїмунного синдрому інсуліну, у хворих на гастриктомію, розладу вродженого порушення вуглеводного обміну, тощо.

Симптоми гіпоглікемії включають слабкість, тремтіння, блідість шкіри, холодний піт, запаморочення, збудження, тривога, серцебиття, порожній шлунок, головний біль, втома тощо.

У випадку стійкої гіпоглікемії це може призвести до конвульсії або судоми, та може спричинити шок та, таким чином, непритомність.

Як застосовано в даному документі, термін "ожиріння" стосується медичного стану з надмірним вмістом жиру в організмі, та коли людину, яка має індекс маси тіла (ВМІ; маса тіла (кг), поділена на квадрат зросту (м)) 25 або більш високий, діагностують як таку, яка має ожиріння. Ожиріння, як правило, відбувається внаслідок тривалого енергетичного дисбалансу, при якому споживання енергії перевищує витрати енергії. Ожиріння є метаболічне захворювання, яке вражає весь організм, що підвищує ризик діабету, гіперліпідемії, сексуальної дисфункції, артриту та серцево-судинних захворювань, а в деяких випадках також пов'язане з виникненням онкологічних захворювань.

Зо Фармацевтична композиція за винаходом може містити фармацевтично прийнятний носій, наповнювач або розріджувач. Як застосовано в даному документі, термін "фармацевтично прийнятний" стосується властивостей, які мають достатню кількість, щоб продемонструвати терапевтичний ефект та не викликати несприятливих ефектів, та можуть бути легко визначені кваліфікованим фахівцем в даній галузі, грунтуючись на чинниках, добре відомих в медичній галузі, таких як вид захворювання, вік, маса тіла, стан здоров'я, стать, чутливість до лікарського засобу пацієнта, шлях введення, спосіб введення, частота введення, тривалість лікування, лікарський засіб, який потрібно змішувати або вводити одночасно в комбінації, тощо.

Фармацевтична композиція за винаходом, яка містить похідну глюкагону згідно з винаходом, може додатково містити фармацевтично прийнятний носій. Фармацевтично прийнятний носій може включати, для перорального введення, зв'язуючу речовину, ковзну речовину, розпушувач, наповнювач, солюбілізуючий агент, диспергуючий агент, стабілізуючий агент, суспендуючий агент, барвник, ароматизуючий агент, тощо; для ін'єкцій, буферний агент, консервант, анальгетик, солюбілізуючий агент, ізотонічний агент, стабілізуючий агент, тощо, які можуть бути об'єднані для застосування; та для місцевого застосування, основу, наповнювач, змащуючу речовину, консервант, тощо, хоча не обмежується цим.

Тип формуляції композиції відповідно до винаходу можуть отримувати по-різному шляхом комбінування з фармацевтично прийнятним носієм, як описано вище. Наприклад, для перорального введення композиція може бути сформульована в таблетки, пастилки, капсули, еліксири, суспензії, сиропи, пластинки, тощо. Для ін'єкцій композиція може бути сформульована в однодозові ампули або багатодозові контейнери. Композиція може бути також сформульованою в розчинах, суспензіях, таблетках, капсулах та композиціях з уповільненим вивільненням.

Тим часом, приклади відповідних носіїв, наповнювачів та розріджувачів можуть включати лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбіт, маніт, ксиліт, еритрит, мальтит, крохмаль, гуміарабік, альгінат, желатин, фосфат кальцію, силікат кальцію, целюлозу, метилцеллюлозу, микрокристалічну целюлозу, полівінілпіролідон, воду, метилгідроксибензоат, пропілгідроксибензоат, тальк, стеарат магнію, мінеральну олію, тощо. Крім того, композиція може додатково містити наповнювач, анти-коагулянт, змащуючу речовину, зволожувач, смаковий агент, консервант, тощо.

Крім того, фармацевтичну композицію за винаходом можуть отримувати у будь-якому типі композиції, вибраному з групи, яка складається з таблеток, пігулок, порошків, гранул, капсул, суспензій, рідких лікарських засобів для внутрішнього застосування, емульсій, сиропів, стерильних ін'єкційних розчинів, неводних розчинів, ліофілізованих композицій та супозиторіїв.

Крім того, композиція може бути сформульована в єдину лікарську форму, прийнятну для організму пацієнта, та, переважно, формулюється в препарат, прийнятний для пептидних лікарських засобів відповідно до типового способу в фармацевтичній галузі для введення пероральним або парентеральним способом, наприклад, включаючи, але не обмежуючись цим через шкіру, внутрішньовенно, внутрішньом'язово, внутрішньоартеріально, інтрамедулярно, інтратекально, внутрішньошлуночково, легенево, трансдермально, підшкірно, внутрішньочеревно, інтраназально, внутрішньошлунково, місцево, сублінгвально, вагінально або ректально.

Крім того, похідна глюкагону може застосовуватись шляхом змішування з різними фармацевтично прийнятними носіями, такими як фізіологічний сольовий розчин або органічні розчинники. Для підвищення стабільності або всмоктування можуть застосовувати вуглеводи, такі як глюкоза, сахароза або декстрани, антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота або глутатіон, хелатуючі агенти, низькомолекулярні білки або інші стабілізатори.

Доза та частота введення фармацевтичної композиції згідно з винаходом визначаються за типом активного інгредієнта(ів) разом з різними чинниками, такими як захворювання, яке лікують, спосіб введення, вік пацієнта, стать та маса тіла, а також тяжкість захворювання.

Загальна ефективна доза композиції згідно за винаходом може бути введена пацієнту в одній дозі або може бути введена протягом тривалого періоду часу в декількох дозах відповідно до фракціонованого протоколу лікування. В фармацевтичній композиції за винаходом вміст активного інгредієнта(ів) може варіювати в залежності від тяжкості захворювання. Переважно загальна добова доза пептиду даного винаходу може становити від приблизно 0,0001 мкг до 500 мг на 1 кг маси тіла пацієнта. Однак, ефективна доза похідної глюкагону визначається з урахуванням різних чинників, включаючи вік пацієнта, масу тіла, стан здоров'я, стать, тяжкість захворювання, дієту та швидкість екскреції на додаток до способу введення та частоти лікування фармацевтичною композицією. У цьому відношенні кваліфіковані фахівці в даній

Зо галузі можуть легко визначити ефективну дозу, прийнятну для конкретного застосування фармацевтичної композиції за винаходом. Фармацевтична композиція відповідно до винаходу не обмежується, зокрема, формулюванням та способом і режимом введення, за умови, що вона показує ефекти за винаходом.

Фармацевтична композиція за винаходом демонструє прекрасну тривалість ефективності та титру іп мімо, тим самим значно зменшуючи кількість та частоту її введення.

Зокрема, оскільки фармацевтична композиція за винаходом містить як активний інгредієнт похідну глюкагону, що має змінене рі, відмінну від тієї що у нативного глюкагон, вона демонструє підвищену розчинність та високу стійкість відповідно до рН наданого розчину, та, таким чином, фармацевтична композиція за винаходом може ефективно застосовуватись для одержання стабільного препарату глюкагону для лікування гіпоглікемії або ожиріння.

Крім того, фармацевтичну композицію за винаходом можуть вводити самостійно або в комбінації з іншим(іими) фармацевтичним(ими) препаратом(ами), що показують профілактичні або терапевтичні ефекти при ожирінні. Крім того, фармацевтична композиція за винаходом може додатково містити фармацевтичний препарат, що показує профілактичні чи терапевтичні ефекти при ожирінні.

Фармацевтичні препарати, що показують профілактичні чи терапевтичні ефекти при ожирінні не є особливо обмеженими, та можуть включати агоніст рецептора СІ Р-1, антагоніст рецептора глюкозозалежного інсулінотропного пептида (СР), агоніст рецептора лептину, інгібітор, ОРР-ЇМ, антагоніст рецептора У5, антагоніст рецептора меланінконцентруючого гормону (МСН), агоніст рецептора М2/3/4, агоніст рецептора МеСЗ3/4, інгібітор гастральної/панкреатичної ліпази, агоніст 5НТ2с, агоніст рецептора ВЗА, агоніст рецептора аміліна, антагоніст греліна та антагоніст рецептора греліна, ЕСЕ1, агоніст рецептора ЕСЕ21, агоніст рецептора холецистокініну (ССК), агоніст рецептора панкреатичного поліпептиду (РР), інгібітор реабсорбції допаміну, тощо.

В ще одному аспекті, представлений винахід передбачає спосіб профілактики або лікування гіпоглікемія або ожиріння, включаючи введення похідної глюкагону або фармацевтичної композиції, яка містить таку саму речовину, суб'єкту.

Як застосовано в даному документі, термін "суб'єкт" стосується тих, у кого підозрюється наявність гіпоглікемії або ожиріння, які є ссавцями, включаючи людей, мишей та домашніх бо тварин, які мають гіпоглікемію або ожиріння, або з можливістю мати гіпоглікемію або ожиріння.

Однак, будь-який суб'єкт, який лікують похідними глюкагону або фармацевтичною композицією за винаходом, є включеним без обмеження. Фармацевтичну композицію, яка містить похідну глюкагону згідно з винаходом, можуть вводити суб'єкту, який підозрюється на те, що має гіпоглікемію або ожиріння, таким чином ефективно лікуючи суб'єкта. Гіпоглікемія та ожиріння є такими самими, як описано вище.

Терапевтичний спосіб за винаходом може включати введення фармацевтичної композиції, яка містить похідну глюкагону в фармацевтично ефективній кількості. Переважно, загальна добова доза повинна визначатися на підставі відповідного медичного висновку лікаря та вводитись один чи кілька разів. З огляду на задачі винаходу, специфічна терапевтично ефективна доза для будь-якого конкретного пацієнта може варіюватися в залежності від різних чинників, таких як вид та ступінь відповіді, яку слід досягти, конкретних композицій, включаючи те, чи інший(і) агент(и) застосовують з ним або ні, вік пацієнта, маса тіла, стан здоров'я, стать та дієта, час та спосіб введення, швидкість секреції композиції, тривалість терапії, інший(ї) лікарський(ї) засіб(и), що застосовуються в комбінації або одночасно з конкретними композиціями, та подібні чинники, добре відомі в медичній галузі.

В ще одному аспекті, представлений винахід передбачає застосування похідних глюкагону у виробництві фармацевтичних лікарських засобів для профілактики або лікування гіпоглікемії або ожиріння.

Переважні ефекти

Нові похідні глюкагону за винаходом мають відмінну стабільність та розчинність відповідно до рН даного розчину, маючи рі відмінну від тієї що у нативного глюкагон. Тому, коли нові похідні глюкагону за винаходом застосовують як терапевтичний агент для лікування гіпоглікемія, вони можуть підвищувати сприйнятливість пацієнта. Крім того, нові похідні глюкагону за винаходом є прийнятними для введення в комбінації з іншими агентами проти ожиріння, та, таким чином, вони можуть ефективно застосовуватись для профілактики або лікування гіпоглікемії та ожиріння.

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ

Далі в даному документі, представлений винахід буде описаний більш детально з посиланням на наступні приклади. Однак, дані приклади наведені тільки для ілюстративних

Зо цілей та не спрямовані на обмеження обсягу винаходу.

Приклад 1: Отримання клітинної лінії, яка має відповідь САМР на глюкагон

ПЛР проводили із застосуванням області, яка відповідає відкритій рамці зчитування (ОКЕ) в

КДНК (Огібепе ТесппоїЇодіе5, Іпс., ЮШБА) гену рецептора глюкагону людини як темплата, та наступні прямі та зворотні праймери 5ЕО ІЮО МО: 35 та 36, включаючи кожну з НіпаП та ЕсокіІ сайтів рестрикції.

Зокрема, ПЛР виконували загалом за З0 циклів із застосуванням наступних умов: денатурація при 95 "С протягом 60 секунд, ренатурація при 55 "С протягом 60 секунд та подовження при 68 "С протягом 30 секунд. Отриманий таким чином ПЛР продукт піддавали електрофорезу в 1,095-вому агарозному гелі, та з нього шляхом елюювання отримали смугу розміром 450 пар основ.

Прямий праймер: 5-САаССАСАССОСАССИаИтососсСатАСТТААСИСО-3 (ЗЕО І МО: 35)

Зворотний праймер: 5-СТААССЯАСсТоТоацасапААаАСталастоасо-3 (5ЕО ІЮ МО: 36)

Продукт ПЛР був клонований у відомому векторі експресії тваринної клітини, хоес/апіт, для одержання рекомбінантного вектора хоС/ЗСОК. Клітинна лінія СНО 0044, культивована в середовищі ОМЕМ/Р12 (1095 ЕВ5), була трансфікована з рекомбінантним вектором хООСиЗСОК, застосовуючи ліпофектаміну, та селективно культивована в селекційному середовищі, яке містить 1 мг/мл 5418 та 10 нМ метотраксата. Одиночні клітинні лінії клонів були відібрані з них із застосуванням способу обмеженого розбавлення, та серед них було остаточно вибрано клітинну лінію, яка демонструє відмінну відповідь САМР на глюкагон за способом залежним від концентрації.

Приклад 2: Синтез похідних глюкагону

Широко відоме в даній галузі є те, що розчинність, активність та стабільність білка в розчині можуть варіюватися в залежності від рі (пам, К. Г. еї аїЇ.,, Ргоївіп Зсіепсе 10, рр 1206-1215, 2001). Для того, щоб отримати похідні глюкагону з покращеними фізичними властивостями, амінокислотна послідовність нативного глюкагону, представлена 5ЕО ІЮ МО: 1 була заміщена амінокислотними залишками, які містять позитивні та негативні заряди, та, таким чином, похідні глюкагону синтезовані як показано в таблиці 1 нижче.

Таблиця 1

ЗБОЮ МО:1 |НЗОстТЕТ5ОУЗКМІО5ВВАОСРУСМЬММТ ОЇ 77777717

ЗЕОІЮ МО:2 |НЗОстЕТЗрУЗКМІОСОВАОсРМОМІММТ ЇЇ 77777777 - 1

ЗБОЮ МО:3 |НЗОсТРТЗОУЗКМІОСЕВАООРУСМЬММТ ЇЇ 77777777

ЗЕОІЮ МО:4 |нНЗОстеЕт5рУЗКМІО5СрАОрРУСМЬММу Її

ЗЕОІЮ МО:5 |НЗОСТЕТЗОУЗКМІОЗСЕАООРМОУМММТ ЇЇ 77777777 - 71

ЗЕОІЮ МО:б |НЗОСТЕРТЗОУЗКУМІОЗСЕАрОРМОМЬММТ ЇЇ 77777777

ЗБОЮ МО:7 Ц|УБООТЕТЗОУЗКУСОЗСЕАРОРМОММІММТ ЇЇ 7777777 -

ЕОР МО:8 |УХООТЕТЗОУЗКУСО5СрАОсРМОУИМу ЇЇ 77777777

ЗЕОІЮ МО:9 УХООТЕТЗОУЗКУСО5СРАООРМУМЬМТЇ Її

ЗБОЮ МО:То |УХООТЕТЗОУЗКУСОБ5СРАрОРУМУЛИМТЇ Її

ЗБОЮ МО:11 ЇУХООТЕТЗОУЗКУСОЕКСАКЕРМОММІММТ | 777777-

ЗБОЮ МО:1т2 |УХОСОТЕТЗОУЗКУСО5ВВАООРМОУМММТ |! 77777777 - 1

ЗБОЮ МО:13 |УХООТЕТЗОУЗСУМІОЕКВАКЕРМОМЬММТ ЇЇ 7777777- 7

ЗБОЮ МО:14 |УХОСОТЕТЗОУЗКУСОСКВАКЕРМОМЛЬММТЇ ОЇ 77777771

ЗБОЮ МО:15 |УХОСОТЕТЗОУЗКУСЕКВАОСРМОМЬММТ ЇЇ 7777777717-

ЗБОЮ МО:16 |УХОСОТЕТЗОУЗКУСОСВВАОМЕМОУМіМАТ |! 77777777 - с

ЗБОЮ МО:17 Ц|УХООТЕТЗОУЗКУСОСУВАОоРМОУМіМАТ //Ї 7777777 - с

ЗБОЮ МО:18 |УХОСОТЕТЗОУЗКУСОЗВВАСОРВІОМОММТ | 7777-77

Стосовно 5ЕО ІЮ МО: 8 - 31 та 33 - 34, показаних в таблиці 1, амінокислота, представлена Х являє собою ненативну амінокислоту, аміноїзомасляною кислотою (АЇїБ); "-" в амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮО МО: 32 означає відсутність амінокислотного залишку в відповідному положенні; та два жирним шрифтом та підкреслених амінокислотних залишки представляють формування кільця між двома амінокислотними залишками.

Приклад 3: Вимірювання рі похідних глюкагону

Для вимірювання покращених фізичних властивостей похідних глюкагону, синтезованих в прикладі 2, значення рі розраховували на основі амінокислотних послідовностей, застосовуючи інструмент рі/Му: (пЕер:/ехразу. огоЛооі!5/рі їоо0ї.пІті; Савзіеїдег еї а!., 2003) на сервері ЕХРА5БУ.

Таблиця 2 о Похідніглюкаону.ї | - рі 2 К

ЗБОЮ МО /17777717117168 о Похідніглюкаону.ї | - рі ГК

Як показано в таблиці 2 вище, у той час як нативний глюкагон 5ЕО ІЮО МО: 1 мав рі 6,8, похідні глюкагону відповідно до винаходу показали значення рі в діапазоні від приблизно 4 до приблизно 9, таким чином, демонструючі покращені фізичні властивості. Оскільки похідні глюкагону відповідно до винаходу мають значення рі відмінні від тих, що у нативного глюкагон, вони можуть демонструвати покращену розчинність та більш високу стабільність відповідно до умов рН наданого розчину.

Відповідно, коли похідні глюкагону відповідно до винаходу застосовують як терапевтичний агент для лікування гіпоглікемія, вони можуть покращити сприйнятливість пацієнта, та також є прийнятними для введення в комбінації з іншими агентами проти ожиріння, наприклад, антагоністом рецептора СІ Р-1, антагоністом рецептора глюкозозалежного інсулінотропного пептида (СІР), тощо, та, таким чином, може ефективно застосовуватись як терапевтичний агент для лікування гіпоглікемії та ожиріння.

Спеціалісти в даній галузі визнають, що представлений винахід може бути втіленим в інших специфічних формах, не відходячи від його духу чи суттєвих характеристик. Описані варіанти здійснення повинні розглядатися в усіх аспектах тільки як ілюстративні, а не обмежувальні.

Таким чином, обсяг винаходу вказується формулою винаходу, яка додається, а не наведеним вище описом. Всі зміни, які належать до значення та діапазону еквівалентності формули винаходу, повинні бути охоплені межами обсягу винаходу.

Перевпік коспідовноастов «у» ХАНМІВАЄМ. КО. ЛТД, «140 Леді таюкаиану з селілинаою статі «МЕМ ОБРАТИ Х хіе КЕ Ново хаб ще «ів «0 Коран Во коліка 3 «ві» 95

Ер» КБ «ва Нею варена м юх ї

МНЕ Бе СНОМ Те Бе тт ЗегАзо Ту Бе уз Туг дер Авр бе і я їв з лез Аг Лін Ав ре мае СЮ Тер вм МЕ Ави ТВ що їв ха Х «ії» В «13» Цісучнатласлідевнть

«ЖИ де веухіднВ ГПЮКОМЄНУ

КК х

Ки Зако Су ТУ бе тп ех Аза ТусЗар бує Тут ка дер ув ї х 10 її дво Ага сп Ар Ве Ме м тр бер Мекави Ти

ХО 5 «им й «1 ха хеіїя РКК киі1Ям Ніучзна проолідееністе ходох

Ми» похідна слюкагону

Небес му Пе иве Те Бек Аве Пе Бегрує Тур Дав Аве був 1 З КЕ 15

Ін А Ав ій Ак Ра Уві 3 ев Мер Ава ТЕ «дм А

«Мб» ВЕК «пк Цтучна вослідевність ие хай похідна гнохатну «НІХ В вів ет ЗвесВу Тетне Гиг ен Авр Ту бегіув Тугіви Авр.баг

З 5 30 35

Сув Ав дів ів Авр Ве магів Таз ев МераАев ТВ за зв о 25 «ке 8 «вії» Я хоій ЦПіхучна послідовне «МУ «да пехіднатлеюкаону сх 5

Не его Му Ті РБе Те Бе Аяю Туг бк був Ту Бен Авр ве

Су Аа іп Авр Не ма! Сни Тто дев МегАва 2 25 хвійв 5 «ах 23 «Від» АТ «ші» Цргучна послідевність оо» тохідма ппнюжкагову «рах В ве Зер сне Оу ТНК ве ти ЗегАВО ТУ лен уз Тут зи Ар бек і 5 10 15 уз І Аз Аврора магів тр цеи Ме Ав ТВу 25 ЗБ хо: СВ «ВІЩ БТ «КІ» тучна послузі их «аа» похдеа глюкагому

КН

Тук Заг «ув (Зі ТА рН: ТНК бен АВ Тугбек ув Туг і ев АБО бе ! у віу й

Су си Кіз Азов Ави Ре Уві С трі ен Ме Ап тн 2 28

«вір В «В» Я хжійвх АТ каіЗе фбтуч«ма послідовність «До» ик мохідни пюКагОоМу яшИККх «кі ВАРАНТ «ВИЗ» Хва предотанняє собою змінхзомасняму КМУ «ке В

Тут Ха а Су тіж па ТНе шен бер тує ою був Тегі ен Ар ех з 5 о 15 ту Ар аю Ва мВ с То ам Це Ав Тог

За каре З сеї х9 «ав ВИТ «лі прруяна поепідювніте

МО

«ЙДУ пехідна глюкагону

«ви «аз БАРІАНІТ «вам 8 кам хавтиадетаавннє зобою вміновомастиму киспоту хаоде

Техас сну ТК БНаЇ ВЕ Вег А гу Зекфу туги АВ КЕ

Кув АВр Аа ів аю Бе мама тер бе Ве Ави ж «ві «Рі» 5 т«арае БИ кет МЦиучна попувдевністів

КЕКЕх «ВМ похідна сплоюагну «Там «й» ВАРІВНІ чайки (й ко» ква предотваляє собою амінежомастяну хувлоту «ше 15

ТугХав іа у ТВ Аре Тнебек Аве Гук бер бує Ту уву Авр баг

З й М 5

Сувлерв Ав АероАвр евде ма! ма Тер без Не ле тв

КІ же «хи 1 ха еВ хай РЕТ «ДІйе Цітучна поспідовність кЕДоШе «ем пОхідна тка тОНу «КК» «айв ВАВІДНТ «дей хі «на Жва праедсуввляє собою зміновомасляму кеспоту «а 1 тує хан Оу Ти бле Тебе дер Ге бекіу Ту ау Аве ЗВ

З В 16 5 іук се АВ Гука еле ма в т о МЕСАА ТНЄ хвіїе Я ем РК «Да» ручна послідовність киод»е мИеЗ» похідне ОКО НУу «ау» «кВеі2 ВАРАНТ «ДВй» (0 хи» жав предотавлнє соб аквкнамарпяну кколоту «ад а тяж Хавсни Му Те Біе тт Зег Аве Туг Яег був Тут ву Ар мех ї 5 та т

Доза лів сни Ако Кне Май ів тріо МерАзе ТЕ 2 5 «рн 48 «Вії 8 «щи ВК «ДІЯ Штучне поспідовність «ШК «аа тюхідна синекагону ста ди «віз ВАРІННІ «ек» ЖХав представняє сов зміновомастану кислоту «Кв 15

Тубхва сну тигри тн Бег дво туге Сх Буг ів АВ си і їх ЕЕ 15 уз Ага АВ ув СО ре ма ЧИ Тур ви МеСАаА ТИХ кое а «й» ОВ «ої ВКЕТ хві1йе ітучна гннзпідовність «о2дх коша пОХхіднатнюкинону хе фе «раї» ВАРІДНІ «ши 8)

Кт Ава представле собою амінаідомасняну кввлоту «ще ла

Тубхав сп у Те Юре Те бег Ав Туга ув Тугієв Аве Су

З 5 18 15

Гуз Аг Ай уз СИч Ре Уві ов Трієс Ме Аби Те а 25 «іде ЛВ «ії ТВ «іш РЕТ каз Вкуяна поспідовність каре «ик похідна пекан у хтее хойіз ВАРІАНТ дош В хо: Хва предетвеннє собою амінаіжомаеєлянуУ кислоту ее 1

Ту Ха т Су Те ема Му Бег Аво Тут Заг ув Тут їв буз СИц 1 й 10 15 уза Ав со вер Ве ма Ме пр іви Ме АВ Пе да 75 «ар 15 «Вт» до «йЇ3» Цтуана востідовністе кед «ВИЗ» похідна глюкаезму кКаще «їв ВААНТ «вам їх «вий» Хавсщевдетавняє собок: зміноїзомастину кисосзту зе 15

ТуєХав сн чу М Бе Те Зо Аве Туг бегіув Турів Ав уз і З за З

Акад ар діа па ма ке мар о: та ен Ме ага ТВ «де хі» «В чаїше РКК кота Нігучна песпдав кут «ЕКО чинила покана глюкагону «ВТ «хи» БАРІАНТ хиаят «ве» Кавпредстаанне собою аміноізомаслену кислоту «адм 17

Тубхвалони су Ті Не Ті бе дер Ту бег мк Ту зи Ако сув 1 В Ка 15

Маг Ат Аа сни Аво Не Ма п прі: Ме Ат ТВ по о «Де В ев ха

«аж РЕТ «тах БДучна гпоасгндеаннсте

Ах зе ху похідна глюхану ки «ийіх ВАРІАНІ «дом ід «ний Жвапредотавлно собою амінаізамаєтану киспоте «Ме В ук Ха ма СНУ Ту бе Ті де Ар Ту Зеагіує Тут кед Ажни ЗО 1 5 13 15 й Ану АВ Су дар ие Ап ец Ттр ан Ме Аа Ту хо Б «іх їз «Вії» В «ід» ВИТ «Я 0 Цітучва порльовнтх «Ка вм похідне глюкагону ка «й» ВАРІАНТ «Йов «ки» Хав предаетавн собен вуіновомаствту каспоту

Мои «12 ВААНТ «вМяе (Б (ТО ху» вмінокисоти В положенні тб та потнуканні 20 мевориакуєь кільсе «Як

Ту Ха ме су Ти бе Ти бБог аеро тує Ве фуз Туга Су ми

З КЕ за 35

Су А АН Суа Са На Уві спи то дви Ме Ази Те 2Е «МНЕ Я

Ді З «їй ВЕ «Ва ЩШтучив послів

ЕКх хИЯт похідна поко ну «т шух

Май «дої» ВАРІАНТ еЕХХ 8 кдеяе Кай прецютвев собою ами емаюияну каолету ках» «Феї ВАРІДНТ кеша КН, І2ОЇ

Кей ВМінекИсСтОТи В ПОЛОжЖенКИ ТК 15 положенні ХО утворюють рве

ХА дО

Туга сви у ТЕ РНе Требег Ар ТуЄ ет ув Туг ев вври ї 5 то 15

СУ АЛЕАН Ку СНИ КМ мана Тр МеК Аза т вхо 25 «ев «11 Я5 ка ВЕК «1 крема послідовність «а «ЖИ» похідна мцокатону «ТЦ кухї» ВАРІАНТ «ИЙ і «ой Кав прадетанляє собою вмикзомастну кислоту «рих «ВТ» ВАРІАНТ «ий НИ, (2

АВЖО ВМмінокистоти я поплежень то хз положенні б утвОорюких кіпьця «ще

Ту Хва СВ СМУ Тег Бра Те ОагАвр Туг Зег ув Тут Кен Авр СИ з х та ії ув ув А ів им ве Уві сна Тр ес Мед т хе вх «Вір о «діа» ВЕТ «13 Цітучна постдеяніить «ка «ай похідна глюкюатну «МОХ «сти БАВАНТ хошх 12 «шаЇ» Хаз повдетавляє собою зміноізомаєснянуУ кмопоту «ВИ каші БАКА «Шодм ,20) хе вмінОокислети впогомяанн та положенні зо утворюють КИНЕ ех 22

Ти Каз Зв СЯу Пе ва Тог ХебАзр Гугбегіув Туг ву Авр СЯ 1 5 то 15 іук Ага був був ЄМО На ма іп Тер бо Ме АВИ ТНК

«10 З «ЕР В киій» ВТ клі штучна поспідовністе «ТК дя пюжкіднатлюювану аа хай» БАБЗАНТ «МИ 2) «ХУ» Хазвпредатавляє ообокх гнанозомаовину КиИстОТУ «и хаіз БАРАН «ВІЙ СНД СО) «Мам знаїмокнопоти з положенні б та положенні ой утворюють хкілпьще «що

ТугХва сни СВ ТВ еВе ТВ Баг АЗОВ Туг Жег і уз Ту сує Аа ці

Ї 5 Бе 15

Муз Ар АЦІЛІВ СУ че уМамонтьітруви МЕ АВА ТК то 25 ка ха ат» 5 «п1йм ВИТ хата Штучна послідовних еИДКх «и похідна слюкатну «ІД «пйі» ВАРІАНТ пф КЕ «чиам Хва предстввля» собою аваеиаомастяну киспоату «ОД каві» БАБАНТ «ай С Я

ВИЗ ВМО тТИи В ПОЛЕОКЕЯЗЯ ТВ тв положенні КО утеррюють клеце хат МА

ТусжХев в НУ Те ве Тв: БекАвр Кук Зег ув Суз Меи Авр ми

З В о та

ГувАка АВ уз С Не Уві Се Тв ен Ме Аве Те «НІ ей «а 89 київ» БЕ ка135 ШНучна послідовність «ов похднатпевнагну «ПМК ма «раї» ВАРІАНТ

«ке (8) хи» Хвасприедстазляє собою вмінаіомасляну кислоту

ЗДЕСЬ

«в БАБА еЕШЕе АВ (МОХ ся вмінокиспови в полаженм 1 ва положенні дО уторюють кільце «Що» яв

Тусхва са Сну Те Ба пе ме АВ Тут баг іув тубі ви АВМ

Я В 36 ча муз'аку Ав ів Су і ма сна Сто бе МЕН Аеа З

За «ае 6 «Вії» У «дам ВТ ей» Цучна послідовність

ЗИМ саке похідне Ток ОНу «ахОух «те БАРІДНТ дай й ккой» Хма прадотавиляє собою змінезамасляну киопоту «2» БАРАНТ

«ие (ТВ КО ша» щМІНОкковОги В положенні ТО те положенні й утізорннуть Кім «а» В пірхяа сно су Тег ве Ті бе: Азо тує осів п Б АВо Ка і З то 15

Сук бла ів Був аво іна Удешн тт ен Ме Аг Не о 25 «Ве й?

ЕІ Я хаїйе ВИТ -й13е Штучна поспідовність оо» «ши похідне гаюкауену «Доїе коді» ВАРІАНТ еккам (8) кройе кава преумвавна собою аміноавомасляну кислоту ко «дйі1х ВАРІАНТ крови БК ЕЙ ой» дМінНекиспоти в попохомчк; 15 та полеженні о утво КЗБЦе дО» г?

Тусхав На Су Те Не Ме Зег йо Тує Бек ув Тут дво Авр си

Е ї та 15

Сбуз АпрАВ УВ АВр Ле Мао Тр іа МмМаєааий Тр

АК й «дії дО «хе РКЕТ «13» Ціучна пос ндеавнєть

Ус

У хЕийе похідна глюкагону «ШІ «Ії» ВАРІАНТ «ее пе» Ха предотавняе собою амінокомаслину квслету

У

«йаї1х ВАРІАНТ кдд ЯКО «До» амінокислота в положенні З та лопоженні хо утворюють фльце ка» хв

Тех ва спа 5 Тит Ріне Уві баг Аве Тут Бек був Ту Сем Ав ї В о 35 сук АЛ Ка уз хо Ре Уві Прі Ме Ав Тег то тб

«Вік в кої» а «им БКТ -иїйх (тучна песмидовність «В ей» похідна гиюкасу «ех хряіх МАРАТ «Мак (Фі «ух Хва продотивляк собою вміновомаєвану кислоту еще «ші» БАБАНТ «рай ІА «а» вмівокистоти а положенні т та чноапоженні во утнорюють кльце са ЗО

Тугхав осів слу Ту Бі Тут Ян ер губ Заг ув (ре МеВ) ВО СЮ

З З юю 15

Аг Ак Аза уз Авро біже ма! С ТИХ м КАВА ТА «а 28 как «ві УЗ ких ЕТ иа 0 Пісучна постцевнеть «ДВОХ жи похідна гпюбагону «КшОх «щі» БАРІАНТ кашах ІЙ) «йшаж Хаа представили собию амвенасмаспяну КЕолОоту «ИрОг «ад» ВАБАНІ «вах С ОО «коиам вМмінокисиотТи в попоженні 16 та попохахчні 20 утабрюкутх килеців «ае о

Зуд ква св СХ іх оре ТВ се ав Ту Бег був Сув ах дерми

З 5 ЩК 15 ме ер АВ и бр Ва ча СО Те де Ме Ав ТВ о в «шт «Ех З «ща РА «ие Мітучна пекидовність «ДЮЕШЕ «Ви пок лю ОоНу

«МОХ хіх ВАРІАНТ «ййшх ї53 «й Хва прадестввняє собою амівовомасивну випоту «аа «аі» ВАМАНТ «йВаю М ких ВАННОКИСНОТИ З НОпОеНН! ТЕ та полеменні 21 утаврюкуна кілкця «НІ З

ТугХва спи СЯу ТВ ее Ті Бог Ар Гугбегіув Тустецаао був

З З НЕ 15 іч АВ ув КО Те Ма Ов Тр се Ме АВ ТНЕ о Зв жеНкх З «о» В «Ід ВТ кої Пн уЧчНА пОСТДОВНІТЬ «ТВО «ВІЇ похідна глюкаюну кад «оди ПБГ «по» амінокислати з пеложенні 15 та положенні 18 утворювюв кільце

«ЩО» 55 щас сну Ту Бе Тек охег Аа Туббекіує Тускец ар см ув з Е 10 їх

Акад ув ва Біла мі МА Тр я МН Адв ТАг 2 25 «ве Ха «дії У «їй ВИ «13 Штучна послідовність «Кае «ре похідна глюкагану хво «ва» ВАРІАНТ «ДИй «Кий» Хви предсуавляє добою вмізовомаєтаму киспоту ки» ВАРІАНТ «ЗХ» (ВМО «Жий» вмінокиєпоти влопоженні ТО та положенні о утворкчотв кізьме «ам 3 тА С (Му т не Те бек Азо Ту Зеєьув Тугісув Авр СУ 1 5 Ек) їх

Агар аАга АВ Був сна Не ма сна Тер де МЕСАВИ ТА: «В ща «В хо «вх» РВК «3» Онучна поспідовність.

ДА

«лам пахне юка оНу «200 «віз ВААНТ «ЯЗ Хвапредетавинє собою амінееомастяму кислоту аКМе «ййїх ВАРІАНТ «ода» В, «ВИЙ вМінОоКистОти г полеженні 1 тв положенні ХО утеррюють кльце «Ве 54

Тж Хваснпа су Тв рве тре БегАзр Туг вег бух Тує Сув АВР НИ 1 5 чо Тк

АврАцу А УВС ня Уа ою тру МерАВИ Гог о 5 хе З

Зб

«фія ща «од» ДНК «Важ УЧНІ пелет

Ве «КЗ» прамий праймер «що 35 сецспаовоє зво соцівепам ооо я «они о «і» 32 «там ДНК

Кай. Ціучна послідовнть «Вод» «иа» зворотний ПошИМеВ «кащмю Зв іавосцвої сісзовзава зсізяосюю со За

Claims (2)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Похідна глюкагону, що складається з амінокислотної послідовності, вибраної з групи, що складається з амінокислотних послідовностей, представлених в 5ЕО ІЮ МО5: 20, 21 та 27, де амінокислоти у позиціях, що відповідають позиціям 1 і 2 нативного глюкагону, замінені тирозином і аміноїзомасляною кислотою (Аіб), відповідно, та кільце сформовано в амінокислотній послідовності шляхом заміщення амінокислот у позиціях, що відповідають позиціям 16 та 20 нативного глюкагону, на глутамінову кислоту та лізин, відповідно, і ізоелектричні точки змінюються, де похідна зберігає активність рецептора глюкагону/стимулює рецептор глюкагону.

2. Полінуклеотид, що кодує похідну глюкагону за п. 1.