UA129977C2 - Спосіб отримання дріжджових білків та застосування одержаного екстракту дріжджового білка в харчуванні людини та тварин - Google Patents

Abstract

Винахід стосується способів отримання дріжджових білків, де в одному випадку спосіб отримання дріжджових білків включає стадії a) забезпечення дріжджової суспензії, b) вплив на цю дріжджову суспензію за допомогою термічного плазмолізу при температурі від 70 до 95 °С протягом періоду часу від 30 секунд до 4 годин, c) вплив на всю кількість активності щонайменше однієї рибонуклеази і однієї глюканази, послідовно або одночасно, при температурі від 40 до 65 °С протягом періоду часу від 8 до 24 годин, d) розділення нерозчинної фракції і розчинної фракції, де нерозчинна фракція, зібрана на стадії d), не має смаку, має вміст нуклеотидів менше ніж 3 % і справжній вміст білка, що становить щонайменше 72 %, де дезаміназну активність також застосовують на стадії с). В другому випадку спосіб отримання дріжджових білків включає наступні стадії a) забезпечення дріжджової суспензії, b) вплив на цю дріжджову суспензію термічного плазмолізу при температурі від 70 до 95 °С протягом періоду часу від 30 секунд до 4 годин, b') розділення нерозчинної фракції і розчинної фракції, c) вплив на нерозчинну фракцію активності щонайменше однієї рибонуклеази і однієї глюканази, послідовно або одночасно, при температурі від 40 до 65 °С протягом періоду часу від 8 до 24 годин, d) розділення нерозчинної фракції і розчинної фракції, де нерозчинна фракція, зібрана на стадії d), не має смаку, має вміст нуклеотидів менше ніж 3 % і справжній вміст білка, що становить щонайменше 72 %, де дезаміназну активність також застосовують на стадії с). Різниця між способами полягає в тому, що в одному випадку ферментативну обробку проводять перед поділом розчинних та нерозчинних фракцій, а в другому випадку ферментативну обробку проводять після поділу розчинних та нерозчинних фракцій. Винахід стосується також застосування одержаного за способами екстракту дріжджового білка в харчуванні людини та тварин.

Description

Даний винахід стосується галузі білків, які походять із мікроорганізмів, а більш конкретно - отриманих із дріжджів, які можуть широко використовуватися в харчуванні, здоров'ї і благополуччі людини та тварин.

ЦИТОВАНА ЛІТЕРАТУРА

Білки являють собою головний компонент тканин людини і тварин. З точки зору харчування білки гідролізуються протеазами і пептидазами до пептидів і амінокислот. Амінокислоти забезпечують організм необхідними елементами, такими як азот, вуглеводи і сірка. Організм не фіксує мінеральний азот для включення його в органічні молекули, тому азот забезпечується амінокислотами. Сірковмісні амінокислоти забезпечують сірку, важливу для обміну речовин. Амінокислоти також є важливими елементами для синтезу білків, пептидів і речовин із низькою молекулярною масою, які є фізіологічно важливими, таких як глутатіон, креатин, дофамін, серотонін і т. д. Потреби в білку для харчування людей і тварин ростуть відповідно зі збільшенням населення світу. Отже, існує необхідність у пошуку додаткових і/або альтернативних джерел білка для білків тваринного походження. Білки вже отримують з рослин (злаки, бобові) або комах. Отримання білків мікробного походження залежить від механізмів ферментації, які відомі протягом сторічь. Мікробні білки є або компонентами всієї клітини або клітинної стінки, або виділеними білками. Одним із недоліків білків мікробного походження для харчування людини є вміст нуклеїнових кислот в ізолятах. Цей вміст повинен бути низьким, тому що одним із кінцевих продуктів метаболізму нуклеїнових кислот є сечова кислота, яку людський організм не може розщепити через нестачу ферменту урикази, необхідного для її катаболізму. Іншими недоліками є, наприклад, вихід екстракції або чистота білків, отриманих шляхом виділення з мікроорганізмів.

Після лізису клітин, наприклад, дріжджових клітин, білюи звичайно виділяються у "благородній" фазі, тобто в розчинній фазі, яка відповідає дріжджовим екстрактам і містить сполуку з чудовим смаком. Однак смак може бути недоліком залежно від передбачуваного застосування отриманого білкового екстракту.

Три патенти однієї і тієї ж групи стосуються отримання концентрованих білків екстрактів.

Патент 05 3867555 розкриває спосіб, який дозволяє отримувати білкові екстракти з низьким вмістом нуклеїнових кислот. Клітини руйнуються механічно (високий тиск, ультразвук) або хімічно (автоліз, зовнішні ферменти), так що білки залишаються у розчинній фракції. Однак ці білки змішуються з результатом гідролізу, тобто з амінокислотами, пептидами і полісахаридами або простими цукрами. Після центрифугування для відділення і видалення нерозчинної фракції білки осаджуються, і лужна обробка забезпечує гідроліз нуклеїнових кислот, які згодом видаляються фільтрацією. Однак загальний вихід "негідролізованих" білків низький.

Патент 05 3887431 розкриває використання ендогенної нуклеази, виявленої в розчинній фракції після лізису дріжджів, для розкладання нуклеїнових кислот. Стадія вакуумного концентрування дозволяє отримати як концентрований білковий екстракт, так і продукт, що має слабий смак і запах.

Патент ШО5 3991215 розкриває спосіб, при якому після розриву клітини до розчинної цитоплазматичної фракції застосовують нагрівання ультрависокої температури, що дозволяє отримати багатий на білок екстракт з невеликою кількістю нуклеїнових кислот.

Нарешті, можна слідувати кільком напрямкам для поліпшення методів виділення білків із мікроорганізмів з метою отримання більш високої чистоти, кращого виходу і/або білкових екстрактів, які можна використовувати безпосередньо для харчування або як харчові добавки.

СУТЬ ВИНАХОДУ

Всупереч напрямку, прийнятому в традиційних методах, автори винаходу розробили спосіб виділення білків мікроорганізмів із нерозчинної фракції, отриманої опісля лізису вказаних мікроорганізмів. Цей новий спосіб дозволяє отримувати концентровані екстракти негідролізованих білків із низьким вмістом нуклеїнових кислот, ароматом і запахом та з добрим виходом.

Спосіб за даним винаходом починається з лізису клітин, переважно шляхом термічного плазмолізу, який приводить до інактивації ферментів мікроорганізмів і вивільнення в середовище вільних амінокислот, включаючи глутамінову кислоту. Їх піддають впливу ферменту типу глюканази і ферменту типу рибонуклеази з подальшим розділенням, після якого нерозчинна фракція представляє продукт, який цікавить, який має вміст істинних білків, що становить щонайменше 72 95. У іншому варіанті здійснення винаходу перше розділення проводять після фази термічного плазмолізу, і тільки нерозчинна фракція, яка містить білки, полісахариди і РНК, піддається дії глюканази і рибонуклеази, а потім знову розділяється для збереження багатої на білок нерозчинної фракції.

Отриманий білковий екстракт не має смаку і запаху і містить мало нуклеїнових кислот.

Білковий екстракт, який все ще містить ліпіди, отримані з мембрани, може бути деліпідований методами, відомими фахівцям у даній галузі, такими як екстракція розчинником типу гексану або етанолу, надкритичним СО» або шляхом обробки ліпазами або фосфоліпазами з подальшим відділенням від солюбілізованої фази.

Отримані білки можуть бути використані безпосередньо для харчування, харчових добавок і т. д.

ВИЗНАЧЕННЯ

Під мікроорганізмом мається на увазі живий організм, невидимий неозброєним оком, але видимий під мікроскопом. У даному винаході мікроорганізми переважно являють собою бактерії (прокаріотичні мікроорганізми) або дріжджі (еукаріотичні мікроорганізми). Дріжджі в однині або множині - це загальний термін, який позначає еукаріотичні мікроорганізми, здатні викликати ферментацію органічних речовин. Серед дріжджів невичерпно згадуються дріжджі роду Засспаготусевз, Сапаїйада,

Ріспіа, Кіпумхеготусезв.

Дріжджова суспензія означає суспензію дріжджів, отриману після розмноження в посудині і після центрифугування, що дозволяє відділити вказану суспензію від оточуючої рідини, яка також називається суслом. Розмноження також можна назвати культурою або, в більш широкому значенні, ферментацією.

Білки являють собою макромолекули, які складаються з послідовності амінокислот, зв'язаних разом пептидними зв'язками. Вони входять до головних основних компонентів усіх клітин тварин і рослин. Вони становлять до 50 95 сухої ваги живого організму і становлять від 15 до 20 95 нашої добової споживаної енергії. Їжа і білки організму є основними джерелами азоту і амінокислот, які виконують кілька основних метаболічних функцій: вони є субстратами синтезу білка, попередниками важливих азотовмісних сполук в організмі (нуклеїнові кислоти, монооксид азоту, глутатіон і т. д.) і субстратами енергетичного обміну.

Загалом, в агропродовольчих товарах під вмістом білка вважається рівень азоту, помножений на 6,25 (коефіцієнт 6,25 отримується із середнього вмісту азоту в білку, який становить 100/6,25, тобто 16 95). Під істинними білками мається на увазі вміст білка, близький до реального, з поправкою на зміщення, викликане небілковим азотом, наприклад азот нуклеїнових кислот. Таким чином, можна сказати, що вміст істинних білків являє собою загальний азот за вирахуванням азоту нуклеїнових кислот і аміачного азоту, помножений на 6,25. Альтернативно, вміст істинних білків можна оцінити за допомогою аналізу загальної кількості амінокислот. Під інтактними нативними білками маються на увазі білки мікроорганізму в тому стані, в якому вони знаходяться в живому мікроорганізмі. По суті, денатуровані нативні білки мають потенційно змінену просторову конформацію через фолдинг або коагуляцію. Білки також можуть бути частково або повністю гідролізовані.

Під плазмолізом мається на увазі порушення непроникності мікроорганізму, переважно дріжджів, або його компартментного аспекту. Далі відбувається втрата води через проникність мембрани.

ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ І ВАРІАНТІВ ЗДІЙСНЕННЯ

На Фігурі 1 показані два основні варіанти здійснення способу за винаходом. На фігурі 1А показаний спосіб, в якому немає стадії розділення між плазмолізом і ферментативним гідролізом. На Фігурі 18 показаний спосіб, в якому розділення проводять після стадії плазмолізу, і де ферментативний гідроліз проводять на нерозчинній фракції, отриманій внаслідок цього розділення.

На Фігурі 2 представлені відповідні профілі білків білкового екстракту, отриманого способом за винаходом, і так званого традиційного білкового екстракту, отриманого за допомогою відомого способу екстракції білків з розчинної фракції, отриманої на стадії плазмолізу.

Спосіб за даним винаходом можна застосовувати до будь-якого типу дріжджів, більш конкретно - до будь-яких дріжджів, які мають базове застосування в харчуванні людини або тварин. З промислової точки зору, спосіб згідно з винаходом реалізовується на дріжджовій суспензії, такій як визначено вище, тобто на суспензії дріжджів. Переважно дріжджі вибирають із дріжджів роду басспаготусез, Ріспіа,

Сапаїда, Кісумеготусе5, Магоумла або УМіскегпатоптусез. Більш переважно дріжджі вибирають із зЗасспаготусевз сегемівіає, Ріспіа іадіпі (що також називається Сапаїда шіїв), Ріснпіа равіогів,

КіІсумеготусез Іасії, Кіпумеготусез тагхіапив, Маїтоула Ігроїуїса, УмісКкетатоїтусез апота|изг і т. д. Ці дріжджі містять від б до 11 95 азоту. Азот вимірюється методом К'єльдаля, відомим фахівцям. Як указано вище, істинний вміст білка екстрапольований з цього аналізу азоту з використанням коефіцієнта множника 6,25.

Культивування дріжджів здійснюється відомими фахівцям методами. Один протокол описаний в довідковій роботі "Уєаві Тесппоіоду" Сегаїй Кеєй апа Тіак Му. Мадодам/йнапа (І58М 0-442-31892-8), 284-293. Вказана культура, яка також називається біомасою, збирається центрифугуванням або фільтрацією і може бути промита. Отримується дріжджова суспензія.

Потім клітини піддаються механічному або хімічному руйнуванню із використанням відомих методів, таких як гомогенізація під високим тиском, механічне подрібнення, ультразвукова дезінтеграція, цикли заморожування-розморожування, які повторюється, осмотичний шок або ферментативний лізис. У одному переважному варіанті здійснення винаходу дріжджі піддають термічному плазмолізу при температурі від 70 до 95"С залежно від типу дріжджів. Температура переважно становить від 80 до 90 "С. Фахівець у даній галузі може відрегулювати температуру і/або час лізису, наприклад, залежно від стійкості клітин і/або ферментів на цій стадії бажана інактивація.

Час становить від 30 секунд до З годин, до 4 годин, більш переважно 1 хвилину, 5 хвилин, 10 хвилин, хвилин, 45 хвилин, 1 годину, 1 годину 30 хвилин або 2 години, до З годин, навіть 4 години. Ця стадія плазмолізу дозволяє денатурувати дріжджі, інактивувати ендогенні ферменти і підвищити проникність мембрани, забезпечуючи вивільнення розчинної фракції. Розчинна фракція по суті містить вільні амінокислоти, низькомолекулярні пептиди, мінерали і, серед іншого, деякі амінокислоти, які впливають на смак, наприклад, глутамінову кислоту.

У першому варіанті здійснення винаходу вся кількість, яка отримана на стадії плазмолізу і містить розчинну фракцію і нерозчинну фракцію, піддається одній або більше ферментативним активностям.

Мета цієї стадії - солюбілізувати максимальну кількість компонентів, які не є білками, без впливу на білки. Переважно використовують рибонуклеазну активність (ЄС 3.1.4.1) і глюканазну активність (ЄС 3.2.1). Ферментативні активності можна здійснювати послідовно або одночасно. Активність рибонуклеази перетворює РНК в 5'-нуклеотиди і солюбілізує останні, примушуючи їх перейти в розчинну фракцію. Можна використовувати кілька рибонуклеаз, наприклад суміш ендо- і екзонуклеаз.

Необов'язково, дезаміназу можна використовувати для перетворення АМР в ІМР з метою відновлення властивості поліпшення смаку розчинної фракції. Дія однієї або більше глюканаз дозволить солюбілізувати полісахариди стінок до розчинних олігосахаридів. Час і температура повинні регулюватися залежно від характеристик ферментів, які використовуються. Температура становить від 40 до 65 "С, переважно 60 "С. Час становить від 8 до 24 годин, переважно від 16 до 24 годин, більш переважно 18 годин. Ця ферментативна стадія, по-перше, дозволяє отримати нову розчинну фракцію, яка включає нуклеотиди, полісахариди (приблизно 60 95 від загальної кількості вуглеводів) і невелику частку амінокислот, а по-друге, нерозчинну фракцію, яка в основному містить білки.

Остання стадія - розділення розчинної фракції і нерозчинної фракції.

У другому варіанті здійснення винаходу розділяють розчинні і нерозчинні фракції, отримані на стадії плазмолізу. Розчинна фракція відкладається, видаляється і може бути відновлена у вигляді дріжджового екстракту. Нерозчинна фракція включає оболонки (або стінки), полімери, полісахариди,

РНК ії білки, які коагулюють при нагріванні. Ця нерозчинна фракція зберігається. Вона піддається ферментативній активності рибонуклеази і глюканази, такої як указано вище, відповідно до аналогічного протоколу інкубації (температура, час), і розділенню розчинних і нерозчинних фракцій.

Кінцева розчинна фракція може бути відкладена і використана.

Кінцева нерозчинна фракція, отримана внаслідок ферментативного розщеплення, має вміст "істинних" білків, який більше або дорівнює 70 95, переважно більше або дорівнює 72 95, 8095 ї до 85 95. Загалом дріжджі містять від 50 до 55 95 "істинних" білків. За допомогою способу за винаходом можна видалити багато елементів і отримати продукт з більш високою концентрацією білка.

Необов'язково, кількість ліпідів у цій нерозчинній фракції можна зменшити або завдяки дії розчинників (етанол, гексан), або завдяки надкритичного СО», або завдяки дії ліпази або фосфоліпази. Таким чином, можна досягнути істинної чистоти білка більше 80 95.

У одному варіанті здійснення винаходу відповідні дії рибонуклеаз і глюканаз здійснюються послідовно в будь-якому порядку. У одному переважному варіанті здійснення винаходу рибонуклеазна і глюканазна активність застосовуються одночасно.

Отриманий продукт може бути ліофілізований, висушений способом, відомим фахівцям, наприклад розпилювальним сушінням або вакуумним сушінням, і може зберігатися зі збререженням його якості і властивостей.

Отже, в одному варіанті здійснення винахід стосується способу отримання дріжджових білків, який включає наступні стадії: а) забезпечення дріжджової суспензії; р) вплив на дріжджову суспензію термічного плазмолізу при температурі від 70 до 95 "С протягом періоду часу від 1 хвилини до З годин, переважно протягом від 40 хвилин до 2 годин; с) вплив на всю кількість щонайменше однієї рибонуклеази і однієї глюканази, послідовно або одночасно, при температурі від 40 до 65 "С протягом періоду часу від 8 до 24 годин; а) розділення нерозчинної фракції і розчинної фракції, де нерозчинна фракція, зібрана на стадії 4), не має смаку, має вміст нуклеотидів менше ніж З 95, і істинний вміст білка становить щонайменше 72 95.

У іншому варіанті здійснення винахід стосується способу отримання дріжджових білків, який включає наступні стадії: а) забезпечення дріжджової суспензії;

БЮ) вплив на цю дріжджову суспензію термічного плазмолізу при температурі від 70 до 957 протягом періоду часу від 1 хвилини до З годин, переважно від 40 хвилин до двох годин;

Б) розділення нерозчинної фракції і розчинної фракції; с) вплив на нерозчинну фракцію активності щонайменше однієї рибонуклеази і глюканази, послідовно або одночасно, при температурі від 40 до 65 "С протягом періоду часу від 8 до 24 годин; а) відділення нерозчинної фракції від розчинної фракції, де нерозчинна фракція, зібрана на стадії а), не має смаку, має вміст нуклеотидів менше ніж З 95 і вміст істинного білка, що становить щонайменше 72 905.

У іншій частині даного опису нерозчинна фракція, зібрана на стадії 4), також може називатися "(дріжджовим) білковим екстрактом за винаходом". Навпаки, екстракт дріжджових білків, отриманий відомим способом з розчинної фракції, отриманої в результаті плазмолізу, можна назвати

"традиційним білковим екстрактом".

У одному переважному варіанті здійснення винаходу дріжджову суспензію на стадії а) отримують у результаті ферментації дріжджів, вибраних з Засспаготусез сегемівзіає, Ріспіа, переважно Рісніа іадіпії,

КіІнумхеготусе5, переважно Кіпумеготусе5 тагхіапизог Кісумеготусевз Іасії5, Магоміа, переважно

Уатоміа Іротойіспатотусев, або М/іскгоула Іротегдупатотусез. Переважно дріжджі вибирають із бЗасспаготусев сегемізіає, Ріснпіа |адіпії або Кісоумеготусе5з тагхіапих. Переважними дріжджами є зЗасспагоітусез сегемізіає.

У одному переважному варіанті здійснення винаходу стадія термічного плазмолізу а) проводиться при температурі від 80 до 90 "С.

У одному переважному варіанті здійснення винаходу глюканазна і рибонуклеазна активність застосовується одночасно.

Необов'язково також може застосовуватися дезаміназна активність.

Переважно дріжджова суспензія, яка використовується на стадії а), містить дріжджі, збагачені селеном. Культивування дріжджів, збагачених селеном, можна провести за методом, відомим фахівцям у даній галузі, наприклад, за методом, описаним у заявці ЕР 1478732. У цьому випадку вміст селену у дріжджовій культурі може досягати 3000 м. ч. або навіть вище.

Продукт, отриманий у нерозчинній фракції, має виключно азот білкового походження в кількості вищій або такій, що дорівнює 11,5 95 сухої речовини, тобто 72 95 істинних білків (використовуючи коефіцієнт перетворення 6,25, наведений вище). Звичайно дріжджі мають максимальний вміст азоту 11 95, що дає 69 95 потенційних білків. Дріжджі також містять небілковий азотний матеріал (нуклеїнові кислоти, РНК, ДНК). При відніманні азоту нуклеїнових кислот від загального азоту дріжджі містять тільки від 50 до 55 95 білків. Отже, мінімальний вміст 72 95 білків, отриманих в кінцевій нерозчинній фракції, є характеристикою способу за винаходом. У цій же нерозчинній фракції загальний вміст нуклеотидів становить від 0,8 до 1,5 95 і до З 95, загальний вміст вуглеводів становить від 1 до 8 95 (антроновий аналіз, відомий фахівцям у даній галузі), з відповідним вмістом від 0,2 до 4 95 для глюканів, від О,2 до 4 95 для мананів, від 7 до 15 95 для ліпідів, від 1 до 7 96 для мінеральних речовин.

Було б цікаво провести відмінність між екстрактом дріжджового білка, отриманого способом за винаходом, і екстрактом згідно з попереднім рівнем техніки, а саме - екстрактом білка, отриманим із розчинної фракції після стадії лізису і концентрування клітин, який буде мати вміст білка, що становить щонайменше 72 95, і, можливо, вміст нуклеотидів менше ніж З 905.

Для цієї мети сумарні ліпіди аналізували на білкових екстрактах, отриманих з Засспаготусевз сегемізіає, з використанням гравіметричного методу після кислотного гідролізу і екстракції гексаном на апараті Сокслета. Рівень ліпідів був систематично вищим ніж 7 95. Таким чином, нерозчинна фракція, зібрана на стадії а) в способі екстракції за винаходом, має вміст ліпідів вище ніж 7 95. Для порівняння, в "традиційному" екстракті дріжджових білків вміст ліпідів становить нижче ніж 1 95. Вміст ліпідів може відрізнятися залежно від виду або штаму дріжджів. Як правило, для промислового продукту вихідний мікроорганізм вказується в технічному паспорті. Фахівці в даній галузі зможуть екстраполювати і вивести комбінацію видів/вмісту ліпідів у білковому екстракті.

Сумарний Мо» у супернатанті

Для екстракту дріжджового білка за винаходом, підданого стадії деліпідування, вміст ліпідів може бути недостатнім, щоб розрізнити два походження. Потім порівняльний аналіз можна завершити шляхом оцінки профілю розчинності білка в білковому екстракті. Відсоток розчинності визначається за наступним рівнянням: 95 розчинності - Сумарний МО у су пернатані

Вихідний Мо» у реакційному середов ищі де Моб означає відсотковий вміст азоту, що визначається за методом Кєльдаля.

Розчинність білкового екстракту за даним винаходом становить менше ніж 3,5 95 у воді.

Для порівняння, "традиційний" екстракт дріжджових білків вважається розчинним і містить тільки від 5 до 10 95 нерозчинних елементів.

Сумарні амінокислоти - вільні амінокислоти

З тією ж метою порівнювали профілі молекулярної маси між екстрактом дріжджового білка за винаходом і екстрактом білка з попереднього рівня техніки. У екстракту дріжджового білка, отриманого згідно з винаходом, відсутній пік з низькою молекулярною масою. Велика частина білкового профілю розподіляється близько 40-45 кДа. Найменші сполуки виявляються при приблизно 500 Да, що відповідає низькомолекулярним пептидам. Для порівняння, профіль "традиційного" дріжджового білка демонструє кілька піків молекулярної маси і істотну кількість для низькомолекулярних мас. Ці профілі можна екстраполювати і виміряти співвідношення:

Су марніамінокислоти - в ільні амінокислоти

Су марніамінокислоти (амінокислоти, проаналізовані традиційним методом визначення амінокислот в продуктах харчування, наприклад, офіційним методом Регламенту Комісії (ЄС) Мо 152/2009). Це співвідношення близьке до 1, завжди вище 0,9 для екстракту дріжджового білка за винаходом, тоді як воно може становити від 0,30 до 0,85 для "традиційних" екстрактів дріжджового білка.

Продукт, отриманий способом за винаходом, відрізняється від відомих білкових екстрактів своїм мікробним походженням, іншими словами, він не рослинний і не тваринний, своїм високим вмістом білка, низьким вмістом нуклеїнових кислот і залишковою присутністю ліпідів клітинної мембрани, якщо не застосовується деліпідуюча обробка. Крім того, він не має смаку. Його мікробне походження також має ту перевагу, що він отриманий із сировини, яка, як відомо, не є алергенною.

Основною перевагою дріжджових білків є їх поживність. Таким чином, продукт, отриманий способом за даним винаходом, є джерелом білків, що має одну головну перевагу: його якість, представлена шкалою РОСААФЗ (оцінка амінокислот із поправкою на засвоюваність білків), відповідає 1, тобто аналогічна показникам контрольного тваринного білка, такого як казеїн і овальбумін. Оцінка якості білка дозволяє визначити його здатність задовольняти метаболічні потреби. У результаті будь- яке застосування, пов'язане з харчуванням і харчовими добавками, або спортивними добавками, може використовувати білковий екстракт, отриманий способом за винаходом. Застосування, наведені в даному описі заявки, не є всеосяжними.

У контексті харчування, здоров'я і благополуччя людини вказаний білковий екстракт можна використовувати для контролю ваги, як добавку для спортсменів або немолодих людей, як харчову добавку або у формі батончика або напою з високим вмістом білка. Наприклад, вказаний білковий екстракт можна використовувати як джерело нетваринного білка для дієт веганського типу, наприклад, у молочних коктейлях, гамбургерах, нагетсах, м'ясних делікатесах на рослинній основі, начинках для равіолі, фрикадельках, вівсяних пластівцях, ароматизаторах для макаронів. Точно так само у багатих на білок хлібові або хлібопекарських виробах можна використовувати білкові екстракти, отримані способом за даним винаходом. Як вказувалося раніше, ці білкові екстракти мають ту перевагу, що вони не додають смаку, гіркоти або присмаку, характерних для деяких сучасних білків рослинного походження або водоростей. З точки зору здоров'я людини вказаний білковий екстракт можна використовувати для харчування немовлят або лікувального харчування, тобто для перорального або ентерального харчування, для усунення дисбалансу харчування. Переважно, коли білковий екстракт отримують із дріжджової суспензії, збагаченої селеном, його можна використовувати як харчову добавку, яка стимулює імунітет і/або поліпшує якість шкіри, волосся і/або нігтів.

Нарешті, вказаний білковий екстракт можна використовувати як джерело білка в кормах для тварин. Переважно, коли білковий екстракт отримують із дріжджової суспензії, збагаченої селеном, тварини будуть мати перевагу комбінованого надходження білків і селену, причому вказаний селен є біодоступним, оскільки він інтегрований в білки в формі селенометіоніну.

Таким чином, винахід також стосується застосування екстракту дріжджового білка з істинним вмістом білка, що становить щонайменше 72 95, отриманого відповідно до будь-якого з варіантів здійснення способу за винаходом, як харчової добавки для контролю ваги для немолодих людей або спортсменів, використання вказаного білкового екстракту як джерела нетваринних білків у напоях, хлібопродуктах або м'ясних делікатесах на рослинній основі, використання вказаного білкового екстракту в пероральному або ентеральному лікувальному харчуванні, або використання вказаного білкового екстракту для харчування тварин. Іншими словами, в одному варіанті здійснення винахід стосується способу доповнення харчування для харчування людей і/або тварин, який включає стадії: - отримання екстракту дріжджового білка шляхом реалізації будь-якого з варіантів здійснення способу отримання дріжджових білків згідно з винаходом; і - введення вказаного білкового екстракту, відповідно, людині як харчової добавки для контролю ваги, немолодим людям або спортсменам і/або тваринам як споживаного білка.

Як згадувалося раніше, кінцева розчинна фракція способу за винаходом також може бути відкладена і використана. Завдяки високому вмісту вуглеводів її можна порівняти зі солодким соком.

Загальний вміст вуглеводів становить від 45 до 70 95. Ці вуглеводи знаходяться у формі глюканів (від до 40 95) і мананів (від 25 до 3595), що дозволяє використовувати цю розчинну фракцію для імуностимуляції, зокрема, для здоров'я тварин. Залежно від типу глюканази, що використовується, також може вивільнятися вільна глюкоза. Ця розчинна фракція багата на загальну кількість нуклеотидів, зокрема 5'-ОМР і 5-ІМР, коли АМР перетворюється в ІМР дезаміназою. Тому його можна використовувати як підсилювач смаку. Коли АМР не перетворюється в ІМР, продукт можна використовувати для маскування гіркоти або другорядних запахів, як розкрито в заявці на патент

ЕВ1762074. Його склад також робить його добрим субстратом для росту різних мікроорганізмів і, зокрема, бактерій.

Наведені нижче приклади можуть проілюструвати даний винахід. Їх не можна тлумачити як обмеження обсягу винаходу.

ПРИКЛАДИ

Приклад 1: Приготування концентрованого білкового екстракту (» 75 95) з Засспаготусез сегемізіає

Проводять ферментацію Засспаготусев сегемізіае в умовах, які дозволяють досягнути високого вмісту азоту в дріжджах, близько 1095 сухої речовини азоту. Використовують розділення на центрифузі сусла цієї ферментації, щоб отримати дріжджову суспензію із вмістом дріжджів 16-18 905 сухої речовини, і промивають суспензію.

У лабораторії проводять термічний плазмоліз З кг цієї багатої на азот промитої суспензії: доводять температуру суспензії до температури від 70 до 95 "С за допомогою теплообмінника, потім залишають

З кг суспензії інкубуватися в хімічній склянці, зануреній в баню з гарячою водою. Залишають суспензію перемішуватися і підтримують температуру суспензії у склянці протягом 2 год. Потім знижують температуру реакційного середовища до 60 "С. Переносять фракцію в колбу Ерленмейєра на 500 мл.

Занурюють колбу Ерленмейєра в баню з гарячою водою, температура якої встановлена на 60 "с.

Додають наступні дози ферментів: 0,2 95 (г на 100 г суспензії) суміші двох глюканаз і 0,1 95 суміші ендо- і екзо-рибонуклеаз. Залишають інкубуватися 18 годин при перемішуванні. Центрифугують після інкубації. Відкладають розчинну фракцію, яка містить вільні нуклеотиди, полісахариди і невелику частину амінокислот. Нерозчинна фракція - це екстракт дріжджових білків. Після З промивань вона має наступний склад: 13,0 95 азоту, З 95 сумарних нуклеотидів і 4,7 У5 сумарних вуглеводів, тобто 77 90 істинних білків.

Приклад 2: Приготування концентрованого білкового екстракту (75 95) з Засспаготусез сегемізіає відповідно до варіанта способу 1.

У варіанті способу, описаному в Прикладі 1, після термічного плазмолізу відділяють нерозчинну фракцію від супернатанта, який містить вільні амінокислоти, центрифугуванням. Нерозчинну фракцію вміщують в об'єм водопровідної води, еквівалентний об'єму відкинутого супернатанта, і знову центрифугують. Ця операція проводиться сумарно З рази. Нарешті, витягують 2 кг нерозчинної фракції із вмістом сухої речовини 16 95, яка містить білки, полісахариди і матеріал нуклеїнових кислот.

Переносять фракцію в 500 мл Ерленмейєра. Занурюють колбу Ерленмейєра в баню з гарячою водою, що має температуру, відрегульовану до 60 "С, і застосовують до неї частину, що залишилася, методу, такого як описано в попередньому прикладі.

У кінцевому результаті отриманий білковий екстракт має наступний склад: 12,2 95 азоту, 1,4 90 сумарних нуклеотидів і 2,9 95 сумарних вуглеводів, тобто 75 95 істинних білків.

Приклад 3: Приготування концентрованого білкового екстракту (» 80 95) з Засспаготусез сегемізіає

За допомогою стадій термічного плазмолізу, розділення на центрифузі і промивання готують нерозчинну фракцію Засспаготусез сегемівзіає, яка містить білки, полісахариди і матеріал нуклеїнових кислот, слідуючи протоколу, описаному в прикладі 2.

Регулюють сухий екстракт цієї фракції до 14 95 і рН до оптимального рН ферментів. Інкубують 200 г цієї фракції при перемішуванні в колбі Ерленмейєра, зануреній в баню з гарячою водою при 60 С протягом 18 годин у присутності наступних доз ферментів: 0,295 очищеного рідкого препарату глюканази і 0,1 95 суміші ендо і екзо-рибонуклєази. Збирають нерозчинну фракцію центрифугуванням і промивають З рази. Отриманий білковий екстракт містить 13,6 95 азоту, 2,4 95 сумарних нуклеотидів і 4,2 У5 сумарних вуглеводів, тобто 83 95 істинних білків.

Приклад 4: Швидке приготування концентрованого білкового екстракту (75 95) з Засспаготусев сегемізіає

В одному з варіантів способу, описаного в Прикладі 2, час інкубації можна скоротити до 8 годин.

Отриманий білковий екстракт містить 12,5 95 азоту, 395 сумарних нуклеотидів і 4,4 95 сумарних вуглеводів, тобто 75 95 істинних білків.

Приклад 5: Приготування концентрованого білкового екстракту (80 95) з Засспаготусез сегемізає

У одному з варіантів способу, описаного в Прикладі 2, білковий екстракт сушать перед екстракцією п'ятьма об'ємами етанолу, промивають, осушують і знову сушать у вакуумі. Отриманий білковий екстракт містить 13,3 95 азоту, 2 96 сумарних нуклеотидів і 3,1 95 сумарних вуглеводів, тобто 81 905 істинних білків.

Приклад 6: Приготування концентрованого білкового екстракту з Ріспіа іадіпії.

Проводять ферментацію Рісніа |адіпії в умовах, які дозволяють досягнути вмісту азоту в дріжджах близько 9 95 сухої речовини. Застосовують розділення на центрифузі до сусла цієї ферментації, щоб отримати дріжджову суспензію із вмістом сухої речовини 11-13 95, і суспензію промивають.

У лабораторії виконують термічний плазмоліз З кг цієї багатої на азот суспензії при температурі від 70 до 95 "С протягом 2 годин, слідуючи тому ж протоколу, що і для штаму Засспаготусез сегемівіає.

Збирають нерозчинну фракцію центрифугуванням і промивають З рази.

Регулюють сухий екстракт цієї фракції до 11-13 95 і рН до оптимального рН ферментів. Інкубують 200 г цієї фракції при перемішуванні в колбі Ерленмейєра, зануреній в баню з гарячою водою при 60 "С протягом 18 годин в присутності наступних доз ферментів: 0,2 95 очищеного рідкого препарату глюканази і 0,1 95 суміші ендо- і екзо-рибонуклеази. Збирають нерозчинну фракцію центрифугуванням і промивають З рази. Отриманий білковий екстракт містить 12,5 95 азоту, З У6 сумарних нуклеотидів і 4,4 у5 сумарних вуглеводів, тобто 75 95 істинних білків.

Приклад 7: Приготування концентрованого білкового екстракту з Кіпулеготусев тагхіапив.

Проводять ферментацію Кішпумеготусез тагхіапих в умовах, які дозволяють досягнути вмісту азоту в дріжджах приблизно 8 95 сухої речовини. Застосовують розділення на центрифузі до сусла цієї ферментації, щоб отримати дріжджову суспензію, і суспензію промивають. Застосовують термічний плазмоліз, центрифугують, промивають нерозчинну фракцію і інкубують зі сумішшю ферментів, які містять глюкани, ендо- і екзорибонуклеази, слідуючи раніше описаному протоколу. Ще раз центрифугують і промивають нерозчинну фракцію, яка містить білки.

Отриманий білковий екстракт містить 11,8 95 азоту, 1,3 95 сумарних нуклеотидів і 8,8 95 сумарних вуглеводів, тобто 72 95 істинних білків.

Приклад 8: Аналіз сумарних ліпідів у "нерозчинному" білковому екстракті, отриманому способом за винаходом, і порівняння з вмістом ліпідів у ""традиційному" екстракті дріжджових білків, екстрагованому з розчинної частини дріжджів після лізису клітин відповідно до попереднього рівня техніки.

Метод, що використовується, являє собою гравіметричний метод після кислотного гідролізу і екстракції гексаном на апараті Сокслета. Цей метод описаний в Постанові ЄС Мо 152/2009. Результати представлені в Таблиці 1 нижче. З трьох партій білкового екстракту, отриманого згідно з винаходом, ці результати показують вміст ліпідів, близький до 10-11 г на 100 г екстракту. Для порівняння, екстракт дріжджового білка попереднього рівня техніки, отриманий з розчинної фракції лізованих дріжджів, демонструє вміст ліпідів менше ніж 1 г на 100 г екстракту. нерозчинної фракції) попереднього рівня фракції)

Приклад 9: Визначення профілю розчинності білка

Сумарний МУ» у супернатанті

На зразку, отриманому з партії 1 білкового екстракту згідно з винаходом (див. Приклад 8), профіль розчинності білка визначали при трьох різних значеннях рН у водному розчині і з використанням кінцевої концентрації білка 2 95 (мас./о0б.). Після 60 хвилин солюбілізації при перемішуванні при температурі оточуючого середовища супернатант збирали центрифугуванням і визначали загальний вміст азоту в супернатанті методом К'єльдаля згідно зі стандартом МЕ ЕМ ІБО 5983-2. Для кожного значення рН відсоток розчинності визначали за наступним рівнянням: 95 розчинності - Сумарний МО у су пернатані

Вихідний Мо» у реакційному середов ищі

Отриманий результат був нижчим ніж 3,5 95.

Приклад 10: Визначення профілів відповідних молекулярних мас білкового екстракту за винаходом і "традиційного" білкового екстракту.

Як і у всьому вищевикладеному, "білковий екстракт за винаходом" означає екстракт дріжджових білків, отриманий з нерозчинної фракції лізованих дріжджових клітин. Навпаки, "традиційний" екстракт дріжджових білків" означає дріжджові білки, отримані екстракцією з розчинної фракції лізованих дріжджових клітин. Екстракцію проводять методами, відомими фахівцям у даній галузі.

Як вказано у Прикладі 9, білковий екстракт за винаходом нерозчинний у водних умовах. Були розроблені спеціальні умови для солюбілізації й аналізу з допомогою ексклюзійної хроматографії.

Протокол наступний (метод 5ЕСІ1 на Фігурі 2): - солюбілізація 10 мг зразка в 5 мл рухомої фази (при перемішуванні протягом 48 годин при 90 С), - аналіз розчину, отриманого на колонці Адіїепі? Рі деІ, 20 мкм МІХЕБ-А (від 2000 до 40000 000 г/моль, еквівалент Р5) при 40 "С.

Рухома фаза: ДМСОЛ/Л ІСІ 0,25 М.

Детектори КІ (показник заломлення) і УФ (280 нм).

Метод (метод 5ЕС2 на Фігурі 2), використаний для "традиційного" екстракту дріжджового білка, був взятий із монографії ОЇМ (Міжнародна організація вина і винограду): - солюбілізація зразка у воді; - аналіз на колонці ЗОРЕКОЕХ 200 10/300 СІ (від 10000 до 600000 Да, еквівалент глобулярного білка; від 1000 до 100000 г/моль, еквівалент декстрану).

Рухома фаза: фосфатний буфер--0,25 М Масі, рн 7 2.

УФ детектування при 214, 260 і 280 нм.

Відповідні білкові профілі представлені на Фігурі 2.

Сумарні амінокислоти

Профіль екстракту дріжджових білків за винаходом розподілений близько 45 кДа і не має піку з низькою молекулярною масою (діапазон 2-10 кДа). Для порівняння, профіль білкового екстракту "традиційних" дріжджів значно відрізняється: він показує два різні піки в діапазоні низької молекулярної маси, 2-10 кДа, і загалом профіль з піками, які більш відмінні і більш широкі.

Сумарні амінокислоти - вільні амінокислоти

Аналіз загальної кількості амінокислот і вільних амінокислот відповідно до офіційного методу, наведеного в Регламенті БО ЄС Мо 152/2009, також дозволяє визначити співвідношення:

Су марніамінокислоти - вільні амінокислоти

Су марніамінокислоти

Це дуже близько до 1 (або 100 95) і завжди вище 0,9 (або 90 95) для екстракту дріжджових білків за винаходом (визначення для З партій, для яких аналізували ліпіди в Прикладі 8). Звичайно він становить від 0,30 до 0,85 (від 30 до 85 95) для "традиційних" екстрактів дріжджових білків Заявника і комерційно доступних екстрактів.

Приклад 11: Приготування концентрованого білкового екстракту (» 75595) з культури

Засспаготусез сегемізіає, збагаченої селеном.

Партію дріжджової суспензії, збагаченої селеном, піддавали способу екстракції білка, описаному в

Прикладі 1 або Прикладі 2. Вміст селену в цих дріжджових вершках був близький до 3200 м. ч.

Загальний вміст азоту в отриманому білковому екстракті становив 13,5 95, вміст істинних білків - 76,7 5. Сумарний вміст селену становив 4750 м. ч. (мг Зе/кг, у сухому вигляді). Вміст селенометіоніну становив 84 95 (екв. 5е/5е сумарного). Для порівняння: селенізовані дріжджі ЗеіЗакю3000, джерело біодоступного органічного селену, містять 63 95 селенометіоніну.

ІВвлЕн: -Й суспензії СТЕК

Фержентатня- З Залишки стінки б внйсгілуслізит! " інерпачиннкі пішки

А зх о.

Е ї. | ха 7 « - - (8-8 "- і Розділення с іх

Плазма: Фермент вт Физвія и нерозчинних в ще йЕракція

В ня ; ї - Козчннина і Я Х - . Я ї шк ТЕТУ

Плахмолів Ту ен .

Є. КЕ . Розділення

Бали. зн ток - 7 дчвНнля : Ферменти ен, вт. 0 фракщя рек ї І нерозчниних

Фіг. 1

Норівняння: ашжажевни «ств ктекавВвинакнииОУма прати ху тради: Те. ж,

ШЕ : й й :суй х І хх дня що им в х й у о, ЕН

ОЗ ж її а І е що ях ох й ще ях є мА -- ш 1125 ка ва жо 238 Ж Ох х - хх ек хх ее ї ї х щш с Шипи ЕКоОх п Жди. : Ж «ХХ хмю Ех я Я ко з док, яке 3 Я и : я МЕ з ще ТМ : зу - з г я Х т ї- х ях У Ж х СЯ Ме

Мод З ях : дядя т ЗИ хо є х ща х ще : Є ІЗ ї ху : Щ я «й х х. х що - зи 1 5 я -Е - ке З х з щі Я

У че ь г м. о УМО

Ж не а з 7 і: ; - по Бо х ї Ка У м

С їх і Х х я М т х З. ї с тля

БУ Її х Е У за Я п-

В і й у, В

МО х Зк Ж Я а о що ! Б - ке дак фе они т» я ЗАКО 2 Гучанй зу Ма Те : с сою до кухлі Жди сх по ех . в НАННЯ

Ен Х РЕ ВЕНЕ МН зн ВЕ ло. ку т х

Бфіслевулярна маса (Ля занню КЛЕЄМ МЕКСЇ ка виндмолом юн. Іралиційний спос ЕС мно іонні іно іонні

Claims (10)

1. Спосіб отримання дріжджових білків, який включає наступні стадії: а) забезпечення дріжджової суспензії, Ь) вплив на цю дріжджову суспензію за допомогою термічного плазмолізу при температурі від 70 до 95 "С протягом періоду часу від 30 секунд до 4 годин, с) вплив на всю кількість активності щонайменше однієї рибонуклеази і однієї глюканази, послідовно або одночасно, при температурі від 40 до 65 "С протягом періоду часу від 8 до 24 годин, 4) розділення нерозчинної фракції 1 розчинної фракції, де нерозчинна фракція, зібрана на стадії 4), не має смаку, має вміст нуклеотидів менше ніж 3 оо 1 справжній вміст білка, що становить щонайменше 72 90, де дезаміназну активність також застосовують на стадії с).

2. Спосіб отримання дріжджових білків, який включає наступні стадії: а) забезпечення дріжджової суспензії, Ь) вплив на цю дріжджову суспензію термічного плазмолізу при температурі від 70 до 95 "С протягом періоду часу від 30 секунд до 4 годин, Ь) розділення нерозчинної фракції 1 розчинної фракції, с) вплив на нерозчинну фракцію активності щонайменше однієї рибонуклеази і однієї глюканази, послідовно або одночасно, при температурі від 40 до 65 "С протягом періоду часу від 8 до 24 годин, 4) розділення нерозчинної фракції 1 розчинної фракції, де нерозчинна фракція, зібрана на стадії 4), не має смаку, має вміст нуклеотидів менше ніж 3 оо 1 справжній вміст білка, що становить щонайменше 72 90, де дезаміназну активність також застосовують на стадії с).

3. Спосіб за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що дріжджі вибирають із видів вбасспаготусе», Ріспіа, Сапдіда, КІнууеготусе», Уагтоуліа, МісКкегтпатотусев.

4. Спосіб за п. 3, який відрізняється тим, що дріжджі вибирають із басслпаготусе» сегеуїзіає, Ріспіа |адіпії, Кінууеготусе» тагхіапи».

5. Спосіб за будь-яким із пп. 1-4, який відрізняється тим, що ферменти, які використовуються на стадії с), використовують одночасно.

6. Спосіб за будь-яким із пп. 1-5, який відрізняється тим, що нерозчинна фракція, зібрана на стадії й), також має вміст ліпідів більше ніж 7 90.

7. Спосіб за будь-яким із пп. 1-6, який відрізняється тим, що нерозчинну фракцію, зібрану на стадії 4), обробляють етанолом, розчинником або надкритичним СО» для видалення ліпідів і збільшення справжнього вмісту білка до 80 90.

8. Спосіб за будь-яким із пп. 1-7, який відрізняється тим, що дріжджова суспензія, яка використовується на стадії а), містить дріжджі, збагачені селеном.

9. Застосування у харчуванні людини екстракту дріжджового білка зі справжнім вмістом білка, що становить щонайменше 72 906, отриманого способом за будь-яким із пп. 1-8, як харчової добавки для контролю ваги, як харчової добавки для немолодих людей, як харчової добавки для спортсменів, як джерело нетваринного білка в напоях, як джерело нетваринного білка в хлібопекарських продуктах або як джерело нетваринного білка в м'ясних делікатесах на рослинній основі.

10. Застосування у харчуванні тварин екстракту дріжджового білка зі справжнім вмістом білка, що становить щонайменше 72 906, отриманого способом за будь-яким із пп. 1-8, як корму для тварин.