UA130461C2 - Композиція окиснених варіантів афліберцепту - Google Patents

Композиція окиснених варіантів афліберцепту

Info

Publication number
UA130461C2
UA130461C2 UAA202201491A UAA202201491A UA130461C2 UA 130461 C2 UA130461 C2 UA 130461C2 UA A202201491 A UAA202201491 A UA A202201491A UA A202201491 A UAA202201491 A UA A202201491A UA 130461 C2 UA130461 C2 UA 130461C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
protein
mese
cells
aflibercept
color
Prior art date
Application number
UAA202201491A
Other languages
English (en)
Inventor
Шунгай Ванґ
Шунгай Ванг
Нін Лі
Нин ЛИ
Гантер Чен
Хантер ЧЕН
Бгалла Амардіп Сінґх Бгупендер
Бхалла Амардип Сингх Бхупендер
Original Assignee
Рідженерон Фармасьютікалз, Інк.
Ридженерон Фармасьютикалз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=76210828&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA130461(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Рідженерон Фармасьютікалз, Інк., Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. filed Critical Рідженерон Фармасьютікалз, Інк.
Publication of UA130461C2 publication Critical patent/UA130461C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • A61K38/1866—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/165—Extraction; Separation; Purification by chromatography mixed-mode chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0031—Serum-free culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21004—Trypsin (3.4.21.4)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/80—Fraction collectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation
    • C12N2529/10—Stimulation by light
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)

Abstract

Винахід стосується композиція для застосування як біомаркера під час виготовлення афліберцепту.

Description

ПЕРЕХРЕСНЕ ПОСИЛАННЯ НА СПОРІДНЕННІ ЗАЯВКИ
Ця заявка витребовує пріоритет та перевагу попередньої заявки на патент США Моб63/065012, поданої 13 серпня 2020 р., розкриття якої включено в цей документ за допомогою посилання в усій своїй повноті. Ця заявка витребовує пріоритет та перевагу за попередньою заявкою на патент США Мо 62/944635, поданою 6 грудня 2019 р.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Ця заявка містить перелік послідовностей, поданий у електронному вигляді в форматі АЗСІЇ і повністю включений у цей документ за допомогою посилання. Зазначена копія АЗСІЇ, створена 26 серпня 2021 р., називається 070816-02459 51 їі і має розмір 148919 байтів.
ОБЛАСТЬ ТЕХНІКИ
Цей винахід загалом стосується композицій проти МЕСЕ та способів їх отримання.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Біофармацевтичні композиції на основі білка стали важливими продуктами для досліджень, лікування офтальмологічних захворювань, раку, автоіїмунного захворювання та інфекції, а також інших захворювань та розладів. Біофармацевтичні препарати являють собою один із найбільш швидко зростаючих сегментів виробництва фармацевтичної промисловості.
Був ідентифікований клас димерних мітогенів, які походять із клітин, із селективністю відносно ендотеліальних клітин судин, і він був позначений як фактор росту ендотеліальних клітин судин (МЕСЕ - англ: мазсціаг епаоїнеїїа! сеїЇ дгоулй Тасіог).
Стійкий ангіогенез може викликати або загострювати певні захворювання, як-от псоріаз, ревматоїдний артрит, гемангіоми, ангіофіброми, діабетична ретинопатія та неоваскулярна глаукома. Інгібітор активності МЕСЕ може бути корисним в якості лікування таких захворювань та іншого МЕСБЕ-індукованого патологічного ангіогенезу та станів проникності судин, як-от васкуляризація пухлини. Ангіопоетини та члени сімейства факторів росту ендотелію судин (МЕСЕ) є єдиними факторами росту, які, як вважається, значною мірою специфічні для ендотеліальних клітин судин.
Деякі захворювання очей пов'язані з патологічним ангіогенезом. Наприклад, розвиток макулярної дистрофії (АМО - англ: аде-геіаїей тасшіаг дедепегаїййоп) пов'язаний із процесом, що називається хоріоїдальною неоваскуляризацією (СММ - спогоїда! пеомазсціагігайоп). Витік із СММ викликає набряк жовтої плями і скупчення рідини під жовтою плямою, що призводить до втрати зору. Діабетичний макулярний набряк (ОМЕ - англ: аіабеїіс тасшціаг едета) являє собою ще одне захворювання очей з ангіогенним компонентом. ОМЕ є найчастішою причиною помірної втрати зору у пацієнтів із діабетом та частим ускладненням діабетичної ретинопатії, захворюванням, що вражає кровоносні судини сітківки. Клінічно значущий ОМЕ виникає, якщо рідина просочується в центр жовтої плями, світлочутливої частини сітківки, яка відповідає за гострий і прямий зір. Рідина у жовтій плямі може викликати серйозну втрату зору чи сліпоту.
Різні інгібітори МЕСЕ, як-от пастка для МЕСЕ ЕХ ЕАФ (Айлія) (афліберцепт), були схвалені для лікування таких захворювань очей.
СУТНІСТЬ ВИНАХОДУ
Цей винахід стосується білків проти МЕСЕ, включно з білком-пасткою для МЕСЕ афліберцепт, який являє собою злитий білок. Цей винахід стосується нового білка проти МЕСЕ, афліберцепт
МіпіТтсар або МЕСЕ МіпіТгар (усі разом іменовані Міпіттар, якщо не вказано інше). У цьому документі розкриті способи отримання цих білків проти МЕСЕ, включно з умовами отримання, які забезпечують ефективні та дієві способи отримання білків, що становлять інтерес. В одному аспекті цей винахід спрямований на застосування хімічно визначеного середовища (ХВС) для отримання білків проти МЕСЕ. У конкретному аспекті ХВС, що становлять інтерес, являють собою такі ХВС, які при використанні забезпечують зразок білка, в якому зразок має жовто-коричневий колір і може містити окиснені форми. Крім того, у цій заявці описані білкові варіанти афліберцепту та МЕСЕ МіпіТгар разом із супутніми способами отримання.
Отримання афліберцепту
У цьому винаході описано виробництво афліберцепту з використанням середовища для культивування клітин. В одному варіанті здійснення середовище для культивування клітин являє собою хімічно визначене середовище («ХВС»). ХВС часто застосовують через те, що воно являє собою хімічно визначену формулу, що не містить білків, не містить компонентів тваринного походження, й існує визначеність щодо складу середовища. В іншому варіанті здійснення середовище для культивування клітин являє собою середовище з гідролізатом сої.
В одному варіанті здійснення спосіб отримання рекомбінантного білка включає (а) забезпечення клітини-господаря, генетично сконструйованої для експресії рекомбінантного білка, що становить інтерес; (Б) культивування клітини-господаря в ХВС у придатних умовах, в яких клітина експресує рекомбінантний білок, що становить інтерес; та (с) збір препарату рекомбінантного білка, що становить інтерес, продукованого клітиною. В одному аспекті рекомбінантний білок, що становить інтерес, являє собою білок проти МЕСЕ. У конкретному аспекті білок проти МЕСЕ вибраний із групи, яка складається з афліберцепту та рекомбінантного
МіпіТгар (приклади яких розкриті в патенті США Мо7279159), зсЕм афліберцепту та інших білків проти МЕСЕ. У переважному аспекті рекомбінантний білок, що становить інтерес, являє собою афліберцепт.
В одному аспекті цього варіанту здійснення афліберцепт експресується у придатній клітині- господарі. Необмежувальні приклади таких клітин-господарів включають без обмеження СНО,
СНО КІ, ЕЕБУВ?, МІСЕЄ, М50, 5рг/0, ембріональні клітини нирок та ВНК.
Придатні ХВС включають середовище Ігла в модифікації Дульбекко (ОМЕ), поживну суміш
Хема, середовище Ехсеї! та середовище ІЗ СНО-СО. Інші ХВС, відомі фахівцям у цій галузі, також розглядаються як такі, що входять до обсягу цього винаходу. У конкретному аспекті придатне ХВС являє собою ХВС1В (Кедепегоп) або вдосконалене середовище Ехсеї| (АЕС).
В одному варіанті здійснення очищений від домішок зразок збору з культури ХВС, що містить афліберцепт, піддають процедурі хроматографії для захоплення. В одному аспекті стадія захоплення являє собою процедуру афінної хроматографії з використанням, наприклад, білка А. У додатковому аспекті елюат афінної процедури має певний колір, наприклад, елюат може мати жовто-коричневий колір. Згідно з більш детальним описом нижче, колір можна оцінювати за допомогою (і) європейського еталона кольору «ВУ», в якому проведений якісний візуальний огляд, або (ії) колориметричного аналізу, СІЕ 1", а", Б" (або СІЕГ АВ), який є більш кількісним, ніж система ВУ. Проте, у будь-якому разі, оцінка кольору між декількома зразками має бути нормалізована відносно концентрації білка з метою забезпечення інформативної оцінки.
Наприклад, щодо прикладу 9 нижче, елюат білка А має значення «р"» близько 2,52, що відповідає значенню ВУ приблизно ВУ5 (при вимірюванні концентрації білка 5 г/л в елюаті білка А). Якщо колір елюату білка А слід порівнювати з іншим зразком, порівняння слід виконувати відносно тієї самої концентрації білка. Значення Б" у колірному просторі СІЕГАВ застосовують для вираження забарвлення зразків та охоплює діапазон від синього (-) до жовтого (х). Більш високе значення Б" одного зразка порівняно з іншим вказує на більш інтенсивне жовто-коричневе забарвлення у зразку порівняно з іншим.
В одному варіанті здійснення афліберцепт отримують із клітини-господаря, генетично сконструйованої для експресії афліберцепту з використанням ХВС. В одному аспекті отримують інші види або варіанти афліберцепту. Ці варіанти включають ізоформи афліберцепту, які містять один або більше окиснених амінокислотних залишків, які загалом називаються оксо-варіантами.
Очищений від домішок зразок збору, отриманий з використанням ХВС, що містить афліберцепт, а також його оксо-варіанти, можна піддавати процедурі хроматографії для захоплення. В одному аспекті стадія захоплення являє собою процедуру афінної хроматографії з використанням, наприклад, колонки з білком А. Якщо зразок, вилучений з афінного елюату, який може демонструвати жовто-коричневий колір або не демонструвати його, аналізують з використанням, наприклад, рідинної хроматографії - мас-спектрометрії (РХ-МС), можуть бути виявлені один або більше оокиснених варіантів афліберцепту. Показано, що деякі амінокислотні залишки модифікованого афліберцепту окислюються, включаючи, без обмеження, залишки гістидину та/або триптофану. В одному аспекті варіанти можуть включати окиснення одного або більше залишків метіоніну, а також інших залишків, див. нижче.
В іншому аспекті варіанти можуть включати окиснення одного або більше залишків триптофану з утворенням М-формілкінуреніну. У додатковому аспекті варіанти можуть включати окиснення одного або більше залишків триптофану з утворенням моно-гідроксилтриптофану. У конкретному аспекті білкові варіанти можуть включати окиснення одного або більше залишків триптофану з утворенням ди-гідроксилтриптофану. У конкретному аспекті білкові варіанти можуть включати окиснення одного або більше залишків триптофану з утворенням /три- гідроксилтриптофану.
В іншому аспекті варіанти можуть включати одну або більше модифікацій, вибраних із групи, яка складається з дезамідування, наприклад, одного або більше аспарагінів; однієї або більше аспарагінових кислот, перетворених на ізо-аспартат та/або Ап; окиснення одного або більше метіонінів; окиснення одного або більше триптофанів у М-формілкінуреніні; окиснення одного або більше триптофанів у моно-гідроксилтриптофані; окиснення одного або більше триптофанів у ди- гідроксилтриптофані; окиснення одного або більше триптофанів у три-гідроксилтриптофані; 3- дезоксиглюкозонування Агд одного або більше аргінінівх видалення С-кінцевого гліцину; та наявності одного або більше не глікозильованих глікозидів.
В іншому варіанті здійснення цей винахід спрямований на способи отримання афліберцепту. В одному аспекті очищений від домішок зразок збору, що містить афліберцепт, і його варіанти піддають стадії захоплення, наприклад, афінній хроматографії з білком А. Після стадії афінності афінний елюат можна піддавати іонообмінній хроматографії. Іонообмінна хроматографія може являти собою або катіоно-, або аніонообмінну хроматографію. Також передбачається, що до обсягу цього варіанта здійснення входить змішана або мультимодальна хроматографія, а також інші хроматографічні процедури, які додатково обговорюються нижче. У конкретному аспекті іонообмінна хроматографія являє собою аніонообмінну хроматографію (АЕХ). Придатні умови для застосування АЕХ включають без обмеження трис-гідрохлорид при рН від близько 8,3 до близько 8,6. Після врівноваження з використанням, наприклад, трис-гідрохлориду при рН від близько 8,3 до близько 8,6, в колонку АЕХ завантажують зразок. Після завантаження колонки її можна промити один або більше разів, з використанням, наприклад, врівноважувального буфера. У конкретному аспекті застосовувані умови можуть забезпечувати диференціальну хроматографічну поведінку афліберцепту та його окиснених варіантів, так що фракція, яка містить афліберцепт за відсутності значних кількостей оксо-варіантів може бути зібрана в проточній фракції, тоді як значна частка оксо-варіантів зберігаються на твердій фазі колонки АЕХ і може бути отримана при очищенні колонки - див. приклад 2 нижче, фіг. 11. Посилаючись на фіг. 11 та приклад 2, зміни оксо-варіантів можна спостерігати між різними стадіями виробництва.
Наприклад, ця зміна може бути проілюстрована даними в розділі «Рівень окиснення триптофану (95)», зокрема в колонці «У/138(-16)». Може спостерігатися, що оксо-варіанти (зокрема, оксо- триптофан) проходять від близько 0,13195 у завантажувальному зразку до близько 0,07095 у проточному зразку після хроматографії АЕХ (розділення АЕХ 2), що вказує на те, що відбувається зниження оксо-варіантів афліберцепту з використанням АЕХ.
Застосування іонного обміну можна використовувати для зменшення або мінімізації кольору.
В одному аспекті цього варіанту здійснення очищений від домішок зразок збору піддають хроматографії для захоплення, наприклад, із використанням афінної хроматографії з білком А.
Афінну колонку елююють і вона має перший колір із конкретним значенням ВУ і/або Б". Потім елюат білка А піддають іонообмінній хроматографії, наприклад, аніонообмінній хроматографії (АЕХ). Іонообмінну колонку промивають і проточну частину збирають, і вона має другий колір із наданим йому конкретним значенням ВУ і/або р". У конкретному аспекті значення кольору (або «ВУ», або «р'"») першого кольору відрізняється від другого кольору. У додатковому аспекті перший колір елюату білка А має більш жовто-коричневий колір у порівнянні з другим кольором проточної частини АЕХ, що відображено відповідним значенням ВУ та/або Б". Зазвичай спостерігається зменшення жовто-коричневого кольору другого кольору після АЕХ, порівняно з першим кольором елюату білка А. Наприклад, застосування аніонного обміну знижувало жовто- коричневий колір, що спостерігається у зразку елюату білка А від значення Б" близько 3,06 (перший колір) до близько 0,96 (другий колір) після АЕХ -- див. приклад 2, таблиця 2-3 нижче.
В одному аспекті варіанта здійснення рН обох буферів для врівноваження та промивання колонки АЕХ може становити від близько 8,30 до близько 8,60. В іншому аспекті провідність обох буферів для врівноваження та промивання для колонки АЕХ може становити від близько 1,50 до близько 3,00 мСм/см.
В одному аспекті варіанта здійснення буфери для врівноваження та промивання можуть являти собою 50 ммоль трис-гідрохлориду. В одному аспекті буфер для очищення містить 2 моль хлориду натрію або 1 н. гідроксиду натрію або обох (див. таблицю 2-2).
Цей варіант здійснення може включати додавання однієї або більше стадій без визначеного порядку, наприклад, хроматографії з гідрофобною взаємодією (НІС), афінної хроматографії, багатомодальної хроматографії, вірусної інактивації (наприклад, із використанням низького рн),
вірусної фільтрації та/або ультра-/діафільтрації, а також інших добре відомих хроматографічних стадій.
В одному варіанті здійснення білок проти МЕСЕ глікозильований на одному або більше аспарагінів таким чином: глікозилювання 50-ІСМАс; глікозилювання (1-бІСсМАс; глікозилювання
С15-СІСМАс; глікозилювання С0; глікозилювання С1; глікозилювання 15; глікозилювання 2; глікозилювання (525; глікозилювання (05252; глікозилювання (С0ОЕ; глікозилювання 225; глікозилювання 2252; глікозилювання (С1Е; глікозилювання С1Е5; глікозилювання сС2Е; глікозилювання С2Е5; глікозилювання 52Е52; глікозилювання СЗЕ5; глікозилювання СЗЕ53; глікозилювання 50-20ІсМАс; глікозилювання Мап4; глікозилювання Мап4 АТ1С1; глікозилювання
Мап4 А10151; глікозилювання Мап5б; глікозилювання Мапо А101; глікозилювання
Мап5о5 А109151; глікозилювання Мапб; глікозилювання Мапб бСОфосфат; глікозилювання
Мапб--фосфат; та/або глікозилювання Мап7. В одному аспекті білок проти МЕСЕ може бути афліберцептом, антитілом до МЕСЕ або МіпіТтар МЕСБЕ.
В одному аспекті профіль глікозилювання композиції білка проти МЕСЕ є таким: від близько 4095 до близько 5095 загальної кількості фукозильованих гліканів, від близько 3095 до близько 5595 загальної кількості сіальованих гліканів, від близько 695 до близько 1595 манози-5, і від близько 6095 до близько 7995 галактозильованих гліканів (див. приклад 6). В одному аспекті білок проти
МЕСЕ має глікозилювання Мап5 на близько 32,495 залишків аспарагіну 123 і/або близько 27,195 залишків аспарагіну 196.
В одному варіанті здійснення спосіб може додатково включати складання лікарської речовини з використанням фармацевтично прийнятної допоміжної речовини. В одному аспекті варіанта здійснення фармацевтично прийнятна допоміжна речовина може бути вибрана з такого: вода, буферні засоби, цукор, сіль, поверхнево-активна речовина, амінокислота, поліол, хелатуючий засіб, емульгатор та консервант. Інші добре відомі фахівцю у цій галузі допоміжні речовини перебувають у межах цього варіанта здійснення.
В одному аспекті варіанта здійснення композиція може бути придатною для введення суб'єкту- людині. Зокрема, введення можна здійснювати за допомогою інтравітреальної ін'єкції. В одному аспекті композиція може мати від близько 40 до близько 200 мг/мл білка, що становить інтерес.
Композицію можна застосовувати як спосіб лікування або попередження ангіогенних захворювань очей, які можуть включати: вікову макулярну дистрофію (наприклад, вологу або суху), макулярний набряк, макулярний набряк після оклюзії вени сітківки, оклюзію вени сітківки (ЕМО), оклюзію центральної вени сітківки (СКМО), оклюзію гілки вени сітківки (ВКМО), діабетичний макулярний набряк (ОМЕ), хоріоїдальну неоваскуляризацію (СММ), неоваскуляризацію райдужної оболонки, неоваскулярну глаукому, післяопераційний фіброз при глаукомі, проліферативну вітреоретинопатію (РУК), неоваскуляризацію диска зорового нерва, неоваскуляризацію рогівки, неоваскуляризацію сітківки, неоваскуляризацію скловидного тіла, паннус, крилоподібну пліву, судинну ретинопатію, діабетичну ретинопатію у суб'єкта з діабетичним макулярним набряком; або діабетичні ретинопатії (наприклад, непроліфератива діабетична ретинопатія (наприклад, що характеризується рівнем за шкалою тяжкості діабетичної ретинопатії (ОК55) близько 47 або 53), або проліферативну діабетичну ретинопатію; наприклад, у суб'єкта, який не страждає на ОМЕ).
Отримання МіпіТтар МЕСЕ
У цьому винаході описано отримання модифікованої версії афліберцепту, причому частина Ес видалена або відсутня, і вона називається афліберцепт МіпіТгар або МіпіТтар МЕСЕ. Ця МіпіТгар може бути отримана в клітинному культурному середовищі, яке включає середовище з хімічно визначеним складом (ХВС) або середовище з гідролізатом сої.
В одному варіанті здійснення МіпіТтар отримують з використанням ХВС. В одному аспекті отримання Міпіїтар, повнорозмірний афліберцепт отримують з використанням придатного господаря і в придатних умовах і додатково обробляють, за допомогою чого частину Ес ферментативно видаляють з отриманням таким чином МіпіТгар. В якості альтернативи, ген, який кодує МіпіТгар (наприклад, нуклеотидна послідовність, що кодує афліберцепт за відсутності його частини Ес), може бути отриманий у придатних умовах із використанням придатної клітини- господаря.
В одному варіанті здійснення спосіб виробництва Міпіїттар, включає отримання повнорозмірного злитого білка афліберцепту з подальшим відщепленням області Ес. В одному аспекті спосіб включає отримання рекомбінантного білка, а саме повнорозмірного злитого білка афліберцепту (див. патент США Мо 7279159, повний вміст якого включено в цей документ за допомогою посилання), яке включає (а) забезпечення клітини-господаря, генетично сконструйованої для експресії повнорозмірного афліберцепту; (Б) культивування клітини- господаря в ХВС у придатних умовах, в якій клітина експресує повнорозмірний афліберцепт; (с) збір препарату повнорозмірного афліберцепту, виробленого клітиною; і (4) піддавання повнорозмірного афліберцепту ферментативному відщепленню, специфічному для видалення частини Ес злитого білка. В іншому аспекті нуклеотидна послідовність, що кодує афліберцепт за відсутності його частини Ес, експресується з придатної клітини-господаря в придатних умовах, добре відомих фахівцю в цій області (див. патент США Мо7279159).
В одному аспекті цього варіанту здійснення афліберцепт експресується у придатній клітині- господарі. Необмежувальні приклади таких клітин-господарів включають без обмеження СНО,
СНО КІ, ЕЕБУВ?, МІСЕЄ, М50, 5рг/0, ембріональні клітини нирок та ВНК.
Придатні ХВС включають середовище Ігла в модифікації Дульбекко (ОМЕ), поживну суміш
Хема, середовище ЕХ-СЕЇ ЇЇ (ЗАЕС) та середовище ІЗ СНО-СО (Ігуіпе). Інші ХВС, відомі фахівцям у цій галузі, також розглядаються як такі, що входять до обсягу цього винаходу. У конкретному аспекті придатне ХВС являє собою ХВС1В (Кедепегоп) або середовище Ехсеї!| (ЗАЕС).
В одному аспекті в ході отримання МіпіТгар зразок, який містить білок, що становить інтерес (тобто, злитий білок афліберцепту та/або МіпіТгар), разом із його варіантами (включно з оксо- варіантами), може демонструвати певні колірні властивості - жовто-коричневий колір. Наприклад, зразок елюату зі стадії афінної хроматографії може демонструвати певний жовто-коричневий колір, виміряний з використанням системи ВУ та/або Бр" (див. приклади 2 та 9 нижче). Ілюстративні джерела для «зразка» можуть включати афінну хроматографію, наприклад, білок А, єлюат; зразок може бути отриманий із проточної фракції процедури іонообмінної хроматографії; він також може бути отриманий в результаті очищення іонообмінної колонки - існують й інші джерела в ході виробничого процесу, добре відомі фахівцям у цій галузі, з яких можна аналізувати зразок. Як зазначено вище та додатково описано нижче, колір можна оцінювати з використанням (і) європейського еталона кольору «ВУ», в якому виконують якісний візуальний огляд, або (ії) колориметричного аналізу, СІЕГ АВ, який є більш кількісним, ніж система ВУ. Тим не менш, у будь- якому випадку, оцінка кольору між декількома зразками має бути нормалізована, наприклад, із використанням концентрації білка з метою інформаційної оцінки між зразками.
В одному аспекті цього варіанта здійснення повнорозмірний злитий білок афліберцепту можна піддавати ферментативній обробці («активність відщеплення») з метою утворення МіпіТгар МЕСБЕ, наприклад, із використанням протеолітичного розщеплення з використанням протеази або її ферментативно активного варіанта. В одному аспекті цього варіанта здійснення протеазу може являти собою фермент, що розкладає імуноглобулін, піогенного стрептокока (Іде5). В іншому аспекті протеаза може являти собою тромбін трипсин, ендопротеазу Агд-С, ендопротеазу Авр-М, ендопротеазу Сіш-С, протеазу Т зовнішньої мембрани (Отрт), Ідеб5, хімотрипсин, пепсин, термолізин, папаїн, проназу або протеєазу від АзрегойШ5 бЗайоі. В одному аспекті протеаза може являти собою цистеїнову протеазу. У конкретному аспекті варіанти здійснення протеаза може являти собою Ідез. В іншому аспекті протеаза може являти собою варіант Іде5. Необмежувальні приклади варіантів дез описані нижче і включають поліпептид, що має амінокислотну послідовність, викладену в групі, яка складається з 560 ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮО МО: 3, 5ЕО ІЮО МО: 4,
ЗЕО ІО МО: 5, 5ЕО І МО: 6, 5ЕО ІО МО: 7, ЗЕО ІО МО: 8, 5ЕО І МО: 9, 5ЕО ІО МО: 10, 5ЕО ІЮ
МО: 11, БЕО ІО МО: 12, БЕО ІО МО: 13, 5ЕО ІО МО: 14, 5ЕО ІЮ МО: 151 5БЕО ІО МО: 16. В одному аспекті протеаза може бути іммобілізована на агарозі або іншій придатній матриці.
В одному аспекті білок, який становить інтерес, (разом із його варіантами) отримують з використанням ХВС. У конкретному аспекті білок, що становить інтерес, включає афліберцепт або
МіпіТгар. Варіанти включають один або більше окиснених амінокислотних залишків, які загалом називаються оксо-варіантами. Приклади окиснених залишків включають без обмеження один або більше залишків гістидину та/або триптофану. Інші окиснені залишки були виявлені за допомогою
РХ-МС та описані нижче, наприклад, окиснений метіонін. Подальшу хроматографію, наприклад,
АЕХ, можна застосовувати для виділення цих оксо-варіантів із білка, що становить інтерес, у зазначеному зразку, і вони описані в цьому документі.
В одному аспекті варіанти можуть включати окиснення одного або більше залишків триптофану з утворенням М-формілкінуренінів. У додатковому аспекті варіанти можуть включати окиснення одного або більше залишків триптофану з утворенням моно-гідроксилтриптофану. У конкретному аспекті білкові варіанти можуть включати окиснення одного або більше залишків триптофану з утворенням ди-гідроксилтриптофану. У конкретному аспекті білкові варіанти можуть включати окиснення одного або більше залишків триптофану з утворенням /три- гідроксилтриптофану.
В іншому аспекті оксо-варіанти можуть включати одну або більше модифікацій, вибраних із групи, яка складається з дезамідування, наприклад одного або більше залишків аспарагіну; однієї або більше аспарагінових кислот, перетворених на ізо-аспартат та/або аспарагін; окиснення одного або більше залишків метіоніну; окиснення одного або більше залишків триптофану в М- формілкінуреніні; окиснення одного або більше залишків триптофану в моно-гідроксилтриптофані; окиснення одного або більше залишків триптофану в ди-гідроксилтриптофані; окиснення одного або більше залишків триптофану з три-гідроксилтриптофану; З-дезоксиглюкозонування Агад одного або більше залишків аргініну; видалення С-кінцевого гліцину; та наявності одного або більше не глікозильованих глікозидів.
В одному варіанті здійснення спосіб виробництва білка МіпіТтар включає (а) захоплення повнорозмірного злитого білка афліберцепту на першій хроматографічній платформі та (Б) відщеплення афліберцепту з утворенням таким чином білка МіпіТгар, тобто, афліберцепту без домену Ес. В одному аспекті перша хроматографічна підкладка містить середовище для афінної хроматографії, іонообмінне середовище для хроматографії або середовище для хроматографії з гідрофобною взаємодією. У конкретному аспекті перша хроматографічна платформа містить платформу для афінної хроматографії, наприклад, білок А. У додатковому аспекті білок стадії захоплення (а) елююють з першої хроматографічної платформи перед стадією відщеплення (Б). У додатковому аспекті друга стадія захоплення йде за стадією відщеплення (Б). У конкретному аспекті цю другу стадію захоплення можна здійснювати з використанням афінної хроматографії, як-от афінна хроматографія з білком А. Проточна частина цієї другої стадії захоплення (яка містить МіпіТгтар) має перший колір, наприклад, жовто-коричневий колір і вимірюється з певним значенням ВУ та/ або Бр" - див., наприклад, приклад 9 нижче. Крім того, аналіз РХ-МС цієї другої проточної частини захоплення може демонструвати наявність оксо-варіантів, причому один або більше залишків Міпі Тгтар окиснені (див. приклад 9 нижче).
У додатковому аспекті другу проточну частину захоплення можна піддавати іонообмінній хроматографії, наприклад, АЕХ. Цю колонку АЕХ можна промивати з використанням придатного буфера, і може бути зібрана проточна фракція АЕХ, яка містить переважно МіпіТгар. Ця проточна фракція АЕХ може мати другий колір, який має жовто-коричневе забарвлення з певним значенням ВУ та/або Б". У додатковому аспекті перший колір (проточна фракція з другої стадії захоплення) і другий колір (проточна фракція з іонообмінної процедури) мають різні кольори, виміряні або за допомогою системи ВУ, або Б". В одному аспекті другий колір має знижений жовто-коричневий колір у порівнянні з першим кольором із використанням або значення ВУ, або
Б", а потім АЕХ.
В іншому варіанті здійснення активність відщеплення на стадії (Б) можна здійснювати з використанням хроматографічної колонки, причому активність відщеплення, наприклад, ферментативна активність, прикріплена або іммобілізована в матриці колонки. Колонка, яка застосовується на стадії (Б), може містити одну або більше протеаз, які згадуються і детальніше описані нижче.
В одному варіанті здійснення процедура іонообмінної хроматографії може включати середовище для аніонообмінної (АЕХ) хроматографії. В іншому аспекті середовище для іонообмінної хроматографії включає середовище для катіонообмінної (СЕХ) хроматографії.
Придатні умови для застосування АЕХ включають без обмеження трис-гідрохлорид при рН від близько 8,3 до близько 8,6. Після врівноваження з використанням, наприклад, трис-гідрохлориду при рН від близько 8,3 до близько 8,6, в колонку АЕХ завантажують зразок. Після завантаження колонки її можна промити один або більше разів, з використанням, наприклад, врівноважувального буфера. У конкретному аспекті застосовувані умови можуть забезпечувати диференціальну хроматографічну поведінку МіпіТгар та його оксо-варіантів із використанням АЕХ, так що МіпіТгар по суті знаходиться у проточній фракції, тоді як оксо-варіанти по суті зберігаються на колонці АЕХ і можуть контролюватись за допомогою очищення колонки (див. приклад 9 нижче).
В одному прикладі зразки з різних етапів отримання аналізували щодо кольору та наявності оксо-варіантів. Відносно прикладу 9, пул афінної проточної фракції (проточна фракція з другого етапу афінності з білком А) мав перше значення р" близько 1,58 (див. таблицю 9-3). Цю другу афінну проточну фракцію піддавали АЕХ. Проточна фракція АЕХ мала друге значення р" близько 0,50, що вказує на значне зниження жовто-коричневого кольору після застосування АЕХ.
Очищення колонки АЕХ забезпечувало зразок очищення, і спостерігалося третє значення Б" близько 6,10, що вказує на те, що цей зразок очищення мав більш жовто-коричневий колір порівняно із завантаженням або з проточною фракцією.
Що стосується прикладу 9, також здійснювали аналіз оксо-варіанта. Аналізовані зразки являли собою пул афінної проточної фракції (другий елюат афінності з білком А), проточної фракції АЕХ і очищення АЕХ. Щодо таблиці 9-5 і таблиці 9-6, зміни оксо-варіантів можуть спостерігатися між різними стадіями отримання. Наприклад, ця зміна може бути проілюстрована даними в розділі «Рівень окиснення триптофану (95)», зокрема в колонці «М/58(-16)». Може спостерігатися, що оксо-варіанти (зокрема, оксо-триптофан) проходять від близько 0,05595 у завантажувальному зразку до близько 0,03895 у проточному зразку після хроматографії АЕХ, що вказує на зниження оксо-варіантів після АЕХ. Очищення АЕХ проаналізували, і було виявлено, що відсоток оксо- триптофану становить близько 0,08995. Якщо значення цієї смуги порівнювали з навантаженням (а також проточною фракцією), виявилося, що значна частина цього оксо-варіанта залишалася на колонці АЕХ.
Цей винахід може включати додавання однієї або більше стадій, без визначеного порядку, наприклад, хроматографії з гідрофобною взаємодією, афінної хроматографії, багатомодальної хроматографії, вірусної інактивації (наприклад, з використанням низького рН), вірусної фільтрації, та/або ультра/діафільтрації.
Один варіант здійснення цього винаходу спрямований на спосіб регенерації хроматографічної колонки, яка містить смолу. В одному аспекті варіанта здійснення смола має іммобілізований гідролізуючий засіб. В іншому аспекті варіанта здійснення смола містить іммобілізований фермент протеазу. В іншому аспекті варіанта здійснення смола являє собою смолу ГарвІСАТОК? або мутант смоли. В одному аспекті варіанта здійснення спосіб регенерації колонки, яка містить смолу, включає реакційну ефективність смоли.
В одному аспекті варіанта здійснення спосіб регенерації колонки, яка містить смолу, включає інкубацію смоли в колонці з оцтовою кислотою. В одному аспекті концентрація застосовуваної оцтової кислоти становить від близько 0,1 моль до близько 2 моль. В одному аспекті концентрація оцтової кислоти становить близько 0,5 моль. В одному аспекті смолу інкубують протягом щонайменше близько 10 хв. В іншому аспекті смолу інкубують протягом щонайменше близько 30 хв. В іншому аспекті цього варіанта здійснення смолу інкубують протягом щонайменше близько 50 хв. В іншому аспекті цього варіанта здійснення смолу інкубують протягом щонайменше близько 100 хв. В іншому аспекті цього варіанта здійснення смолу інкубують протягом щонайменше близько 200 хв. В іншому аспекті цього варіанта здійснення смолу інкубують протягом щонайменше близько 300 хв.
Необов'язково, смолу в колонці додатково інкубують з гідрохлоридом гуанідину ((и-НСЇ). В одному аспекті зИи-НСЇ без оцтової кислоти застосовують для регенерації смоли у колонці.
Концентрація застосовуваного би-НСІЇ становить від близько 1 н. до близько 10 н. В іншому аспекті концентрація зи-НСІ становить близько 6 н. У додатковому аспекті смолу в колонці можна інкубувати протягом щонайменше близько 10 хв із регенеруючими засобами (оцтова кислота, би-
НСІ). В іншому аспекті смолу інкубують протягом щонайменше близько 30 хв. В іншому аспекті смолу інкубують протягом щонайменше близько 50 хв. В іншому аспекті зазначену смолу інкубують протягом щонайменше близько 100 хв.
В одному варіанті здійснення колонку, яка містить смолу, зберігають в етанолі. В одному аспекті колонку зберігають в етанолі, причому відсотковий вміст етанолу становить від близько 595 об./06. до близько 2095 об./0б. У конкретному аспекті колонку зберігають з використанням 20905 об/об. етанолу.
В одному варіанті здійснення спосіб може додатково включати складання МіпіТтар МЕСЕ з використанням фармацевтично прийнятної допоміжної речовини. В одному аспекті фармацевтично прийнятна допоміжна речовина може бути вибрана з такого: вода, буферні засоби, цукор, сіль, поверхнево-активна речовина, амінокислота, поліол, хелатуючий засіб, емульгатор та консервант. Інші добре відомі фахівцю у цій галузі допоміжні речовини перебувають у межах цього варіанта здійснення.
Композиція за цим винаходом підходить для введення суб'єкту-людині. В одному аспекті цього варіанта здійснення введення можна здійснювати за допомогою інтравітреальної ін'єкції. В одному аспекті композиція може мати від близько 40 до близько 200 мг/мл білка, що становить інтерес. У конкретному аспекті білок, що становить інтерес, являє собою або афліберцепт, або
МіпіТгтар.
Композицію можна застосовувати в способі лікування або попередження ангіогенних захворювань очей, які можуть включати: вікову макулярну дистрофію (наприклад, вологу або суху), макулярний набряк, макулярний набряк після оклюзії вени сітківки, оклюзію вени сітківки (ЕМО), оклюзію центральної вени сітківки (СКМО), оклюзію гілки вени сітківки (ВКМО), діабетичний макулярний набряк (ОМЕ), хоріоїдальну неоваскуляризацію (СММ), неоваскуляризацію райдужної оболонки, неоваскулярну глаукому, післяопераційний фіброз при глаукомі, проліферативну вітреоретинопатію (РУК), неоваскуляризацію диска зорового нерва, неоваскуляризацію рогівки, неоваскуляризацію сітківки, неоваскуляризацію скловидного тіла, паннус, крилоподібну пліву, судинну ретинопатію, діабетичну ретинопатію у суб'єкта з діабетичним макулярним набряком; або діабетичні ретинопатії (наприклад, непроліфератива діабетична ретинопатія (наприклад, що характеризується рівнем за шкалою тяжкості діабетичної ретинопатії (ОК55) близько 47 або 53), або проліферативну діабетичну ретинопатію; наприклад, у суб'єкта, який не страждає на ОМЕ).
Варіанти Іде5
У цьому розкритті описано застосування Ідеб5 (БГаркІСАТОК) (5ЕО ІО МО: 1) або інших поліпептидів, які являють собою варіанти Ідез (ЗЕО ІЮ МО: 2-16) для отримання МіпіТтар МЕСЕ.
Ідез (ЗЕО ІО МО: 1) містить залишки аспарагіну в положенні 87, 130, 182 та/або 274 (показано як «М'"» жирним шрифтом та курсивом у 5ЕО ІЮО МО: 1 нижче). Аспарагін у цих положеннях може бути мутованим до амінокислоти, відмінної від аспарагіну, з утворенням варіантів Ідез (Її мутованаїйї) амінокислота(-и) показані курсивом і підкреслені):
МиКИСеУВТ ААУ ААУ КУЄ ВУПЧО ЛАСК ЧАМОЕНУВЕУТВУНУ ТУ ТОСТИ МАНЕТООЕОУЄНАЮУУАМО
СЕ УПНТК ТЕМ ОКОМ СТ ААТАСММІ НУО КИМ ЕЕНЕЕКОКІЧЕМ ЗЕ СМЕОУКЕАНУ КМНО ПМ ККУ
ЕКЕКАЕРУ ЕТКНІ СУВВОНАМКІМ УНІ В ТОНОВТРуУКЕСЕКОРВОС ОАЄ І ТЯКНОККЕКМ КЕ
ВЕНКЕ ТЕКУ С ЗНТУАМУВЕМНАЛЬІ УЦАЮСВОВКЧМ КАТУТОВОЕМАВНІМККУРУСУМОАЮКУААКЕ КЕРІ
САСБСВ ЕТ УТОМИ ВА МОМ
МАКЕСУТОААЯ ААУ М ВУДВО АВМ ВВЕ У ТЕХН ТЕААЮТКОУТЕРАМЕ ТОК ВУ НАРУУАМО
ОЛЯ ЖЕНТКТЕВОКОТВ І СОААТАСУМІ НУАЖ КТ КОСІВ ЕЕНРЕКОКІЧЕМ ОБОМЕСУКЕАЮТЕННОВ ОКУ
ЕКЕКАРБЕЧІ ЗТКНІ ЗУККОНУЮМЕЦ ЧУВ ВІ ТМИНОКТЕ УКВ УКОК ЦК АУЄТВЗООВКІ ТаЕОЕКЕКМ КЕКВ
ДЕК ТЕОКАОЇ ЯНТТАМУВІЧНАУТ МОГО ОМ КАМУТОВОЗМАНОМККТРУССМААОКУАНВАКЕКЕОМІ аАСУБО ЕТ ТОНОМ
МеКИСТОАА КАТ РУ УДКСУ ОВК ВАМОЄНУ ВЕУ ТТН ТУ ЧУ ТТ ОАЕ ТЕС УКНАКУУАМИ
САРУБИ ТК ТЕМОЮ СОУАТАЄНМІ НУХУЕР ТОМИ ОСНКВУ КЕНЕ КОМІ ТКС СУК АЮТТИМНОВ ВК РЕУ
ЕКЕКАБКЧІ ЯТКНІ ОУКРОЧУЮ МЕМ ЖК ВІ ТУНОКТКУКЕОКОКНСИНЕОАУКТИООСОВКИ ТВЕУБЕКЕКМ КВ
ЇВ ЖККЕЕТЕСОКАБСЯ ВІТ УАМУМВМНУ ВІ УОАЦДЕОЕМ МІ КАГТТУ ТОВ ОМАВНЗУМК КУРИ ВАК УАНАКЕ КЕСНО
ОАСМБОВ ЕТ ЕТОДОВУМС М
МЕКАСтЕ ТВА АВТ РУ ВУСА ЛАЮВЯК АМСУ ВЕМТИ НУТУ ТУТ В АНКЕТ ЕСУЄНАЮУ АН
СИТО К ТЕМ ОКО СОЛДАТ АВММІ НУК ОСМИОСКИУ ЕЕНЕЕКОКІЧЕ МЕ ОМЕОУКЕАНУТКЧНОС ОВК ВЕУ
ЕКЕКАКРУ яТКНІ СУКРОНЛОМЕЦОТВІ БЕ ТУНОВТВУКВОВКОРеОСІКОВУКТНОМОВКИ ТЗБНІЖКЕКВН КВ рЕККЕТЕСКМ СІ ЗНТУАМУВЕМНУ ТІ УКОАСКОВК ЯВИ КАГРУТОЗОЕРОМККУРУЄУМИАСКУАВАКЕКЕОМІ
ПСАСУО ЕТ ЕТЗООВАМОТМ
МОКОСУВТОАВУМ ААУ ЕМ ВУДВОУАЮЗЕВАНОЄВ ВЕУ ТЕНЕТА. ТКУ РАМЕ ТО ВУЄНАРТУМАКВІ
САРУЕНТКТЕМ КОС СТУ ТАС НИЛУКОСВВ КА КЕНЕ КОКІЧЕ КК ОМЕОУКЕАЦТКМНО ПОКІ ГЕ У
ТЕКЕКАБРХІ ЗТКНІ ЗУКРОНУЮЕН СУК В ТМНОРТРУКЕОВКОРОСИМЕОВУЄТВОГЮвКИ ТаВНОРКЕКМ КЕ
ПпЕЕКЕЕТЕСКАЦО ОНТТАМУВІМНУВИ УСАОКОЗНВОМ КАГТУТОВВОМАВКУМККУКМОУМВАСКУМВАЮЕКЕЮКІ
ЗАМ ОР ВТО ОАТМ
«ак мосе
МЕКМСУ ТА ААУ, ВУС АЗК ВЕУ ТВ УТА ТУТ РАМНЕТОЗЕ СУКНА У АН
СУС КЕКС СеЗААЖТАЮММІ НУДНОЮ ЕЕ НЕЕКОКМЕ ОКОМ ОУКЕАКНКМНО Пак ЕЕУЕ
КЕНАБРЖ ТЕН СУБРОНУНЮНМЕНУЧУМІ ВД ТУМНСРТРУКЕОКОРНОСІЕОАУК ТВОГО ВКИ ТеАНОБИЕКМ КЕКО
ЦНиКСЕТЕСМАВІ ЗНТУАММІМНУ ВЕ УЗА ОМ КАУУ ПИ ВМАВІИОМКА УКУСИ ВІАКУАВАКЕККОМИО са ЕТ ЗТОодраумстю
ЗОМ
МЕКИСУЗТБААМ ААЖТ ЕІ ВУПВИОУАОЗЕВАМОКНВУВЕУТРУНУТЕУ ВТО ТЕВАМЕТООСЕСУКНАВХУАМО
СМИМТЖЕНТК ТОСОЛ СОЛАТАСММІ НУАЧЕОСМК КВУ ЕЕНРЕКОКОЧЕМРОЕОЗМЕВУКЕАШИТКМНО ОЗКІ ТЕТ
ЕКЕКАБІРУЯ ЯТКНІ СУКЕОНУЮ МЕН СУ ВІТ УНЕВТРУКЕОЯКОКНОСІСВАУЕТВОПОЗК І ТЗЕНОВКЕКМВ КВ
ТЕ ККЕ ТЕОКАМ СЯ ЗНТУАМУВИНУВЦ УАНМ ОМ КАМУТОВОВ МАВ ОМККТЕУОУМОАОКУЛІЗАКЕКЕСНВЯ
ЗАШУ І ЕТ ЗТОЗОУМОМ що мов
МЕСТО ААУААУТИСЯ УПМ АООК АМСУ ТЕ УНУ ПУ ТК ОТАК Т СОКУ КНАКВУУАНО
СУТКИ ТЕКС СовАТАСММІ НУЛУКОСМИОКИУ ЕЕНРЕКОКИЧЕМ ОК ОМЕ СУК АНТКМНО КІ ТЕЖ
РКЕКАРРЧІ ВТК УКРОНУЮМЕ НМ ЗУ ВЕ Ві ТМНОРТРУКЕОВКООЗОКОАУКТИЗОСОМ ТЕМНОБМКЕКМі КЕ
ГеЖКЕТЕОЮА ог ЯНГ УАМУВІЧНУВИ ШОАСГОЗІ КО КАГМУТОВОВУ АВК ТКУ ЦМВ ОМ ЖУААКЕКЕ МІ
ПАС ЕТ ВТОМУ МОВ
«ва км
МКС ТОААУАДУТИСЯ БУС КОВЕ АМСУ ТЕ НУ ПУТ ТК ОТУТ ОО ЄНАКУ КАМИ
Це УТ НТК ТЕМ ОКО ОСА ТАС НААУ ЕЗОМКОСВВ Я КЕНВЕКОК ЗЕ НОКОМЕОУКЕАННКМНОЇ ОЯКІ ЕХ
ЕКЕКАРЕМ БТКНІ ЗУККОНУЮМЕН СУМІ ЖІ ТЧНОКТУКЕСВКПЕНОСНЕИАУКТНОМОВАК І ТВЕНОЕКЕКМЬ КВ
ПЕККЕРТЕСКАНОЇ ВНТУ АМУВІИМНУВМ ОСОБ ОМ КАВУТОВВ МАВ ОВККУРУСУМОАОКУАНАКЕКЕСМІ папуг і ЕТ ЗТ У МОВ щоки щМОос о
МКС АВТ РУ УМВСУ АВІЕВАМОВІВУВЕУТВУНУ ПОЛЮТКОУТЕВАМНЕТОСЕВУКНАВУУАНІ
СЕНТ КЕ КО ЕСОААТАВММ ТАЛАН СМ КОКИТ ЕЕНРЕКСКІЧЕВОКОМЕПУКЕВДЮТКМННО ОБКІ КЕУ
ЕКЕКАБРЧ ТК ОУЕН УЮ МЗУВЕ ВІ ТОК УКВ ОКО ПАКТ ТЕННОГКЕКМі КЗ
ТО ККЕТЕОКА СЕ ВНТУ АМУВИЧНУМ АКОСАПКОВООМ КАРУ ТИООВМАВКУКИУКУСУМНАОКУАВАКЕКЕОМІ пас ЕТ ТО чуУМс м
ЕЛ НО М. З
МЕКНСУВТААМААУТ ЕМІ БУТИ АЯКС ВАМОВІВУВЕУТРЖНУТОУУТКОУТЕРАМЕТОСЕСУКНАЮТЧАНО
ООП КТЕМ ОК І СОСААТАСММІ НУКУБ КОВКА У ЕСЕНРЕКОКІМЕ МУЗ ОМЕОСУКЕАНИТИМНО ПУ БЕУ
ЕКЕКАКВУ СТКНІ ОУКРОНУЮМЕ ОХ ВІ ТУНОКТРУКЕОВКОКВОСІКОАУЄТВОВОВКИ ТЯМНОБКЕКМ КВ
І КЕТЕСКАЦО ЗНТТАМУВІЧНУЮМ У ОАСКОВООМІ КАГТУТО ВО ВМАВНКИУККТРУЄУМВАСКУАНВАКЕКЕОМІ
АСУ ЕТ ВТО ВУМОТМ ка насе
МЕКМСтВТЕААМЕ ВАУТ УС МИТОМ АВЗЕЗАМОВЕЩУВЕМТВУНИТОЛАТКОТЕВАМЕТОЗЕПУВНАЮТУАНО
СУФУСТТ КЕ ООКОО І СОВАТАСММІ НЕЛАТТМКОСНКВТІ ЕНЕЕКОКІМЕ НОСКОМ СУКЕАНИКМНО ПОКЕГЕТЕ
КЕМАККИ ЯТКНЕСУКРОНУЮМЕВ СУМІ ЗІ МНЕ ТРУКЕ ОВК ОКО ТЕрАУЄ ТЕО ВКИ ТОМНОККЕКМ КЕ
КБ ТЕСКА ОЇ ЯН ТУАМУВІЧНУНІ УУ САКЕ СОМ КАТУТООВаМВИ КИ УКУСУ МОАСКУАВАЮСКЕ ОА
Се В г ясну мати зва Юма
МІКС ААУ СІ БУС У АЗЗЕ ЗАМКУ УНУТ ЗЛАК ТКОУТЕРАМЕТОССОУЕНАРУУАМО
ОКО КТК СОДА ТАС НААЕСОМКОСКВ Я ЕЕНРЕКОКІЧЕВОБСМЕВУКЕАЮТИМНОЇ СЕК ЕБУК
МЕКАЕРЧ ЕТКН ОУЕН ЦМВ СОТНІ ВІТ УНОВТРУКЕ ОКО ВОСІЕВАУЕТВООВОКИ ТЕВНОВКЕКН КЕ
ЦККВІТЕОКА СІ ВНТУАМУВІЗНЯМ НОВОГО ВОМ КАГУТОВОЗМАВНМКК УВУ ВУЧВАСКУАВАКЕ КЕН
СМС ЕТ ВТОМИ М
ЗЕ ЕМО 4
МЕКНСУВТ ААУ ААУ ТЕМІ БУТИ АВЯСОАМОВІВУВЕУТРИНУ ТУ ТКОМТЕРАМЕТОСЕСУЄНАЮУЧАНО
ОАЕ КТЕВОКОТВ І СОДАТАСНМІ ЛУКОМ КОСІКА У БЕНЕЕКОКІЧЕ М ОБОМЕОУКЕАНЮТКМНН СЕК ЕХ
ЕКЕКАВЕУЯ СТКНІ ЗУБОМ УВЯ Ві ТУНастьУКвОаКОНОСІЮАУЕТВОСНІВКИ ТЯКНОБКЕКМ КВ
ІМ ЖКЕ ТЕОКАНО ЗНТТАМУ ВІН МНОАОЕОВЕОМ КАТУУТОВОВМАВЮМККУКУЄУМВАСКУАВАКЕКЕСМІ зас вт ато чумстм «ка щас
МНК ЕААМЕААМТ ЕМ КУН АОВЕВАМОЕКУВЕУТВУНУ ТОЖ ТКОУТЕВАМЕТОСЕВУКНАКУЧАМО
ПОФУВИ КЕ КО СОДАТАОММІ НУПЛАУВОСМКОСКВУ ЕЕНРЕКОКІМЕ НОВОМУ КЕАЮТКННОВ ОЗКІТЕХ
ЕКЕКАРЕЧІ ІКНІ ЗУРЕОНУЮМ СУМІ ЗЕ ТУНОВТРУКЕВЕКОВВОВІЕОАУКТКОПОВК ЕЕ ТЗЕНОВКЕКМ КВ
ЇВ КК ТЕОКАС ОР БНТУАМУ ВІЧНУ МУ ОАПРИВОСМІ КАРРУТТНМ МАМ ЕКУКУВУМІАСКУАВАКЕКЕОМІ
ЗАМ ет атомом щЕСНЮ МОМ В
МІКС ВТЯААМІ ЗАСТ ЕІ ВУПЕОУАПЗЕВАМОЄИУВЕМ ТВ УНУ ГІУУКТКОУТЕВАМЕ ПМЖ УКНАВУУАМИ
За УТТКТЕООКОО СОВА ТАЄММІ НУЛІ МКК ЕЕНКЕЕКОКІМЕ ВОК ОМЕОУКЕАЮТКМНОЇ ОК ЕЕ
КЕКАЕКУІ ЗТКНІЕ УКР ННЯЕВ Ж ВЕ ТМ УуКЕ СЕКТ ЕОВУЄ ТЕОООБКИ ТОЯНОВКЕКМ КО
КЕ ТЕКА ЗНТУ АНУ ВАВ ОМ КМУ ТВО В ЧКЗНУМКЕ УА ТАЛЗАСКУАЗАКЕКЕВМОА
СВ СТЕ ПЗ СУ
В одному варіанті здійснення поліпептид має виділену амінокислотну послідовність, яка щонайменше на 7095 ідентична по всій довжині виділеній амінокислотній послідовності, наведеній в групі, яка складається з ФЕО ІЮ МО: 2, ЗЕО І МО: 3, 5ЕО ІО МО: 4, 5ЕО ІО МО: 5, 5ЕО ІЮО МО: 6,
ЗЕО ІО МО: 7, БЕО ІО МО: 8, 5ЕО ІЮ МО: 9, 5ЕО ІЮО МО: 10, 5ЕО ІО МО: 11, 5ЕО ІО МО: 12, 5ЕО І
МО: 13, 5ЕО ІО МО: 14, 5БЕО ІО МО: 151 5ЕО ІО МО: 16. В одному аспекті виділена амінокислотна послідовність щонайменше на близько 8095 ідентична по всій довжині виділеній амінокислотній послідовності. В іншому аспекті виділена амінокислотна послідовність щонайменше на близько 9095 ідентична по всій довжині виділеній амінокислотній послідовності. В іншому аспекті виділена амінокислотна послідовність щонайменше на близько 10095 ідентична по всій довжині виділеній амінокислотній послідовності. В одному аспекті поліпептид може бути здатний розщеплювати цільовий білок на фрагменти. У конкретному аспекті цільовий білок являє собою Ід. В іншому аспекті цільовий білок являє собою злитий білок. В іншому аспекті фрагменти можуть містити фрагмент Раб та/або фрагмент Ес.
Цей винахід також включає виділену молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який має виділену амінокислотну послідовність щонайменше на 7095 ідентичну по всій довжині виділеній амінокислотній послідовності, наведеній в групі, яка складається з ЗЕО ІЮО МО: 2, 5ЕО ІЮ
МО: 3, 5ЕО ІО МО: 4, 5ЕО ІЮ МО: 5, 5ЕО ІО МО: 6, 5ЕО І МО: 7, 5ЕБЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО ІО МО: 9,
ЗЕО ІЮО МО: 10, 5ЕО ІЮ МО: 11, 5ЕО ІЮО МО: 12, 5ЕО ІЮО МО: 13, 5ЕО ІЮО МО: 14, 5ЕО ІЮО МО: 151 5ЕО ІЮО МО: 16. В одному аспекті виділена амінокислотна послідовність щонайменше на близько 8095 ідентична по всій довжині виділеній амінокислотній послідовності. В іншому аспекті виділена амінокислотна послідовність щонайменше на близько 9095 ідентична по всій довжині виділеній амінокислотній послідовності. В іншому аспекті виділена амінокислотна послідовність щонайменше на близько 10095 ідентична по всій довжині виділеній амінокислотній послідовності.
В одному аспекті поліпептид може бути здатний розщеплювати цільовий білок на фрагменти. У конкретному аспекті цільовий білок являє собою до. В іншому конкретному аспекті цільовий білок являє собою злитий білок. В іншому конкретному аспекті фрагменти можуть містити фрагмент Бар та/або фрагмент Ес.
Це розкриття також включає вектор, який містить нуклеїнову кислоту, що кодує поліпептид, який має виділену амінокислотну послідовність щонайменше на 7095 ідентичну по всій довжині виділеній амінокислотній послідовності, наведеній в групі, яка складається з ЗЕО ІЮО МО: 2, 5ЕО ІЮ
МО: 3, 5ЕО ІО МО: 4, 5ЕО ІЮ МО: 5, 5ЕО ІО МО: 6, 5ЕО І МО: 7, 5ЕБЕО ІЮ МО: 8, 5ЕО ІО МО: 9,
ЗЕО ІЮО МО: 10, 5ЕО ІО МО: 11, 5ЕО І МО: 12, 5ЕО ІО МО: 13, 5ЕО ІО МО: 14, 5ЕО ІЮ МО: 15
ЗБО ІЮО МО: 16. В одному аспекті молекула нуклеїнової кислоти функціонально зв'язана з послідовністю для контролю експресії, здатною керувати її експресією в клітині-господарі. В одному аспекті вектор може являти собою плазміду. В одному аспекті виділена амінокислотна послідовність щонайменше на близько 8095 ідентична по всій довжині виділеній амінокислотній послідовності. В іншому аспекті виділена амінокислотна послідовність щонайменше на близько 9095 ідентична по всій довжині виділеній амінокислотній послідовності. В іншому аспекті виділена амінокислотна послідовність щонайменше на близько 10095 ідентична по всій довжині виділеній амінокислотній послідовності. В одному аспекті поліпептид може бути здатний розщеплювати цільовий білок на фрагменти. У конкретному аспекті цільовий білок являє собою Ід. В іншому аспекті цільовий білок являє собою злитий білок. В іншому аспекті фрагменти можуть містити фрагмент Раб та/або фрагмент Ес.
В одному варіанті здійснення виділена амінокислота може містити вихідну амінокислотну послідовність, визначену в 5ЗЕО ІО МО.: 1, із залишком аспарагіну в положенні 87, 130, 182 та/або 274, мутованим до амінокислоти, відмінної від аспарагіну. В одному аспекті мутація може забезпечити підвищену хімічну стабільність при лужних значеннях рН у порівнянні з вихідною послідовністю амінокислот. В іншому аспекті мутація може забезпечувати підвищення хімічної стабільності на 5095 при лужних значеннях рН, порівняно з вихідною амінокислотною послідовністю. В одному аспекті амінокислота може бути вибрана з аспарагінової кислоти, лейцину та аргініну. У конкретному аспекті залишок аспарагіну в положенні 87 мутований до залишку аспарагінової кислоти. В іншому аспекті залишок аспарагіну в положенні 130 мутований до залишку аргініну. В іншому аспекті залишок аспарагіну в положенні 182 мутований до залишку лейцину. В іншому аспекті залишок аспарагіну в положенні 274 мутований до залишку аспарагінової кислоти. В іншому аспекті залишки аспарагіну в положеннях 87 та 130 мутовані. В іншому аспекті залишки аспарагіну в положеннях 87 та 182 мутовані. В іншому аспекті залишки аспарагіну в положеннях 87 та 274 мутовані. В іншому аспекті залишки аспарагіну в положеннях
130 та 182 мутовані. В іншому аспекті залишки аспарагіну в положеннях 130 та 274 мутовані. В іншому аспекті залишки аспарагіну в положеннях 182 та 274 мутовані. В іншому аспекті залишки аспарагіну в положеннях 87, 130 та 182 мутовані. В іншому аспекті залишки аспарагіну в положеннях 87, 182 та 274 мутовані. В іншому аспекті залишки аспарагіну в положеннях 130, 182 та 274 мутовані. В іншому аспекті залишки аспарагіну в положеннях 87, 130, 182 та 274 мутовані.
У спорідненому варіанті здійснення цей винахід включає молекулу виділеної нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид із виділеною амінокислотною послідовністю, яка містить вихідну амінокислотну послідовність, визначену в ЗЕО ІЮО МО: 1, із залишком аспарагіну в положенні 87, 130, 182 та/або 274, мутованим до амінокислоти, відмінної від аспарагіну - див. вище. Мутація може забезпечувати підвищену хімічну стабільність при лужних значеннях рН в порівнянні з вихідною амінокислотною послідовністю.
У додатковому спорідненому варіанті здійснення цей винахід включає вектор, який містить молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид із виділеною амінокислотною послідовністю, яка містить вихідну амінокислотну послідовність, визначену в 5ЕБЕО ІЮО МО: 1, із залишком аспарагіну в положенні 87, 130, 182 та/або 274, мутованим до амінокислоти, відмінної від аспарагіну - див. вище. Мутація може забезпечувати підвищену хімічну стабільність при лужних значеннях рН в порівнянні з вихідною амінокислотною послідовністю. В одному аспекті молекула нуклеїнової кислоти функціонально зв'язана з послідовністю для контролю експресії, здатною керувати її експресією в клітині-господарі. В одному аспекті вектор може являти собою плазміду.
Отримання на основі афінності
У цьому винаході представлені способи зниження білків клітини-господаря, а також інших небажаних білків і нуклеїнових кислот у ході отримання білка проти МЕСЕ з використанням афінної хроматографії.
В одному варіанті здійснення спосіб отримання рекомбінантного білка включає (а) забезпечення клітини-господаря, генетично сконструйованої для експресії рекомбінантного білка, що становить інтерес; (Б) культивування клітини-господаря у придатних умовах, в яких клітина експресує рекомбінантний білок, що становить інтерес; та (с) збір препарату рекомбінантного білка, що становить інтерес, який продукується клітиною. В одному аспекті рекомбінантний білок, що становить інтерес, являє собою білок проти МЕСРЕ. У конкретному аспекті білок проти МЕСЕ вибраний із групи, яка складається з афліберцепту, МіпіТгар, рекомбінантного МіпіТгар (приклад яких розкритий у патенті США Мо 7279159), зсЕм та інших білків проти МЕС.
В одному аспекті цього варіанта здійснення рекомбінантний білок, що становить інтерес, експресується у придатній клітині-господарі. Необмежувальні приклади придатних клітин- господарів включають без обмеження СНО, СНО КІ, ЕЕ5УР?, МІСЕЄ, М50, 5рг/0, ембріональні клітини нирок та ВНК.
В одному аспекті цього варіанта здійснення рекомбінантний білок, що становить інтерес, культивують в ХВС. Придатне ХВС включає середовище Ігла в модифікації Дульбекко (ОМЕ), поживну суміш Хема, середовище ЕхсеїЇ, середовище ІЗ СНО-СО та ХВС18В. Інші ХВС, відомі фахівцям у цій галузі, також розглядаються як такі, що входять до обсягу цього винаходу.
Препарат для отримання може містити щонайменше одну домішку, включаючи один або більше білків клітини-господаря на додаток до рекомбінантного білка, що становить інтерес.
Щонайменше одна домішка може бути утворена з клітинного субстрату, клітинної культури або подальших процесів.
В одному варіанті здійснення цей винахід спрямований на способи отримання білка проти
МЕСЕ з біологічного зразка з використанням афінної хроматографії. У конкретному аспекті способи, розкриті в цьому документі, можна застосовувати для відокремлення щонайменше часткового білка проти МЕСЕ від одного або більше білків клітини-господаря та нуклеїнових кислот (наприклад, ДНК), утвореного в ході способу отримання культури білка проти МЕСЕ.
В одному аспекті спосіб може включати піддавання біологічного зразка, що містить білок проти
МЕСРЕ, разом із супутніми домішками, афінній хроматографії у придатних умовах. У конкретному аспекті афінна хроматографія може включати матеріал, здатний селективно або специфічно зв'язуватися з білком проти МЕСЕ («захоплення»). Необмежувальні приклади такого хроматографічного матеріалу включають білок А, білок С, хроматографічний матеріал, що містить, наприклад, білок, здатний зв'язуватися з білком проти МЕСЕ, і хроматографічний матеріал, що містить Ес-зв'язувальний білок. У конкретному аспекті білок, здатний зв'язуватися або взаємодіяти з білком проти МЕСЕ, може являти собою антитіло, злитий білок або його фрагмент. Необмежувальні приклади такого матеріалу, здатного селективно або специфічно зв'язуватися з білком проти МЕСЕ, описані в прикладі 7.
В одному аспекті цього варіанта здійснення спосіб може включати піддавання біологічного зразка, що містить білок проти МЕСЕ і один або більше білків клітини-господаря/домішок, афінній хроматографії у придатних умовах, причому стаціонарна фаза афінної хроматографії містить білок, здатний селективно або специфічно зв'язуватися з білююом проти МЕСЕ. У конкретному аспекті білок може являти собою антитіло, злитий білок, зсЕм або фрагмент антитіла. У конкретному аспекті білок може являти собою форми УЕСЕ 65, МЕСЕ 21 або МЕСЕ інших видів, як- от кролик. Наприклад, як проілюстровано в таблиці 7-1 та таблиці 7-10, застосування МЕСЕ 65 в якості білка, здатного селективно або специфічно зв'язуватися або взаємодіяти з білком проти
МЕСРЕ, забезпечує успішне отримання МТ5 (білка проти МЕСЕ), афліберцепту та фрагмента зсЕм проти МЕСРЕ. В іншому конкретному аспекті білок може являти собою один або більше білків з амінокислотною послідовністю, показаною в ЗЕО ІЮ МО: 73-80. У таблиці 7-1 також розкрито успішне отримання МТ»5 з використанням білків з амінокислотними послідовностями, показаними в 5ЕО ІО МО: 73-80, в якості білка, здатного селективно або специфічно зв'язуватися з білком проти МЕСЕ (МТ).
В одному аспекті цього варіанта здійснення спосіб може включати піддавання біологічного зразка, що містить білок проти МЕСЕ і один або більше білків/домішок клітини-господаря, афінній хроматографії у придатних умовах, причому стаціонарна фаза афінної хроматографії містить білок, здатний селективно або специфічно зв'язуватися з білком проти МЕСЕ, причому білок проти
МЕСЕ може бути вибраний з афліберцепту, Міпіттар МЕСЕ або антитіла проти МЕСЕ. У конкретному аспекті МіпіТтар МЕСЕ може бути отриманий, крім того, з компонентів рецептора
МЕС; він може бути утворений за допомогою рекомбінантної експресії МіпіТтар МЕСЕ у клітині- господарі. Здійснення способу може знижувати кількість одного або більше білків клітини- господаря у зразку. Наприклад, на фіг. З5А і фіг. 358 показано значне зниження загального вмісту білків клітини-господаря у зразку, що містить МТ5 (білок проти МЕСЕ) при використанні п'яти різних колонок для афінної хроматографії, які містять () МЕСЕтв5 (ЗЕО ІО МО: 72); (ії) тАБІ1 (людський ЇдО1 проти мишачого тАб до МЕСЕКТІ, де 5ЕО ІО МО: 73 являє собою важкий ланцюг і
ЗЕО ІЮО МО: 74 являє собою легкий ланцюг); (ії) тАбБ2 (людський ЇдДС1 проти мишачого тАБ до
МЕСЕКІ, де 5ЕО І МО: 75 являє собою важкий ланцюг і 5ЕО ІО МО: 76 являє собою легкий ланцюг); (м) тАБЗ (мишачий (951 проти мишачого тАб до МЕСЕК!І, де 5ЕО ІО МО: 77 являє собою важкий ланцюг і 5ЕО ІЮ МО: 78 являє собою легкий ланцюг) і (у) тАбБ4 (мишачий Ідс1 проти мишачого тАб до МЕСЕК'І, де ЗЕО ІО МО: 79 являє собою важкий ланцюгі 5ЕО ІО МО: 80 являє собою легкий ланцюг), оскільки різні білки здатні селективно або специфічно зв'язуватися з
МТ». Як видно на фіг. З5А ії фіг. 358, елюати з кожного зі способів отримання на основі афінності знижували кількість білків клітини-господаря від більше 7000 ч./млн до близько 25 ч./млн і до близько 55 ч./млн, відповідно.
Придатні умови застосування афінної хроматографії можуть включати без обмеження врівноважування колонки афінної хроматографії з використанням буфера для врівноваження.
Після врівноваження з використанням, наприклад, трис-гідрохлориду при рН від близько 8,3 до близько 8,6, в колонку для афінної хроматографії завантажують біологічний зразок. Після завантаження колонку можна промити один або більше разів із використанням, наприклад, буфера для врівноваження, як-от фосфатно-сольовий буфер Дульбекко (ОРВ5Б). Інші промивання, у тому числі промивання з використанням різних буферів, можна застосовувати перед елююванням колонки. Елюювання колонки може залежати від типу буфера, рН та провідності.
Можуть застосовуватися інші умови елюювання, добре відомі фахівцю в цій області. Після елюювання з використанням одного або більше типів елююючих буферів, наприклад, гліцину при рН від близько 2,0 до близько 3,0, елюйовані фракції можна нейтралізувати за допомогою додавання нейтралізуючого буфера, наприклад, 1 моль Ттіз при рН 7,5.
В одному аспекті варіанта здійснення рН як промивного буфера, так і буфера для врівноваження, може становити від близько 7,0 до 8,6. В одному аспекті варіанта здійснення промивний буфер може являти собою ЮРВ5. В одному аспекті елююючий буфер може містити 100 ммоль гліцинового буфера з рН близько 2,5. В іншому аспекті елююючий буфер може являти собою буфер з рН від близько 2,0 до близько 3,0. В одному аспекті нейтралізуючий буфер може містити 1 моль Ттіз з рН близько 7,5.
В одному аспекті цього варіанта здійснення спосіб може додатково включати промивання колонки буфером промивання. В одному аспекті цього варіанта здійснення спосіб може додатково включати елюювання колонки елююючим буфером з отриманням елюйованих фракцій. У конкретному аспекті кількість білків клітини-господаря в елюйованих фракціях значно знижена порівняно з кількістю білків клітини-господаря в біологічному зразку, наприклад, на близько 7095, близько 8095, 90905, близько 9595, близько 9895 або близько 99905.
Цей винахід може включати додавання однієї або більше стадій, без визначеного порядку, наприклад, хроматографії з гідрофобною взаємодією, афінної хроматографії, багатомодальної хроматографії, вірусної інактивації (наприклад, з використанням низького рН), вірусної фільтрації, та/або ультра/діафільтрації.
В одному аспекті профіль глікозилювання композиції білка проти МЕСЕ є таким: від близько 4095 до близько 5095 загальної кількості фукозильованих гліканів, від близько 3095 до близько 5595 загальної кількості сіальованих гліканів, від близько бо до близько 1595 манози-5, і близько 6095 до близько 7995 галактозильованих гліканів.
В одному аспекті цього варіанта здійснення білок проти МЕСЕ має глікозилювання Мапо з близько 32,495 залишків аспарагіну 123 та/або близько 27,196 залишків аспарагіну 196. У конкретному варіанті здійснення білок проти МЕСЕ може являти собою афліберцепт, антитіло проти МЕСЕ або МіпіТтар МЕСБЕ.
В одному варіанті здійснення спосіб може додатково включати складання лікарської речовини з використанням фармацевтично прийнятної допоміжної речовини. В одному аспекті фармацевтично прийнятна допоміжна речовина може бути вибрана з такого: вода, буферні засоби, цукор, сіль, поверхнево-активна речовина, амінокислота, поліол, хелатуючий засіб, емульгатор та консервант. Інші добре відомі фахівцю у цій галузі допоміжні речовини перебувають у межах цього варіанта здійснення.
В одному аспекті варіанта здійснення композиція може бути придатною для введення суб'єкту- людині. В одному аспекті цього варіанта здійснення введення можна здійснювати за допомогою інтравітреальної ін'єкції. В одному аспекті композиція може мати від близько 40 до близько 200 мг/мл білка, що становить інтерес. В конкретному аспекті білок, що становить інтерес, може являти собою афліберцепт, антитіло до МЕСЕ або МіпіТтар МЕСБЕ.
Композицію можна застосовувати в способі лікування або попередження ангіогенних захворювань очей, які можуть включати: вікову макулярну дистрофію (наприклад, вологу або суху), макулярний набряк, макулярний набряк після оклюзії вени сітківки, оклюзію вени сітківки (ЕМО), оклюзію центральної вени сітківки (СКМО), оклюзію гілки вени сітківки (ВКМО), діабетичний макулярний набряк (ОМЕ), хоріоїдальну неоваскуляризацію (СММ), неоваскуляризацію райдужної оболонки, неоваскулярну глаукому, післяопераційний фіброз при глаукомі, проліферативну вітреоретинопатію (РУК), неоваскуляризацію диска зорового нерва, неоваскуляризацію рогівки, неоваскуляризацію сітківки, неоваскуляризацію скловидного тіла, паннус, крилоподібну пліву, судинну ретинопатію, діабетичну ретинопатію у суб'єкта з діабетичним макулярним набряком; або діабетичні ретинопатії (наприклад, непроліфератива діабетична ретинопатія (наприклад, що характеризується рівнем за шкалою тяжкості діабетичної ретинопатії (ОК55) близько 47 або 53), або проліферативну діабетичну ретинопатію; наприклад, у суб'єкта, який не страждає на ОМЕ).
Синтез оксо-форм
Один варіант здійснення цього винаходу спрямований на один або більше способів синтезу окиснених форм білка з використанням світла. В одному аспекті цього варіанта здійснення рекомбінантний білок, що становить інтерес, являє собою білок проти МЕСЕ. У конкретному аспекті білок проти МЕСЕ являє собою афліберцепт. В іншому аспекті білок проти МЕСЕ являє собою Міпіттар МЕСЕ, у тому числі рекомбінантний Міпіїттар МЕСБ. В іншому аспекті цього варіанта здійснення білок проти МЕСЕ являє собою одноланцюговий варіабельний фрагмент (СЕМ).
В одному аспекті цього варіанта здійснення зразок містить білок, що становить інтерес, наприклад, злитий білок афліберцепт із мінімальним вмістом оксо-варіантів або без них. Зразок піддають фото-стресу для синтезу окиснених форм афліберцепту. У конкретному аспекті зразок піддають фото-стресу за допомогою застосування холодного білого світла. В іншому конкретному аспекті зразок піддають фото-стресу за допомогою ультрафіолетового світла.
У певному аспекті варіанта здійснення зразок, що містить афліберцепт або інший білок проти
МЕСРЕ, піддають впливу холодного білого світла протягом від близько 30 годин до близько 300 годин, з отриманням від близько 1,5 до близько 50-разового підвищення модифікованого олігопептиду. Ці пептиди ферментативно розщеплюються та їх аналізують, при цьому вони містять одне або більше групи, яка складається з
ОКТНТСТРРСО"РАРЕЇ С (5ЕБО 10 МО: 17), БІС ТС'ЕАТУМОаН' МК (БО ІО МО: 18),
ОТМТІПОМУМІ 5РОЗН'СІЕЇ 5МОЕК (5ЕО І МО: 19), ТЕГММОаірЕМУ/ЕМРЗБКН'ОНК (5ЕО ІО МО: 20),
ТММ ТН"А (5ЕО ІЮ МО: 21), БОТавАРЕМЕМУ5ЗЕЇІРЕЇПН"МТЕСВА (5ЕО ІО МО: 22), МН'ЕЄКОК (5ЕО Ір
МО: 23), БОТавАРЕМЕМ'УЗЕІРЕПНМТЕСА (5ЕО 10 МО: 64), БОТОА!АРЕМЕМУ5ЗЕЇІРЕПНМ"ТЕСВ (5ЕО ІО МО: 65), ТОБОБЕМ'К (5ЕО 0 МО: 66), 5БОСІ МТС ААББОЇ МТК (ЗЕО ІО МО: 67),
ПМУТОБА (5ЕБО 10 МО: 28), ВІМИО5А (БО 10 МО: 115), ПМИОБАК (5ЕБО 10 МО: 114),
ТЕСММат ЕМ" ЕМРББУК (5ЕО ІЮ МО: 29), ОРІЗМАТУ"К (5ЕО І МО: 69), КЕРІ ОТИРООК (5ЕО
ІО МО: 70) Е".5ТІТІОСМТАК (5ЕО ІО МО: 32), де Н" являє собою гістидин, окиснений до 2-оксо- гістидину, де С" являє собою карбоксиметильований цистеїн, де М' являє собою окиснений метіонін, де М/" являє собою окиснений триптофан, де У" являє собою окиснений тирозин і де Е" являє собою окиснений фенілаланін. Розщеплення можна здійснювати за допомогою протеаз, про які говорилося раніше, наприклад, трипсину. Олігопептиди можна аналізувати з використанням мас-спектрометрії.
У певному аспекті варіанта здійснення зразок, що містить афліберцепт або інший білок проти
МЕСРЕ, піддають впливу ультрафіолетового світла протягом від близько 4 годин до близько 40 годин, з отриманням від близько 1,5 до близько 25-разового підвищення модифікованих олігопептидних продуктів (отриманих при здійсненні розщеплення), причому зразок містить один або більше модифікованих олігопептидів, вибраних із групи, яка складається з
ОКТНТС"РРСО"РАРЕЇ С (5ЕБО 10 МО: 17), БІС ТС"ЕАТУМОаН'Т МК (5ЕБЕО ІО МО: 18),
ОТМТІПОМУМІ 5РОЗН'СІЕЇ 5МОЕК (5ЕО І МО: 19), ТЕГММОаірЕМУ/ЕМРЗБКН'ОНК (5ЕО ІО МО: 20),
ТММ ТН"А (5ЕО ІЮ МО: 21), БОТаАРЕМЕМУЗЕЇІРЕЇН"МТЕС (5ЕО ІЮ МО: 22), МН'ЕЄКОК (5ЕО І
МО: 23), БОТавАРЕМЕМ'УЗЕІРЕПНМТЕСА (5ЕО 10 МО: 64), БОТаА!ВРЕМЕМУ5ЗЕЇІРЕПНМ"ТЕСВ (5ЕО ІО МО: 65), ТОБОБЕМ'К (5ЕО 0 МО: 66), 5БОСІ МТС ААББОЇ МТК (ЗЕО ІО МО: 67),
ПМУТОБА (5ЕБО 10 МО: 28), ВІМИОБА (БО 10 МО: 115), ПІМИОБАК (5ЕБО І МО: 114),
ТЕСММатоЕмММ"ЕМРББУК (5ЕО ІЮ МО: 29), ОРІЗМАТУ"К (5ЕО І МО: 69), КЕРІ ОТ ІРОСК (5ЕО
ІО МО: 70) Е".5ТІТІОСМТАК (5ЕО ІО МО: 32), де Н" являє собою гістидин, окиснений до 2-оксо- гістидину, де С" являє собою карбоксиметильований цистеїн, де М' являє собою окиснений метіонін, де М/" являє собою окиснений триптофан, де У" являє собою окиснений тирозин і де Е" являє собою окиснений фенілаланін. Розщеплення можна здійснювати за допомогою протеаз, про які говорилося раніше, наприклад, трипсину. Олігопептиди можна аналізувати з використанням мас-спектрометрії.
Способи зведення жовто-коричневого кольору до мінімуму
У цьому винаході представлені способи зниження жовто-коричневого забарвлення в ході отримання афліберцепту, МіпіТгар або т.п., отриманих у ХВО.
В одному варіанті здійснення спосіб включає культивування клітини-господаря в ХВС у придатних умовах, причому клітина-господар експресує рекомбінантний білок, що становить інтерес, а потім збір препарату, який містить рекомбінантний білок, що становить інтерес. В одному аспекті рекомбінантний білок, що становить інтерес, являє собою білок проти МЕСЕ. У конкретному аспекті білок проти МЕСЕ вибраний із групи, яка складається з афліберцепту,
МіпіТгар, рекомбінантного Міпіттар (приклади яких розкриті в патенті США Мо 7279159, який включений в цей документ шляхом посилання в усій своїй повноті), зсЕм та інших білків проти
МЕСЕ. В одному аспекті спосіб може забезпечувати отримання рекомбінантного білка, що становить інтерес, причому колір препарату характеризують з використанням європейського способу ВУ або способу СІЕГ АВ (67). Крім того, наявність оксо-варіантів можна аналізувати з використанням, наприклад, РХ-МС.
В одному аспекті цього варіанта здійснення умови пом'якшення впливу включають підвищення або зниження кумулятивних концентрацій одного або більше компонентів середовища, наприклад, амінокислот, металів або антиоксидантів, у тому числі солей та прекурсорів, що відповідає зниженню кольору та білкових варіантів афліберцепту та Міпіїтар, МЕСБЕ.
Необмежувальні приклади амінокислот включають аланін, аргінін, аспарагін, аспарагінову кислоту, цистеїн, глутамін, глутамінову кислоту, гліцин, гістидин, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, пролін, серин, треонін, триптофан, тирозин і валін. У конкретному аспекті зниження концентрації цистеїну може бути ефективним для зниження жовто-коричневого кольору препарату. Концентрація цистеїну може також впливати на оксо-варіанти.
В одному варіанті здійснення спосіб включає культивування клітини-господаря в ХВС у придатних умовах, причому клітина-господар експресує рекомбінантний білок, що становить інтерес, наприклад, афліберцепт, і збір препарату білка, що становить інтерес, продукованого клітиною, причому придатні умови отримують частково за допомогою зниження кумулятивної концентрації цистеїну в ХВС до не більше ніж близько 10 ммоль. Приклади придатного середовища включають без обмеження ХВС1В, Ехсеї, тощо. Термін «кумулятивна кількість», що застосовується в цьому документі, стосується загальної кількості конкретного компонента, доданого в біореактор під час культивування клітин з утворенням ХВС, включно з кількостями, доданими на початку культивування (ХВС на день 0) і доданими внаслідок кількості компонента.
Кількості компонента, додані до культури в системі посівних ферментерів або інокулят перед отриманням у біореакторі (тобто, перед ХВС на день 0), також включені при розрахунку кумулятивної кількості компонента. Кумулятивна кількість не залежить від втрати компонента протягом часу під час культивування (наприклад, за допомогою метаболізму або хімічного розкладання). Таким чином, дві культури з однаковими кумулятивними кількостями компонента можуть, тим не менш, мати різні абсолютні рівні, наприклад, якщо компонент додають до двох культур в різні моменти часу (наприклад, якщо до однієї культури весь компонент додають з самого початку, а до іншої культури компонент додають протягом часу). Кумулятивна кількість також не залежить від синтезу компонента іп 5йи протягом часу в ході культивування (наприклад, за допомогою метаболізму або хімічного перетворення). Таким чином, дві культури з однаковими кумулятивними кількостями наведеного компонента можуть, тим не менш, мати різні абсолютні рівні, наприклад, якщо компонент синтезується іп 5йи в одній із двох культур за допомогою способу біологічного перетворення. Кумулятивна кількість може виражатися у таких одиницях, як, наприклад, грами або молі компонента.
Використовуваний у цьому документі термін «кумулятивна концентрація» стосується кумулятивної кількості компонента, розділеної на об'єм рідини в біореакторі на початку виробничої партії, включно зі споживанням початкового обсягу з будь-якого інокуляту, що застосовується в культурі. Наприклад, якщо біореактор містить 2 літри середовища клітинної культури на початку виробничої партії, й один грам компонента Х додають у дні 0, 1, 2 та 3, то кумулятивна концентрація після дня З становить 2 г/л (тобто, 4 грами, розділені на 2 літри). Якщо на день 4 до біореактора додають ще один літр рідини, яка не містить компонент Х, кумулятивна концентрація, як і раніше, становитиме 2 г/л. Якщо на день 5 деяка кількість рідини була втрачена з біореактора (наприклад, внаслідок випаровування), кумулятивна концентрація, як і раніше, становитиме 2 г/л.
Кумулятивна концентрація може виражатися в таких одиницях, як, наприклад, грами на літр або молі на літр.
В одному аспекті цього варіанту здійснення спосіб включає культивування клітини-господаря в
ХВС у придатних умовах, причому клітина-господар експресує рекомбінантний білок, що становить інтерес, збір препарату білка, продукованого клітиною, причому придатні умови отримують за допомогою зниження відношення кумулятивної концентрації цистеїну від близько 1:10 до 1:29 до загальної кумулятивної концентрації амінокислоти від близько 1:50 до близько 1:30.
В одному варіанті здійснення спосіб включає (ї) культивування клітини-господаря в ХВС у придатних умовах, причому клітина-господар експресує рекомбінантний білок, що становить інтерес, як-от афліберцепт, і (її) збір препарату рекомбінантного білка, що становить інтерес, продукованого клітиною, причому придатні умови отримують за допомогою зниження кумулятивної концентрації заліза в ХВС до менше ніж близько 55,0 мкмоль. В одному аспекті цього варіанта здійснення препарат, отриманий за допомогою цього способу, має менш жовто- коричневий колір, ніж препарат, отриманий за допомогою способу, в якому кумулятивна концентрація цинку в ХВС становить більше ніж близько 55,0 мкмоль.
В одному варіанті здійснення спосіб включає культивування клітини-господаря в ХВС у придатних умовах, причому клітина-господар експресує рекомбінантний білок, що становить інтерес, як-от афліберцепт. Спосіб додатково включає збір препарату рекомбінантного білка, що становить інтерес, продукованого клітиною, причому придатні умови отримують за допомогою зниження кумулятивної концентрації цинку в ХВС до не більше ніж 0,8 мкмоль. В одному аспекті цього варіанта здійснення препарат, отриманий за допомогою цього способу, має менш жовто- коричневий колір, ніж препарат, отриманий за допомогою способу, в якому кумулятивна концентрація цинку в ХВС становить більше ніж близько 0,8 мкмоль.
В одному варіанті здійснення спосіб включає культивування клітини-господаря в ХВС у придатних умовах, причому клітина-господар експресує рекомбінантний білок, що становить інтерес, як-от афліберцепт, і збір препарату рекомбінантного білка, що становить інтерес, продукованого клітиною, причому придатні умови отримують за допомогою зниження кумулятивної концентрації нікелю в ХВС до не більше приблизно 0,40 мкмоль. В одному аспекті цього варіанта здійснення препарат, отриманий за допомогою цього способу, має менш жовто- коричневий колір, ніж препарат, отриманий за допомогою способу, в якому кумулятивна концентрація цинку в ХВС становить більше ніж близько 0,40 мкмоль.
В одному варіанті здійснення спосіб включає культивування клітини-господаря в ХВС у придатних умовах, причому клітина-господар експресує рекомбінантний білок, що становить інтерес, як-от афліберцепт. Спосіб додатково включає збір препарату рекомбінантного білка, що становить інтерес, продукованого клітиною, причому придатні умови отримують за допомогою зниження кумулятивної концентрації цинку в ХВС до не більше ніж 56 мкмоль. В одному аспекті цього варіанта здійснення препарат, отриманий за допомогою цього способу, має менш жовто- коричневий колір, ніж препарат, отриманий за допомогою способу, в якому кумулятивна концентрація цинку в ХВС становить більше ніж близько 56 мкмоль.
В одному варіанті здійснення спосіб включає культивування клітини-господаря в ХВС у придатних умовах, причому клітина-господар експресує рекомбінантний білок, що становить інтерес, як-от афліберцепт. Спосіб додатково включає збір препарату рекомбінантного білка, що становить інтерес, продукованого клітиною, причому придатні умови отримують за допомогою наявності антиоксидантів у ХВС в кумулятивній концентрації від близько 0,001 ммоль до близько ммоль для одного антиоксиданту і кумулятивній концентрації не більше близько 30 ммоль, якщо в зазначене ХВС додають кілька антиоксидантів. В одному аспекті цього варіанту здійснення препарат, отриманий за допомогою цього способу, має менш жовто-коричневий колір, ніж препарат, отриманий за допомогою способу, причому антиоксиданти присутні в ХВС у кумулятивній концентрації менше 0,01 ммоль або більше 100 ммоль. Необмежувальні приклади антиоксиданту можуть включати таурин, гіпотаурин, гліцин, тіоктову кислоту, глутатіон, холінхлорид, гідрокортизон, вітамін С, вітамін Е, хелатоутворювальні засоби, каталазу, 5- карбоксиметил-! -цистеїн та їхні комбінації. Необмежувальні приклади хелатоутворювальних засобів включають ауринтрикарбонову кислоту (АТА), дефероксамін (ОБО), ЕОТА та цитрат.
В одному варіанті здійснення спосіб включає культивування клітини-господаря в ХВС у придатних умовах, причому клітина-господар експресує рекомбінантний білок, що становить інтерес, як-от афліберцепт. Спосіб додатково включає збір препарату рекомбінантного білка, що становить інтерес, продукованого клітиною, причому придатні умови включають ХВС із кумулятивною концентрацією заліза у зазначеному ХВС, що становить менше близько 55 мкмоль, кумулятивною концентрацією міді у зазначеному ХВС, що становить не більше близько 0,8 мкмоль, концентрацією нікелю у зазначеному ХВС, що становить не більше близько 0,40 мкмоль, кумулятивною концентрацією цинку у зазначеному ХВС, що становить не більше близько 56 мкмоль, кумулятивною концентрацією цистеїну у зазначеному ХВС, що становить менше 10 ммоль; таЛабо антиоксидант у зазначеному ХВС у концентрації від близько 0,001 ммоль до близько 10 ммоль для одного антиоксиданту, та кумулятивною концентрацією не більше близько ммоль, якщо у зазначене ХВС додають кілька антиоксидантів.
В одному аспекті цього варіанта здійснення препарат, отриманий за допомогою придатних умов, забезпечує зниження білкових варіантів афліберцепту та МіпіТттар МЕСЕ до необхідної кількості білкових варіантів афліберцепту та Міпіттар МЕСЕ (що називається «цільовим значенням» білкових варіантів афліберцепту та МіпіТттар МЕСЕ). У додатковому аспекті цього варіанту здійснення препарат, отриманий за допомогою застосування придатних умов, забезпечує зниження кольору препаратів до необхідного значення Б" або значення ВУ (що називається «цільовим значенням Б"» або «цільовим значенням ВУ», відповідно), якщо препарат білка, в тому числа варіанти афліберцепту та МіпіТтар МЕСЕ, нормалізовані до концентрації 5 г/л або 10 г/л. У наступному аспекті цього варіанта здійснення цільове значення Б" (або цільове значення ВУ) та/або цільове значення варіантів може бути отримано в препараті, в якому титр підвищується або значно не знижується.
Ці та інші аспекти винаходу будуть краще оцінені й зрозумілі при розгляді разом із наведеним нижче описом та доданими графічними матеріалами. Подальший опис, хоч і вказує на різні варіанти здійснення та їхні численні конкретні деталі, передбачений в якості ілюстрації, а не обмеження. Багато замін, модифікацій, додавання або перестановки можуть бути виконані в межах обсягу цього винаходу.
КОРОТКИЙ ОПИС ГРАФІЧНИХ МАТЕРІАЛІВ
Файл патенту або заявки містить щонайменше один кольоровий графічний матеріал. Копії цього патенту або публікації заявки на патент із кольоровим графічним матеріалом(ами) будуть надані Відомством за запитом та після сплати необхідного мита.
На фіг. 1 зображений МіпіТтар МЕСЕ, утворений з використанням ілюстративного варіанта здійснення, що містить МЕСЕК'І1 (5ЕО ІО МО: 34), МЕСЕК2 (5ЕО ІО МО: 36), фрагмент шарнірного домену (5ЕО ІЮ МО: 60) відщеплений від афліберцепту фрагмент Ес (ЗЕО ІО МО: 113).
На фіг. 2 зображений запропонований механізм окислення гістидину до 2-оксо-гістидину (14
Да).
На фіг. З зображений запропонований механізм окиснення гістидину до 2-оксо-гістидину (16
Да).
На фіг. 4 зображений запропонований механізм окиснення триптофану до М-формілкінуреніну та кінуреніну.
На фіг. 5 зображений ілюстративний варіант здійснення отримання афліберцепту.
На фіг. 6 зображений ілюстративний варіант здійснення отримання МіпіТгар МЕСЕ.
На фіг. 7 зображений ілюстративний варіант здійснення отримання афліберцепту.
На фіг. 8 зображений ілюстративний варіант здійснення отримання МіпіТгар МЕСБЕ.
На фіг. 9 зображена блок-схема розрахованих стандартів ВУ у порівнянні зі значенням Б", розрахованим згідно з ілюстративним варіантом здійснення.
На фіг. 10 зображені результати експерименту, здійснюваного для оцінки відсоткового вмісту 2-оксо-гістидинів та окиснення триптофану (де підкреслення означає окиснення залишку) в олігопептидах із розщепленого протеазою завантаження АЕХ і проточної фракції, включаючи фрагменти відновленого та алкільованого афліберцепту (5ЕО ІЮ МО: 55), включно з ЗЕО ІЮО МО5 114-115, 21, 115, 28, 28, 20, 18, 17, 116-117 та 19, відповідно, в порядку появи.
На фіг. 11 зображена відносна поширеність пептидів, ідентифікованих з аналізу пептидного картування, здійсненого з використанням олігопептидів із розщепленого протеазою завантаження
АЕХ ії проточної фракції (де підкреслення означає окиснення залишку в пептидній послідовності), включаючи фрагменти афліберцепту (5ЕО ІЮ МО: 55), включно з 5ЕО ІО МО5 22, 18, 21, 19-20, 118-119 та 28-29, відповідно, в порядку появи.
На фіг. 12А зображений повний огляд графіка хроматограми поглинання в залежності від часу (хвилини) для МТА та МТ з довжиною хвилі 350 нм.
На фіг. 128 зображений розгорнутий вигляд графіка хроматограми поглинання в залежності від часу (16-30 хвилин) для МТА та МТ з довжиною хвилі 350 нм, включно з ЗЕО ІЮ МОЗ 21, 28 та 28, відповідно, у порядку появи.
На фіг. 123 зображений розгорнутий вигляд графіка хроматограми поглинання в залежності від часу (30-75 хвилин) для МТА та МТ з довжиною хвилі 350 нм, включно з 5ЕО ІЮ МОЗ 17, 20, 18 та 19, відповідно, у порядку появи.
На фіг. 13 зображені результати експерименту, здійснюваного для оцінки відсоткового вмісту 2-оксо-гістидинів (і подвійного окиснення триптофану) в олігопептидах із розщепленого протеазою
МТ, який був оброблений за допомогою хроматографії АЕХ та олігопептидів із розщепленого протеазою МТ, який вичищали з хроматографії АЕХ, включно з 5ЕО ІО МО5 21, 28, 17, 20 і 18- 19, відповідно, в порядку появи.
На фіг. 14 зображені результати експерименту, що здійснюється для порівняння кислотних форм, присутніх у різних виробничих партіях МТ, і кислотних фракцій кислоти, отриманих під час здійснення сильної катіонообмінної (СЕХ) хроматографії, включно з 5ЕО ІЮ МОЗ 21, 28, 28, 17, 20, і 18-19, відповідно, у порядку появи.
На фіг. 15 зображений ілюстративний спосіб збагачення кислотних форм та інших варіантів,
присутніх у зразках збору клітинної культури з використанням сильної катіонообмінної хроматографії.
На фіг. 16 зображені фракції, утворені при здійсненні сильної катіонообмінної хроматографії згідно з ілюстративним варіантом здійснення.
На фіг. 17 зображені сильні катіонообмінні хроматограми, отримані згідно з ілюстративним варіантом здійснення, для отримання МТ1 (перед будь-якою виробничою процедурою, «ВУ 3), який піддається СЕХ, і для збагачених варіантів десіальованого Міпі Ттар (а5МТ1) з використанням подвійного градієнта солі та рН.
На фіг. 18А зображена 30 хроматограма для нефракціонованого вихідного контролю, що здійснюється за допомогою сильної катіонообмінної хроматографії згідно з ілюстративним варіантом здійснення.
На фіг. 188 зображена 30 хроматограма для МТ, при цьому фракція 1 демонструє деякі з хвостових особливостей експерименту, який здійснюється за допомогою сильної катіонообмінної хроматографії згідно з ілюстративним варіантом здійснення.
На фіг. 18С зображена 30 хроматограма для МТ1, функція фракції 2, яка здійснюється за допомогою сильної катіонообмінної хроматографії згідно з ілюстративним варіантом здійснення.
На фіг. 180 зображена 30 хроматограма для МТ1, функція фракції 3, яка здійснюється за допомогою сильної катіонообмінної хроматографії згідно з ілюстративним варіантом здійснення.
На фіг. 18Е зображена ЗО хроматограма для МТ, функція фракції 4, яка здійснюється за допомогою сильної катіонообмінної хроматографії згідно з ілюстративним варіантом здійснення.
На фіг. 18 зображена ЗО хроматограма для МТ1, функція фракції 5, яка здійснюється за допомогою сильної катіонообмінної хроматографії згідно з ілюстративним варіантом здійснення.
На фіг. 1805 зображена 3О хроматограма для МТ, функція фракції 6, яка здійснюється за допомогою сильної катіонообмінної хроматографії згідно з ілюстративним варіантом здійснення.
На фіг. 18Н зображена 30 хроматограма для МТ1, функція фракції 7, яка здійснюється за допомогою сильної катіонообмінної хроматографії згідно з ілюстративним варіантом здійснення.
На фіг. 19 зображені електроферограми капілярного ізоелектричного фокусування з детекцією (СІЕР) безпосередньо в капілярі, виконаного згідно з ілюстративним варіантом здійснення для отримання МТ.
На фіг. 20 зображені результати дослідження кореляції впливу холодного білого світла на МТ1 або УФА-світла з появою окиснених амінокислотних залишків, включно з 5ЕО ІЮ МО5 114, 114- 115, 21, 115, 28, 28, 28, 17, 83, 20, 18, 29, 29, 19, та 22, відповідно, у порядку появи.
На фіг. 21 зображені ЗО хроматограми 5ЕС-РОА (ексклюзійної хроматографії у поєднанні з детектором на фотодіодній матриці) підданого впливу ХБС МТ з поглинанням при «350 нм (див., наприклад, кругове виділення 350 нм) згідно з ілюстративним варіантом здійснення, де А позначає хроматограму при Т-0, В позначає хроматограму при 0,5х ІСН, С позначає хроматограму при 2,0х ІСН та О позначає МТ1 у флаконах (нормалізований до 80 мг/мл), підданого впливу ХБС протягом різних часових інтервалів.
На фіг. 22 зображені 30 хроматограми 5ЗЕС-РОА підданого впливу УФА МТ1 з поглинанням при -350 нм (див., наприклад, кругове виділення -350 нм) згідно з ілюстративним варіантом здійснення, де А позначає хроматограму при Т-0, В позначає хроматограму при 0,5х ІСН, С позначає хроматограму при 2,0х ІСН та О позначає МТ у флаконах (нормалізований до 80 мг/мл) підданого впливу УФА протягом різних часових інтервалів.
На фіг. 23А зображені коефіцієнти поглинання АЗ20/280, розраховані на підставі хроматограм
ЗЕС-РОА для зразків, підданих стресу з використанням СУМІ. (верхня панель), а В являє собою графік коефіцієнтів поглинання АЗ20/280 варіантів розміру у зразках, підданих впливу СМ/І. (нижня панель), причому зразки піддають впливу згідно з ілюстративним варіантом здійснення.
На фіг. 24А зображені коефіцієнти поглинання АЗ20/280, розраховані на підставі хроматограм
ЗЕС-РОА для зразків, підданих стресу з використанням ОМА (верхня панель), а В являє собою графік коефіцієнтів поглинання АЗ20/280 варіантів розміру у зразках, підданих впливу ОМА (нижня панель), причому зразки піддають впливу згідно з ілюстративним варіантом здійснення.
На фіг. 25А зображена масштабна оцінка впливу інкубації різних компонентів з афліберцептом на формування кольору (СІЕ І", а", Б", прогнозоване значення Б); і В являє собою графік фактичного значення відносно прогнозованого значення б.
На фіг. 26 А зображений вплив ХВС, що містять низький вміст цистеїну та низький вміст металів, на титр афліберцепту, на фіг. 26 В зображений вплив ХВС, що містять низький вміст цистеїну та низький вміст металів, на концентрацію життєздатних клітин, на фіг. 26 С зображений вплив ХВС, що містять низький вміст цистеїну та низький вміст металів, на життєздатність, на фіг. 26 О зображений вплив ХВС, що містять низький вміст цистеїну та низький вміст металів, на вміст аміаку, на фіг. 26 Е зображений вплив ХВС, що містять низький вміст цистеїну та низький вміст металів, на осмоляльність.
Фіг 27 являє собою діаграму, що демонструє прогнозований профіль кольору врожаю (видимого як значення Б" дня 13) при збільшенні/зменшенні вмісту металів та цистеїну згідно з ілюстративним варіантом здійснення.
На фіг. 28(А-В) зображений вплив інкубації різних компонентів з афліберцептом у відпрацьованому ХВС на формування кольору (СІЕ І", а", Б", прогнозоване значення б) (А); та за графіком масштабованих прогнозованих впливів на значення Б (В).
На фіг. 28С зображені масштабовані оцінювані ефекти інкубації різних компонентів з афліберцептом у ХВС на формування кольору (СІЕ 1", а", Б", прогнозоване значення Б) в культурі у струшуваній колбі.
На фіг. 280 зображений вплив інкубації мезилатної солі гіпотаурину та дефероксаміну (ОБО) з афліберцептом у відпрацьованому ХВС на генерацію кольору (СІЕ І", а", Б", прогнозоване значення «р»).
На фіг. 28Е зображений вплив інкубації різних компонентів окремо з афліберцептом із культури у струшуваній колбі на формування кольору (СІЕ І", а", Б", прогнозоване значення «бБ»).
Фіг. 29 являє собою діаграму, яка показує вплив додавання уридину, марганцю, галактози і дексаметазону до ХВС на титр продукованого афліберцепту.
Фіг. 30 являє собою діаграму, яка показує вплив додавання уридину, марганцю, галактози та дексаметазону до ХВС на життєздатність клітин, які експресують афліберцепт, у яких утворюється афліберцепт.
Фіг. 31 являє собою діаграму, яка показує вплив додавання уридину, марганцю, галактози та дексаметазону до ХВС на кількість життєздатних клітин, що експресують афліберцепт, у яких утворюється афліберцепт.
Фіг. 32 являє собою діаграму, яка показує стандартну криву поглинання білка клітини- господаря залежно від білка (нг/мл), отриманого з використанням стандартних розчинів білка клітини-господаря з Судпив ЗО (550).
Фіг. 33 являє собою зображення аналізу 505-РАСЕ, виконаного з використанням невідновлювального буфера для зразків 5Х05-РАСЕ.
Фіг. 34 являє собою зображення аналізу 505-РАСЕ, виконаного з використанням невідновлювального буфера для зразків 5205-РАСЕ.
Фіг. З5А являє собою діаграму загальної кількості білка клітини-господаря, виявленого в завантажувальному розчині, елюйовані фракції з колонки для афінної хроматографії 1-3, що містять МЕСЕ 65, тАБІ1 та тАбБ2, відповідно.
Фіг. 35В являє собою діаграму загальної кількості білків клітини-господаря, виявлених у завантажувальному розчині, елюйовані фракції з колонки для афінної хроматографії 1, 2, 4 та 5, що містять МЕСЕ 65, тАб1, тАбБ3З та тАБба4, відповідно.
На фіг. ЗбА показані профілі ХЕС МЕСЕ МіпіТгар до та на фіг. 36В показані профілі «»ЕС МЕСЕ
МіпіТгар після проведення афінної хроматографії.
На фіг. 37 зображено мультиплікаційне зображення кінетичного дослідження МЕСЕ МіпіТгар на МЕС :вє5, де вивчені конструкції МЕСЕ МіпіТтар отримували до та після отримання афінної хроматографії згідно з деякими ілюстративними варіантами здійснення.
На фіг. 38 представлені сенсограми 5РК від кінетичного дослідження МЕСЕ МіпіТтар до
МЕСЕ:в5, де вивчені конструкції МЕСЕ МіпіїТтар, отримували до та після отримання афінної хроматографії згідно з деякими ілюстративними варіантами здійснення.
Фіг. 39 являє собою діаграму загальної кількості білка клітини-господаря, виявленого в завантажувальному розчині, елюйовані фракції з колонки для афінної хроматографії, повторно застосовувані для колонок, що містять МЕСЕ 65, тАбБІ1 та тАба2.
На фіг. 40 зображена структура МЕСЕ МіпіТгар МТІ (ЗЕО ІО МО: 46) згідно з ілюстративним варіантом здійснення.
На фіг. 41 зображена структура МЕСЕ МіпіТгар МТ6 (З5ЕО ІО МО: 51) згідно з ілюстративним варіантом здійснення.
На фіг. 42 зображені загальні іонні хроматограми (ТІС) відносної абсорбції залежно від часу (хвилини) для нативного аналізу ЗЕС-М5 МТ1, МТ5 та Мб та збільшений вид низькомолекулярної області з ТІС.
На фіг. 43 зображені мас-спектри з деконволюцією основного піку для МТ1 і МТ5 для підтвердження ідентичності димеру МіпіТгтар зі з'ясуванням для деяких РТМ з указанням М- кінцевих амінокислот (5ЕО ІО МО: 120).
На фіг. 44 зображені мас-спектри з деконволюцією основного піку для МТ, які підтверджують ідентичність одноланцюгової Міпі Тгар зі з'ясуванням деяких РТМ.
На фіг. 45А представлений графік залежності відносного поглинання від часу (хвилини) для низькомолекулярних домішок у МТ.
На фіг. 458 зображені мас-спектри низькомолекулярних домішок у МТ1.
На фіг. 46 зображено відносне поглинання залежно від часу (хвилини) для МТ, що показує відсутність ферменту ГаркКІСАТОК, який застосовується для розщеплення афліберцепту на МТ1.
На фіг. 47 показана відносна абсорбція залежно від часу (хвилини) для низькомолекулярних домішок МТ5.
На фіг 48 зображено відносне поглинання залежно від часу (хвилини) для низькомолекулярних домішок МТ6.
Фіг 49А являє собою графік залежності поглинання від часу (хвилини), отриманий при виконанні НІГІС-ОМ/М5 для МЕСЕ МіпіТгтар МТ, де графік показує елюювання основного піку за 21 хвилину та О-гліканів приблизно за 21,5 хвилини.
На фіг. 498 зображений мас-спектр, отриманий при виконанні НІ ІС-ОМ/М5 для МЕСЕ МіпіТгар
МТЄ, який показує основний пік при 47985,8 Да.
На фіг. 49С зображені мас-спектри О-гліканів МЕСЕ МіпіТтар МТб, отримані при виконанні
НІС-ОМ/М5.
Фіг. 50 являє собою зображення димеру МЕСЕ МіпіТгар, де дисульфідний місточок у шарнірній області МЕСЕ МіпіТгар (ЗЕО ІО МО: 83, 123, 83 та 123) може бути паралельним або схрещеним.
На фіг. 51 зображена відносна частота розподілу гліканів, яка спостерігається в Азп36, серед
МТ, МТ?5 і МТб6. Фігура розкриває 5ЕО ІО МО: 121.
На фіг. 52 зображена відносна частота розподілу гліканів, яка спостерігається в Азпб8, серед
МТ, МТ? їі МТб6. Фігура розкриває 5ЕО 10 МОЗ 101 та 30, відповідно, у порядку появи.
На фіг. 53 зображена відносна частота розподілу гліканів, яка спостерігається в Азп123, серед
МТ, МТ5 і МТб6. Фігура розкриває 5ЕО ІО МО: 82.
На фіг. 54 зображена відносна частота розподілу гліканів, яка спостерігається в Азп196, серед
МТ, МТ? їі МТ6. Фігура розкриває 5ЕО 10 МО5 103 та 122, відповідно, у порядку появи.
На фіг. 55 показаний аналіз вивільненого М-зв'язаного глікану за допомогою хроматографії з гідрофільною взаємодією (НІГІС) у поєднанні з виявленням за допомогою флуоресценції та мас- спектрометричним аналізом (повномасштабним та скороченим).
На фіг. 56 представлені хроматограми НІГІС-РІ КК для МТ, МТ5 та МТ6.
На фіг. 57 показаний аналіз вивільненого М-зв'язаного глікану за допомогою НІГІС у поєднанні з виявленням за допомогою флуоресценції та мас-спектрометричним аналізом (повномасштабним, скороченим та нормалізованим).
Фіг. 58А являє собою таблицю з детальною ідентифікацією та кількісною оцінкою гліканів зі зразків МЕСЕ МіпіТгар МТ, МТ5 та Мб.
Фіг. 588 являє собою таблицю з детальною ідентифікацією та кількісною оцінкою гліканів зі зразків МЕСЕ МіпіТгар МТ, МТ5 та МТ6.
Фіг. 58С являє собою таблицю з детальною ідентифікацією та кількісною оцінкою гліканів зі зразків МЕСЕ МіпіТгар МТ, МТ5 та Мб.
На фіг. 59 зображена ілюстративна виробнича процедура для отримання МіпіТгар згідно з ілюстративним прикладом здійснення.
ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС СУТІ ВИНАХОДИ
Ангіогенез - зростання нових кровоносних судин із раніше існуючої судинної мережі, являє собою високоорганізований процес, який має вирішальне значення для правильного ембріонального та постнатального розвитку судин. Аномальний або патологічний ангіогенез є ознакою раку та деяких захворювань сітківки, коли підвищена регуляція проангіогенних факторів,
як-от фактор росту ендотелію судин (МЕСЕ), призводить до збільшення проліферації ендотелію, змін морфології судин та підвищення проникності судин. Підвищені рівні МЕСЕ були виявлені у скловидному тілі та судинній мережі сітківки у пацієнтів із різними захворюваннями очей.
Блокування активності МЕСЕ також стало терапією вибору для лікування ОМЕ, вологої АМО, СМУ, оклюзії вени сітківки та інших захворювань очей, в основі яких лежить патологічний ангіогенез.
У контексті цього документа афліберцепт являє собою один із таких білків проти МЕСЕ, який містить повністю людську амінокислотну послідовність, що містить другий домен Ід людського
МЕСЕК' і третій Ід4-домен людського МЕСЕК2, експресовані у вигляді лінійного злиття з (Ес) людського ЇДС1. Афліберцепт зв'язує всі форми МЕСЕ-А (МЕСРЕ), але, крім того, зв'язує РІСЕ та
МЕСЕ-В. Декілька інших гомодимерних МіпіТтар МЕСЕ були створені у вигляді ферментативно розщеплених продуктів із афліберцепту або рекомбінантно експресованих безпосередньо з ліній клітин-господарів. Один такий приклад МіпіТгтар МЕСЕ показаний на фіг. 1. На цій фігурі показаний кінцевий лізин (К), деякі процеси культивування забезпечують видалення цього кінцевого лізину, а інші - ні. Фіг. 1 проілюстрований спосіб, у якому кінцевий лізин залишається. У цілому афліберцепт охоплює як наявність, і відсутність кінцевого лізину.
Як показано у цьому документі, в цьому винаході частково розкрито отримання білків проти
МЕСЕ (приклад 1) з використанням ХВС. Аналіз розчинів, які містять афліберцепт, отриманих із використанням певних ХВС, продемонстрував певну властивість кольору, наприклад, інтенсивний жовто-коричневий колір. Інтенсивність кольору розчину залежить від застосовуваного ХВС. Не всі досліджені ХВС забезпечували зразок із виразним жовто-коричневим кольором після того, як розчини були нормалізовані до концентрації 5 г/л.
Колір, наприклад, жовто-коричневий, у розчині ін'єкційного терапевтичного препарату може бути небажаною характеристикою. Це може бути важливим параметром, що застосовується для визначення того, чи задовольняє лікарський продукт заданому рівню чистоти та якості для конкретного терапевтичного засобу. Такий колір, як жовто-коричневий, що спостерігається під час отримання біологічного препарату, може бути викликаний хімічними модифікаціями цього біологічного препарату, продуктами розкладання допоміжних речовин композиції або продуктами розкладання, утвореними внаслідок реакції біологічних та допоміжних речовин композиції. Тим не менш, така інформація може бути корисною для розуміння причин зміни кольору. Це також допоможе у розробці умов як короткострокового, так і тривалого зберігання для запобігання модифікаціям, що сприяють такій зміні кольору.
Автори цього винаходу спостерігали, що застосування АЕХ в ході отримання розчину білка проти МЕСЕ зводило до мінімуму жовто-коричневе забарвлення. Крім того, автори цього винаходу виявили, що жовто-коричневе забарвлення може бути зменшено за допомогою модифікації культури клітин, яка застосовується для отримання рекомбінантного білка, як-от афліберцепт, або модифікованого афліберцепту, як-от МіпіТгар.
Цей винахід охоплює білки проти МЕСЕ та їх отримання з використанням ХВС. Крім того, цей винахід заснований на ідентифікації та оптимізації технології попередніх та подальших процесів для отримання білка.
Як показано в цьому документі, в деяких із прикладів, наведених нижче, описано отримання білка проти МЕСЕ (приклад 1), отримання окиснених білків проти МЕСЕ (приклад 4), способи зменшення окиснених білків проти МЕСЕ за допомогою оптимізації культурального середовища (приклад 5) і за рахунок оптимізації способів отримання (приклад 2).
Низка нещодавніх патентних заявок та виданих патентів спрямовані на опис різних форм афліберцепту та способів його отримання, але в жодній з них не описані або не пропонуються композиції проти МЕСЕ та способи їх отримання, описані в цьому документі. Див., наприклад, заявку на патент США Мо16/566847 від Сопегив Віозсіепсез Іпс., патент США Мо10646546 від Зат
Спип Оапд РПпагт. Со., Ца., патент США Мо 10576128 від Еоппусоп АС, міжнародну заявку Мо
РСТ/О52020/015659 від Атдеп Іпс. та патенти США МоМо 8956830; 9217168; 9487810; 9663810; 9926583 та 10144944 від Мотепіа Ріпаптасецігсаї!5, Іпс.
Ї. Пояснення вибраних термінів
Якщо не зазначено інше, всі технічні та наукові терміни, що застосовувані в цьому документі, мають таке саме значення, яке зазвичай розуміє звичайний фахівець в галузі, до якої належить це розкриття. Способи та матеріали, аналогічні або еквівалентні описаним у цьому документі, відомі фахівцю в цій галузі, можна застосовувати на практиці конкретних варіантів здійснення, описаних у цьому документі. Усі згадані публікації включені у цей документ за допомогою посилання в усій своїй повноті.
Форми однини слід розуміти як такі, що означають «щонайменше один», терміни «близько» і «приблизно» слід розуміти як такі, що допускають стандартні варіації, як буде зрозуміло фахівцям у цій галузі техніки, а у випадках, коли вказані діапазони, в них включені кінцеві точки.
Використовуваний у цьому документі термін «ангіогенне захворювання ока» означає будь-яке захворювання ока, викликане або асоційоване зі зростанням або проліферацією кровоносних судин або проникністю кровоносних судин.
Використовуваний у цьому документі термін «середовище з хімічно визначеним складом» або «середовища з хімічно визначеним складом» (скорочення «ХВС» в обох випадках) стосується синтетичного поживного середовища, в якому визначено ідентичність і концентрацію всіх інгредієнтів. Середовище з хімічно визначеним складом не містить екстрактів бактерій, дріжджів, тварин або рослин, сироватки або плазми тварин, незважаючи на те, що можуть бути додані окремі компоненти рослинного або тваринного походження (наприклад, білки, поліпептиди тощо).
Середовища з хімічно визначеним складом можуть містити неорганічні солі, як-от фосфати, сульфати тощо, необхідні для підтримки зростання. Джерело вуглецю визначено і зазвичай являє собою цукор, як-от глюкоза, лактоза, галактоза, тощо, або інші сполуки, як-от гліцерин, лактат, ацетат, тощо. У той час як у деяких культуральних середовищах із визначеним хімічним складом також застосовуються фосфатні солі в якості буфера, можна застосовувати інші буфери, як-от бікарбонат натрію, НЕРЕ5, цитрат, триєтаноламін тощо. Приклади комерційно доступних середовищ включають, без обмеження, різні середовища Ігла в модифікації Дульбекко (ОМЕ) (бБідта-Аїагіснй Со; ЗАБС Віозсіепсе5, Іпс.), поживну суміш Хема (Зідта-Аїайгісй Со; ЗАЕС
Віозсіепсев5, Іпс.), різні середовища ЕХ-СЕЇЇ (бідта-АЇйгісн Со; ЗАЕС Віозсіепсев, Іпс.), різні середовища ІЗ СНО-СО (БОЛЕМ Ігуїпе 5бсіепійіс), їхні комбінації, тощо. Способи отримання культуральних середовищ із визначеним хімічним складом відомі в цій галузі, наприклад, у патентах США МоМо 6171825 та 6936441, МО 2007/077217 та заявках на патент США МоМо 2008/0009040 та 2007/0212770, повний вміст яких включений в цей документ за допомогою посилання.
Використовуваний у цьому документі термін «кумулятивна кількість» стосується загальної кількості конкретного компонента, доданого до біореактора в ході культивування клітин з утворенням ХВС, включаючи кількості, додані на початку культивування (ХВС на день 0) і додані згодом кількості компонента. Кількості компонента, додані до культури в системі посівних ферментерів або інокулят перед отриманням у біореакторі (тобто, перед ХВС на день 0), також включені при розрахунку кумулятивної кількості компонента. Кумулятивна кількість не залежить від втрати компонента протягом часу під час культивування (наприклад, за допомогою метаболізму або хімічного розкладання). Таким чином, дві культури з однаковими кумулятивними кількостями компонента можуть, тим не менш, мати різні абсолютні рівні, наприклад, якщо компонент додають до двох культур в різні моменти часу (наприклад, якщо до однієї культури весь компонент додають з самого початку, а до іншої культури компонент додають протягом часу). Кумулятивна кількість також не залежить від синтезу компонента іп 5йи протягом часу в ході культивування (наприклад, за допомогою метаболізму або хімічного перетворення). Таким чином, дві культури з однаковими кумулятивними кількостями наведеного компонента можуть, тим не менш, мати різні абсолютні рівні, наприклад, якщо компонент синтезується іп зіш в одній із двох культур за допомогою способу біологічного перетворення. Кумулятивна кількість може виражатися у таких одиницях, як, наприклад, грами або молі компонента.
Використовуваний у цьому документі термін «кумулятивна концентрація» стосується кумулятивної кількості компонента, розділеної на об'єм рідини в біореакторі на початку виробничої партії, включно зі споживанням початкового обсягу з будь-якого інокуляту, що застосовується в культурі. Наприклад, якщо біореактор містить 2 літри середовища клітинної культури на початку виробничої партії, й один грам компонента Х додають у дні 0, 1, 2 та 3, то кумулятивна концентрація після дня З становить 2 г/л (тобто, 4 грами, розділені на 2 літри). Якщо на день 4 до біореактора додають ще один літр рідини, яка не містить компонент Х, кумулятивна концентрація, як і раніше, становитиме 2 г/л. Якщо на день 5 деяка кількість рідини була втрачена з біореактора (наприклад, внаслідок випаровування), кумулятивна концентрація, як і раніше, становитиме 2 г/л.
Кумулятивна концентрація може виражатися в таких одиницях, як, наприклад, грами на літр або молі на літр.
Використовуваний у цьому документі термін «склад» або «композиція» стосується білка, що становить інтерес, об'єднаного у складі разом із одним або більше фармацевтично прийнятними середовищами. У одному аспекті білок, що становить інтерес, являє собою афліберцепт та/або
МіпіТгар. У деяких ілюстративних варіантах здійснення кількість білка, що становить інтерес, у складі може варіювати від близько 0,01 мг/мл до близько бО0 мг/мл. У деяких конкретних варіантах здійснення кількість білка, що становить інтерес, у складі може складати близько 0,01 мг/мл, близько 0,02 мг/мл, близько 0,03 мг/мл, близько 0,04 мг/мл, близько 0,05 мг/мл, близько 0,06 мг/мл, близько 0,07 мг/мл, близько 0,08 мг/мл, близько 0,09 мг/мл, близько 0,1 мг/мл, близько 0,2 мг/мл, близько 0,3 мг/мл, близько 0,4 мг/мл, близько 0,5 мг/мл, близько 0,6 мг/мл, близько 0,7 мг/мл, близько 0,8 мг/мл, близько 0,9 мг/мл, близько 1 мг/мл, близько 2 мг/мл, близько З мг/мл, близько 4 мг/мл, близько 5 мг/мл, близько 6 мг/мл, близько 7 мг/мл, близько 8 мг/мл, близько 9 мг/мл, близько 10 мг/мл, близько 15 мг/мл, близько 20 мг/мл, близько 25 мг/мл, близько 30 мг/мл, близько 35 мг/мл, близько 40 мг/мл, близько 45 мг/мл, близько 50 мг/мл, близько 55 мг/мл, близько 6О мг/мл, близько 65 мг/мл, близько 70 мг/мл, близько 75 мг/мл, близько 80 мг/мл, близько 85 мг/мл, близько 90 мг/мл, близько 100 мг/мл, близько 110 мг/мл, близько 120 мг/мл, близько 130 мг/мл, близько 140 мг/мл, близько 150 мг/мл, близько 160 мг/мл, близько 170 мг/мл, близько 180 мг/мл, близько 190 мг/мл, близько 200 мг/мл, близько 225 мг/мл, близько 250 мг/мл, близько 275 мг/мл, близько 300 мг/мл, близько 325 мг/мл, близько 350 мг/мл, близько 375 мг/мл, близько 400 мг/мл, близько 425 мг/мл, близько 450 мг/мл, близько 475 мг/мл, близько 500 мг/мл, близько 525 мг/мл, близько 550 мг/мл, близько 575 мг/мл або близько 600 мг/мл. У деяких ілюстративних варіантах здійснення рН складу може становити більше близько 5,0. В одному ілюстративному варіанті здійснення рН може становити більше близько 5,0, більше близько 5,5, більше близько 6,0, більше близько 6,5, більше близько 7,0, більше близько 7,5, більше близько 8,0 або більше близько 8,5.
Використовуваний у цьому документі термін «база даних» стосується біоінформатичного інструменту, який забезпечує можливість пошуку неінтерпретованих спектрів МО-МС за всіма можливими послідовностями в базі даних. Необмежувальними прикладами таких інструментів є
Мавзсої (мумли.тайіхвсіепсе.сот), Зресігшт МІ! (м/мли.спет.аднепі.сот), Ра (м/млу.маїегв.сот),
РЕАК5 (мумлу.Біоіптоптпаїісв5зо!шіопв.сот), Ргоїевіпріої (домпіоаа. арріїєдбіозувзієтв.сот//ргоїеіпрії!ої), Рпепух (мли. рпепух-тв5.сот), зогсегег (мли. задептезеагси.сот), ОМ55А (мим. рибспет. пебі.піт. піп. дом/отвза/), ХІТапает (милу Іедрт.ога/ТАМОЕМІ/), Ргоївїп Ргозресіог (ммли.ргозресіог.ис5т.еди/ргозресіог/тзпоте.піт),
Вуопіс (мили. ргоїеіптеїйгіс5.сопт/ргодисів/Буопіс) або Зеднезві (Пеїіаз.зсгірр5.еди/5едцеві).
Використовуваний у цьому документі термін «ультрафільтрація» або «ОР» може включати процес мембранної фільтрації, подібний до зворотного осмосу, з використанням гідростатичного тиску для проштовхування води крізь напівпроникну мембрану. Ультрафільтрація детально описана в Гео5 У. етап 4 Апагемж/ І. 7уапеу, Містоїійгайоп апа ийгайнганоп: ргіпсіріе5 апа арріїсайоп5 (1996), повний вміст якого включений у цей документ. Для ультрафільтрації можна застосовувати фільтри з розміром пор менше 0,1 мкм. При використанні фільтрів, які мають такий маленький розмір пор, обсяг зразка може бути зменшений за рахунок проникнення буфера зразка крізь фільтр, в той час як білки залишаються за фільтром.
У контексті цього документа «діафільтрація» або «ОР» може включати спосіб застосування ультрафільтрів для видалення та заміни солей, цукрів і неводних розчинників, для відокремлення вільних форм від зв'язаних, для видалення низькомолекулярного матеріалу та/або для забезпечення швидкої зміни іонних та/або рН середовищ. Найбільш ефективно розчинені мікрочастинки видаляються при додаванні розчинника до розчину, що піддається ультрафільтрації, зі швидкістю, приблизно рівною швидкості ультрафільтрації. Це забезпечує вимивання мікрочастинки із розчину в постійному обсязі. У певних ілюстративних варіантах здійснення цього винаходу стадію діафільтрації можна застосовувати для заміни різних буферів, що застосовуються спільно з цим винаходом, наприклад, перед хроматографією або іншими стадіями виробництва, а також для видалення домішок із препарату білка. Використовуваний у цьому документі термін «технологія подальших процесів» стосується однієї або більше технік, які застосовуються після технологій попередніх процесів для отримання білка. Технологія подальших процесів включає, наприклад, отримання білкового продукту з використанням, наприклад, афінної хроматографії, у тому числі афінної хроматографії з білком А, а також афінної хроматографії, в якій застосовують тверду фазу з точно визначеною молекулою, як-от МЕСЕ, яка може взаємодіяти з її спорідненою формою, як-от рецептор МЕСЕ (МЕСЕК), іонообмінної хроматографії, як-от аніоно- або катіонообмінна хроматографія, хроматографії з гідрофобною взаємодією або витіснювальної хроматографії.
Вираз «рекомбінантна клітина-господар» (або просто «клітина-господар») включає клітину, в яку був введений рекомбінантний вектор експресії, який кодує білок, що становить інтерес. Слід розуміти, що такий термін призначений для позначення не тільки конкретної клітини, що розглядається, але й потомства такої клітини. Оскільки певні модифікації можуть відбуватися в наступних поколіннях через мутації або впливи навколишнього середовища, таке потомство може фактично не бути ідентичним вихідній клітині, але все ж таки включено в обсяг терміну «клітина- господар», який використовується в цьому документі. В одному варіанті здійснення клітини- господарі включають прокаріотичні та еукаріотичні клітини, вибрані з будь-якого біологічного царства. В одному аспекті єукаріотичні клітини включають клітини найпростіших, грибів, рослин та тварин. У наступному аспекті клітини-господарі включають еукаріотичні клітини, як-от клітини рослин та/або тварин. Клітини можуть являти собою клітини ссавця, клітини риби, клітини комахи, клітини земноводного або клітини пернатого. У конкретному аспекті клітина-господар являє собою клітину ссавця. Широке розмаїття клітинних ліній ссавців, придатних для зростання в культурі, доступно в Американській колекції типових культур (Манассас, Вірджинія) та інших сховищах, і навіть у комерційних постачальників. Клітини, які можна застосовувати в процесах за цим винаходом, включають без обмеження клітини МК2.7, клітини РЕБ-Сб, клітини яєчника китайського хом'яка (СНО), як-от СНО-КІ (АТС ССІ -61), 0244 (СНавзіп еї а!., 1986, 5от. Сеї)
Моїес. Сепеї., 12:555-556; КоїКекКаг вї а!., 1997, Віоспетівігу, 36: 10901-10909; та УМО 01/92337 Аг), негативні за дигідрофолатредуктазою клітини СНТ (СНО/-ОНЕН, Опаць апа Снавзіп, 1980, Ргос.
Маї)!. Асад. 5сі. ОБА, 77:4216), та клітини др12.СНО (патент США Мо 5721121); клітини нирки мавпи (СМІ, АТОС СО -70); клітини СМ1 нирки мавпи, трансформовані 540 (клітини СО5, СО5-7, АТОС
СВІ -1651); клітини НЕК 293 та клітини 5р2/0, клітини гібридоми 51 8, клітини Вацаї, клітини ЕГА, клітини Нега, клітини НІ -60, клітини К5б62, клітини дигКаї, клітини ТНР-1, клітини 5р2/0, первинні епітеліальні клітини (наприклад, кератиноцити, клітини епітелію шийки матки, клітини бронхіального епітелію, клітини епітелію трахеї, клітини епітелію нирок та клітини епітелію сітківки) та стійкі клітинні лінії та їх штами (наприклад, ембріональні клітини нирок людини (наприклад, клітини 293 або клітини 293, субклоновані для росту в суспензійній культурі, Сгайат еї аї,, 1977, 9. Сеп. Мігої!., 36:59); клітини нирки новонародженого хом'яка (ВНК, АТСС СС -10); клітини Сертолі миші (ТМ4, Маїег, 1980, Вісі. Нергод., 23:243-251); клітини карциноми шийки матки людини (НЕГА, АТСС СС -2); клітини нирки собаки (МОСК, АТСС СС -34); клітини легені людини (М/138, АТОС СС -75); клітини гепатоми людини (НЕР-52, НВ 8065); клітини пухлини молочної залози миші (ММТ 060562, АТСС СС -51); клітини печінки щура лінії Вимаїо (ВК. ЗА,
АТОС СВІ -1442); клітини ТКІ (Маїпег, 1982, Аппаіє МУ Асадй. 5сі., 383:44-68); клітини МОСК 5; клітини Е54; клітини сітківки РЕК-Сб, клітини МОВК (МВІ-1), клітини 911, клітини СКЕК, клітини
МОСК, клітини Веумо, клітини Спапод, клітини Оеїгоїї 562, клітини НеГа 229, клітини Неї а 53, клітини Нер-2, клітини КВ, клітини І 5 180, клітини І 5 174Т, клітини МСІ-Н-548, клітини КЕРМІ 2650, клітини ЗМУ-13, клітини Т24, М/-28 МА13, клітини 2ЕА, клітини М/Н, клітини В5-С-Ї, клітини ГІ С-
МК», клітини Сіопе М-3, клітини 1-10, клітини КАС, клітини ТСМК-1, клітини У-1, клітини ІІ С-РК, клітини РК(15), клітини СНІ, клітини ОН», клітини 12, клітини Г/С-КСО 256, клітини МНІСі, клітини
ХО, клітини МООК, клітини У5УУ та клітини ТН-ЇІ, ВІ, або їхні похідні), клітини фібробластів із будь- якої тканини або органа (включаючи без обмеження серце, печінку, нирки, товсту кишку, кишківник, стравохід, шлунок, нервову тканину (головного, спинного мозку), легеню, судинну тканину (артерію, вену, капіляр), лімфоїдну тканину (лімфатичну залозу, аденоїд, мигдалину, кістковий мозок і кров), селезінку і фібробластні та фібробластоподібні клітинні лінії (наприклад, клітини ТКО-2, клітини ІМК-33, клітини ЮОоп, клітини СНК-21, клітини цитрулінемії, клітини
Оетргзхеу, клітини Оеїгоїї 551, клітини Оеїгоїй 510, клітини Оеїгоїї 525, клітини Оеїгої 529, клітини
Оеїгоїї 532, клітини Оеїгоїї 539, клітини Оеїгоїї 548, клітини Оеєїгоїї 573, клітини НЕЇ. 299, клітини
ІМА-90, клітини МКО-5, клітини УМІ-38, клітини УМІ-26, клітини МіСі:, клітини СМ-1, клітини СО5-1, клітини СО5-3, клітини СО5-7, клітини нирки африканської зеленої мартишки (МЕКО-76, АТОС
САІГ-1587; МЕНО, АТОС СС -81); клітини ОВ5-ЕтТІ -2, клітини ВАГ В/3Т3, клітини Е9, клітини 5М-
Т2, клітини М-М5М-ВАЇВ/3Т3, клітини К-ВАГВ, клітини ВІО-11, клітини МОК-10, клітини
СЗНЛОТІ/2, клітини НОМ :Сз, клітини КІ М205, клітини МеСоу, І -клітини миші, клітини штаму 2071 (І -клітини миші), клітини штаму І -М (І -клітини миші), клітини І -МТК (І -клітини миші), клони МСТО 2472 і 2555, клітини 5СС-РБАТ, клітини бм/із5/313, клітини індійського мунтжака, клітини 5ІКС, клітини Сії та клітини депзеп, або їхні похідні) або будь-який інший тип клітин, відомий фахівцю в цій області.
Використовуваний у цьому документі термін «білки клітини-господаря» (НСР) включає білок, утворений з клітини-господаря, і він може не мати відношення до необхідного білка, що становить інтерес. Білки клітини-господаря можуть являти собою виробничу домішку, яка може бути утворена в ході способу виробництва, і вона може включати три основні категорії: похідні клітинного субстрату, похідні клітинної культури і похідні подальшого процесу. Домішки, утворені з клітинного субстрату, включають, без обмеження, білки, отримані з організму-господаря, та нуклеїнову кислоту (геномну, векторну або загальну ДНК клітини-господаря). Домішки, отримані з клітинної культури, включають, без обмеження, індуктори, антибіотики, сироватку та інші компоненти середовища. Утворені в ході наступних стадій домішки включають, без обмеження, ферменти, хімічні та біохімічні реагенти для обробки (наприклад, бромистий ціаноген, гуанідин, окислювальні та відновлювальні засоби), неорганічні солі (наприклад, важких металів, миш'яку, іона неметалу), розчинники, носії, ліганди (наприклад, моноклональні антитіла) та інші продукти, що вилужуються.
У деяких ілюстративних варіантах здійснення білок клітини-господаря може мати рі в діапазоні від близько 4,5 до близько 9,0. В ілюстративному варіанті здійснення рі може становити близько 4,5, близько 5,0, близько 5,5, близько 5,6, близько 5,7, близько 5,8, близько 5,9, близько 6,0, близько 6,1, близько 6,2, близько 6,3, близько 6,4, близько 6,5, близько 6,6, близько 6,7, близько 6,8, близько 6,9, близько 7,0, близько 7,1, близько 7,2, близько 7,3, близько 7,4, близько 7,5, близько 7,6, близько 7,7, близько 7,8, близько 7,9, близько 8,0, близько 8,1, близько 8,2, близько 8,3, близько 8,4, близько 8,5, близько 8,6, близько 8,7, близько 8,8, близько 8,9 або близько 9,0.
Використовуваний у цьому документі термін «гідролізуючий засіб» стосується будь-якого одного або комбінації більшої кількості різних засобів, які можуть здійснювати розщеплення білка.
Необмежувальні приклади гідролізуючих засобів, які можуть здійснювати ферментативне розщеплення, включають протеазу з АзрегодіПиз зайої, еластазу, субтилізин, протеєазу ХІЇЇ, пепсин, трипсин, Тгур-М, хімотрипсин, аспергілопепсин І, протеазу ГузМ (І уз-М), ендопротеазу ГГ узсС (І увз-
С), ендопротеазу Авр-М (Авзр-М) С (Аг9-С), ендопротеазу СіІш-С (Сщюіи-С) або зовнішній білок мембран Т (ОтрТ), імуноглобулін-розщеплювальний фермент Зігеріососсиз руодепез (Ідеб), термолізин, папаїн, проназу, протєазу М8 або їхні біологічно активні фрагменти або гомологи, або їхні комбінації. Необмежувальні приклади гідролізуючих засобів, які можуть здійснювати неферментативне розщеплення, включають застосування високої температури, мікрохвильового випромінювання, ультразвуку, високого тиску, інфрачервоного випромінювання, розчинників (необмежувальними прикладами є етанол і ацетонітрил), розщеплення іммобілізованим ферментом(МЕК), ферментів із іммобілізованими магнітними частинками і вбудованих іммобілізованих ферментів. Недавній огляд, в якому обговорюються доступні способи розщеплення білка, див. в Зу/йлаг еї а!., «Ргоївіп Оідезіоп: Ап Омегу/ієм ої ШТе Амайаріє Тесппіднев апа Кесепі Оемеіортепів» (І іпда 5м/йлаг, Мапіп Сієга 8. Умінтівй М. А. Міеззеп, Ргоївіп Оідевійоп: Ап
Омегмієм ої Ше Амайаріе Тесппіднез апа Несепі ЮОемеІорітепів, 12 Чошгтпаї ої Ргоїеоте Незвеагсп 1067-1077 (2013), повний вміст яких включений у цей документ) Один або комбінація гідролізуючих засобів може розщеплювати пептидні зв'язки в білку або поліпептиді специфічним для послідовності чином, створюючи передбачувану колекцію більш коротких пептидів.
Відношення гідролізуючого засобу до білка і час, необхідний для розщеплення, можуть бути відповідним чином вибрані для отримання оптимального розщеплення білка. Якщо відношення ферменту до субстрату є неприйнятно високим, відповідна висока швидкість розщеплення не дає достатньо часу для аналізу пептидів за допомогою мас-спектрометра, і послідовність покриття буде порушена. З іншого боку, при низькому співвідношенні Е/5 буде потрібно тривале розщеплення й, отже, тривалий час збору даних. Співвідношення ферменту і субстрату може становити від близько 1:0,5 до близько 1:200. Використовуваний у цьому документі термін «розщеплення» стосується гідролізу одного або більше пептидних зв'язків білка. Існує кілька підходів до проведення розщеплення білка в біологічному зразку з використанням придатного гідролізуючого засобу, наприклад, ферментативне розщеплення або неферментативне розщеплення. Один із найпоширеніших способів розщеплення білків у зразку передбачає застосування протеази. Існує безліч протеаз, і кожна з них має свої особливості відносно специфічності, ефективності та оптимальних умов розщеплення. Протеази належать як до ендопептидаз, так і до екзопептидаз, які класифікуються на основі здатності протеази розщеплювати некінцеві або кінцеві амінокислоти в пептиді. В якості альтернативи, протеази також належать до шести різних класів - аспарагінова, глутамінова і металопротеаза, цистеїнова, серинова і треонінова протеази, які класифікуються на основі механізму каталізу. Терміни «протеаза» та «пептидаза» застосовуються взаємозамінно для позначення ферментів, які гідролізують пептидні зв'язки.
Термін «спільно з» вказує на те, що компоненти, композиція проти МЕСЕ за цим винаходом разом з іншим засобом, як-от антитіло до АМО2, можуть бути об'єднані в єдину композицію для одночасної доставки або можуть бути об'єднані окремо в дві або більше композицій (наприклад, набір, який включає кожний компонент). Компоненти, що вводяться спільно, можна вводити суб'єкту в інший час, ніж коли вводиться інший компонент; наприклад, кожне введення можна проводити не одночасно (наприклад, роздільно або послідовно) з інтервалами протягом зазначеного періоду. Окремі компоненти, що вводяться спільно, також можна вводити по суті одночасно (наприклад, точно в той самий час або через клінічно незначущий період) під час одного і того самого сеансу введення. Крім того, окремі компоненти, що вводяться спільно, можна вводити суб'єкту тим самим або іншим шляхом, наприклад, композиція афліберцепту разом з іншим засобом, як-от антитіло до АМО2, де композиція афліберцепту містить близько 1595 його варіантів або менше.
Використовуваний у цьому документі термін «рідинна хроматографія» стосується процесу, в якому біологічна/хімічна суміш, що переноситься рідиною, може бути розділена на компоненти в результаті диференціального розподілу компонентів, коли вони протікають крізь(або в) нерухому рідку або тверду фазу.
Необмежувальні приклади рідинної хроматографії включають обернено-фазову рідинну хроматографію, іонообмінну хроматографію, ексклюзійну хроматографію, афінну хроматографію, хроматографію зі змішаним режимом або гідрофобну хроматографію.
У контексті цього документу «афінна хроматографія» може включати розділення, що включають будь-який спосіб, за допомогою якого дві речовини розділяються на підставі їх афінності до хроматографічного матеріалу. Вона може включати піддавання речовин впливу колонки, яка містить придатне афінне хроматографічне середовище. Необмежувальні приклади такого хроматографічного середовища включають, без обмеження, смолу з білком А, смолу з білком С, афінні підкладки, що містять антиген, проти якого була вироблена зв'язувальна молекула (наприклад, антитіло), білок, здатний зв'язуватися з білком, що становить інтерес, та афінні підкладки, що містять Ес-зв'язувальний білок. В одному аспекті афінна колонка може бути врівноважена придатним буфером перед завантаженням зразка. Прикладом придатного буфера може бути буфер Ттіз/МасСіІ з рН від 7,0 до 8,0. Кваліфікований спеціаліст може розробити придатний буфер без надмірного навантаження. Після цього врівноваження зразок може бути завантажений у колонку. Після завантаження колонки її можна промити один або більше разів, з використанням, наприклад, врівноважувального буфера. Інші промивання, у тому числі промивання з використанням різних буферів, можна застосовувати перед елююванням колонки.
Потім афінну колонку можна елюювати з використанням придатного елююючого буфера.
Прикладом придатного елююючого буфера може бути буфер оцтова кислота/Масі, рН приблизно від 2,0 до 3,5. Знову, кваліфікований фахівець може розробити відповідний елююючий буфер без надмірного навантаження. Елюат можна контролювати з використанням способів, добре відомих фахівцям у цій галузі, включно з УФ. Наприклад, можна застосовувати поглинання при 280 нм, особливо якщо зразок, що становить інтерес, містить ароматичні кільця (наприклад, білки з ароматичними амінокислотами, такі як триптофан).
У контексті цього документу «іонообмінна хроматографія» може стосуватися розділень, включаючи будь-який спосіб, за допомогою якого дві речовини розділяються на підставі різниці їх відповідних іонних зарядів або на молекулі, що становить інтерес, та/або хроматографічному матеріалі в цілому, або локально в специфічних областях молекули, що становить інтерес, та/або хроматографічного матеріалу, і таким чином, можна застосовувати або катіонообмінний матеріал, або аніонообмінний матеріал. Іонообмінна хроматографія забезпечує розділення молекул на основі відмінностей між локальними зарядами молекул, що становлять інтерес, і локальними зарядами хроматографічного матеріалу. Упакована іонообмінна хроматографічна колонка або іонообмінний мембранний пристрій може працювати в режимі зв'язування-елюювання, режимі проточної фракції або гібридному режимі. Після промивання колонки або мембранного пристрою буфером для врівноваження або іншим буфером вилучення продукту може бути досягнуто за рахунок збільшення іонної сили (тобто, провідності) буфера для елюювання, щоб він міг конкурувати з розчиненою речовиною за заряджені ділянки іонообмінної матриці. Зміна рН й, отже, зміна заряду розчиненої речовини може являти собою інший спосіб досягнення елюювання розчиненої речовини. Зміна провідності або рН може бути поступовою (градієнтне елюювання) або ступінчастою (ступінчасте елюювання). Аніонні або катіонні замісники можуть бути приєднані до матриць у порядку отримання аніонних або катіонних підкладок для хроматографії.
Необмежувальні приклади аніонообмінних замісників включають діетиламіноетильну (ОЕАЕ), четвертинну аміноетильну групи (ОАЕ) та четвертинну аміногрупу (0). Катіонні замісники включають карбоксиметил (СМ), сульфоетил (5Е), сульфопропіл (5Р), фосфат (Р) та сульфонат (5). Целюлозні іонообмінні середовища або підкладка можуть включати ОЕ23"М, СЕЗ32"7М, ОЕ52 М,
СМ-237м, СМ-32"7М та СМ-52 М, доступні від М/пайтап Ца. Маїазіопе, Кепі, О.К. Також відомі зшиті та отримані на основі ЗЕРНАОЕХФ іонообмінні матеріали. Наприклад, ОЕАЕ-, ОАБ-, СМ- та ЗР- 5ЕРНАОЕХОФ та ОЕАБ-, О-, СМ- та 5--ЗЕРНАКОБЕФ та БЕРНАКОЗЕЄ Гаві Ріому, та Саріо "М 5, всі з яких доступні від СЕ Неаїїйсаге. Крім того, співполімер етиленгліколю та метакрилату, похідна як
СЕАЕ, так і СМ, яксот ТОХОРЕАКІ м ОЕАЕ-6505 або М та ТОУОРЕАКІ м СМ-6505 або М доступні від То5о Нааз Со., РпйШадеї!їрніа, Ра., або Миміа 5 та ОМОзЗрпПеге "м 5 від ВіоКай, Негси!ев,
Саїїї., ЕвптипоФ 5 від ЕМО Мійроге, МА.
Використовуваний у цьому документі термін «смола для хроматографії з гідрофобною взаємодією» може включати тверду фазу, яка може бути ковалентно модифікована фенілом, октилом, бутилом, тощо. У ній можуть застосовуватися властивості гідрофобності для відділення молекул одна від одної. У цьому типі хроматографії гідрофобні групи, як-от феніл, октил, гексил або бутил можуть утворювати стаціонарну фазу колонки. Молекули, як-от білки, пептиди тощо, проходять крізь колонку НІС (хроматографія з гідрофобною взаємодією), яка має одну або більше гідрофобних областей на своїй поверхні або має гідрофобні кишені та можуть взаємодіяти з гідрофобними групами, що складають стаціонарну фазу НІС. Приклади смол НІС або підкладки включають феніл-сефарозу ЕЕ, капто-феніл (СЕ НеайПсаге, Упсала, Швеція), феніл 650-М (Тозоп
Віозсієпсе, Токіо, Японія) та феніл Запобіпа (Запогіив Согрогайоп, Нью-Йорк, США).
Використовуваний у цьому документі термін «хроматографія зі змішаним режимом» або «багатомодальна хроматографія» (скорочення для обох «ММС») включає спосіб хроматографії, в якому розчинені речовини взаємодіють зі стаціонарною фазою за допомогою більше ніж одного режиму або механізму взаємодії. ММС можна застосовувати в якості альтернативного або комплементарного інструменту до традиційної обернено-фазової (КР), іонообмінної (ЕХ) і нормально-фазової хроматографії (МР). На відміну від хроматографії КР, МР та ІЕХ, у яких гідрофобна взаємодія, гідрофільна взаємодія та іонна взаємодія, відповідно, є домінуючим режимом взаємодії, в хроматографії зі змішаним режимом можна застосовувати комбінацію двох або більше таких режимів взаємодії. Середовище хроматографії зі змішаним режимом може забезпечувати унікальну селективність, яка не може бути відтворена за допомогою хроматографії з одним режимом. Хроматографія зі змішаним режимом також може забезпечувати потенційну економію витрат, більш тривалий термін служби колонки та гнучкість в експлуатації порівняно зі способами на основі афінності. У деяких ілюстративних варіантах здійснення середовище для хроматографії зі змішаним режимом може складатися з лігандів змішаного типу, зв'язаних з органічною або неорганічною підкладкою, що іноді позначається як основна матриця, безпосередньо або за допомогою спейсера. Підкладка може бути в формі частинок, як-от по суті сферичні частинки, моноліт, фільтр, мембрана, поверхня, капіляри, тощо. В деяких ілюстративних варіантах здійснення підкладка може бути отримана з природного полімеру, як-от зшитий вуглеводний матеріал, такий як агароза, адРМУ, целюлоза, декстран, хітозан, конжак, карагінан, гелан, альгінат, тощо. Для отримання високої адсорбційної здатності підкладка може бути пористою, і ліганди потім приєднуються до зовнішніх поверхонь, а також до поверхонь пор. Такі підкладки з вихідного полімеру можуть бути отримані згідно зі стандартними способами, як-от зворотне гелеутворення суспензії (5 Ніепеп: Віоспіт Віорпуз Асіа 79(2), 393-398 (1964), повний вміст якого включений у цей документ). В якості альтернативи, підкладка може бути отримана з синтетичного полімеру, як-от зшиті синтетичні полімери, наприклад, стирол або похідні стиролу, дивінілбензен, акриламіди, естери акрилату, естери метакрилату, вінілові естери, вініламіди, тощо. Такі синтетичні полімери можна отримувати за допомогою стандартних способів, наприклад, «5іугепе разей роїутег зиррогпіз демеІорей ру зизрепзіоп роЇутегігайоп» (К АгзНаду:
СНітіса е І"пайвіга 70(9), 70-75 (1988), повний вміст якої включений у цей документ). Пористі підкладки з природного або синтетичного полімеру також доступні з комерційних джерел, як-от СЕ
Неайсаге, Упсала, Швеція.
Використовуваний у цьому документі термін «мас-спектрометр» включає пристрій, здатний ідентифікувати конкретні види молекул і точне вимірювання їх мас. Мається на увазі, що термін містить будь-який молекулярний детектор, за допомогою якого можна охарактеризувати поліпептид або пептид. Мас-спектрометр може включати три основні частини: джерело іонів, мас- аналізатор та детектор. Роль джерела іонів полягає в утворенні іонів газової фази. Атоми, молекули або кластери речовини, що визначається, можуть переноситися в газову фазу та іонізовані одночасно (як іонізації електророзпиленням) або за допомогою окремих способів. Вибір джерела іонів залежить від використання. У деяких ілюстративних варіантах здійснення мас- спектрометр може являти собою тандемний мас-спектрометр. Використовуваний у цьому документі термін «тандемна мас-спектрометрія» включає методику, в якій структурну інформацію про молекули зразка отримують за допомогою застосування декількох етапів масового відбору та розділення ізотопів. Обов'язковою умовою є перетворення молекул зразка на газову фазу та іонізацію таким чином, щоб фрагменти формувалися у передбачуваний та керований спосіб після першої стадії масового відбору. Багатостадійну МС/МС, або МС", можна здійснювати за допомогою першого вибору та виділення іона прекурсора (МО), його фрагментації, виділення первинного фрагментного іона (МОЗ), його фрагментації, виділення вторинного фрагмента (МС), і так доти, доки можна буде отримати значущу інформацію, або сигнал фрагментного іона піддається виявленню. Тандемну МС успішно здійснювали з широкою різноманітністю комбінацій аналізатора. Вибір аналізатора для конкретного застосування може визначатися безліччю різних факторів, як-от чутливість, селективність та швидкість, а також розмір, вартість та доступність. Дві основні категорії способів тандемної М5 являють собою тандемну в просторі й тандемну в часі, але є також гібриди, де тандемні в часі аналізатори з'єднані в просторі або з тандемними в просторі аналізаторами. Тандемний в просторі мас-спектрометр включає джерело іонів, пристрій активації іонів-прекурсорів і щонайменше два не захоплювальних мас-аналізатора. Конкретні функції розділення маси/заряду можуть бути спроектовані таким чином, щоб в одній секції приладу іони вибиралися, дисоціювали в проміжній області, а іони продукту потім передавалися в інший аналізатор для розділення маси/заряду та збору даних. У тандемному в часі мас- спектрометрі іони, які утворюються в іонному джерелі, можуть бути захоплені, виділені, фрагментовані та розділені за масою/зарядом у тому самому фізичному пристрої. Виявлені мас- спектрометром пептиди можуть застосовуватися в якості сурогатних представників інтактного білка та їхніх посттрансляційних модифікацій. Їх можна використовувати для характеристики білків за допомогою зіставлення експериментальних і теоретичних даних М5/М5, останні генеруються з потенційних пептидів у базі даних послідовностей білків. Характеристика включає, без обмеження, секвенування амінокислот фрагментів білка, визначення секвенування білка, визначення секвенування білка де помо, визначення місця розташування посттрансляційних модифікацій або визначення посттрансляційних модифікацій, або аналіз сумісності, або їхні комбінації.
У контексті цього документа «Міпі-Тгар» або «МіпіТгар» або «МіпіТгар-зв'язувальна молекула» здатний зв'язуватися з молекулою МЕС. Такі МіпіТгар можуть включати (ї) химерні поліпептиди, а також (ії) мультимерні (наприклад, димерні) молекули, що містять два або більше поліпептидів, які зв'язуються нековалентно, наприклад, за допомогою одного або більше дисульфідних місточків.
МіпіТгар можуть бути отримані за допомогою хімічної модифікації, рерментативної активності або рекомбінантно.
У контексті цього документа «МЕСЕ МіпіТгар» або «зв'язувальна МЕСЕ МіпіТгар молекула» може являти собою молекулу або комплекс молекул, які зв'язуються з МЕСЕ і має один або більше наборів Ід-подібних доменів рецептора МЕСЕ (або їхніх варіантів) (наприклад, Ід-домен 2
МЕСННКІ та/або Ід-домен З та/або 4 МЕСЕК2) і модифікований або відсутній мультимеризуючий компонент (МС), наприклад, в якому МС являє собою модифікований імуноглобулін Ес.
Модифікація може бути результатом протеолітичного розщеплення пастки МЕСЕ (наприклад, афліберцепту або конберцепту) або прямої експресії поліпептидних ланцюгів, що утворюються, з укороченою послідовністю МС. (див. молекулярну структуру, зображену на фіг. 1.) Фіг. 1 являє собою зображення молекули МЕСЕ МіпіТгар, яка є продуктом протеолізу афліберцепту з Іде5 зігеріососсиз руодепе5. Зображена гомодимерна молекула, яка має Ід-фрагмент шарнірного домену, з'єднаний двома паралельними дисульфідними зв'язками. Указані домен МЕСЕК'І, домен
МЕСЕМК2 та фрагмент шарнірного домену (МС). Точка в афліберцепті, де відбувається розщеплення Ідез, позначена знаком «//». Відщеплений від афліберцепту фрагмент Ес також позначений. Один такий химерний поліпептид, який не димеризується, також може являти собою
МЕСЕ МіпіТгар, якщо він має активність зв'язування МЕСЕ. Термін «МЕСЕ МіпіТтар» включає один поліпептид, що містить перший набір одного або більше Ід-доменів рецептора МЕСЕ (або його варіантів), без МС, але злитий з лінкером (наприклад, лінкером пептиду) з одним або більше додатковими наборами з одного або більше Ід-доменів МЕСЕ рецептора (або його варіантів).
Зв'язувальні МЕСЕ домени в МЕСЕ МіпіТтар за цим винаходом можуть бути ідентичними або відрізнятися від інших (див. ММО2005/00895, повний вміст якої включений у цей документ).
Наприклад, у варіанті здійснення цього винаходу немодифікований Ес домен імуноглобуліну містить амінокислотну послідовність або її амінокислоти 1--226:
ОКТНТОРХІСРАРЕЇ І СОРБУБ ЕРРКРКОТІ МІЗВТРЕУТСУУМОУЗНЕОРЕУКЕМИ УМО, МЕУН
МАКТКРАЕЕ
ОММеТУвУМ5МІ ТМ Н
ОМ МЕОКЕУКСКУЗМКАЇ РАРІЕКТІЗКАКСООРАЕРОМУМТІ РРОВОЕЇ ТКМОУБІ ТС УКаЕМРБОЇ
АМЕМІ
ЕЗМСОРЕММУКХ»ТРРМІ 05
БОБЕР УЗКІ ТМОКЗКУМООСММЕЗСЗУМНЕАІЇ НМНУТОК5І 5І РОК (ЗЕО ІО МО: 33; де Хі являє собою І або Р, а Хо являє собою А або Т).
Інгібування МЕСЕ включає, наприклад, антагонізм МЕСЕ, МЕСЕ, що зв'язується з рецептором, наприклад, за допомогою конкуренції з рецептором МЕСЕ за зв'язування з МЕСЕ (наприклад,
МЕС о, МЕСЕі2гі та/(або МЕСЕ:165). Таке інгібування може призвести до інгібування МЕСЕ- опосередкованої активації МЕСЕК, наприклад, інгібування експресії люциферази клітинної лінії (наприклад, НЕК293), МЕСЕ, що експресує химерний рецептор, (наприклад, його гомодимер), який має позаклітинні домени МЕСЕК, злиті з внутрішньоклітинними доменами ІІ 18Ко; та/або
ІШ18АД вна поверхні клітини, а також має репортерний ген МЕКВ-люцифераза-ІВЕ5-есвР, наприклад, клітинна лінія НЕК293/09/Е-І-18Но/Р І-ІІ 188р, як викладено у цьому документі.
Компоненти Ід-домену рецептора МЕСЕ із МЕСЕ МіпіТгар за цим винаходом можуть включати () один або більше імуноглобулін-подібних (Ід) доменів 2 МЕСЕК'І (РН) (К102), (ї) один або більше Ід-доменів З МЕСЕКЗ (РІК1 або КОК) (РІК1О3) (К203), (її) один або більше Ід-доменів 4 МЕСЕКЗ2 (РІК! або КОК) (РІК104) (К204) та/або (м) один або більше Ід-доменів З МЕСЕКЗ (ЕК) (ЕШОЗ або КЗ303).
Імуноглобулін-подібні домени рецепторів МЕСЕ можуть називатися в цьому документі доменами МЕСЕК Ід. Ід-домени МЕСЕК, згадані в цьому документі, наприклад, К102 (які можуть називатися в цьому документі МЕСЕКІТ(аг2)), К203 (які можуть називатися в цьому документі
МЕСЕКЗ(аз)), К204 (які можуть називатися в цьому документі МЕСЕКЗ(а4)) і КЗ3О3 (які можуть називатися в цьому документі МЕСЕКЗ(аз)) призначені для охоплення не тільки повного домену Ід дикого типу, але також його варіантів, які по суті зберігають функціональні характеристики домену дикого типу, наприклад, зберігають здатність утворювати домен функціонує зв'язування МЕСЕ при включенні до МЕСЕ МіпіТгар. Фахівцеві в цій галузі буде очевидно, що можуть бути отримані численні варіанти вищевказаних Ід-доменів, які зберігають по суті ті самі функціональні характеристики, що й домен дикого типу.
У цьому винаході представлений поліпептид МЕСЕ МіпіТтар, що містить таку структуру домену: - (8102)-(8203))а-лінкер-«Н1О02)-(8203) )ь; - (8102)-(8203)-(8204))с-лінкер-(А102)-(8203)-(Н204)) а; - (8102)-(8203))е-(МеО)о;
- (8102)-(8203)-(8204))-(МО)»о; де - К102 являє собою Ід-домен 2 (02) рецептора МЕСЕ 1 (МЕСЕКІ); - К2О3 являє собою Ід-домен З МЕСЕК2; - К2р4 являє собою Ід-домен 4 МЕСЕК2; - МС являє собою мультимеризуючий компонент (наприклад, шарнірний домен дО або його фрагмент, наприклад, ІдсС1); - лінкер являє собою пептид, що містить близько 5, 6, 7, 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 або 16 амінокислот, наприклад, (5(05055)5 (5ЕО ІЮО МО.: 104);
І, незалежно, а-1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15; р-1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15; с-1,2,3,4,5,6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15; а-1,2,3,4,5,6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15; е-1,2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15;
Т-1,2,3,4,5,6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15; і 9-1,2,3,4,5,6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15.
В одному варіанті здійснення цього винаходу К102 містить амінокислотну послідовність:
ЗОТОаАРЕМЕМУ5ЕЇІРЕПНМТЕСВАЕЇ МІРСВУТЗРМІТМТІ ККЕРІ ОТП РОСКАПМОЗАКОИРИЗМАТУКЕЇ аг
ТСЕАТУМОНІ ХКТМУІТНКОТМТИО (5ЕО ІЮО МО: 34). В одному аспекті К1І02 не містить М- кінцевий ОТ.
В одному варіанті здійснення цього винаходу К102 містить амінокислотну послідовність:
РЕМЕМУ5ЕЇІРЕПНМТЕСЕЕЇ МІРСАУТЗРМІТМТІ ККЕРГОТ ТРОСКАПУМОЗАКОРІЗМАТУКЕ ІСІ І ТО
ЕАТУ
Ман УкКтТМм І ТНАОТ (5ЕО ІО МО: 35).
В одному варіанті здійснення цього винаходу К2ОЗ містить амінокислотну послідовність:
МУМІ ЗРЗНОЇІЕЇ 5МОЕКІ М МСТАВТЕ ММОа у СЕМ ЕМ РОБКНОНККІ УМАОІ КТОБОЗЕМККРЕЇ 5ТІ ТІ аУТА зрОСІУТСААББаІЇ МТКкКМ5Т
ЕМАУНЕК (5ЕО ІО МО: 36).
В одному варіанті здійснення цього винаходу К204 містить амінокислотну послідовність:
РЕМАРОЗОМЕБІ МЕАТУСЕВУВІРАКМІ аМмРРРЕЇКУУКМаїП РІ ЕЗМНТІКАСНУМ ТІМЕУЗЕНОТОа МУ
МІ Т
МРІЗКЕКОЗНУМУ5І УММУРРОРО (5ЕО ІО МО: 37).
В одному варіанті здійснення цього винаходу К204 містить амінокислотну послідовність:
ЕМАРОБОМЕ5БІ МЕАТУСЕВУВІРАКМІ СМРРРЕЇКМ/УКМОІРІ ЕЗМНТІКАСНМІ ТІМЕМУ5ЕНО Та МУ ТМІ
ІТ
МРІКЗЕКОЗНУМУ5І МУМУР (5ЕО ІО МО: 38).
В одному варіанті здійснення цього винаходу мультимеризуючий компонент (МС) для застосування МЕСЕ МіпіТгар являє собою пептид, наприклад, модифікований Ес імуноглобулін (наприклад, із ЇДС1), який здатний зв'язуватися з іншим мультимеризуючим компонентом. В одному аспекті МС являє собою модифікований Ес імуноглобулін, який включає шарнірну область імуноглобуліну. Наприклад, в одному варіанті здійснення цього винаходу МС являє собою пептид, який містить один або більше (наприклад, 1, 2, 3, 4, 5 або 6) цистеїнів, які здатні утворювати один або більше цистеїнових місточків із цистетнами в іншому МС, наприклад, ОКТНТСРРС (5ЕО ІЮ
МО: 39), ОКТНТСРРСОРРО (5ЕБО 10 МО: 40) ОКТНТСРРСОРРСРРО (5БО 10 МО: 41),
ОКТНТС(РРС)н, де М являє собою 1, 2, 3, 4 або 5 (ЗЕО ІЮ МО: 105), ОКТНТСРРСРАРЕЇГ І о (5ЕО
ІЮ0 МО: 60), ОКТНТСРІСРАРЕЇ ІС (5БО ІЮО МО: 43), ОКТНТС (ЗЕБЕО ІО МО: 44) або
ОКТНТОСРІ СРАР (5ЕО ІО МО: 45).
У цьому винаході також представлений поліпептид МЕСЕ МіпіТгар, який має таку структуру домену: () (В8102)4-(8203)5-(Ме)с; або (і) (Я102)4-(Н203)-(Н204)с-(МО а;
який може бути гомодимеризований з другим із зазначених поліпептидів, наприклад, за допомогою зв'язування між МС кожного поліпептиду, де () зазначені домени К102 узгоджуються; (ї) зазначені домени К2О3 узгоджуються; та/або (ії) зазначені домени К204 узгоджуються, з утворенням димерного МЕСЕ-зв'язувального домену.
В одному варіанті здійснення цього винаходу поліпептид МЕСЕ МіпіТтар містить таку амінокислотну послідовність:
ЗОТОаВАРЕМЕМУ5ЕЇІРЕПНМТЕСВАЕЇ МІРСВУТ5РМзвІ ТМТІ ККЕР ОТЛРОСКАПУОЗАКОИ РОМ евАТУ
КЕ.
ГТСЕАТУМОНІ МКТММІ ТНАЕОТМТІПОМУМІ 5РЗНОЇЕЇ 5МОЕКІ МІ Міга3СТАВТЕЇ ММО 10 ЕМУМЕМРОБ кнОНн
КК УМАОІ КТОЗОЗЕМККРЕЇ ТІ ТІраУТАЗОО
СІ МТСААББИЇ МТККМІ965ТЕМАУНЕКОКІНТІСРРОРАРЕЇЇ С: (5ЕБЕО 10 МО: 46; Мо підкреслений);
САРЕМЕМУ5ЗЕЇІРЕПНМТЕСВЕЇ МІРСАУТЗРМІТМТІ ККЕРГОТРОСКАПУОЗАКаРІЗМАТУКЕІСИ
ТОСЕА тУмані мкм ТНнеОтТМТПОУМІ 5РЗНОИЇЕЇ 5МОЕКІ МІ МСТАВТЕЇ ММа ТОМУ ЕМРЗЗКНОНКК
ГУМАО
ІгКкТОо5азЕМККРЇІ ТІ ТрИамтАБроаі МмТСАА5БаЇ МІ'ККМЗТЕМАУНЕМІ БМАРОЗОМЕ5І МЕА тУав
ВУВІРАКМІ аХРРРЕЇКУ/УКМОІ РІ ЕЗМНТІКАС,НМІ ТІМЕУЗЕВНОТОа
МУТМІ-ТМРІЗКЕКОЗНУУ5І МУМУРРОРООКІНТСРІСРАРЕ І СС (5БО 10 МО: 47; Мо підкреслений);
ЗОТОаВАРЕМЕМУ5ЕЇІРЕПНМТЕСВАЕЇ МІРСВУТ5РМзвІ ТМТІ ККЕР ОТ ТРєРОСКАПУОЗАКавІ5М.евАТУ
КЕ
ГГ ТСЕАТУМОНІ УКТММІ ТНеЕОТМТПОМУМІ 5РОНИТЕЇ 5МОЕКІ МІ Мі2СТАВТЕЇ ММИаїОєМУЕМРБ оКкНО
НККІ ММАОІ КТОБОЗЕМККРНЇ ТІ ТІраУТАБО
ОСІ УТСААББЗОЇ МТККМІ965 ТТ ЕМАУМНЕКОКТНІСРРО (5ЕБО ІО МО: 48; МС підкреслений);
ЗОТОаВАРЕМЕМУ5ЕЇІРЕПНМТЕСВАЕЇ МІРСВУТ5РМзвІ ТМТІ ККЕР ОТ РєРОСКАПУОЗАКаТРІЗМ.евАТУ
КЕЇ
С ГСТоЕАТУМСОаНІ УКТММІ ТНеОТМТІОМУМІ 5РЗНИТЕЇ 5МОЕКІ МІ МігСТАВТЕЇ ММОИОЕМУУ ЕМ Р
З
КНОНККІ УМАОІ КТОБОЗЕМККРЕЇ ЗТ ТІрамтАро
СІ МТСААББЗаИЇ МТККМ:1965ГТЕМАУНЕКОКТНІСРРОРРО (ЗЕО ІО МО: 49; МС підкреслений);
ЗОТОаВАРЕМЕМУ5ЕЇІРЕПНМТЕСВАЕЇ МІРСВУТ5РМзвІ ТМТІ ККЕР ОТ ЛРОСКАПУОЗАКаТРІЗМ.евАТУ
КЕЇ
С ГСТоЕАТУМСОаНІ УКТММІ ТНеОТМТІОМУМІ 5РЗНИТЕЇ 5МОЕКІ МІ МігСТАВТЕЇ ММОИОЕМУУ ЕМ Р
З
КНОНККІ УМАОІ КТОЗОЗЕМККРЕЇ ЗТ ТІраУТАБрОСІ УТСААЗЗаЇ МТККМ 196571 -:ЕМАУНЕКОК тн
СРРОРРОРРСОС (ЗЕО ІО МО: 50; Мо підкреслений); або
ЗОТОаАРЕМЕМУ5ЕЇІРЕПНМТЕСАРЕЇ МІРСВУТ5РМІТМТІ ККЕРІ ОТП РОСКА ПМ ОЗАКОРИЗМАТУКЕЇ аг
ТСЕАТУМОНІ МКТММІ ТНАЕОТМТІПОМУМІ 5РЗНОЇЕЇ 5МОЕКІ МІ МСТАВТЕЇ ММИа | ЕМУЕМРЗЗКН
ОнКк
КСММАОІ КТОБавзЕМККРІ ЗТ ТІрИаМТАБрОСІ МТ СААЗЗОІ МТ ККМЗТЕМАМНЕКОКТНТО- (РРС)Хх (МС підкреслений; де х становить 1, 2, 3, 4 або 5 (ЗЕБЕО ІЮО МО: 106). Як вже обговорювалося, такі поліпептиди можуть бути мультимеризовані (наприклад, димеризовані (наприклад, гомодимеризовані)), причому зв'язування між поліпептидами опосередковане мультимеризуючими компонентами.
В одному варіанті здійснення цього винаходу Ід-подібний домен 2 МЕСЕКІ мономерних МЕСЕ
Міпіттар за цим винаходом мають М-зв'язане глікозилювання М3б та/або Мб8; та/або внутрішньоланцюговий дисульфідний місточок між С30О та С79; та/або Ід-подібний домен З
МЕСЕК2 мономерних МЕСЕ МіпіТгтар за цим винаходом мають М-зв'язане глікозилювання М123 та/або М196; та/або внутрішньоланцюговий дисульфідний місточок між С124 та С185.
В одному варіанті здійснення цього винаходу МЕСЕ МіпіТгар містить таку структуру: - (ВТ102):-(8203)1-(С45)3-(8102)1-(8203)1 ((045)з" розкрита як ЗЕО ІО МО: 107); - (ВТ1О2):-(8203)1-(Сс45)6-(8102)1-(8203)1 ((045)6" розкрита як ЗЕО ІО МО: 108); - (ВЯТО2):-(Н203)1-(с45)5-(8102)1-(8203)1 ((025)5" розкрита як БЕО ІО МО: 109); або - (ВТО2)1-(8203)1-(С445)12-(А102)1-(8203)1 ((б45)12" розкрита як ЗЕО ІО МО: 110). са5 являє собою -С1у-сту-сту-сту-зег (БЕО 10 МО: 111)
В одному варіанті здійснення цього винаходу МЕСЕ МіпіТгтар містить таку амінокислотну послідовність: ()
ЗОТОаВАРЕМЕМУ5ЕЇІРЕПНМТЕСВАЕЇ МІРСВУТЗРМІТМТІ ККЕРІ ОТП РОСКАПМОЗАКОИРИЗМАТУ
КЕІСІІ ТСЕАТ
Умані мктМмМІ| ТнеОтТМТПОУМІ 5РЗНОЇЕЇ 5МОЕКІ М МСТАВТЕЇ ММИа | ЕМУЕМРЗЗКНОНККІ.
УМАВІ КТО5О
ЗЕМККРІ ЗТ ТІраУтТАЗрОІ МТСААЗБЗОІЇ МІККМОТЕМАУНЕКСССОСЗСВССОоЗОССВСОССССО заасаБаса азо5ОТавРЕМЕМУ5ЗЕЇІРЕПІНМТЕСВАЕЇ МІРСВУТЗРМІТМТІ ККЕРІ ОТП РОСКАПУ/ОЗАКОРІИЗМА
ТУКЕІСІ ГТСЕА тУмані мкм ТнеОтТМТОУМІ 5РЗНОИЇЕЇ 5МОЕКІ МІ МСТАВТЕЇ ММа | ЕМУЕМРЗЗКНОНКК
ГУМА КТО5
ОСЗЕМККРЇІ 5ТІ ТІЮСУТКЗрОСІ УТСААЗЗСІЇ МІККМЗТЕМАКМНЕК (5ЕБЕО ІО МО: 51; лінкер підкреслений); (ії)
ЗОТОаВАРЕМЕМУ5ЕЇІРЕПНМТЕСВАЕЇ МІРСВУТЗРМІТМТІ ККЕРІ ОТП РОСКАПМОЗАКОИРИЗМАТУ
КЕІСІГГ ТСЕАТУМСОНІ УКТ
ММ ТНеЕОТМТІОМУМІ 5РЗНОЇЕЇ 5МОЕКІ МІ МСТАВТЕЇ ММС 1ОЕМУЕМ РОЗКНОНККІ УМА ПІ КТО 5а5ЕМККРЇ ТІ ТІСТА зроОоаІіУТСААЗБЗаІМТккКМЗТЕУВУнНЕКОССавсазСОСООосЗС,а,а5ООТавВРЕМЕМУ5ЕЇІРЕННМТЕ
СВАЕЇ МІРСВУТ5РМІТМТІ.
ККЕРГОТТРОСКАПУМОЗАКОРІЗМАТУКЕЇСТ ГП ТСЕАТтУМСОНІ МКТММІ ТНАОТМТІПОМУМІ 5РЗНОИЇ
ЕГЗМОЕКІ МІ МСТАВТЕЇ М
МОаІ!рЕМУЕМРОБКНОНККІ ММАОІ КТОБаЗЕМККРЇІ ТІ ТІрОаУТАБРОСІ МТ СААЗЗаОІ МТККМ5
ТЕМАМНЕК (5ЕО ІО МО: 52; лінкер підкреслений); (ім)
ЗОТОаВАРЕМЕМУ5ЕЇІРЕПНМТЕСВАЕЇ МІРСВУТЗРМІТМТІ ККЕРІ ОТП РОСКАПМОЗАКОИРИЗМАТУ
КЕІСІПГТОСЕА тУмані мкм ТНнеОтТМТПОУМІ 5РЗНОИЇЕЇ 5МОЕКІ МІ МСТАВТЕЇ ММа ТОМУ ЕМРЗЗКНОНКК
ГУМА КТО5 аз ЕМККРЕІ ТІ ТІраУтТАЗрОСІМТСААЗЗаІ МТІККМОТЕУВУнЕКСЇВсС,азСОСсСОоосОСИВОСІО сзьасцдавоса созасасзасосазасаєеоОогаВвВРЕМЕМУЗЕЇІРЕННМТЕСАЕЇ МІРСВУТ5РМІТМТІ ККЕРІ 0
ТИПРОСКАПМУ
ОБАКОРІЗМАТУКЕІЇСІ І ТСЕАТУМОНІ УК ТНАОТМТПОМУМІ 5РОНИЇПЕЇ 5МОЕКІ МІ МСТАВТ
ЕСММСИатрЕМУУЕ
УРББКНОНККІ УМАОЇ КТОБОаЗЕМККРЕЇ ТІ ТІраУТАЗрОСІ УТСААЗЗОЇ МТККМЗТЕУАУНЕК (ЗЕО ІО МО: 53; лінкер підкреслений) (ху)
ЗОТОаВАРЕМЕМУ5ЕЇІРЕПНМТЕСВАЕЇ МІРСВУТЗРМІТМТІ ККЕРІ ОТП РОСКАПМОЗАКОИРИЗМАТУ
КЕІСІГ ТСЕАТУМОа
НгЕУКТММІ ТНВОТМТПОМУМІ 5РОНИЇЕЇ 5МОЕКІ М МСТАВТЕЇ ММа т ОЕМ! ЕМРОЗКНОНККІ УМА ріктТОоБазЕМККРЇ. зп тлреМтАЗрОСІ УТСАА5Заї МТККМЗТЕУАУнЕКОСОСОсСосССВОЗСОСЯСБОСССОоБОСССЗ сассзасавазас ссозсссазассаосзсасазасацевогОавАРЕМЕМУ5ЕЇІРЕПНМТЕСВЕЕЇ МІРСАУТЗРМІТМТІ КК
ЕРГОТИРОСКАПМ
ОБАКОРІЗМАТУКЕІЇСІ І ТСЕАТУМОНІ УК ТНАОТМТПОМУМІ 5РОНИЇПЕЇ 5МОЕКІ МІ МСТАВТ
ЕСМУМСОИ!рЕМУУЕМРБЗБ
КНОНККІ УМАОІ КТОЗОЗЕМККЕРЕЇ ЗТ ТІраУТАБрОСІ УТСААЗЗаї МТККМЗТЕУАВУНЕК (5ЕО
ІО МО: 54; лінкер підкреслений); або (мі)
ЗОТОаВАРЕМЕМУ5ЕЇІРЕПНМТЕСВАЕЇ МІРСВУТЗРМІТМТІ ККЕРІ ОТП РОСКАПМОЗАКОИРИЗМАТУ
КЕІСІ І ТСЕАТ
Умані мктМмМІ| ТнеОтТМТПОУМІ 5РЗНОЇЕЇ 5МОЕКІ М МСТАВТЕЇ ММИа | ЕМУЕМРЗЗКНОНККІ.
УМАВІ КТО5О
ЗЕМККРІ ЗТ ТІрОУТАБрОІ МТСААББЗаЇ МІ'ККМЗТЕМАУМНЕК--бИиИс5)Х-
ЗОТОаАРЕМЕМУ5ЕЇІРЕПНМТЕСВАЕЇ МІРСВУТЗРМІТМТІ ККЕРІ ОТП РОСКАПМОЗАКОИРИЗМАТУКЕЇ
СІ ГТСЕАТУМО
НгЕУКТММІ ТНВОТМТПОМУМІ 5РОНИЇЕЇ 5МОЕКІ М МСТАВТЕЇ ММа т ОЕМ! ЕМРОЗКНОНККІ УМА ріктТОоБазЕМК
КА ЗТ ТІВСУТАБЗРОСІ УТСААББЗОЇ МТККМЗТЕУВУНЕК (5ЕО ІЮ МО: 112) (де х становить 1, 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 15). Як обговорюється в цьому документі, ці поліпептиди можуть містити вторинну структуру, в якій подібні домени Яд МЕСЕК зв'язані з утворенням внутрішньоланцюгового МЕСЕ-зв'язувального домену (наприклад, фіг. 2). В одному варіанті здійснення цього винаходу два або більше таких поліпептидів мультимеризуються (наприклад, димеризуються (наприклад, гомодимеризуються)), причому Ід- домени МЕСЕК кожного ланцюга зв'язуються з подібними Ід-доменами іншого ланцюга з утворенням міжланцюгового МЕСЕ-зв'язувального домену.
У певних варіантах здійснення цього винаходу МЕСЕ МіпіТгтар за цим винаходом не містить будь-якої значної модифікації амінокислотних залишків поліпептиду МЕСЕ МіпіТгар (наприклад, спрямована хімічна модифікація, як-от пегілювання або йодацетамідування, наприклад, на М- та/або С-кінці).
В одному варіанті здійснення цього винаходу поліпептид містить вторинну структуру, в якій Ід- домени МЕСЕК в одному химерному поліпептиді (наприклад, (К102)а-(Н203)Б-лінкер-(А102) с- (8203)4; або (К102)4-(8203)5-(Н204)с-лінкер-(8102)а-(Н203)2-(8204)) або в окремих химерних поліпептидах (наприклад, гомодимерах) координують з утворенням МЕСЕ-зв'язувального домену.
Наприклад, у якому () зазначені домени К102 узгоджуються; (ї) зазначені домени К2О3 узгоджуються; та/або (ії) зазначені домени К204 узгоджуються, з утворенням МЕСЕ-зв'язувального домену. На фіг. 2 являє собою опис одноланцюгового
МЕСЕ МіпіТгар, який зображує таке узгодження домену. МЕСЕКІ, МЕСЕК2 та лінкерні домени вказані. Показаний лінкер являє собою (б45)6 (ЗЕБЕО ІО МО: 108). Цей винахід включає одноланцюгові МЕСЕ МіпіТгар з лінкером (б45)з (ЗЕО ІЮО МО: 107); (Са5)а (ЗЕО ІО МО: 109) або (С4а5)12 (ЗЕО ІО МО: 110).
Крім того, в цьому винаході також представлений комплекс, що містить МЕСЕ МіпіТгар, як обговорюється в цьому документі, зв'язаний в комплекс із поліпептидом МЕСЕ або його фрагментом чи злиттям. В одному варіанті здійснення цього винаходу МЕСЕ (наприклад, МЕСЕ 65) гомодимеризований та/або МЕСЕ МіпіТгар гомодимеризований у комплекс 2:2 (2 МЕСЕ:2 МіпіТгар) тал?або МЕСЕ Міпіттар, гомодимеризований у комплекс 1:1. Комплекси можуть включати гомодимеризовані молекули МЕСЕ, зв'язані з гомодимеризованими поліпептидами МЕСЕ
МіпіТттар. В одному варіанті здійснення цього винаходу комплекс представлений іп мйго (наприклад, іммобілізований на твердій підкладці) або перебуває в організмі суб'єкта. Цей винахід також включає композицію комплексів димеру МЕСЕ (наприклад, МЕСЕ (в5), зв'язаного у комплекс із МЕСЕ МіпіТгар.
Використовуваний у цьому документі термін «білок» або «білок, що становить інтерес» може включати будь-який амінокислотний полімер із ковалентно зв'язаними амідними зв'язками.
Приклади білків, що становлять інтерес, включають без обмеження афліберцепт та МіпіТгар.
Білки містять один або більше амінокислотних полімерних ланцюгів, широко відомих у цій галузі як «поліпептиди». «Поліпептид» стосується полімеру, який складається з амінокислотних залишків, відповідних структурних варіантів, що зустрічаються в природі, та їхніх синтетичних аналогів, що не зустрічаються в природі, зв'язаних за допомогою пептидних зв'язків. «Синтетичний пептид або поліпептид» стосується пептиду або поліпептиду, що не зустрічаються в природі. Синтетичні пептиди або поліпептиди можуть бути синтезовані, наприклад, із використанням автоматичного синтезатора поліпептидів. Фахівцю в цій галузі відомі різні способи твердофазного пептидного синтезу. Білок може містити один або більше поліпептидів з утворенням єдиної функціонуючої біомолекули. В іншому ілюстративному аспекті білок може включати фрагменти антитіла, нанотіла, химери рекомбінантного антитіла, цитокіни, хемокіни, пептидні гормони, тощо. Білки, що становлять інтерес, можуть включати будь-який із біотерапевтичних білків, рекомбінантних білків, які застосовуються в дослідженнях або терапії, білків-пасток та інших Ес-злитих білків химерного рецептора, химерних білків, антитіл, моноклональних антитіл, поліклональних антитіл, людських антитіл та біспецифічних антитіл. У конкретному аспекті білок, що становить інтерес, являє собою злитий білок проти МЕСЕ (наприклад, афліберцепт або МіпіТгар). Білки можуть бути отримані з використанням систем продукування на основі рекомбінантних клітин, як-от система бакуловірусів комах, системи дріжджів (наприклад, Рісніа 5р.) і системи ссавців (наприклад, СНО-клітини та похідні СНО-клітин, як-от СНО-КІ1-клітини). Нещодавній огляд біотерапевтичних білків та їхнього отримання див. у
СПадегі еї аї., «Ргодисцоп ріайогпт5 їТог Біо(Шегарешіс діусоргоївіп5. Оссигтепсе, ітрасі, апа спаІМмепдев5 ої поп-питап взіауїайоп,» (Оагіиз СНадегі еї аїЇ., Ргодисіоп ріабогтв»5 Тог ріоїштегареціс діусоргоївіп5. Осситепсе, Іітрасі, апа спаПепдев ої поп-питап взіаіуїанйоп, 28 ВІОТЕСНМОГ ОС
АМО СЕМЕТІС ЕМСІМЕЄЕВІМО ВЕМІЕМУ5 147-176 (2012), повний вміст яких включений у цей документ). У деяких ілюстративних варіантах здійснення білки містять модифікації, адукти та інші ковалентно зв'язані фрагменти. Ці модифікації, адукти та фрагменти включають, наприклад, авідин, стрептавідин, біотин, глікани (наприклад, М-ацетилгалактозамін, галактозу, нейрамінову кислоту, М-ацетилглюкозамін, фукозу, манозу та інші моносахариди), РЕС, полігістидин, РІ Асад, мальтоза-зв'язувальний білок (МВР), хітин-зв'язувальний білок (СВР), глутатіон-5-трансферазу (51) тус-епітоп, флуоресцентні мітки та інші барвники, тощо. Білки можуть бути класифіковані на підставі композицій та розчинності й, таким чином, можуть включати прості білки, як-от глобулярні білки та фібрилярні білки; кон'юговані білки, як-от нуклеопротеїни, глікопротеїни, мукопротеїни, хромопротеїни, фосфопротеїни, металопротеїни та ліпопротеїни; і похідні білки, як- от первинні похідні білки та вторинні похідні білки.
У деяких ілюстративних варіантах здійснення білок, що становить інтерес, може являти собою рекомбінантний білок, антитіло, біспецифічне антитіло, мультиспецифічне антитіло, фрагмент антитіла, моноклональне антитіло, злитий білок, зсЕм та їхні комбінації.
Використовуваний у цьому документі термін «рекомбінантний білок» стосується білка, отриманого в результаті транскрипції та трансляції гена, що міститься в рекомбінантному векторі експресії який був упроваджений у придатну клітину-господаря. У певних ілюстративних варіантах здійснення рекомбінантний білок може являти собою злитий білок. У конкретному аспекті рекомбінантний білок являє собою злитий білок проти МЕСЕ (наприклад, афліберцепт або
МіпіТгар). У певних ілюстративних варіантах здійснення рекомбінантний білок може являти собою антитіло, наприклад, химерне, гуманізоване або повністю людське антитіло. У певних ілюстративних варіантах здійснення рекомбінантний білок може являти собою антитіло ізотипу, вибраного з групи, яка складається з Ідс, І9М, ІДдДА1, ІдА2, ІдО або Ід4Е. У певних ілюстративних варіантах здійснення молекула антитіла являє собою повнорозмірне антитіло (наприклад, Ідс1) або, в якості альтернативи, антитіло може являти собою фрагмент (наприклад, фрагмент Ес або
Еаб).
Застосовуваний у цьому документі термін «антитіло» включає молекули імуноглобуліну, що містять чотири поліпептидні ланцюги, два важкі ланцюги (Н) і два легкі ланцюги (І), зв'язані між собою дисульфідними зв'язками, а також їхні мультимери (наприклад, ІМ). Кожен важкий ланцюг містить варіабельну область важкого ланцюга (скорочено НСМК або УН) і константну область важкого ланцюга. Константна область важкого ланцюга містить три домени, СНІ, СН2 та СНЗ.
Кожен легкий ланцюг містить варіабельну область легкого ланцюга (скорочено позначається в цьому документі як ЇСМК або МІ) і константну область легкого ланцюга. Константна область легкого кола містить один домен (СІ 1). МН- їі Мі -області можуть бути додатково підрозділені на області гіперваріабельності, які називаються областями, що визначають комплементарність (СОК), з вкрапленнями більш консервативних областей, які називаються каркасними областями (ЕК). Кожна МУН і Мі. складається з трьох СОК і чотирьох ЕК, розташованих від аміно-кінця до карбокси-кінця в такому порядку: ЕКТ, СОКІ, ЕК2, СОМК2, ЕКЗ, СОКЗ ї ЕКА. У різних варіантах здійснення цього винаходу антитіла ЕК проти Бід-ЕТ-1 (або його антигензв'язувальної частини) можуть бути ідентичні послідовностям зародкової лінії людини або можуть бути модифіковані природним або штучним шляхом. Амінокислотна консенсусна послідовність може бути визначена на основі паралельного аналізу двох або білоше СОК. Використовуваний у цьому документі термін «антитіло» також включає антигензв'язувальні фрагменти молекул повного антитіла.
Застосовувані в цьому документі терміни «антигензв'язувальна частина» антитіла, «антигензв'язувальний фрагмент» антитіла тощо включають будь-який, ферментативно отримуваний, синтетичний або генетично сконструйований поліпептид або глікопротеїн, що зустрічається в природі, який специфічно зв'язує антиген з утворенням комплексу.
Антигензв'язувальні фрагменти антитіла можуть бути отримані, наприклад, із молекул повного антитіла з використанням будь-яких придатних стандартних методик, як-от протеолітичне розщеплення або методики рекомбінантної генної інженерії, які включають маніпулювання та експресію ДНК, що кодує варіабельні та необов'язково константні домени антитіла. Така ДНК відома та/або легко доступна, наприклад, із комерційних джерел, бібліотек ДНК (включаючи, наприклад, фагові бібліотеки антитіл), або може бути синтезована. ДНК може бути секвенована і оброблена хімічно або з використанням методів молекулярної біології, наприклад, для розміщення одного або більше варіабельних та/або константних доменів у придатній конфігурації або для введення кодонів, створення цистеїнових залишків, модифікації, додавання або видалення амінокислот тощо.
Використовуваний у цьому документі термін «фрагмент антитіла» включає частину інтактного антитіла, як-от, наприклад, антигензв'язувальна або варіабельна область антитіла. Приклади фрагментів антитіл включають, але не обмежуються ними, фрагмент Бар, фрагмент Раб, фрагмент Е(аб)2, фрагмент 5сЕм, фрагмент Ем, діатіло а5Ем, фрагмент аАБ, фрагмент Бе, фрагмент Ба та область виділеної області, що визначає комплементарність (СОК), а також триатіла, тетратіла, лінійні антитіла, одноланцюгові молекули антитіл та мультиспецифічні антитіла, утворені з фрагментів антитіл. Фрагменти Ем являють собою комбінацію варіабельних областей важкого та легкого ланцюгів імуноглобуліну, а 5сЕм-білки являють собою рекомбінантні одноланцюгові поліпептидні молекули, в яких варіабельні області легкого та важкого ланцюгів імуноглобуліну з'єднані пептидним лінкером. У деяких ілюстративних варіантах здійснення фрагмент антитіла містить достатню амінокислотну послідовність вихідного антитіла, до якого належить цей фрагмент, який зв'язується з тим самим антигеном, що й вихідне антитіло; у деяких ілюстративних варіантах здійснення фрагмент зв'язується з антигеном із зіставною афінністю, подібною до афінності вихідного антитіла, та/або конкурує з вихідним антитілом за зв'язування з антигеном. Фрагмент антитіла можна отримати у будь-який спосіб. Наприклад, фрагмент антитіла може бути отриманий ферментативним або хімічним шляхом за допомогою фрагментації інтактного антитіла та/або він може бути отриманий рекомбінантним шляхом із гена, який кодує часткову послідовність антитіла. Альтернативно або додатково фрагмент антитіла може бути повністю або частково отриманий синтетичним шляхом. Фрагмент антитіла може необов'язково містити одноланцюговий фрагмент антитіла. Альтернативно або додатково фрагмент антитіла може містити кілька ланцюгів, зв'язаних разом, наприклад, дисульфідними зв'язками. Фрагмент антитіла може необов'язково мати багатомолекулярний комплекс. Функціональний фрагмент антитіла зазвичай містить щонайменше близько 50 амінокислот і більш типово містить щонайменше близько 200 амінокислот.
Термін «біспецифічне антитіло» включає антитіло, здатне селективно зв'язувати два або більше епітопів. Біспецифічні антитіла зазвичай включають два різні важкі ланцюги, кожен із яких специфічно зв'язується з різними епітопами - або з двома різними молекулами (наприклад, антигенами) або з тією самою молекулою (наприклад, на тому самому антигені). Якщо біспецифічне антитіло здатне селективно зв'язувати два різні епітопи (перший епітоп і другий епітоп), афінність першого важкого ланцюга до першого епітопу зазвичай буде на один, два, три або чотири порядки нижче, ніж спорідненість першого важкого ланцюга до другого епітопу, і навпаки. Епітопи, що розпізнаються біспецифічним антитілом, можуть бути на одній або іншій мішені (наприклад, на тому самому або іншому білку). Біспецифічні антитіла можуть бути отримані, наприклад, за допомогою об'єднання важких ланцюгів, що розпізнають різні епітопи одного антигену. Наприклад, послідовності нуклеїнових кислот, що кодують варіабельні послідовності важкого ланцюга, які розпізнають різні епітопи на тому самому антигені, можуть бути злиті з послідовностями нуклеїнових кислот, які кодують різні константні області важкого ланцюга, і такі послідовності можуть експресуватися в клітині, яка експресує легкий ланцюг імуноглобуліну.
Типове біспецифічне антитіло має два важкі ланцюги, кожен із яких має три СОК важкого ланцюга, за якими йде домен СНІ, шарнірна область, домен СН2, домен СНЗ і легкий ланцюг імуноглобуліну, який або не надає антигензв'язувальної специфічності, але може зв'язуватися з кожним важким ланцюгом, або які можуть зв'язуватися з кожним важким ланцюгом, і які можуть зв'язувати один або кілька епітопів, зв'язаних з антигензв'язувальними областями важкого ланцюга, або які можуть зв'язуватися з кожним важким ланцюгом і забезпечувати зв'язування одного або обох важких ланцюгів з одним або обома епітопами. В5АБ можна розділити на два основні класи: ті, що містять Ес-область (ІдсС-подібну), і ті, що не мають Ес-області, причому остання зазвичай менша, ніж до та ІдсС-подібні біспецифічні молекули, що містять Ес. ІдС-подібні р5АБ можуть мати різні формати, як-от, крім іншого, тріомаб, виступи в отворах дос (Кіп Ідс), сго55Маб, опр-Раб Ідс, подвійні варіабельні домени Ід (0МО-Ід), Раб два-в-одному або подвійної дії (ОАЕ), Ідс-одноланцюговий Ем (Ідс-5сЕм) або кА-тільця. Різні формати, які не є Ідс-подібними, включають тандемні 5сЕм, формат діатіла, одноланцюгове діатіло, тандемні діатіла (ТападАБ), молекулу з ретаргетингом із подвійною афінністю (АКТ), САКТ-Ес, нанотіла або антитіла, що продукуються за допомогою способу аосКк-апа-іоск (ОМ) (Саомеї Рап, 2ціап Уапа 4 Міпд)и Нао,
Візресіїйс апііродієз апа (Неї арріїсайоп5, 8 "ООВАМАГЇ. ОЄ НЕМАТОГ СІМ а ОМСОГ ОС 130; баїтпе
МиШег 5 Коїапа Е. Копіегтапп, Візресійс Апіібодіех, НАМОВООК ОЄ ТНЕКАРЕШОТІС АМТІВОСІЕЗ 265-310 (2014), повний вміст яких включений у цей документ). Способи отримання р5АБ не обмежуються квадромною технологією, заснованою на соматичному злитті двох різних клітинних ліній гібридоми, хімічної кон'югації, яка включає хімічні перехресні лінкери, та генетичними підходами, в яких застосовується технологія рекомбінантної ДНК. Приклади р5АБб включають розкриті в наступних патентних заявках, які включені в цей документ шляхом посилання: США Мо 12/823838, подана 25 червня 2010 р.; США Мо 13/488628, подана 5 червня 2012 р.; США Мо 14/031075, подана 19 вересня 2013 р.; США Мо 14/808171, подана 24 липня 2015 р.; США Мо 15/713574, подана 22 вересня 2017 р.; США Мо 15/713569, подана 22 вересня 2017 р.; США Мо 15/386453, подана 21 грудня 2016 р.; США Мо 15/386443, подана 21 грудня 2016 р.; США Мо 15/22343 подана 29 липня 2016 р.; США Мо 15814095, подана 15 листопада 2017 р. Низькі рівні домішок гомодимеру можуть бути присутніми на кількох етапах виробництва біспецифічних антитіл. Виявлення таких домішок гомодимерів може бути проблематичним при виконанні з використанням аналізу неушкодженої маси внаслідок низького вмісту домішок гомодимерів та спільної елюції цих домішок з основними видами при проведенні з використанням звичайного рідинного хроматографічного способу.
У контексті цього документа «мультиспецифічне антитіло» стосується антитіла зі зв'язувальною специфічністю щонайменше для двох різних антигенів. Незважаючи на те, що такі молекули зазвичай зв'язують лише два антигени (тобто, біспецифічні антитіла, Б5АБ), антитіла з додатковою специфічністю, як-от триспецифічні антитіла та триспецифічні КІН, також можуть бути розглянуті з використанням системи та способу, описаних у цьому документі.
Використовуваний у цьому документі термін «моноклональне антитіло» не обмежується антитілами, отриманими за допомогою гібридомної технології. Моноклональне антитіло може бути отримане з одного клону, включаючи будь-який еукаріотичний, прокаріотичний або фаговий клон, за допомогою будь-яких способів, доступних або відомих у цій галузі. Моноклональні антитіла, придатні для використання у цьому винаході, можуть бути отримані з використанням широкого спектра методів, відомих у цій галузі техніки, включаючи використання технологій гіоридомної, рекомбінантної та фагової індикації або їх комбінації.
У деяких ілюстративних варіантах здійснення білок, що становить інтерес, може мати рі в діапазоні від близько 4,5 до близько 9,0. В одному конкретному ілюстративному варіанті здійснення рі може становити близько 4,5, близько 5,0, близько 5,5, близько 5,6, близько 5,7,
близько 5,8, близько 5,9, близько 6,0, близько 6,1, близько 6,2, близько 6,3, близько 6,4, близько 6,5, близько 6,6, близько 6,7, близько 6,8, близько 6,9, близько 7,0, близько 7,1, близько 7,2, близько 7,3, близько 7,4, близько 7,5, близько 7,6, близько 7,7, близько 7,8, близько 7,9, близько 8,0, близько 8,1, близько 8,2, близько 8,3, близько 8,4, близько 8,5, близько 8,6, близько 8,7, близько 8,8, близько 8,9 або близько 9,0. У деяких ілюстративних варіантах здійснення композиціях може бути більше одного типу білка, що становить інтерес.
У деяких ілюстративних варіантах здійснення білок, що становить інтерес, може продукуватися клітиною ссавця. Клітини ссавця можуть бути людського походження або не людського походження, можуть включати первинні епітеліальні клітини (наприклад, кератиноцити, клітини епітелію шийки матки, клітини бронхіального епітелію, клітини епітелію трахеї, клітини епітелію нирок та клітини епітелію сітківки), стійкі клітинні лінії та їх штами (наприклад, 293 ембріональні клітини нирок, клітини ВНК, Неї а клітини епітелію шийки матки і клітини сітківки
РЕВ-С6, клітини МОВК (МВІ-1), клітини 911, клітини СКЕК, клітини МОСК, клітини СНО, клітини
Веумо, клітини Спапод, клітини Оеїгоїї 562, клітини НеГа 229, клітини НеГа 53, клітини Нер-2, клітини КВ, клітини І 5 180, клітини І 5 174Т, клітини МСІ-Н-548, клітини КРМІ 2650, клітини 5МУ-13, клітини Т24, УМІ-28 МА13, клітини 2ЕА, клітини УМІЗН, клітини В5-С-Ї, клітини Г.О-МК2, клітини
Сіопе М-3, клітини 1-10, клітини КАС, клітини ТОМК-1, клітини У-1, клітини Г/С-РКІ1, клітини
РКО15), клітини СНІ, клітини ОНЗ, клітини 12, клітини Г/С-КС 256, клітини МНІСТ, клітини ХС, клітини МООК, клітини УБУМ і клітини ТН-Ї, клітини В1, клітини В5СО-1, клітини КАЇ, ЕК-клітини, клітини РК-15 або їх похідні), клітини фібробластів із будь-якої тканини або органу (включаючи, без обмеження, серце, печінку, нирки, товсту кишку, кишечник, стравохід, шлунок, нервову тканину (головного, спинного мозку), легеню, судинну тканину (артерію, вену, капіляр), лімфоїдну тканину (лімфатичну залозу, аденоїд, мигдалину, кістковий мозок і кров), селезінку та фібробластні та фібробластоподібні клітинні лінії (наприклад, клітини СНО, клітини ТАИ-2, клітини
ІМА-33, клітини Юоп, клітини СНК-21, клітини цитрулінемії, клітини Оетрзеу, клітини Оеїгоїї 551, клітини Оеєїгоїйї 510, клітини Оеїгоїї 525, клітини Оеїгоїї 529, клітини Оеєїгоїї 532, клітини Оеєїгоїй 539, клітини Оеїгоїї 548, клітини Оеєїгоїї 573, клітини НЕЇ. 299, клітини ІМК-90, клітини МКС-5, клітини
ММІ-38, клітини М/І-26, клітини Міаї, клітини СНО, клітини СМ-1, клітини СО5-1, клітини СО5-3, клітини СО5-7, клітини Мего, клітини ОВ5-ЕТІ -2, клітини ВАГ В/3Т3, клітини Е9, клітини 5МУ-Т2, клітини М-М5М-ВАГ- В/3Т3, клітини К-ВАГ В, клітини ВІ О-11, клітини МОБ-10, клітини СЗН/ОСТІ/2, клітини Н2ОМ1С3, клітини КІ.М205, клітини МесСоу, І -клітини миші, клітини штаму 2071 (І-клітини миші), клітини штаму Г-М (І-клітини миші), клітини Г-МТК' (І-клітини миші), клони МСТС 2472 і 2555, клітини ЗСС-РБАТ, клітини бугіз5/3Т3, клітини індійського мунтжака, клітини 5ІКС, клітини
Сп і клітини депзеп, 5р2/0, клітини М5О, М51 або їхні похідні).
Використовуваний у цьому документі термін «засіб, що алкілує білок» стосується засобу, який застосовується для алкілування певних вільних амінокислотних залишків у білку.
Необмежувальними прикладами засобів, що алкілують білок, є йодацетамід (ІФА), хлорацетамід (САА), акриламід (АА), М-етилмалеїмід (МЕМ), метилметантіосульфонат (ММТ5) і 4-вінілпіридин або їхні комбінації.
У цьому документі «денатурація білка» може стосуватися процесу, в якому тривимірна форма молекули змінюється від його вихідного стану. Денатурація білка може здійснюватися з використанням засобу, що денатурує білок. Необмежувальні приклади засобу, що денатурує білок, включають тепло, високий або низький рН, відновлювальні засоби, як-от ОТТ (див. нижче) або вплив хаотропних засобів. В якості засобів, що денатурують білок, можна застосовувати кілька хаотропних засобів. Хаотропні розчинені речовини підвищують ентропію системи за допомогою перешкоджання внутрішньомолекулярним взаємодіям, опосередкованим нековалентними силами, такими як водневі зв'язки, ван-дер-ваальсові сили та гідрофобні ефекти.
Необмежувальні приклади хаотропних засобів включають бутанол, етанол, хлорид гуанідину, перхлорат літію, ацетат літію, хлорид магнію, фенол, пропанол, додецилсульфат натрію, тіосечовину, М-лаурилсаркозинат, сечовину та їхні солі.
Використовуваний у цьому документі термін «засіб, що відновлює білок» стосується засобу, який застосовується для відновлення дисульфідних місточків у білку. Необмежувальними прикладами засобів, що відновлюють білок, які застосовуються для відновлення білка, є дитіотреїтол (017), В-меркаптоетанол, реактив Еллмана, хлороводневий гідроксиламін, ціаноборгідрид натрію, трис(2-карбоксиетил)гідрохлорид фосфіну (ТСЕР-НСІ) або їхні комбінації.
Використовуваний у цьому документі термін «варіант» поліпептиду (наприклад, Ід-домен
МЕСЕРК) стосується поліпептиду, що містить амінокислотну послідовність, яка на щонайменше близько 70-99,995 (наприклад, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,995) ідентична або подібна зазначеній або вихідній амінокислотній послідовності білка, що становить інтерес. Порівняння послідовностей може бути виконано, наприклад, із використанням алгоритму ВІ А5Т, в якому параметри алгоритму вибрані для забезпечення найбільшого збігу між відповідними послідовностями по всій довжині відповідних контрольних послідовностей (наприклад, очікуваний поріг: 10; розмір слова: 3; максимальна кількість збігів у діапазоні запиту: 0; матриця ВО5ИМ 62; вартість гепа: наявність 11; розширення 1; умовне композиційне коригування матриці замін). Варіанти поліпептиду (наприклад, Ід-домен МЕСЕК) також можуть стосуватися поліпептиду, що містить зазначену амінокислотну послідовність, за винятком однієї або більше (наприклад, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 або 10) мутацій, як-от, наприклад, мутації зі зміною сенсу (наприклад, консервативні заміщення), несенсові мутації, делеції або вставки. Наступні посилання стосуються алгоритмів ВІ АБ5Т, які часто застосовуються для послідовного аналізу: В А5Т АГ ООМКІТНМ5: Аївспиї еї а. (2005) РЕВ5
У. 272(20): 5101-5109; Айв5епниї, 5. Е., єї аї., (1990) У. Мої. ВіоІ. 215:403-410; (ібн, М/., еї аї., (1993)
Маїшге Сепеї. 3:266-272; Мадаенп, Т. Ї.., еї а!., (1996) Меїй. Епгутої. 266:131-141; Анвсйші, 5. Е., єї аІ.,, (1997) Мисівіс Асійз Невз. 25:3389-3402; 7Напа, ч., еї аїІ., (1997) Сепоте Вез. 7:649-656;
Муооноп, у. С., еї а!., (1993) Сотриї. Спет. 17:149-163; Напсоск, .. М. еї а!., (1994) Сотриї. Аррі.
Віозсі. 10:67-70; АГІСММЕМТ 5СОКІМО 5У5ТЕМ5: баупйоїї, М. 0О,., еї аї., "А тодеї ої емоїшіопагу спапде іп ргоївіп5." в АМаз ої Ргоївїп Зедоепсе апа біпосішиге, (1978) мої. 5, зиррі. 3. М. 0. Оаупоїйї (ед.), рр. 345-352, Маї!. Віотейд. Ке5. Боцпа., М/азпіпдіоп, О.С.; 5спухапя, К. М., еї аї., "Маїгісевз Тог дегесіїіпу аістапі геіайоп5Пірв." в АЙаз ої Ргоївіп Зедцепсе апа Зігисіиге, (1978) мої. 5, зиррі. 3.7" М.
О. Баунотїй (ед.), рр. 353-358, Маї). Віотеа. Ве5. Рошпа., УУазНпіпдіюп, 0.0. Анбепиї, 5. Е., (1991) У.
Мої. Віої. 219:555-565; Зіаїев, 0. у., єї аї!., (1991) Меїноаз 3:66-70; Непікої, 5., еї а!., (1992) Ргос.
Май. Асай. 5сі. ОБА 89:10915-10919; АйбсНи!І, 5. Е., еї аЇ., (1993) У. Мої. Емої. 36:290-300;
АПОММЕМТ 5ТАТІ5ТІС5: Кап, 5., еї а!., (1990) Ргос. Маї). Асай. 5сі. ОБА 87:2264-2268; Капіп, 5., еї аї., (1993) Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 90:5873-5877; ЮОетро, А., єї а!., (1994) Апп. Ргоб. 22:2022- 2039; і АібБспи, 5. Е. «ЕмаїЇчайпуд Ше «аїйізіїса! зідпійсапсе ої тиріе аїзіпсі Іосаї аїдптепів.» в
Тпеогеїїса! апа Сотршиїайопа! Меїйодз іп сепоте Везеагсйі (5. ЗипПаї, єд.), (1997) рр. 1-14, Ріепит,
МУ; вміст яких включено до цього документа.
Деякі варіанти можуть бути ковалентними модифікаціями, яким піддаються поліпептиди, або в ході (котрансляційна модифікація), або після (посттрансляційна модифікація «РТМ») їх рибосомного синтезу. РТМ зазвичай вводяться специфічними ферментами або ферментними шляхами. Багато з них виникає в місці специфічної характерної білкової послідовності (наприклад, сигнатурної послідовності) усередині білкового каркасу. Було зареєстровано кілька сотень РТМ і ці модифікації незмінно впливають на деякі аспекти структури або функції білка (УмМаївй, 0. «Ргоїєїп5» (2014) друге видання, опубліковане в Умієу апа Зопз, Ца., ІЗВМ: 9780470669853, вміст якого включено в цей документ). У певних ілюстративних варіантах здійснення білкова композиція може містити більше одного типу білка варіанта білка, що становить інтерес.
Білкові варіанти у випадку афліберцепту (і білки з однаковими структурними характеристиками афліберцепту, наприклад, одна або більше областей важкого або легкого ланцюгів афліберцепту) можуть включати, без обмеження, варіанти окиснення, які можуть утворюватися внаслідок окиснення одного або більше амінокислотних залишків, які виникають, наприклад, на залишках гістидину, цистеїну, метіоніну, триптофану, фенілаланіну та/лабо тирозину; варіанти дезамідування, які можуть утворюватися внаслідок дезамідування на залишках аспарагіну та/або дезоксиглюкозонування в залишках аргініну.
Відносно афліберцепту (і білків з однаковими структурними характеристиками афліберцепту, наприклад, одна або більше областей важкого або легкого ланцюга афліберцепту) варіанти окиснення можуть включати окиснення залишків гістидину в Ніз86б, Ніз110, Ніз145, Ніз209, Ніз95,
Ніз19 та/або Ніз203 (або еквівалентних положеннях залишку на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту); окиснення залишків триптофану в Тгр58 та/або
Тгр1138 (або еквівалентних положеннях залишку на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту); окиснення залишків тирозину в Тугб4 (або еквівалентних положеннях залишку на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту); окиснення залишків фенілаланіну в Рпе44 та/або Рпе16б (або еквівалентних положеннях залишку на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту); та/або окиснення залишків метіоніну в Мей10, Меї20, Ме/163 та/або Ме!192 (або еквівалентних положеннях залишку на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту).
Відносно афліберцепту (і білків з однаковими структурними характеристиками афліберцепту, наприклад, однієї або більше областей важкого або легкого ланцюга афліберцепту) варіанти дезамідування можуть включати дезамідування залишку аспарагіну в Азп84 та/або Азп99 (або еквівалентних положеннях залишку на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту).
Відносно афліберцепту (і білків з однаковими структурними характеристиками афліберцепту, наприклад, однієї або більше областей важкого або легкого ланцюга афліберцепту) варіант дезоксиглюкозонування може включати З3-дезоксиглюкозонування залишку аргініну в Агд5 (або еквівалентному положенні залишку на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту).
Білкові варіанти можуть включати як кислотні форми, так і основні форми. Кислі форми зазвичай являють собою варіанти, які елююються раніше, ніж основний пік від СЕХ, або пізніше, ніж основний пік від АЕХ, у той час як основні різновиди являють собою варіанти, які елююються пізніше, ніж основний пік від СЕХ, або раніше, ніж основний пік від АЕХ.
Використовувані в цьому документі терміни «кислотні форми», «А5», «кислотна область» та «АК» стосуються варіантів білка, які характеризуються загальним кислотним зарядом. Наприклад, у препаратах рекомбінантного білка такі кислотні форми можуть бути виявлені за допомогою різних способів, як-от іонообмінна, наприклад, МУСХ-10 ВЕРХ (слабка катіонообмінна хроматографія) або ІЕЕ (ізоелектричне фокусування). Кислотні форми антитіла можуть включати варіанти структури та/або варіанти фрагментації. Ілюстративні варіанти можуть включати без обмеження варіанти дезамідування, варіанти афукозилювання, варіанти окиснення, метилгліоксальні (МОО) варіанти, варіанти глікації та варіанти лимонної кислоти. Ілюстративні варіанти структури включають, без обмеження, варіанти глікозилювання та варіанти ацетонування. Ілюстративні варіанти фрагментації включають будь-які модифіковані форми білка з цільової молекули внаслідок дисоціації пептидного ланцюга, ферментативні та/або хімічні модифікації, включаючи, без обмеження, фрагменти Ес і Раф, фрагменти без Раб, фрагменти без варіабельного домену важкого ланцюга, варіанти С-кінцевого усічення, варіанти з висіченням М- кінцевого Ар в легкому ланцюгу, і варіанти з М-кінцевим усіченням легкого ланцюга. Інші варіанти кислотних форм включають варіанти, що містять непарні дисульфіди, білки клітини-господаря та нуклеїнові кислоти клітини-господаря, хроматографічні матеріали та компоненти середовища.
Зазвичай кислотні форми елююються раніше основного піку під час СЕХ або пізніше основного піку під час аналізу АЕХ (див. фіг. 16 і 17).
У певних варіантах здійснення білкова композиція може містити більше одного типу варіанта кислотних форм. Наприклад, але не в якості обмеження, загальну кількість кислотних форм можна розділити на категорії на основі хроматографічного часу утримання піків, що з'являються.
Інший приклад, в якому загальні кислотні форми можуть бути класифіковані, може бути заснований на типі варіанта - варіанти, варіанти структури або фрагментації.
Термін «кислотні форми» або «Аб» не стосується технологічних домішок. Термін «виробнича домішка» в контексті цього документа стосується домішок, присутніх у композиції, яка містить білок, але не походять від самого білка. Технологічні домішки включають, без обмеження, білки клітини-господаря (НСР), нуклеїнові кислоти клітини-господаря, хроматографічні матеріали та компоненти середовища.
В одному ілюстративному варіанті здійснення кількість кислотних форм у композиції проти
МЕС порівняно з білком, що становить інтерес, може складати не більше близько 2095, 1595, 1495, 1395, 12905, 1195, 1095, 990, 8 90, 790, був, БУ, 4,590, 490, З,9Ую, Зо, 2,9о, 2 о, 1,990, 1,890, 1,790, 1,696, 1,595, 1,495, 1,395, 1,20, 1,195, 195, 0,995, 0,895, 0,790, 0,бУю, 0,590, 0,495, 0,ЗУю, 0,290, 0,190, або 0,095 ї варіює в межах одного або більше з попередніх. Приклади композицій проти МЕСЕ обговорюються нижче у розділі ІП. В одному аспекті композиція проти МЕСЕ може містити білок проти МЕСЕ, вибраний із групи, яка складається з афліберцепту, рекомбінантного МіпіТгар (приклади яких розкриті в патенті США Мо 7279159), 5сЕм та інших білків проти МЕОЕ. У переважному аспекті рекомбінантний білок, що становить інтерес, являє собою афліберцепт.
Серед способів хімічного розкладання, які відповідають за кислотні або основні форми, дві найбільш часто спостережувані ковалентні модифікації, що відбуваються в білках і пептидах, являють собою дезамінування і окиснення. Метіонін, цистеїн, гістидин, триптофан і тирозин є деякими амінокислотами, які найбільш чутливі до окиснення: Меї і Суз внаслідок їхніх атомів сульфуру і Ні, Тгр і Туг внаслідок їхніх ароматичних кілець.
Використовувані в цьому документі терміни «окислювальні форми», «О5» або «варіант окиснення» стосуються варіантів білка, утворених за допомогою окиснення. Такі окислювальні форми також можуть бути виявлені за допомогою різних способів, як-от іонообмінна, наприклад,
М/СХ-10 ВЕРХ (слабка катіонообмінна хроматографія) або ІЕЕ (ізоелектричне фокусування).
Варіанти окиснення можуть утворюватися внаслідок окиснення, яке виникає на залишках гістидину, цистеїну, метіоніну, триптофану, фенілаланіну та/або тирозину. Зокрема, відносно афліберцепту (і білків із однаковими структурними характеристиками афліберцепту, наприклад, одна або більше областей важкого або легкого ланцюга афліберцепту) варіанти окиснення можуть включати окиснення залишків гістидину в Ніз8б, Ніз110, Нівз145, Нівз209, Ніз95, Ніз19 та/або Ніз203 (або еквівалентних положеннях залишку на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту); окиснення залишків триптофану в Тгр58 та/або
Тгр1138 (або еквівалентних положеннях залишку на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту); окиснення залишків тирозину в Тугб4 (або еквівалентних положеннях залишку на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту); окиснення залишків фенілаланіну в Рпе44 та/або Рпе16б (або еквівалентних положеннях залишку на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту); та/або окиснення залишків метіоніну в Мей0, Меї 20, Мей163 та/або Ме!192 (або еквівалентних положеннях залишку на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту).
В одному ілюстративному варіанті здійснення кількість окислювальних форм у композиції проти МЕСЕ порівняно з білком, що становить інтерес, може складати не більше близько 1595, 1495, 1395, 12905, 1195, 1095, 990, 8 90, 790, був, БУ, 4,590, 490, З,9Ую, Зо, 2,9о, 2 о, 1,990, 1,890, 1,790, 1,696, 1,595, 1,495, 1,395, 1,20, 1,195, 195, 0,995, 0,895, 0,790, 0,бУю, 0,590, 0,495, 0,ЗУю, 0,290, 0,190, або 0,095 ї варіює в межах одного або більше з попередніх. Приклади композицій проти МЕСЕ обговорюються нижче у розділі ІП. В одному аспекті композиція проти МЕСЕ може містити білок проти МЕСЕ, вибраний із групи, яка складається з афліберцепту, рекомбінантного МіпіТгар (приклади яких розкриті в патенті США Мо 7279159), 5сЕм та інших білків проти МЕОЕ. У переважному аспекті рекомбінантний білок, що становить інтерес, являє собою афліберцепт або
МіпіТгтар.
Залишки цистеїну можуть піддаватися мимовільному окисненню з утворенням або внутрішньо- л або міжмолекулярних дисульфідних зв'язків або мономолекулярних побічних продуктів, як-от сульфенова кислота.
Гістидинові залишки також дуже чутливі до окиснення за рахунок реакції з їхніми імідазольними кільцями, які згодом можуть генерувати додаткові гідроксили (Її, 5, С 5сПпопеїсй, апа АТ. ВогсНагаї. 1995. Спетісаї! Інвіабіїну ої Ргоївіп Рнагптасеціїсаів: Меспапівітз ої Охідайноп апа зігаїецієз ог їабіїйгайноп. Віотеснпої. Віоепу. 48:490-500, повний вміст якої включений в цей документ). Запропоновані механізми окиснення гістидину виділені на фіг 2 та фіг. 3. Детальні дослідження механізмів доступні в АпаЇ. Спет. 2014, 86, 4940-4948 та 5. Рпагт. Віотеа. Апаї. 21(2000) 1093-1097, повний вміст якої включений в цей документ.
Окиснення метіоніну може призводити до утворення сульфоксиду метіоніну (Ії, 5, С
Зспопеїісп, апа ВТ. ВогсНагаї. 1995. Спетісаї! Іпетаріїйу ої Ргоївїп РНнаптасеціїсаІ5: Меспапівтв ої
Охідайноп апа 5ігагедієз Ттог еїабіїїгайноп. Віотесппої. Віоепа. 48:490-500). Різні можливі механізми окиснення метіоніну обговорювалися у літературі (Вгої, М., МУеіззрасі, Н. 1982. Те Біоспетівігу ої теїпіопіпе зийохіде гезідсевз іп ргоївіп5. Тгтепаб5 Віоспет. осі. 7: 137-139, повний вміст якої включений в цей документ).
Окиснення триптофану може забезпечувати комплексну суміш продуктів. Первинними продуктами можуть бути М-формілкінуренін та кінуренін разом із продуктами моно-окиснення, ди- окиснення та/або продуктів три-окиснення (фіг. 4). Пептиди, які несуть модифікації окисненого Тгр зазвичай показують підвищення маси на 4, 16, 32 і 48 Да, що відповідає утворенню кінуреніну
(КУМ), гідрокситриптофану (ММох) та М-формілкінуреніну/дигідрокситриптофану (МЕКЛЛ/охг, що називається також «двічі окиснений Тгр»), тригідрокситриптофану (М/охз, що називається також «тричі окиснений Ттгр») та їхніх комбінацій, як-от гідроксикінуренін (КУМохі, 20 Да). Окиснення до гідрокситриптофану (Мох) обговорювалося в літературі (Маз5 зресіготейіс ідепійсайоп ої охідайме тоаїйісайоп5 ої ШМуріорпап гезідцеб іп ргоївіп5: спетіса! апітасі ог розі-шапвіайопаї тоаїйїїсайоп? У. Ат. 5ос. Мавз Зресігот. 2010 диї; 21(7): 1114-1117, повний вміст якої включений в цей документ). Було виявлено, що окиснення триптофану, але не окиснення метіоніну і гістидину, викликає зміну кольору білкових продуктів (СПагасієегігайоп ої Те Редгадайоп Ргодисів ої а Соїог-
Спапдед Мопосіопа! Апіїбоду: Туріорпап-Оеймей Спготорпогев. ах.дої.огд/10.1021/ас4042181
АпаІ. Спет. 2014, 86, 6850-6857). Подібно до триптофану, окислення тирозину насамперед забезпечує 3,4-дигідроксифенілаланін (СОРА) і дитирозин (Іі, 5, С ЗсПпопеїсіп, апа КТ. Вогснагаї. 1995. Спетісаї! Іпеїабійу ої Ргоївіп Рнаптасеціїсаіє: Меспапібтв ої Охідайоп апа 5ігаїецдіє5 ог зіабіїїганоп. Віотесппо!. Віоепд. 48:490-500).
Використовувані в цьому документі терміни «основні форми», «основна область» та «ВК» стосуються варіантів білка, наприклад, антитіла або його антигензв'язувальної області, які характеризуються загальним основним зарядом відносно варіанта первинного заряду, присутнього в білку. Наприклад, у препаратах рекомбінантного білка такі основні форми можуть бути виявлені за допомогою різних способів, як-от іонообмінна, наприклад, М/СХ-10 ВЕРХ (слабка катіонообмінна хроматографія) або ІЕЕ (ізоелектричне фокусування). Ілюстративні варіанти можуть включати без обмеження варіанти лізину, ізомеризацію аспарагінової кислоти, утворення сукциніміду на аспарагіні, окиснення метіоніну, амідування, неповне утворення дисульфідного зв'язку, мутація від серину до аргініну, аглікозилювання, фрагментація та агрегація. Зазвичай основні види елююються пізніше, ніж основний пік під час СЕХ або раніше, ніж основний пік під час аналізу АЕХ. (Спготайодгарпніс апаїузів ої пе асідіс апа Бравіс зресієз ої гесотбріпапі топосіопаї апіїродієз. МАБ5. 2012 ер 1; 4(5): 578-585. дої: 10,4161/тарз.21328, повний вміст якої включено в цей документ.)
У певних варіантах здійснення білкова композиція може містити більше одного типу варіанта основної форми. Наприклад, але не в якості обмеження, загальні основні форми можна розділити на категорії на основі хроматографічного часу утримування піків, що з'являються. Інший приклад, у якому загальні основні форми можуть бути розділені, може бути заснований на типі варіанта - варіанти, варіанти структури або фрагментації.
Як обговорюється для кислотних форм, термін «основні форми» не включає технологічні домішки, і основні форми можуть бути результатом отримання продукту (називаються в цьому документі як «основні форми, отримані з препарату»), або результатом зберігання (називаються в цьому документі як «утворені внаслідок зберігання основні форми»).
В одному ілюстративному варіанті здійснення кількість основних форм у композиції проти
МЕС порівняно з білком, що становить інтерес, може складати не більше близько 1595, 1495, 1395, 1295, 1195, 1090, ЗУ, 8 У, 790, бю, Зо, 4,590, 490, 3,50, Зв, 2,29ю, 2ю, 1,990, 1,890, 1,790, 1,690, 1,595, 1,495, 1,395, 1,295, 1,195, 195, 0,995, 0,895, 0,795, 0,695, 0,595, 0,495, 0,395, 0,295, 0,195, або 0,095 і варіює в межах одного або більше з попередніх. Приклади композицій проти МЕСЕ обговорюються нижче у розділі ІП. В одному аспекті композиція проти МЕСЕ може містити білок проти МЕСЕ, вибраний із групи, яка складається з афліберцепту, рекомбінантного МіпіТгар (приклади яких розкриті в патенті США Мо 7279159), 5сЕм та інших білків проти МЕСЕ. У переважному аспекті рекомбінантний білок, що становить інтерес, являє собою афліберцепт.
У контексті цього документа «матриця зразка» або «біологічний зразок» можуть бути отримані на будь-якій стадії біопроцесу, наприклад, рідина для культивування клітин (ССР), рідина для культивування зібраних клітин (НССЕ), на будь-якій стадії подальшого процесу обробки, лікарська речовина (05) або лікарський продукт (ОР), що містить кінцевий сформульований продукт. У деяких інших конкретних ілюстративних варіантах здійснення біологічний зразок може бути вибраний із будь-якої стадії подальшого процесу освітлення, хроматографічного отримання, вірусної інактивації або фільтрації. У деяких конкретних ілюстративних варіантах здійснення лікарський продукт може бути вибраний із виробленого лікарського продукту в ході клінічних випробувань, транспортування, зберігання або обігу.
Використовуваний у цьому документі термін «суб'єкт» стосується ссавця (наприклад, щура, миші, кішки, собаки, корови, вівці, коня, кози, кролика), переважно людини, яка потребує запобігання та/або лікування раку або ангіогенного захворювання очей. Суб'єкт може мати рак або ангіогенне захворювання очей, або бути схильним до розвитку раку або ангіогенного захворювання очей.
З точки зору складу білка, термін «стабільний» у контексті цього документа стосується білка, що становить інтерес, у складі, здатному зберігати прийнятний рівень хімічної структури або біологічної функції після зберігання в ілюстративних умовах, визначених у цьому документі. Склад може бути стабільним, навіть якщо білок, який міститься в ньому, що становить інтерес, не зберігає 10095 своєї хімічної структури або біологічної функції після зберігання протягом певного часу. За певних обставин підтримання близько 9095, близько 9595, близько 9695, близько 9790, близько 9895 або близько 9995 структури або функції білка після зберігання протягом певного часу може розглядатися як «стабільне».
Термін «лікувати» або «лікування» стосується терапевтичних заходів, які обертають назад, стабілізують або усувають небажане захворювання або розлад (наприклад, ангіогенне захворювання очей або рак), наприклад, викликаючи регрес, стабілізацію або усунення одного або більше симптомів або ознак такого захворювання або розладу в будь-якому клінічно вимірюваному ступені, наприклад, відносно ангіогенного захворювання очей, викликаючи зниження або підтримання показника тяжкості діабетичної ретинопатії (ОК55), за допомогою поліпшення або підтримання зору (наприклад, при найкращій корекції гостроти зору, наприклад, при вимірюванні збільшення літер ЕТОК5), збільшення або підтримання поля зору та/або зменшення або підтримання центральної товщини сітківки й, відносно раку, зупинка або обернення назад зростання, виживаності та/"або метастазування ракових клітин у суб'єкта.
Зазвичай терапевтичний захід являє собою введення однієї або більше доз терапевтично ефективної кількості МЕСЕ МіпіТгар суб'єкту із захворюванням або розладом.
Використовуваний у цьому документі термін «технологія попереднього процесу» в контексті отримання білка стосується дій, які включають отримання і збір білків із клітин під час або після клітинного культивування білка, що становить інтерес. Використовуваний у цьому документі термін «клітинна культура» стосується способу утворення і підтримання популяції клітин- господарів, здатних продукувати рекомбінантний білок, що становить інтерес, а також способів і методик оптимізації отримання і збору білка, що становить інтерес. Наприклад, одразу після введення вектора експресії у відповідну клітину-господаря, клітина-господар може підтримуватися в умовах, придатних для експресії відповідних послідовностей, що кодують нуклеотид, і збору та отримання необхідного рекомбінантного білка.
При використанні методик культивування клітин за цим винаходом білок, що становить інтерес, може бути продукований внутрішньоклітинно, в периплазматичному просторі або безпосередньо секретований у середовище. У варіантах здійснення, у яких білок, що становить інтерес, продукований внутрішньоклітинно, тверді залишки - або клітини-господарі, або лізовані клітини (наприклад, у результаті гомогенізації) можуть бути видалені за допомогою різних способів, включаючи, без обмеження, центрифугування або ультрафільтрацію. Якщо білок, що становить інтерес, секретується в середовище, супернатанти з таких систем експресії можуть бути спочатку сконцентровані з використанням комерційно доступного фільтра білків, наприклад, із використанням ультрафільтраційної установки Атісоп'М або Мійїроге Реїйсоп'м. В одному аспекті білок, що становить інтерес, може бути зібраний за допомогою центрифугування з подальшою глибинною фільтрацією, а потім афінною хроматографією для захоплення.
У контексті цього документа «антагоніст МЕСЕ» являє собою будь-який білок або пептид, який зв'язується або взаємодіє з МЕСЕ. Зазвичай це зв'язування або взаємодія інгібує зв'язування
МЕСЕ з його рецепторами (МЕСЕКІ і МЕСЕКЗ), та/або інгібує біологічні сигнальні шляхи та активність МЕСРЕ. Антагоністи МЕСЕ включають молекули, які перешкоджають взаємодії між МЕСЕ та природним рецептором МЕСЕ, наприклад, молекулами, які зв'язуються з МЕСЕ або рецептором
МЕСЕ та попереджають або іншим чином перешкоджають взаємодії між МЕСЕ та рецептором
МЕСР. Конкретні ілюстративні антагоністи МЕСЕ включають антитіла до МЕСЕ (наприклад, ранібізумаб (І ОСЕМТІБФ|), антитіла до рецептора МЕСЕ (наприклад, антитіла до МЕСЕКІ1, антитіла до МЕСЕК2, тощо) та химерні молекули на основі рецептора МЕСЕ або МЕСРЕ-інгібуючі злиті білки (також називаються в цьому документі «МЕСЕ-Тгар» або «МЕСЕ МіпіТгар»), як-от афліберцепт, зив-афліберцепт та білок, який має амінокислоту з 5ЕО І МО.: 60. Іншими прикладами МЕСЕ-Тгар є АГТ-19, М710, ЕУВ203 та СН5У-2020. Додаткові приклади МЕСЕ-Ттар можуть бути знайдені у патентах США Мо 7070959; 7306799; 7374757; 7374758; 7531173; 7608261; 5952199; 6100071; 6383486; 6897294 та 7771721, які конкретно включені в цей документ за допомогою посилання в усій своїй повноті.
Химерні молекули на основі рецептора МЕСЕ включають химерні поліпептиди, які містять два або більше імуноглобулін(Ід)-подібних домени рецептора МЕСЕ, як-от МЕСЕКІ (також позначений як ЕІ) та/або МЕСЕК2 (також позначений як РІК! або КОК), і можуть також містити мультимеризуючий домен (наприклад, домен Ес, який забезпечує мультимеризацію Інаприклад, димеризацію)| двох або більше химерних поліпептидів). Ілюстративною химерною молекулою на основі рецептора МЕСЕ є молекула, що називається МЕСЕК1К2-ЕсСАС1 (а) (також відома як афліберцепт; продається під торговою назвою ЕМІЕАФ). У певних ілюстративних варіантах здійснення афліберцепт містить викладену амінокислотну послідовність:
ЗОТОаВАРЕМЕМУ5ЕЇІРЕПНМТЕСВАЕЇ МІРСВУТЗРМІТМТІ ККЕРІ ОТП РОСКАПМОЗАКОИРИЗМАТУ
КЕІСІГ ТСЕАТУМОа
НгЕУКТММІ ТНВОТМТПОМУМІ 5РОНИЇЕЇ 5МОЕКІ М МСТАВТЕЇ ММа т ОЕМ! ЕМРОЗКНОНККІ УМА рікТОоБазЕМККЕ г ЗП ІрамУтАЗрОСІ УТСААЗЗаІ МІТІККМЗТЕУАУНЕКОКТНТСРРОРАРЕЇГ І СС РБЗУГБІ ЕРРКРК
ОТ МІЗАТРЕМТСМ
УУМОУЗНЕОРЕУКЕМУМУ УМО МЕМНМАКТКРАЕЕОУМЗТ УАМБ МІ ТМ НОБУУЛ МОКЕУКСКУЗМК
АЇ РАРІЕКТІЗКАКО
ОРРБЕЕРОМУТІ РРЗОВОЕЇ ТКМОМУ5І ТС УКОЕМРБОІАМЕМ ЕБМСОРЕММУКТТРРМІ О5раБЕРІ мМ
Зк тМоОКЗАМОО
СММЕ5СЗУМНЕАЇ НМНУТОКОБІ 5І 5РОК. (5ЕО І МО: 55)
У контексті цього документа «вірусна фільтрація» може включати фільтрацію з використанням придатних фільтрів, включаючи, без обмеження, Ріапома 20М"7М, 50 М або ВіоєЕх від Азайі Казеї
Ріагта, фільтри Мігезоїме"М від ЕМО Мійїроге, Мігозай СРМ від Запогіц5, або фільтр ОБброг ОМ20 або ОМ507М від РаїЇ Согрогайоп. Звичайному фахівцю в цій області буде очевидним вибір придатного фільтра для отримання необхідних характеристик фільтрації.
ІЇ. Визначення кольору
У контексті цього документа колір, що спостерігається в ході отримання рекомбінантного білка, конкретніше, білка проти МЕСЕ може бути визначений за допомогою різних способів.
Необмежувальні приклади включають застосування йодного індексу кольору, індексу кольору за
Хазеном, індексу кольору за Гарднером, індексу кольору за Ловібондом, індексу кольору за
Сейболтом, індексу кольору мінеральної олії, індексу кольору Європейської Фармакопеї, індексу кольору Фармакопеї США, СІЕ І", а", Б" (або СІЕГ АВ), індексу кольору за Клеттом, індексу кольору за Гессом-Івсом, індексу пожовтіння, індексу кольору АОМІ та АЗВС та індексу кольору пивоваріння ЕВС. Детальний опис цих шкал можна знайти у звіті про застосування Мо 3.9 е від
І апде, повний вміст якого включений у цей документ.
Візуальне зіставлення кольорів на основі Європейської фармакопеї (РП Еиг) (європейського еталона кольорів, див. Еигореап Рпаптасоровєїа. Спарієг 2.2.2. Оедгее ої соіогайоп ої Ідцід5. 8 ей. ЕР, повний вміст якої включений у цей документ) можуть включати підготовку розчину з еталонним кольором, як описано в Рі. Ениг. (ЕР 2.2.2. Оедгеє ої Соіогайіоп ої І ідціаз 2) - отримують три вихідні розчини для червоного (хлорид кобальту (ІЇ)), жовтого (хлорид заліза (ІІЇ)) і синього (сульфат міді (1І)) ї 195 хлоридної кислоти, п'ять кольорових еталонних розчинів для жовтого (У), зеленувато-жовтого (У), коричнево-жовтого (ВУ), коричневого (В) та червоного (К) відтінків. З використанням цих п'яти еталонних розчинів по черзі готують загалом тридцять сім розчинів із еталонним кольором (1-7, 1-57, ВУ1-8У7, В1-89 та К1-К7). Кожен еталонний розчин чітко визначений у колірному просторі СІЕ-І ар, наприклад, за яскравістю, відтінком та кольоровістю. Із семи стандартів жовто-коричневий (стандарти ВУ) ВУ1 є найбільш темним стандартом, а ВУ7 - найменш темним. Відповідність цього зразка стандарту кольору ВУ зазвичай виконується при розсіяному денному світлі. Композиції європейських стандартів жовто-коричневого кольору описані нижче в таблиці 1.
Таблиця 1
Композиція європейських стандартів жовто-коричневого кольору вм 7777771117177771111711111111100011111111111111111111110011
Коричнево-жовтий (ВУ) стандартний розчин 10,8 г/л РесСіз.6НгоО, 6,0 г/л СоСі».бНгО та 2,5 г/л бибО».5НгО
Випробування кольору рідин проводять у вигляді порівняння досліджуваного розчину зі стандартним колірним розчином. Композиція стандартного колірного розчину вибрана залежно від відтінку та інтенсивності кольору досліджуваного розчину. Зазвичай порівняння здійснюють у плоскодонних пробірках із безбарвного прозорого нейтрального скла, які максимально відповідають внутрішньому діаметру та в усіх інших аспектах (наприклад, пробірки діаметром близько 12, 15, 16 або 25 мм). Наприклад, порівняння може бути між 2 або 10 мл досліджуваного розчину та стандартного колірного розчину. Глибина рідин, наприклад, може становити 15, 25, 40 або 50 мм. Колір, присвоєний досліджуваному розчину, не має бути більш інтенсивним, ніж стандартний колір. Порівняння кольорів зазвичай проводять при розсіяному світлі (наприклад, денному світлі) на білому тлі. Кольори можна порівнювати за вертикальною або горизонтальною віссю пробірок.
На відміну від вимірювання кольору ЕР, монографія ОБР 1061 Соог - Інвіштепіа)!
Меазигетепі посилається на застосування вимірювання кольору СІЕ 1", а", Б" (або СІЕЇ АВ) для точної та об'єктивної кількісної оцінки кольорів. У Фармакопеї США визначено всього двадцять кольорових еталонних розчинів (позначених послідовно літерами від А до Т). Колір вимірюваного зразка автоматично корелює з колірними еталонними розчинами. Це означає, що відображається еталонний колірний розчин, найближчий до зразка (тобто, еталонний розчин із найменшою відмінністю кольору ДЕ" від кольору зразка). Значення АГ", Да" та ДЬ" дають кількісні відмінності між значеннями І", а" та р" зразка та відображуваними розчинами згідно з ОБР. Система координат СІЕ ГГ" а" Б", ГГ" представляє ступінь світлоти кольору за шкалою від 0 до 100, де 0 є найтемнішим, і 100 - найсвітліший, а" представляє почервоніння або зеленуватість кольору (позитивні значення а" представляють червоний колір, тоді як негативні значення а" представляють зелений колір), і Б" представляє жовтизну або блакитність зразка, позитивні значення р" представляють жовтий колір, а негативні значення Б" представляють синій колір.
Відмінність кольору від стандарту або вихідного зразка при оцінці може бути представлена зміною окремих колірних компонентів ДІ", Да" та ДБ". Складну зміну або відмінність у кольорі можна розрахувати як просту евклідову відстань у просторі згідно з формулою:. Колірні координати СІЕ
Ї", а", 65" можуть бути згенеровані, наприклад, із використанням Нипіег Габ5 ОпйгазсапРго (Нипіег
Авззосіасез І арогаїогу, Рестон, Вірджинія) або на ВУК Сагіпег І С5 ІМ (ВУК-Сагапег, Колумбія,
Меріленд). Для Нипіег арх Окгабсап Рго можна виконати випробування дидимієвого фільтра для калібрування довжини хвилі. Прилад може бути стандартизований у ТТЕКАМ із використанням вставки порту 0,780 дюйма та СІМ/ перед використанням; таким чином встановлюючи верхнє (І. - 100) та нижнє (І. - 0) значення фотометричної шкали з використанням світлової пастки та чорної карти. Див. РасК еї аїЇ., Модегпігайоп ої Рпузісаї Арреагапсе апіа боіЇшіоп Соіог Тевів Овіпд
Опцапійайме Тгівіітиив5 Соіогпітеїу: Ааймапіадез5, Наптпопігайоп, апа Маїїдайомп Бігаіедіев5, 3.
Ріпаптасешіса! сі. 104: 3299-3313 (2015), повний вміст якої включений в цей документ. Колір стандартів ВМ може бути виражений у колірному просторі СІЕ І", а", Б" (колірний простір «СІЕГ АВ» або «СІЕЇ аб»). Див. таблицю 2.
Таблиця 2
Характеристика європейських стандартів коричнево-жовтого кольору у колірному просторі СІЕ І", а", Б" "За повідомленням Раск еї аї. " Виміряно експериментально у цьому документі - значення 1" ії Б" кожного стандарту кольору ВУ.
Для забезпечення високопродуктивного скринінгу для аналізу кольору спосіб спектрофотометричного аналізу (СІЄЇ АВ) є більш придатним і кількісним показником, ніж стандарти кольору ВУ. Сурогатний аналіз був додатково оптимізований, як описано в розділі «Приклади».
Для будь-якого зі зразків, які оцінюються за кольором, білок у зразках має бути стандартизований відносно білка у зразку, наприклад, 5 г/л, 10 г/л тощо для порівняння.
І. Композиції проти МЕСЕ
Існує щонайменше п'ять членів сімейства білків МЕСЕ, які регулюють сигнальний шлях МЕСЕ:
МЕСБЕ-А, МЕСЕ-В, МЕСЕ-С, МЕСЕ-О та плацентарний фактор росту (РІСЕ). Композиції проти МЕСЕ можуть містити антагоніст МЕСЕ, який специфічно взаємодіє з одним або більше членами сімейства білків МЕСЕ та інгібує одну або більше його біологічних активностей, наприклад, його мітогенну, ангіогенну та/або активність відносно проникності судин.
В одному варіанті здійснення спосіб отримання білка проти МЕСЕ включає (а) забезпечення клітини-господаря, генетично сконструйованої для експресії білка проти МЕСЕ; (Б) культивування клітини-господаря в ХВС у придатних умовах, у яких клітина експресує білок проти МЕСБЕ; та (с) збір препарату білка проти МЕСЕ, продукованого клітиною. В одному аспекті білок проти МЕСЕ вибраний із групи, яка складається з афліберцепту, рекомбінантного МіпіТтар (приклади яких розкриті в патенті США Мо 7279159), зсЕм та інших білків проти МЕСЕ. У переважному аспекті рекомбінантний білок, що становить інтерес, являє собою афліберцепт.
Автори цього винаходу виявили, що виробництво білків проти МЕСЕ (наприклад, афліберцепту) у певних ХВС забезпечувало біологічний зразок, який має відмінний колір. Різні колірні властивості спостерігалися на різних стадіях виробництва і навіть у кінцевому складі, що містить білок проти МЕСЕ. Як спостерігали в прикладі У, для отримання МЕСЕ МіпіТгар культивування клітин у ХВС забезпечувало білок проти МЕСЕ (наприклад, афліберцепт) з інтенсивним жовто-коричневим кольором. Афінність стадії захоплення після збору також забезпечувало елюат, який має певний колір - жовто-коричневий колір. Подальші виробничі стадії з використанням АЕХ також показали жовто-коричневий колір, але з меншою інтенсивністю.
Згідно з більш детальним описом нижче, колір можна оцінювати за допомогою (і) європейського еталона ВУ, в якому проведений якісний візуальний огляд, або (ії) колориметричного аналізу, СІЕЇГ АВ, який є більш кількісним, ніж система ВУ. Проте, у будь-якому випадку, оцінка кольору між декількома зразками була нормалізована відносно концентрації білка з метою забезпечення змістовної оцінки/порівняння. Наприклад, відносно прикладу 9 нижче, зокрема, таблиці 9-2, елюат білка А має значення «Бр"» близько 2,52, що відповідає значенню ВУ близько ВУ5 (при вимірюванні в концентрації білка 5 г/л в елюаті білка А). Якщо колір елюату білка А слід порівнювати з іншим зразком, тоді порівняння слід виконувати з використанням тієї самої концентрації білка. Таким чином, при порівнянні елюату білка А з пулом АЕХ, який має значення ар" близько 0,74 (при вимірюванні з вмістом 5 г/л білка в елюаті білка А), спосіб отримання показує істотне зниження жовто-коричневого кольору зразка від елюату білка А до пулу АЕХ після хроматографії АЕХ.
Композиції за цим винаходом можуть характеризуватись жовто-коричневим кольором, як обговорюється в цьому документі, наприклад, не більш темним/інтенсивним, ніж європейський стандарт коричнево-жовтого кольору ВУ2-ВУЗ, ВУ3-В8У4, ВУ4-ВУ5 або ВУ5-ВУб та/або які мають значення Б" 17-23, 10-17, 5-10, 3-5 або 1-3, причому композиція містить близько 5 г/л білка проти
МЕСБЕ або близько 10 г/л білка проти МЕСРЕ, і при цьому композицію отримують у вигляді зразка з освітленого збору або елюату білка А освітленого збору.
В одному варіанті здійснення композиції за цим винаходом, отримані з використанням ХВС, забезпечують отримання біологічного зразка з відмінним жовто-коричневим кольором, причому зразок може характеризуватися визнаною стандартною колірною характеристикою: () не більш жовто-коричневий, ніж європейський стандарт кольору ВУ2; (ї) не більш жовто-коричневий, ніж європейський стандарт кольору ВУЗ; (її) не більш жовто-коричневий, ніж європейський стандарт кольору ВУ4; (м) не більш жовто-коричневий, ніж європейський стандарт кольору ВУ5; (у) між значеннями європейського еталона кольору ВУ2 та ВУЗ; (мі) між значеннями європейського еталона кольору ВУЗ та ВУ4; (мі) між значеннями європейського еталона кольору ВУ4 та ВУ5, причому композиція містить близько 5 г/л або близько 10 г/л білка проти МЕСЕ, і при цьому композиція отримана у вигляді зразка з елюату білка А освітленого збору.
В іншому варіанті здійснення композиції за цим винаходом, отримані з використанням А ХВС, забезпечують отримання біологічного зразка з жовто-коричневим кольором, причому композиція характеризується визнаною стандартною колірною характеристикою за шкалою СІЕЇГ АВ: () не більш жовто-коричневий, ніж значення Б" близько 22-23; (ї) не більш жовто-коричневий, ніж значення Б" близько 16-17; (її) не більш жовто-коричневий, ніж значення Б" 9-10; (м) не більш жовто-коричневий, ніж значення р" 4-5; (у) не більш жовто-коричневий, ніж значення р" 2-3; (мі) значення Б" від 17 до 23; (мії) значення Б" від 10 до 17; (мії) значення Б" від 5 до 10; (їх) значення Б" від З до 5; або (х) значення Б" від 1 до З, причому композиція містить близько 5 г/л або близько 10 г/л білка проти МЕСЕ, і при цьому композиція отримана у вигляді зразка з елюату білка А освітленого збору.
В одному варіанті здійснення композиції за цим винаходом, отримані з використанням ХВС, можуть містити інші форми або варіанти білка проти МЕС. Ці варіанти включають ізоформи білка проти МЕС, які містять один або більше амінокислотних окиснених залишків, які спільно називаються оксо-варіантами. Ферментативне розщеплення таких композицій, що містять білок проти МЕСЕ та його оксо-варіанти, може включати одне або більше з такого:
ЕІСІ ГТО"ЕАТУМОН" УК (ЗЕО ІО МО: 18), яка містить близько 0,004-0,0139»5 2-оксо-гістидинів,
ОТМТПІОММІ 5РОН"СІБЕЇ 5МОЕК (5ЕБО ІЮО МО: 19), яка містить близько 0,006-0,02895 2-оксо- гістидинів,
ТЕСММОСІЮЕМУМЕМРЗБКН'ОНК (З5ЕБО ІО МО: 20), яка містить близько 0,049-0,08595 2-оксо- гістидинів,
ОКТН"ТС"РРОС"РАРЕЇ І о (5ЕО ІО МО: 17), яка містить близько 0,057-0,09295 2-оксо-гістидинів,
ТМУТН"К (ЗЕО ІО МО: 21), яка містить близько 0,008-0,0229»5 2-оксо-гістидинів, та/або
ІМ/О5БК (5ЕО ІО МО: 56), яка містить близько 0,185-0,29895 діокисненого триптофану; або
ЕІСІ Г/ТО"ЕАТУМОН" МУК (ЗЕО ІО МО: 18), яка містить близько 0,00895 2-оксо-гістидинів,
ОТМТІПОМУМІ 5РОЗН'"СІЕЇ 5МОЕК (5ЕО ІЮО МО: 19), яка містить близько 0,0295 2-оксо-гістидинів,
ТЕСММОСІЮЕМУМЕМРЗКН"ОНК (5ЕО ІЮО МО: 20), яка містить близько 0,0695 2-оксо-гістидинів,
ОКТН"ТС"РРО"РАРЕЇ І о (5ЕО ІО МО: 17), яка містить близько 0,0795 2-оксо-гістидинів,
ТМУТН"К (ЗЕО ІО МО: 21), яка містить близько 0,0195 2-оксо-гістидинів, та/або
ІМ/О5К (5ЕО ІО МО: 56), яка містить близько 0,2395 ди-оксо-триптофанів, де Н" являє собою гістидин, який може бути окиснений до 2-оксо-гістидину, і де С" являє собою цистеїн, який може бути карбоксиметильований. У конкретних варіантах здійснення білок проти МЕСЕ являє собою афліберцепт. В іншому варіанті здійснення білок проти МЕСЕ являє собою МЕСЕ МіпіТгар.
В одному ілюстративному варіанті здійснення цього винаходу композиції за цим винаходом можуть містити білок проти МЕСЕ, причому не більше близько 195, не більше 0,195 або близько 0,1-196, 0,2-195, 0,3-195, 0,4-195, 0,5-195, 0,6-195, 0,7-195, 0,8-195 або 0,9-195 залишків гістидину білка проти МЕСЕ являють собою 2-оксо-гістидин. У таких композиціях може бути неоднорідна популяція варіантів білка проти МЕСЕ, кожен із яких має змінну кількість залишків 2-оксо-гістидину і неокиснених залишків гістидину. Таким чином, відсотковий вміст білка 2-оксо-гістидину проти
МЕСЕ у композиції стосується сайт-специфічних 2-оксо-гістидинів серед молекул проти МЕСЕ, розділений на загальну кількість сайт-специфічних гістидинів у молекулах білка проти МЕСЕ (окиснений плюс неокиснений), помножену на 100. Одним із способів кількісного визначення рівня 2-оксо-гістидинів у композиції є розщеплення поліпептида протєеазою (наприклад, ІГуз-С та/або трипсином) та аналіз кількості 2-оксо-гістидинів в утворених пептидах, наприклад, за допомогою мас-спектрометрії (МС).
Перед розщепленням білка проти МЕСЕ сульфгідрильні групи цистеїнів блокуються реакцією з йодацетамідом (ІАМ), внаслідок чого утворюється залишок, представлений такою хімічною структурою:
МН
Білок тег 7 о
Така модифікація захищає вільні тіоли від повторного утворення дисульфідних місточків та запобігає розщепленню дисульфідних зв'язків. Цей винахід включає композиції (наприклад, водні композиції), що містять білок проти МЕСЕ та його варіанти, які при модифікації ІАМ та розщепленні протеазою (наприклад, ГІ уз-С і трипсином) та аналізі за допомогою мас-спектрометрії містять такі пептиди:
ЕС ТО"ЕАТУМОН" УК (5ЕО ІО МО: 18), яка містить близько 0,004-0,0139»5 2-оксо-гістидинів,
ОТМТПІОММІ 5РОН"СІБЕЇ 5МОЕК (5ЕБО ІЮО МО: 19), яка містить близько 0,006-0,02895 2-оксо- гістидинів,
ТЕСММОСІЮЕМУМЕМРЗБКН'ОНК (З5ЕБО ІО МО: 20), яка містить близько 0,049-0,08595 2-оксо- гістидинів,
ОКТН"ТС"РРОС"РАРЕЇ І о (5ЕО ІО МО: 17), яка містить близько 0,057-0,09295 2-оксо-гістидинів,
ТМУТН"К (ЗЕО ІО МО: 21), яка містить близько 0,008-0,0229»5 2-оксо-гістидинів, та/або
ІМ/О5БК (5ЕО ІО МО: 56), яка містить близько 0,185-0,29895 діокисненого триптофану; або
ЕІСІ Г/ТО"ЕАТУМОН" МУК (ЗЕО ІО МО: 18), яка містить близько 0,00895 2-оксо-гістидинів,
ОТМТПОММІ 5РЗНУСІБЕЇ 5МОЕК (5ЕО ІЮО МО: 19), яка містить близько 0,0295 2-оксо-гістидинів,
ТЕСММОСІЮЕМУМЕМРЗКН"ОНК (5ЕО ІЮО МО: 20), яка містить близько 0,0695 2-оксо-гістидинів,
ОКТН"ТС"РРО"РАРЕЇ І о (5ЕО ІО МО: 17), яка містить близько 0,0795 2-оксо-гістидинів,
ТМУТН"К (ЗЕО ІО МО: 21), яка містить близько 0,0195 2-оксо-гістидинів, та/або
ІПМ/О5БК (5ЕО ІО МО: 56), яка містить близько 0,2395 ди-оксо-триптофанів, де Н" являє собою 2-оксо-гістидин, і де С" являє собою карбоксиметильований цистеїн. В одному варіанті здійснення цього винаходу пептиди деглікозильовані за допомогою РМюО-ази Е.
Цей винахід включає композиції, що містять білок проти МЕСЕ, причому близько 0,1-1095 всіх гістидинів білел«а проти МЕСЕ модифіковані до 2-оксо-гістидину. Крім того, колір композиції не більш темний/інтенсивний, ніж, наприклад, європейський стандарт коричнево-жовтого кольору вУу2-ВУЗ, 8У3-ВУ4, ВУ4-ВУ5 або ВУ5-ВУб, або, в якості альтернативи, який має значення Б", як охарактеризовано за допомогою СІЕ 1", а", Б" від близько 17-23, 10-17, 5-10, 3-5, або 1-3, причому композиція містить близько 5 г/л або близько 10 г/л білка проти МЕСЕ. Композицію отримують або у вигляді зразка з освітленого збору, або у вигляді елюату білка А з освітленого збору. Такі композиції можуть бути отримані з освітленого збору, якщо зібраний матеріал піддають процедурі хроматографії для захоплення. В одному аспекті стадія захоплення являє собою процедуру афінної хроматографії з використанням, наприклад, афінної колонки з білком А. Якщо афінний зразок аналізують з використанням рідинної хроматографії - мас-спектрометрії (ЖХ-МС), можуть бути виявлені один або більше варіантів.
Цей винахід включає композиції, що містять білок проти МЕСЕ, причому близько 0,1-1095 всіх триптофанів білка проти МЕСЕ модифіковані до кінуреніну. Крім того, колір композиції не більш темний/інтенсивний, ніж європейський стандарт коричнево-жовтого кольору ВУ2-ВУЗ, ВУЗ-ВУ4,
ВУ4-ВУ5 або ВУ5-ВУб та/або має значення Б", як охарактеризовано за допомогою СІЕ Ї", ах, Б" близько 17-23, 10-17, 5-10, 3-5, або 1-3, причому композиція містить близько 5 г/л білка проти
МЕСБЕ або близько 10 г/л білка проти МЕСЕ. Композицію отримують у вигляді зразка з освітленого збору або елюату білка А з освітленого збору. Такі композиції можуть бути отримані з освітленого збору при процедурі хроматографії для захоплення. Стадія захоплення являє собою процедуру афінної хроматографії з використанням, наприклад, афінної колонки з білюом А. Якщо афінний зразок аналізують з використанням рідинної хроматографії - мас-спектрометрії (ЖХ-МС), можуть бути виявлені один або більше цих варіантів.
Цей винахід включає композиції, що містять білок проти МЕСЕ, причому близько 0,195-1095 всіх триптофанів білка проти МЕСЕ модифіковані до моно-гідроксилтриптофану. Крім того, колір композиції не більш темний/інтенсивний, ніж європейський стандарт коричнево-жовтого кольору вуУ2-ВУЗ, ВУЗ3-8У4, ВУ4-ВУ5 або ВУ5-ВУб та/або має значення Бр", як охарактеризовано за допомогою СІЕ І", а ", Б" від близько 17-23, 10-17, 5-10, 3-5, або 1-3, причому композиція містить близько 5 г/л білка проти МЕСЕ або близько 10 г/л білка проти МЕСЕ. Композицію отримують у вигляді зразка з освітленого збору або елюату білка А з освітленого збору. Такі композиції можуть бути отримані з освітленого збору при процедурі хроматографії для захоплення. Стадія захоплення являє собою процедуру афінної хроматографії з використанням, наприклад, афінної колонки з білююм А. Якщо зразок, вилучений на стадії афінності, аналізують з використанням рідинної хроматографії - мас-спектрометрії (РХ-МС), можуть бути виявлені один або більше цих варіантів.
Цей винахід включає композиції, що містять білок проти МЕСЕ, причому близько 0,195-1095 всіх триптофанів білка проти МЕСЕ модифіковані до ди-гідроксилтриптофану. Крім того, колір не більш темний/інтенсивний, ніж європейський стандарт коричнево-жовтого кольору ВУ2-ВУЗ, ВУЗ3-
ВУ4, ВУ4-ВУ5 або ВУ5-ВУб та/або має значення Б", як охарактеризовано за допомогою СІЕ 1", а", р" від близько 17-23, 10-17, 5-10, 3-5, або 1-3, причому композиція містить близько 5 г/л білка проти МЕСЕ або близько 10 г/л білка проти МЕСЕ. Композицію отримують у вигляді зразка з освітленого збору або елюату білка А з освітленого збору. Такі композиції можуть бути отримані з освітленого збору, отриманого з використанням ХВС, що містить білок проти МЕСЕ, а також його оксо-варіанти, піддані процедурі хроматографії для захоплення. Стадія захоплення являє собою процедуру афінної хроматографії з використанням, наприклад, афінної колонки з білком А. Якщо зразок, вилучений на стадії афінності, аналізують з використанням рідинної хроматографії - мас- спектрометрії (РХ-МС), можуть бути виявлені один або більше цих варіантів.
Цей винахід включає композиції, що містять білок проти МЕСЕ, причому близько 0,195-1095 всіх триптофанів білка проти МЕСЕ модифіковані до три-гідроксилтриптофану. Крім того, колір композиції не більш темний/інтенсивний, ніж європейський стандарт коричнево-жовтого кольору вуУ2-ВУЗ, ВУЗ3-8У4, ВУ4-ВУ5 або ВУ5-ВУб та/або має значення Бр", як охарактеризовано за допомогою СІЕ 1", а ", Б" від близько 17-23, 10-17, 5-10, 3-5, або 1-3, причому композиція містить близько 5 г/л білка проти МЕСЕ або близько 10 г/л білка проти МЕСЕ. Композицію отримують у вигляді зразка з освітленого збору або елюату білка А з освітленого збору. Такі композиції можуть бути отримані за допомогою хроматографії для захоплення. Стадія захоплення являє собою процедуру афінної хроматографії з використанням, наприклад, афінної колонки з білком А. Якщо зразок, вилучений на афінності, аналізують з використанням рідинної хроматографії-мас- спектрометрії (РХ-МС), можуть бути виявлені один або більше цих варіантів.
В одному варіанті здійснення композиції за цим винаходом можуть містити білок проти МЕСЕ, причому білок проти МЕСЕ може характеризуватись модифікаціями одного або більше залишків таким чином: один або більше аспарагінів дезамідовані; одна або більше аспарагінових кислот перетворені на ізо-аспартат та/або аспарагін; один або більше метіонінів окиснені; один або більше триптофанів перетворені на М-формілкінуренін; один або більше триптофанів являють собою моно-гідроксилтриптофан; один або більше триптофанів являють собою ди-
гідроксилтриптофан; один або більше триптофанів являють собою три-гідроксилтриптофан; один або більше аргінінів перетворені на Ага З-дезоксиглюкозон; С-кінцевий гліцин відсутній; та/або існує один або більше неглікозильованих глікосайтів.
Такі композиції можуть бути отримані з освітленого збору, отриманого з використанням ХВС, що містить білок проти МЕСЕ, а також його варіанти, піддані, наприклад, процедурі хроматографії для захоплення. Стадія захоплення являє собою процедуру афінної хроматографії з використанням, наприклад, колонки з білююом А. Якщо зразок, вилучений на стадії афінності, аналізують, наприклад, із використанням рідинної хроматографії мас-спектрометрії (РХ-МОС), можуть бути виявлені один або більше цих варіантів.
В одному ілюстративному варіанті здійснення композиції за цим винаходом можуть містити білок проти МЕСЕ, що має однакові структурні характеристики афліберцепту, який може бути окиснений на одному або більше з такого: Ніз86б, Ніз110, Ніз145, Ніз209, Ніз95, Ніз19 та/або
Ніз203 (або еквівалентних положеннях залишку на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту); Тгр58 та/або Тгр138 (або еквівалентних положеннях залишку на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту); Тугб4 (або еквівалентних положеннях на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту); Рпе44 та/або Ріпе16б (або еквівалентних положеннях залишку на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту); та/л?або Мем, Меї 20,
Меї!163 та/або Ме!192 (або еквівалентних положеннях залишку на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту). Такі композиції можуть бути отримані з освітленого збору з використанням ХВС, містить афліберцепт, а також його оксо-варіанти, піддані процедурі хроматографії для захоплення. Стадія захоплення може бути процедурою афінної хроматографії з використанням, наприклад, колонки з білком А. Якщо зразок, вилучений на стадії афінності, аналізують, наприклад, із використанням рідинної хроматографії-мас-спектрометрії (РХ-МС), можуть бути виявлені один або більше цих варіантів.
В одному варіанті здійснення композиції за цим винаходом можуть містити МЕСЕ МіпіТгар з амінокислотною послідовністю 5ЕО І МО. 46, який може бути окиснений на Нівз8б, Нів110,
Ніз145, Ніз209, Ніз95, Ніз19 та/або Ніз203; Тгр58 та/або Тгр138; Тугб4; Рпе44 та/або Рпе166; та/або Мей0, Меї 20, Ме! 163 та/або Ме 192. Такі композиції можуть бути отримані з освітленого збору, отриманого з використанням ХВС, що містить МЕСЕ МіпіТгар, а також варіанти, піддані процедурі хроматографії для захоплення. Стадія захоплення являє собою процедуру афінної хроматографії з використанням, наприклад, колонки з білком А - при аналізі з використанням рідинної хроматографії - мас-спектрометрії (РХ-МС) можуть бути виявлені один або більше цих варіантів.
У деяких ілюстративних варіантах здійснення композиції за цим винаходом можуть містити білок проти МЕСЕ і його варіанти (в тому числі оксо-варіанти), причому кількість білкових варіантів у композиції може складати не більше близько 2095, 1995, 18905, 1795, 1695, 1595, 1495, 1395, 1295, 1195, 1095, УЗую, був, 79Ую, був, 5Ую, 4,590, 490, З,5Ую, ЗУ, 2,00, 2ю, 1,990, 1,890, 1,790, 1,690, 1,590, 1,495, 1,395, 1,295, 1,195, 195, 0,995, 0,895, 0,795, 0,695, 0,595, 0,495, 0,395, 0,295, 0,195 або 0,095 і варіює в межах одного або більше з попередніх. Такі композиції можуть бути отримані з освітленого збору, отриманого з використанням ХВС, що містить білок проти МЕСЕ, а також його варіанти, піддані процедурі хроматографії для захоплення. Стадія захоплення являє собою процедуру афінної хроматографії з використанням, наприклад, колонки з білком А - при аналізі з використанням рідинної хроматографії - мас-спектрометрії (РХ-МС) можуть бути виявлені один або більше цих варіантів. В одному аспекті колір такої композиції не темніше/інтенсивніше, ніж, наприклад, європейський стандарт коричнево-жовтого кольору ВУ2-ВУЗ, ВУ3-ВУ4, ВУ4-ВУ5 або
ВУ5-ВУб та/або який має значення Б", характеризоване СІЕ 1", а", Б" від близько 17-23, 10-17, 5- 10, 3-5 або 1-3, причому композиція містить близько 5 г/л або близько 10 г/л білка проти МЕСЕ.
В інших ілюстративних варіантах здійснення композиції за цим винаходом може містити білок проти МЕСЕ та його варіанти, причому кількість білкових варіантів у композиції може складати від близько 095 до близько 2095, наприклад, від близько 095 до близько 2095, від близько 0,0595 до близько 2095, від близько 0,195 до близько 20905, від близько 0,295 до близько 2095, від близько 0,395 до близько 20905, від близько 0,495 до близько 2095, від близько 0,595 до близько 2095, від близько 0,695 до близько 2095, від близько 0,795 до близько 2095, від близько 0,895 до близько 2095, від близько 0,995 до близько 2095, від близько 195 до близько 2095, від близько 1,595 до близько 2095, від близько 295 до близько 2090, від близько 3956 до близько 2095, від близько 495 до близько 2095, від близько 595 до близько 2095, від близько 695 до близько 2095, від близько 795 до близько 2095, від близько 895 до близько 2095, від близько 995 до близько 20905, від близько 1095 до близько 2095, від близько 095 до близько 1095, від близько 0,0595 до близько 1095, від близько 0,195 до близько 10905, від близько 0,295 до близько 10905, від близько 0,395 до близько 1095, від близько 0,495 до близько 1095, від близько 0,595 до близько 1095, від близько 0,695 до близько 1095, від близько 0,796 до близько 1095, від близько 0,896 до близько 1095, від близько 0,995 до близько 1095, від близько 195 до близько 1095, від близько 1,595 до близько 1095, від близько 295 до близько 1095, від близько 395 до близько 1095, від близько 495 до близько 1095, від близько 595 до близько 1095, від близько 695 до близько 1095, від близько 79о до близько 1095, від близько 895 до близько 1095, від близько 995 до близько 1095, від близько 09о до близько 7,595, від близько 0,0595 до близько 7,595, від близько 0,195 до близько 7,595, від близько 0,295 до близько 7,595, від близько 0,395 до близько 7,595, від близько 0,495 до близько 7,595, від близько 0,595 до близько 7,5 о, від близько 0,695 до близько 7,590, від близько 0,795 до близько 7,590, від близько 0,895 до близько 7,595, від близько 0,995 до близько 7,595, від близько 195 до близько 7,595, від близько 1,595 до близько 7,590, від близько 295 до близько 7,595, від близько 395 до близько 7,595, близько 495 до близько 7,595, від близько 595 до близько 7,595, від близько бю до близько 7,590, від близько 795 до близько 7,595, від близько 095 до близько 595, від близько 0,059 до близько 595, від близько 0,195 до близько 595, від близько 0,295 до близько 595, від близько 0,395 до близько 595, від близько 0,495 до близько 595, від близько 0,595 до близько 595, від близько 0,695 до близько
БУ, від близько 0,796 до близько 5905, від близько 0,895 до близько 595, від близько 0,995 до близько 595, від близько 195 до близько 595, від близько 1,595о до близько 595, від близько 295 до близько 595, від близько 395 до близько 595, від близько 495 до близько 595 і варіює в межах одного або більше з попередніх. Такі композиції можуть бути отримані хроматографією для захоплення на зібраному зразку. Стадія захоплення являє собою процедуру афінної хроматографії з використанням, наприклад, колонки з білком А. Якщо зразок аналізують з використанням рідинної хроматографії - мас-спектрометрії (РХ-МС), можуть бути виявлені один або більше цих варіантів. В одному аспекті колір такої композиції не темніше/інтенсивніше, ніж, наприклад, європейський стандарт коричнево-жовтого кольору ВУ2-ВУЗ, ВУ3-ВУ4, ВУ4-ВУ5 або
ВУ5-ВУб та/або який має значення Б", характеризоване СІЕ 1", а", Б" від близько 17-23, 10-17, 5- 10, 3-5 або 1-3, причому композиція містить близько 5 г/л або близько 10 г/л білка проти МЕСЕ.
В одному варіанті здійснення композиції за цим винаходом можуть містити білок проти МЕСЕ, у тому числі його кислотні форми, причому кількість кислотних форм композиції може становити близько 2095, 19905, 18905, 1795, 1695, 1595, 1495, 1395, 1295, 1195, 1095, 995, 890, 790, б Зо, Бо, 4,5, 4905, 3,50, Зо, 2,50, 2Уо, 1,995, 1,890, 1,790, 1,695, 1,590, 1,490, 1,390, 1,20, 1,190, 190, 0,990, 0,89, 0,795, 0,695, 0,595, 0,495, 0,395, 0,295, 0,195 або 0,095 та варіює в межах одного або більше з попередніх. Як обговорювалося вище, такі кислотні форми можуть бути виявлені за допомогою різних способів, як-от іонний обмін, наприклад, МУСХ (МУСХ-10 ВЕРХ, слабка катіонообмінна хроматографія) або ІЕЕ (ізоелектричне фокусування). Зазвичай кислотні форми елююються раніше основного піку під час СЕХ або пізніше основного піку під час аналізу АЕХ (див. фіг. 16 і фіг. 17). Композиції, які містять кислотні форми, можуть бути отримані з біологічного матеріалу, як-от збір, або отриманий за допомогою афінності матеріал із використанням іонообмінної хроматографії.
В одному аспекті колір такої композиції не темніший/інтенсивніший, ніж, наприклад, європейський стандарт коричнево-жовтого кольору ВУ2-ВУЗ, ВУ3-В8У4, ВУ4-В8У5 або ВУ5-ВУб6 та/або має значення Б", характеризоване СІЕ 1", а", Б" від близько 17-23, 10-17, 5-10, 3-5 або 1-3, причому композиція містить близько 5 г/л або близько 10 г/л. В якості прикладу, посилаючись на фіг. 16 ї фіг. 17, фракції Е1 та Б2 означають кислотні фракції, які містять більшість кислотних форм. Піки 1 ї 2 МТ на фіг. 17 містять кислотні форми, а фракції Е1 та Е2 містять більшість кислотних фракцій. Фракції, що містять такі кислотні форми (Е1 та Е2), також продемонстрували жовто-коричневий колір порівняно з іншими фракціями (фіг. 188 і фіг. 183).
В інших ілюстративних варіантах здійснення композиції за цим винаходом можуть містити білок проти МЕСЕ і його кислотні форми, причому кількість кислотних форм у композиції може складати від близько 095 до близько 2095, наприклад, від близько 095 до близько 20 95, від близько 0,0595 до близько 2095, від близько 0,195 до близько 2095, від близько 0,295 до близько 2095, від близько 0,395 до близько 2095, від близько 0,495 до близько 2095, від близько 0,595 до близько 2095, від близько 0,695 до близько 2095, від близько 0,796 до близько 2095, від близько 0,895 до близько 2095, від близько 0,995 до близько 20905, від близько 195 до близько 20905, від близько 1,590 до близько 20905, від близько 295 до близько 2095, від близько 395 до близько 2095, від близько 495 до близько 2095, від близько 595 до близько 2095, від близько бо до близько 2095, від близько 790 до близько 20905, від близько 895 до близько 2095, від близько 995 до близько 2095, від близько 1095 до близько 2095, від близько 095 до близько 1095, від близько 0,0595 до близько 1095, від близько 0,195 до близько 1095, від близько 0,295 до близько 1095, від близько 0,395 до близько 1095, від близько 0,495 до близько 1095, від близько 0,595 до близько 1095, від близько 0,695 до близько 1095, від близько 0,796 до близько 1095, від близько 0,896 до близько 1095, від близько 0,995 до близько 1095, від близько 195 до близько 1095, від близько 1,595 до близько 1095, від близько 295 до близько 1095, від близько 395 до близько 1095, від близько 495 до близько 1090, від близько 595 до близько 1095, від близько 695 до близько 1095, від близько 79о до близько 1095, від близько 895 до близько 1095, від близько 995 до близько 1095, від близько 09о до близько 7,595, від близько 0,0595 до близько 7,595, від близько 0,195 до близько 7,590, від близько 0,295 до близько 7,595, від близько 0,395 до близько 7,595, від близько 0,495 до близько 7,595, від близько 0,595 до близько 7,595, від близько 0,695 до близько 7,595, від близько 0,795 до близько 7,595, від близько 0,895 до близько 7,595, від близько 0,995 до близько 7,595, від близько 1956 до близько 7,595, від близько 1,595 до близько 7,590, від близько 295 до близько 7,595, від близько 395 до близько 7,595, близько 495 до близько 7,595, від близько 595 до близько 7,595, від близько бю до близько 7,590, від близько 795 до близько 7,590, від близько 095 до близько 595, від близько 0,059 до близько 595, від близько 0,195 до близько 595, від близько 0,295 до близько 595, від близько 0,395 до близько 595, від близько 0,495 до близько 595, від близько 0,595 до близько 595, від близько 0,695 до близько
БУ, від близько 0,795 до близько 595, від близько 0,895 до близько 595, від близько 0,995 до близько 595, від близько 195 до близько 595, від близько 1,595о до близько 595, від близько 295 до близько 595, від близько 395 до близько 595, від близько 495 до близько 595 і варіює в межах одного або більше з попередніх. Як обговорювалося вище, такі кислотні форми можуть бути виявлені за допомогою різних способів, як-от іонний обмін, наприклад, М/СХ (МУСХ-10 ВЕРХ, слабка катіонообмінна хроматографія) або ІЕЕ (ізоелектричне фокусування). Зазвичай кислотні форми елююються раніше основного піку під час СЕХ або пізніше основного піку під час аналізу
АЕХ (див. фіг. 16 і фіг. 17).
При використанні катіонообмінної колонки всі піки, елюйовані до основного піку, що становить інтерес, підсумовувалися як кислотна область, а всі піки, елюйовані після білка, що становить інтерес, підсумовувалися як основна область. В ілюстративних варіантах здійснення кислотні форми можуть бути елюйовані у вигляді двох або більше кислотних областей і можуть бути пронумеровані як АКТ, АК2, АКЗ тощо на основі певного часу утримування піків та іонообмінної колонки.
В одному варіанті здійснення композиції можуть містити білок проти МЕСЕ, у тому числі кислотні форми, причому АК! складає 2095, 1595, 1495, 1395, 12905, 1195, 1095, УУо, ВУ, 790, бю, 590, 4,595, 495, 3,2, ЗУю, 2,505, 2Ую, 1,9Уо, 1,890, 1,790, 1,690, 1,590, 1,495, 1,30, 1,290, 1,195, 190, 0,990, 0,895, 0,790, 0,6, 0,590, 0,49, 0,390, 0,290, 0,195 або 0,095, та варіює в межах одного або більше з попередніх. В одному аспекті композиції можуть містити білок проти МЕСЕ, у тому числі його кислотні форми, причому АКТ становить від близько 0,095 до близько 1095, від близько 0,095 до близько 595, від близько 0,095 до близько 495, від близько 0,095 до близько 395, від близько 0,0 95 до близько 2 95, від близько 395 до близько 595, від близько 595 до близько 8905, від близько 895 до близько 1095, або від близько 1095 до близько 1595, і варіює в межах одного або більше попередніх. Як обговорювалося вище, такі кислотні області можуть бути виявлені за допомогою різних способів, як-от іонний обмін, наприклад, МУСХ (МУСХ-10 ВЕРХ, слабка катіонообмінна хроматографія) або ІЕЕ (ізоелектричне фокусування). Зазвичай кислотні форми елююються раніше основного піку під час СЕХ або пізніше основного піку під час аналізу АЕХ (див. фіг. 16 і фіг. 17).
В іншому варіанті здійснення композиції можуть містити білок проти МЕСЕ, у тому числі кислотні форми, причому АК2 складає 2095, 1595, 1495, 1395, 1295, 1195, 1095, 990, 890, 7905, бо, 590, 4,595, 490, 3,590, Зо, 2,90, 2, 1,990, 1,890, 1,790, 1,690, 1,5 90, 1,4 Уо, 1,390, 1,290, 1,19, 190, 0,990, 0,895, 0,790, 0,6, 0,590, 0,49, 0,390, 0,290, 0,195 або 0,095, та варіює в межах одного або більше з попередніх. В одному аспекті композиції можуть містити білок проти МЕСЕ, у тому числі кислотні форми, причому АК2 становить від близько 0,095 до близько 1095, від близько 0,095 до близько 595, від близько 0,095 до близько 495, від близько 0,095 до близько 395, від близько 0,0 95 до близько 2 95, від близько 395 до близько 595, від близько 595 до близько 895, від близько 895 до близько 1095, або від близько 1095 до близько 1595, і варіює в межах одного або більше попередніх.
В одному варіанті здійснення композиції можуть містити білок проти МЕСЕ, у тому числі його основні форми, причому кількість основних форм композиції може становити не більше близько 2096, 1990, 1896, 1796, 16905, 1595, 1495, 13905, 1295, 11 Зв, 10 96, 9 ув, 890, 79, бою, бУю, 4,590, 495,
ЗБ, Зв, 2,090, 2ю, 1,99, 1,890, 1,7, 1,66, 1,5, 1,4, 1, 12, 1,190, 19, 0,9, 0,8, 0,7, 0,695, 0,595, 0,495, 0,390, 0,295, 0,195 або 0,095 та варіює в межах одного або більше з попередніх. В одному аспекті композиції можуть містити білок проти МЕСЕ та його основні форми, причому кількість основних форм у композиції в порівнянні з білюом проти МЕСЕ може складати від 095 до близько 2095, наприклад, від близько 095 до близько 2095, від близько 0,0595 до близько 2095, від близько 0,195 до близько 2095, від близько 0,295 до близько 2095, від близько 0,395 до близько 2095, від близько 0,495 до близько 2095, від близько 0,595 до близько 2095, від близько 0,695 до близько 2095, від близько 0,795 до близько 2095, від близько 0,895 до близько 2095, від близько 0,995 до близько 2095, від близько 195 до близько 2095, від близько 1,595 до близько 2095, від близько 295 до близько 2095, від близько 395 до близько 20905, від близько 495 до близько 2095, від близько 595 до близько 2095, від близько 695 до близько 20905, від близько 795 до близько 20905, від близько 895 до близько 2095, від близько 995 до близько 2095, від близько 1095 до близько 2095, від близько 095 до близько 1095, від близько 0,0595 до близько 10 95, від близько 0,195 до близько 1095, від близько 0,295 до близько 1095, від близько 0,396 до близько 1095, від близько 0,495 до близько 1095, від близько 0,595 до близько 10905, від близько 0,695 до близько 1095, від близько 0,795 до близько 10905, від близько 0,895 до близько 10905, від близько 0,995 до близько 1095, від близько 195 до близько 1095, від близько 1,595 до близько 1095, від близько 295 до близько 10 95, від близько 395 до близько 1095, від близько 495 до близько 1095, від близько 595 до близько 10905, від близько 695 до близько 1095, від близько 790 до близько 1095, від близько 895 до близько 1095, від близько 995 до близько 1095, від близько 095 до близько 7,595, від близько 0,0595 до близько 7,595, від близько 0,195 до близько 7,595, від близько 0,295 до близько 7,595, від близько 0,395 до близько 7,595, від близько 0,495 до близько 7,595, від близько 0,595 до близько 7,595, від близько 0,695 до близько 7,595, від близько 0,795 до близько 7,590, від близько 0,895 до близько 7,595, від близько 0,995 до близько 7,590, від близько 195 до близько 7,595, від близько 1,5 95 до близько 7,5 ую, від близько 295 до близько 7,595, від близько 395 до близько 7,595, від близько 495 до близько 7,595, від близько 595 до близько 7,595, від близько бю до близько 7,595, від близько 795 до близько 7,595, від близько 09о до близько 595, від близько 0,0595 до близько 595, від близько 0,190 до близько 5 95, від близько 0,295 до близько 595, від близько 0,395 до близько 595, від близько 0,495 до близько 595, від близько 0,595 до близько 595, від близько 0,695 до близько 5905, від близько 0,795 до близько 595, від близько 0,895 до близько 5905, від близько 0,995 до близько 5905, від близько 195 до близько 595, від близько 1,596 до близько 595, від близько 2956 до близько 5905, від близько 395 до близько 595, від близько 495 до близько 5595 і варіює в межах одного або більше з попередніх.
Основні форми можуть бути елюйовані у вигляді двох або більше основних областей і можуть бути пронумеровані як ВКІ!, ВК2, ВКЗ, тощо на підставі певного часу утримання піків та застосовуваного іонного обміну.
В одному варіанті здійснення композиції можуть містити білок проти МЕСЕ, у тому числі основні форми, причому ВКІ становить 1595, 1495, 1395, 1295, 1195, 10905, 995, 895, 790, бю, 590, 4,Б90, 496, З,БУю, ЗУ, 2,0ю, 2, 1,99, 1,80, 1,70, 1,6 90, 1,5 90, 1,496, 1,3, 1,20, 1,190, 190, 0,996,
Ов, 0,790, 0,6, 0,596, 0,495, 0,390, 0,295, 0,195 або 0,095, та варіює в межах одного або більше з попередніх. В одному аспекті композиції можуть містити білок проти МЕСЕ і його основні форми, причому ВКІ1 становить від близько 0,095 до близько 1095, від близько 0,095 до близько 595, від близько 0,095 до близько 4905, від близько 0,095 до близько 395, від близько 0,095 до близько 295, від близько 395 до близько 595, від близько 596 до близько 895, від близько 895 до близько 10905, або близько від 1095 до близько 1595, і варіює в межах одного або більше попередніх.
В одному варіанті здійснення композиції можуть містити білок проти МЕСЕ та його основні форми, причому ВК2 становить 1595, 1495, 1395, 1295, 1195, 1095, 995, 890, 7905, 696, 590, 4,590, 490, 3,595, Зо, 2,590, 20, 1,990, 1,890, 1,790, 1,690, 1,590, 1,4 90, 1,395, 1,20, 1,190, 190, 0,995, 0,8в9ю, 0,790, 0,696, 0,595, 0,495, 0,395, 0,290, 0,195 або 0,095, і варіює в межах одного або більше з попередніх. В одному аспекті композиції можуть містити білок проти МЕСЕ та його основні форми білка проти
МЕСРЕ, причому ВК2 становить від близько 0,095 до близько 1095, від близько 0,095 до близько 5905, від близько 0,095 до близько 4905, від близько 0,095 до близько 395, від близько 0,0 95 до близько 2 о, від близько 3905 до близько 5905, від близько 5905 до близько 8905, від близько 895 до близько 1095, або від близько 1095 до близько 1595, і варіює в межах одного або більше попередніх.
В одному варіанті здійснення композиції можуть містити білок проти МЕСЕ та його основні форми, причому ВЕКЗ становить 1595, 1495, 1395, 1295, 1195, 1095, 995, 890, 7905, 696, 590, 4,590, 490,
З,5Уо, Зо, 2,590, 2Ую, 1,990, 1,890, 1,790, 1,690, 1,590, 1,4 90, 1,395, 1,20, 1,190, 190, 0,990, 0,в9ю, 0,790, 0,696, 0,595, 0,495, 0,395, 0,290, 0,195 або 0,095, і варіює в межах одного або більше з попередніх. В одному аспекті композиції можуть містити білок проти МЕСЕ та його основні форми білка проти
МЕСРЕ, причому ВКЗ становить від близько 0,095 до близько 1095, від близько 0,095 до близько 595, від близько 0,095 до близько 4905, від близько 0,095 до близько 395, від близько 0,0 95 до близько 2 о, від близько 3905 до близько 5905, від близько 595 до близько 895, від близько 895 до близько 10905, або від близько 1095 до близько 1595, і варіює в межах одного або більше попередніх.
Фотоіндуковане окиснення афліберцепту
Крім виявлення різних колірних характеристик або варіантів білкових композицій проти МЕСЕ, отриманих із використанням ХВС, автори цього винаходу також виявили, що такі композиції можуть бути штучно отримані в лабораторії за допомогою впливу світла.
Модифіковані, у тому числі окиснені, варіанти композиції проти МЕСЕ можуть бути отримані за допомогою впливу на білок проти МЕСЕ холодного білого світла або ультрафіолетового світла. В одному аспекті композиція проти МЕСЕ може включати від близько 1,5 до близько 50-разового підвищення вмісту одного або більше модифікованих олігопептидів порівняно зі зразком, причому олігопептиди вибрані з групи, яка складається з
ОКТНТСТРРСО"РАРЕЇ С (5ЕБО 10 МО: 17), БІС ТС'ЕАТУМОаН' МК (БО ІО МО: 18),
ОТМТІПОМУМІ 5РОЗН'СІЕЇ 5МОЕК (5ЕО І МО: 19), ТЕГММОаірЕМУ/ЕМРЗБКН'ОНК (5ЕО ІО МО: 20),
ТММ ТН"А (5ЕО ІЮ МО: 21), БОТавАРЕМЕМУЗЕЇІРЕЇПН"МТЕСВА (5ЕО ІО МО: 22), МН'ЕЄКОК (5ЕО Ір
МО: 23), БОТавАРЕМЕМ'УЗЕІРЕПНМТЕСА (5ЕО 10 МО: 64), БОТОА!АРЕМЕМУ5ЗЕЇІРЕПНМ"ТЕСВ (5ЕО ІО МО: 65), ТОБОБЕМ'К (5ЕО 0 МО: 66), 5БОСІ МТС ААББОЇ МТК (ЗЕО ІО МО: 67),
ПМИОБА (5ЕБЕО 10 МО: 28), ВИМИОБА (5ЕБО 10 МО: 115), ПМИОБАК (5ЕБЕО ІЮО МО: 114),
ТЕСММатоЕмММ"ЕМРББУК (5ЕО ІЮ МО: 29), ОРІЗМАТУ"К (5ЕО І МО: 69), КЕР ОТИРОСОК (5ЕО
ІО МО: 70) Е".5ТІТІОСМТАК (5ЕО ІО МО: 32), де Н" являє собою гістидин, окиснений до 2-оксо- гістидину, де С" являє собою карбоксиметильований цистеїн, де М' являє собою окиснений метіонін, де М/" являє собою окиснений триптофан, де У" являє собою окиснений тирозин і де Е" являє собою окиснений фенілаланін. У додатковому аспекті композиція проти МЕСЕ може включати близько 1,5 до близько 10-разового підвищення вмісту одного або більше модифікованих олігопептидів за допомогою піддавання композиції проти МЕСЕ холодному білому світлу протягом періоду, наприклад, близько 30 годин. В іншому аспекті композиція проти МЕСЕ може включати від близько 1,5 до близько 10-разового підвищення вмісту одного або більше модифікованих олігопептидів за допомогою піддавання зразка холодному білому світлу протягом близько 75 годин. В іншому аспекті композиція проти МЕСЕ може включати від близько 1,5 до близько 20-разового підвищення вмісту одного або більше олігопептидів перед піддаванням зразка холодному білому світлу протягом близько 100 годин. В іншому аспекті композиція проти
МЕСЕ може включати від близько 1,5 до близько 20-разового підвищення вмісту одного або більше олігопептидів перед піддаванням зразка холодному білому світлу протягом близько 150 годин. У додатковому аспекті композиція проти МЕСЕ може включати від близько 1,5 до близько
БО-разового підвищення вмісту одного або більше олігопептидів за допомогою піддавання зразка холодному білому світлу протягом близько 300 годин -- див. приклад 4 нижче.
Композиція проти МЕСЕ може включати від близько 1,5 до близько З-разового підвищення вмісту одного або більше олігопептидів, описаних вище, за допомогою піддавання зразка композиції проти МЕСЕ ультрафіолетовому світлу протягом близько 4 годин. В іншому аспекті композиція проти МЕСЕ може містити від близько 1,5 до близько 10-разового підвищення вмісту одного або більше олігопептидів за допомогою піддавання зразка ультрафіолетовому світлу протягом близько 10 годин. В іншому аспекті композиція проти МЕСЕ може включати від близько 1,5 до близько 10-разового підвищення вмісту одного або більше описаних олігопептидів за допомогою піддавання зразка ультрафіолетовому світлу протягом близько 16 годин. В іншому аспекті композиція проти МЕСЕ може включати від близько 1,5 до близько 25-разового підвищення вмісту одного або більше описаних олігопептидів за допомогою піддавання зразка ультрафіолетовому світлу протягом близько 20 годин. В іншому аспекті композиція проти МЕСЕ може включати від близько 1,5 до близько 25-разового підвищення вмісту одного або більше описаних олігопептидів за допомогою піддавання зразка ультрафіолетовому світлу протягом близько 40 годин. Див. приклад 4.
Глікорізноманіття - білок проти МЕСЕ, отриманий із використанням ХВО
Композиції за цим винаходом містять білок проти МЕСЕ, причому білок проти МЕСБЕ, отриманий у ХВС, має різне глікорізноманіття. Різні профілі глікозилювання білка проти МЕСЕ входять до обсягу цього винаходу.
У деяких ілюстративних варіантах здійснення цього винаходу композиція може містити білок проти МЕСЕ, глікозильований на одному або більше аспарагінів таким чином: глікозилювання с0-
СісМАс; глікозилювання (1-СІсСМАс; глікозилювання (5315-СіІсМАс; глікозилювання /с0; глікозилювання (31; глікозилювання (515; глікозилювання (052; глікозилювання 25; глікозилювання (5252; глікозилювання СОЕ; глікозилювання 5225; глікозилювання 52252; глікозилювання С1Е; сглікозилювання 15; глікозилювання (52Е; глікозилювання (25; глікозилювання С2Е52; глікозилювання СЗ3Е5; глікозилювання СЗ3Е53; глікозилювання с0- 2бІСМАс; глікозилювання Мап4; глікозилювання Мап4 АТО1; глікозилювання Мап4 А10151; глікозилювання Мап5б; глікозилювання Мапо А101; глікозилювання Мапо А10151; глікозилювання Мапб; глікозилювання Мапб СО0-фосфат; глікозилювання Мапбфосфат; та/або глікозилювання Мап7. В одному аспекті білок, що становить інтерес, може являти собою афліберцепт, антитіло проти МЕСЕ або МіпіТгар МЕСЕ.
В одному варіанті здійснення композиція може мати такий профіль глікозилювання: від близько 4095 до близько 5095 загальних фукозильованих гліканів, від близько 3095 до близько 5090 загальних сіальованих гліканів, від близько 695 до близько 1595 манози-5, і від 6095 до близько 7995 галактозильованих гліканів. (Приклад 6).
В одному варіанті здійснення композиція може містити білок проти МЕСЕ, причому білок, що становить інтерес, має глікозилювання Мапо близько 32,495 залишків аспарагіну 123 та/або близько 27,196 залишків аспарагіну 196. В одному аспекті білок, що становить інтерес, може являти собою афліберцепт, антитіло проти МЕСЕ або МіпіТтар МЕСБЕ.
В іншому варіанті здійснення композиція може містити близько 4095, близько 4195, близько 4295, близько 43 95, близько 44 95, близько 4595, близько 4695, близько 4795, близько 4895, близько 4995 або близько 5095 загальних фукозильованих гліканів.
В іншому варіанті здійснення композиція може містити близько 3095, близько 3195, близько 3295, близько 33 90, близько 34 95, близько 35905, близько 3695, близько 37905, близько 3895, близько 3995, близько 4095, близько 4195, близько 4295, близько 43 95, близько 4495, близько 4595, близько 4695, близько 4795, близько 4895, близько 4995 або близько 5095 загальних сіальованих гліканів.
В одному варіанті здійснення композиція може містити близько 695, близько 795, близько 895, близько 995, близько 1095, близько 1195, близько 1295, близько 1395, близько 1495 або близько 1595 манози-5.
В іншому варіанті здійснення композиція може містити близько 6095, близько 6195, близько 62905, близько 63 95, близько 64 95, близько 6595, близько 6695, близько 6795, близько 6895, близько 6995, близько 7095 близько 71905, близько 72 90, близько 73 90, близько 7495, близько 75905, близько 7695, близько 7790, близько 7895 або близько 7995 загальних галактозильованих гліканів.
В одному варіанті здійснення білок проти МЕСЕ може мати рівень фукозильованих гліканів, знижений на близько 195, 1,295, 1,595, 295, 2,295, 2,595, 395, 3,295, 3,595, 495, 4,295, 4,590, 590, 1095, 1595, 2095, 2595, 3095, 3590, 4095, 4595, 5095, 5595 бОдю, 650, 70905, 7595, 8095, 8595, 9095, 9595 або 9995. Білки проти МЕСЕ можуть мати знижений рівень фукозильованих гліканів у діапазонах у межах одного або більше попередніх значень, наприклад, 1-1095, 1-1595, 1-2095, 1-2595, 1-3095, 1-
ЗБ, 1-40 90, 1-41 Фо, 1-42 95, 1-43905, 1-4495, 1-4595, 1-4695, 1-4795, 1-4895, 1-4995, 1-5095, 2-10 9», 2- 1595, 2-2095, 2-2595, 2-30905, 2-35905, 2-40905, 2-4195, 2-4295, 2-4390, 2-44 Чо, 2-4595, 2-4695, 2-4790, 2- 4895, 2-4995, 2-5095, 3-10905, 3-1595, 3-2090, 3-25 Уо, 3-309о, 3-35 Чо, 3-40 96, 3-4195, 3-4295, 3-4390, З-
4дов, 3-4595, 3-4690, 3-47 Зо, 3-489У0ю, 3-4990, 3-50, 4-1095, 4-15905, 4-2095, 4-2590, А4-З3095, 4-3590, 4- 4095, 4-4195, 4-4295, 4-4395, 4-4495, 4-4595, 4-4695, 4-4795, 4-4895, 4-4995, 4-50 95 або 1-9995 порівняно з рівнем фукозильованих гліканів у білюу проти МЕСЕ, отриманому з використанням гідролізату сої.
В одному варіанті здійснення білок проти МЕСЕ може мати рівень сіальованих гліканів, знижений на близько 195, 1,2 9Уо, 1,5 95, 2 У, 2,2. Ую, 2,590, ЗУо, 3,290, 3,59, 49, 4,20, 4,590, оо, 10905, 1595, 2095, 2595, 3095, 3595, 4095, 4595, 5095, 5595 бю, 6595, 7095, 7595, 8095, 8595, 9095, 9595 або 9995. Білки проти МЕСЕ можуть мати знижений рівень сіальованих гліканів у діапазонах у межах одного або більше попередніх значень, наприклад, 1-1095, 1-1595, 1-2095, 1-2595, 1-3095, 1-3590, 1- 490, 1-4195, 1-4295, 1-43905, 1-4495, 1-45905, 1-46905, 1-479У0, 1-48 У, 1-4995, 1-5095, 2-1095, 2-15925, 2- 2095, 2-2595, 2-309ю, 2-3595, 2-4095, 2-4195, 2-4295, 2-4395, 2-4495, 2-4595, 2-46905, 2-4795, 2-4А890, 2- 4995, 2-50 Зв, 3-1095, 3-1595, З3-2090, 3-2590, 3-309ю, 3-359У0, 3-4090, 3-4195, 3-4290, 3-4395, 3-4490, З- 4596, 3-4695, 3-479У0, 3-4895, 3-4995, 3-509ю, 4-1095, 4-1595, 4-2095, 4-2595, 4-3090, 4-3595, 4-4090, 4- 4195, 4-4295, 4-4395, 4-4495, 4-4595, 4-4695, 4-4795, 4-4895, 4-4995, 4-5095 або 1-9995 порівняно з рівнем сіальованих гліканів у білку проти МЕСЕ, отриманому з використанням гідролізату сої.
В одному варіанті здійснення білок проти МЕСЕ може мати рівень галактозильованих гліканів, знижений на близько 1 95, 1,295, 1,595, 295, 2,2Ую, 2,990, ЗУо, 3,20, 3,590, 49, 4,20, 4,590, Бо, 1090, 1595, 2095, 2595, 3095, 3595, 4095, 4595, 5095, 5595 бю, 6595, 7095, 7595, 8095, 8595, 9095, 9595 або 9995. В одному варіанті здійснення білок проти МЕСЕ може мати рівень галактозильованих гліканів, знижений, наприклад, на 1-1095, 1-1595, 1-20905, 1-25905, 1-3095, 1-3590, 1-40905, 1-4195, 1-42
Чо, 1-43 Зв, 1-4495, 1-4595, 1-4695, 1-4795, 1-4895, 1-4995, 1-5095, 2-1095, 2-1595, 2-2095, 2-2590, 2-
ЗО90, 2-3595, 2-4095, 2-4195, 2-429У0, 2-4АЗ9ю, 2-44905, 2-4590, 2-46905, 2-4790, 2-4890, 2-49, 2-50 90, З- 1095, 3-1595, 3-2090, 3-2595, 3-З095, 3-359ю, 3-4095, 3-4195, З3-429У0, 3-4395, 3-4495, 3-4595, 3-4695, З- 479, 3-4895, 3-4995, 3-50, 4-10905, 4-15 Зв, 4-2095, 4-2590, А4-З3095, 4-3595, 4-4095, 4-4195, 4-4296, 4- 4395, 4-4495, 4-4595, 4-4695, 4-4795, 4-4895, 4-4995, 4-5095 або 1-9995 порівняно з рівнем галактозильованих гліканів у білку проти МЕСЕ, отриманому з використанням гідролізату сої.
В одному варіанті здійснення білок проти МЕСЕ може мати рівень манозильованих гліканів, підвищений на близько 1 95, 1,295, 1,595, 295, 2,290, 2,590, Зо, 3,20, 3,590, 490, 4,290, 4,590, 990, 1095, 1595, 2095, 2590, 3090, З5Ую, 4090, 4595, 5095, 559о 6090, 6595, 7090, 7590, 8095, 8595, 9090, 9595 або 9995. Білки проти МЕСЕ можуть мати підвищений рівень манозильованих гліканів у діапазонах у межах одного або більше попередніх значень, наприклад, 1-1095, 1-1595, 1-2095, 1-2595, 1-3095, 1-3595, 1-40905, 1-4195, 1-4295, 1-43975, 1-4495, 1-45905, 1-4695, 1-47, 1-4895, 1-4995, 1-50905, 2-1095, 2- 1595, 2-2095, 2-2595, 2-3095, 2-3595, 2-4095, 2-4195, 2-4295, 2-439ю, 2-4495, 2-4595, 2-4695, 2-4 790, 2- 48ов, 2-А995, 2-509ю, 3-1095, 3-1595, З-209ю, 3-2595, 3-З095, 3-359Ую, 3-4095, 3-4195, 3-4295, 3-4390, З- 4дов, 3-4595, 3-4690, 3-479Ую, 3-48, 3-49 Зо, 3-50, 4-1095, 4-1595, 4-2095, 4-2595, 4-З3095, 4-3590, 4- 4095, 4-4195, 4-4295, 4-4395, 4-4495, 4-4595, 4-4695, 4-4795, 4-4895, 4-4995, 4-5095 або 1-9995 порівняно з рівнем манозильованих гліканів у білюу проти МЕСЕ, отриманому з використанням гідролізату сої.
Композиції, описані в цьому розділі, можуть бути вироблені за допомогою декількох попередніх та наступних параметрів, як описано нижче у розділах ІМ та У, відповідно.
ЇМ. Отримання композицій з використанням технологій попереднього процесу
Для біопрепаратів необхідно впровадження надійного і гнучкого висхідного процесу.
Ефективний попередній процес може забезпечувати необхідне отримання та масштабування білка, що становить інтерес. Автори цього винаходу виявили, що композиції за цим винаходом, що містять білок проти МЕСЕ, можуть бути отримані за допомогою модулювання умов під час продукції білка у висхідному напрямку, як-от зміни в компонентах середовища ХВС. Кожна стадія попереднього процесу може вплинути на якість, чистоту та кількість білка.
У цьому винаході надані докази існування певних варіантів афліберцепту та/або МіпіТгар, отриманих із використанням ХВС. Ці варіанти включають ізоформи, які містять один або більше окиснених амінокислотних залишків. Приклади окиснених залишків включають без обмеження один або більше залишків гістидину, триптофану, метіоніну, фенілаланіну або тирозину.
Композиції, отримані за допомогою модифікованого ХВС, можуть забезпечувати препарат білка проти МЕСЕ з необхідним цільовим значенням білкових варіантів афліберцепту та/або МіпіТгар.
Як згадувалося вище, також може спостерігатись жовто-коричневий колір, пов'язаний із фракціями, отриманими з використанням ХВС. (Як згадувалося вище, не всі ХВС, випробувані авторами цього винаходу, демонстрували чітку зміну кольору.)
Цей винахід включає культивування клітини-господаря в модифікованому ХВС у придатних умовах, в яких клітина експресує рекомбінантний білок, що становить інтерес, з подальшим збором препарату рекомбінантного білка, що становить інтерес, продукованого клітиною. Таке модифіковане ХВС можна застосовувати для отримання композицій, як описано в розділі ПІ.
В одному варіанті здійснення спосіб включає культивування клітини-господаря в ХВС у придатних умовах, причому клітина-господар експресує рекомбінантний білок, що становить інтерес, як-от афліберцепт. Спосіб додатково включає збір препарату рекомбінантного білка, що становить інтерес, продукованого клітиною, причому придатні умови включають ХВС з кумулятивною концентрацією заліза у зазначеному ХВС, що становить менше близько 55 мкмоль, кумулятивною концентрацією міді у зазначеному ХВС, що становить не більше близько 0,8 мкмоль, концентрацією нікелю у зазначеному ХВС, що становить не більше близько 0,40 мкмоль, кумулятивною концентрацією цинку у зазначеному ХВС, що становить не більше близько 56 мкмоль, кумулятивною концентрацією цистеїну у зазначеному ХВС, що становить менше близько ммоль; та/або антиоксидант у зазначеному ХВС у концентрації від близько 0,001 ммоль до близько 10 ммоль для одного антиоксиданту, та кумулятивною концентрацією не більше близько ммоль, якщо у зазначене ХВС додають кілька антиоксидантів.
В одному аспекті цього варіанта здійснення препарат, отриманий за допомогою придатних умов, забезпечує зниження білкових варіантів афліберцепту та МіпіТттар МЕСЕ до необхідної кількості білкових варіантів афліберцепту та Міпіттар МЕСЕ (що називається «цільовим значенням» білкових варіантів афліберцепту та МіпіТттар МЕСЕ). У додатковому аспекті цього варіанта здійснення препарат, отриманий внаслідок застосування придатних умов, забезпечує зниження кольору препаратів до необхідного значення ВУ (що називається «цільове значення
ВУ»), якщо препарат білка, у тому числі варіанти афліберцепту та МЕСЕ МіпіТгар, нормалізовані до концентрації 5 г/ л, 10 г/л або навіть вище.
У додатковому аспекті цього варіанта здійснення цільове значення ВУ та/або цільове значення варіантів може бути отримано в препараті, в якому титр підвищується або значно не знижується (див. приклад 5).
У деяких варіантах здійснення композиції отримані за допомогою застосування модифікованого ХВС, можуть забезпечувати отримання білка проти МЕСЕ препарату з необхідним цільовим значенням ВУ, причому колір препарату характеризується таким чином: () не більш жовто-коричневий, ніж європейський стандарт кольору ВУ2; (ї) не більш жовто-коричневий, ніж європейський стандарт кольору ВУЗ; (її) не більш жовто-коричневий, ніж європейський стандарт кольору ВУ4; (м) не більш жовто-коричневий, ніж європейський стандарт кольору ВУ5; (у) між значеннями європейського еталона кольору ВУ2 та ВУЗ; (мі) між значеннями європейського еталона кольору ВУЗ та ВУ4; (мі) між значеннями європейського еталона кольору ВУ4 та ВУ5, причому композиція містить близько 5 г/л або близько 10 г/л білка проти МЕСЕ, і при цьому зразок композиції може бути отриманий у вигляді зразка з елюату білка А освітленого збору. Як видно нижче у прикладі 9, таблиці 9-3, елюат білка А, що містить 5 г/л афліберцепту, мав жовто-коричневий колір, виміряне значення Бр" якого становить 1,77. Такий зразок, якщо він був отриманий після АЕХ, мав значення р" 0,50, демонструючи корисність АЕХ зниження жовто-коричневого забарвлення зразка (таблиця 9-3).
Композиції, отримані з використанням модифікованого ХВС, можуть забезпечувати препарат білка проти МЕСЕ, причому колір препарату характеризується визнаною стандартною колірною характеристикою за шкалою СІЕГАВ: () не більш жовто-коричневий, ніж значення Б" близько 22-23; (ї) не більш жовто-коричневий, ніж значення Б" близько 16-17; (її) не більш жовто-коричневий, ніж значення Б" 9-10; (м) не більш жовто-коричневий, ніж значення р" 4-5; (у) не більш жовто-коричневий, ніж значення р" 2-3; (мі) значення Б" від 17 до 23; (мії) значення Б" від 10 до 17; (мії) значення Б" від 5 до 10;
(їх) значення Б" від З до 5; або (х) значення Б" від 1 до 3, причому композиція містить близько 5 г/л або близько 10 г/л білка проти МЕСЕ, і при цьому композиція отримана у вигляді зразка з елюату білка А освітленого збору. Див. приклад 9, таблицю 9-3.
Для компонентів, доданих до культури клітин з утворенням модифікованого ХВС, термін «кумулятивна кількість», що застосовується в цьому документі, стосується загальної кількості конкретного компонента, доданого до біореактора в ході культивування клітин з утворенням ХВС, включаючи кількості, додані на початку культивування (ХВС на день 0) та додані згодом кількості компонента. Кількості компонента, додані до культури в системі посівних ферментерів або інокулят перед отриманням у біореакторі (тобто, перед ХВС на день 0), також включені при розрахунку кумулятивної кількості компонента. Кумулятивна кількість не залежить від втрати компонента протягом часу під час культивування (наприклад, за допомогою метаболізму або хімічного розкладання). Таким чином, дві культури з однаковими кумулятивними кількостями компонента можуть, тим не менш, мати різні абсолютні рівні, наприклад, якщо компонент додають до двох культур в різні моменти часу (наприклад, якщо до однієї культури весь компонент додають з самого початку, а до іншої культури компонент додають протягом часу). Кумулятивна кількість також не залежить від синтезу компонента іп зйи протягом часу в ході культивування (наприклад, за допомогою метаболізму або хімічного перетворення). Таким чином, дві культури з однаковими кумулятивними кількостями наведеного компонента можуть, тим не менш, мати різні абсолютні рівні, наприклад, якщо компонент синтезується іп 5йи в одній із двох культур за допомогою способу біологічного перетворення. Кумулятивна кількість може виражатися у таких одиницях, як, наприклад, грами або молі компонента. Термін «кумулятивна концентрація» стосується кумулятивної кількості компоненту, розділеного на об'єм рідини в біореакторі на початку виробничої партії, включно зі споживанням початкового обсягу з будь-якого інокуляту, що застосовується в культурі. Наприклад, якщо біореактор містить 2 літри середовища клітинної культури на початку виробничої партії, й один грам компонента Х додають у дні 0, 1, 2 та 3, то кумулятивна концентрація після дня З становить 2 г/л (тобто, 4 грами, розділені на 2 літри). Якщо на день 4 до біорєактора додають ще один літр рідини, яка не містить компонент Х, кумулятивна концентрація, як і раніше, становитиме 2 г/л. Якщо на день 5 деяка кількість рідини була втрачена з біореактора (наприклад, внаслідок випаровування), кумулятивна концентрація, як і раніше, становитиме 2 г/л. Кумулятивна концентрація може виражатися в таких одиницях, як, наприклад, грами на літр або молі на літр.
А. Амінокислоти:
У деяких варіантах здійснення модифіковане ХВС може бути отримано за допомогою зниження або підвищення кумулятивних концентрацій амінокислот у ХВО. Необмежувальні приклади таких амінокислот включають аланін, аргінін, аспарагін, аспарагінову кислоту, цистеїн, глутамін, глутамінову кислоту, гліцин, гістидин, ізолейцин, лейцин, лізин, метіонін, фенілаланін, пролін, серин, треонін, триптофан, тирозин і валін (або їхні солі). Підвищення або зниження кумулятивної кількості цих амінокислот у модифікованому ХВС можуть становити близько 195, 590, 1095, 1595, 2095, 2590, З09ю, 3590, 4090, 4595, 509ю, 5590, 60 90, 6590, 7090, 7590, 8095, 85905, 9095, 9590, 10095 порівняно з вихідним ХВС, і варіює в межах одного або більше з попередніх. В якості альтернативи, підвищення або зниження кумулятивної кількості однієї або більше амінокислот у модифікованому ХВС може становити від близько 595 до близько 2095, від близько 1095 до близько 3095, від близько 3095 до близько 40905, від близько 3095 до близько 50 95, від близько 4090 до близько 6095, від близько 6095 до близько 7095, від близько 7095 до близько 80905, від близько 8095 до близько 9095 або від близько 9095 до близько 10095 порівняно з немодифікованим ХВС, і варіює в межах одного або більше з попередніх (див. фіг. 25-27 та приклад 5).
У деяких варіантах здійснення модифіковане ХВС може бути отримано шляхом зниження кумулятивної концентрації цистеїну в ХВС. Зниження кількості цистеїну в ХВС з утворенням модифікованого ХВС може становити близько 195, 595, 1095, 15 95, 20 95, 2595, Зв, ЗБ, 4090, 4595, 5095, 5595, 605 , бБОю, 7095, 7595, 8095, 8595, 9095, 9595 або 10095 порівняно з немодифікованим ХВС, і варіює в межах одного або більше з попередніх. В якості альтернативи, зниження кумулятивної кількості цистеїну в модифікованому ХВС можуть становити від близько
БУ до близько 2095, від близько 1095 до близько 3095, від близько 3095 до близько 40905, від близько 3095 до близько 5095, від близько 40 95 до близько 6090, від близько 6095 до близько 7090,
від близько 7095 до близько 80905, від близько 8095 до близько 9095 або від близько 9095 до близько 10095 порівняно з ХВС, і варіює в межах одного або більше з попередніх. В одному аспекті кількість кумулятивного цистеїну в модифікованому ХВС становить менше близько 1 ммоль, близько 2 ммоль, близько З ммоль, близько 4 ммоль, близько 5 ммоль, близько 6 ммоль, близько 7 ммоль, близько 8 ммоль, близько 9 ммоль або близько 10 ммоль (див. фіг. 25-27 та приклад 5).
У деяких варіантах здійснення модифіковане ХВС може бути отримано за допомогою заміщення щонайменше певного відсоткового вмісту кумулятивного цистеїну в ХВС цистеїном.
Заміщення може становити близько 195, 595, 1095, 1595, 20 95, 2595, 3095, 3590, 40 У, 45 У, 50905, 5595, 6095, 6590, 7095, 75 95, 8095, 8595, 9095, 9595 або 10095 порівняно з немодифікованим ХВС, і варіює в межах одного або більше з попередніх. В якості альтернативи, заміщення може становити від близько 595 до близько 2095, від близько 1095 до близько 3095, від близько 3095 до близько 4095, від близько 3095 до близько 50905, від близько 4095 до близько 6095, від близько 6090 до близько 7095, від близько 7095 до близько 8095, від близько 8095 до близько 9095 або від близько 9095 до близько 10095 порівняно з немодифікованим ХВС, і варіює в межах одного або більше з попередніх (див. фіг. 25-27 та приклад 5).
У деяких варіантах здійснення модифіковане ХВС може бути отримано за допомогою заміщення щонайменше певного відсоткового вмісту кумулятивного цистеїну в ХВС сульфатом цистеїну. Заміщення може становити близько 195, 595, 10 95, 15 95, 2095, 2595, З09ю, 3590, 40905, 4595, 5095, 5595, б, бБО5, 7096, 79 95, 8095, 8595, 9095, 9595 або 10095 порівняно з немодифікованим ХВС, і варіює в межах одного або більше з попередніх. В якості альтернативи, заміщення може становити від близько 595 до близько 2095, від близько 1095 до близько 3095, від близько 3095 до близько 4095, від близько 3095 до близько 5095, від близько 4095 до близько 60905, від близько 6095 до близько 7095, від близько 70956 до близько 8095, від близько 8095 до близько 9095 або від близько 9095 до близько 10095 порівняно з немодифікованим ХВС, і варіює в межах одного або більше з попередніх.
В. Метали:
У деяких варіантах здійснення модифіковане ХВС може бути отримано за допомогою зниження або підвищення кумулятивної концентрації металів у ХВС. Необмежувальні приклади металів включають залізо, мідь, марганець, молібден, цинк, нікель, кальцій, калій та натрій.
Підвищення або зниження кількості одного або більше металів у модифікованому ХВС може складати близько 195, 595, 1095, 15905, 2095, 25905, 309, ЗБ, 4095, 4595, 5095, 5595, бю, бБою, 7090, 7595, 8095, 8595, 9095, 9595 або 10095 у порівнянні з немодифікованим ХВС, і варіює в межах одного або більше з попередніх. В якості альтернативи, підвищення або зниження кумулятивної кількості одного або більше металів у модифікованому ХВС може становити від близько 595 до близько 2095, від близько 1095 до близько 3095, від близько 3095 до близько 4095, від близько 3090 до близько 50 95, від близько 4095 до близько 6095, від близько 6095 до близько 7095, від близько 7095 до близько 8095, від близько 8095 до близько 9095 або від близько 9095 до близько 10095 порівняно з немодифікованим ХВС, і варіює в межах одного або більше з попередніх (див. фіг. 25- 27 та приклад 5).
С. Антиоксиданти:
У деяких варіантах здійснення модифіковане ХВС містить один або більше антиоксидантів.
Необмежувальні приклади антиоксидантів можуть включати таурин, гіпотаурин, гліцин, тіоктову кислоту, глутатіон, холінхлорид, гідрокортизон, вітамін С, вітамін Е та їхні комбінації (див. фіг. 28А-
Е та приклад 5).
У деяких варіантах здійснення модифіковане ХВС містить від близько 0,01 ммоль до близько ммоль таурину, тобто, від 0,01 ммоль до близько 1 ммоль, від близько 0,01 ммоль до близько 5 ммоль, від близько 0,01 ммоль до близько 10 ммоль, від близько 0,1 ммоль до близько 1 ммоль, від близько 0,1 ммоль до близько 5 ммоль, від близько 0,1 ммоль до близько 10 ммоль, від близько 1 ммоль до близько 5 ммоль, від близько 1 ммоль до близько 10 ммоль і варіює в межах одного або більше з попередніх.
У деяких варіантах здійснення модифіковане ХВС містить від близько 0,01 ммоль до близько 20 ммоль гіпотаурину, тобто, від 0,01 ммоль до близько 1 ммоль, від близько 0,01 ммоль до близько 5 ммоль, від близько 0,01 ммоль до близько 10 ммоль, від близько 0,1 ммоль до близько 1 ммоль, від близько 0,1 ммоль до близько 5 ммоль, від близько 0,1 ммоль до близько 10 ммоль,
від близько 1 ммоль до близько 5 ммоль, від близько 1 ммоль до близько 10 ммоль і варіює в межах одного або більше з попередніх.
У деяких варіантах здійснення модифіковане ХВС містить від близько 0,01 ммоль до близько 20 ммоль гліцину, тобто, від 0,01 ммоль до близько 1 ммоль, від близько 0,01 ммоль до близько 5 ммоль, від близько 0,01 ммоль до близько 10 ммоль, від близько 0,1 ммоль до близько 1 ммоль, від близько 0,1 ммоль до близько 5 ммоль, від близько 0,1 ммоль до близько 10 ммоль, від близько 1 ммоль до близько 5 ммоль, від близько 1 ммоль до близько 10 ммоль і варіює в межах одного або більше попередніх.
У деяких варіантах здійснення модифіковане ХВС містить від близько 0,01 мкмоль до близько мкмоль тіоктової кислоти, тобто, від близько 0,01 мкмоль до близько 0,1 мкмоль, від близько 0,1 мкмоль до близько 1 мкмоль, від близько 1 мкмоль до близько 2,5 мкмоль, від близько 1 мкмоль до близько З мкмоль, від близько 1Т мкмоль до близько 5 мкмоль і варіює в межах одного або більше з попередніх.
У деяких варіантах здійснення модифіковане ХВС містить близько 0,01 М до близько 5 ммоль глутатіону, тобто, від близько 0,01 ммоль до близько 1 ммоль, від близько 0,1 ммоль до близько 1 ммоль, від близько 0,1 ммоль до близько 5 ммоль, від близько 1 ммоль до близько 5 ммоль і варіює в межах одного або більше з попередніх.
У деяких варіантах здійснення модифіковане ХВС містить від близько 0,01 мкмоль до близько 5 мкмоль гідрокортизину, тобто, від близько 0,01 мкмоль до близько 0,1 мкмоль, від близько 0,1 мкмоль до близько 1 мкмоль, від близько 1 мкмоль до близько 2,5 мкмоль, від близько 1 мкмоль до близько З мкмоль, від близько 1 мкмоль до близько 5 мкмоль і варіює в межах одного або більше з попередніх.
У деяких варіантах здійснення модифіковане ХВС містить від близько 1 мкмоль до близько 50 мкмоль вітаміну С, тобто, від близько 1 мкмоль до близько 5 мкмоль, від близько 5 мкмоль до близько 20 мкмоль, від близько 10 мкмоль до близько 30 мкмоль, від близько 5 мкмоль до близько мкмоль, від близько 20 мкмоль до близько 50 мкмоль, від близько 25 мкмоль до близько 50 мкмоль і варіює в межах одного або більше з попередніх. р. Зміни середовища для модуляції глікозилювання:
Це розкриття також включає способи модуляції глікозилювання білка проти МЕСЕ шляхом зміни кумулятивних концентрацій певних компонентів у ХВС. На підставі кумулятивних кількостей компонентів, доданих до ХВС, загальний 95 фукозилювання, загальний 95 галактозилювання, загальний 95 сіалювання та маноза-5 можуть варіювати.
В ілюстративних варіантах здійснення спосіб модуляції глікозилювання білка проти МЕСЕ може включати додавання до ХВС уридину. Білок проти МЕСЕ може мати від близько 4095 до близько 5095 загальних фукозильованих гліканів, від близько 3095 до близько 5595 загальних сіальованих гліканів, від близько 295 до близько 1595 манози-5 і від близько 6095 до близько 7990 галактозильованих гліканів. (Див. приклад 6 нижче).
У деяких варіантах здійснення спосіб модуляції глікозилювання білка проти МЕСЕ може включати додавання до ХВС марганцю. В одному аспекті ХВС не містять марганцю до подачі.
Білок проти МЕСЕ може мати від близько 4095 до близько 5095 загальних фукозильованих гліканів, від близько 3095 до близько 5595 загальних сіальованих гліканів, від близько 295 до близько 1595 манози-5 і від близько 6095 до близько 7995 галактозильованих гліканів. (Див. приклад 6 нижче).
У деяких варіантах здійснення спосіб модуляції глікозилювання білка проти МЕСЕ може включати додавання до ХВС галактози. В одному аспекті ХВС не містить галактозу до подачі.
Білок проти МЕСЕ може мати від близько 4095 до близько 5095 загальних фукозильованих гліканів, від близько 3095 до близько 5595 загальних сіальованих гліканів, від близько 295 до близько 1595 манози-5 і від близько 6095 до близько 7995 галактозильованих гліканів. (Див. приклад 6 нижче).
У деяких варіантах здійснення спосіб модуляції глікозилювання білка проти МЕСЕ може включати додавання до ХВС дексаметазону. В одному аспекті ХВС не містить дексаметазону до подачі. Білок проти МЕСЕ може мати від близько 4095 до близько 5095 загальних фукозильованих гліканів, від близько 3095 до близько 55950 загальних сіальованих гліканів, від близько 295 до близько 1595 манози-5 і від близько 6095 до близько 7995 галактозильованих гліканів. (Див. приклад 6 нижче).
У деяких варіантах здійснення спосіб модуляції глікозилювання білка проти МЕСЕ може включати подачу до ХВС одного або більше з уридину, марганцю, галактози та дексаметазону. В одному аспекті ХВС не містить одного або більше з уридину, марганцю, галактози та дексаметазону до подачі. Білок проти МЕСЕ може мати від близько 4095 до близько 5095 загальних фукозильованих гліканів, від близько 3095 до близько 5595 загальних сіальованих гліканів, від близько 295 до близько 1595 манози-5 і від близько 6095 до близько 7995 галактозильованих гліканів. (Див. приклад 6 нижче).
М. Отримання композицій з використанням технологій подальшого процесу
Композиції, які містять білок проти МЕСЕ за цим винаходом, можуть бути отримані за допомогою модуляції умов під час подальшого отримання білка. Автори цього винаходу виявили, що оптимізація подальших процедур може забезпечувати зведення до мінімуму певних варіантів білка проти МЕСЕ, а також знебарвлення. Оптимізація подальшого процесу може забезпечувати композицію зі зниженими оксо-варіантами, а також оптимізованими колірними характеристиками.
Технології подальшого процесу можна застосовувати окремо або у комбінації з технологіями попереднього процесу, описаними вище у розділі ІМ.
А. Аніонообмінна хроматографія:
У деяких варіантах здійснення композиція за цим винаходом може включати процес, який включає експресію білка проти МЕСЕ у клітині-осподарі в ХВС, причому білок проти МЕСЕ секретується з клітини-господаря в середовище з отриманням освітленого збору. Збір піддають таким стадіям: (а) завантаження біологічного зразка, отриманого зі збору, в колонку для аніонообмінної хроматографії (АЕХ); (Б) промивання колонки АЕХ придатним промивним буфером, (с) збір проточної(-их) фракції(-й), необов'язково, (4) промивання колонки придатним буфером для очищення та (є) збір очищених фракцій.
Проточні фракції можуть містити оксо-варіанти білка проти МЕСРЕ, які становлять близько 1905,
БУ, 1095, 1595, 2090, 259Ую, ЗО Зв, 35 У, 4095, 4595, 5090, 5595, 6090, 6590, 7090, 7595, 8095, 85905, 9090 або 9595 зразка білка проти МЕСЕ порівняно з оксо-варіантами в очищеній фракції колонки для аніонообмінної хроматографії. Наприклад, щодо таблиці 9-5 і таблиці 9-6, проточні фракції містять окиснені варіанти білка проти МЕСЕ, де деякі залишки гістидину і триптофану близько 195, 5905, 1095, 1595, 2095, 2595, 3090, ЗБУю, 4090, 4595, 090, Зоо, б09ю, 6590, 709о, 759Уо, 8090, 8595, 9090, 9590 (і варіює в межах одного або більше з попередніх), порівняно з окисненими варіантами в очищених фракціях. рН обох із буфера для врівноваження та промивання для колонки АЕХ може становити від близько 8,20 до близько 8,60. В іншому аспекті провідність обох буферів для врівноваження та промивання для колонки АЕХ може становити від близько 1,50 до близько 3,0 мСм/см. В одному аспекті буфери для врівноваження та промивання можуть являти собою 50 ммоль трис- гідрохлориду. В одному аспекті буфер для очищення містить 2 моль хлориду натрію або 1 н. гідроксиду натрію або обох (див. таблицю 2-2). У прикладі 2 додатково проілюстрована оптимізація провідності буфера для врівноваження та промивання.
Білкові варіанти можуть включати модифікації одного або більше залишків у такий спосіб: один або більше аспарагінів дезамідовані; одна або більше аспарагінових кислот перетворені на ізо-аспартат та/або А5п; один або більше метіонінів окиснені; один або більше триптофанів перетворені в М-формілкінуреніну; один або більше триптофанів являють собою моно- гідроксилтриптофан; один або більше триптофанів являють собою ди-гідроксилтриптофан; один або більше триптофанів являють собою три-гідроксилтриптофан; один або більше аргінінів перетворені на Агд З-дезоксиглюкозон; С-кінцевий гліцин відсутній; та/або існує один або більше неглікозильованих глікосайтів.
Білок, що становить інтерес, може являти собою афліберцепт, антитіло проти МЕСЕ або МЕСЕ
МіпіТгар. Білкові варіанти можуть бути утворені за допомогою одного або більше з такого: (Її) окиснення гістидинів із залишків гістидину, вибраних із Ніз86б, Ніз110, Ніз145, Ніз209, Нівз95, Ніз19 та/або Ніз203 (або еквівалентних положеннях залишку на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту); (ії) окиснення залишків триптофану, вибраних із залишків триптофану в Тгр58 та/або Тгр138 (або еквівалентних положеннях залишку на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту); (ії) окиснення залишку тирозину в Тугб4 (або еквівалентних положеннях на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту); (м) окиснення залишків фенілаланіну, вибраних із Рпе44 та/або
Рпе166 (або еквівалентних положеннях залишку на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту); та/або (м) окиснення залишків метіоніну, вибраних із Мем, Меї
20, Мейб3 та/або Ме192 (або еквівалентних положеннях залишку на білках з однаковими певними структурними характеристиками афліберцепту).
Проточні фракції можуть містити одне або більше з такого: (а) відсотковий вміст залишків гістидину, які були окиснені до 2-оксо-гістидину, причому їхня колірна характеристика є такою: () не більш жовто-коричневий, ніж європейський стандарт кольору ВУ2; (ї) не більш жовто-коричневий, ніж європейський стандарт кольору ВУЗ; (її) не більш жовто-коричневий, ніж європейський стандарт кольору ВУ4; (м) не більш жовто-коричневий, ніж європейський стандарт кольору ВУ5; (у) між значеннями європейського еталона кольору ВУ2 та ВУЗ; (мі) між значеннями європейського еталона кольору ВУЗ та ВУ4; (мі) між значеннями європейського еталона кольору ВУ4 та ВУ5, причому композиція містить близько 5 г/л або близько 10 г/л білка проти МЕСЕ, і при цьому композицію отримують у вигляді зразка проточних фракцій. (р) Відсотковий вміст залишків гістидину, які були окиснені до 2-оксо-гістидину. Крім того, їхній колір характеризується наявністю жовто-коричневого кольору, що приблизно відповідає ВУ2, ВУЗ, вВУ4, вВУ5, ВУб, ВУ7; або він не темніший/інтенсивніший, ніж ВУ2, не темніший, ніж ВУЗ, не темніший, ніж ВУ4, не темніший, ніж ВУ5, не темніший, ніж ВУб, не темніший, ніж ВУ7; або перебуває між значеннями ВУ2 та ВУЗ, між значеннями ВУ2 та ВУ4, між значеннями ВУЗ та ВУ4 або між значеннями ВУЗ та ВУ 5. (с) Відсотковий вміст залишків гістидину, які були окиснені до 2-оксо-гістидину, причому їхній колір характеризується кольором у колірному просторі СІЕ І", а", Б" таким чином: () не більш жовто-коричневий, ніж значення Б" близько 22-23; (ї) не більш жовто-коричневий, ніж значення Б" близько 16-17; (її) не більш жовто-коричневий, ніж значення Б" 9-10; (м) не більш жовто-коричневий, ніж значення р" 4-5; (у) не більш жовто-коричневий, ніж значення р" 2-3; (мі) значення Б" від 17 до 23; (мії) значення Б" від 10 до 17; (мії) значення Б" від 5 до 10; (їх) значення Б" від З до 5; або (х) між значеннями Б" 1-3, причому композиція містить близько 5 г/л або близько 10 г/л білка проти МЕСРЕ, і при цьому композицію отримують у вигляді зразка з проточних фракцій. (4) Не більше близько 195, не більше близько 0,195 або близько 0,1-195, 0,2-195, 0,3-195, 0,4- 196, 0,5-195, 0,6-195, 0,7-195, 0,8-195 або 0,9-195 залишків гістидину в композиції окиснені до 2-оксо- гістидину. Розрахунок відсоткового вмісту описаний в розділі ІІ.
В. Афінна хроматографія:
У деяких варіантах здійснення композиції за цим винаходом можуть бути отримані за допомогою процесу, який включає експресію білка проти МЕСЕ у клітині-господарі, причому білок проти МЕСЕ секретується з клітини-господаря в середовище з отриманням освітленого збору.
Збір піддають стадіям, які включають (а) завантаження біологічного зразка, отриманого з очищеного врожаю, в колонку для афінної хроматографії, причому афінна хроматографія включає білок, здатний селективно або специфічно зв'язуватися з білююм проти МЕСЕ; (Б) промивання колонки для афінної хроматографії придатним елююючим буфером, та (с) збір елюйованої(-их) фракції(-й). Наприклад, як проілюстровано в таблиці 7-1 та таблиці з 7-7 по 7-10, застосування
МЕС 65 в якості білка, здатного селективно або специфічно зв'язуватися з білком проти МЕСЕ, і збір елюйованих фракцій, як описано вище, забезпечувало успішне отримання МТ5 (білка проти
МЕСРЕ), афліберцепту і фрагмента зсЕм проти МЕСЕ. У таблиці 7-1 також розкрито успішне отримання МТ»5 з використанням (ії) тАБб1 (людський ЇДе1 проти мишачого тАбБ до МЕСЕК'І, де
ЗЕО ІЮ МО: 73 являє собою важкий ланцюг і 5ЕО ІО МО: 74 являє собою легкий ланцюг); (ії) тАБ2 (людський ЇдО1 проти мишачого тАб до МЕСЕК'І, де 5ЕО ІО МО: 75 являє собою важкий ланцюг і
ЗЕО ІЮ МО: 76 являє собою легкий ланцюг); (ії) тАбБЗ (мишачий ЇД01 проти мишачого тАб до
МЕСЕМКІ1, де 5ЕО ІЮО МО: 77 являє собою важкий ланцюг і ЗЕО ІЮО МО: 78 являє собою легкий ланцюг) і (м) тАб4 (мишачий Їде1 проти мишачого тАб до МЕСЕКІ, де ЗЕО ІО МО.: 79 являє собою важкий ланцюг і ЗЕО ІО МО: 80 являє собою легкий ланцюг), оскільки різні білки здатні селективно або специфічно зв'язуватися з МТ5.
Щодо стадії (а) вище, біологічний зразок для завантаження в афінну колонку може бути отриманий зі зразка, в якому освітлений збір може бути підданий хроматографії до афінності, включаючи, без обмеження, іонообмінну хроматографію (аніонну або катіонну). Інші хроматографічні процедури, добре відомі фахівцю в цій галузі, також можуть бути використані перед застосуванням стадії афінності. Важливим моментом є те, що біологічний зразок, який містить білок проти МЕСЕ, можна піддавати афінній хроматографії.
У деяких варіантах здійснення композиції за цим винаходом можуть бути отримані з використанням процесу, який включає: експресію білка МЕСЕ МіпіТтар в клітині-господарі, причому МЕСЕ МіпіТгар секретований з клітини-господаря в середовищі, і при цьому середовище може бути додатково оброблено з утворенням освітленого збору. Цей збір може бути додатково оброблений за допомогою відомих хроматографічних процедур з отриманням біологічного зразка, що містить МЕСЕ МіпіТтар. Цей біологічний зразок може бути додатково оброблений за допомогою стадій, що включають (а) завантаження біологічного зразка в колонку для афінної хроматографії, причому афінна хроматографія містить білок, здатний селективно або специфічно зв'язуватися або взаємодіяти з білююм МЕСЕ МіпіТгар; (Б) промивання колонки для афінної хроматографії придатним елююючим буфером та (с) збір елюйованої(-их) фракції(-й). Щодо таблиці 7-1, у цій таблиці розкрито успішне отримання МТ5 (МЕСЕ МіпіТгар) з використанням (Її)
МЕЯЕ в5; (її) тАбБІ1 (людський ЇД61 проти мишачого тАб до МЕСЕКІ, де 5ЕО ІЮО МО: 73 являє собою важкий ланцюг і 5ЕО ІО МО.: 74 являє собою легкий ланцюг); (ії) тАбБ2 (людський ІдС1 проти мишачого тАБб до МЕСЕК'І, де 5ЕО ІО МО: 75 являє собою важкий ланцюг і ЗЕО ІЮО МО: 76 являє собою легкий ланцюг); (м) тАБбБЗ (мишачий Їдс1 проти мишачого тАБб до МЕСЕ-К1, де ЗЕО
ІО МО.: 77 являє собою важкий ланцюг і 5ЕО ІО МО.: 78 являє собою легкий ланцюг) і (м) тАБ4 (мишачий Ідс1 проти мишачого тАБб до МЕСЕК'І, де ЗЕО ІО МО: 79 являє собою важкий ланцюг і
ЗЕО ІО МО: 80 являє собою легкий ланцюг), оскільки різні білки здатні селективно або специфічно зв'язуватися або взаємодіяти з МТ5.
В одному варіанті здійснення афінну хроматографію також можна застосовувати для виділення інших білків Міпіїтар. Після розщеплення афліберцепту зразок, що містить розщеплений афліберцепт, можна піддати афінній хроматографії з використанням зв'язувальної речовини, специфічної для розщепленого афліберцепту. В одному аспекті зв'язувальна речовина може являти собою антитіло або його частину.
Відщеплення афліберцепту можна полегшити з використанням протеолітичного розщеплення афліберцепту, наприклад, протеази Ідез (ГаркІСАТОК) або його варіанта для створення МЕСЕ
МіпіТгтар. Відщеплення афліберцепту за допомогою протеази Ідеб5 або її варіанта може забезпечувати суміш продуктів, включаючи фрагмент Ес та МЕСЕ МіпіТгар. МЕСЕ МіпіТгар може бути додатково оброблений за допомогою однієї або більше стратегій отримання, описаних у цьому документі.
У деяких ілюстративних варіантах здійснення білок, здатний селективно або специфічно зв'язуватися («зв'язувальна речовина») або взаємодіяти з білюом проти МЕСЕ, як-от афліберцепт або МіпіТгар, може походити від людини або миші.
Афінний процес отримання може додатково включати врівноваження афінної колонки з використанням буфера для врівноваження перед завантаженням біологічного зразка.
Ілюстративні буфери для врівноваження можуть являти собою 20 ммоль фосфату натрію, рН 6-8 (особливо 7,2), 10 ммоль фосфату натрію, 500 ммоль Масі, рН 6-8 (особливо 7,2), 50 ммоль Ттгі5 рн 7-8, ОРВ5 рН 74.
Біологічний зразок може бути завантажений за допомогою придатного буфера, як-от ОРВ5.
Цей афінний процес отримання може додатково включати промивання афінної колонки одним або більше промивних буферів. Колонку можна промивати один або більше разів. Крім того, промивання також можуть бути зібрані в якості промивних фракції. рН промивного буфера може становити від близько 7,0 до близько 8,60. В одному аспекті промивний буфер може являти собою ОРВЗ5. В іншому аспекті промивний буфер може являти собою 20 ммоль фосфату натрію, рН 6-8 (особливо 7,2), 10 ммоль фосфату натрію, 500 ммоль Масі, рН 6-8 (особливо 7,2), 50 ммоль Ттіз рН 7-8 або ОРВ5 рн 7,4.
Цей афінний процес може додатково включати промивання афінною колонкою одним або більше придатних елююючих буферів і збір елюйованих фракцій. Колонку можна промивати один або більше разів. Необмежувальні приклади такого придатного елююючого буфера включають ацетат амонію (рН від близько 2,0 до близько 3,0), оцтову кислоту (рН від близько 2,0 до близько 3,2), гліцин-НСІ (рН від близько 2,0 до близько 3,0), цитрат натрію (рН від близько 2,0 до близько 3,0), лимонну кислоту (рН від близько 2,0 до близько 3,0), ізотіоціанат калію (рН від близько 2,0 до близько 3,0) або їхні комбінації.
У деяких аспектах елюйовані фракції можуть бути нейтралізовані з використанням нейтралізуючого буфера. Прикладом такого нейтралізуючого буфера є Тіз - Тгів-НСІ (рН від близько 7,0 до близько 9,0).
Мутанти Іде5:
Протеєаза Ідеб5, що використовується для відщеплення злитого білка Ес, як-от афліберцепт, швидко втрачатиме ферментативну активність в умовах основного рН, що може обмежувати його застосування при виробництві МЕСЕ МіпіТгтар. Таким чином, були розроблені варіанти, більш стабільні при основному рН, наприклад, у присутності сильної основи, такого як Маон. Такі основні умови можуть являти собою 0,05 н. Маон протягом 1 год. або 0,1 н. МасонН протягом 0,5 год.
У деяких варіантах здійснення мутант Ідеб5 може мати амінокислотну послідовність, щонайменше на близько 7095 ідентичну по всій її довжині амінокислотним послідовностям, викладеним у групі, що складається з 560 І МО: 2, 5ЕО ІЮО МО: З, ЗЕО ІЮО МО: 4, БЕО ІЮО МО: 5,
ЗЕОІЮ МО: 6, 5ЕО ІЮ МО: 7, 5ЕО ІЮО МО: 8, 5ЕО ІЮ МО: 9, 5ЕО ІЮ МО: 10, 5ЕО ІЮ МО: 11, 5ЕО Ір
МО: 12, 5ЕО ІО МО: 13, 5ЕО 10 МО: 14, 5ЕО ІЮО МО: 15 і 5ЕО ІО МО: 16. У деяких аспектах амінокислотна послідовність на близько 7595, 8095, 8595, 9095, 9595 або близько 10095 ідентична по всій її довжині амінокислотним послідовностям, безпосередньо зазначеним вище.
У деяких варіантах здійснення мутант Іде5 може мати виділену молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з амінокислотною послідовністю, щонайменше на 7095 ідентичну по всій її довжині амінокислотним послідовностям, наведеним у групі, яка складається з 5Е0 ІО МО: 2, 5ЕО
ІО МО: 3, 5ЕО ІО МО: 4, 5ЕО І МО: 5, 5ЕО ІО МО: 6, 5ЕО ІО МО: 7, 5ЕО ІО МО: 8, 5ЕО ІЮО МО: 9,
ЗЕО ІЮ МО: 10, ЗЕО ІЮО МО: 11, 5ЕО ІО МО: 12, 5ЕО ІЮО МО: 13, 5ЕО ІО МО: 14, 5ЕО ІЮ МО: 15 5ЕО ІО МО: 16. У деяких аспектах амінокислотна послідовність на близько 7595, 8095, 8595, 9090, 9595 або близько 10095 ідентична по всій її довжині амінокислотним послідовностям, безпосередньо зазначеним вище.
У деяких варіантах здійснення поліпептид може мати амінокислотну послідовність, щонайменше на 7095 ідентичну по всій її довжині амінокислотним послідовностям, наведеним у групі, яка складається з 5ЕО ІЮ МО: 2, 5ЕО ІЮО МО: 3, 5ЕОІО МО: 4, 5ЕО ІЮО МО: 5, 5ЕО ІЮ МО: 6,
ЗЕО ІО МО: 7, БЕО ІО МО: 8, 5ЕО І МО: 9, 5ЕО ІЮ МО: 10, 5ЕО ІО МО: 11, 5ЕО І МО: 12, 5ЕО І
МО: 13, 5ЕБЕО ІО МО: 14, 5БО ІО МО: 15 і 5ЕО ІО МО: 16 і може експресуватися клітиною- господарем придатним вектором, що містить нуклеїнову кислоту, яка кодує ідентифіковані пептиди. В одному аспекті молекула нуклеїнової кислоти функціонально зв'язана з послідовністю для контролю експресії, здатною керувати її експресією в клітині-господарі. В одному аспекті вектор може являти собою плазміду. У деяких аспектах амінокислотна послідовність на близько 7595, 8095, 8590, 9095, 9595 або близько 10095 ідентична по всій її довжині амінокислотним послідовностям, безпосередньо зазначеним вище. У деяких аспектах виділену молекулу нуклеїнової кислоти можна застосовувати для кодування поліпептиду.
У деяких варіантах здійснення мутант І(Чеб5 може мати амінокислотну послідовність, що містить вихідну амінокислотну послідовність, ідентифіковану в 5ЕО ІЮ МО: 1, (Іде5) із залишком аспарагіну у положенні 87, 130, 182 та/або 274, мутовану до амінокислоти, відмінної від аспарагіну. В одному аспекті мутація може забезпечити підвищену хімічну стабільність при лужних значеннях рН у порівнянні з вихідною послідовністю амінокислот. В іншому аспекті мутація може забезпечувати підвищення хімічної стабільності на 5095 при лужних значеннях рнН, порівняно з вихідною амінокислотною послідовністю. В одному аспекті амінокислота може бути вибрана з аспарагінової кислоти, лейцину та аргініну. У конкретному аспекті залишок аспарагіну в положенні 87 мутований до залишку аспарагінової кислоти. В іншому конкретному аспекті залишок аспарагіну в положенні 130 мутований до залишку аргініну. В іншому конкретному аспекті залишок аспарагіну в положенні 182 мутований до залишку лейцину. В іншому конкретному аспекті залишок аспарагіну в положенні 274 мутований до залишку аспарагінової кислоти. В іншому конкретному аспекті залишки аспарагіну в положенні 87 та 130 мутовані. В іншому конкретному аспекті залишки аспарагіну в положенні 87 та 182 мутовані. В іншому конкретному аспекті залишки аспарагіну в положенні 87 та 274 мутовані. В іншому конкретному аспекті залишки аспарагіну в положенні 130 та 182 мутовані. В іншому конкретному аспекті залишки аспарагіну в положенні 130 та 274 мутовані. В іншому конкретному аспекті залишки аспарагіну в положенні 182 та 274 мутовані. В іншому конкретному аспекті залишки аспарагіну в положенні 87, 130 та 182 мутовані. В іншому конкретному аспекті залишки аспарагіну в положенні 87, 182 та 274 мутовані.
В іншому конкретному аспекті залишки аспарагіну в положенні 130, 182 та 274 мутовані. В іншому конкретному аспекті залишки аспарагіну в положенні 87, 130, 182 та 274 мутовані. У деяких аспектах амінокислотна послідовність на близько 7595, 8095, 8595, 9095, 9595 або близько 10095 ідентична по всій її довжині амінокислотним послідовностям, описаним вище. У деяких аспектах виділену молекулу нуклеїнової кислоти можна застосовувати для кодування поліпептиду.
Фахівці в цій галузі, знайомі зі стандартними способами молекулярної біології, можуть без зайвого навантаження отримувати та застосовувати мутанти Ідеб5 за цим винаходом. Для рекомбінантної ДНК, синтезу олігонуклеотидів, культури тканини та трансформації можна застосовувати стандартні способи (наприклад, електропорацію, ліпофекцію). див., наприклад, затргоок вї а!., МоїІесціаг Сіопіпо: А І арогаїогу Мапиаї, вище, включений до цього документа за допомогою посилання для будь-яких цілей. Ферментативні реакції та методики отримання можна здійснювати відповідно до опису виробника або як описано в цьому документі.
МІ. Загальне отримання білка
Безліч різних методик отримання, включаючи без обмеження афінну, іонообмінну хроматографію, хроматографію зі змішаним режимом, ексклюзивну хроматографію (|і хроматографію з гідрофобною взаємодією, окремо або в комбінації, розглядаються як такі, що входять в обсяг цього винаходу. Ці хроматографічні стадії дозволяють розділити суміші білків біологічного зразка на основі заряду, ступеня гідрофобності, розміру або їх комбінацій, залежно від конкретної форми розділення. Для кожного зі способів, згаданих вище, доступно кілька різних хроматографічних смол, що дозволяє точно адаптувати виробничу схему до конкретного задіяного білка. Кожен спосіб розділення призводить до того, що білок проходить з різною швидкістю крізь колонку для досягнення фізичного розділення, яке збільшується в міру того, як вони проходять далі крізь колонку або селективно прилипають до середовища. Потім білки або (ї) диференціально елююють з використанням відповідного елююючого буфера та/або (ії) збирають з проточних фракцій, отриманих із колонки, необов'язково внаслідок промивання колонки відповідним буфером для врівноваження. У деяких випадках білок, що становить інтерес, відокремлюють від домішок (НСР, білкових варіантів, тощо), якщо домішки переважно прилипають до колонки, і білок, що становить інтерес, меншою мірою, тобто, білок, що становить інтерес, не адсорбується на твердій фазі конкретної колонки і, таким чином, протікає крізь колонку. У деяких випадках домішки відокремлюють від білка, що становить інтерес, коли вони не адсорбуються в колонці і таким чином протікають крізь колонку.
Процес виробництва може починатися на стадії розділення після того, як рекомбінантний білок був отриманий з використанням попередніх способів виробництва, описаних вище, та/або альтернативних способів виробництва, традиційних у цій галузі. Після отримання освітленого розчину або суміші, яка містить білок, що становить інтерес, наприклад, злитий білок, відбувається відокремлення білка, що становить інтерес, від технологічних домішок (наприклад, інших білків, продукованих клітиною (наприклад, НОР), а також споріднених сполук, як-от кислотні або основні варіанти). Можна застосовувати комбінацію одного або більше різних способів отримання, включаючи афінну, іонообмінну хроматографію (наприклад, СЕХ, АЕХ), хроматографію зі змішаним режимом (ММ) та/або хроматографію з гідрофобною взаємодією. Такі стадії отримання дозволяють розділяти суміші компонентів у межах біологічного зразка на основі їхнього, наприклад, заряду, ступеня гідрофобності талабо видимого розміру. Для кожної зі згаданих у цьому документі методик хроматографії комерційно доступні багаточисленні хроматографічні смоли, які дозволяють точно адаптувати виробничу схему до конкретного задіяного білка. Кожен зі способів розділення дозволяє білкам або проходити з різною швидкістю крізь колонку, досягаючи фізичного розділення, яке збільшується в міру того, як вони проходять далі крізь колонку, або адсорбуватися селективно смолою (або середовищем) для розділення.
Потім білки можна збирати по-різному. У деяких випадках білок, що становить інтерес,
відокремлюється від компонентів біологічного зразка, коли інші компоненти специфічно адсорбуються на смолу в колонці, а білок, що становить інтерес, не абсорбується.
А. Первинне відновлення та інактивація вірусів
У деяких варіантах здійснення початкові стадії способів отримання, розкритих у цьому документі, включають роз'яснення та первинне вилучення білка, що становить інтерес, з біологічного зразка. Первинне відновлення включатиме одну або більше стадій центрифугування для відокремлення білка, що становить інтерес, від клітини-господаря та супутніх клітинних залишків. Центрифугування зразка можна виконувати зі швидкістю, наприклад, без обмеження, від 7000 х д до приблизно 12750 х д. У контексті великомасштабного виробництва таке центрифугування може відбуватися в оперативному режимі зі встановленою швидкістю потоку для досягнення, наприклад, рівня мутності 150 МТ в отриманому супернатанті. Такий супернатант потім можна збирати для подальшої обробки або потокової фільтрації крізь один або більше глибинних фільтрів для подальшого освітлення зразка.
У деяких варіантах здійснення первинне вилучення може включати застосування однієї або більше стадій глибинної фільтрації для освітлення зразка і, таким чином, полегшення обробки білка, що становить інтерес. В іншому варіанті здійснення первинне відновлення може включати застосування однієї або більше стадій глибинної фільтрації після центрифугування.
Необмежувальні приклади глибинних фільтрів, які можна застосовувати в контексті цього винаходу, включають глибинні фільтри Мійївтак- ХОНС, РОНС, ВОНС, АТНС, ВІНС (ЕМО Міїїроге),
ЗМ'М модель 30/602А, 60/90 2А, УКО5, МКО7, глибинні фільтри Оеїїріа (ЗМ Согр.). За глибинними фільтрами зазвичай йдуть фільтр 0,2 мкм, як-от двошаровий б5апороге"М Запогійи5 0,45/0,2 мкм або картриджі фільтрів Мійроге Ехргез5 5НК або ЗНОС. Також можна використовувати інші фільтри, добре відомі фахівцям.
У певних варіантах здійснення процес первинного відновлення також може бути точкою для зменшення або інактивації вірусів, які можуть бути присутніми в біологічному зразку. Будь-які один або більше з множини способів зменшення/інактивації вірусів можна застосовувати у фазі первинного відновлення виробництва, включаючи теплову інактивацію (пастеризацію), рн- інактивацію, обробку буфером/миючим засобом, УФ- і опромінення у-променями і додавання певних хімічних інактивуючих засобів, як-от ВД-пропіолактон або, наприклад, фенантролін міді, як описано в патенті США Мо 4534972, повний вміст якого включений у цей документ за допомогою посилання. У деяких ілюстративних варіантах здійснення цього винаходу зразок піддають впливу вірусної інактивації за допомогою миючого засобу в ході фази первинного відновлення. В іншому варіанті здійснення зразок можна піддавати інактивації при низькому рН в ході фази первинного відновлення.
У тих варіантах здійснення, в яких застосовують зменшення/інактивацію вірусу, біологічний зразок може бути скоригований, за необхідності, для подальших стадій отримання. Наприклад, після вірусної інактивації з низьким рН, рН зразка зазвичай доводять до більш нейтрального рн, наприклад, від приблизно 4,5 до близько 8,5, до продовження процесу отримання. Додатково, суміш може бути розведена водою для ін'єкцій (М/РІ) з отриманням необхідної провідності.
В. Афінна хроматографія
У певних ілюстративних варіантах здійснення може бути бажано піддавати біологічний зразок афінній хроматографії з отриманням білка, що становить інтерес. Хроматографічний матеріал здатний селективно або специфічно зв'язуватися або взаємодіяти з білком, що становить інтерес.
Необмежувальні приклади такого хроматографічного матеріалу включають білок А і білок 5. Крім того, включає хроматографічний матеріал, який містить, наприклад, білок або його частину, здатний зв'язуватися з або взаємодіяти з білком, що становить інтерес. В одному аспекті білок, що становить інтерес, являє собою білок проти МЕСЕ, як-от афліберцепт, МіпіТгтар або білок, споріднений із ним.
Афінна хроматографія може включати піддавання біологічного зразка впливу колонки, що містить придатну смолу з білком А. Використовуваний у цьому документі термін «білок А» охоплює білок А, виділений з його природного джерела, білок А, отриманий синтетичним шляхом (наприклад, за допомогою пептидного синтезу або за допомогою рекомбінантних методик), та його варіанти, які зберігають здатність зв'язувати білки, які мають область Сн2/Сн3. У певних аспектах смола з білююом А придатна для отримання на основі афінності та виділення різних ізотипів антитіл за допомогою специфічної взаємодії з частиною молекули Ес, якщо вона містить таку область.
Існує кілька комерційних джерел смоли з білюм А. Одна придатна смола являє собою
МабрзеїєесіМ від СЕ Неайсаге. Придатні смоли включають без обмеження Марзбеїесі 5икКе "мМ,
Мабрзеїесї зиКе І Х, Марзеїесї, Марзеїесї З,иКе РС, Мабрзеїесі Хіга, гРгоївіп А ерпагозе від СЕ
Неайсаге, Ргозер НС, Ргозер Шіга та Ргобзер ОКга Різ від ЕМО МійШроге, МарсСарішиге від І Те
ТесппоЇодіеєє. Необмежувальний приклад придатної колонки, упакованої з Маббеїесї! М, являє собою колонку діаметром близько 1,0 см х довжину близько 21,6 см (об'єм шару 17 мл). Придатна колонка може містити смолу, як-от МарбеїЇесіМ 5уКе або аналогічну смолу. Білок А також може бути комерційно придбаний у Керіїдеп, Рпагтасіа та Рептаїесі.
Афінність колонки може бути врівноважена придатним буфером перед завантаженням зразка.
Після завантаження колонки її можна промити один або більше разів за допомогою придатного буфера для промивання. Потім колонку можна елюювати з використанням придатного елююючого буфера, наприклад, гліцин-НСЇ, оцтової кислоти або лимонної кислоти. Елюат можна контролювати з використанням способів, добре відомих фахівцям у цій галузі, як-от УФ-детектор.
Елюйовані фракції, що становлять інтерес, можуть бути зібрані, а потім підготовлені для подальшої обробки.
В одному аспекті елюат можна піддавати вірусній інактивації, наприклад, або за допомогою миючого засобу, або низького рН. Придатна концентрація миючого засобу або рН (і час) можуть бути вибрані з отриманням необхідного результату відносно вірусної інактивації. Після вірусної інактивації елюат зазвичай піддають регулюванню рН та/або провідності для подальших стадій отримання.
Елюат можна фільтрувати крізь глибинний фільтр для видалення каламутності та/або різних домішок із білка, що становить інтерес, перед додатковими хроматографічними стадіями додаткового очищення. Приклади придатних глибинних фільтрів включають, без обмеження, фільтри Міййвіак- ХОНС, ЕОНС, СОНС, АІНС, ХО5Р та ВІНС Роа (ЕМО Мійіроге), або фільтри 7еїа
Різ 302А/607А, 6027 А/907А, аеїїріа, МКО7 та МКО5 (ЗМ). Багатоступеневий фільтр Етрпа7е АЕХ
Нубгій Ригйег також можна використовувати для очищення елюату. Пул елюату, можливо, потрібно відрегулювати до певного значення рН та провідності для забезпечення необхідного видалення домішок та вилучення продукту на стадії глибинної фільтрації.
С. Аніонообмінна хроматографія
У певних варіантах здійснення білок, що становить інтерес, отримують за допомогою біологічного зразка щонайменше однієї стадії аніонообмінного розділення. В одному випадку аніонообмінна стадія може відбуватися після процедури афінної хроматографії (наприклад, афінності з білком А). В інших випадках аніонообмінна стадія може відбуватися перед стадією афінної хроматографії. В інших протоколах аніонний обмін може відбуватися як до, так і після стадії афінної хроматографії. В одному аспекті білок, що становить інтерес, являє собою або афліберцепт, або МіпіТгар.
Застосування матеріалу аніонного обміну порівняно з матеріалом катіонного обміну частково засноване на локальних зарядах білка, що становить інтерес. Аніонообмінну хроматографію можна застосовувати в комбінації з іншими хроматографічними процедурами, як-от афінна хроматографія, ексклюзивна хроматографія, хроматографія з гідрофобною взаємодією, а також інші режими хроматографії, відомі фахівцю в цій галузі.
При виконанні розділення вихідну білкову композицію (біологічний зразок) можна приводити в контакт з аніонообмінним матеріалом із використанням будь-якої з множини методик, наприклад, із використанням методики серійного виробництва або хроматографічної методики.
У контексті серійного виробництва аніонообмінний матеріал отримують у необхідному вихідному буфері або врівноважують ним. При отриманні отримують суспензію аніонообмінного матеріалу. Біологічний зразок приводять у контакт із суспензією для забезпечення адсорбції білка аніонообмінним матеріалом. Розчин, що містить кислотні форми, які не зв'язуються з матеріалом
АЕХ, отримують із суспензії за допомогою забезпечення осадження суспензії та видалення супернатанту. Суспензію можна піддати одній або більше стадіям промивання та/або стадіям елюювання.
У контексті хроматографічного розділення хроматографічну колонку застосовують для вміщення хроматографічної підкладки матеріалу (смоли або твердої фази). Зразок, який містить білок, що становить інтерес, завантажують у певну хроматографічну колонку. Потім колонку можна налаштувати на одну або більше стадій промивання з використанням придатного буфера для промивання. Компоненти зразка, не адсорбовані смолою, швидше за все протікатимуть крізь колонку. Компоненти, адсорбовані смолою, можна диференційовано елюювати з використанням придатного елююючого буфера.
Стадію промивання зазвичай здійснюють за допомогою хроматографії АЕХ з використанням умов, аналогічних умовам завантаження, або, в якості альтернативи, за допомогою зниження рн і/або збільшення іонної сили/провідності промивання ступінчастим або лінійним градієнтом. В одному аспекті водний розчин солі, використовуваний як у завантажувальному, так і буфері для промивання, має рн, рівний або близький до ізоелектричної точки (рі) білка, що становить інтерес.
Зазвичай рН на близько 0-2 одиниці вище або нижче рі білка, що становить інтерес, тим не менше, він може бути на 0-0,5 одиниць вище або нижче. Він також може дорівнювати рі білка, що становить інтерес.
Аніонний засіб може бути вибраний із групи, яка складається з ацетату, хлориду, форміату та їхньої комбінації. Катіонний засіб може бути вибраний із групи, яка складається з трису, аргініну, натрію та їхньої комбінації. У конкретному прикладі буферний розчин являє собою буфер трис/форміат. Буфер може бути вибраний із групи, яка складається з піридину, піперазину, І - гістидину, біс-трису, біс-трис-пропану, імідазолу, М-етилморфоліну, ТЕА (триетаноламіну), трису, морфоліну, М-метилдіетаноламіну, АМРО (2-аміно-2-метил-1,3-пропандіолу), діетаноламіну, етаноламіну, АМР (2-аміно-2-метил-1-пропанолу), піперазину, 1,3-діамінопропану та піперидину.
Упакована аніонообмінна хроматографічна колонка, аніонообмінний мембранний пристрій, аніонообмінний монолітний пристрій або глибинний фільтруючий матеріал можуть працювати або в режимі зв'язування з елююванням, або в режимі проточної фракції, або в гібридному режимі, в якому білки взаємодіють з хроматографічним матеріалом із використанням буфера, який аналогічний або по суті аналогічний завантажувальному буферу.
У режимі зв'язування-елюювання колонку або мембранний пристрій спочатку кондиціонують буфером із відповідною іонною силою та рН в умовах, коли певні білки будуть адсорбуватися на матриці на основі смоли. Наприклад, у ході завантаження білок, що становить інтерес, може адсорбуватися смолою внаслідок електростатичного тяжіння. Після промивання колонки або мембранного пристрою буфером для врівноваження або іншим буфером з іншим рН та/або провідністю відновлення продукту досягається за рахунок збільшення іонної сили (тобто, провідності) елююючого буфера для конкурування з розчиненою речовиною за заряджені ділянки аніонообмінної матриці Зміна рН й, таким чином, зміна заряду розчиненої речовини являє собою ще один спосіб досягти елюювання розчиненої речовини. Зміна провідності або рН може бути поступовою (градієнтне елюювання) або ступінчастою (ступінчасте елюювання).
У режимі проточної фракції колонка або мембранний пристрій працює з вибраними рН і провідністю, так що білок, що становить інтерес, не зв'язується зі смолою або мембраною, тоді як кислотні форми або зберігатимуться на колонці, або будуть мати відмінний профіль елюювання в порівнянні з білком, що становить інтерес. У контексті цієї стратегії кислотні форми будуть взаємодіяти або зв'язуватися з хроматографічним матеріалом у придатних умовах, тоді як білок, що становить інтерес, і певні агрегати та/або фрагменти білка, що становить інтерес, протікатиме крізь колонку.
Необмежувальні приклади аніонообмінних смол включають групи діетиламіноетилу (ОЕАЕ), четвертинного аміноетилу (ОАЕ) та четвертинного аміну (0). Додаткові необмежувальні приклади включають Рогов 50РІ ії Рогоз 50НО, які являють собою жорсткі полімерні гранули з каркасом, що складається зі зшитого поліІ(стирол-дивінілбензену|; Саріо О Ітргез і Саріо ОЕАЕ, які являють собою гранули агарози з високою плинністю; Тоуореагі ОАДЕ-550, Тоуореа! ОЕАЕ-650 і Тоуореагі
СідаСар О-650, які являють собою гранули з полімерною основою; ЕгасіодеІ? ЕМО ТМАЕ Нісар, який являє собою синтетичну полімерну смолу з іонообмінним матеріалом типу «щупальці»;
Запобіпа 5ТІС? РА папо, який являє собою стійку до солі хроматографічну мембрану з лігандом первинного аміну; Запобіпа О папо, який являє собою сильну аніонообмінну хроматографічну мембрану; СИОМО ВіоСар, який являє собою середовище глибинного фільтра 7еїа-Ріш5, виготовлене з неорганічних фільтрувальних добавок, очищеної целюлози та іонообмінної смоли; і
ХОНС, який являє собою середовище глибинного фільтра, виготовлене з неорганічної фільтрувальної добавки, целюлози та змішаних естерів целюлози.
У певних варіантах здійснення завантаження білка зразка можна регулювати до загального завантаження білка в колонці від близько 50 г/л до близько 500 г/л, або близько від 75 г/л до близько 350 г/л, або від близько 200 г/л до близько 300 г/л. В інших ілюстративних варіантах здійснення концентрацію білка суміші завантаження білка регулюють до концентрації білка матеріалу, завантаженого в колонку, від близько 0,5 г/л до близько 50 г/л, від близько 1 г/л до близько 20 г/л, або від близько З г/л до 10 г/л. В інших варіантах здійснення концентрація білка суміші завантаження білка регулюють до концентрації білка в матеріалі в колонці близько 37 г/л.
Добавки, як-от поліетиленгліколь (ПЕГ), миючі засоби, амінокислоти, цукри, хаотропні засоби, можуть бути додані для підвищення ефективності розділення для досягнення кращого розділення, вилучення та якості продукту.
У деяких варіантах здійснення, включаючи ті, що стосуються афліберцепту талабо МЕСЕ
МіпіТгар, способи за цим винаходом можна застосовувати для селективного видалення, значного зменшення або по суті видалення щонайменше 1095 білкових варіантів з отриманням таким чином білкових композицій, які мають зменшений вміст білкових варіантів.
Білкові варіанти можуть включати модифікації одного або більше залишків таким чином: один або більше аспарагінів дезамідовані; одна або більше аспарагінових кислот перетворені на аспартат-гліцин та/або Авп-Сіу; один або більше метіонінів окиснені; один або більше триптофанів перетворені на М-формілкінуренін; один або більше триптофанів являють собою моно-гідроксилтриптофан; один або більше триптофанів являють собою ди-гідроксилтриптофан; один або більше триптофанів являють собою три-гідроксилтриптофан; один або більше аргінінів перетворені на Агд З-дезоксиглюкозон; С-кінцевий гліцин відсутній; та/або існує один або більше неглікозильованих глікосайтів. Було також зазначено, що застосування АЕХ знижує окиснені та кислотні форми варіантів анти-МЕСЕ у зазначеному афінному елюаті. Порівняно з афінним елюатом, після застосування АЕХ проточна фракція може продемонструвати зниження щонайменше на близько 2095, 1995, 18905, 1795, 1695, 15905, 1495, 1395, 1295, 1195, 1095, 995, 890, 70, бу або 595 окиснених та/або кислотних форм варіантів проти МЕСЕ.
Білкові варіанти афліберцепту та/"або МЕСЕ МіпіТгтар можуть включати одне або більше з (ї) окиснених гістидинів із залишків гістидину, вибраних із Ніз86б, Ніх110, Ніз145, Ніз209, Нівз95, Ніз19 та/або Ніз203; (її) окиснених залишків триптофану, вибраних із залишків триптофану в Тгр58 та/або Тгр138; (ії) окисненого залишку тирозину в Тугб4; (м) окиснених залишків фенілаланіну, вибраних із Рпе44 та/або Ріе166; та/або (м) окиснених залишків метіоніну, вибраних із Мем10, Меї 20, Ме!163 та/або Ме!192. р. Катіонообмінна хроматографія
Композиції за цим винаходом можуть бути отримані за допомогою піддавання біологічного зразка, який містить білок, що становить інтерес, щонайменше однієї катіонообмінної (СЕХ) стадії.
У певних ілюстративних варіантах здійснення стадія СЕХ доповнюватиме стадію АЕХ та її здійснюють або до, або після стадії АЕХ. В одному аспекті білок, що становить інтерес, являє собою або афліберцепт, або МіпіТгар, або споріднену ним молекулу.
Застосування матеріалу катіонного обміну в порівнянні з матеріалом аніонного обміну, як-от матеріали аніонного обміну, що обговорюються вище, частково засноване на локальних зарядах білка, що становить інтерес, у цьому розчині та необхідних умовах розділення. До обсягу цього винаходу входить застосування стадії катіонного обміну перед застосуванням стадії аніонного обміну або стадії аніонного обміну перед застосуванням стадії катіонного обміну. Крім того, до обсягу цього винаходу входить застосування тільки стадії катіонного обміну в комбінації з іншими хроматографічними процедурами.
При здійсненні катіонного обміну зразок, який містить білок, що становить інтерес, можна приводити в контакт із катіонообмінним матеріалом за допомогою застосування будь-якої з множини методик, наприклад, із використанням методики серійного виробництва або хроматографічної методики, як описано вище для АЕХ.
Водний розчин солі можна застосовувати в якості як завантажувального буфера, так і буфера для промивання з рН нижче ізоелектричної точки (рі) білка, що становить інтерес. В одному аспекті рН на близько 0-5 одиниць нижче рі білка. В іншому аспекті він на 1-2 одиниці нижче білка рі. В іншому аспекті він на 1-1,5 одиниці нижче білка рі.
У певних варіантах здійснення концентрацію аніонного засобу у водному розчині солі підвищують або знижують для досягнення рН від близько 3,5 до близько 10,5, або від близько 4 до близько 10, або від близько 4,5 до близько 9,5, або від близько 5 до близько 9, або від близько
5,5 до близько 8,5, або від близько 6 до близько 8, або від близько 6,5 до близько 7,5. В одному аспекті концентрацію аніонного засобу підвищують або знижують у водному розчині солі з метою досягнення рН 5 або 5,5, або б, або 6,5, або 6,8, або 7,5. Буферні системи, придатні для застосування у способах СЕХ, включають, без обмеження трис-форміат, трис-ацетат, сульфат амонію, хлорид натрію та сульфат натрію.
У певних варіантах здійснення провідність та рН водного розчину солі регулюють за допомогою підвищення або зниження концентрації катіонного засобу. В одному аспекті концентрацію катіонного засобу підтримують в діапазоні від близько 20 ммоль до близько 500 ммоль, від близько 50 ммоль до близько 350 ммоль, від близько 100 ммоль до близько 300 ммоль або від близько 100 ммоль до близько 200 ммоль. Необмежувальні приклади катіонного засобу можуть бути вибрані з групи, яка складається з натрію, трису, триетиламіну, аміаку, аргініну та їхньої комбінації.
Упакована катіонообмінна хроматографічна колонка або пристрій з катіонообмінною мембраною можуть працювати як в режимі зв'язування-елюювання, так і в проточному режимі, або гібридному режимі, причому продукт демонструє зв'язування або взаємодію з хроматографічним матеріалом, але її можна очистити від такого матеріалу з використанням буфера, який є таким самим або по суті аналогічним завантажувальним буфером (деталі цих режимів викладені вище).
Катіонні замісники включають карбоксиметил (СМ), сульфоєтил (ЗЕ), сульфопропіл (5Р), фосфат (Р) та сульфонат (5). Додаткові катіонні матеріали включають, без обмеження, Саріо ЗР
ІтрКез, який являє собою гранули агарози з високою плинністю; СМ Нурег О ступеня Е, який являє собою керамічні гранули, покриті та просочені функціоналізованим гідрогелем, 250 - 400 іонних груп мкекв./мл; ЕвПптипо 5, який являє собою гідрофільну базову матрицю на основі полівінілового етеру з 50-100 мкмекв./мл іонної ємності; Миміа С Ргіте, який являє собою гідрофобне катіонообмінне середовище, яке складається з макропористої високозшитої гідрофільної полімерної матриці 55-75 нє/мл; Миміа 5, який має базову матрицю ОМО5рпеге з 90 - 150 реє/мл іонних груп; Рого5 Н5, який являє собою жорсткі полімерні гранули з каркасом, який складається зі зшитого полі(стирол-дивінілбензену|; Рого5 Х5, який являє собою жорсткі полімерні гранули з каркасом, який складається зі зшитого поліІ(стирол-дивінілбензену); Тоуо Реагі Сіда Сар
СМ 650М, який являє собою гранули з полімерною основою 0,225 мекв./мл іонної ємності; Тоуо
Реагі біда Сар 5 650ОМ, який являє собою гранули з полімерною основою; та Тоуо Реагі МХ ТЕР, який являє собою гранули з полімерною основою. Відзначено, що хроматографію СЕХ можна застосовувати зі смолами ММ, описаними в цьому документі.
Завантаження білка зразка, який містить білок, що становить інтерес, регулюють до загального завантаження білка в колонці від близько 5 г/л до близько 150 г/л, або від близько 10 г/л до близько 100 г/л, від близько 20 г/л до близько 80 г/л, від близько 30 г/л до близько 50 г/л, або близько від 40 г/л до близько 50 г/л. У певних варіантах здійснення концентрацію білка суміші завантаження білка регулюють до концентрації білка матеріалу, що підлягає завантаженню в колонку, від близько 0,5 г/л до близько 50 г/л, або від близько 1 г/л до близько 20 г/л.
Добавки, як-от полієтиленгліколь, миючі засоби, амінокислоти, цукри, хаотропні засоби, можуть бути додані для підвищення ефективності розділення для досягнення таким чином кращого розділення, вилучення та якості продукту.
У певних варіантах здійснення, включно з тими, що стосуються афліберцепту або антитіла до
МЕСЕ або МЕСЕ МіпіТгар, способи за цим винаходом можна застосовувати для селективного видалення, значного зниження або по суті видалення всіх оксо-варіантів у зразку, де білок, що становить інтерес, буде по суті являти собою проточну фракцію процедури СЕХ, тоді як оксо- варіанти будуть по суті захоплені середовищем колонки.
Е. Хроматографія зі змішаним режимом
Хроматографію зі змішаним режимом («ММ») можна застосовувати для отримання композицій за цим винаходом. Хроматографія ММ, яка також називається в цьому документі «багатомодальною хроматографією», являє собою хроматографічну стратегію, в якій застосовується підкладка, яка містить ліганд, здатний забезпечувати щонайменше дві різні взаємодії з аналітом або білком, що становить інтерес, зі зразка. Один із цих сайтів забезпечує привабливий тип взаємодії зарядів між лігандом і білком, що становить інтерес, а інший сайт забезпечує донорно-акцепторну взаємодію електронів та/або гідрофобну та/або гідрофільну взаємодію. Донорно-акцепторні взаємодії електронів включають такі взаємодії, як водневий зв'язок, п-п, катіон-тт, перенесення заряду, диполь-диполь, індукований диполь тощо.
Смола в колонці, що використовується для розділення зі змішаним режимом, може являти собою Саріо Айпеге. Саріо Адіпеге являє собою сильний аніонообмінний матеріал із багатомодальними технічними характеристиками. Його основна матриця являє собою сильно зшиту агарозу з лігандом (М-бензил-М-метилетанолмін), який проявляє різні функціональні можливості для взаємодії, наприклад іонна взаємодія, водневий зв'язок і гідрофобна взаємодія. У певних аспектах смола, що застосовується для розділення зі змішаним режимом, вибрана з РРА-
НурегсСеї і НЕА-НурегСеї!. Базові матриці РРА-НурегСеї і НЕА-НурегСе! являють собою зшиту целюлозу з високою пористістю. Їхніми лігандами є фенілпропіламін та гексиламін, відповідно.
Фенілпропіламін та гексиламін забезпечують різні варіанти селективності та гідрофобності для розділення білка. Додаткові підкладки для хроматографії зі змішаним режимом включають, без обмеження, Миміа С Ргіте, Тоуо Реагі МХ Тгр 650М та Ехптипо? НСХ. У певних аспектах смола для хроматографії зі змішаним режимом складається з лігандів, зв'язаних з органічною або неорганічною підкладкою, що іноді позначаються як базова матриця, безпосередньо або через роздільник. Підкладка може бути у формі частинок, як-от по суті сферичні частинки, моноліт, фільтр, мембрана, поверхня, капіляри, тощо. У певних аспектах підкладка отримана з вихідного полімеру, як-от зшитий вуглеводневий матеріал, наприклад, агароза, агар, целюлоза, декстран, хітозан, конжак, карагінан, гелан, альгінат, тощо. Для отримання високої адсорбційної здатності підкладка може бути пористою, та ліганди потім приєднуються до зовнішніх поверхонь, а також до поверхонь пор. Такі підкладки з вихідного полімеру можуть бути отримані згідно зі стандартними способами, як-от зворотне гелеутворення суспензії (5 Ніепеп: Віоспіт Віорпуз Асіа 79(2), 393-398 (1964), повний вміст якої включений у цей документ за допомогою посилання). В якості альтернативи, підкладка може бути отримана з синтетичного полімеру, як-от зшиті синтетичні полімери, наприклад, стирол або похідні стиролу, дивінілбензен, акриламіди, естери акрилату, естери метакрилату, вінілові естери, вініламіди, тощо. Такі синтетичні полімери можуть бути отримані за допомогою стандартних способів, див. «Зїугепе Ббазейа роїутег зиррогіз аемеІорейд ру зизрепвіоп роїЇутегігайоп» (К АгізПпаду: Спітіса е І "пдивійа 70(9), 70-75 (1988), повний вміст якої включений у цей документ за допомогою посилання). Підкладки з пористого вихідного або синтетичного полімеру також доступні з комерційних джерел, як-от СЕ НеайНсаге, Упсала,
Швеція.
Завантаження білка суміші біологічного зразка, яка містить білок, що становити інтерес, можна регулювати до загального завантаження білка в колонці від близько 25 г/л до близько 750 г/л, або від близько 75 г/л до близько 500 г/л або від близько 100 г/л до близько 300 г/л. У певних ілюстративних варіантах здійснення концентрацію білка суміші завантаження білка регулюють до концентрації білка матеріалу, завантаженого в колонку, від близько 1 г/л до близько 50 г/л, або від близько 9 г/л до близько 25 г/л.
Добавки, як-от полієтиленгліколь, миючі засоби, амінокислоти, цукри, хаотропні засоби, можуть бути додані для підвищення ефективності розділення для досягнення таким чином кращого розділення, вилучення та якості продукту.
У певних варіантах здійснення, включно з тими, що стосуються афліберцепту та/або МіпіТгар, способи за цим винаходом можна застосовувати для селективного видалення, значного зниження або по суті видалення всіх РТМ, включаючи оксо-варіанти.
Способи отримання композицій за цим винаходом можна застосовувати в безперервному режимі хроматографії. У цьому режимі застосовують щонайменше дві колонки (називаються «першою» колонкою і «другою» колонкою). У певних варіантах здійснення цей безперервний режим хроматографії можна здійснювати таким чином, що елюйовані фракції та/або очищені фракції, які містять РТМ, наприклад, оксо-варіанти, потім можуть бути завантажені послідовно або паралельно в другу колонку (з розведенням або без нього).
В одному варіанті здійснення вибране середовище для безперервного режиму може являти собою одну з багатьох хроматографічних смол із бічними гідрофобними та аніонообмінними функціональними групами, монолітне середовище, мембранно-адсорбуюче середовище або середовище для глибинної фільтрації.
Е. Хроматографія з гідрофобною взаємодією
Композиції за цим винаходом також можуть бути отримані з використанням хроматографії з гідрофобною взаємодією (НІС).
При здійсненні розділення біологічний зразок приводять у контакт із матеріалом для НІС, наприклад, із використанням методики серійного виробництва або з використанням колонкової або мембранної хроматографії. Перед обробкою за допомогою НІС може бути необхідно скоригувати концентрацію сольового буфера для досягнення необхідного зв'язування/взаємодії білків зі смолою або мембраною.
Оскільки іонообмінна хроматографія заснована на локальному заряді білка, що становить інтерес, для селективного розділення, у хроматографії з гідрофобною взаємодією застосовуються гідрофобні властивості білків для досягнення селективного розділення. Гідрофобні групи на білку або всередині білка взаємодіють із гідрофобними групами хроматографічної смоли або мембрани. Зазвичай у придатних умовах чим більше гідрофобний білок (або частини білка), тим сильніше він взаємодіє з колонкою або мембраною. Таким чином, у придатних умовах НІС можна застосовувати для полегшення відокремлення технологічних домішок (наприклад, НОР), а також споріднених речовин (наприклад, агрегатів та фрагментів) від білка, що становить інтерес, у зразку.
Подібно до іонообмінної хроматографії, колонка НІС або мембранний пристрій НІС також може працювати в режимі елюювання, проточному або гібридному режимі, в якому продукт зв'язується або взаємодіє з хроматографічним матеріалом, але може бути очищений від такого матеріалу з використанням буфера, який є таким самим або по суті аналогічним завантажувальному буферу. (Подробиці цих режимів описані вище у зв'язку з обробкою АЕХ.)
Оскільки гідрофобні взаємодії найбільш сильні при високій іонній силі, цю форму розділення зручно проводити після стадії елюювання солі, як-от ті, що зазвичай використовуються у зв'язку з іонообмінною хроматографією. В якості альтернативи, солі можна додавати до зразка перед застосуванням стадії НІС. Адсорбції білка на колонці НІС сприяє висока концентрація солі, але фактичний вміст може варіювати в широкому діапазоні залежно від природи білка, що становить інтерес, типу солі та конкретного вибраного ліганду НІС. Різні іони можуть бути організовані в так званий солофобний ряд залежно від того, чи сприяють вони гідрофобним взаємодіям (ефекти висолювання) або порушують структуру води (хаотропний ефект) і призводять до ослаблення гідрофобної взаємодії. Катіони класифікуються з точки зору збільшення ефекту висолення у вигляді Ва?; Са; Маг; Гі бв; Мах; КУ; Вр; МНаУ"», в той час як аніони можуть бути віднесені до категорії посилення хаотропного ефекту у вигляді РОг3; 5042; СНзСО»з ; СІ; Ви; МОз ; СіОєс; Г;
ЗОМ.
У цілому, сульфати Ма", К" або МН4- ефективно забезпечують взаємодію ліганду з білком із використанням НІС. Можуть бути складені солі, які впливають на силу взаємодії, що визначається таким співвідношенням: (МН4а)25О4 » Маг25О4 » Масі » МНАС1 » МаВг » Мазсм. Зазвичай корисні концентрації солі з вмістом сульфату амонію від 0,75 М до близько 2 М або Масі від 1 М до близько 4 М.
Середовище НІС зазвичай містить базову матрицю (наприклад, зшиту агарозу або синтетичний співполімерний матеріал), з якою зв'язані гідрофобні ліганди (наприклад, алкільні або арильні групи). Придатне середовище для НіС включає агарозну смолу або мембрану, функціоналізовану фенільними групами (наприклад, Рпепу! Зерпагозе"М від СЕ Неайнсаге або
Рпепу! Метрбгапе від Запогійи5). Багато видів смол НІС доступні у продажу. Приклади включають без обмеження Саріо РІепуїЇ, Рпепу! берпагозе"мМ б Раві Ріом/у з низьким або високим ступенем заміщення, РПепу! Зерпагозе"м Нідп Репогтапсе, Осіу! берпагозе"М Нідпн Репогтапсе (СЕ
Неайсаге); пропіл Ргасіоде!м ЕМО або феніл Егасіоде! м ЕМО (Е. МегсК, Німеччина); метил
Масго-Ргер"м або колонки з трет-бутилом Масго-Ргер "м (Віо-Кай, Каліфорнія); МУР. НІ-Ргоруї! (С3)у М (9. Т. ВакКкег, Нью-Джерсі); й етер, феніл або бутил Тоуореагі м (ТозоНаа;», РА); Тоуобсгееп РРО; феніл Тоуобсгееп; бутил ТоуозЗстгееєеп; гексил ТоуозЗстгеєеп; СЕ Нібсгееп та Виці ЕЕ Нібстгееп Осіді
ЕЕ.
Завантаження білка зразка, що містить білок, який становить інтерес, регулюють до загального завантаження білка в колонці від близько 50 г/л до близько 1000 г/л, від близько 5 г/л до близько 150 г/л, від близько 10 г/л до близько 100 г/л, близько від 20 г/л до близько 80 г/л, від близько 30 г/л до близько 50 г/л або від близько 40 г/л до близько 50 г/л. У певних варіантах здійснення концентрацію білка суміші завантаження білка регулюють до концентрації білка матеріалу, що підлягає завантаженню в колонку, від близько 0,5 г/л до близько 50 г/л, або від близько 1 г/л до близько 20 г/л.
Оскільки рН, вибраний для будь-якого конкретного виробничого процесу, має бути сумісним зі стабільністю та активністю білка, конкретні умови рН можуть бути специфічними для кожного застосування. Тим не менш, оскільки при рН 5,0-8,5 конкретні значення рН мають дуже невелике значення для кінцевої селективності та роздільної здатності НІС, такі умови можуть бути переважними. Підвищення рН послаблює гідрофобні взаємодії, й утримання білків змінюється різкіше при значеннях рН вище 8,5 або нижче 5,0. Крім того, зміни іонної сили, присутність органічних розчинників, температури та рН (особливо в ізоелектричній точці рі, коли немає чистого поверхневого заряду) можуть впливати на структуру та розчинність білка й, отже, на взаємодію з іншими гідрофобними поверхнями, як-от такі у середовищі НІС, й, отже, в деяких варіантах здійснення цей винахід включає стратегії отримання, в яких одне або більше з вищепереліченого регулюють для досягнення необхідного зниження технологічних домішок і/або споріднених речовин.
У певних варіантах здійснення способи спектроскопії, як-от УФ, МІК, ЕТІК, флуоресцентна та раманівська, можна застосовувати для моніторингу білка, що становить інтерес, і домішок у режимі в системі, в потоці або в контурі, який потім можна застосовувати для контролю рівня агрегатів в об'єднаному матеріалі, зібраному з вихідного потоку адсорбенту НІС. У певних варіантах здійснення способи моніторингу в системі, в потоці або в контурі можна застосовувати або в лінії вихідного потоку стадії хроматографії, або в посудині для збору для забезпечення досягнення необхідної якості/відновлення. У певних варіантах здійснення УФ-сигнал можна застосовувати в якості сурогату для досягнення відповідної якості/відновлення продукту, причому
Уф-сигнал може бути оброблений відповідним чином, включаючи, без обмеження, такі способи обробки, як інтеграція, диференціація та ковзне середнє, так що нормальна мінливість процесу може бути усунена і може бути досягнута цільова якість продукту. У певних варіантах здійснення такі вимірювання можуть бути об'єднані зі способами потокового розведення, так що концентрація іонів/провідність завантаження/промивання можна контролювати з використанням зворотного зв'язку й, отже, полегшувати контроль якості продукту. б. Ексклюзійна хроматографія
Ексклюзійна хроматографія або гельфільтрація заснована на розділенні компонентів залежно від їхнього молекулярного розміру. Розділення залежить від кількості часу, який речовини проводять у пористій стаціонарній фазі порівняно з часом, проведеним у рідині. Імовірність того, що молекула перебуватиме в порі, залежить від розміру молекули та пори. Крім того, здатність речовини проникати в пори визначається дифузійною рухливістю макромолекул, яка є вищою для невеликих макромолекул. Дуже великі макромолекули можуть взагалі не проникати у пори стаціонарної фази; а для дуже маленьких макромолекул ймовірність проникнення близька до одиниці. У той час як компоненти з більшою молекулярною масою переміщуються швидше крізь стаціонарну фазу, компоненти з малим молекулярним розміром мають велику довжину шляху крізь пори стаціонарної фази і, таким чином, довше затримуються в стаціонарній фазі.
Хроматографічний матеріал може містити матеріал розділення за розміром, де матеріал розділення за розміром являє собою смолу або мембрану. Матриця, яка застосовується для виключення розміру, переважно являє собою інертне гелеве середовище, яке може являти собою композит із поперечно-пошитих полісахаридів, наприклад, поперечно-зшитої агарози та/або декстрану у формі сферичних кульок. Ступінь зшивки визначає розмір пір, присутніх у набряклих гранулах гелю. Молекули більше за визначений розмір не потрапляють у гранули гелю і, таким чином, найбільш швидко проходять крізь хроматографічний шар. Більш дрібні молекули, як-от миючий засіб, білок, ДНК тощо, які проникають у гранули гелю різною мірою залежно від їх розміру та форми, затримуються при проходженні крізь шар. Таким чином, молекули зазвичай елююються в порядку зменшення розміру молекул.
Пористі хроматографічні смоли, придатні для гельхроматографії вірусів, можуть складатися з декстрози, агарози, поліакриламіду або діоксиду кремнію, які мають різні фізичні характеристики.
Також можна використовувати комбінації полімерів. Найчастіше застосовують ті, що продаються під торговою назвою ЗЕРНАОЕХ від Атегейпат Віозсіепсе5. Також підходять підкладки іншого розміру з інших конструкційних матеріалів, наприклад, Тоуореагі 55Е (поліметакрилат від То5зоПп
Віозсіепсе, Мопідотегу Ра.) та Віо-Се! Р-30 Ріпе (ВіоКає І абогагієз5, Геркулес, Каліфорнія).
Завантаження білка зразка, що містить білок, який становить інтерес, може регулювати до загального завантаження білка в колонці від близько 50 г/л до близько 1000 г/л, близько від 5 г/л до близько 150 г/мл, від близько 10 г/л до близько 100 г/л, від близько 20 г/л до близько 80 г/л, від близько 30 г/л до близько 50 г/л, або від близько 40 г/л до близько 50 г/л. У певних варіантах здійснення концентрацію білка суміші завантаження білка регулюють до концентрації білка матеріалу, що підлягає завантаженню в колонку, від близько 0,5 г/л до близько 50 г/л, або від близько 1 г/л до близько 20 г/л.
Н. Вірусна фільтрація
Вірусна фільтрація являє собою спеціальну стадію виробничого процесу, яка знижує вірусне навантаження. Цю стадію зазвичай виконують після хроматографічного полірування. Зниження кількості вірусів можна досягти з використанням придатних фільтрів, включаючи без обмеження
Ріапома 20М7М, 50 М або ВіоЕх від Азайі Казеї Рпагта, фільтри Мігезоїме"М від ЕМО Мійіроге,
Мігозап СРМ від бапогіи5, або фільтр Шброг ЮОМ20 або ЮМ5О "М від Раї! Согрогайоп. Звичайному фахівцю в цій області буде очевидним вибір придатного фільтра для отримання необхідних характеристик фільтрації.
І. Ультрафільтрація/діафільтрація
У певних варіантах здійснення цього винаходу застосовуються ультрафільтрація та діафільтрація для додаткової концентрації та складання білка, що становить інтерес.
Ультрафільтрація докладно описана в МісгойКгайоп апа ОкКгайнгайоп: Ргіпсірієз апа Арріїсайоп5, Ї. гетап апа А. 2уапеу (Магсеї! ЮОекККег, Іпс., Мем/ МогК, М.У., 1996); і в Ойгайнкгайоп НапабоокК, Мипіг
СНегуап (Тесппотіс Рибіїзпіпу, 1986; ІЗВМ Мо. 87762-456-9); повний вміст якої включений в цей документа допомогою посилання. Одним із процесів фільтрації є фільтрація тангенціального потоку, як описано в каталозі МіПроге під назвою «РНагтасецшіїса! Ргосез5 Еійгайоп Сагаюдие» стор. 177-202 (Веатога, Мавз5., 1995/96), повний вміст якого включений у цей документ за допомогою посилання. Під ультрафільтрацією зазвичай розуміють фільтрацію з використанням фільтрів із розміром пор менше 0,1 мкм. При використанні фільтрів, які мають такий маленький розмір пор, обсяг зразка може бути зменшений за рахунок проникнення буфера для зразка крізь пори мембрани фільтра, в той час як білки залишаються над поверхнею мембрани.
Фахівець у цій галузі може вибрати придатний пристрій мембранного фільтра для операції
Уф/ДФ. Приклади мембранних касет, придатних для цього винаходу, включають, без обмеження, касети Реїїсоп 2 або Рейсоп З з мембранами 10 кДа, 30 кДа або 50 кДа від ЕМО МійПіроге, мембранні касети Кміск 10 кДа, 30 кДа або 50 кДа від СЕ Неайсаге, і касети Сепігатаїє або
Сепігазеце 10 кДа, 30 кДа або 50 кДа від Раї! Согрогайоп.
У. Ілюстративні стратегії отримання
Первинне відновлення може відбуватися шляхом послідовного застосування зниження рн, центрифугування та фільтрації для видалення клітин та клітинних залишків (включно з НСР) зі збору виробничого біореактора. Цей винахід спрямований на біологічний зразок, який містить білок, що становить інтерес, з первинного відновлення однією або більше стадіями отримання, включаючи (без визначеного порядку) АЕХ, СЕХ, 5ЕС, НІС і/або ММ. Певні аспекти цього винаходу включають додаткові етапи обробки. Приклади додаткових процедур обробки включають осадження етанолом, ізоелектричне фокусування, обернено-фазову ВЕРХ, хроматографію на силікагелі, хроматографію на гепарині Зерпагозе"М, подальшу аніонообмінну хроматографію та/або подальшу катіонообмінну хроматографію, хроматофокусування, 505-
РАСЕ, осадження сульфатом амонію, хроматографія з гідроксиапатитом, гель-електрофорез, діаліз та афінну хроматографію (наприклад, із використанням білка А або с, антитіла, специфічного субстрату, ліганду або антигену в якості реагента захоплення). У певних аспектах температура колонки (а також інші параметри) можуть незалежно варіювати для покращення ефективності розділення та/або виходу будь-якої конкретної стадії отримання.
У певних варіантах здійснення незв'язана проточна фракція та промивні фракції можуть бути додатково фракціоновані та комбінація фракцій, які забезпечують цільову чистоту продукту, можуть бути об'єднані.
Стадії завантаження колонки і промивання можуть контролюватись за допомогою вимірювання в контурі, в потоці або поза контуру рівнів домішок/речовин, пов'язаних із продуктом, або у вихідному потоці колонки, або в зібраному пулі, або в обох, для досягнення конкретної цільової якості продукції та/або виходу. У деяких варіантах здійснення концентрацію в завантаженні можна динамічно контролювати за допомогою розведення в контурі, серійного або безперервного розведення буферами або іншими розчинами для досягнення розділення, необхідного для підвищення ефективності розділення та/або виходу.
Приклади таких виробничих процесів зображені на фіг. 5-8.
На фіг. 5 представлений один ілюстративний варіант здійснення, який застосовується для отримання афліберцепту. Посилаючись на фіг. 5, спосіб включає (а) експресію афліберцепту в клітині- господарі, культивованій у ХВС; (Б) захоплення афліберцепту з використанням першої підкладки для хроматографії, яка може включати афінну смолу для захоплення; та (с) приведення в контакт щонайменше частини афліберцепту з другою підкладкою для хроматографії, яке може включати аніонообмінну хроматографію. Стадія (с) може додатково включати промивання колонки АЕХ і збір проточної фракції(-й) зразка, який містить афліберцепт. Необов'язково, стадія (с) може включати очищення другої хроматографічної підкладки та збір очищених фракцій. Ці стадії можуть бути виконані за стандартною методикою у поєднанні з методологією, згаданою вище. Слід розуміти, що фахівець у цій галузі може надати перевагу застосуванню СЕХ замість або на додаток до АЕХ. Довільно можна застосовувати додаткові хроматографічні стадії, включаючи, без обмеження, НІС і ЗЕС.
На додаток до ілюстративного варіанту здійснення на фіг. 5 інший додатковий ілюстративний варіант здійснення (4) приведення в контакт щонайменше частини зазначеного афліберцепту, отриманого на стадії (с), з третьою хроматографічною підкладкою. В одному аспекті протокол може включати (е) приведення в контакт щонайменше частини афліберцепту зі стадії (а) з четвертою хроматографічною підкладкою. В одному аспекті цього варіанта здійснення протокол може необов'язково включати піддавання зразка, який містить афліберцепт зі стадії (с), впливу рН менше 5,5. В одному аспекті цей спосіб включає стадію освітлення перед стадією (а).
На фіг. 6 представлений один ілюстративний варіант здійснення, який застосовується для отримання МЕСЕ МіпіТгар. Цей спосіб включає (а) експресію афліберцепту в клітині-господарі, культивованій у ХВС; (Б) захоплення афліберцепту з використанням першої хроматографічної підкладки, яка може включати смолу для афінної хроматографії; (с) відщеплення афліберцепту з видаленням таким чином домену Ес та утворенням зразка, який містить МЕСЕ МіпіТгар; (4) приведення в контакт зразка зі стадії (с) з другою хроматографічною підкладкою, яка може являти собою афінну хроматографію та (є) приведення в контакт проточної фракції зі стадії (4) з третьою хроматографічною підкладкою, яка може включати аніонообмінну хроматографію. Стадія (а) включає збір проточної фракції(-й), де внаслідок відсутності домену Ес МіпіТтар повинен знаходитися, тоді як афліберцепт або будь-який інший білок, що має домен Ес, має по суті взаємодіяти з афінною колонкою на стадії (4). Необов'язково, стадія (4) може включати очищення третьої хроматографічної підкладки та збір очищених фракцій. Ці стадії можуть бути виконані відповідно до стандартної методики у поєднанні з методологією, викладеною вище. У довільному порядку можуть бути включені, без обмеження, додаткові хроматографічні стадії, НІС і 5ЕС.
На фіг 7 представлений один ілюстративний варіант здійснення для отримання афліберцепту. Цей спосіб включає (а) експресію афліберцепту в клітині-господарі, культивованій в ХВС; (5) захоплення афліберцепту з використанням першої хроматографічної підкладки, яка може включати катіонообмінну хроматографію; та (с) приведення в контакт проточної фракції зі стадії (5) з другою хроматографічною підкладкою, яка може включати аніонообмінну хроматографію. Необов'язково, стадія (с) може включати очищення другої хроматографічної підкладки та збір очищених фракцій. Ці стадії можуть бути виконані відповідно до стандартної методики у поєднанні з протоколами, згаданими вище. У довільному порядку можна застосовувати додаткові хроматографічні процедури, включаючи, без обмеження, НІС та 5ЕС.
На фіг. 8 представлений один ілюстративний варіант здійснення для отримання МЕСЕ
МіпіТгар. Цей спосіб включає (а) експресію афліберцепту в клітині-господарі, культивованій у
ХВО; (Б) захоплення афліберцепту з використанням першої хроматографічної підкладки, яка може включати іонообмінну хроматографію; (с) піддавання проточної фракції з (Б), що містить афліберцепт, афінній хроматографії; елюювання, причому елюювання включає афліберцепт; (а) піддавання афліберцепту (с) активності відщеплення, при цьому домен Ес розщеплюється, утворюючи МЕСЕ МіпіТгар. В одному аспекті іонний обмін зі стадії (Б) включає АЕХ. В якості альтернативи, стадія (Б) може включати СЕХ. У довільному порядку можуть бути включені додаткові хроматографічні стадії, як-от додаткові стадії іонообмінної хроматографії після стадії (4), додавання НІС та/або 5ЕС.
МІЇ. Фармацевтичні склади, що містять композиції
У цьому винаході також розкриті склади, що містять композиції проти МЕСЕ (як описано вище).
Придатні склади білків проти МЕСЕ включають, без обмеження, склади, описані в патенті США Мо 7608261, патенті США Мо 7807164, патенті США Мо 8092803, патенті США Мо 8481046, патенті
США Мо 8802107, патенті США Мо 9340594, патенті США Мо 9914763, патенті США Мо 9580489, патенті США Мо 10400025, патенті США Мо 8110546, патенті США Мо 8404638, патенті США Мо 8710004, патенті США Мо 8921316, патенті США Мо 9416167, патенті США Мо 9511140, патенті
США Мо 9636400 та патенті США Мо 10406226, всі з яких включені в цей документ шляхом посилання в усій своїй повноті.
Технології попереднього процесу (описані у розділі ЇМ вище), і технології подальшого процесу (описані в розділі М вище) можна застосовувати окремо або у комбінації один з одним для здійснення отримання складу.
У цьому винаході розкриті склади, що містять композиції проти МЕСЕ, спільно з одним або більше інгредієнтами/допоміжними речовинами, а також способи застосування та способи отримання таких композицій. В одному варіанті здійснення цього винаходу фармацевтичний склад за цим винаходом має рН приблизно 5,5, 5,6, 5,7, 2,8, 5,9,6,0, 6,1 або 6.2.
Для отримання фармацевтичних складів композицій проти МЕСЕ композицію проти МЕСЕ змішують з фармацевтично прийнятним носієм або допоміжною речовиною. Див., наприклад,
Ветіпдіоп'є Рпагтасеціїса! 5сіепсе5 апа 0.5. Рпаптасореїа: Маїопа! Роптшіагу, Маск Рибіїзпіпу
Сотрапу, Еазіоп, Ра. (1984); Нагатанп, еї а. (2001) Соодтап апа Сітап'є Те РІаптпасоіоадіса!
Вазі5 ої Тнегареціїс5, МесСтам-НІіЇЇ, Мемж/ Мої, М.М.; Сеппаго (2000) Ветіпдіоп: ТНе 5сіепсе апа
Ргасіїсе ої Рпаптасу, Іірріпсой, УМіПат»в, апа УМїКіп5, Мем/ Мої/К, М.М.; Амів, еї аї. (еавз.) (1993)
Рпаптасешіса! Бозаде Еопт5: Рагепієга! Медісайоп5, Магсе! ЮОекКег, МУ; Іерептап, еї аї. (еав.) (1990) Рпаптасешіса! Юозаде Еопте: Тарієї5, Магсе! ОекККег, МУ; І іерептап, еї аї. (єадз.) (1990)
Рпагтасешіїса! Оозаде Роптв: Оізрегзе бузівєтв5, Магсе! ЮОекКег, МУ; У/еіпег апа КоїковКіє (2000)
Ехсіріепі Тохісйу апа Заїеку, Магсеї! ОеккКег, Іпс., Мем/ Хогк, МУ; повний вміст яких включений у цей документ за допомогою посилання. В одному варіанті здійснення цього винаходу фармацевтичний склад є стерильним.
Фармацевтичні склади за цим винаходом включають композицію проти МЕСЕ і фармацевтично прийнятний носій, включаючи, наприклад, воду, буферні засоби, консерванти та/або миючі засоби.
У цьому винаході представлений фармацевтичний склад, що містить будь-які композиції проти
МЕСБЕ, викладені в цьому документі, і фармацевтично прийнятний носій, наприклад, причому концентрація поліпептиду становить близько 40 мг/мл, близько 60 мг/мл, близько 80 мг/мл, близько 90 мг/мл, близько 100 мг/мл, близько 110 мг/мл, близько 120 мг/мл, близько 130 мг/мл, близько 140 мг/мл, близько 150 мг/мл, близько 200 мг/мл або близько 250 мг/мл.
Обсяг цього винаходу включає зневоднені, наприклад, ліофілізовані композиції, що містять білок проти МЕСЕ і фармацевтично прийнятний носій, який по суті (від приблизно 8595 до приблизно 9995 або більше) не містить воду.
В одному варіанті здійснення додатковий терапевтичний засіб, який вводять суб'єкту спільно з композицією проти МЕСЕ, розкритою в цьому документі, вводять суб'єкту згідно з Рпузісіапе" Оевзк
Веїегепсе 2003 (Тпотзоп Неайнсаге; 57-е видання (1 листопада 2002 р.), вміст якого включений у цей документ за допомогою посилання).
У цьому винаході представлена посудина (наприклад, пластиковий або скляний флакон із кришкою або хроматографічною колонкою, порожнисту голку або циліндр шприца), що містить будь-яку з композицій проти МЕСЕ або фармацевтичний склад, що містить фармацевтично прийнятний носій, описаний у цьому документі. У цьому винаході також представлений ін'єкційний пристрій, який містить композицію проти МЕСЕ або склад, наведений у цьому документі, наприклад, шприц, попередньо заповнений шприц або шприц-ручка. В одному аспекті посудина забарвлена (наприклад, у коричневий колір) для блокування світла, природного або іншого.
Цей винахід включає комбінації, які включають композицій проти МЕСЕ спільно з одним або більше додатковими терапевтичними засобами. Композиція проти МЕСЕ і додатковий терапевтичний засіб може перебувати в одній композиції або в окремих композиціях. Наприклад,
терапевтичний засіб являє собою інгібітор Апд-2 (наприклад, несвакумаб), активатор рецептора
Тіе-2, антитіло до РОСЕ або його антигензв'язувальний фрагмент, рецептор проти РОСЕ або антитіло до рецептора РОСЕ бета або його антигензв'язувальний фрагмент та/або додатковий антагоніст МЕСЕ, як-от афліберцепт, конберцепт, бевацизумаб, ранібізумаб, аптамер до МЕСЕ, як-от пегаптаніб (наприклад, пегаптаніб натрію), одноланцюгове (наприклад, МІ-МН) антитіло до
МЕСРЕ, як-от бролуцизумаб, САКРІп до МЕСЕ, як-от ОАКРІПп абіципар пегол, біспецифічне антитіло до МЕСЕ, наприклад, яке також зв'язується з АМО2, наприклад, КС7716, або розчинна форма рецептора З фактора росту ендотелію судин людини (МЕСЕК-3), що містить позаклітинні домени 1-3, які експресуються у вигляді Ес-злитого білка.
МІЇЇ. Способи лікування
У цьому винаході представлені способи лікування або попередження раку (наприклад, зростання та/або метастазування якого опосередковано, щонайменше частково, МЕСБЕ, наприклад, МЕСЕ-опосередкований ангіогенез) або ангіогенного захворювання очей у суб'єкта, що включає введення терапевтично ефективної кількості композицій, описаних у цьому документі (розділ ІЇЇ вище).
Технології попереднього процесу (розділ ІМ вище), технології подальшого процесу (розділи М та МІ вище) можна застосовувати окремо або у комбінації одна з одною з отриманням композицій, описаних у розділі І, та/або складів, описаних у розділі МІЇ, які можна застосовувати для лікування або попередження різних розладів, включно з офтальмологічним та онкологічним захворюванням.
У цьому винаході також представлений спосіб введення композицій, наведених у цьому документі (розділ ПШ та розділ МІ), суб'єкту (наприклад, людині), який включає введення композицій з близько 0,5 мг, 2 мг, 4 мг, 6 мг, 8 мг, 10 мг, 12 мг, 14 мг, 16 мг, 18 мг або 20 мг білка, що становить інтерес, (наприклад, афліберцепт або МіпіТтар) в не більше близько 100 мкл, наприклад, близько 50 мкл, близько 70 мкл або близько 100 мкл, і необов'язково додатковий терапевтичний засіб, в організм суб'єкта за допомогою, наприклад, внутрішньоочної ін'єкції, наприклад, за допомогою інтравітреальної ін'єкції.
У цьому винаході представлений спосіб лікування раку, зростання та/або метастазування якого опосередковано, щонайменше частково, за допомогою МЕСЕ, наприклад, МЕСБЕ- опосередкований ангіогенез або ангіогенне захворювання очей у суб'єкта, який потребує цього, при цьому спосіб включає введення терапевтично ефективної кількості композицій, наведених у цьому документі (розділ І та розділ МІЇ вище), наприклад, 2 мг, 4 мг, 6 мг, 8 мг або 10 мг білка, що становить інтерес, у не більше близько 100 мкл, і необов'язково додаткового терапевтичного засобу, суб'єкту. В одному варіанті здійснення цього винаходу введення здійснюють за допомогою інтравітреальної ін'єкції. Необмежувальні приклади ангіогенних захворювань очей, які можна лікувати або попереджати з використанням описаних у цьому документі, включають - вікову макулярну дистрофію (наприклад, вологу або суху), - макулярний набряк, - макулярний набряк після оклюзії вени сітківки, - оклюзію вени сітківки (ЕМО), - оклюзію центральної вени сітківки (СКМО), - оклюзію вени гілки сітківки (ВКМО), - діабетичний макулярний набряк (ОМЕ), - хоріоїдальну неоваскуляризацію (СММ), - неоваскуляризацію райдужної оболонки, - неоваскулярну глаукому, - післяопераційний фіброз при глаукомі, - проліферативну вітреоретинопатію (РМК), - неоваскуляризацію диска зорового нерва, - неоваскуляризацію рогівки, - неоваскуляризацію сітківки, - неоваскуляризацію склоподібного тіла, - паннус, - крилоподібну пліву, - судинну ретинопатію,
- діабетичну ретинопатію у суб'єкта з діабетичним макулярним набряком; і - діабетичні ретинопатії (наприклад, непроліферативну діабетичну ретинопатію (наприклад, яка характеризується рівнем за шкалою тяжкості діабетичної ретинопатії (ОК55) від близько 47 або 53) або проліферативну діабетичну ретинопатію; наприклад, у суб'єкта, який не страждає на
ОМЕ).
Спосіб введення таких композицій або композицій (розділ І та розділ МІЇ) може варіювати та може визначається досвідченим фахівцем. Способи введення включають парентеральний, відмінний від парентерального, пероральний, ректальний, трансмукозальний, кишковий, парентеральний; внутрішньом'язовий, підшкірний, внутрішньошкірний, інтрамедулярний, інтратекальний, прямий внутрішньошлуночковий, внутрішньовенний, внутрішньоочеревинний, інтраназальний, внутрішньоочний, інгаляційний, інсуфляційний, зовнішній, шкірний, внутрішньоочний, інтравітреальний, крізьшкірний або внутрішньоартеріальний.
В одному варіанті здійснення цього винаходу інтравітреальна ін'єкція фармацевтичного складу за цим винаходом (який включає композиції або склади за цим винаходом) включає стадію проколу ока шприцом та голкою (наприклад, ін'єкційною голкою 30 калібру), що містять склад, та ін'єкцію складу (наприклад, не більше близько 100 мікролітрів; близько 40, 50, 55, 56, 57, 57,1, 58, 60 або 70 мікролітрів) у склоподібне тіло ока в достатньому обсязі з метою доставки терапевтично ефективної кількості, наведеної в цьому документі, наприклад, близько 2, 4, 6, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 10 або 20 мг білка, що становить інтерес. Необов'язково, способи включають стадії введення місцевого анестетика (наприклад, проксиметакаїну, лідокаїну або тетракаїну), антибіотика (наприклад, фторхінолону), антисептика (наприклад, повідон-йоду) та/або засобу для розширення зіниці в око, яке підлягає ін'єкції. В одному аспекті перед ін'єкцією створюється стерильне поле навколо ока, яке підлягає ін'єкції. Після інтравітреальної ін'єкції суб'єкта контролюють щодо підвищення внутрішньоочного тиску, запалення та/або артеріального тиску.
Ефективна або терапевтично ефективна кількість білка, що становить інтерес, для ангіогенного захворювання очей, стосується кількості білка, що становить інтерес, достатньої для того, щоб викликати регрес, стабілізацію або усунення раку або ангіогенного захворювання очей, наприклад, за допомогою регресу, стабілізації або усунення одного або більше симптомів або ознак раку або ангіогенного захворювання очей до будь-якого клінічно вимірюваного ступеня, наприклад, відносно ангіогенного захворювання очей, викликаючи скорочення або підтримання шкали тяжкості діабетичної ретинопатії (ОК55), за допомогою покращення або підтримання зору (наприклад, у найбільш скоригованій гостроті зору, виміряній збільшенням букв ЕТОК5Б), збільшення або підтримання поля зору та/або зменшення або підтримання центральної товщини сітківки та, відносно раку, зупинки або обернення назад зростання, виживаності та/або метастазування ракових клітин у суб'єкта.
В одному варіанті здійснення цього винаходу ефективна або терапевтично ефективна кількість білка, що становить інтерес, як-от афліберцепт, для лікування або попередження ангіогенного захворювання очей становить близько 0,5 мг, 2 мг, З мг, 4 мг, 5 мг, 6 мг, 7 мг, 7,25 мг, 7,7 мг, 7,9 мг, 8,0 мг, 8,1 мг, 8,2 мг, 8,3 мг, 8,4 мг, 8,5 мг, 8,6 мг, 8,7 мг, 8,8 мг, 8,9 мг, 9 мг, 10 мг, 11 мг, 12 мг, 13 мг, 14 мг, 15 мг, 16 мг, 17 мг, 18 мг, 19 мг або 20 мг, наприклад, у не більше близько 100 мкл. Кількість може варіювати залежно від віку і розміру суб'єкта, який потребує введення, цільового захворювання, умов, способу введення, тощо. У певних ілюстративних варіантах здійснення за вихідною дозою може йти введення другої або множини наступних доз білка, що становить інтерес, у кількості, яка може бути приблизно такою самою, або меншою, або більшою, ніж початкова доза, причому наступні дози розділені щонайменше 1-3 днями; щонайменше одним тижнем, щонайменше 2 тижнями; щонайменше З тижнями; щонайменше 4 тижнями; щонайменше тижнями; щонайменше б тижнями; щонайменше 7 тижнями; щонайменше 8 тижнями; щонайменше 9 тижнями; щонайменше 10 тижнями; щонайменше 12 тижнями; або щонайменше 14 тижнями.
Слід зазначити, що значення дозування можуть змінюватись залежно від типу та тяжкості стану, який необхідно пом'якшити. Слід також розуміти, що для будь-якого конкретного суб'єкта конкретні схеми застосування можуть коригуватися з часом відповідно до індивідуальної потреби та професійного судження особи, яка здійснює або контролює введення композицій, і що діапазони доз, зазначені в цьому документі, є тільки ілюстративними і не призначені для обмеження обсягу або практики заявленої композиції.
ЇХ. Спосіб аналізу білкових варіантів
Рівні білкових варіантів у хроматографічному зразку, отриманому з використанням описаних у цьому документі методик, можуть бути проаналізовані, як описано в прикладах нижче. У деяких варіантах здійснення застосовують спосіб СІЕЕ з використанням аналізатора ІСЕЗ (Ргоївіпбітріє) з капілярним картриджем, покритим фторвуглецем (100 мкм х 5 см). Розчин амфоліту складається з суміші 0,3595 метилцелюлози (МС), 495 амфолітів-носіїв Рпагтаїйусе 3-10, 495 амфолітів-носіїв
Рпаптаїуїе 5-8, 10 ммоль І -аргініну НСІ, 2495 формаміду та маркерів рі 5,12 та 9,77 в очищеній воді. Аноліт являє собою 80 ммоль фосфорної кислоти, а католіт являє собою 100 ммоль гідроксиду натрію, обидва в 0,1095 метилцелюлози. Зразки розводили очищеною водою до 10 мг/мл. Зразки змішували з розчином амфоліту, а потім фокусували, створюючи потенціал 1500 В протягом однієї хвилини, а потім потенціал 3000 В протягом 7 хвилин. Зображення сфокусованих варіантів отримували за допомогою пропускання ультрафіолетового світла 280 нм крізь капіляр і в лінзу цифрової камери пристрою з зарядовим зв'язком. Потім це зображення аналізували для визначення розподілу різних варіантів заряду. Фахівці у цій галузі можуть змінювати точні параметри, досягаючи у своїй необхідного результату.
У тексті опису цитуються різні публікації, включаючи патенти, патентні заявки, опубліковані патентні заявки, номери доступу, технічні статті та наукові статті. Кожне з цих цитованих посилань повністю включена за допомогою посилання.
Цей винахід стане більш зрозумілим із наведених нижче прикладів. Однак їх не слід розглядати як такі, що обмежують обсяг винаходу.
ПРИКЛАДИ
МіпіТгтар (МТ) 1-6, які обговорюються в прикладах, є такими:
МТ1: МЕСЕ МіпіТгтар, отриманий за допомогою відщеплення афліберцепту, отриманого з використанням ХВСІ1.
МТ2: МЕСЕ МіпіТгтар, отриманий за допомогою відщеплення афліберцепту, отриманого з використанням ХВС2.
МТЗ: МЕСЕ МіпіТгтар, отриманий за допомогою відщеплення афліберцепту, отриманого з використанням ХВСЗ.
МТ4: МЕеЕаЕ МіпіТтар, отриманий за допомогою відщеплення афліберцепту, отриманого з використанням гідролізату сої.
МТ»: рекомбінантний МЕСЕ МіпіТгар (димер).
МТ6: рекомбінантний МЕСЕ МіпіТгар (зсЕм).
Характеристики МТ, МТ»5 та МТ описані нижче у прикладі 8.
Оцінка кольору зразків
Спосіб спектрофотометричного аналізу для вимірювання значення Б" (СІЕЇ АВ) виявився придатним для виконання оцінки кольору.
Поглинання зразка білка об'ємом 1 мл визначали кількісно за спектром видимого світла (від 380 до 780 нм), і криву поглинання перетворювали на колірний простір СІЕГ АВ з використанням набору матричних операцій. Інструмент може обробляти приблизно б зразків на годину. У високопродуктивному форматі аналізу застосовували зчитувальний пристрій для планшетів
СІ АВІОзІаг (ВМО І абіесп). Можна проаналізувати до 96 зразків із використанням 9б-лункового планшета, для якого необхідно 0,3 мл зразка.
Для перетворення стандартів ВУ на значення Б" еталонні стандарти ВУ (від ВУ! до ВУ7) були кількісно визначені з використанням формату високопродуктивного аналізу.
Розчини отримували відповідно до стандартів ВУ, описаних вище. Значення Б" для кожного зі стандартів показано на фіг. 9. Цей спосіб забезпечив більш швидкий аналіз із меншими вимогами до зразків і більш короткий час аналізу, як показано нижче в таблиці 3. Для всіх зразків, які оцінюються з використанням цього способу, концентрацію білка у зразках для випробування стандартизували до 5 г/л або 10 г/л.
Таблиця З 11111111 Вихідний | Висока пропускна здатність сенетнення о Денеснт 00 Толдрент ормат вимірювання кювета (окрема) частина)
Приклад 1. Отримання білка з використанням середовища з хімічно визначеним складом 111 Джерело та збір клітин
У поточному дослідженні застосовували клітинну лінію, яка продукує афліберцепт. Клітинні лінії, які продукують афліберцепт, культивували і збирали з використанням середовища з хімічно визначеним складом (ХВО). 1.2 Протеолітичне відщеплення афліберцепту
Колонку з іммобілізованим ферментом Ідез (РаркІСАТОМКФ, отриманим від Сепомів (Кембридж, Массачусетс)), застосовували для утворення МТ1. Афліберцепт, отриманий зі збору клітинних культур (20 мг 1,0 мл буфера для розщеплення), додавали в колонку та інкубували протягом 30 хв при 18"С. Через 30 хв. колонку промивали буфером для відщеплення (1,0 мл).
Суміш для розщеплення та промивні розчини об'єднували. Суміш завантажували на аналітичну колонку з білком А та елюювали (Арріїед Віозузвіетеь "мМ, РОКОМ 20 мкмоль білка А, картридж 2,1х30 ммоль, 0,1 мл (Мо за каталогом 2-1001-00)3). Обробку проводили згідно з протоколом
Арріїед Віозузіетв"М для картриджа РОКО5"М 20 мкмоль білка А 2,1х30 ммоль, 0,1 мл (Мо за каталогом 2-1001-00). Висота колонки становила 20 ж 1,0 см, час перебування становив 15 хвилин, і врівноважування/відмивання проводили з використанням 40 ммоль буфера трис, 54 ммоль ацетату рН 7,0 0,1.
Приклад 2. Аніонообмінна хроматографія (АЕХ) для зведення кольору до мінімуму (А) АЕХ застосовували для зменшення утворення кольору
Хроматографію АЕХ застосовували для видалення забарвлення, отриманого під час отримання афліберцепту, експресованого з використанням ХВС1. 2.1 Дизайн
Для цього дослідження виконували п'ять розділень АЕХ, як детально описано в таблиці 2-1, з протоколом АЕХ, як описано в таблиці 2-2. Колонку ОО Зерпагозе Равзі Ріом/ об'ємом 15,7 мл (висота шару 19,5 см, внутрішній діаметр 1,0 см) та колонку РОКО5 50 НО об'ємом 14,1 мл (висота шару 18,0 см, внутрішній діаметр 1,0 см) інтегрували в настільний контролер рідинної хроматографії АКТА Амапі. рН завантаження АЕХ доводили до цільового значення х 0,05 одиниць рН з використанням 2 моль трис-основи або 2 моль оцтової кислоти. Електропровідність завантаження АЕХ доводили до цільового значення х 0,1 мСм/см із використанням 5 моль хлориду натрію або деіонізованої води. Усі зразки пулу аналізували щодо високої молекулярної маси (НМУ), кольору та виходу.
Таблиця 2-1
Коротке викладення дизайну дослідження зменшення кольору АЕХ
Таблиця 2-2
Протокол АЕХ для зниження кольору
Об'єм Лінійна
Стадія Опис Рухома фаза колонки швидкість
СУ см/год.
Попереднє . ммоль буфера трис, мінлива 2 Урівноваження кількість ммоль Масі 2 200
Змінні рН та провідність зе Ото 0015
З Завантаження г. г, 200
Змінні рН та провідність смола 50 ммоль буфера трис, мінлива 4 ЕТПпромивання кількість ммоль Масі 2 200
Змінні рН та провідність 6 |Очищення2 | н.огідроксидунатрю(МаснН) | 7-2 2 | 200 2.2. Результати
Застосування розділення АЕХ для виробництва показало значне зменшення кольору. (Таблиця 2-3). Наприклад, як видно в таблиці 2-3, колір, що спостерігається у проточній фракції (ЕТ) та промиванні у розділенні АЕХ 1 (рН 8,30-8,50, 1,90-2,10 мСм/см), мав значення ар" 1,05 у порівнянні з кольором завантаження для АЕХ («Завантаження АЕХ») зі значенням ар" 3,06.
Збільшення значення Б" відображає інтенсивність жовто-коричневого забарвлення зразка.
Здійснювали п'ять розділень АЕХ для оцінки впливу смоли (0 Зерпагозе ЕЕ або РОКО5 50
НО) та заданої величини рн і провідності (рН 8,40 та 2,00 мСм/см, рН 8,00 та 2,50 мСм/см або рн 7,80 та 4,00 мСм/см) на зменшення кольору. Для РОКО5 50 НО виходи (64,4, 81,9 та 91,495) та рівні пулу НМУУ (1,02, 1,29 та 1,8395) підвищувалися при зміні заданої величини на більш низький рН ії більш високу провідність. Колір (значення Б") також збільшився (1,05, 1,33 і 1,55), оскільки задану величину змінювали на більш низький рН і більшу провідність. Більш високі рівні рН та нижча провідність забезпечували найбільше зниження кольору порівняно з розділенням АЕХ для
РОВОЗ5 50 НО.
Для О Зерпагозе Раві Ріом/ виходи (49,5 та 77,79о) та рівні НМУМ у пулі (0,59 та 1,2595) також збільшувалися, оскільки задану величину змінювали на більш низький рН і більш високу провідність. Колір (значення Б") також збільшився (0,96 і 1,35), оскільки задану величину змінювали на більш низький рн і більш високу провідність.
Застосування АЕХ знижує жовто-коричневу кольоровість - див. таблицю 2-3. Крім того, було визначено, що ОО Зерпагозе Равзі Ріом/у знижувала колір більше, ніж РОКО5 50 НО для двох заданих величин, оцінених в обох смолах. При заданій величині рН 8,00 і 2,50 мСм/см, пул
РОКО5 50 НО мав значення Б" 1,33, тоді як пул О Зерпагозе Раві Ріом/ мав значення р" 0,96.
Подібним чином, при заданій величині рН 7,80 та 4,00 мСм/см, пул РОКО5 50 НО мав значення Б" 1,55, тоді як пул О Зерпагозе Раві РіІожу мав значення Б" 1,35 (таблиця 2-3).
Таблиця 2-3
Коротке викладення результатів експериментів дослідження зменшення кольору АЕХ
Розділення за допомогою Фракція Вихід (96)! ВМ (95) | Колір (І ")| Колір (а")| Колір (657)
АЕХ
1112 |БТ/лромиванняд///// | 49,5 | 059 | 98,30 003 | 0,96 1115 БЕТ/лромивання.//// | 914 | 1,83 | 9919 -009 | 155 (111 - |Фільтрованийпул./-// | - |3,66-3,98| 98,73 | -021 | 306
11111111 |савантаженнядЕХ)їд//:/ | //: | | Її ЇЇ
АЕХ, аніонообмінна хроматографія; НММУ, високомолекулярні сполуки; Н/В, не вказано
Для вимірювання кольору фракції коригували до концентрації білка 10 г/л. 2.3 Висновок
Встановлено, що застосування АЕХ знижує жовто-коричневе забарвлення, див. таблицю 2-3.
Посилаючись на таблицю 2-3, завантаження АЕХ має значення Б", яке дорівнює 3,06, але при піддаванні хроматографії АЕХ (розділенню АЕХ 1-5) значення р" зменшується, вказуючи на зменшення жовто-коричневого забарвлення. Знову, у міру зменшення значення Б" зменшується забарвлення; збільшення значення р" відображає збільшення жовто-коричневого кольору у цьому зразку.
Зниження кольору оцінювали з використанням двох смол АЕХ (РОКОЗ5 50 НО та О Зерпагозе
Еаві РіІом/) та трьох заданих значень (рн 8,40 та 2,00 мСм/см, рН 8,00 та 2,50 мСм/см, та рН 7,80 та 4,00 мСм/см). Для обох смол зниження кольору було вищим для більш високих значень рН і більш низьких значень провідності. Крім того, ОО Зерпагозе ЕРавзі Ріомж/ забезпечувала більше зменшення кольору, ніж РОКО5 50 НО, у двох контрольних точках, оцінених на обох смолах (рн 8,00 та 2,50 мСм/см та рН 7,80 та 4,00 мСм/см). Проте всі п'ять способів розділення АЕХ забезпечували значне зменшення кольору порівняно із завантажувальним розчином для АЕХ («Завантаження АЕХ»), демонструючи важливість отримання АЕХ у процесі отримання афліберцепту, експресованого з використанням ХВС. Початкове значення Б" навантаження АЕХ (при масі 10 г/л) може варіювати від близько 0,5 до близько 30, більш конкретно від близько 1,0 до близько 25,0, і ще більш конкретно від близько 2,0 до близько 20,0. Після застосування АЕХ значення Б" для проточної фракції (при концентрації 10 г/л) може варіювати від 0,5 до близько 10,0, більш конкретно від близько 0,5 до близько 7,0 і ще більш конкретно від 0,5 до близько 5,0. 2.4 Картування пептиду
Отримання зразка. Триптичне картування зразків відновленого та алкільованого афліберцепту, отриманих із завантаження АЕХ, та проточну фракцію зазначеного вище експерименту (таблиця 2-3) здійснювали для виявлення та кількісної оцінки посттрансляційної модифікації (РТМ). Аліквоту кожного зразка (завантаження та проточної фракції) денатурували з використанням 8,0 моль сечовини, 0,1 моль трис-НСІ, рН 7,5, відновлювали ОТТ, а потім алкілували йодацетамідом. Денатурований, відновлений та алкільований зразок спочатку розщеплювали рекомбінантним ГІ уз-С (п уз-С) при співвідношенні ферменту до субстрату 1:100 (мас./мас.) при 37"С протягом 30 хв, розводили 0,1 моль трис-НСЇ, рН 7,5, так що кінцева концентрація сечовини була 1,8 моль, потім розщеплювали трипсином при співвідношенні ферменту до речовини 1:20 (мас./мас.) при 379 протягом 2 годин, а потім деглікозилювали з використанням РМС-ази Е при співвідношенні ферментних субстратів 1:5 (мас./мас.) при 3790 протягом 1 години. Розщеплення зупиняли, доводячи рН нижче 2,0 з використанням мурашиної кислоти (БА).
Аналіз за допомогою РХ-МС. Аліквоту 20 мкг г уз-С/триптичних пептидів, що утворюються, з кожного зразка відокремлювали і аналізували за допомогою ультрапродуктивної рідинної хроматографії з оберненою фазою (ШРІ С) з використанням колонки М/аїет5 АСОШІТУ ОРІ С СН
С18 (130 А, 1,7 мкмоль, 2,1 х 150 мм) з подальшим детектуванням КПК у системі (на довжинах хвиль 280 нм, 320 нм та 350 нм) та аналізом за допомогою мас-спектрометрії. Рухома фаза А містила 0,195 ЕА у воді, а рухома фаза В - 0,195 ЕА в ацетонітрилі. Після введення зразка ініціювали градієнт із витримуванням протягом 5 хвилин при 0,195 В з подальшим лінійним збільшенням до 3595 В протягом 75 хвилин для оптимального розділення пептидів. Експерименти
МС та МС/МС проводили з використанням мас-спектрометра Тпепто 5сіепійс О Ехасіїме Нубгіа
Огцаагироіе-ОгЬйгар з більш високою енергією ударної дисоціації (НСО), що застосовується для пептидної фрагментації експериментів МС/МС. Присвоєння ідентичності пептидам базувалося на експериментально визначеній точній масі цього пептиду у повному спектрі МС, а також на фрагментах іонів Б та у у відповідному спектрі МС/МС НСО. Отримували вилучені іонні хроматограми пептидів із завантаження та проточної фракції (див. фіг. 10). Як видно на вилученій іонній хроматограмі фіг. 10, показані пептидні фрагменти, ідентифіковані в «завантаженні АЕХ» та
«ЕТ/промиванні АЕХ» з розділень АЕХ 1-5 (як визначено в таблиці 2-3). Відносна кількість деяких із цих пептидів, ідентифікованих на фіг. 10 з аналізу картування пептидів, показана нафіг. 11.
Посилаючись на фіг. 11, ця цифра ідентифікує різні проаналізовані пептидні фрагменти та їх відносні рівні окиснення Зокрема, третя колонка ідентифікує амінокислотні залишки («пептидну послідовність») пептидних фрагментів, які були виділені та проаналізовані. Кожна пептидна послідовність має амінокислотний залишок, який підкреслений. Підкреслений амінокислотний залишок вказує на амінокислоту в пептидній послідовності, яка окиснена. Окиснені амінокислоти відповідають або окисненню гістидину (Н), або окисненню триптофану (М/). На цій фігурі також зображені рядки праворуч від кожної з пептидних послідовностей, які показують кількість окиснених форм. Це штрихування в рядках вказує на відмінності у відносній кількості окиснених залишків у конкретному зразку з використанням різних розділень АЕХ, зазначених у відповідних заголовках колонок. Наприклад, посилаючись на другий ЕІ І ТСЕАТУМОНІ УК (ЗЕО ІО МО.: 18) на фіг. 11, якщо читати по горизонталі, відносна загальна популяція цього пептиду в конкретному зразку («завантаження АЕХ афліберцепту»), який є окисненим, окиснена приблизно на 0,01395. У міру просування тим самим рядком спостерігається усунення штрихування, що вказує на зміну відносного вмісту окиснених форм. Наприклад, при використанні тієї самої пептидної послідовності відносна кількість окиснених форм для розділення АЕХ становить від 0,00695 до 0,01095 при дотриманні різних протоколів розділення АЕХ. Таким чином, можна зрозуміти, що хроматографія АЕХ знижує вміст окиснених форм. (В) АЕХ застосовували для зменшення утворення кольору при отриманні МіпіТгтар
Хроматографію АЕХ проводили для видалення забарвлення, отриманого в ході отримання
МТ, яке було отримано при виконанні розщеплення повнорозмірного афліберцепту, експресованого з використанням ХВС1. 2.5 Дизайн
Для цього дослідження виконували чотири розділення АЕХ, як описано в таблиці 2-4.
Завантаження АЕХ отримували з фільтрації зразка МТ1 («фільтрований пул МТ1»). Колонка з 15,7 мл Саріо О (висота шару 20,0 см, внутрішній діаметр 1,0 см), колонка з 14,1 мл РОКО5 50
НО (висота шару 18,0 см, внутрішній діаметр 1,0 см) та колонка з 16,5 мл О Зерпагозе ЕЕ (висота шару 21,0 см, внутрішній діаметр 1,0 см) були інтегровані в настільний контролер рідинної хроматографії АКТА Амапі для цього експерименту. рН завантаження АЕХ доводили до цільового значення х 0,05 одиниць рН з використанням 2 моль трис-основи або 2 моль оцтової кислоти. Електропровідність завантаження АЕХ доводили до цільового значення х 0,1 мСм/см із використанням 5 моль хлориду натрію або деїіонізованої води. Усі зразки пулу аналізували щодо НММУ, кольору та виходу.
Таблиця 2-4
Коротке викладення дизайну для дослідження зниження кольору АЛЕХ
Таблиця 2-5
Протокол проточної фракції АЕХ, який застосовується для дослідження зменшення кольору
Об'єм Лінійна
Стадія Опис Рухома фаза колонки швидкість
СУ см/год. врівноважування
50 ммоль буфера трис, 40 ммоль 2 Урівноваження Масі 2 200 рН 7,90 - 8,10, 6,50 - 7,50 мСм/см
З Завантаження Завантаження АЕХ ЗО г/л- 200
ОН 7,90 - 8,10, 6,50 - 7,50 мСм/см смола 50 ммоль буфера трис, 40 ммоль 4 Промивання Масі 2 200 рН 7,90 - 8,10, 6,50 - 7,50 мСм/см 2 моль хлориду натрію (масі) 6 |Очищення? | н. гідроксиду натрію (маоН)
АЕХ, аніонообмінна хроматографія; СМ, обсяг колонки
Таблиця 2-6
Протокол зв'язування та елюювання АЕХ, який застосовується для дослідження зменшення кольору
Об'єм Лінійна
Стадія Опис Рухома фаза колонки швидкість
СУ см/год.
Попереднє . . 50 ммоль буфера трис 2 |Урівноваження оно. 850, 1,90--. 210 мСм/см 2 200
З Завантаження Завантаження АЕХ 30 г/л- 200 рН 8,30 - 8,50, 1,90 - 2,10 мСм/см смола 50 ммоль буфера трис 4 |Промивання он 8,30 -- 8,50, 1,90 - 2,10 мСм/см 2 200 50 ммоль буфера трис, 70 ммоль
Елюювання Масі 2 200 рН 8,30 - 8,50, 8,50 - 9,50 мСм/см 6 |Очищення!ї /|2 моль хлориду натрію (Масі) 1 н. гідроксиду натрію (МаОН)
АЕХ, аніонообмінна хроматографія; СМ, обсяг колонки 2.6. Результати
Усі чотири розділення АЕХ забезпечували зменшення кольору, як це було видно при забарвленні проточної фракції та промиванні для розділення АЕХ 1-4 (таблиця 2-7). Незважаючи на те, що перші три розділення АЕХ оцінювали в режимі зв'язування та елюювання (таблиця 2-6), було відмічено, що більшість продукту була присутня у завантажувальних і промивних блоках (6290-9496).
Перші три розділення застосовували для оцінки заданого значення рн 8,4 та 2,0 мСм/см для смол Саріо О, РОКО5 50 НО та О Зерпагозе ЕР. Усі три розділення забезпечували хороший вихід (більше 8095). Пул РОКО5 50 НО АЕХ показав найнижчий жовтий колір у пулі АЕХ (значення Б" 2,09), за ним йшли пул О Зерпагозе ЕЕ АЕХ (значення Б" 2,22) та пул Саріо О АЕХ (значення Б" 2,55).
Таблиця 2-7
Коротке викладення результатів експериментів дослідження зменшення кольору АЕХ
Фільтрований пул МТ1 1 Ісаватакенийєю | 7001065 | оевив | оо | т
АЕХ, аніонообмінна хроматографія; НММУ, високомолекулярні сполуки.
Для вимірювання кольору фракції коригували до концентрації білка 5 г/л. 2.71 Висновок
Як видно для афліберцепту (див. розділ 2.3 вище), було виявлено, що застосування АЕХ знижує жовто-коричневе забарвлення (таблиця 2-7) при отриманні МіпіТтар. Посилаючись на таблицю 2-7, завантаження АЕХ має значення Б", яке дорівнює 4,17, але при піддаванні хроматографії АЕХ (розділенню АЕХ 1-4) значення Б" зменшується, вказуючи на зменшення жовто-коричневого забарвлення. Знову, у міру зменшення значення Б" зменшується й забарвлення. Початкове значення р" навантаження АЕХ (при масі 5 г/л) може варіювати від близько 0,5 до близько 25, більш конкретно від близько 1,0 до близько 20,0, і ще більш конкретно від близько 1,5 до близько 15,0. Після застосування АЕХ значення Б" для проточної фракції (при концентрації 5 г/л) може варіювати від 0,5 до близько 10,0, більш конкретно від близько 0,5 до близько 7,0 і ще більш конкретно від 0,5 до близько 5,0.
Приклад 3. Дослідження окисненого пептиду 3.1 Картування пептиду
Отримання зразка. Триптичне картування зразків відновленого та алкільованого МіпіТтар (МТ) та МТА (МіпіТгар, аналогічне МТІ1 з використанням іншого повнорозмірного афліберцепту, отриманого з використанням клітинної культури в гідролізаті сої) виконували для ідентифікації та кількісної оцінки посттрансляційної модифікації. Аліквоту зразка денатурували з використанням 8,0 моль сечовини в 0,1 моль трис-НСІ, рН 7,5, відновлювали ОТТ, а потім алкілували йодацетамідом. Денатуровану, відновлену та алкільовану лікарську речовину спочатку розщеплювали рекомбінантним ГІ уз-С (п уз-С) при співвідношенні ферменту до субстрату 1:100 (мас./мас.) при 37"С протягом 30 хв, розводили 0,1 моль трис-НСЇ, рН 7,5, так що кінцева концентрація сечовини була 1,8 моль, потім розщеплювали трипсином при співвідношенні ферменту до речовини 1:20 (мас./мас.) при 3720 протягом 2 годин, а потім деглікозилювали з використанням РМОС-ази Е при співвідношенні ферментних субстратів 1:5 (мас./мас.) при 3726 протягом 1 години. Розщеплення зупиняли, доводячи рН нижче 2,0 з використанням мурашиної кислоти (БА).
Аналіз за допомогою РХ-МС. Аліквоту 20 мкг г уз-С/триптичних пептидів, що утворюються, з кожного зразка відокремлювали і аналізували за допомогою ультрапродуктивної рідинної хроматографії з оберненою фазою (ШРІ С) з використанням колонки М/аїет5 АСОШІТУМ ОРІ С СН
С18 (130 А, 1,7 мкмоль, 2,1 х 150 мм) з подальшим детектуванням КПК у системі (на довжинах хвиль 280 нм, 320 нм та 350 нм) та аналізом за допомогою мас-спектрометрії. Рухома фаза А містила 0,195 ЕА у воді, а рухома фаза В - 0,195 ЕА в ацетонітрилі. Після введення зразка починали градієнт із витримуванням протягом 5 хв при 0,195 В з подальшим лінійним збільшенням до 3596 В протягом 75 хвилин для оптимального розділення пептидів. Експерименти МС та
МС/МС проводили на мас-спектрометрі Тпегто 5сіепійс 0 Ехасіїме Нубргії Очадгироіе-Огбйгар з більш високою енергією ударної дисоціації (НС), яка застосовується для пептидної фрагментації експериментів МС/МС. Присвоєння ідентичності пептидам базувалося на експериментально визначеній точній масі цього пептиду у повному спектрі МС, а також на фрагментах іонів 5 та у у відповідному спектрі МС/МС НСО. Отримували екстраговані іонні хроматограми окиснених пептидів та відповідного вихідного пептиду з інтегрованими площами піків для розрахунку сайт- специфічного відсоткового вмісту окисненого(-их) амінокислотного(-их) залишку(с-ів) у зразку МТ1.
Фрагменти пептиду, зв'язані для підвищення поглинання при 350 нм
РТМ на МТ спостерігали при порівнянні карт триптичних пептидів для МТ та МТА (фіг. 12А показує поглинання пептидів, елюйованих від 20,0 до 75 хвилин). Виділені пептиди з різними УФ- піками. Розширений вид хроматограми показаний на фіг. 12В, на якій показано поглинання пептидів, елюйованих від 16 до 30 хвилин Пептиди з різким контрастом УФ-поглинання між МТ1 та МТ4 являли собою ТММ ТН"К (ЗЕО ІО МО: 21), ПМ/-43О5К (ЗЕО ІО МО: 28) і ШУМ -132)055Е (ЗЕО ІЮО МО: 124) (" або підкреслення означає окиснення залишку). Далі розширений вигляд хроматограми показаний на фіг. 12С, яка демонструє поглинання пептидів, елюйованих від 30 до 75 хвилин. Пептиди з різким контрастом УФ-поглинання між МТ і МТ4 являли собою
ОКТНТС"РРСО"РАРЕЇ С (5ЕО І МО: 17), ТЕГ'ММатпювємМУЕМРОЗЗКН'ОНК (5ЕБО ІО МО: 20),
ЕІСІ Г/ТСЕАТММОН'" УК (5ЕБО ІО МО: 18) ї ОТМПТІОММІ 5РБЗН'"СІБЇ ЗМОЕК (5ЕБО 10 МО: 19) С означає окиснення залишку). Картування пептидів виявило ідентичність пептидів, кількість яких значно відрізняється у МЕСЕ МіпіТгар. Відносна кількість пептидів, ідентифікованих за допомогою аналізу картування пептидів, показана в таблиці 3-1. Кількість 2-оксо-гістидинів у МТ1 (продукованих у ХВС) була вищою, ніж у МТ4 (продукованому в гідролізаті сої), що дозволяє припустити, що середовище, яке застосовується для експресії афліберцепту, може значно впливати на відносний вміст пептидів з окисненими гістидинами або окисненими триптофанами.
Наприклад, для пептиду ОТМТПІОММІ 6РОН"СІЕЇ 5МОЕК (5ЕО ІО МО: 19), відсотковий відносний вміст пептиду в МТ1 (продукованому в ХВС) становив 0,01595 порівняно з відсотковим відносним вмістом пептиду в МТ4 (продукованому в гідролізаті сої; що приблизно в 15 разів менше порівняно з МТ).
Таблиця 3-1 . Кратність послідовність МІ/Мта
ЕІСП ТСЕАТУМОНІ УК | ЕС ТО(А5ЯЕАТУМОаНІНІ Я МК о о
ОТМТІПОМУМІ 5РЗНОИЇЕЇ | ОТМПІОУМІ 5РЗНІ-НІЯСІЕЇ 5МОаЕКІ о о
ТЕСМУСІОЄМУУЕМРБО | ТЕСМУМа! ВЕМУЕМРЗЗКНІ АН ДОНК о о
ОКТНТСРРСОРАРЕЇ ТС | ОКТНІ-141ТС(А57Я| РРОЇА-5У|РАРЕЇ. о о
Кількісне визначення кольору та 2-оксо-гістидину. Також показаний відсотковий вміст 2-оксо- гістидинів в олігопептидах, утворених у результаті розщеплення протеази, виміряний за допомогою мас-спектрометрії (таблиця 3-2). (Значення були нормалізовані відносно немодифікованих пептидів.) У таблиці 3-2 (І) показаний відсоток окиснених гістидинів/триптофанів, що спостерігається для проточної фракції АЕХ: МТ партія 1, проточної фракції АЕХ для МТ партія 2 та проточної фракції АЕХ для МТ партія 3. У таблиці 3-2(ІЇ) показаний відсоток окиснених гістидинів/триптофанів, який спостерігається для кислотної фракції 1, кислотної фракції 2 та основної фракції, отриманих при виконанні розділення СЕХ для партії
МТ 3. Із цієї таблиці зрозуміло, що кислотні варіанти складаються з окиснених частинок. Із таблиці 3-2() зрозуміло, що 95 2-оксо-гістидинів та діокиснення триптофану, які містять пептиди/білок, знижений у проточній фракції АЕХ порівняно з очищенням АЕХ. Очевидно, що очищення колонки АЕХ збільшує відсоток модифікованих пептидів. Наприклад, 95 модифікованого пептиду «ЕІ СТОІ-5ЛЕАТМУММОНІГ-14|СМУК (5ЕО ІО МО: 18)» у проточній фракції АЕХ (МТ партія 1) становив 0,01395 та в «очищенні АЕХ» становив 0,08095. Це також підтверджує, що колонка
АЕХ захоплює модифіковані пептиди, знижуючи таким чином відсоток модифікованих пептидів у проточній фракції АЕХ.
Таблиця 3-2 (І)
Відсотковий вміст 2-оксо-гістидинів/триптофанів
Очищення АЕХ Проточна фракція АЕХ пннншнннншшшш і і Я : МТ
Модифіковані пептиди Інтенсивний МТ партія | МТ партія партія З й 1 ВМ1, 110 | 2 «ВУЗ, 110 р жовтий «ВУЗ, 110 мг/мл мг/мл мг/мл ота полЕАТуканатннук (5ЕО І 0,0809 0,01392 0,0089 0,0069
Мо Не ВУЗЕК(ВКО 1 оовавь 002896 | 002395 | 0,01996 коор ТЕКА ТНОНК(ВКО 1 огзвеь 08596 | 004995 | 0,04995 оКТНІНІ4Я1ТСІ57У|РРСОІ-57Я РАРЕ ! С о о о о
ФО Ю МО: 17 0,54495 0,09295 0,077 0,0579о
ТММСТНІ-141А (ЗЕО І МО: 21 0,089 0,022 0,01195 0,01095
ПМ/Т-32105А (5ЕО І МО: 28 0,738 0,252 0,19895 0,29895
Таблиця 3-2 (ІІ). Відсотковий вміст 2-оксо-гістидинів/гриптофанів
Проточна фракція СЕХ : : Кислотна фракція) Кислотна фракція Основна
Модифіковані пептиди 1 з МТІ1 партія З | 2 з МТІ партія З фракція З Мт . . партія З Колір
Жовтий Жовтий . хм відсутній
КЗ ТОВ ЛЕАТУМаНгМ «УК (ЗЕО І 0,009 000896 0,004
Мо пт ВУЗЕК (5ЕО 0,01395 001595 0,00696
ТЕОМУСІОРМУЕУРЗЗКНЕТЯДОНК (5ЗЕО 0,13195 015195 0,0499
ІО МО: 20 окт С(А5ЯРРОГЇА5УЯ РАРЕГ І С о о о
ФЕО Ю МО: 17 0,11795 0,13295 0,06895
ТММ ТНІ-1418 (5ЕО І МО: 21 0,01495 0,00895 0,00895
ПМ/-321О58А (5ЕО ІО МО: 28 0,45895 0,26995 0,18595
У таблиці 3-2 (ІІ) Ї-57| являють собою алкілування цистеїну йодоактамідом із додаванням фрагмента карбоксиметиламіну на цистеїні, що являє собою збільшення маси нетто приблизно на 57 порівняно з немодифікованим цистеїном:
нм -5 с 2 що ТК з ПМ 87 г фермент фермент У о о
У таблиці 3-2 (ІІ), (414) представлено перетворення з Ні на 2-оксо-Ніз. Один атом оксигену додається до карбону 2, але два атоми гідрогену втрачаються (один від карбону 2, інший від нітрогену 3), що являє собою збільшення маси нетто приблизно на 14 у порівнянні з немодифікованим гістидином.
Мн -ИКЖхВх8О 5 М М
У2 - -- т 2 й-о 4 7МН СЕ
З М
Ніз 2-оксо-Ніб
У таблиці 3-2(ІЇ) (432| являє діокиснення триптофану, яке призводить до утворення М- формілкінуреніну, що являє собою збільшення маси нетто приблизно на 32 у порівнянні з немодифікованим триптофаном (фіг. 4).
Другу серію експериментів проводили для оцінки відсоткового вмісту 2-оксо-гістидинів (їі діокиснення триптофану) в олігопептидах із розщепленого протеазою відщепленого за допомогою
ЕаьЬкІСАТОК афліберцепту (МТ4), який обробляли за допомогою хроматографії АЕХ (фіг. 13 і таблиця 3-3 нижче). Відсотковий вміст 2-оксо-гістидинів і діокиснення триптофану в очищенні АЕХ для олігопептидів із розщепленого протеазою відщепленого за допомогою БаркІСАтТОоКк афліберцепту (МТ4) був значно більше, ніж відсотковий вміст 2-оксо-гістидинів та діокиснення триптофану в проточній фракції АЕХ (посилаючись на «МТ» в таблиці 3-3 нижче).
Таблиця 3-3
Відсотковий вміст 2-оксо-гістидинів
Повнорозмірний Очищення міна
Модифіковані пептиди : МТ АЕХ від афліберцепт Мт очищення
АЕХ/МТ1
УМ 4321058 (5ЕО І МО: 28 0,229 0,349 0,819
ЕКвИТОГБЛЕАТУМОНІ ТЯ УК (ЗЕО 0,009 0,029 0,8
ОТМТІПОМУМІ 5РЗНІ-14|СІЕЇ 5МОЕК о о о
ФЕО ІЮ МО: 19 0,0195 0,0495 0,079о 1,8
ТЕСММатЕМУЕМРЗБКНІНІ ЯОНК о о о
ФЕО ІЮ МО: 20 0,0195 0,199 0,429о 22 оКТНІНІ4Я1ТСІ57У|РРСОІ-57Я РАРЕ ! С о о о
ЕО Ю МО: 17 0,О19ра 0,1195 0,639о 5,7 тМмтНні14|8 (ЗЕО О МО: 21 0,0096 0,0396 0,1095 а значення, розраховане з використанням іншого пептиду для повнорозмірного афліберцепту, оскільки С-кінцевий пептид відрізняється від МіпіТгар.
Відсотковий вміст 2-оксо-гістидинів та діокиснення триптофану в смузі АЕХ був значно більший, ніж відсоток 2-оксо-гістидинів та діокиснення триптофану в проточній фракції АЕХ у ході отримання МТ (посилаючись на «МТ 1» у таблиці 3-3 вище). Порівняно з таблицею 3-2, в таблиці 3-3 показані подібні результати, що очищення колонки АЕХ забезпечувало зразок зі значно більш високим відсотковим вмістом 2-оксо-гістидинів і діокиснення триптофану в порівнянні з відсотковим вмістом 2-оксо-гістидинів і діокиснення триптофану в проточній фракції АЕХ, що дозволяє припустити, що форми 2-оксо-гістидинів та діокиснення триптофану пов'язані з колонкою АЕХ в ході розділення та видаляються при очищенні колонки АЕХ. Це також очевидно на вилученій іонній хроматограмі, як видно на фіг. 14.
Сильна катіонообмінна хроматограма (СЕХ)
Здійснювали серію експериментів для виявлення кислотних форм та інших варіантів, присутніх у зразках, що містять білки проти МЕСЕ.
Сильну катіонообмінну хроматографію виконували з використанням колонки Мопоб5 (10/100)
СІ (СЕ Це бсіеєпсе5, Мальборо, Массачусетс). Для розділення зразків застосовували рухомі фази: 20 ммоль 2-(М-морфоліно)етансульфонової кислоти (МЕ5), рН 5,7 (рухома фаза А) і 40 ммоль фосфату натрію, 100 ммоль хлориду натрію, рН 9,0 (рухома фаза В). Нелінійний рн градієнт застосовували для елюювання заряджених варіантів МТ1 з детектуванням при 280 нм.
Піки, які елююються при відносному часі перебування раніше основного піку, позначені в цьому документі як кислотні форми.
Зразок із МТ1 партії 2 («ВУ3) до будь-якого збагачення піддавали СЕХ з використанням способу, описаного на фіг. 15. Зразок піддавали десіалюванню для спрощення варіантів МТ1. За цим йшла препаративна обробка 5ЕС (Зирегаех 200, ргер дгаде ХК26/100) з використанням 1Х
ОРВ5, рН 7,2 5 0,2 в якості рухомої фази. Фракції, отримані з препаративної колонки ЗЕС, яка містить десіальований МіпітТтар, (а5М'Т1), об'єднували та додатково піддавали сильній катіонообмінній хроматографії (5СХ) для збагачення зарядженими варіантами МТ1 з використанням подвійного градієнта солі та рН. У результаті отримували всього 7 фракцій (Е1-Е7;
МС являє собою контроль способу, фіг. 16 ї фіг. 17).
При виконанні СЕХ кислотні форми елююються раніше основних піків, а основні форми елююються після основних піків. Як видно на фіг. 17, піки 3-5 є основними піками. Піки 1 та 2 елююються перед елююванням основних форм МТ (піки 3-5) і, таким чином, містять кислотні форми. Пік Є елююється після елюювання основних видів МТ (піки 3-5) і, таким чином, включає основні форми. У таблиці 3-4 показаний відносний вміст піків у МС (як показано на фіг. 16).
Наприклад, рядок два в таблиці 3-4 (позначений як МС) демонструє, що загальна відносна кількість кислотних форм МС становить близько 19,895 (тобто, пік 1 «т пік 2). У таблиці-3-4 також показаний відносний вміст піків для кожної окремої фракції. Незважаючи на те, що існують види, які перекриваються, в різних фракціях (як показано на фіг. 16 і фіг. 17), більша частина фракцій Е1 і 2 являють собою кислотні форми (тобто, пік 1 їі пік 2). Наприклад, фракція Е1 складається з 63,7905 піку 1 та 19,295 піку 2 (загалом 82,995 кислотних форм). Фракція Е2 складається з 9,695 піку 1 та 75,995 2 (всього 85,5956 кислотних форм). Більшість фракцій ЕЗ3-Е5 є головними формами МТ1 (піки 3-5). Нарешті більшість фракцій Е6-Е7 є основними формами (пік б), але включають деякі частини головних видів (наприклад, піки 4 та 5).
Також було помічено, що фракції Е1 та Е2 (які складають кислотні форми) мали інтенсивне жовто-коричневе забарвлення порівняно з фракціями Е3-Е5 (які включають головні форми або «МТ1»). Усі фракції перевіряли щодо кольору концентрації не менше 13 мг/мл. Як видно з цього прикладу, наявність кислотних форм у зразку відстежується з появою жовто-коричневого забарвлення, видалення (або зведення до мінімуму) якого можна здійснювати за допомогою видалення (або зведення до мінімуму) кислотних форм із МТ1.
Таблиця 3-4
Відносна кількість піків на основі аналітичного СЕХ оМмтіг2 1196 | 759 | 106 | 22 | 16 | нв н/в омтів7 1 28 | 77 | 80 | 161 | 7165 | 485 н/в: не виявлено
ЗО хроматограми для МТ партії 2 та фракцій Е1-Е7 показані на фіг. 18А-Н. МТ партія 2 не продемонструвала будь-яких суттєвих спектральних особливостей (фіг. 18А). Фракції 1 та 2 (які містять кислотні форми) продемонстрували спектральну характеристику від 320-360 нм (див. коло на фіг. 188). Ця особливість була більш помітною у фракції 1 порівняно з фракцією 2 (фіг. 188 і 180) і була відсутня у фракції З ї фракціях 4-7 (основні види, МТ) (фіг. 180 і 18Н), які не виявляли жовто-коричневого забарвлення.
Таким чином, як зазначалося вище, СЕХ призвела до ідентифікації кислотних форм/кислотних фракцій (фракції 1 і 2), які показують інтенсивне жовто-коричневе забарвлення порівняно з основними формами/фракціями (фракції 3-6). Цей результат також спостерігався у вигляді чіткої спектральної характеристики, присутньої на тривимірних хроматограмах фракцій Е1-Е2 і відсутніх у фракціях ЕЗ3-Е7.
Візуалізовані електрофореграми капілярного ізоелектричного фокусування (ісІЕ Є)
Розподіл варіантів за фракціями Е1-Е7 та МС (від МТ1 - партія 2 після СЕХ) додатково оцінювали з використанням ісіЕК (фіг. 19).
Розподіл варіантів у фракціях Е1-Е7 та МС (з МТ - партія 2 після СЕХ) додатково оцінювали за допомогою ісіеЕЕ з використанням аналізатора іІСЕЗ (Ргоївіпб5ітріє) з капілярним картриджем, покритим фторвуглецем (100 мкм х 5 см). Розчин амфоліту складався з суміші 0,3590 метилцелюлози (МС), 0,7595 амфолітів-носіїв Рпагта!уе 3-10, 4,295 амфолітів-носіїв Рпагтаї/!уїе 8- 10,5 та 0,295 маркера рі 7,40 та 0,1595 маркера рі 9,77 в очищеній воді. Аноліт являє собою 80 ммоль фосфорної кислоти, а католіт являє собою 100 ммоль гідроксиду натрію, обидва в 0,1095 метилцелюлози. Зразки розводили очищеною водою та сіалідазу А додавали до кожного розведеного зразка при співвідношенні ферменту до субстрату 1:200 (одиниць сіалідази А на міліграм МТ1) з подальшою інкубацією при температурі навколишнього середовища протягом приблизно 16 годин. Зразки, оброблені сіалідазою А, змішували з розчином амфоліту, а потім фокусували, створюючи потенціал 1500 В протягом однієї хвилини, а потім потенціал 3000 В протягом 7 хвилин. Зображення сфокусованих варіантів МТ1 отримували за допомогою пропускання ультрафіолетового світла 280 нм крізь капіляр і в лінзу цифрової камери пристрою з зарядовим зв'язком. Потім це зображення аналізували для визначення розподілу різних варіантів заряду (фіг. 19). Посилаючись на фіг. 19, фракції ЕЇї та Р2 (або кислотні фракції) показали відсутність піку для МТ, що чітко спостерігається для МС та фракцій Е3-Е7 (основні форми, МТ1).
Таким чином, вважалося, що електрофореграми ісІієЄЕ здатні виявляти та визначати розподіл різних варіантів заряду білка, що розглядається, в цьому випадку МТ1. Таким чином, було очевидно, що кислотна фракція при проведенні аналізу СЕХ показала (а) підвищений відносний вміст 2-оксо-гістидину або діоксо-триптофану (таблиця 3-2(ІІ)); (Б) підвищене жовто-коричневе забарвлення (дані не показані); та (с) наявність спектрального підпису на тривимірних хроматограмах для фракцій 1 та 2 (фіг. 188 і фіг. 185).
Приклад 4. Дослідження фотоіндукції
У цьому прикладі фотоіїндукцію МЕСЕ МіпіТтар (МТ), наприклад МТІ, проводили шляхом впливу на зразок білка різних кількостей холодного білого (СМУ) флуоресцентного світла або ультрафіолетового А (МА) світла. Визначали кольоровий вміст і вміст окисненої амінокислоти у зразках, що зазнали впливу світла. РХМС-аналіз виконували після впливу, як описано вище.
Піддавання МТ холодному білому світлу або УФА-світлу призводить до збільшення окиснених амінокислотних залишків, наприклад, гістидину (таблиця 4-1, таблиця 4-2 і таблиця 4-3).
Таблиця 4-1
Дизайн дослідження фотоіндукції флуоресцентного світла ж ж ж ж ж х люкс"год. люкс"год. люкс"год. люкс"год. люкс"год. (люкс"год.)
СЕК вени | теме шосте | вотри | хоснн білим флуоресцентним 30 годин 75 годин 100 годин 150 годин 300 годин світлом (8 клюкс) т/м
ІСН посилається на Гармонізоване тристороннє керівництво ІСН: Випробування стабільності:
Випробування фотостабільності нових лікарських речовин та продуктів О18В, в якому вказані дослідження фотостабільності, які мають проводитися при холодному білому флуоресцентному світлі не менше 1,2 мільйона люкс"годину та енергії ближнього ультрафіолетового спектру не менше 200 Вт"год./м2.
У таблиці 4-2 показано посилення забарвлення зразка МТ під впливом холодного білого світла та ультрафіолетового світла. Наприклад, значення Б для зразка (1-0) складало 9,58. Під час впливу на цей зразок холодного білого світла з інтенсивністю 2,4 мільйона люкс"год. значення р збільшується до 22,14. Це збільшення значення Б вказує на те, що вплив холодного білого світла на МТ при 2,4 мільйона люкс"год. збільшує жовто-коричневе забарвлення зразка порівняно зі зразком (1-0). Подібним чином при впливі ультрафіолетового світла на зразок МТ (ї - 0) при 400
Вт"год./м2 значення Б збільшується до 10,72 з 9,58. Це збільшення значення Б вказує на те, що вплив ультрафіолетового світла на зразок МТ при 400 Вт"год./м2 призводить до посилення жовто- коричневого забарвлення зразка порівняно зі зразком (Її - 0).
Таблиця 4-2
Колір зразків, підданих впливу холодного білого світла та ультрафіолетового світла
1,0х (200 Вт"год./м? 97,48 11,36 2,0х (400 Вт"год./ме 97,76 10,72
Зразки кольорів вказані з використанням колірного простору СІЕГАВ (змінні І", а" та р") та відносно стандарту кольору ЕР ВУ; І" - від білого до чорного (І " - світлота); а" - від пурпурового до кольору морської хвилі; Б" - від жовтого до синього, що вище значення б, тим більше жовтого.
Таблиця 4-3(Ї).
Рівні 2-оксо-НІі5 в пептидах із МіпіТгар, який піддався впливу ультрафіолетового світла . УФ 4 | УФ 10) УФ 16 | УФФ 20) УФ 40
Пептиди Сайт Ю год год год год год
МО СРРОРАРЕЦН-О (ЗО 1О )Н2да 005695 | 006795 | 0,08195 | 0,08895 | 0,07795 | 0,09195 ко тумансук (во 0,010965 | 0,02095 | 0,03495 | 0,03795 | 0,03395 | 0,03596
ОТМТІПОМУМІ 5РЗНОИЇЕЇ 5МОЕК о о о о о о
ФЕО ІЮ МО: 19 НІТ101| 0,02495 | 0,03195 | 0,02895 | 002895 | 0027905 | 0,02790
ТЕСМУСа!ОєМУЕМРЗЗКНОНК о о о о о о
ФЕО ІЮ МО: 20 НІТ451| 0,09695 | 0,14795 1 0,16395 | 0.173905 | 0,14795 | 012590
ТММ ТНА (5ЕО І МО: 21 0,01495 | 0,03295 | 0,04495 | 0,05695 | 0,058975 | 0,078975
ЗОТавРЕМЕМУ5ЗЕЇІ!РЕННМТЕСА о о о о о о
ЗЕО І МО: 22 0,00795| 0,01395 | 0002195 | 002595 | 0,02495 | 0,03490
МНЕКОК (5ЕО ІО МО: 23 НгоЗІ| 0,04095 | 0010595 | 0,23895 | 00255905 | 0,2699о | 0,32490
Таблиця 4-3 (ІЇ).
Рівні 2-оксо-НІів в пептидах із підданого впливу холодного білого світла МіпіТгар . ХБ 30 ХБ 75 хХБ 100 ХБ 150 хХБ 300
Пептиди Сайт | Ю год год год год год
ОКТНТСРРОСР
АРЕ СЯС(ЗЕОІЮО МО: |НгО091| 0,05695| 0,15295 022095 0,243 0,25895 0,399 17
ЕІСП ТСЕАТУМ анімУк НеВб | 001095 | 0,0639о 011095 0,13295 0,17095 0,30895
ЗЕОІО МО: 18
ОТМТІПОУМІ 5РБ
НОЇІЕЇ 5МОЕК (5ЕО ІО | НІТО0 | 002495 | 0,08595 0,12095 0,12895 0,14895 0,18095
МО: 19
ТЕСМУСІОЄМУУЕМ Р
ЗЗКНОНК (5ЕО І МО НІ45 | 0,09695| 0,42395 0,58595 0,63495 0,697 0,74895
ТТН (ББО ІВ МО: 001496| 00396 | 017595 | 09895 | 0,26795 | 0,43795
ЗзрТавРЕМЕ
МУ5ЕІРЕПНМТЕСА НІТ9 |0,00795| 0,02590 0,0439о 0,04995 0,05895 0,11595
ЗЕО І МО: 22
ЕКО К(ЗБО То МО: нгоз| 004096| 042веь | 054295 | 0,бореь | 070296 | 1,30996
Вплив на афліберцепт МТ холодного білого світла або УФА світла відслідковувався за появою окиснених гістидинів (2-оксо-Нів). (Таблиця 4-3). Посилаючись на таблицю 4-3, пептид «5ЗОТОКРЕМЕМУЗЕЇІРЕЇПНМТЕСК (ЗЕО ІО МО.: 22)» з оксо-гістидином становив 0,00795 у зразку
МТ (1-0), тоді як його вміст збільшився до 0,32495 під час впливу ультрафіолетового світла протягом 40 годин (таблиця 4-3(І)) і до 1,30995 під час впливу холодного білого світла протягом
З00 годин (таблиця 4-3(1І)).
Спостерігалися дві форми 2-оксо-гістидину, форми 13,98 Да (як показано на фіг. 2) та форми 15,99 Да (як показано на фіг. 3), при цьому форми 13,98 Да є переважними у підданих світлу зразках МіпіТгар. Відомо, що форми 15,99 Да є продуктом процесу, що каталізується металевою міддю (Зспбпеїісй, 9). Рпапт. Віотей Апаї., 21:1093-1097 (2000)). Крім того, форми 13,98 Да є продуктом процесу, керованого світлом (Гіи еї а!., АпаїЇ. Спет., 86, 10, 4940-4948 (2014)).
Подібно до підвищеного вмісту окиснених гістидинів у зразках, підданих впливу холодного білого світла та УФА-світла, впливу холодного білого світла або УФА-світла на МТ також викликало утворення інших РТМ (таблиця 4-4 і таблиця 4-5).
Таблиця 4-4 (І). Інші РТМ у пептидах із МіпіТгар, що піддався впливу холодного білого світла . ХБ 30| ХБ 751| ХБ 100| ХБ 1501 ХБ 300
Пептиди Сайт Ю год. год. год. год. год.
ЕІСП ТСЕАТУМСОНІ УК о о о о о о
ЗЕОЮ МО: 62 20,895| 220956 | 22,995 | 20,395 | 21,895 | 21,3 95
ОТМТІПОМУМІ ЗРЗНИЕ о о о о о о
І. 8УОЕК (8ЕО 10 МО: 63 ее | Р
ЗзОТавРЕМЕМУ5ЕЇРЕЇЇ о о о о о о
ЗзОТавРЕМЕМУ5ЕЇРЕЇЇ о о о о о о
НМТЕСН (ЗЕО 1 МО: 65 Ме Ме Ми
СЕ ОЗЕМК(ВБО МО) мів 15795 | 11,795 | 26495 |) 20,595 зрОІМТСААББИІЇМТК о о о о о о 5ЕОЇІр МО: 67 М192 10,7 95 | 15,395 | 18,795 | 22895 | 37,6 95
ЗзОТавРЕМЕМУ5ЕЇРЕЇЇ о о о о о о
НМТЕСН (5ЕО 10 МО: 68 Ме | Ме | М»
Таблиця 4-51).
Рівні окиснення триптофану/гтирозину/фенілаланіну в пептидах із МіпіТгар, що піддався впливу ультрафіолетового світла кація год. год. год. год. год.
РОС УТСААЄ 0,016 95 | 0,049 95 | 0,089 95 | 0,119 95 10,132 950,22 95 осгмтк (ЗО о -1600 1000 10047951 0109951 0,177 95 | 0,225 95 |0,242 95І0,514 92
МО: 67) -32 | 0200951 048795 | 041595 | 0,481 95 10423 95І0,498 92 ! -48 | | 000095|0,00095 | 0,000 95 | 0,001 95 10,001 950,001 97
УМ138 0,435 95) 0,462. 95 | 0,550 95 | 0,557 95 |0,502 95І0,512 9/5
ЕУРЗВК (ЗЕО мо/ 56 1 Гоов8355 00095 | 0161 95 | 0,206 55 (0,239 95 0,448 95 29) ТТ -32 | | 0,00995|0,01895 0,027 95 | 0,039 95 10,044 95І0,115 95 48 | 028495 | 027895 | 0,270 95 | 0,302 95 0,343 950,275 95
Мов во Ов Д|мва 0,032 95 | 0,041 95 | 0,046 95 | 0,053 95 (0,054. 95 0,073 95
КЕРГОТ РОК о о о о о о
ФЕО ІЮ МО: 70 0,068 до | 0,077 Фо | 0,087 Фо | 0,084 95 10,070 95 Ю0,096 95 мо Ва во г166| 0066965 0,075 95 | 0,085 95 | 0,089 95 |0,089 95 0,124 95
Таблиця 4-5 (ІІ). Рівні окиснення триптофану/тирозину/фенілаланіну в пептидах із
МіпіТгар, який піддався впливу холодного білого світла кація год. год. год. год. год. 0-40 1М58 0,016 95) 0,063 95 | 0,124 95 | 0,161, 95 | 0,228 95 | 0,526 95
ЗеСІ МТК (ЗО юю н6 | бо4794 0129961 0,22735| 028395 0,377 З6 | 0,795 35
МО: 67) 0-32 | 2009 1,601 95 | 2,706 95 | 3,139 95 | 3,925 95 | 6,974 95 ! -48 | 00009 0,001 95 | 0,00295 | 0,002 95 | 0,003 95 | 0,005 95
ТЕМУСІОЕМ М1380,435 975 0,555 95 | 0,481 95 | 0,490 95) 042995 | 0,522 95
У/ЕУРУБК (ЗЕО 10 -16 | 00839 010995 | 0,364 95 | 0,251 95 | 0,399 95 | 0,753 95
МО: 29) 0-32 | обо 001995 | 0,027 95 | 0,033 95 | 0,048 95 | 0,135 95 ' 48 | 02849 0,284 95 | 0,930 95 | 0,308 95 | 0,347 95 | 0,316 95 но нео ува рово 90 0,043 95 | 0,057 95 | 0,063 95 | 007895.) 0,127 96
ФЕО ІЮ МО: 70 ме вах ровв у 0,087 90 | 0,072 95 | 0,088 905 | 0,079 90 | 0,144 95
ЕТ ТІраМТА о о о о о о
ФЕО О МО: 71 Е166 0,066 95 0,091 95 | 0.088595 | 010195 | 011295 | 0,168 90
Таким чином, вплив на МТ холодного білого світла або УФА-світла відслідковували за появою окиснених залишків (як-от гістидини/триптофани (оксо-Тгр)). Спостерігали чотири види оксо-їгр: -4
Да, 416 Да, «32 Да їі 48 Да. Форми 14 Да пояснюються утворенням кінуреніну (фіг. 4), тоді як 416
Да, 32 Да і 448 Да являє собою моно-окиснення, ди-окиснення і три-окиснення залишків триптофану. Пептидне картування триптичних гідролізатів зразків МТ, яке спостерігається при довжині хвилі 320 нм, як показано на фіг. 20. Відносну присутність окиснених залишків, що містять пептиди, можна порівняти на фіг. 20. Наприклад, для пептиду, ПМ/-4)0О5АК (5ЕО ІО МО: 114), значну різницю в його присутності можна побачити для зразка МТ при 1-0 і зразка МТ, підданого
УФА протягом 40 годин, і зразка МТ, підданого впливу холодного білого світла протягом 300 годин.
Вплив на МТ холодного білого світла або УФА світла також оцінювали на наявність високомолекулярних (НМУМ)унизькомолекулярних (І ММ) частинок (таблиця 4-6).
Таблиця 4-6
Форми НМУМ/Л МУ були утворені після розширеного впливу УФА та холодного білого світла
Зразок: МТ, 80 мг/мл, рН 5,8
ШЕ ЕЕ ЕЕ впливу . впливу . впливу . . контрольні . контрольні . контрольні світла світла світла зразки зразки зразки зразки зразки зразки
Кумулятивний вплив УФА (х ІСН)
11111111 фе НММ/ 11111111 |ббнативносіїд////// ГжнНМК СС
Вт"год./м2) 0,бх ІСН (100 веду | 76 | 22 |в оввє еп 0,вх ІСН (160 вроду | 6 | 22 | вм | оввє мо 1,Ох ІСН (200 ее тв 5201 вв зв
Вт"год./м2) 11111111 (НМ 71111111 |Убнативносії////// реНМК 7771 0,2х ІСН (0,24 мільйона 12,1 22 86,6 1,4 12 люкс"год.) 0,Ббх ІСН (0,6 мільйона 20,4 2,3 71,9 96,4 1,6 1,3 люкс"год.) 0,вх ІСН (0,96 мільйона 23,2 24 75,1 96,2 1,7 14 люкс"год.) 1,0х ІСН (1,2 мільйона 30,1 2,6 68,1 96,2 1,9 1,3 люкс"год.) 2,0х ІСН (2,4 мільйона 45,0 2,9 52,6 95,8 2,4 14 люкс"год.)
Для відстеження забарвлення відносно форм НМУМЛМУМ для кожного зразка проводили аналітичну ексклюзійну хроматографію з детектуванням РОА повного спектра (ЗЕС-РОА), як показано вище, на всіх підданих стресу зразках (холодне біле світло та УФА). Аналіз БЗЕС-РОА
МТ, підданих впливу холодного білого світла, показує значне збільшення поглинання при - 350 нм для всіх варіантів розміру, крім форм ГМУМ (фіг. 21), тоді як ЗЕС-РОА на МТ, підданих впливу
УФА, не виявляє збільшення поглинання при - 350 нм (фіг. 22). На відміну від зразків, підданих впливу холодного білого світла, зразки, піддані впливу УФА, не забезпечували скільки-небудь значущої кількісної оцінки жовто-коричневого кольору.
Аналогічний результат був отриманий після вивчення коефіцієнтів поглинання при 320 нм та 280 нм для зразків, які зазнали впливу УФА та холодного білого світла. Співвідношення
АЗ20/А280, проаналізовані або за необробленою інтенсивністю, або за загальною площею піку, відстежувалися зі збільшенням інтенсивності жовтого кольору в зразках, підданих холодному білому світлу (фіг. 23), тоді як співвідношення АЗ20/А280 не відслідковувалися зі збільшенням інтенсивності жовтого кольору у зразках, підданих УФА-випромінюванню (фіг. 24). Це підтверджує попереднє спостереження, що зразки МТ, піддані впливу УФА, не забезпечують такий самий жовто-коричневий колір, який спостерігається після впливу холодного білого світла.
Приклад 5. Попередні способи зниження забарвлення 5.1 Дослідження інкубації середовища із хімічно визначеним складом
Було виявлено вплив різних компонентів, внесених у свіже середовище з хімічно визначеним складом (ХВС), яке містить афліберцепт, відносно забарвлення.
Одну або більше 50 мл пробірок для струшування вентиляційними кришками з 10 мл робочого об'єму (свіже ХВСІ1) інкубували протягом 7 днів, відбираючи зразки на день 0 і день 7. Зразки афліберцепту (рекомбінантний білок афліберцепт у водному буферному розчині, рН 6,2, що містить 5 ммоль фосфату натрію, 5 ммоль цитрату натрію та 100 ммоль хлориду натрію) вносили у пробірки для струшування в концентрації 6 г/л.
Компоненти, додані для досягнення кумулятивної концентрації: - Цистеїн: 16,6 ммоль - Залізо: 0,23 ммоль - Мідь: 0,0071 ммоль - Цинк: 0,54 ммоль
Масштабний ефект кожної складової, доданої до значення Б" (колірний простір СІЕ /", а", БУ), представлений на фіг. 25А та графік залежності фактичного значення Б" від прогнозованого значення Б" показаний на фіг. 258. Додавання цистеїну призвело до найбільшого збільшення жовто-коричневого кольору. Залізо та цинк також утворюють колір. Фолієва кислота та вітамін групи В (у тому числі тіамін, ніадинамід, Ю-пантотенова кислота, ЮО-біотин та піридоксин) підвищували жовто-коричневий колір. Рибофлавін та вітамін В12 значно не впливали на колір. 5.2 Вплив зниження цистеїну та металів на значення Б"
Біореактори (наприклад, 2) інокулювали з посівної культури клітинної лінії, яка продукує афліберцепт. Інокульовані культури вирощували при температурі 35,5, рн 7,1-0,25 та заданому значенні барботажу 22 куб. див. За необхідності до біорєакторів додавали глюкозу, піногасник та основне живлення. Вплив зниження концентрації цистеїну та металів на колір при експресії афліберцепту оцінювали у ХВС1.
Середовище на день 0 - ХВСІ1, включаючи 1,48 ммоль цистеїну - Поживні середовища: - День 2 « поживне середовище з хімічно визначеним складом (СОБЕ) «5 1,3-2,1 ммоль цистеїну - День 4-СОР--1,6-1,7 ммоль цистеїну - День 6-СОЕ--1,6-1,7 ммоль цистеїну - День 8-СОЕ-1,6-1,7 ммоль цистеїну
Умови біореактора були такими: - цистеїн додавали при кумулятивній концентрації близько 6-7 мілімолей на літр культури, 8-9 мілімолей на літр культури або 10-11 мілімолей на літр культури. - Метали в ХВСІ (рівні 0,5х, 1х або 1,5х ХВСТІ) на рівнях 1х перераховані нижче (де значення передують додаванню інокулята): - Ге-68-83 мікромолей на літр культури - 7п-6-7 мікромолей на літр культури - би-0,1-0,2 мікромолей на літр культури - Мі-0,5-1 мікромолей на літр культури
Зниження кумулятивних рівнів цистеїну до 6-7 мілімоль/л знижує жовто-коричневий колір без значного впливу на титр. Зменшення вмісту металу до 0,5 разів у середовищі зменшило колір зі значним збільшенням титру. Вплив на титр, МСС (концентрація життєздатних клітин), життєздатність, аміак або осмоляльність був мінімальним, див. фіг. 26А-Е). Прогнозований масштабний ефект вмісту металів та цистеїну на значення Б" та титр викладений на фіг. 27. 5.3 Оцінка впливу антиоксидантів на значення Б"
Оцінювали вплив антиоксидантів, таурину, гіпотаурину, тіоктової кислоти, глутатіону, гліцину та вітаміну С на колір, що вноситься у відпрацьоване ХВС, яке містить афліберцепт. Одну або більше 50 мл пробірок для струшування з вентиляційними кришками з 10 мл робочого об'єму (ХВСТ) інкубували протягом 7 днів, відбираючи зразки на день 0 і 7 день.
Умови для додавання компонентів до збідненого ХВСІ1 були такими: - зразок афліберцепту (рекомбінантний білок афліберцепт у водному буферному розчині, рН 6,2, що містить 5 ммоль фосфату натрію, 5 ммоль цитрату натрію та 100 ммоль хлориду натрію), доданий до пробірки для струшування в концентрації 6 г/л - антиоксиданти, додані до збідненого ХВСІ1 у таких концентраціях: - таурин - 10 ммоль культури - гіпотаурин - 10 ммоль культури - гліцин - 10 ммоль культури - тіоктова кислота - 0,0024 ммоль культури - глутатіон, відновлений - 2 ммоль культури - гідрокортизон - 0,0014 ммоль культури
- вітамін С (аскорбінова кислота) - 0,028 ммоль культури
Декілька антиоксидантів зменшували кольороутворення у відпрацьованому середовищі: комбінація гіпотаурину, таурину та гліцину; тіоктова кислота; і вітамін С. Глутатіон підвищував значення бр".
Таблиця 5-1
Коротке викладення ефекту антиоксиданту на утворення кольору в МіпіТгар " антиоксиданти, які значно знизили значення Б": гіпотаурин/таурин/гліцин, тіоктова кислота, вітамін С.
Коротке викладення прогнозованого впливу різних антиоксидантів на значення Б" (колірний простір СІЕ І", а", 5") наведено на фіг. 28 (А-С).
Був оцінений вплив подальшого додавання антиоксидантів на колір збідненого ХВС, яке містить афліберцепт. Одну або більше 50 мл пробірок для струшування з вентиляційними кришками з 10 мл робочого об'єму (ХВСТ) інкубували протягом 7 днів, відбираючи зразки на день
ОЇ 7 день.
Умови для додавання компонентів до збідненого ХВС1 були такими: - зразок афліберцепту (рекомбінантний білок афліберцепт у водному буферному розчині, рн 6,2, що містить 5 ммоль фосфату натрію, 5 ммоль цитрату натрію та 100 ммоль хлориду натрію), доданий до пробірки для струшування в концентрації 6 г/л - Проводили два експерименти РОЕ: - () антиоксиданти, додані до збідненого ХВСІ1 у таких концентраціях: - таурин - 10 ммоль культури - гіпотаурин - 10 ммоль культури - гліцин - 10 ммоль культури - тіоктова кислота - 0,0024 ммоль культури - вітамін С (аскорбінова кислота) - 0,028 ммоль культури - (її) антиоксиданти, додані для досягнення таких кумулятивних концентрацій: - АТА-2,5 мкмоль - 5 мкмоль - дефероксамін мезилат (ОБО) - 5 мкмоль - 10 мкмоль - каталаза - 101,5 мг/л - 5-карбоксиметил-і -цистеїн - 10 ммоль гіпотаурин знижує утворення кольору збідненого середовища (фіг. 280). ОБО також значно знижував утворення кольору збідненого середовища (фіг. 280). Інші антиоксиданти не мали статистичного впливу на утворення кольору.
Таблиця 5-2
Коротке викладення ефекту антиоксиданту на утворення кольору в МіпіТгар
Дослідження з антиоксидантом у флаконі для струшування: таурин, гіпотаурин, гліцин, тіоктова кислота та вітамін С оцінювали окремо та в комбінації щодо їх здатності знижувати утворення кольору в клітинній культурі (таблиця 5-3).
Флакони для струшування об'ємом 250 мл інокулювали з посівної культури клітинної лінії, яка продукує афліберцепт. Інокульовані клітини вирощували при 35,5 "С в інкубаторах із контролем
Б9У6є СО. За необхідності до струшуваних колб додавали глюкозу та основне живлення.
Застосовували описаний вище процес, в якому метали були присутні в концентрації 0,5х ХВСІ і цистеїн додавали в кумулятивній концентрації 6-7 ммоль.
Таблиця 5-3
Ох 0.5х їх
ЛТаурин////////7777777771717171717171717111111111|1110111111 | З5ммоль | 75ммоль
Ппотаурино//////777777777771717171111111111111111 11101111 | З5ммоль | 7оммоль (Втамнс 77777771 Ї717171011117171 | 1обО мкмоль | 21,0 мкмоль
На фіг. 28Е показаний прогнозований ефект антиоксидантів у таблиці 5-3 на значення бр" (колірний простір СІЕ І", а", БУ) ї кінцевий титр. Таурин, гіпотаурин і гліцин значно знижували значення Б" без негативного впливу на титр.
Приклад 6. Дослідження глікозилювання та життєздатності для отримання афліберцепту з використанням ХВС
Біореактори (наприклад, 2) інокулювали з посівної культури клітинної лінії, яка продукує афліберцепт. Інокульовані культури вирощували при температурі 35,5, рн 7,1-0,25 та заданому значенні барботажу 22 куб. див. За необхідності до біорєакторів додавали глюкозу, піногасник та основне живлення. Отримання білка афліберцепту здійснювали з використанням
ХВСІ1 (фірмового). Отримання лінії клітин-господарів, які експресують злитий білок афліберцепту, здійснювали з використанням ХВС1 (фірмового) ХВС2 (доступного у продажу) та ХВСОЗ (доступного у продажу). Низку експериментів здійснювали з використанням ХВС 1, 2 і З без додаткових компонентів середовища. Ще одну низку експериментів здійснювали з використанням
ХВО 1-3, до яких додавали марганець (марганцю хлорид тетрагідрат, Зідта, 3,2 мг/л), галактозу (бЗідта, 8 г/л) та уридин (Зідта, б г/л) у поживні середовища для зміни профілю галактозилювання. Нарешті, здійснювали низку експериментів із використанням ХВС 1-3, до яких додавали марганець (марганцю хлорид тетрагідрат, б5ідта, 3,2 мг/л), галактозу (Зідта, 8 г/л) та уридин (5ідіта, 6 г/л) у поживні середовища для зміни профілю галактозилювання та додавали дексаметазон (Зідта, 12 мг/л) у поживні середовища для зміни профілю сіалювання композиції.
Освітлений збір з використанням кожного ХВС отримували за допомогою центрифугування з подальшим фільтруванням 0,45 мкм.
Зразки обробляли білком А перед аналізом М-гліканом.
Вимірювання титру
У цих прикладах, якщо не зазначено інше, титри афліберцепту вимірювали щодня з використанням ВЕРХ серії 1200 Адієпі (Санта-Клара, Каліфорнія) або еквівалентного, працюючого при низькому рН, ступінчастому градієнті елюювання з детектуванням при 280 нм.
Концентрації були присвоєні відносно еталонної калібрувальної кривої.
Значення щільності життєздатних клітин (МСО) та життєздатності клітин
У цих прикладах, якщо не зазначено інше, значення щільності життєздатних клітин (МСО) і життєздатності клітин вимірювали за допомогою виключення трипанового синього з використанням автоматичних лічильників клітин Мома ВіоРгойе РіІех (Мома Віотеадіса!, Уолтем,
Массачусетс). Глюкоза, лактат, рН поза контуром, розчинений кисень (00), вимірювання росоа2 та осмоляльність вимірювали з використанням Мома ВіоРгопйіе Біех (Мома Віотеаіса!Ї, Уолтем,
Массачусетс).
Профілювання М-глікан-олігосахаридів
Приблизно 15 мкг оброблених зразків білка А зі зборів ХВС 1-3 отримували для аналізу М-
гліканів згідно з протоколом УмМаїег5 СіусоУМогк5 з використанням наборів СіІусоУмМогк5 Каріа
Оедіусозуїаййоп та сІусоумогк5 Каріг Ійог-М5 Гареї (номери деталей Умаїег5 186008939 і 186008091, відповідно). М-глікани видаляли з білка афліберцепту за допомогою обробки зразків із використанням РМО-ази-Е при 50,5 "С протягом 5 хвилин із подальшим охолодженням при 2570 протягом 5 хвилин. Вивільнені глікани помічали флуоресцентним барвником КаріРіІйог-М5 шляхом реакції при кімнатній температурі протягом 5 хвилин. Білок осаджували за допомогою додавання ацетонітрилу до реакційної суміші і осаджували на дно лунки центрифугуванням при 2204 х г протягом 10 хвилин. Супернатант, що містить мічені глікани, збирали та аналізували за допомогою НВЕРХ з використанням рідинної хроматографії з гідрофільною взаємодією (колонка
Умаїег5 ВЕН Атіає) з постколонковою флуоресцентною детекцією. Після зв'язування з колонкою мічені глікани розділяли та елюювали з використанням градієнта бінарної рухомої фази, яка складається з ацетонітрилу та 50 ммоль водного форміату амонію (рН 4,4). Мічені глікани детектували з використанням флуоресцентного детектора з довжиною хвилі збудження 265 нм та довжиною хвилі випромінювання 425 нм. Використовуючи відносні відсотки площ піків М-гліканів на отриманих хроматограмах, розподіл М-гліканів представлений як загальний відсоток М-гліканів (1), які містять залишки ядра фукози (загальне фукозилювання, таблиця 6-1), (2) які містять щонайменше один залишок саліцилової кислоти (загальне сіалювання, таблиця 6-2), (3) ідентифікованих як маноза-5 (маноза-5, таблиця 6-3), (4) які містять щонайменше один залишок галактози (загальне галактозилювання, таблиця 6-4), та (5) з відомою ідентичністю (загальні ідентифіковані піки, таблиця 6-5).
Результати
Підрахунок життєздатних клітин (МСС), життєздатність та титри збору показані на фіг. 29-31 для ХВС 1-3 з додатковими компонентами та без них.
Серед дев'яти культур культура ХВСІ, яка містить уридин, марганець та галактозу, показала найвищий титр за 12 днів (5,5 г/л). ХВС1 без додаткових компонентів також показав високий титр за 12 днів (близько 4,25 г/л) порівняно з іншими сімома культурами (фіг. 29).
Результати життєздатності клітин були однаковими в різних умовах до Є дня процесу. Після дня 7 процесу культури ХВС2 та ХВОСЗ з додатковими компонентами середовища або без них показали життєздатність більше 90 95 (фіг. 30).
Культура ХВСІ з уридином, марганцем та галактозою продемонструвала найвищий УСС приблизно на день 6 (фіг. 31).
Вплив культур і добавок мав ефект на загальний розподіл М-гліканів (таблиці з 6-1 по 6-5).
Рівні глікану порівнювали з використанням афліберцепту, обробленого білком А (оцінювали два зразки), отриманого з використанням гідролізату сої. Загальні ідентифіковані піки перераховані в таблиці 6-5.
Таблиця 6-1
Загальне фукозилювання (95) хвсС1 77777711 4875 | 777-771 4626 0 всім 7 / Ї777171717171492а1 | -11111111711111114495800 хвсізуМозрех 7 | 777771174888.777 |7717171717171717-1111111171111111146230 хвВса 111111171Г1111117171717-11111111171171111111456871 17711111 45400 хвсаяМме 1 Ї7777171717171717-1111111117117111111468671 1711111 4527 0 хвСсоМеозрех// ЇЇ -1111111Ї111114682 1111111 хво3 77777771 Ї71717171714924 | -11111111111111114559..ЙШ:КСЦБ хвсззОМе 7 Ї77771711ся48и1 ЇЇ -111111117111111142610 хвсззуМозрех 7 | 7777171174996. | 7-71 1777111 4456 ШГ:
У являє собою уридин, М являє собою марганець, С являє собою галактозу, Оех являє собою дексаметазон
Таблиця 6-2
Загальне сіалювання (95)
Хв 44,06 нн 39,14 хвсі1зОМо 43,72 2-11 1711111558 0 хвсС1яуМехОех 143 | 36,72
ХВС2 нн 37,62 36,67 хвСсахуМо нн 37,57 36,29 хвСа2зуМохОех нн 38,06 т
ХВО 11 31,21 хвозОМо 42,48 нн 30,84 хвоЗз Мох рех 43,82 нн 32.74 58,24 59,23
У являє собою уридин, М являє собою марганець, С являє собою галактозу, Оех являє собою дексаметазон
Таблиця 6-3
Маноза-5 (95)
Хв 1111676 77777171 -111111117111111лом хвсСіхуМо 71716981 - 13,17 хвсС1яуМехОех 7777623 | ..ЮюЮЙЮЙ- 7 | 886 2 щЩ Фрзв/ ( хвс2 нн хі 11,96 хвСсахуМо 111 11111119440 10,93 хвсахуМехОех в Її хвоЗ ам 111111 12,63 хвозМо гей 11111 13,38 хвозМехрех 12205 Її 11,98
У являє собою уридин, М являє собою марганець, С являє собою галактозу, Оех являє собою дексаметазон
Таблиця 6-4
Загальне галактозилювання (95)
Хв 68,44 2-16
ХхвсС1ОМо 69,25 нн 59,02
ХВСТяОМохОех 69,05 ниж 63,26 хвс2 нн 65,33 63,68 хвСсахуМо нн 68.13 7.66 2 2- хвСса2зуМохОех нин 69,35 1 хвВо3 77777771 111117117457. | 777717171717-111111111Ї1111116228 хвсззиМе 7777/7777 748277 11111111 111111бла хвсззуМоОзрех | 77777648. | 777777 -777171717111 71711165
У являє собою уридин, М являє собою марганець, С являє собою галактозу, Оех являє собою дексаметазон
Таблиця 6-5
Загальні ідентифіковані піки (95) хвсС1 77777711 Ї1711717171718728 | -111111111711111111846700 всім 777777 77717171 8843 77717171 -11111717171711711111 83820 хвсізуМозрех 77 | 77771711787956. | 7777-7711 1777111 83440 хВса 77711111117Ї17777171717171717-11111111171177111111862е3111 1711111 8667 2 хвсаяМме 71777717 -11111717117117717171711718781 17778687 2 хвСсоМеозрех// ЇЇ Ї17111178753 11111111 хво3 77777771 Ї717171717171718688. | 777171717171717-11111711711711111 86310 хвсззиМе 777777 Ї77717171717178707. | 7777-7771 вв 2 хвсззуМозрех 7/7 87М8 ЇЇ 777771717171717-11111111171111111 87430
У являє собою уридин, М являє собою марганець, С являє собою галактозу, Оех являє собою дексаметазон
Загальне фукозилювання, загальне сіалювання, загальне галактозилювання та маноза-5, які спостерігаються на день 12 культур різних ХВС, склали від 42,61 95 до 46,26 95, від 30,84 95 до 39,14 95, від 59,02 до 66 95 та від 8,86 95 до 13,38 95, відповідно. Ці значення глікозилювання відрізняються від значень глікозилювання, отриманих із використанням гідролізату сої.
Нарешті, проводили вимірювання кольору для освітлених зборів, отриманих із клітин, які експресують афліберцепт у ХВС1, ХВС2 і ХВСОСЗ, доповнених уридином, марганцем і галактозою.
Робочі параметри для стадій дослідження біореактора будуть відомі середньому фахівцю в цій галузі.
Приклад 7. Афінне отримання білків проти МЕСЕ 7.1 Експресія МЕСЕ МіпіТгар
Кодуючі області рекомбінантного МЕСЕ МіпіТтар (наприклад, МТ5, 5ЕО ІЮ МО: 46) були функціонально зв'язані з сигнальною послідовністю, клонованою у вектор експресії ссавця і трансфікували в клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО-К1); стабільно трансфіковані пули виділяли після відбору з використанням гігроміцину 400 мкг/мл протягом 12 днів. Стабільні пули клітин СНО, вирощені в середовищі без білків із визначеним хімічним складом, застосовували для отримання білків для випробування. Рекомбінантні поліпептиди секретувалися з клітин у поживне середовище.
Послідовності складових доменів МЕСЕ МіпіТгар - Людський РІЙ (номер доступу МР 001153392.1) - Людський РІК1 (номер доступу МР. 0022441) - Людський Ес (ІСНОЇ, номер доступу РО1857-1)
Рекомбінантний УЕСЕ МіпіТгар з (МТ5) отримували з цього процесу і додатково обробляли. 7.2 Отримання колонок для афінної хроматографії
Оцінювали п'ять різних білків, здатних зв'язуватися з МЕСЕ МіпіТгар (МТ5). Застосовувані білки включають МЕСЕтв5 (ЗЕО ІО МО: 72), тАБІі (людський ЇД61 проти мишачого тАБ до
МЕСЕМКІ, де 5ЕО ІЮО МО: 73 являє собою важкий ланцюг і ЗЕО ІЮО МО: 74 являє собою легкий ланцюг); тАбБ2 (людський ЇдДС1 проти мишачого тАб до МЕСЕК'ІТ, де 5ЕО ІО МО: 75 являє собою важкий ланцюг і ЗЕО ІЮО МО: 76 являє собою легкий ланцюг); тАбБЗ3 (мишачий ІдсС1 проти мишачого тАБб до МЕСЕМК'І, де 5ЕО ІЮО МО: 77 являє собою важкий ланцюг і 5ЕО ІЮО МО: 78 являє собою легкий ланцюг) і тАБб4 (мишачий Їдс1 проти мишачого тАб до МЕСЕК'І, де ЗЕО ІЮО МО: 79 являє собою важкий ланцюг і 5ЕО ІО МО: 80 являє собою легкий ланцюг).
Колонку активували за допомогою промивання колонок б об'ємами колонки (СМ) 1 ммоль крижаної хлороводневої кислоти при швидкості потоку, яка не перевищує 1 мл/хв. Десять мг кожного білка завантажували в три афінні колонки НіТгар МН -Асіїмайей НР (1 мл, СЕ Неаїсаге,
Мо за каталогом 17-0716-01), і колонки закривали для забезпечення зв'язування протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Колонки промивали 18 об'ємами колонки 0,5 моль ацетату натрію, 0,5 моль Масі, рН 4,0 і відкриті ділянки блокували 18 об'ємами колонки 0,5 моль трис-НСЇ, 0,5 моль Масі рН 8,3 (промивання проводили в такому порядку: б об'ємів колонки 0,5 моль трис-
НОЇ, 0,5 моль Масі, рН 8,3; 6 об'ємів колонки 0,5 моль ацетату натрію (ацетат натрію: 9УТ ВакКег, Мо за кат. 3470-01) 0,5 моль Масі, рН 4,0; б об'ємів колонки 0,5 моль буфера трис, рН 8,3; колонку інкубували протягом 30 хвилин при кімнатній температурі; б об'ємів колонки 0,5 моль буфера ацетату натрію, 0,5 моль Масі, рН 4,0; 6 об'ємів колонки 0,5 моль трис-НСЇІ, 0,5 Масі, рН 8,3 та 6 об'ємів колонки 0,5 моль буфера ацетату натрію, 0,5 моль Масі, рН 4,0). Колонки зберігали у
ОРВ5, рН 7,5. П'ять оцінюваних колонок були позначені як колонка 1 (містить МЕСЕ165), колонка 2 (містить тАБбІ), колонка З (містить тАб2), колонка 4 (містить тАбБЗ) і колонка 5 (містить тАба). 7.3 Отримання МіпіТгар з використанням афінної хроматографії
Отримання зразка. Виконували два різні процеси отримання для МіпіТтгар. В одному випадку матеріал, який містить зразок МіпіТгар, отримували з використанням кожної афінної колонки, де вихідний матеріал (МіпіТгар) розводили 1Х буфером ОРВ5 до 20 мг/мл і наносили на колонку і включали при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Використовуючи афінну колонку,
МіпіТгар виділяли з -- 7000 ч./млн НОР.
В якості альтернативи застосовували зібраний супернатант культури, який містив 0,4 мг/мл білка в супернатанті, та завантажували різні афінні колонки (1-5) окремо. Подальше розведення не проводили. Потім афінні колонки промивали з використанням 9 СМ їх буфера ОРВ5 з подальшим розведенням білків із використанням елююючого буфера до, рН 2,8 (Тпегто, Мо за кат. 21009).
Потім матеріал МіпіТгар, отриманий як описано вище, фільтрували крізь фільтр 0,45 мкмоль або центрифугували перед завантаженням колонки, отримані як описано вище в розділі 7.2.
Двадцять п'ять мл завантажувального розчину, що містить приблизно 0,4 мг/мл, завантажували в кожну колонку та інкубували протягом 20 хвилин. Кожну колонку промивали 9 СМ ОРВ5 (Іпийгодеп, Мо за кат. 14190-144) перед елююванням для врівноваження. Кількість МТ5 у фракціях промивання показана в таблиці 7-1. Після промивань йшло елюювання з використанням 6 СМ при рН 2,8 (комерційний елююючий буфер, (Тпепто, Мо за кат. 21009)) і 100 ммоль гліцинового буфера з рН 2,5 і фракції швидко нейтралізували за допомогою додавання 1 моль буфера трис, 7,5 (Іпийгодеп, Мо за кат. 15567-027). Кількість МіпіТтар в елюйованих фракціях також показана в таблиці 7-1.
МіпіТгар (МТ5) був успішно отриманий з усіх п'яти афінних колонок. Вихід із колонки з МЕСЕ і65 був великим у порівнянні з колонками тАбІ1 та тАбБ2. МАБЗ та тАБба, які містять гуманізовані тАб проти МЕСЕК'Т, також показали успішне отримання МТ5 з виходом, аналогічним тАбБІ1 та тАбБ2. У таблиці 7-1 очікуваний вихід розраховували на основі 100 95 ефективності кон'югації та молярного відношення 1:1 захопленого на основі афінності білка до МТ5.
Таблиця 7-1
МЕС 165 тАбБІ1 тАра2 тАБЗ тА
7.А Дослідження стабільності колонки
Декілька циклів виконували з використанням колонок 1 і 2 після способу, описаного в розділі 7.3 (таблиця 7-2 для колонки 1 та таблиця 7-3 для колонки 2).
Таблиця 7-2
Вихід продукту
Мецилуї | 1 | 2 | з | 4 | 5 | 6 | 7
Завантажені | 210 19,7 19,7 197 196 196 196 ня (мг) тн
Таблиця 7-3
Вихід продукту
Мецилу.ї | 1 | 2 | З | 4 | 5 | 6 | 7
Завантажен- повне
Колонки зберігали при 42С протягом близько 5 тижнів. Подібна кількість МТ5 була елюйована з кожної продукції, демонструючи хорошу стабільність колонки. 7.5 Дослідження стабільності отриманого МЕСЕ Міпі Ттар
Здійснювали аналіз 505-РАСЕ елюйованих фракцій з трьох колонок (колонки 1, колонки 2 та колонки 3). Зразки отримували в невідновлювальному та відновлювальному ілюстративному буфері 505-РАСЕ і запускали на 4-12 95 градієнті МиРаде гелю біс-трис із використанням 1Х МЕ5 (Мо за кат. МРО322, Іпийгодеп, Карлсбад, Каліфорнія).
У лунки завантажували (1) стандарт молекулярної маси, (2) завантажувальний розчин, (3) промивання колонки з колонки 1, (4) елюйовану фракцію з колонки 2, (5) елюйовану фракцію з колонки 1, (б) елюйовану фракцію з колонки 3, (7) МТ5, який зберігається при рН 2,8 протягом 1 хв., (8) МТ?5, який зберігається при рН 2,8 протягом 30 хв., та (9) стандарт молекулярної маси (фіг. 33 ї фіг. 34). Аналіз показав, що фракції, отримані з елюйованих фракцій із всіх трьох афінних колонок (колонки 1-3), показали однаковий розмір профілів, і застосування афінних колонок не дестабілізувало МіпіТгар. 7.6 Розрахунок рівня білка клітини-господаря
Стандартну криву концентрації білків клітини-господаря отримували з використанням набору
СНО НСР ЕЇІ5А, зб (550) (Судив ТесПппоіодіеєв) (фіг. 32 і таблиця 7-4). Кількість НСР у завантажувальних розчинах та елюйованих фракціях розраховували з використанням стандартної кривої, як показано на фіг. 32, і формули кривої, представленої в таблиці 7-4.
Таблиця 7-4 асимптота
У 5 (А-ОУ(ОУСУВ) я 0
Загальну кількість НСР розраховували з використанням стандартної кривої, а діаграма із загальною кількістю білків клітини-господаря представлена на фіг. З5А. На фіг. 358 також показана загальну кількість білків клітини-господаря у завантаженні порівняно з промиваннями та елюйованими фракціями з колонок 1, 2, 4 та 5. Декілька прогонів здійснювали з використанням колонок і (2) на фіг. 358 представляє прогін, з якого була елюйована фракція.
Застосування афінного захоплення з використанням білків, здатних зв'язуватися з МіпіТгар, показало ефективне зниження НСР близько 7000 ч./млн до близько 25-50 ч./млн. Як спостерігалося для виходу, колонка з МЕСЕ165 продемонструвала більш високу чистоту МіпіТгар з НОР, ніж показано для колонок тАбІ1 та тАбБ2. 7.1 Профілі ЗЕС МЕСЕ МіпіТгар до та після афінного отримання
Профілі 5ЕС елюйованих фракцій із трьох колонок (колонки 1-3) порівнювали з профілем ЕС
МіпіТгар у завантажувальному розчині. Як видно на фіг. 36 і в таблиці 7-5, профілі ЗЕС МТ5 до або після афінного отримання були значною мірою подібні.
Таблиця 7-5
Ме піка Час Бод Час Бод Час Б. Час Б. відповідно площі площі площі площі до фіг. 36 утримування Діра утримування Дуд (утримування Цра Утримування Діга фр |Елюзтюлонші (Елювтколонши Елюатколониз розчин 1 1 68 | 18 | 68 | 72 69 || 70 | 12 7.8 Кінетичні характеристики МЕСЕ МіпіТгар до та після зв'язування зразків із колонок з тАб1, тАбБ2 та МЕСЕ 165
Дослідження кінетичних характеристик здійснювали за допомогою інструменту Віасоге 1200.
Рівноважні константи дисоціації (значення Ко) для МЕСЕ165, що зв'язується з МіпіТтар в елюатах із колонок 1 і 2, та завантажувального розчину визначали з використанням біосенсора поверхневого плазмонного резонансу в реальному часі з використанням інструменту Віасоге
Т200. Усі дослідження зв'язування проводили в 10 ммоль НЕРЕ5, 150 ммоль Масі, З ммоль ЕОТА і 0,05 95 об./06б. поверхнево-активної речовини Твін-2го рН 7,4 (НВ5-ЕТ), запускаючи буфер при 25"Сб. Поверхню сенсора Віасоге спочатку отримували за допомогою зв'язування амінного сполучення з тАБі для захоплення МТ5. Спрощене зображення дослідження зв'язування показано на фіг. 37.
Коротко, еєлюати з колонок та завантажувального розчину розводили в буфері НВ5-ЕР (Віасоге) та вводили крізь іммобілізовані білкові матриці на рівні захоплення - 70 КИ. Потім
МЕСЕ:6є5 ін'єктували зі швидкістю потоку 50 мкл/хв. Еквівалентний обсяг аналіту одночасно вводили на необроблену контрольну поверхню, щоб він служив в якості порожніх сенсограм для віднімання фону об'ємного показника заломлення. Поверхню сенсорного чіпа регенерували між циклами за допомогою двох 5-хвилинних ін'єкцій 10 ммоль гліцину зі швидкістю 25 мкл/хв. Потім отримані експериментальні сенсограми зв'язування оцінювали з використанням програмного забезпечення ВІА Авзез5тепі 4.0.1 для визначення параметрів кінетичної швидкості. Набори даних для кожного зразка відповідали моделі Ленгмюра 1:1. Для цих досліджень дані зв'язування та дисоціації аналізували згідно з протоколом аналізу Сіоваї Рїї, при цьому вибираючи локальну відповідність для максимальної зв'язувальної здатності аналіту (КО) або атрибуту Ктах. У цьому випадку програма розраховувала єдину константу дисоціації (Ка), константу асоціації (Ка) і константу афінності (Ка). Рівноважна константа дисоціації становила Ко-Ка/кКа. Кінетичну швидкість прямої реакції, кінетичну швидкість зворотної реакції та загальну спорідненість визначали з використанням різних концентрацій МЕСЕ 65 в діапазоні 0,03-2 нмоль (таблиця 7-6).
Періоди напіввиведення дисоціації (2) були розраховані на основі кінетичних констант швидкості як П/2:Іп(2)/60"Ка. Кінетичні параметри зв'язування для МТ5 до МЕС 65, отримані внаслідок попередньої та подальшої афінної хроматографії при 25 "С, показані в таблиці 7-6.
Афінність (КО), швидкість прямої реакції (Ка, М-1с-1) і швидкість зворотної реакції (Ка) для
МТ», отриманого за допомогою афінної хроматографії, порівняно із завантажувальним розчином для оцінки ефекту(-ів) стадії афінної хроматографії, не продемонструвало зміни кінетичних характеристик МТ? від інших зразків. Сенсограми 5РЕК конструктів МЕСЕ МіпіТгар представлені на фіг. 38.
Таблиця 7-6
Міпітгар 106 Мис) | (105с7 1072Мм (хв) во тах (НО) розчин 7.9 Кілька виробничих циклів
Хроматографічне отримання збору, отриманого на стадії 7.1, проводили з використанням колонки 1 (ПМЕСЕ165) та колонки 2 (тАБІ1), як показано в 7.3. Колонки застосовували для декількох хроматографічних циклів. Вихід колонок істотно не змінився внаслідок додаткових прогонів, що свідчить про те, що колонки зберегли зв'язувальну здатність (таблиця 7-7).
Таблиця 7-7
Вихід продукту
Розрахунки НСР у завантажувальному розчині, промивних фракціях та елюйованих фракціях для колонок 1 і 2 виконували з використанням способу, описаного в 7.4 (фіг. 39). Розрахована загальна кількість НСР показала, що повторне застосування колонок не знижує здатність колонок зв'язуватися з Міпі Тгар. 7.10 Оптимізація афінних хроматографічних колонок
Хроматографічне отримання зібраного матеріалу згідно з отриманням 7.1 здійснювали з використанням колонки 1 (МЕСЕ165) та колонки 2 (тАБІ1). Для досліджень з оптимізації 14 мг або 45 мг замість 10 мг МЕСЕ165 або тАб до МЕСЕК'І завантажували в дві афінні колонки НіТгар
МН5-Асіїмаєед НР (1 мл, СЕ НеайНсаге), і колонки закривали для забезпечення витримування сполучення протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Підготовку колонки та отримання збору, включаючи МіпіТгар, виконували, як описано вище в пунктах 7.2 та 7.3. Кількість МТ5 у промиванні та елюйованих фракціях зазначена в таблиці 7-83. Порівняння афінної колонки з кількістю кон'югації 14 мг або 45 мг (МЕСЕ165 або тАБ до МЕСЕК'І (тАБбБІ)) замість 10 мг показує підвищений вихід МіпіТгар з обох колонок. Таким чином, вихід колонки з використанням описаного способу може бути поліпшений за допомогою оптимізації співвідношення білка до колонки або за допомогою збільшення ефективності кон'югації шляхом зміни рнН, часу інкубації, температури інкубації, тощо.
Таблиця 7-8
7.11 Застосування СЕХ з афінною хроматографією
Зразок культури клітин від експресії МТ5 отримували з використанням колонки 1, як описано вище в розділі 7.3. Отриманий елюат піддавали катіонообмінній хроматографії (СЕХ) колонка (НіТгар Сарію 5, 1 мл). Умови експлуатації колонки показані в таблиці 7-9.
Таблиця 7-9 (завантаження/промивання 1) . . тм 50 ммоль буфера трис, 62,5 ммоль . . 50 ммоль буфера трис, 1 моль
Загальна кількість НСР у вихідному/стартовому зразку культури клітин, елюаті колонки для афінної хроматографії 1 та елюаті СЕХ становила близько 230000 нг/мл, від близько 9000 нг/мл до близько 850 нг/мл, відповідно. Кількості НСР визначали кількісно з використанням набору
Судпиз СНО НСР ЕГІЗА, 30, як зазначено вище. 7.12 Застосування афінної хроматографії для отримання іншого білка проти МЕСЕ
Колонку 1 оцінювали для вивчення її здатності продукувати інші білки проти МЕСЕ. Для цього дослідження застосовували афліберцепт та фрагмент 5сЕм із потенціалом зв'язування МЕСЕ.
Виробничі процеси виконували згідно з описом у розділі 7.3. У таблиці 7-10 показано, що колонка 1 успішно зв'язувала та елюювала інші білки проти МЕСБЕ.
Таблиця 7-10
Приклад 8. Характеристика конструктів МЕСЕ МіпіТгар на основі мас-спектрометрії
Матеріали. МЕСЕ МіпіТгар (МТ) отримували з афліберцепту, як описано в прикладі 1. МЕСЕ
МіпіТттар 5 (МТ5) отримували, як описано у прикладі 7. МЕСЕ МіпіТтар (МТб6) отримували за допомогою такого способу: кодуючі області рекомбінантного МЕСЕ МіпітТтар, (МТ5) були функціонально зв'язані з сигнальною послідовністю і клоновані у вектор експресії ссавців, трансфіковані в клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО-КТІ) і стабільно трансфіковані пули виділяли після відбору з використанням гігроміцину 400 мкг/мл протягом 12 днів. Стабільні пули клітин СНО, вирощені в ХВС, застосовували для отримання білків для аналізу. 8.1 Деглікозилювання глікопротеїнів.
Зразки з освітленого збору МТ, МТ5 і МТЄ розводили або відновлювали до концентрації 0,52 мг/мл у 28,8 мкл 1 95 (мас./об.) розчину поверхнево-активної речовини КСО (Карісеві 5Е, Умаїегв,
Мілфорд, Массачусетс) та 50 ммоль НЕРЕЗ (рН 7,9). Ці розчини нагрівали приблизно до 95 С протягом 2 хвилин, давали охолонути до 50 "С і змішували з 1,2 мкл розчину РМС-ази Е (Сіусоуогк5 Карій РМСазе Е, Умаїег5, Мілфорд, Массачусетс). Деглікозилювання завершували інкубацією зразків при 50 "С протягом 5 хв. 8.2 Аналіз за допомогою НІГІС-флуоресцентної-Е5І-М5 (МС/МС).
МТ1 аналізували за допомогою розділення НІС у поєднанні з флуоресцентним та мас- спектрометричним детектуванням. МТ5 та МТб аналізували з використанням тільки НІГІС.
Хроматографію проводили з використанням Умаїег5 20 Асдийу ОРІ С, обладнаного фотодіодною матрицею та детекторами флуоресценції (БІК) та пов'язаними з мас-спектрометром УМаїетг5
Зупарі б2-5 (умови МС). Режим розділення за допомогою хроматографії з гідрофільною взаємодією (НІГІС) застосовували з колонкою Умаїег5 ОРІ С СІусап ВЕН Атіае, 150х2,1 ммоль, 1,7 мкм. Температуру колонки встановлювали на б0"С, а температуру автоматичного пробовідбірника встановлювали на 5 "С. Об'єм упорскування становив 50 мкл. Діапазон сканування матриці фотодіодів складав 190-700 нм. РІК встановлювали на збудження 265 нм, випускання 425 нм для мічених КаріРіцог гліканів і збудження 274 нм і випускання 303 нм для тирозину, присутнього в глікопептидах. Початкова швидкість потоку становила 0,4 мл/хв. з рухомою фазою А, яка містить 100 ммоль форміату амонію (рн 4,4), і рухомою фазою В, яка є ацетонітрилом. 8.3 Умови МС
Експерименти рідинної хроматографії/мас-спектрометрії (РХ/МС) проводили з використанням мас-спектрометра Умаїег5 Зупарі 2-5. Діапазон сканування являв собою відношення маси до заряду 100-2400 для аналізів у режимі позитивних і негативних іонів. Час сканування становив 1 с, і глю-фібринопептид В постійно вводили (2 мкл/хв.) в якості калібруючої речовини ("фіксуючої маси"). Напругу на капілярі встановлювали рівною 2,5 кВ при температурі джерела 120 7С і температурі десольватації 500 "С. Витрату газу азотного розпилювача встановлювали на 700 л/год. 8.4 Вихідна ЗЕС-М5
Система АСОМІТУМ ОРІ С | класу (Умаїегз, Мілфорд, Массачусест) була пов'язана з мас- спектрометром О Ехасіїме НЕ Нубгій диаагироІїе-Огрігар (Тпегто Зсіепіййс, Бремен, Німеччина) для всіх онлайн-аналізів ЗЕС-М5. Колонку АСОШІТУ ОРІ С Ргоївіп ВЕН 5ЕС (200 А, 1,7 мкм, 4,6 х 300 мм) встановлювали за 30 "С і застосовували для розділення білків. Рухома фаза являла собою 100 ммоль ацетату амонію при рН 6,8. Кожне розділення займало 30 хвилин зі швидкістю потоку 0,3 мл/хв., і об'єм упорскування встановлювали на 40 мкг. Наступні параметри М5 застосовували для онлайн збору даних 5ЗЕС-нано-Е5БІ-М5. Кожне отримання даних тривало 25 хвилин, починаючи одразу після введення зразка. Деглікозильовані зразки іонізували в позитивному режимі з напругою розпилення З кВ, температурою капіляра 200 "С та рівнем КЕ 70 о-лінзи. Внутрішній СІЮ встановлювали на 75 еВ. Повне сканування М5 було отримано при роздільній здатності 15 К з діапазоном мас маса/заряд 2000-8000. Для повного сканування М5 застосовували максимальний час упорскування 100 мс, цільове значення автоматичного регулювання посилення Зеб та 10 мікросканів. 8.5 Пептидне картування
Отримання зразка для пептидного картування. Зменшення досягали за допомогою додавання 500 ммоль/л дитіотреїтолу (ОТ) до кінцевої концентрації 5 ммоль/л з подальшою інкубацією при 4 "С протягом 60 хв. Алкілювання проводили за допомогою додавання 500 ммоль/л йодацетаміду (ІАМ) до кінцевої концентрації 10 ммоль/л та інкубування при 4 "С протягом 60 хв. в темряві.
Денатуруючий буфер заміняли на буфер для розщеплення (1 моль/л сечовини в 0,1 моль/л буфера трис, рН 7,8) з використанням знесолюючих екслюзійних колонок 7еба"м 5ріп 7 К МУСО (Р/М 89882) (Тпепто Зсіепійс, Уолтем, Массачусетс) згідно з інструкцією виробника.
Рекомбінантний трипсин свині (придбаний у бідітта, Мо за кат. 03708985001) додавали в масовому співвідношенні 1:18 (фермент:зразок) (на основі білка МЕСЕ МіпіТгар, виміряного з використанням спектрофотометрії ОМ-Міз після заміни буферу), концентрацію білків МЕСЕ МіпіТгар доводили до 0,5 мкг/мкл та розщепленню дозволяли протікати протягом 4 год. інкубації при кімнатній температурі. Після закінчення розщеплення додавали 0,1 95 мурашиної кислоти у воду ступеня
РХ-МС у співвідношенні за об'ємом 11. Гідролізати зберігали при -80 "С до аналізу.
Аналіз за допомогою РХ-МС/М5 триптичних гідролізатів. Один або більше 2,5 мкг (10 мкл) розщеплених пептидів завантажували за допомогою автоматичного пробовідбірника на колонку
С18, укладену в термостатувальну піч колонки, встановлену на 40 "С. У черзі на ін'єкцію зразки витримували при 7 "С. Хромографічний спосіб починали з 98 95 рухомої фази А (0,1 95 об'ємної частки мурашиної кислоти у воді) та 2 95 рухомої фази В (0,1 95 об'ємної частки мурашиної кислоти в ацетонітрилі) при постійній швидкості потоку 0,200 мл/хв. Після промивання протягом 10 хвилин пептиди елюювалися протягом градієнта 110 хвилин, при якому вміст рухомої фази В збільшувався зі швидкістю 0,39 95 за хвилину до досягнення кінцевої композиції, що містить 45 95 рухомої фази В. Перед подальшим введенням зразка колонку промивали протягом 15 хв. 97 95 рухомої фази В, потім врівноважували 9895 рухомої фази А протягом 25 хв. Елюат був направлений на відпрацювання протягом перших 1,5 хвилин та останніх 5 хвилин прогону.
Пептиди, що елююють з хроматографічної колонки, аналізували за УФ-поглинанням при 214 нм з подальшою мас-спектрометрією на ТО ОгбБйгар ЕїЇйе або Оізсомегу Хі. Реплікаційні дані пептидного картування збирали для зразків РО 8670 та КМ 8671 для включення трьох тандемних аналізів МС (МС/МС) та одного аналізу тільки МС. Аналізи МС/МС виконували для ідентифікації пептидів залежно від даних режиму, в якому один цикл експериментів складався з одного повного
МеС-сканування від 300 маса/заряд до 2000 маса/заряд, за яким йшли п'ять послідовних МС/МСО- явищ, виконаних для іонів із першого по п'ятий за інтенсивністю, виявлених при мінімальному пороговому рахунку 500 при скануванні МС, що ініціює цей цикл. Ціль послідовної мас- спектрометрії (Мбп) АСС була встановлена на 1Е4 з мікроскануванням - 3. Іонну пастку застосовували в режимі центроїду за нормальної швидкості сканування для аналізу фрагментів
МС/МС. Повні скани МС збирали в режимі профілю з використанням аналізатора ЕТМ5 високої роздільної здатності (К-30 000) з метою повного сканування АСС 1Е6б та мікросканувань - 1. Іони відбирали для МС/МС з використанням ширини ізоляції 2 Да, потім фрагментували за допомогою дисоціації, індукованої зіткненням (СІЮ) з газоподібним гелієм, із використанням нормованої енергії СІО, що дорівнює 35, ОО активації 0,25 і часу активації 10 мсек. Стан заряду за замовчуванням встановлений на 7 - 2. Маси, залежні від даних, поміщали до списку виключень на 45 секунд, якщо іон-попередник ініцював явище двічі протягом 30 с; ширина виключення була встановлена на рівні 4-1 Да. Відмова стану заряду включена для непризначених станів заряду. У масовий список відмови були включені поширені домішки на 122,08 маса/заряд, 185,94 маса/заряд, 355,00 маса/заряд, 371,00 маса/заряд, 391,00 маса/заряд, 413,30 маса/заряд, 803,10 маса/заряд, 1222,10 маса/заряд, 1322,10 маса/заряд, 1422,10 маса/заряд, 1522,10 маса/заряд, 1622,10 маса/заряд, 1722,10 маса/заряд, 1822,10 маса/заряд та 1922,10 маса/заряд. Аналізи тільки для МС виконували для створення картки невідновлених пептидів ТІС та зменшених карток. 8.6. Результати
Структура конструкту МЕСЕ МіпіТгар. Структура МЕСЕ МіпіТгар МТ, МТ5 та МТ6 показана на фіг. 40, фіг. 41, фіг. 43 і фіг. 44.
Початковий мас-аналіз із використанням ЗЕС-М5 підтвердив ідентичність всіх трьох молекул на рівні інтактного білка після деглікозилювання (фіг. 42). Хромограма загальної кількості іонів (ТІС) нативного аналізу ЗЕС-М5 демонструє виявлення інтактних молекул МЕСЕ МіпіТгар приблизно за 12-13 хвилин. Розширення низькомолекулярної (ІМУМ) області ТІС показало наявність домішок ЇММУ в усіх трьох зразках білків.
Мас-спектри МЕСЕ МіпіТтар з деконволюцією додатково підтвердили їхню ідентичність і надали дані для з'ясування основних присутніх РТМ у зразку, що містять МТ і МТ5 (фіг. 43), які являють собою димери та МТ (фіг. 44), який являє собою одноланцюговий білок.
Аналіз зразка МТ1. Форми І ММУУ, ідентифіковані за допомогою ТІС аналізу БЕС-М5 зразків, що містять МТ, екстрагували для визначення трьох різних домішок І МУУ-Ї ММ, ГСМУМ2 та ІГМУУЗ (фіг. 45А і фіг. 458). Форми /ММ/1 включали усічені форми афліберцепту. Форми ЇМУМ2 включали домішку Ес, присутню у зразку від розщеплення афліберцепту, яке виконували для отримання
МіпіТгар. Форма І МУУЗ включає мономер, можливо відщеплений від молекули МТ (димеру).
Зразок МТ1 не показав наявність ферменту БарКІСАТОК, який застосовували для розщеплення афліберцепту з утворенням білка Міпіїтар. Фермент, якщо він присутній, виявляється приблизно за 11,5 та 12,5 хвилин. Такий пік не був виявлений під час аналізу БЕС-
М5 зразка МТ (фіг. 46).
Аналіз зразка МТ5. Форми І ММУУ, ідентифіковані за допомогою ТІС аналізу БЕС-М5 зразків, що містять МТ5, екстрагували на наявність двох різних домішок ГММУ-СММУ1 та І МУМ2 (фіг. 47).
Аналіз зразка МТб. Форми І ММУУ, ідентифіковані за допомогою ТІС аналізу БЕС-М5 зразків, що містять МТ, екстрагували на наявність трьох різних домішок ГМУМУ-ІМУМ1, ГМУУ2 та І МУУЗ (фіг. 48). Форми /ММ/2 включають фрагмент МТ, у результаті розщеплення утворюється фрагмент
МЕСЕ МіпіТгар із лінкером 545 (ЗЕО ІО МО.: 111). Форми І МУУ5 являють собою фрагмент МТ, в якому розщеплення відбулося безпосередньо до або після лінкеру 545 (5ЕО ІЮ МО.: 111).
Глікани у зразку МТЄ були ідентифіковані за їх масою та порядком елюювання у способі хроматографії НІГІС з використанням значення одиниці глюкози, вперше введеного Маїег5 та
Національним інститутом досліджень та навчання біотехнології (Дублін, Ірландія) (фіг. 49А і фіг. 498).
Кількісне визначення вільного тіолу. Залишки цистеїну конструктів МЕСЕ МіпіТтар можуть брати участь в утворенні внутрішньо- та міжмолекулярних дисульфідних зв'язків або можуть існувати у вигляді вільних тіолів. Було показано, що наявність сульфідних зв'язків у пептидах і білках накладає конформаційну жорсткість на білок. Тіоли можуть бути виявлені за допомогою різних реагентів та способів розділення. Аналіз трьох конструкцій МЕСЕ МіпіТтар щодо дуже низького рівня вільних тіолів показаний у таблиці 8-1.
Таблиця 8-1 знаходження
МЕСЕВІ ЕГМІРСВ (5ЕО І МО: 81
УЕСЕВа ІММСТАВ (ЕС І МО: 82
Шарнір Ес ТНТОСРРОСРАРЕЦ С (5ЕО І МО: 83
Кількісне визначення трисульфіду. Подібно вільним тіолам у Суз-залишках конструктів МЕСЕ
МіпіТгар, трисульфідні зв'язки можуть впливати на структуру білка. Аналіз трьох конструктів МЕСЕ
МіпіТгар в умовах із дуже низьким рівнем вільних тіолів показаний у таблиці 8-2.
Таблиця 8-2 знаходження
МЕСЕВІ вслесн - ЕІСП ТСЕАТУМОНІ УК (5ЕО І
ГМГМСТАН-5БРОСІ МТСААББОИЇ МТК(К) о о о
УгаЕВ2 ЗЕО І МО: 85 «0,1 95 «0195 . ТНТСРРОРАРЕЇ Г Я-ТНТСРРСОРАРЕЦЧ (С) о о
Шарнір Ес 5ЕО ІЮ МО: 86 3,796 |Н/В
Внутрішньоланцюговий дисульфід у шарнірній області. Неспарені дисульфідні зв'язки в шарнірній області можуть впливати на структуру, функцію та стабільність конструктів МЕСЕ
МіпіТгар. Аналіз трьох конструктів МЕСЕ Міпіїтар на дуже низьку або повну відсутність внутрішньоланцюгових дисульфідних зв'язків у шарнірній області конструктів МЕСЕ МіпіТгар
ІТНТС"РРС"РАРЕЇЇ С, С" показує, де може утворюватися внутрішньоланцюговий сульфідний зв'язок) (ЗЕО ІЮ МО.: 83) показаний у таблиці 8-3.
Таблиця 8-3
Дисульфід
Трисульфід
Кількісне визначення ізомерів поперечних та паралельних дисульфідних зв'язків. Для МТ і
МТ», які являють собою димери, з'єднані паралельними дисульфідними зв'язками в шарнірних областях, існує можливість ізомерів, в яких дисульфідні зв'язки в шарнірних областях можуть перетинатися (фіг. 50).
Кількісне визначення типів дисульфідного зв'язку, паралельного та перехресного, показало, що рекомбінантно експресований білок МТ5 мав дещо більш високий рівень перехресного дисульфідного місточка в шарнірній області Ес порівняно з МТІ, який являє собою молекулу, розщеплену ГаьЬкКІСАТОК (таблиця 8-4).
Таблиця 8-4 99,8 95 96,1 95
Посттрансляційні модифікації (Р' ТМ).
Таблиця 8-5
Авп8А ЕІСП-ТСЕАТУМОНІ УК
Дезаміду- (Азп319) |(5ЕО ІО МО: 87) 21,9 95 | 18,9 95 | 20,9 95 вання 0 допою 0 ОТМТІВУМІВР
Мено ВОТОНРЕУЕМУЗЕІРЕННМТЕСВ (ЗЕО І
Меїго ВОТОНРЕУЕМУЗЕІРЕННМТЕСВ (ЗЕО І свасзасавоза,асаЗааасва
Меї245 сазссваа55ОТавВРЕМЕМУЗ5ЕЇ 1,4 95
Окиснен-ня РЕПНМТЕСВ (5ЕО ІО МО: 91 савасзасавосзассазоаавсавасиас
Меї255 заспасеЗОГТавВРЕМЕМУ5ЗЕЇІРЕПНМТЕСА 2,7 Уо
ЗЕО ІЮ МО: 92
МеМб3 |ТО5О5ЕМК (5ЕО ІО МО: 93) 4395 | 4395 | 3,895
Меї398 І ' ' ' (м дл З0ОСІУТСААВВСІ МТК (5ЕО 10 МО: 94)
Втрата С- кінцевого Спуг11 ТНТСРРСОРАРЕГГ С (5ЕО ІЮ МО: 95) 0,190 | 2,0 95 гліцину
Оцінка РТМ в усіх трьох конструкціях МЕСЕ МіпіТгар показала зіставні рівні РТМ (таблиця 8-5).
Дезамідування, яке спостерігалося при Азп84 з утворенням сукциніміду, становило від 3,1 до 3,296, а з утворенням аспарагінової кислоти/ізоаспарагінової кислоти становило 18,9-21,9 95.
Окиснення кількох залишків метіоніну (наприклад, Мемй10, Меї 20т Мей163 та Ме!192) спостерігали в діапазоні близько 0,7-6,8 95 для всіх трьох конструктів МЕСЕ МіпіТгар. МТб, який, на відміну від
МТ1 та МТ5, містить лінкер, показав додаткове окиснення залишків метіоніну на лінкері (наприклад, Меї245 та Меї255). Близько 0,1 95 ії 2,0 95 С-кінцевого гліцину (СІу211) у МТІ та МТ5 показали втрату гліцину. Цього не спостерігалося для МТ, у якому відсутній С-кінцевий гліцин.
Модифікації кінцевого продукту вдосконаленої глікації, пов'язані з глікацією лізину та аргініну.
Глікація конструкцій МЕСЕ МіпіТтар може змінювати їх структуру та функцію, що призводить до порушення активності проти МЕСЕ.
Таблиця 8-6
Ага
00001011 |Карбоксиметилювання.д/-/-/ | 1,596 | 1496 | 1496 ув ОН ступованя в
Гузб2
Оцінка модифікацій в усіх трьох конструкціях МЕСЕ МіпіТгар показала зіставні рівні (таблиця 8- б).
Модифіковані сайти. Змінені сайти на конструктах МЕСЕ МіпіТгтар, як з'ясувалося за допомогою аналізу інтактної маси згідно з розділом 8.4, були підтверджені та кількісно визначені з використанням скороченого пептидного картування, як показано в розділі 8.5 (таблиця 8-7). Сайт
Т90М91 для пептидної послідовності ТММ ТНК (ЗЕО ІЮО МО: 21) 7" означає, що аспарагін був перетворений на аспарагінову кислоту після усічення, тоді як для сайта М99Т100 для пептидної послідовності ОТМПТІОММІ5РЗНОЇБІЇЗМОЕК (5БО ІО МО: 19) " означає високий рівень неспецифічного відщеплення трипсином. Ці дві ділянки усічення були виявлені при утворенні домішок низькомолекулярних форм під час оцінки МТ1 і МТ5. Усічення на М245у246 було виявлено тільки на МТб, який мав унікальний лінкер та відповідав за домішку ГМУМ2 під час отримання МТ6.
Таблиця 8-7 свсозасавосзасаазавоазБасасзавоаоо о
Мменеуге ТОНРЕуЕМУВЕ ІРЕНА Зоо Мо 02017
Кількісне визначення зайнятості глікозитів. М-глікозилювання є звичайним РТМ.
Характеристика сайт-специфічного М-глікозилювання, включаючи макрогетерогенність М-глікана (зайнятість сайту глікозилювання) та мікрогетерогенність (сайт-специфічна структура глікана), важлива для розуміння біосинтезу та функції глікопротеїнів. Ступінь глікозилювання може змінюватися залежно від того, яким чином білок експресований. Рівні глікозилювання на МЗ36б були однаковими для всіх трьох МЕСЕ МіпіТгтар (таблиця 8-8 і фіг. 51). Подібним чином рівні глікозилювання на Мб68 також були однаковими для всіх трьох МЕСЕ МіпіТгар (таблиця 8-8 і фіг. 52). Рівні глікозилювання на М123 також були однаковими для всіх трьох МЕСЕ МіпіТгар (таблиця 8-6 і фіг. 53), але було виявлено, що рівень манози-5 підвищений препараті МТ1. Для конструкцій
МЕСЕ МіпіТгар глікозилювання Азп196 було нижче для МТ?5 та МТ порівняно з МТ (таблиця 8-8 і фіг. 54). Крім того, рівень манози-5 був також підвищений для препарату МТ, ніж у препаратів
МТ і Мб.
Таблиця 8-8
Аналіз М-гліканів. Глікозилювання на М3б показано в таблиці 8-9. 52Е, 52Е5, 52Е52 були основними М-гліканами, виявленими в усіх трьох МЕСЕ МіпіТгар. Для глікозилювання на Мб8, показаного в таблиці 8-10, 52Е та 525 були основними М-гліканами, виявленими в усіх трьох
МЕСЕ МіпіТгар. Для глікозилювання на М123, показаного в таблиці 8-11, 52Е та 525 були основними М-гліканами, виявленими в усіх трьох МЕСЕ МіпіТгар, і маноза-5 була виявлена при високих рівнях МТ порівняно з МТ5 та МТ6. Для глікозилювання на М196, показаного в таблиці 8- 12, 052, 625, 6252 були основними М-гліканами, виявленими в усіх трьох МЕСЕ МіпіТгар, і маноза- була виявлена при високих рівнях МТІ1 порівняно з МТ5 та МТ6.
Таблиця 8-9
Таблиця 8-10
Таблиця 8-11
Таблиця 8-12
О-глікани на лінкері для МТб. Лінкер 5 для МТЄ оцінювали для дослідження О-гліканів на
МТ6. О-ксилозилювання було виявлено на залишках серину, що знаходиться на 55 лінкері МТЄ (чсаесозасссазассоза,васзасааЗа,ИасеОТОКРЕМЕМУЗЕЇІРЕПНМТЕСК, підкреслені залишки серину були глікозильовані) (ЗЕО ІЮ МО: 98). Композиція О-глікана показана в таблиці 8- 13.
Таблиця 8-13
Ксилозилювання -132,0 Ди 000015 ооксилоза галактоза. | 2941 | |Моно-/ | 0,995
Ксилоза галактоза я сіаловакислота| 585,2 | /Моно- | 0795
Аналіз НІГІС-РІ А-М5. Аналіз НІІС-РІ 8-М5 здійснювали для всіх білків МЕСЕ МіпіТгар, як описано в розділі 8.2. Аналіз показав, що М-зв'язані глікани для МТ5 та МТб були схожі, але відрізнялися від гліканів, отриманих для МТ (на фіг. 55 показані повні та скорочені хроматограми, на фіг. 56 показані повні та хроматограми, що перекриваються, та на фіг. 57 показані повні, скорочені та нормалізовані хроматограми).
Нарешті, відсоток глікозилювання та детальна ідентифікація гліканів і кількісна оцінка для всіх трьох білків МЕСЕ МіпіТтар, перераховані у таблиці 8-14 і на фіг. 58А-С, відповідно. Як спостерігається в усіх аналізах гліканів, профіль глікозилювання та рівні манози для МТ5 та МТ6 аналогічні, але відрізняються від МТ.
Таблиця 8-14 11101111 м 1777 м?5/ | мб
Приклад 9. Отримання та кількісна оцінка кольору з використанням висхідного середовища та оптимізація процесу подачі. (А) Неоптимізоване ХВС (контрольний біореактор)
Застосовували виготовлення МіпіТгар, описане у прикладі 5.
Робочі параметри для стадій дослідження відомі середньому фахівцю в цій галузі.
Середовище на день 0 - ХВСІ і включало такі поживні речовини, антиоксиданти та метали: - Цистеїн додавали в кумулятивній концентрації 8-9 ммоль. - Метали у вихідному середовищі перераховані нижче в концентрації їх (якщо елементи вказані до додавання інокулята): - Ге-68-83 мікромолей на літр культури - 7п-6-7 мікромолей на літр культури - би-0,1-0,2 мікромолей на літр культури - Мі-0,5-1 мікромолей на літр культури
При зборі МТ1 слідувала процедура отримання, показана на фіг. 59. Робочі параметри хроматографії відомі звичайному фахівцю в цій галузі. Робочі параметри для афінного захоплення (стадія З фіг. 59), афінна проточна фракція (стадія 5 на фіг. 59), АЕХ (стадія 8 на фіг. 59) та НІС (стадія 9 на фіг. 59) викладені в таблиці 9-1. Протеолітичне розщеплення афліберцепту після стадії афінного захоплення та фільтрації проводили з використанням процедури, описаної у прикладі 1.2.
Таблиця 9-1 захоплення фракція 40 г/л смоли 100 г/л смола рн
Завантаження 30 г/л смоли 30 г/л смоли РН) рН 8,30 - 8,50, 4,40 - 4,60 7,50 - 6,80 - 7,20 1,р90-210 10.50 МСм/см
МмСм/см ' 26 ммоль буфера 40 ммоль буфера 20 ммоль трис, 16 ммоль |50 ммоль буфера) трис, 30 ммоль фосфату натрію | фосфату натрію, трис цитрату натрію,
Урівноваження рН 7,10- 7,30, |18 ммоль ацетату)! рН 8,30 - 8,50, )74 ммоль ацетату 2,60 - 3,20 рн 6,90 - 7,10, 1,р90-210 рн 4,40 - 4,60,
МмСм/см 2,00 - 4,00 МмСм/см 7,50 -10,50
МмСм/см МмСм/см 26 ммоль буфера 40 ммоль буфера ммоль трис, 16 ммоль |50 ммоль буфера) трис, 30 ммоль фосфату натрію, | фосфату натрію, трис цитрату натрію,
Промивання 1 500 ммоль Масі |18 ммоль ацетату! рН 8,30 - 8,50, /74 ммоль ацетату рН 7,10 - 7,30,40| рн 6,90 - 7,10, 1,р90-210 рн 4,40 - 4,60, - 50 мСм/см 2,00 - 4,00 МмСм/см 7,50 -10,50
МмСм/см МмСм/см
Таблиця 9-1 захоплення фракція ммоль фосфату натрію
Промивання 2 рН 7,10- 7,30, |Н/В н/В н/В 2,60 - 3,20
МмСм/см ммоль оцтової |40 ммоль оцтової кислоти рН 2,80 - |кислоти рН 2,80 -
Елюювання 3,20,0,28--0,36 3,20,0,28--0,36 В Нв
МмСм/см МмСм/см 500 ммоль 500 ммоль
Регенерація/очищення оцтової кислоти, ) оцтової кислоти, 2 моль хлориду . я 4 рнг2,25- 2,65, рнг2,25- 2,65, натрію (масі) Фірмовий буфер 0,90 -1,25 0,90 -1,25
МмСм/см МмСм/см
Регенерація/очищення 1 н. гідроксиду
У таблиці 9-2 показана кількісна оцінка кольору пулів, отриманих при виконанні різних хроматографічних стадій. Кількісну оцінку кольору проводили з використанням зразків із пулу, що мають білок у концентрації 5 г/л.
Пул афінного захоплення відноситься до елюату, зібраного при здійсненні стадії афінного захоплення (стадія З на фіг. 59). Ферментативний пул відноситься до проточної фракції, зібраної при здійсненні стадії ферментативного відщеплення (стадія 4 фіг. 59). Пул афінної проточної фракції відноситься до проточної фракції, зібраної при здійсненні стадії афінної проточної фракції (стадія 5 на фіг. 59) та елюат афінної проточної фракції відноситься до елюату, зібраного при здійсненні стадії афінної проточної фракції (стадія 5 на фіг. 59). Пул АЕХ та очищення АЕХ відносяться до проточної фракції та очищеної фракції, отриманих на стадії аніонообмінної хроматографії (стадія 8 на фіг. 59). Пул НІС відноситься до проточної фракції, зібраної при здійсненні стадії хроматографії з гідрофобною взаємодією (стадія 9 на фіг. 59).
Як видно в таблиці 9-2, кожна стадія демонструє зниження забарвлення (як видно зі зменшення значень р" пула). Наприклад, при виконанні афінної хроматографії проточної фракції проточна фракція має значення Б" 2,16 (зменшено зі значення Б" 2,52 для проточної фракції, отриманої в результаті стадії афінного захоплення). Проточна фракція та промивання після розділення АЕХ ще більше зменшили забарвлення, про що свідчить зменшення значення Б" з 2,16 до 0,74. Як і очікувалося, очищення колонки АЕХ призвело до зразка з жовто-коричневим кольором, який був значно інтенсивнішим, ніж забарвлення від проточної фракції та промивання після розділення АЕХ, як видно зі значень Б" (8,10 проти 0,74). Нарешті, стадія НІС забезпечувала подальше зменшення кольору (значення Б" може бути нормалізовано для концентрації білка 5 г/л зі значення Б", отриманого для пулу НІС при концентрації білка 28,5 г/л).
Таблиця 9-2
Кількісна оцінка кольору зразків на різних стадіях отримання
(В) Оптимізоване ХВС (низький рівень цистеїну, низький рівень металів та підвищений рівень антиоксидантів, біореактор)
Вплив зниження вмісту цистеїну, зниження вмісту металів та збільшення вмісту антиоксидантів на забарвлення оцінювали з використанням таких протоколів:
Середнє на день 0 - ХВС1 - Цистеїн додавали в кумулятивній концентрації 5-6 ммоль. - Антиоксиданти додавали до ХВСІ1 для досягнення таких кумулятивних концентрацій (де дані присутні до додавання інокуляту): - таурин - 10 ммоль культури - гліцин - 10 ммоль культури - тіоктова кислота - 0,0024 ммоль культури - вітамін С (аскорбінова кислота) - 0,028 ммоль культури - Метали в початковому середовищі перераховані нижче рівня 1х. - Ге-68-83 мікромолей на літр культури - 7п-6-7 мікромолей на літр культури - би-0,1-0,2 мікромолей на літр культури - Мі-0,5-1 мікромолей на літр культури - Зменшення вмісту всіх металів включено з використанням концентрацій 0,25х, зазначеного вище для середовища.
Після збору зразка МТ1 слідувала процедура отримання, показана на фіг. 59. Робочі параметри хроматографії відомі звичайному фахівцю в цій галузі. Робочі параметри для афінного захоплення, афінної проточної фракції та НіС викладені в таблиці 9-1. Протеолітичне розщеплення афліберцепту після стадії афінного захоплення та фільтрації проводили з використанням процедури, описаної у прикладі 1.2.
У таблиці 9-3 показана кількісна оцінка кольору пулів, отриманих при виконанні різних хроматографічних стадій. Кількісну оцінку кольору проводили з використанням зразків із пулу, що мають білок у концентрації 5 г/л. Як видно в таблиці 9-3, стадії забезпечували подібне отримання, що й для стадій у таблиці 9-2.
Таблиця 9-3
Кількісна оцінка кольору зразків на різних стадіях отримання Міпі Ттар
Пулафінногозахопленняд | 505401 | 9918 | -0009. | 77
Пулферментативноговідщеплення| 505401 | 9944 | -006 | 117
Елюатафінної проточної фракції | 505401 | 99,74 | -005 | 060
Порівнюючи таблицю 9-2 і таблицю 9-3, очевидно, що "умова біореактора з низьким вмістом цистеїну, низьким вмістом металів і підвищеним вмістом антиоксидантів" має більш низький колір у пулі афінного захоплення (значення Б" 1,77) порівняно з "умовою контрольного біореактора" (значення Б" 2,52).
Для зразка МТ з концентрацією 160 г/л, де МТ утворений з використанням стадій, перерахованих у таблиці 9-2 і таблиці 9-3, прогнозується значення ар" 13,45 для "умови низького вмісту цистеїну, низького вмісту металів та підвищеного вмісту антиоксидантів у біореакторі" та значення ар" 17,45 для "умови контрольного біореактора". Зменшення кольору на 23 95 досягається за рахунок оптимізації вихідних носіїв та поживних середовищ. Для зразка МТ з концентрацією 110 г/л, де МТ утворений з використанням стадій, перерахованих у таблиці 9-2 і таблиці 9-3, прогнозується значення аб" 9,25 для "умови низького вмісту цистеїну, низького вмісту металів та підвищеного вмісту антиоксидантів у біореакторі" та значення ар" 12 для "умови контрольного біореактора".
Для розуміння того, як кожна операція виробничої установки сприяє зниженню кольору, було обчислено значення Б" для кожної проміжної ланки виробничого процесу у вигляді відсотка від кольору пулу афінного захоплення (таблиця 9-4).
Таблиця 9-4 р" у вигляді 95 пулу
Зразок Конц. (г/л) | р" др" афінного захоплення . відщеплення
Контрольний Пул афінної проточної фракції
Низький вміст цистеїну, Пул ферментативного низький вміст пиши бою | лм | ово | ви металів та Пул афінної проточної вміст . зоеежетеупине 11101 вою) о | ов
Операція модуля АЕХ забезпечує максимальне зменшення кольору (зміна Б" від 1,08 до 1,42), тоді як операція модуля НІС забезпечує деяке додаткове зменшення кольору (зміна Б" від 0,08 до 0,19). Операції установки оцінювали загальне видалення 76,3 95 - 78,2 95 кольору, присутнього в пулі афінного захоплення.
Колір різних проміжних продуктів виробничого процесу для "умови контрольного біореактора" та "низький вміст цистеїну, низький вміст металів і підвищений вміст антиоксидантів у біореакторі" також вивчали відсотковий вміст 2-оксо-гістидинів і відсоток оксо-триптофанів в олігопептидах, які були утворені за допомогою розщеплення протеазою, як виміряно за допомогою мас- спектрометрії, як показано в таблиці 9-5 і таблиці 9-6, відповідно. Пептидне картування виконували, як описано в прикладі 3.
Посилаючись на таблицю 9-5, при порівнянні рівнів окиснення гістидину в пулах на різних стадіях отримання очевидно, що відносний вміст відсотка утворених рівнів окиснення гістидину для МТ зменшується в пулі при просуванні процесу отримання. Наприклад, для Н2г09 за "умови контрольного біореактора" відсотковий рівень окиснення гістидину становив 0,062 для пулу ферментативного розщеплення, який був знижений до 0,029 для проточної фракції АЕХ і далі знижений до 0,020 для пулу НІС. Подібним чином, для Н2г09 в умовах "низького вмісту цистеїну, низького вмісту металів і підвищеного вмісту антиоксидантів у біореакторі" відсоток окиснення гістидину становив 0,039 для пулу ферментативного розщеплення, і він був знижений до 0,023 для проточної фракції АЕХ і далі знижений до 0,016 для пулу НІС. Таким чином, виробнича стратегія призвела до зниження відсоткового рівня окиснення гістидину в МТ. У міру зменшення забарвлення зменшується наявність деяких окиснених залишків у зразку. Подібно до окиснення гістидину, рівні окиснення триптофану також відстежувалися для пулів на різних стадіях виробництва для обох "умов контрольного біореактора" і "низького вмісту цистеїну, низького вмісту металів та підвищеного вмісту антиоксидантів у біореакторі" (таблиця 9-6).
Таблиця 9-5 77777717 | Фракція |Колір(ю) Рівні окиснення гістидину (95)
НнІ19 невб НІ110 НІ45 | нгоЗ9 1 | спврнеся | су с
Пул ферментатив" 161 | 0023 | 018 | 0011 | 0,014 | 0007 | 0,062 відщеплення
Пул афінної проточної фрак-ції 2,16 0,030 0,027 0,018 0,015 | 0,011 | 0,067
У (завантажен- мови ня АЕХ) контрольного ГЕ ---- т біореактора люат афінної проточної 0,83 0,030 0,022 0,000 0,018 | 0,004 | 0,046 фрак-ції
Проточна фракція АЕХ 0,026 0,025 0,013 0,016 | 0,010 | 0,029
Очищення
АЕХ 2 моль 810 0,024 0,063 0,033 0,019 | 0,012 | 0,063
Масі
Пул НІС 0,018 0,009 0,002 0,021 0,005 | 0,020
Пул ферментатив" 117 | 0019 | 0,017 | 0009 | 0,014 | 0008 | 0,039
Умова відщеплення низького Пул афінної вмісту проточної цистеїну, фракції 1,58 0,026 0,025 0,013 0,014 | 0,010 | 0,043 низького (завантажен- вмісту металів| ня АЕХ) та Елюат афін- підвищеного |ної проточної 0,031 0,017 0,007 0,020 | 0,003 | 0,016 вмісту фракції антиоксидан- | Проточна бо | 0020 | 0,022 | 0,009 | 0,014 | 010 | 0,023 тів у фракція АЕХ біореакторі Очищення
АЕХ 2 моль 610 0,020 0,055 0,025 0,016 | 0,011 | 0,042
Масі
Пул НІС 0,013 0,009 0,002 0,017 | 0,003 | 0,016
Таблиця 9-6 7777.7.7юЮюЮ | Фракція. |Колір (5) Рівні окиснення триптофану (96)
МУ58| М/58 | М/58 | М/58 | М/138| М/138 | М/138 -4 -16 -2 -48 -4 -16 -2
Умови ферментатив- контрольного ного 1,61 0,006 0,032 | 0,289 | 0,000 | 0,020 | 1,093 | 0,106 біореактора й відщеплення
Таблиця 9-6 77111111... | Фракція |Колір(бУ| Рівніокисненнятриптофану(ф). -: С шви ЮК МОВ ЕЕ -4 -16 -2 -48 -4 -16 -2
Пул афінної проточної фрак-ції 2,16 0,016 0,055) 0,327 | 0,000 | 0,017 | 0,771 | 0,111 (завантажен- ня АЕХ)
Елюат афінної | 0,83 |0,009) 0,031 | 0453 | 0,000 | 0,025 | 1,039.) 0,132 проточної фрак-ції фракція АЕХ
Очищення
АЕХ 2 моль 8,10 0,043) 0,089 | 0,462 | 0,000 | 0,031 | 0,620 | 0,175
Масі
Пул ферментатив" 117 0,009) 0,027 | 0239.) 0,001 | 0,027 | 1,026 | 0,136 відщеплення
Умова Пул афінної низького проточної вмісту фракції 1,58 0,013) 0,045) 0284 | 0,000 | 0,021 | 0,628 | 0,107 цистеїну, (завантажен- низького ня АЕХ) вмісту металів | Елюат тапідвище- афінної 0,003 | 0,026 | 0,421.) 0,021 | 0,025 | 1,032.) 0,132 ного вмісту проточної антиоксидан- |/|фракції тів у Проточна
Очищення
АЕХ 2 моль бо 0,034) 0,073 | 0,478 | 0,000 | 0,032 | 0,635 | 0,169
Масі
Перераховані приклади
Ілюстративні перераховані нижче приклади не призначені для обмеження, і на основі наведеного в цьому документі опису, як оцінять фахівці в цій галузі, буде зрозуміло, що можуть бути реалізовані додаткові варіанти для отримання композиції проти МЕСЕ, включно з афліберцептом і МЕСЕ МіпіТгтар, з використанням ХВС та зміни умов для зменшення або збільшення білкових варіантів та жовто-коричневого кольору, згідно з описом у цьому документі. 1. Композиція, що містить оксо-МіпІтар, в якій один або більше амінокислотних залишків
МіпіТгар окиснені. 2. Композиція за п. 1, в якій указані один або більше амінокислотних залишків являють собою гістидин і/або триптофан.
З. Композиція за п. 1, в якій зазначений оксо-МіпіТгар, ферментативно розщеплений із забезпеченням одного або більше олігопептидів і, при цьому зазначені один або більше олігопептидів вибрані з групи, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 17, 5ЕО ІЮО МО: 18, 5ЕО ІО МО: 19,
ЗЕО ІО МО: 20, 5ЕО ІЮО МО: 21, 5ЕО ІЮ МО: 22, 5ЕО ІО МО: 23, 5ЕО ІЮО МО: 24, 5ЕО І МО: 25,
ЗЕО ІЮ МО: 26, 5ЕО ІЮО МО: 27, 5ЕО ІЮ МО: 28, 5ЕО ІЮ МО: 29, 5ЕО І МО: 30, 5ЕО ІО МО: 31,
ЗЕО ІЮО МО: 32 та їхньої комбінації. 4. Композиція за п. З, в якій зазначене ферментативне розщеплення здійснюють з використанням трипсину. 5. Спосіб отримання окиснених форм МіпіТгтар, що включає піддавання зразку, що містить
МіпіТгар, впливу холодного білого світла від близько 0,24 мільйона люкс"год. до близько 2,4 мільйонів люкс"год. 6. Спосіб отримання окиснених форм МіпіТгар, який включає а. піддавання зразку, що містить МіпіТгар, впливу холодного білого світла від близько 0,24 мільйона люкс"год. до близько 2,4 мільйонів люкс"год.; і р. здійснення розщеплення продукту стадії (а) з утворенням олігопептидів, причому зазначені олігопептиди містять один або більше з наступних олігопептидів:
ОКТНТС"РРСО"РАРЕЇ С (5ЕБО ІО МО: 17), БІС! ТС"ЕАТУМОаН'Т МК (5ЕБО ІО МО: 18),
ОТМТІПОМУМІ 5РОЗН'СІЕЇ 5МОЕК (5ЕО І МО: 19), ТЕГММОаірЕМУ/ЕМРЗБКН'ОНК (5ЕО ІО МО: 20),
ТММ ТН"А (5ЕО ІЮ МО: 21), БОТаАРЕМЕМУЗЕЇІРЕЇН"МТЕС (5ЕО ІЮ МО: 22), МН'ЕЄКОК (5ЕО І
МО: 23), БОТавАРЕМЕМ'УЗЕІРЕПНМТЕСА (5ЕО І МО: 64), БОТОАРЕМЕМУ5ЗЕЇІРЕПНМ"ТЕСВ (5ЕО ІО МО: 65), ТОБОБЕМ'К (5ЕО 0 МО: 66), 5БОСІ МТС ААББОЇ МТК (ЗЕО ІО МО: 67),
ПМ/ТОБА/ВПМУ"ОБАЛІМ"ОЗАК (5ЕБЕО І МО: 28), ТЕГ ММОІЮЕМУУЕМРБОБЗК (5ЕБО ІО МО: 29),
СЕРПЗМАТМУ"К (5ЕО І МО: 69), КЕРІ ОТИРООК (5ЕО ІЮ МО: 70) ЕЕ" ТІ ТІРОМТА (5ЕО ІЮ МО: 32), де Н" являє собою гістидин, окиснений до 2-оксо-гістидину, де С" являє собою карбоксиметильований цистеїн, де М" являє собою окиснений метіонін, де М/" являє собою окиснений триптофан, де У" являє собою окиснений тирозин і де ЕЕ" являє собою окиснений фенілаланін. 7. Спосіб за п. б, в якому кількість окиснених форм МіпіТгар підвищується приблизно 1,5-50- кратно в порівнянні з необробленим МіпіТгар після впливу холодного білого світла. 8. Спосіб за п. б, в якому зазначене розщеплення здійснюють з використанням трипсину. 9. Спосіб за п. б, в якому зазначені олігопептиди аналізують з використанням мас- спектрометрії. 10. Спосіб за п. б, в якому зазначене холодне біле світло має інтенсивність від близько 8 кілолюкс. 11. Спосіб за п. 5 або 6, в якому зазначений МіпіТгар піддають впливу холодного білого світла близько 0,24 мільйона люкс"год. і, при цьому кількість окиснених форм МіпіТгар підвищується приблизно 1,5-10-разово в порівнянні з необробленим МіпіТгар. 12. Спосіб за п. 5 або 6, в якому зазначений МіпіТгар піддають впливу холодного білого світла близько 0,96 мільйона люкс"год. і, при цьому кількість окиснених форм МіпіТгар підвищується приблизно 1,5-20-разово в порівнянні з необробленим МіпіТгар. 13. Спосіб за п. 5 або 6, в якому зазначений МіпіТгар піддають впливу холодного білого світла близько 1,2 мільйона люкс"год. і, при цьому кількість окиснених форм МіпіТгтар підвищується приблизно 1,5-20-разово в порівнянні з необробленим МіпіТгар. 14. Спосіб за п. 5 або 6, в якому зазначений МіпіТгар піддають впливу холодного білого світла близько 2,4 мільйона люкс"год. і, при цьому кількість окиснених форм МіпіТгтар підвищується приблизно 1,5-50-разово в порівнянні з необробленим МіпіТгар. 15. Спосіб отримання окиснених форм МіпіТгар, який включає а. культивування клітин, генетично сконструйованих для експресії афліберцепту в хімічно визначеному середови щі(ХВС); р. зв'язування афліберцепта із зазначеного освітленого збору в смолі з білком А; с. елюювання зазначеного афліберцепту зі стадії (б) і піддавання зазначеного афліберцепту ферментативному розщепленню для видалення його домену Ес з утворенням таким чином
МіпіТгар з першою кількістю окиснених форм МіпіТгар; а. піддавання МіпіТгар зі стадії (с) другої хроматографії для захоплення, причому зазначену стадію другої хроматографії для захоплення піддають однією або більше промивкам, і при цьому перша проточна фракція містить МіпіТгар; е. піддавання зазначеної першої проточної фракції зі стадії (4) аніонообмінної хроматографії (АЕХ) і
І. промивання зазначеної колонки АЕХ зі стадії (є) та збір другого потоку; і
9. очищення колонки АЕХ зі стадії () з використанням буфера для очищення, причому зазначений Міпіїтар в зазначеній очищеній фракції після зазначеного очищення зазначеної колонки АЕХ містить другу кількість окисненого Міпі Тгар. 16. Спосіб за п. 15, в якому зазначений буфер для очищення вибраний з групи, що включає 2
М хлорид натрію (Масі), 1 н. гідроксид натрію (Маон) або їхню комбінацію. 17. Спосіб за п. 15, в якому зазначений МіпіТгар зі стадії (с) додатково піддають впливу холодного білого світла від близько 0,24 мільйона люкс"год. до близько 2,4 мільйонів люкс"год. і, при цьому зазначена кількість окиснених форм МіпіТгар підвищується приблизно 1,5-50-разово. 18. Спосіб за п. 15, в якому зазначений елюйований МіпіТгар зі стадії (с) піддають впливу холодного білого світла протягом від близько 0,96 мільйона люкс"год. і, при цьому зазначена кількість окиснених форм МіпіТгар підвищується приблизно 1,5-20-разово. 19. Спосіб за п. 15, в якому зазначений елюйований МіпіТгар зі стадії (с) піддають впливу холодного білого світла протягом від близько 1,2 мільйона люкс"год. і, при цьому зазначена кількість окиснених форм МіпіТгар підвищується приблизно 1,5-20-разово. 20. Спосіб за п. 15, в якому зазначений елюйований МіпіТгар зі стадії (с) піддають впливу холодного білого світла протягом від близько 2,4 мільйона люкс"год. і, при цьому зазначена кількість окиснених форм МіпіТгар підвищується приблизно 1,5-50-разово.
ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«1105 БЕСЕМЕКБОМ РНАЕБЕМАСЕОТІСАТ5, ІМС. «1205 БІЛКОВІ КОМПОЗИЦІЇ ПРОТИ УЕСЕ ТА СПОСОБИ ЇХ ОТРИМАННЯ «1305 070816-02459 «1405 «1505 «1605 103 «1705 РавепсІп версія 3.5 «2105 1 «2115 339 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 1
Ме Атуд ув Агуд Сув Тут бБет ТПїІ Бек Аза Аїа Уаі Гей Аїа Аїа Уаї 1 5 10 15
ТПЕх Гец Рпе Уаї Ггец бБет Уаі Авр Агд сіу Уаі Іїе Аїа Авр бек РІеє бек Аїа Авп Сбіп Сі І1е Агд Тук бег Сіц Уаї ТБІ Рго Тук Нів Уаї1
ТПкх бБет Уаї Ткр ТПї Кгуз біу Уа1 ТПг Рго Рго Аїа Авп Рпе ТПт сіп бо сСі1іу бі Авр Уа1ї Робе Ніз Аїа Рго Тут Уаї Аї1а Авп Ссіп Сс1у Тгр Туг 65 70 75 80
Авр Іїе ТПт Гпув ТПт Рпе Авп с1у Гуз Авр Авр еп Гей Сув О1Уу Аї1а 85 90 95
А1ї1а ТІ АТїа с1у Авп Меє Гц Нів Тгр Тер Рбе Азр біп Авп о Гув Авр 100 105 110
Сіп чІ1е пуз Агд Тут Гц Сі бі Ніз Рго біц Гуз Сіп Гуз І1е Авп 115 120 125
Рпе Авп біу бі біп Меє Рпе Авр Уаї Гпув сіп Аїа Ії1е Авр ТПтї Гуз 130 135 140
Авп о Нів Сіп їец Авр бБет пув Тецп Рпе біш Тухк Рпе Гуз с1ц Кгув Аї1а 145 150 155 160
Рпе Рго Тут Гец бек ТПт пуз Нів їец сС1у Маії Рібе Рго Авзр Нів Уаї1 165 170 175
І1е Авр Меє Робе І1їе Азп сбіу Тут Агд Гец бек Гей ТПтІ АвБп Нів О1У 180 185 190
Рко ТПї Рго Уаі пув біц б1іу бек Гув Авр Рго Агд сіу сіу І1е РПе 195 200 205
Авр Аїа Уаії Рпе ТПтІ Акуд с1у Авр Сіп бек гув Ггец їец ТПтІ 5бет Агд 210 215 220
Ніз Авр Рбе пув С1іц Гпув Авп о Тец Ггув біц І1їе бБег Авр їєц І1е Гуз 225 230 235 240 пуз бі Гец ТБг сі сС1і1у уз Аїа Гец Сіу Гїєц бег Ніз ТПхг Тут Аї1а 245 250 255
Авп о уаії Агтуд Іїе Авп Ніз Уа! І1їе Азп Ге Тгр сС1у Аїа Авр Ріе Авр 260 265 270 зек Авп біу Авп їецп пув Аїа Іїе Тук УМаі ТПї Авр бБехг Авр бек Авп 275 280 285
А1їа бБет Іїе сіу Меє Гпув пув Тут Рпе Уаі Сіу Уаії Авп бБехт Аїа 0Щ1Уу 290 295 300 туз УМаії Аїа І1е бек Аза пув біш Іїе Гув бі Авр Авп І1е с1у А1а 305 310 315 320 сіп Маї їецш с1у Ге Рпе ТПт Гецп бет ТПхї біу біп Авр бек Тгр Авп 325 330 335 біп ТК Авп «2105 2 «2115 339 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 2
Ме Атуд ув Агуд Сув Тут бБет ТПїІ Бек Аза Аїа Уаі Гей Аїа Аїа Уаї 1 5 10 15
ТПЕх Гец Рпе Уаї Ггец бБет Уаі Авр Агд сіу Уаі Іїе Аїа Авр бек РІеє бек Аїа Авп Сбіп Сі І1е Агд Тук бег Сіц Уаї ТБІ Рго Тук Нів Уаї1
ТПкх бБет Уаї Ткр ТПї Кгуз біу Уа1 ТПг Рго Рго Аїа Авп Рпе ТПт сіп бо сСі1іу бі Авр Уа1ї Робе Ніз Аїа Рго Тут Уаї Аї1а Авп Ссіп Сс1у Тгр Туг
65 70 75 80
Авр Іїе ТПт Гув ТПт Рпе Авр с1у пув Авр Авр їец Гей Сув О1Уу Аї1а 85 90 95
А1ї1а ТІ АТїа с1у Авп Меє Гц Нів Тгр Тер Рбе Азр біп Авп о Гув Авр 100 105 110
Сіп чІ1е пуз Агд Тут Гц Сі бі Ніз Рго біц Ггув Сіп Був І1е Авзп 115 120 125
Рпе Авп біу бі біп Меє Рпе Авр Уаї пув сбіц Аїа І1їе Авр ТПкК Гуз 130 135 140
Авп о Нів біп їец Авр бБет Кув Тецш Рпе біш Тук Рпе Гув сіц Кгув Аї1а 145 150 155 160
Рпе Рго Тут Гец бек ТПт Кпуз Нів їец с1у Уаії Робе Рго Авзр Ніз Уаї 165 170 175
І1е Авр Меє Рбе І1їе Азп сіу Тут Агд Пец бек Гей ТБгІ АвБп Ніз С1У 180 185 190
Рко ТПї Рго Уаі пув біц сіу бек Гув Авр Рго Агд сіу с1у І1е РБПе 195 200 205
Авр Аїа Уаії Рпе ТПтІ Акуд с1у Авр Сіп бек гув Гец Гей ТПг бБег Агд 210 215 220
Ніз Авр Рбе пув С1іц Гув Авп Тец гув біц І1їе бБег Авр їєц І1е Гуз 225 230 235 240 пуз бі Гец ТБг сі с1у був Аїа Гец Сіу їєц бетг Нів ТрІ Туг Аїа 245 250 255
Авп о уаії Агтуд Іїе Авп Ніз Уа1ії І1їе Азп їєцш Тгр С1у Аї1а Авр Ріе Авр 260 265 270 зек Авп біу Авп Гецп пув Аїа Іїе Тугк Маї ТПІ Авр 5Бетг Авр 5ет Авп 275 280 285
А1їа бБет Іїе сіу Меє Гпув пув Тут РпПе Уаі Сіу Уаії Авп б5ехт Аїа 0Щ1У 290 295 300 туз УМаії Аїа І1е бек Аза пув біш Іїе Гув бі Авр Авп Ії1е с1у А1а 305 310 315 320 сіп Маї Гецп с1у Ге Рпе ТПт Гец бет ТПї біу біп Авр бет Тгр Авп 325 330 335 біп ТК Авп «2105 З «2115 339 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 З
Ме Атуд ув Агуд Сув Тут бБет ТПїІ Бек Аза Аїа Уаі Гей Аїа Аїа Уаї 1 5 10 15
ТПЕх Гец Рпе Уаї Ггец бБет Уаі Авр Агд сіу Уаі Іїе Аїа Авр бек РІеє бек Аїа Авп Сбіп Сі І1е Агд Тук бег Сіц Уаї ТБІ Рго Тук Нів Уаї1
ТПкх бБет Уаї Ткр ТПї Кгуз біу Уа1 ТПг Рго Рго Аїа Авп Рпе ТПт сіп бо сСі1іу бі Авр Уа1ї Робе Ніз Аїа Рго Тут Уаї Аї1а Авп Ссіп Сс1у Тгр Туг 65 70 75 80
Авр Іїе ТПт Гув ТПт Рпе Авп с1у Гуз Авр Авр їец Гей Сув О1Уу Аї1а 85 90 95
А1ї1а ТІ АТїа с1у Авп Меє Гц Нів Тгр Тер Рбе Азр біп Авп о Гув Авр
100 105 110
Сіп чІ1е пуз Агд Тут Гц Сі бі Ніз Рго біц Ггув Сіп Був І1е Авзп 115 120 125
Рпе Агкд біу бі біп Меє Рпе Авр Уаї Гпув сіп Аїа Ії1е Авр ТПтї Гуз 130 135 140
Авп о Нів Сіп їец Авр бБет Кпув Тецп Рпе біш Тут Рпе Гув сіц Кгув А1а 145 150 155 160
Рпе Рго Тут Гец бек ТПт пуз Нів їец сС1у Маії Рібе Рго Авзр Нів Уаї1 165 170 175
І1е Авр Меє Робе І1їе Азп біу Тут Агд Гей бек Гей ТБг АвБп Нів О1У 180 185 190
Рко ТПї Рго Уаі пув біц б1іу бек Гув Авр Рго Агд сіу сіу І1е РПе 195 200 205
Авр Аїа Уаії Рпе ТПтІ Акуд с1у Авр Сіп бек гув Ггец їец ТПтІ 5бет Агд 210 215 220
Ніз Авр Рбе пув С1іц Гпув Авп о Тец Ггув біц І1їе бБег Авр їєц І1е Гуз 225 230 235 240 пуз бі Гец ТБг сі сС1у був Аїа Гец Сіу Гїец бег Ніз ТПхг Тут Аї1а 245 250 255
Авп о уаії Агтуд Іїе Авп Ніз Уа! І1їе Азп Ге Тгр сС1у Аїа Авр Ріе Авр 260 265 270 зек Авп біу Авп їецп пув Аїа Іїе Тук УМаі ТПї Авр бБехг Авр бБег Авп 275 280 285
А1їа бБет Іїе сіу Меє Гпув пув Тут Рпе Уаі Сіу Уаії Авп бБехт Аїа 0Щ1Уу 290 295 300 туз Уаії Аїа І1е бБехт Аза гув біц Іїе Пув б1ц Авр Авп Ії1е с1у Аїа 305 310 315 320 сіп Маї їецш с1у Ге Рпе ТПт Гецп бет ТПхї біу біп Авр бек Тгр Авп 325 330 335 біп ТК Авп «2105 4 «2115 339 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 4
Ме Атуд ув Агуд Сув Тут бБет ТПїІ Бек Аза Аїа Уаі Гей Аїа Аїа Уаї 1 5 10 15
ТПЕх Гец Рпе Уаї Ггец бБет Уаі Авр Агд сіу Уаі Іїе Аїа Авр бек РІеє бек Аїа Авп Сбіп Сі І1е Агд Тук бег Сіц Уаї ТБІ Рго Тук Нів Уаї1
ТПкх бБет Уаї Ткр ТПї Кгуз біу Уа1 ТПг Рго Рго Аїа Авп Рпе ТПт сіп бо сСі1іу бі Авр Уа1ї Робе Ніз Аїа Рго Тут Уаї Аї1а Авп Ссіп Сс1у Тгр Туг 65 70 75 80
Авр Іїе ТПт Гув ТПт Рпе Авп с1у Гуз Авр Авр їец Гей Сув О1Уу Аї1а 85 90 95
А1ї1а ТІ АТїа с1у Авп Меє Гц Нів Тгр Тер Рбе Азр біп Авп о Гув Авр 100 105 110
Сіп чІ1е пуз Агд Тут Гц Сі бі Ніз Рго біц Ггув Сіп Був І1е Авзп 115 120 125
Рпе Авп біу бі біп Меє Рпе Авр Уаї Гпув сіп Аїа Ії1е Авр ТПтї Гуз
130 135 140
Авп о Нів біп їец Авр бБет Кув Тецш Рпе біш Тук Рпе Гув сіц Кгув Аї1а 145 150 155 160
Рпе Рго Тут Гец бек ТПт пуз Нів їец сС1у Маії Рібе Рго Авзр Нів Уаї1 165 170 175
І1е Авр Меє Рбе І1їе Гец сСіу Тут Агд Пец бек Гей ТБгІ Авп Ніз С1У 180 185 190
Рко ТПї Рго Уаі пув біц сіу бек Гув Авр Рго Агд сіу сіу І1е РБГе 195 200 205
Авр Аїа Уаії Рпе ТПтІ Акуд с1у Авр Сіп бек гув Гец Гей ТПг бБег Агд 210 215 220
Ніз Авр Рбе пув С1іц Гув Авп Тец Ггув біц І1їе бБег Авр їєц І1е Гуз 225 230 235 240 пуз бі Гец ТБг сі с1у був Аїа Гец Сіу їєц бетг Нів ТрІ Туг Аїа 245 250 255
Авп о уаії Агтуд Ії1е Авп о Нівз Уа! І1їе Азп їєш Тгр СсС1у Аї1а Авр Ріе Авр 260 265 270 зек Авп біу Авп Гецп пув Аїа Іїе Тугк Маї ТПІ Авр 5Бетг Авр 5ет Авп 275 280 285
А1їа бБет Іїе сіу Меє Гпув пув Тут РпПе Уаі Сіу Уаії Авп б5Бет Аїа 01Уу 290 295 300 туз УМаії Аїа І1е бек Аза пув біш Іїе Гув бі Авр Авп Ії1е с1у А1а 305 310 315 320 сіп УМаї Гей с1у Гецп Рпе ТПх Гей бет ТПї біу біп Авр бБет Тгр Авп 325 330 335 біп ТК Авп
«2105 5 «2115 339 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 5
Ме Атуд ув Агуд Сув Тут бБет ТПїІ Бек Аза Аїа Уаі Гей Аїа Аїа Уаї 1 5 10 15
ТПЕх Гец Рпе Уаї Ггец бБет Уаі Авр Агд сіу Уаі Іїе Аїа Авр бек РІеє бек Аїа Авп Сбіп Сі І1е Агд Тук бег Сіц Уаї ТБІ Рго Тук Нів Уаї1
ТПкх бБет Уаї Ткр ТПї Кгуз біу Уа1 ТПг Рго Рго Аїа Авп Рпе ТПт сіп бо сСі1іу бі Авр Уа1ї Робе Ніз Аїа Рго Тут Уаї Аї1а Авп Ссіп Сс1у Тгр Туг 65 70 75 80
Авр Іїе ТПт Гув ТПт Рпе Авп с1у Гуз Авр Авр їец Гей Сув О1Уу Аї1а 85 90 95
А1ї1а ТІ АТїа с1у Авп Меє Гц Нів Тгр Тер Рбе Азр біп Авп о Гув Авр 100 105 110
Сіп чІ1е пуз Агд Тут Гц Сі бі Ніз Рго біц Ггув Сіп Був І1е Авзп 115 120 125
Рпе Авп біу бі біп Меє Рпе Авр Уаї Гпув сіп Аїа Ії1е Авр ТПтї Гуз 130 135 140
Авп о Нів біп їец Авр бБет Кув Тецш Рпе біш Тук Рпе Гув сіц Кгув Аї1а 145 150 155 160
Рпе Рго Тут Гец бек ТПт пуз Нів їец сС1у Маії Рібе Рго Авзр Нів Уаї1
165 170 175
І1е Авр Меє Рбе І1їе Азп сіу Тут Агд Пец бек Гей ТБгІ АвБп Ніз С1У 180 185 190
Рко ТПї Рго Уаі пув біц б1іу бек Гув Авр Рго Агд сіу сіу І1е РПе 195 200 205
Авр Аїа Уаії Рпе ТПтІ Акуд с1у Авр Сіп бек гув Ггец їГец ТПг 5бег Агд 210 215 220
Ніз Авр Рбе пув С1іц Гпув Авп о Тец Ггув біц І1їе бБег Авр їєц І1е Гуз 225 230 235 240 пуз бі Гец ТБг сі сС1у був Аїа Гец Сіу Гїец бетг Нів ТПхг Тут Аї1а 245 250 255
Авп о уаії Агтуд Іїе Авп Ніз Уа! І1їе Азп Ге Тгр сС1у Аїа Авр Ріе Авр 260 265 270 зект Авр б1у Авп їецп пув Аїа Іїе Тук УМаі ТПї Авр бБехг Авр бБег Авп 275 280 285
А1їа бБет Іїе сіу Меє Гпув пув Тут Рпе Уаі Сіу Уаії Авп бБехт Аїа 0Щ1Уу 290 295 300 туз Уаії Аїа І1е бБехт Аїа пув біш Іїе пув б1ц Авр Авп Іїе с1у Аїа 305 310 315 320 сіп Маї їецш с1у Ге Рпе ТПт Гецп бет ТПхї біу біп Авр бек Тгр Авп 325 330 335 біп ТК Авп «2105 6 «2115 339 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 6
Ме Атуд ув Агуд Сув Тут бБет ТПїІ Бек Аза Аїа Уаі Гей Аїа Аїа Уаї 1 5 10 15
ТПЕх Гец Рпе Уаї Ггец бБет Уаі Авр Агд сіу Уаі Іїе Аїа Авр бек РІеє бек Аїа Авп Сбіп Сі І1е Агд Тук бег Сіц Уаї ТБІ Рго Тук Нів Уаї1
ТПкх бБет Уаї Ткр ТПї Кгуз біу Уа1 ТПг Рго Рго Аїа Авп Рпе ТПт сіп бо сСі1іу бі Авр Уа1ї Робе Ніз Аїа Рго Тут Уаї Аї1а Авп Ссіп Сс1у Тгр Туг 65 70 75 80
Авр Іїе ТПт Гув ТПт Рпе Авр с1у пув Авр Авр їец Гей Сув О1Уу Аї1а 85 90 95
А1ї1а ТІ АТїа с1у Авп Меє Гц Нів Тгр Тер Рбе Азр біп Авп о Гув Авр 100 105 110
Сіп чІ1е пуз Агд Тут Гц Сі бі Ніз Рго біц Ггув Сіп Був І1е Авзп 115 120 125
Рпе Агкд біу бі біп Меє Рпе Авр Уаї Гпув сіп Аїа Ії1е Авр ТПтї Гуз 130 135 140
Авп о Нів біп їец Авр бБет Кув Тецш Рпе біш Тук Рпе Гув сіц Кгув Аї1а 145 150 155 160
Рпе Рго Тут Гец бек ТПт пуз Нів їец сС1у Маії Рібе Рго Авзр Нів Уаї1 165 170 175
І1е Авр Меє Рбе І1їе Азп сіу Тут Агд Пец бек Гей ТБгІ АвБп Ніз С1У 180 185 190
Рко ТПї Рго Уаі пув біц б1іу бек Гув Авр Рго Агд сіу сіу І1е РПе
195 200 205
Авр Аїа Уаії Рпе ТПтІ Акуд с1у Авр Сіп бек гув Гец Гей ТПг бБег Агд 210 215 220
Ніз Авр Рбе пув С1іц Гпув Авп о Тец Ггув біц І1їе бБег Авр їєц І1е Гуз 225 230 235 240 пуз бі Гец ТБг сі с1у був Аїа Гец Сіу їєц бетг Нів ТрІ Туг Аїа 245 250 255
Авп о уаії Агтуд Ії1е Авп о Нівз Уа! І1їе Азп їєш Тгр сС1у Аїа Авр Ріе Авр 260 265 270 зек Авп біу Авп Гецп пув Аїа Іїе Тугк Маї ТПІ Авр 5Бетг Авр 5ет Авп 275 280 285
А1їа бБет Іїе сіу Меє Гпув пув Тут РпПе Уаі Сіу Уаії Авп б5Бет Аїа 01Уу 290 295 300 туз УМаії Аїа І1е бек Аза пув біш Іїе Гув бі Авр Авп Ії1е с1у А1а 305 310 315 320 сіп Маї Гей с1у Ге Рпе ТПт Гец бет ТПї біу біп Авр бБет Тгр Авп 325 330 335 біп ТК Авп «2105 7 «2115 339 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 7
Ме Атуд ув Агуд Сув Тут бБет ТПїІ Бек Аза Аїа Уаі їец Аїа Аїа Уаї 1 5 10 15
ТПЕх Гец Рпе Уаї Ггец бБет Уаі Авр Агд сіу Уаі Іїе Аїа Авр бек РІеє бек Аїа Авп Сбіп Сі І1е Агд Тук бег Сіц Уаї ТБІ Рго Тук Нів Уаї1
ТПкх бБет Уаї Ткр ТПї Кгуз біу Уа1 ТПг Рго Рго Аїа Авп Рпе ТПт сіп бо сСі1іу бі Авр Уа1ї Робе Ніз Аїа Рго Тут Уаї Аї1а Авп Ссіп Сс1у Тгр Туг 65 70 75 80
Авр Іїе ТПт Гув ТПт Рпе Авр с1у пув Авр Авр їец Гей Сув О1Уу Аї1а 85 90 95
А1ї1а ТІ АТїа с1у Авп Меє Гц Нів Тгр Тер Рбе Азр біп Авп о Гув Авр 100 105 110
Сіп чІ1е пуз Агд Тут Гц Сі бі Ніз Рго біц Ггув Сіп Був І1е Авзп 115 120 125
Рпе Авп біу бі біп Меє Рпе Авр Уаї Гпув сіп Аїа Ії1е Авр ТПтї Гуз 130 135 140
Авп о Нів біп їец Авр бБет Кув Тецш Рпе біш Тук Рпе Гув сіц Кгув Аї1а 145 150 155 160
Рпе Рго Тут Гец бек ТПт пуз Нів їец сС1у Маії Рібе Рго Авзр Нів Уаї1 165 170 175
І1е Авр Меє Рбе І1їе Гец сСіу Тут Агд Пец бек Гей ТБгІ Авп Ніз С1У 180 185 190
Рко ТПї Рго Уаі пув біц б1іу бек Гув Авр Рго Агд сіу сіу І1е РПе 195 200 205
Авр Аїа Уаії Рпе ТПтІ Акуд с1у Авр Сіп бек гув Гец Гей ТПг бБег Агд 210 215 220
Ніз Авр Рбе пув С1іц Гпув Авп о Тец Ггув біц І1їе бБег Авр їєц І1е Гуз
225 230 235 240 пуз бі Гец ТБг сі с1у був Аїа Гец Сіу їєц бетг Нів ТрІ Туг Аїа 245 250 255
Авп о уаії Агтуд Іїе Авп Ніз Уа! І1їе Азп Ге Тгр сС1у Аїа Авр Ріе Авр 260 265 270 зек Авп біу Авп їецп пув Аїа Іїе Тук УМаі ТПК Авр 5Бетї Авр бек Авп 275 280 285
А1їа бБет Іїе сіу Меє Гпув пув Тут Рпе Уаі Сіу Уаії Авп бБехт Аїа 0Щ1Уу 290 295 300 туз Уаії Аїа І1е бБехт Аїа пув біш Іїе Пув б1ц Авр Авп Іїе с1у Аїа 305 310 315 320 сіп Маї їецш с1у Ге Рпе ТПт Гецп бет ТПхї біу біп Авр бек Тгр Авп 325 330 335 біп ТК Авп «2105 8 «2115 339 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 8
Ме Атуд ув Агуд Сув Тут бБет ТПїІ Бек Аза Аїа Уаі Гей Аїа Аїа Уаї 1 5 10 15
ТПЕх Гец Рпе Уаї Ггец бБет Уаі Авр Агд сіу Уаі Іїе Аїа Авр бек РІеє бек Аїа Авп Сбіп Сі І1е Агд Тук бег Сіц Уаї ТБІ Рго Тук Нів Уаї1
ТПкх бБет Уаї Ткр ТПї Кгуз біу Уа1 ТПг Рго Рго Аїа Авп Рпе ТПт сіп бо сСі1іу бі Авр Уа1ї Робе Ніз Аїа Рго Тут Уаї Аї1а Авп Ссіп Сс1у Тгр Туг 65 70 75 80
Авр Іїе ТПт Гув ТПт Рпе Авр с1у пув Авр Авр їец Гей Сув О1Уу Аї1а 85 90 95
А1ї1а ТІ АТїа с1у Авп Меє Гц Нів Тгр Тер Рбе Азр біп Авп о Гув Авр 100 105 110
Сіп чІ1е пуз Агд Тут Гц Сі бі Ніз Рго біц Ггув Сіп Був І1е Авзп 115 120 125
Рпе Авп біу бі біп Меє Рпе Авр Уаї Гпув сіп Аїа Ії1е Авр ТПтї Гуз 130 135 140
Авп о Нів біп їец Авр бБет Кув Тецш Рпе біш Тук Рпе Гув сіц Кгув Аї1а 145 150 155 160
Рпе Рго Тут Гец бек ТПт пуз Нів їец сС1у Маії Рібе Рго Авзр Нів Уаї1 165 170 175
І1е Авр Меє Рбе І1їе Азп сіу Тут Агд Пец бек Гей ТБгІ АвБп Ніз С1У 180 185 190
Рко ТПї Рго Уаі пув біц б1іу бек Гув Авр Рго Агд сіу сіу І1е РПе 195 200 205
Авр Аїа Уаії Рпе ТПтІ Акуд с1у Авр Сіп бек гув Гец Гей ТПг бБег Агд 210 215 220
Ніз Авр Рбе пув С1іц Гпув Авп о Тец Ггув біц І1їе бБег Авр їєц І1е Гуз 225 230 235 240 пуз бі Гец ТБг сі с1у був Аїа Гец Сіу їєц бетг Нів ТрІ Туг Аїа 245 250 255
Авп о уаії Агтуд Іїе Авп Ніз Уа! І1їе Азп Ге Тгр сС1у Аїа Авр Ріе Авр
260 265 270 зект Авр бі1у Авп Гецп пув Аїа Іїе Тугк Маї ТПІ Авр 5Бетг Авр 5ет Авп 275 280 285
А1їа бБет Іїе сіу Меє Гпув пув Тут Рпе Уаі Сіу Уаії Авп бБехт Аїа 0Щ1Уу 290 295 300 туз УМаії Аїа І1е бек Аза пув біш Іїе Гув бі Авр Авп Ії1е с1у А1а 305 310 315 320 сіп Маї Гей с1у Ге Рпе ТПт Гец бет ТПї біу біп Авр бек Тгр Авп 325 330 335 біп ТК Авп «2105 9 «2115 339 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 9
Ме Атуд ув Агуд Сув Тут бБет ТПїІ бБехт Аза Аза Уаі! їец Аїа Аїа Уаї 1 5 10 15
ТПЕх Гец Рпе Уаї Ггец бБет Уаі Авр Агд сіу Уаі Іїе Аїа Авр бек РІеє бек Аїа Авп біп Сі І1е Агуд Тук бегт біц Уаї ТБІ Рго Тут Нів Уаї
ТПкх бБет Уаї Ткр ТПї Кгуз біу Уа1 ТПг Рго Рго Аїа Авп Рпе ТПт сіп бо сСі1іу бі Авр Уа1ї Робе Ніз Аїа Рго Тут Уаї Аї1а Авп сСіп с1у Тгр Туг 65 70 75 80
Авр Іїе ТПт Гув ТПт Рпе Авп с1у Гуз Авр Авр їец Гей Сув О1Уу Аї1а 85 90 95
А1ї1а ТІ АТїа с1у Авп Меє Гц Нів Тгр Тер Рбе Азр біп Авп о Гув Авр 100 105 110
Сіп чІ1е пуз Агд Тут Гц Сі бі Ніз Рго біц Ггув Сіп Був І1е Авзп 115 120 125
Рпе Агкд біу бі біп Меє Рпе Авр Уаї Гпув сіп Аїа Ії1е Авр ТПтї Гуз 130 135 140
Авп о Нів біп їец Авр бБет Кув Тецш Рпе біш Тук Рпе Гув сіц Кгув Аї1а 145 150 155 160
Рпе Рго Тут Гец бек ТПт пуз Нів їец сС1у Маії Рібе Рго Авзр Нів Уаї1 165 170 175
І1е Авр Меє Рбе І1їе Гец сСіу Тут Агд Пец бек Гей ТБгІ Авп Ніз С1У 180 185 190
Рко ТПї Рго Уаі пув біц б1іу бек Гув Авр Рго Агд сіу сіу І1е РПе 195 200 205
Авр Аїа Уаії Рпе ТПтІ Акуд с1у Авр Сіп бек гув Гец Гей ТПг бБег Агд 210 215 220
Ніз Авр Рбе пув С1іц Гпув Авп о Тец Ггув біц І1їе бБег Авр їєц І1е Гуз 225 230 235 240 пуз бі Гец ТБг сі с1у був Аїа Гец Сіу їєц бетг Нів ТрІ Туг Аїа 245 250 255
Авп о уаії Агтуд Іїе Авп Ніз Уа! І1їе Азп Ге Тгр сС1у Аїа Авр Ріе Авр 260 265 270 зек Авп біу Авп Гецп пув Аїа Іїе Тугк Маї ТПІ Авр 5Бетг Авр 5ет Авп 275 280 285
А1їа бБет Іїе сіу Меє Гпув пув Тут Рпе Уаі Сіу Уаії Авп бБехт Аїа 0Щ1Уу
290 295 300 туз УМаії Аїа І1е бек Аза пув біш Іїе Гув бі Авр Авп Ії1е с1у А1а 305 310 315 320 сіп Маї їецш с1у Ге Рпе ТПт Гецп бет ТПхї біу біп Авр бек Тгр Авп 325 330 335 біп ТК Авп «2105 10 «2115 339 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 10
Ме Атуд ув Агуд Сув Тут бБет ТПїІ Бек Аза Аїа Уаі Гей Аїа Аїа Уаї 1 5 10 15
ТПЕх Гец Рпе Уаії Ггецп бБегт Уаії Авр Агуд сіу Маі Іїе Аїа Авр бек РіГе бек Аїа Авп Сбіп Сі І1е Агд Тук бег Сіц Уаї ТБІ Рго Тук Нів Уаї1
ТПк бБет Уаї Ткр ТПї Кгуз біу Уа1 ТПхг Рго Рго Аїа Авп Рпе ТПт сіп бо сСі1іу бі Авр Уа1ї Робе Ніз Аїа Рго Тут Уаї Аї1а Авп Ссіп Сс1у Тгр Туг 65 70 75 80
Авр Іїе ТПт Гув ТПт Рпе Авп с1у Гуз Авр Авр їец їец Сув О1Уу Аї1а 85 90 95
А1ї1а ТІ АТїа с1у Авп Меє Гц Нів Тгр Тер Рбе Азр біп Авп о Гув Авр 100 105 110
Сіп чІ1е пуз Агд Тут Гц Сі бі Ніз Рго біц Ггув Сіп Був І1е Авзп 115 120 125
Рпе Агкд біу бі біп Меє Рпе Авр Уаї Гпув сіп Аїа Ії1е Авр ТПтї Гуз 130 135 140
Авп о Нів біп їец Авр бБет Кув Тецш Рпе біш Тук Рпе Гув сіц Кгув Аї1а 145 150 155 160
Рпе Рго Тут Гец бек ТПт пуз Нів їец сС1у Маії Рібе Рго Авзр Нів Уаї1 165 170 175
І1е Авр Меє Рбе І1їе Азп сіу Тут Агд Пец бек Гей ТБгІ АвБп Ніз С1У 180 185 190
Рко ТПї Рго Уаі пув біц б1іу бек Гув Авр Рго Агд сіу сіу І1е РПе 195 200 205
Авр Аїа Уаії Рпе ТПтІ Акуд с1у Авр Сіп бек гув Гец Гей ТПг бБег Агд 210 215 220
Ніз Авр Рбе пув С1іц Гпув Авп о Тец Ггув біц І1їе бБег Авр їєц І1е Гуз 225 230 235 240 пуз бі Гец ТБг сі с1у був Аїа Гец Сіу їєц бетг Нів ТрІ Туг Аїа 245 250 255
Авп о уаії Агтуд Іїе Авп Ніз Уа! І1їе Азп Ге Тгр сС1у Аїа Авр Ріе Авр 260 265 270 зект Авр бі1у Авп Гецп пув Аїа Іїе Тугк Маї ТПІ Авр 5Бетг Авр 5ет Авп 275 280 285
А1їа бБет Іїе сіу Меє Гпув пув Тут Рпе Уаі Сіу Уаії Авп бБехт Аїа 0Щ1Уу 290 295 300 туз УМаії Аїа І1е бек Аза пув біш Іїе Гув бі Авр Авп Ії1е с1у А1а 305 310 315 320 сіп Маї їецш с1у Ге Рпе ТПт Гецп бет ТПхї біу біп Авр бек Тгр Авп
325 330 335 біп ТК Авп «2105 11 «2115 339 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 11
Ме Атуд ув Агуд Сув Тут бБет ТПт бБехт Аза Аза Уаі! їец Аїа Аїа Уаї 1 5 10 15
ТПЕх Гец Рпе Уаї Ггец бБет Уаі Авр Агд сіу Уаі Іїе Аїа Авр бек РІеє бек Аїа Авп Сбіп Сі І1е Агд Тут бБегт біц Уаї ТБІ Рго Тут Ніз Уаї
ТПкх бБет Уаї Ткр ТПї Кгуз біу Уа1 ТПг Рго Рго Аїа Авп Рпе ТПт сіп бо сСі1іу бі Авр Уаї Робе Ніз Аїа Рго Тут Уаї Аї1а Авп сСіп С1у Тгр Туг 65 70 75 80
Авр Іїе ТПт Гув ТПт Рпе Авп с1у Гуз Авр Авр їец Гей Сув О1Уу Аї1а 85 90 95
А1ї1а ТІ АТїа с1у Авп Меє Гц Нів Тгр Тер Рбе Азр біп Авп Гув Авр 100 105 110
Сіп чІ1е пуз Агд Тут Гц Сі бі Ніз Рго біц Ггув Сіп Був І1е Авзп 115 120 125
Рпе Авп біу бі біп Меє Рпе Авр Уаї Гпув сіп Аїа Ії1е Авр ТПтї Гуз 130 135 140
Авп о Нів біп їец Авр бБет Кув Тецш Рпе біш Тук Рпе Гув сіц Кгув Аї1а 145 150 155 160
Рпе Рго Тут Гец бек ТПт пуз Нів їец сС1у Маії Рібе Рго Авзр Нів Уаї1 165 170 175
І1е Авр Меє Рбе І1їе Гец сСіу Тут Агд Пец бек Гей ТБгІ Авп Ніз С1У 180 185 190
Рко ТПї Рго Уаі пув біц б1іу бек Гув Авр Рго Агд сіу сіу І1е РПе 195 200 205
Авр Аїа Уаії Рпе ТПтІ Акуд с1у Авр Сіп бек гув Гец Гей ТПг бБег Агд 210 215 220
Ніз Авр Рбе пув С1іц Гпув Авп о Тец Ггув біц І1їе бБег Авр їєц І1е Гуз 225 230 235 240 пуз бі Гец ТБг сі с1у був Аїа Гец Сіу їєц бетг Нів ТрІ Туг Аїа 245 250 255
Авп о уаії Агтуд Іїе Авп Ніз Уа! І1їе Азп Ге Тгр сС1у Аїа Авр Ріе Авр 260 265 270 зект Авр бі1у Авп Гецп пув Аїа Іїе Тугк Маї ТПІ Авр 5Бетг Авр 5ет Авп 275 280 285
А1їа бБет Іїе сіу Меє Гпув пув Тут Рпе Уаі Сіу Уаії Авп бБехт Аїа 0Щ1Уу 290 295 300 туз УМаії Аїа І1е бек Аза пув біш Іїе Гув бі Авр Авп Ії1е с1у А1а 305 310 315 320 сіп Маї їецш с1у Ге Рпе ТПт Гецп бет ТПхї біу біп Авр бек Тгр Авп 325 330 335 біп ТК Авп «2105 12
«2115 339 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 12
Ме Атуд ув Агуд Сув Тут бБет ТПїІ Бек Аза Аїа Уаі Гей Аїа Аїа Уаї 1 5 10 15
ТПЕх Гец Рпе Уаії Гей бек Уа1і Авр Агуд сіу Маі Іїе Аїа Авр бек РіГе бек Аїа Авп Сбіп Сі І1е Агд Тук бег Сіц Уаї ТБІ Рго Тук Нів Уаї1
ТПк бБет Уаї Ткр ТПї Кгуз біу Уаії ТПхг Рго Рго Аїа Авп Рпе ТПк сіп бо сСі1іу бі Авр Уа1ї Робе Ніз Аїа Рго Тут Уаї Аї1а Авп Ссіп Сс1у Тгр Туг 65 70 75 80
Авр Іїе ТПт Гув ТПт Рпе Авр с1у пув Авр Авр ей їец Сув О1Уу Аї1а 85 90 95
А1ї1а ТІ АТїа с1у Авп Меє Гц Нів Тгр Тер Рбе Азр біп Авп о Гув Авр 100 105 110
Сіп чІ1е пуз Агд Тут Гц Сі бі Ніз Рго біц Гуз Сіп Гуз І1е Азп 115 120 125
Рпе Агкд біу бі біп Меє Рпе Авр Уаї Гпув сіп Аїа Ії1е Авр ТПтї Гуз 130 135 140
Авп о Нів біп їец Авр бБет Кув Тецш Рпе біш Тук Рпе Гув сіц Кгув Аї1а 145 150 155 160
Рпе Рго Тут Гец бек ТПт пуз Нів їец сС1у Маії Рібе Рго Авзр Нів Уаї1 165 170 175
І1е Авр Меє Рбе І1їе Гец сСіу Тут Агд Пец бек Гей ТБгІ Авп Ніз С1У 180 185 190
Рко ТПї Рго Уаі пув біц б1іу бек Гув Авр Рго Агд сіу сіу І1е РПе 195 200 205
Авр Аїа Уаії Рпе ТПтІ Акуд с1у Авр Сіп бек гув Гец Гей ТПг бБег Агд 210 215 220
Ніз Авр Рбе пув С1іц Гпув Авп о Тец Ггув біц І1їе бБег Авр їєц І1е Гуз 225 230 235 240 пуз бі Гец ТБг сі с1у був Аїа Гец Сіу їєц бетг Нів ТрІ Туг Аїа 245 250 255
Авп о уаії Агтуд Іїе Авп Ніз Уа! І1їе Азп Ге Тгр сС1у Аїа Авр Ріе Авр 260 265 270 зек Авп біу Авп Гецп пув Аїа Іїе Тугк Маї ТПІ Авр 5Бетг Авр 5ет Авп 275 280 285
А1їа бБет Іїе сіу Меє Гпув пув Тут Рпе Уаі Сіу Уаії Авп бБехт Аїа 0Щ1Уу 290 295 300 туз УМаії Аїа І1е бек Аза пув біш Іїе Гув бі Авр Авп Ії1е с1у А1а 305 310 315 320 сіп Маї їецш с1у Ге Рпе ТПт Гецп бет ТПхї біу біп Авр бек Тгр Авп 325 330 335 біп ТК Авп «2105 13 «2115 339 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид
«4005 13
Ме Атуд ув Агуд Сув Тут бБет ТПїІ бБехт Аза Аїа Уаі їец Аїа Аїа Уаї 1 5 10 15
ТПЕх Гец Рпе Уаї Ггец бБет Уаі Авр Агд сіу Уаі Іїе Аїа Авр бек РІеє бек Аїа Авп Сбіп Сі І1е Агуд Тук бБет біц Уаї ТБІ Рго Тут Ніз Уаї
ТПкх бБет Уаї Ткр ТПї Кгуз біу Уа1 ТПг Рго Рго Аїа Авп Рпе ТПт сіп бо сСі1іу бі Авр Уа1! Робе Ніз Аїа Рго Тут Уаї Аї1а Авп сСіп С1у Тгр Туг 65 70 75 80
Авр Іїе ТПт Гув ТПт Рпе Авр с1у пув Авр Авр їец Гей Сув О1Уу Аї1а 85 90 95
А1їа ТІ АТїа с1у Авп Меє Гц Нів Тгр Тер Рбе Азр біп Авп Гув Авр 100 105 110
Сіп чІ1е пуз Агд Тут Гц Сі бі Ніз Рго біц Ггув Сіп Був І1е Авзп 115 120 125
Рпе Агкд біу бі біп Меє Рпе Авр Уаї Гпув сбіц Аїа І1їе Авр ТПЕ Гуз 130 135 140
Авп о Нів біп їец Авр бБет Кув Тецш Рпе біш Тук Рпе Гув сіц Кгув Аї1а 145 150 155 160
Рпе Рго Тут Гец бек ТПт пуз Нів їец сС1і1у Маії Робе Рго Авзр Нів Уаї1 165 170 175
І1е Авр Меє Рбе І1їе Азп сіу Тут Агд Пец бек Гей ТБгІ АвБп Ніз С1У 180 185 190
Рко ТПї Рго Уаі пув біц б1іу бек Гув Авр Рго Агд сіу сіу І1е РПе 195 200 205
Авр Аїа Уаії Рпе ТПтІ Акуд с1у Авр Сіп бек гув Гец Гей ТПг бБег Агд 210 215 220
Ніз Авр Рбе пув С1іц Гпув Авп о Тец Ггув біц І1їе бБег Авр їєц І1е Гуз 225 230 235 240 пуз бі Гец ТБг сі с1у був Аїа Гец Сіу їєц бетг Нів ТрІ Туг Аїа 245 250 255
Авп о уаії Агтуд Іїе Авп Ніз Уа! І1їе Азп Ге Тгр сС1у Аїа Авр Ріе Авр 260 265 270 зект Авр бі1у Авп Гецп пув Аїа Іїе Тугк Маї ТПІ Авр 5Бетг Авр 5ет Авп 275 280 285
А1їа бБет Іїе сіу Меє Гпув пув Тут Рпе Уаі Сіу Уаії Авп бБехт Аїа 0Щ1Уу 290 295 300 туз УМаії Аїа І1е бек Аза пув біш Іїе Гув бі Авр Авп Ії1е с1у А1а 305 310 315 320 сіп Маї їецш с1у Ге Рпе ТПт Гецп бет ТПхї біу біп Авр бек Тгр Авп 325 330 335 біп ТК Авп «2105 14 «2115 339 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 14
Ме Атуд ув Агуд Сув Тут бБет ТПїІ Бек Аза Аїа Уаі Гей Аїа Аїа Уаї 1 5 10 15
ТПЕх Гец Рпе Уаії Гей бек Уа1і Авр Агуд сіу Уаі І1е Аїа Авр бек РіГе бек Аїа Авп Сбіп Сі І1е Агд Тук бег Сіц Уаї ТБІ Рго Тук Нів Уаї1
ТПк бБет Уаї Ткр ТПї Кгуз біу Уа1 ТПхг Рго Рго Аїа Авп Рпе ТПк сіп бо сСі1іу бі Авр Уа1ї Робе Ніз Аїа Рго Тут Уаї Аї1а Авп Ссіп Сс1у Тгр Туг 65 70 75 80
Авр Іїе ТПтІ Гув ТПтІ Рпе Авр с1іу Гуз Авр Авр ей їец Сув О1Уу А1а 85 90 95
А1ї1а ТІ АТїа с1у Авп Меє Гц Нів Тгр Тер Рбе Азр біп Авп о Гув Авр 100 105 110
Сіп чІ1е пуз Агд Тут Гц Сіц б1іц Ніз Рго біц Гуз Сіп Гуз І1е Авп 115 120 125
Рпе Авп біу бі біп Меє Рпе Авр Уаї Гпув сіп Аїа Ії1е Авр ТПтї Гуз 130 135 140
Авп о Нів Сіп їец Авр бБет пув Тецп Рпе біш Тук Рпе Гуз с1ц Кгув А1а 145 150 155 160
Рпе Рго Тут Гец бек ТПт пуз Нів їец сС1у Маії Рібе Рго Авзр Нів Уаї1 165 170 175
І1е Авр Меє Рбе І1їе Гец сСіу Тут Агд Пец бек Гей ТПІ Авп Ніз С1У 180 185 190
Рко ТПї Рго Уаі пув біц б1іу бек Гув Авр Рго Агд сіу сіу І1е РПе 195 200 205
Авр Аїа Уаії Рпе ТПтІ Акуд с1у Авр Сіп бек гув Гец Гей ТПг бБег Агд 210 215 220
Ніз Авр Рбе пув С1іц Гпув Авп о Тец Ггув біц І1їе бБег Авр їєц І1е Гуз 225 230 235 240 пуз бі Гец ТБг сі с1у був Аїа Гец Сіу їєц бетг Нів ТрІ Туг Аїа 245 250 255
Авп о уаії Агтуд Іїе Авп Ніз Уа! І1їе Азп Ге Тгр сС1у Аїа Авр Ріе Авр 260 265 270 зект Авр бі1у Авп Гецп пув Аїа Іїе Тугк Маї ТПІ Авр 5Бетг Авр 5ет Авп 275 280 285
А1їа бБет Іїе сіу Меє Гпув пув Тут Рпе Уаі Сіу Уаії Авп бБехт Аїа 0Щ1Уу 290 295 300 туз УМаії Аїа І1е бек Аза пув біш Іїе Гув бі Авр Авп Ії1е с1у А1а 305 310 315 320 сіп Маї їецш с1у Ге Рпе ТПт Гецп бет ТПхї біу біп Авр бек Тгр Авп 325 330 335 біп ТК Авп «2105 15 «2115 339 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 15
Ме Атуд ув Агуд Сув Тут бБет ТПїІ бБехт Аза Аза Уаі! Гей Аїа Аїа Уаї 1 5 10 15
ТПЕх Гец Рпе Уаї Ггец бБет Уаі Авр Агд сіу Уаі Іїе Аїа Авр бек РІеє бек Аїа Авп Сбіп Сі І1е Агуд Тук бБегт біц Уаї ТБІ Рго Тут Ніз Уаї
ТПкх бБет Уаї Ткр ТПї Кгуз біу Уа1 ТПг Рго Рго Аїа Авп Рпе ТПт сіп бо сСі1іу бі Авр Уа1! Робе Ніз Аїа Рго Тут Уаї Аї1а Авп сСіп С1у Тгр Туг 65 70 75 80
Авр Іїе ТПт Гув ТПт Рпе Авп с1у Гуз Авр Авр їец Гей Сув О1Уу Аї1а 85 90 95
А1їа ТІ АТїа с1у Авп Меє їеєцш Нів Тгр Тер Рбе Азр біп Авп Гув Авр 100 105 110
Сіп чІ1е пуз Агд Тут Гц Сі бі Ніз Рго біц Ггув Сіп Був І1е Авзп 115 120 125
Рпе Агкд сбіу бі біп Меєсє Рпе Авр Уаї Гпув сбіц Аїа І1їе Авр ТПкК Гуз 130 135 140
Авп о Нів біп їец Авр бБет Кув Тецш Рпе біш Тук Рпе Гув сіц Кгув Аї1а 145 150 155 160
Рпе Рго Тут Гец бек ТПт Кпуз Нів їец с1у Уаії Робе Рго Азр Нів Уаї 165 170 175
І1е Авр Меє Рбе І1їе Гец сСіу Тут Агд Пец бек Гей ТБгІ Авп Ніз С1У 180 185 190
Рко ТПї Рго Уаі пув біц б1іу бек Гув Авр Рго Агд сіу сіу І1е РПе 195 200 205
Авр Аїа Уаії Рпе ТПтІ Акуд с1у Авр Сіп бек гув Гец Гей ТПг бБег Агд 210 215 220
Ніз Авр Рбе пув С1іц Гпув Авп о Тец Ггув біц І1їе бБег Авр їєц І1е Гуз 225 230 235 240 пуз бі Гец ТБг сі с1у був Аїа Гец Сіу їєц бетг Нів ТрІ Туг Аїа 245 250 255
Авп о уаії Агтуд Іїе Авп Ніз Уа! І1їе Азп Ге Тгр сС1у Аїа Авр Ріе Авр 260 265 270 зект Авр бі1у Авп Гецп пув Аїа Іїе Тугк Маї ТПІ Авр 5Бетг Авр 5ет Авп 275 280 285
А1їа бБет Іїе сіу Меє Гпув пув Тут Рпе Уаі Сіу Уаії Авп бБехт Аїа 0Щ1Уу 290 295 300 туз УМаії Аїа І1е бек Аза пув біш Іїе Гув бі Авр Авп Ії1е с1у А1а 305 310 315 320 сіп Маї їецш с1у Ге Рпе ТПт Гецп бет ТПхї біу біп Авр бек Тгр Авп 325 330 335 біп ТК Авп «2105 16 «2115 339 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 16
Ме Атуд ув Агуд Сув Тут бБет ТПїІ Бек Аза Аїа Уаі Гей Аїа Аїа Уаї 1 5 10 15
ТПЕх Гец Рпе Уаії Гей бек Уа1і Авр Агуд сіу Маі Іїе Аїа Авр бек РіГе бек Аїа Авп Сбіп Сі І1е Агд Тук бег Сіц Уаї ТБІ Рго Тук Нів Уаї1
ТПк бБет Уаї Ткр ТПї Кгуз біу Уа1 ТПхг Рго Рго Аїа Авп Рпе ТПк сіп бо сСі1іу бі Авр Уа1ї Робе Ніз Аїа Рго Тут Уаї Аї1а Авп Ссіп Сс1у Тгр Туг 65 70 75 80
Авр Іїе ТПт Гув ТПт Рпе Авр с1у пув Авр Авр Гец їец Сув О1Уу А1а 85 90 95
А1ї1а ТІ АТїа с1у Авп Меє Гц Нів Тгр Тер Рбе Азр біп Авп о Гув Авр 100 105 110
Сіп чІ1е пуз Агд Тут Гц Сі бі Ніз Рго біц Гуз Сіп Гуз І1е Авп 115 120 125
Рпе Агкд біу бі біп Меє Рпе Авр Уаї Гпув сіп Аїа Ії1е Авр ТПтї Гуз 130 135 140
Авп о Нів Сіп їец Авр бБет Гуз Тец Рпе біцш Тухк Рпе Гуз с1ц Кгув Аї1а 145 150 155 160
Рпе Рго Тут Гец бек ТПт пуз Нів їец сС1у Маії Рібе Рго Авзр Нів Уаї1 165 170 175
І1е Авр Меє Рбе І1їе Гец СбСіу Тут Агд Гей бек Гей ТПІ АвБп Ніз С1Уу 180 185 190
Рко ТПї Рго Уаі пув біц б1іу бек Гув Авр Рго Агд сіу сіу І1е РПе 195 200 205
Авр Аїа Уаії Рпе ТПтІ Акуд с1у Авр Сіп бек гув Ггец їец ТПт 5бег Агд 210 215 220
Ніз Авр Рбе пув С1іц Гпув Авп о Тец Ггув біц І1їе бБег Авр їєц І1е Гуз 225 230 235 240 пуз бі Гец ТБг сі с1у був Аїа Гец Сіу їєц бетг Нів ТрІ Туг Аїа 245 250 255
Авп о уаії Агтуд Іїе Авп Ніз Уа! І1їе Азп Ге Тгр сС1у Аїа Авр Ріе Авр 260 265 270 зект Авр бі1у Авп Гецп пув Аїа Іїе Тугк Маї ТПІ Авр 5Бетг Авр 5ет Авп 275 280 285
А1їа бБет Іїе сіу Меє Гпув пув Тут Рпе Уаі Сіу Уаії Авп бБехт Аїа 0Щ1Уу 290 295 300 туз УМаії Аїа І1е бек Аза пув біш Іїе Гув бі Авр Авп Ії1е с1у А1а 305 310 315 320 сіп Маї їецш с1у Ге Рпе ТПт Гецп бет ТПхї біу біп Авр бек Тгр Авп 325 330 335 біп ТпПг Авп «2105 17 «2115 16 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (4)..(84) «223» Може бути окиснений «2205 «2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (6)..(6) «223» Може бути карбоксиметильований «2205 «2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (9)..(9) «223» Може бути карбоксиметильований «4005 17
Авр Гув ТПт Нів ТБт Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго Сб1іцш Ієц Ієц С1У 1 5 10 15 «2105 18 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид
«2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (7)..(7) «223» Може бути карбоксиметильований «2205 «2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (14)..(14) «223» Може бути окиснений «4005 18
Сі І1е с1у Гец Пец ТПтІ Сув б1іц Аїа ТПк Уаї Авп сС1у Нів Ієц Туг 1 5 10 15
Туз «2105 19 «2115 23 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (14)..(14) «223» Може бути окиснений «4005 19
Сіп ТБт Авп о ТБг о І1е І1е Азр Уаї Уаї Ггец бетг Рго бек Нів с1у І1е 1 5 10 15 сбіЧ Гей бек Уаї о1у сіц Гув «2105 20 «2115 21 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид
«2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (18)..(18) «223» Може бути окиснений «4005 20
ТПкх січ Гец Авзп Уаії Сіу Іїе Авр Рпе Авп Ттр бі Тут Рко бБет 5бег 1 5 10 15 пуз Нів Сіп Нів Гуз «2105 21 «2115 7 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (6)..(6) «223» Може бути окиснений «4005 21
ТЕ Авп Тугк Гей ТрІ Нів Агд 1 5 «2105 22 «2115 24 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (19)..(19) «223» Може бути окиснений «4005 22 зект Авр ТПх бі1у Агд Рго Рпе Уа1і Сі Мес Тут бБехт сіц Іїе Ркго с1ц 1 5 10 15
І1е І1е Нів Месє ТрІ сі с1у Агд «2105 23 «2115 6 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «2225 (2)..(2) «223» Може бути окиснений «4005 23 уаї Нів с1Ч Гпув Авр Гуз 1 5 «2105 24 «2115 24 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «222» (10)..(10) «223» Може бути окиснений «4005 24 зект Авр ТПх бі1у Агд Рго Рпе Уа1і Сі Мес Тут бБехт сіц Іїе Ркго с1ц 1 5 10 15
І1е І1е Нів Месє ТрІ сі с1у Агд 20 «2105 25 «2115 24 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «222» (20)..(20) «223» Може бути окиснений «4005 25 зект Авр ТПх бі1у Агд Рго Рпе Уа1і Сі Мес Тут бБехт сіц Іїе Ркго с1ц 1 5 10 15
І1е І1е Нів Месє ТрІ сі с1у Агд «2105 26 «2115 8 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «2225 (7)..(7) «223» Може бути окиснений «4005 26
ТПк сіп бет сі1у Бек бі Меє Гуз 1 5 «2105 27 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «2225 (8)..(8) «223» Може бути карбоксиметильований
«4005 27 зехт Авр біп бі1у Ггецп Тухк ТПг Сув Аза Аїа бБет бБет сіу Гец Меє ТПг 1 5 10 15
Туз «2105 28 «2115 6 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215 ІНШ ОЗНАКИ «2225 (3)..(3) «223» Може бути окиснений «4005 28
Іїе Ії1е Тгр Авр 5ет Агд 1 5 «2105 29 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (11)..(11) «223» Може бути окиснений «4005 29
ТПкх січ Гец Авзп Уаії Сіу Іїе Авр Рпе Авп Ттр бі Тут Рко бБет 5бег 1 5 10 15
Туз
«2105 30 «2115 10 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «2225 (9)..(9) «223» Може бути окиснений «4005 30 сіу Рпе Іїе Іїе бБег Авп Аїа ТПтІ Тут Гуз 1 5 10 «2105 31 «2115 12 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «2225 (2)..(2) «223» Може бути окиснений «4005 31
Туз Рпе Рко Гец Авр ТПїх Ггец Іїе Рго Авр О1У Гув 1 5 10 «2105 32 «2115 12 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ
«222» (1)..(1) «223» Може бути окиснений «4005 32
Рпе Гецп бек ТПх Гец ТПт Іїе Авр с1і1у Уаі ТПхК Акгд 1 5 10 «2105 33 «2115 227 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «2205 «221» МО ВЕ5 «222» (8)..(8) «223» Ггец або Рго «2205 «221» МО ВЕ5 «222» (173)..(173) «223» А1їа або ТПг «4005 33
Авр Гув ТПт Нів ТБт Сув Рго Хаа Сув Рго Аїа Рго С1іцш Ієц Ієц С1Уу 1 5 10 15 сіу Рго бБет Маії РПпе Гец Рпе Рко Ркго Гуз Рго гув Авр ТПг Івц Мес
ІТ1е бБег Агд ТПт Рго Сі Уа1ї ТрІ Сув Уаї Уа1 Уаї Авр Уа1ї бек Нів січ Авр Рго біц Маії Ппув Рпе Авп Тктр Тут Уа1і1 Авр сСіу Уа1 сі Уаї бо
Ніз Авп Аїа пув ТПтї Гпув Рго Агд Сі бі б1іп Туг Авп бБет ТПк Туг 65 70 75 80
Атд Уаї Уаї бек Уаі1ї їец ТБг Уаї їец Нів сіп Азр Тер Іеєц Азп 01УуУ 85 90 95
Туз січ Тут пув Сув пув Уаії Бек Авп ув Аїа їец Рго Аїа Рго Іїє 100 105 110 біц пув ТПІ Іїе Бех Гув Аїа Гпув сіу сіп Рго Акд бі Рго біп Уаї1ї 115 120 125
Тук ТПт Ггец Рко Рго Бек Агуд Авр бій Тецй ТПтІ пув Авп сіп Уаї 5ег 130 135 140 теп ТПт Сув Гец Уаії пуз б1у Рпе Тук Рго бБет Авр Іїе Аїа Уаї сіц 145 150 155 160
ТЕр сіц бБет Авп б1у біп Рго бі Авп Авп Тут пув Хаа ТПт Рго Ркго 165 170 175 уаї гейш Авр бБет Авр сіу бБет РПе РПбе Гей Тут бет Ппув Гей ТПг Уаї 180 185 190
Авр Гув бБет Агуд Тгтр сіп сіп с1у Авзп Уа1і Рібе бет Сув бек Уа! Меє 195 200 205
Ніз с1п АТїа Пец Нів Авп Нів Тут ТПг бСіп Гпув бБет Пец бБет Гец 5бег 210 215 220
Рхго с1У Гувг 225 «2105 34 «2115 103 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 34 зект Авр ТПх бі1у Агд Рго Рпе Уа1і Сі Мес Тут бБехт сіц Іїе Ркго с1ц 1 5 10 15
І1е І1ї1е Нів Месє ТІ Сі б1у Агд Сі їец Уаї І1е Рго Суз Агд Уаї
ТПк о бБет Рко Авп І1е ТПх Уаі1! ТПкх Гецп Гув Пув Рпе Рго Гец Авр ТПг 35 40 45 теп І1їе Ркго Авр с1у пув Агуд Іїе Іїе Тгр Авр бБет Агд Гув О1Уу РПе 50 55 бо
І1їе Іїе бБегт Авп Аїа ТПтІ Тут Гпузв бі Іїе сі1у Гец їец ТПг Сув с1цЦ 65 70 75 80
А1їа ТПт Уаї Авп сіу Нів їец Тут КПув ТБтІ Авп Тут їец ТПртІ Нізв Агд 85 90 95 біп ТПг Авп о ТПтІ Іїе І1е Авр 100 «2105 35 «2115 93 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 35
Рго Рпе Уаї сСіц Меє Туг Бех Сі І1їе Рго Сіцш І1їе І1їе Ніз Меєсє ТПг 1 5 10 15 сбіц б1у Атд бій Гец Маі Іїе Ркго Сув Акд Уаі1і ТПг бБег Рго Авп Іїє
ТПкх Уаї ТПтї Ггецп пузв Гпув Рібе Рго Гей Авр ТПтІ Гец Іїе Рго Авр с1УуУ
Туз Акуд І1е І1е Тгр Авр бек Агуд пув Сб1у Рпе Іїе Іїе 5еїг Авп Аїа бо
ТПкх Тут пув сі1п І1е с1у Ггецп Ггеп ТПкх Сув біц Аїа ТПт Уаії Авп с1У 65 70 75 80
Нівз Гецп Тук Пув ТПтІ Авп Тут їец ТП Нів Агд С1іп ТБбг 85 90
«2105 36 «2115 102 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 36
Ууаї уаї теп бек Рго Бех Нів сі1іу І1ї1е Сі Гец бек Уаї с1у січ Гув 1 5 10 15 теп Уаії Ггец Авп Сув ТПх Аза Агуд ТПх бій ТГец Авп Уаі сі1у І1е Авр
Рпе Авзп Тгр Сіц Тук Рго бБет бет Пув Ніз Сіп Ніз Ппув Ппув Пец Уаї
Авп Атуд Авр оТГец Гув ТПт сіп бет біу бек біц Меє пув пув РПе Іей бо
Зек ТПї Гей ТПх Іїе Авр біу Уаі ТПг Агуд бБет Авр сіп с1Уу Гец Тук 65 70 75 80
ТПкх Сув Аїа А1їа бет бек біу Ггецп Меє ТПх пув Ппув Авп о бет ТПг РІе 85 90 95 уаї Агд Уаї Нів сіц Гуз 100 «2105 37 «2115 97 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 37
Рхто Рпе Уаі Аза Рпе сіу бек сіу Месє бій бБет Гей Уаі сіц Аїа ТПг 1 5 10 15 уаї б1у бі1ц Агд Уаі Акуд І1е Рго Аїа Гуз Тут Гец б1іу Тук Рго РІго
Рго Сі І1їе пуз Тер Тут Ппув Авп б1у І1їе Рго їец Сіц бек Авп Ніз
ТПЕ І1ї1е ув Аїа сС1у Нів Уаї їєц ТПтг І1їе Меє Сі Уаї Бех Сс1п Агд бо
Авр ТПІ со1у Авп Тут ТПт Уаї І1е Гей ТПї Авп о Рго Іїе бек Гув С1ц 65 70 75 80 пуз б1іп бек Нів Уа1 Уа1ї бБетг Іїєц Уаї Уаї Тук Уаії Рго Рго СсС1у Рго 85 90 95 ов1уУ «2105 38 «2115 92 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 38
Рпе Уаі Аїа Рібе сіу бек біу Меє бій бБег Гецп Уаі сіц Аїа ТПт Уаї 1 5 10 15 сіу бій Агуд УМаі Агу І1е Рго Аїа Гуз Тут гей біу Тук Рго Рго Ркго 20 25 30 сСіш І1е пуз Тер Тут Ппувз Авп б1іу І1їе Рго Гец С1іц бек Авп Ніз Тіг 35 40 45
ІТ1е пуз Аїа сСіу Ніз Уаї Пец ТПтг І1ї1е Месє с1іц Уаї бБегт сб1п Агд Авр 50 55 бо
ТП с1у Авп Тут ТПтї Уа1ї Ії1їе Ггецп ТБПк Авп Рго Іїе Гув бек с1ц Гув 65 70 75 80
Сіп бБег Ніз Уа1ї Уаї бБегт теп Уаї Уа1ї Тук Уа1ї Рго 85 90 «2105 39 «2115 9 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 39
Авр Гув ТПт Нів ТБт Сув Рго Рго Сувз 1 5 «2105 40 «2115 12 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 40
Авр Гув ТПт Нів ТБПт Сув Рго Рго Сувз Рго Рго Сув 1 5 10 «2105 41 «2115 15 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 41
Авр Гув ТПт Нів ТБПт Сув Рго Рго Сув Рго Рго Сув Рго Рго Сув 1 5 10 15 «2105 42 «2115 16 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 42
Авр Гув ТПт Нів ТБт Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго Сб1іцш Ієц Ієц С1У 1 5 10 15 «2105 43 «2115 16 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 43
Авр Гув ТПт Нів ТБт Сув Рго Іец Сув Рго Аїа Рго Сб1іцш Ієц Ієц С1У 1 5 10 15 «2105 44 «2115 6 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 44
Авр Гув ТПг Нів ТБг Сувз 1 5 «2105 45 «2115 12 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 45
Авр Гув ТПх Нів Трт Сув Рго Іец Сув Рго Аїа Рго 1 5 10 «2105 46 «2115 221
«2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 46 зект Авр ТПх бі1у Агд Рго Рпе Уа1і Сі Мес Тут бБехт сіц Іїе Ркго с1ц 1 5 10 15
І1е І1ї1е Нів Месє ТрІ сі б1у Агд Сі Гец Уаї І1е Рго Сув Агд Уаї1ї
ТПк о бБет Рко Авп І1е ТПх Уаі1! ТПкх Гецп Гув Пув Рпе Рго Гец Авр ТПг
Тецп І1їе Ркго Авр сСі1у пув Агуд Іїе Іїе Тгр Авр 5Бет Агд Гув с1Уу РіПе бо
І1їе Іїе бБегт Авп Аїа ТПтІ Тут Гпузв бі Іїе сі1у Гец їец ТПг Сув с1цЦ 65 70 75 80
А1їа ТПт Уаї Авп сіу Нів їец Тут КПув ТБг Авп Тут їец ТПрх Нів Агд 85 90 95
Сіп ТБт Авп о ТБг о І1е І1е Азр Уаї Уаї Ггец бетг Рго бек Нів с1у І1е 100 105 110 сіЧ Гей бехт Уаі сіу сі пув Гец Уаі гей Авп Сув ТПтІ Аїа Аг9д ТПг 115 120 125 бі гей Авп Уаії с1у Іїе Авр Рпе Авп Ткр біц Тут Рго бек бек Гуз 130 135 140
Ніз сіп Нів Гуз Гпув їец Уа1і Авп Агд Авр їєц Гуз ТПт Сіп бех 01У 145 150 155 160
Ззек бі Меє гув Кпув РіПе Гпецй бет ТПтІ Гей ТПІ Іїе Авр сіу Уаї ТПг 165 170 175
Атдуд бБегхт Авр сіп сіу Гец Тут ТПїІ Сув Аза Аза бет бБет б1у Гей Мес
180 185 190
ТПк пувз пув Авп бет ТПк Ріобе Уаї Агд Уаї Нів Сі Пув Авр Гув ТЕГ 195 200 205
Ніз ТЕ Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго Ссіц Ієц Іец О1У 210 215 220 «2105 47 «2115 315 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 47 сС1у Агд Рго Рбе Уаї Сіц Меє Туг Бех Сі І1їе Рго Сі І1їе І1е Нів 1 5 10 15
Меє ТПІ біц с1у Акд сід Гец Уаі І1е Рго Сув Акд Уа1 ТПг бек Рго
Авп о І1е ТПт Уаії ТПт Гец пув пув РіПе Рго гей Авр ТПтх Іецй Іїе Ртго
Авр б1у ув Агуд Ії1е І1е Тгр Авр бБегт Агд гув біу Рпе Іїе Іїе 5ег бо
Авп Аза ТПтІ Тут пув сіц І1е сС1у Гей Ггеп ТПт Сув бій Аїа ТПг Уаї 65 70 75 80
Авп о сбіу Нівз їец Тут Кпув ТПг Авп Тут їец ТПтх Нів Агд с1іп ТК Авп 85 90 95
ТПЕ І1їе І1їе Авр Уа1ї Уаї Пец бБег Рго бБет Нів С1іу І1е сі Гєец 5бег 100 105 110 маї б1у біц Гпув Гец Уаії Ггец Авп Сув ТПх Аза Агу ТПхкх бій Гей Авп 115 120 125 уаї сб1у І1їе Авр Робе Авп Тгр біц Тут Рго бБет бек КГув Нів Ссіп Нівз 130 135 140
Туз Гпув гец Уаі Авп Агд Авр о Гецп пув ТПт біп бет с1іу Бех сіц Меє 145 150 155 160
Туз Кпув РпПе Гец бБет ТПхїх Ггецп ТПх Іїе Авр сб1і1у Уаі ТПтг Акгуд 5етг Авр 165 170 175 сбіп сб1у Гей Тугк ТПт Сув Аїа Аїа бет бБет сіу Гей Меє ТК ув Туз 180 185 190
Авп обБет ТПтї РіПе Уа1ї Агтд Уа1! Нів сі Авп Тед бБегт Уа1і Аїа Рое с1Уу 195 200 205
Ззек біу Меє бі бек Ге Уа1! бій Аза ТПт Уа1і с1у сіц Акд Уаї Акгд 210 215 220
І1е Рго Аїа пув Тут Ггец сіу Тук Рго Рго Рго біц Іїе Гув Тгр Туг 225 230 235 240 уз Авп с1у І1е Рго Гец бі бБег Авп Нів ТПг І1їе ув Аза СсС1у Нів 245 250 255
Ууаї Гей ТПІ Іїе Меє сіц Уаї бек бій Агд Авр ТПт б1у Авп Тут ТПг 260 265 270 уаї І1їе їец ТБг Авп Рго Іїе бБег пуз Сі Пуз Сіп бек Нів Уа1! Уаї 275 280 285 бек гец Уаї Уаї Тук Маї Рго Рго біу Рго С1у Авр Гуз ТПк Нів ТПг 290 295 300
Сув Рко Гец Сув Рго Аїа Рго бі Гей Гей 1У 305 310 315 «2105 48 «2115 214 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 48 зект Авр ТПх бі1у Агд Рго Рпе Уа1і Сі Мес Тут бБехт сіц Іїе Ркго с1ц 1 5 10 15
І1е І1ї1е Нів Месє ТІ Сі б1у Агд Сі їец Уа1ї І1е Рго Суз Агд Уаї
ТПк о бБет Рко Авп І1е ТПх Уаі1! ТПкх Гецп Гув Пув Рпе Рго Гец Авр ТПг теп І1їе Ркго Авр с1у пув Агуд Іїе Іїе Тгр Авр бБет Агд Гув О1Уу РПе бо
І1їе Іїе бБегт Авп Аїа ТПтІ Тут Гпузв бі Іїе сі1у Гец їец ТПг Сув с1цЦ 65 70 75 80
А1їа ТПт Уаї Авп сіу Нів їец Тут КПув ТБтІ Авп Тут їец ТПртІ Нізв Агд 85 90 95
Сіп ТБтг Авп о ТБг о І1е І1е Авзр Уаї Уаї Гец бетг Рго бек Нів с1у І1еє 100 105 110 сбіЧ Гей бек Уаії с1у сіц Гпув Гец Уаії Ггец Авп Сув ТПї Аза Агд ТіК 115 120 125 бі гей Авп Уаії с1у Іїе Авр Рпе Авп Ткр сб1іц Тутк Рго бБет бБет Гув 130 135 140
Ніз с1іп Нів пув Гпув їец Уа1і Авзп Агд Авр їеєц Гуз ТПт Сіп бехг О1У 145 150 155 160
Ззек бі Меє гув Кпув РіПе Пец бет ТПт Гей ТПІ Іїе Авр сіу Уа1ї ТЕПкК 165 170 175
Атдуд бБегхт Авр сіп сіу Гец Тут ТПїІ Сув Аїа Аза бет бек б1у Гей Мес 180 185 190
ТПЕ пузв пув Авп бет ТПг Робе Уаї Агд Уа1ї Нів Сі Гуз Авр Гув ТЕПг 195 200 205
Ніз ТрЕ Сув Рго Рго Сув 210 «2105 49 «2115 217 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 49 зект Авр ТПх бі1у Агд Рго Рпе Уа1і Сі Мес Тут бБехт сіц Іїе Ркго с1ц 1 5 10 15
І1е І1ї1е Нів Месє ТІ Сі б1у Агд Сі їец Уа1ї І1е Рго Суз Агд Уаї
ТПк о бБет Рко Авп І1е ТПх Уаі1! ТПкх Гецп Гув Пув Рпе Рго Гец Авр ТПг теп І1їе Ркго Авр с1у пув Агуд Іїе Іїе Тгр Авр бБет Агд Гув О1Уу РПе бо
І1їе Іїе бБегт Авп Аїа ТПтІ Тут Гпузв бі Іїе сі1у Гец їец ТПг Сув с1цЦ 65 70 75 80
А1їа ТПт Уаї Авп сіу Нів їец Тут КПув ТБтІ Авп Тут їец ТПртІ Нізв Агд 85 90 95
Сіп ТБт Авп о ТБг о І1е І1е Азр Уаї Уаї Ггец бетг Рго бек Нів с1у І1е 100 105 110 сбіЧ Гей бек Уаії с1у сіц Гпув Гец Уаії Ггец Авп Сув ТПї Аза Агд ТіК 115 120 125 бі гей Авп Уаії с1у Іїе Авр Рпе Авп Ткр біц Тут Рго бек бек Гуз 130 135 140
Ніз с1іп Нів пув Гпув їец Уа1і Авзп Агд Авр їеєц Гуз ТПт Сіп бехг О1У 145 150 155 160
Ззек бі Меє гув Кпув РіПе Гпецй бет ТПтІ Гей ТПІ Іїе Авр сіу Уаї ТПг 165 170 175
Атдуд бБегхт Авр сіп сіу Гец Тут ТПїІ Сув Аї1а Аза бет бек б1у Гец Меє 180 185 190
ТПк пувз пув Авп бет ТПк Ріобе Уаї Агд Уаї Нів Сі Пув Авр Гув ТЕГ 195 200 205
Ніз ТрПї Сув Рго Рго Сув Рго Рго Сув 210 215 «2105 50 «2115 220 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 50 зект Авр ТПх бі1у Агд Рго Рпе Уа1і Сі Мес Тут бБехт сіц Іїе Ркго с1ц 1 5 10 15
І1е І1ї1е Нів Месє ТІ Сі б1у Агд Сі їец Уа1ї І1е Рго Суз Агд Уаї
ТПк о бБет Рко Авп І1е ТПх Уаі1! ТПкх Гецп Гув Пув Рпе Рго Гец Авр ТПг теп І1їе Ркго Авр с1у пув Агуд Іїе Іїе Тгр Авр бБет Агд Гув О1Уу РПе бо
І1їе Іїе бБегт Авп Аїа ТПтІ Тут Гпузв бі Іїе сі1у Гец їец ТПг Сув с1цЦ 65 70 75 80
А1їа ТПт Уаї Авп сіу Нів їец Тут КПув ТБтІ Авп Тут їец ТПртІ Нізв Агд 85 90 95
Сіп ТБт Авп о ТБг о І1е І1е Азр Уаї Уаї Ггец бетг Рго бек Нів с1у І1е 100 105 110 сбіЧ Гей бек Уаії с1у сіц Гпув Гец Уаії Ггец Авп Сув ТПї Аза Агд ТіК 115 120 125 бі гей Авп Уаії с1у Іїе Авр Рпе Авп Ткр сб1іц Тут Рго бек бБет Гув 130 135 140
Ніз с1іп Нів пув Гпув їец Уа1і Авзп Агд Авр їеєц Гуз ТПт Сіп бехг О1У 145 150 155 160
Ззек бі Меє гув Кпув РіПе Пец бет ТПт Гей ТПІ Іїе Авр сіу Уа1ї ТЕПкК 165 170 175
Атдуд бБегхт Авр сіп сіу Гец Тут ТПїІ Сув Аїа Аза бет бек б1у Гей Мес 180 185 190
ТПЕ пузв пув Авп бет ТПг Робе Уаї Агд Уаї Нів Сі Гуз Авр Гув ТЕПг 195 200 205
Ніз ТрПї Сув Рго Рго Сув Рго Рго Сув Рго Рго Сув 210 215 220 «2105 51 «2115» 440 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 51 зект Авр ТПх бі1у Агд Рго Рпе Уа1і Сі Мес Тут бБехт сіц Іїе Ркго с1ц 1 5 10 15
І1е І1ї1е Нів Месє ТрІ сі б1у Агд Сі Гец Уаї І1е Рго Сув Агд Уаї1ї
ТПк о бБет Рко Авп І1е ТПх Уаі1! ТПкх Гецп Гув Пув Рпе Рго Гец Авр ТПг
Тецп І1їе Ркго Авр сСі1у пув Агуд Іїе Іїе Тгтр Авр бБет Агд Гув с1Уу РіПе бо
І1їе Іїе бБегт Авп Аїа ТПтІ Тут Гпузв бі Іїе сі1у Гец їец ТПг Сув с1цЦ 65 70 75 80
А1їа ТПт Уаї Авп сіу Нів їец Тут КПув ТПг Авп Тут їец ТПрх Нів Агд 85 90 95
Сіп ТБт Авп о ТБг о І1е І1е Азр Уаї Уаї Ггец бетг Рго бек Нів с1у І1е 100 105 110 сіЧ Гей бехт Уаії сіу сіц пув Гецп Уаі гей Авп Сув ТПтІ Аїа Аг9д ТПг 115 120 125 бі гей Авп Уаії с1у Іїе Авр Рпе Авп Ткр біц Тут Рго бек бек Гуз 130 135 140
Ніз сіп Нів Гпув Гпув Гец Уа1і Авп Агд Авр теп Гуз ТПт Сіп бехг 01У 145 150 155 160
Ззек бі Меє гув Кпув РіПе Гпецй бет ТПтІ Гей ТПІ Іїе Авр сіу Уаї ТПг 165 170 175
Атдуд бБегхт Авр сіп сіу Гец Тут ТПїІ Сув Аїа Аза бет бет біу Гей Меє 180 185 190
ТПЕ Кпуз пув Авп о бег ТПг Ропе Уа1і Агкд уа1ї Нів сбі1цш туз сС1у б1у Ф1У 195 200 205 сіу бек б1у с1у сіу сіу бБехт сіу сі1у сСі1у сСі1у Бех біу С1у СШ1у щу 210 215 220 бек сі1у сбіу бі1у бі1у бек біу сб1у сб1у с1у бБет 5Беїт Авр ТПтІ с1у Агд 225 230 235 240
Рго Рпе Уаї сСіц Меє Туг Бех Сі І1їе Рго Сіцш І1їе І1їе Ніз Меєсє ТПг 245 250 255 сбіц б1у Ат9д біц Гец Маі Іїе Ркго Сув Акд Уаі1 ТПг бек Рго Авп Пе 260 265 270
ТПкх Уаї ТПтї Ггецп пузв Гпув Рібе Рго Гей Авр ТПтІ Гец Іїе Рго Авр с1УуУ 275 280 285
Туз Акуд І1е І1е Тгр Авр бек Агуд пув сб1іу Рпе Іїе Іїе 5егт Авп А1а 290 295 300
ТПкх Тут пув сі1п І1е с1у Ггецп Ггеп ТПкх Сув біц Аїа ТПт Уаії Авп с1У 305 310 315 320
Нівз Гецп Тук Пув ТПтІ Авп Тут їец ТПкг Нів Агд Сіп ТБт АвБп ТПк І1е 325 330 335
І1е Авр Уаї Уаї Гїєц бек Рго бБет Нів біу Іїе Сі Гец бБехт Уаї с01Уу 340 345 350 січ пув Гец Маі Гец Авп Сув ТПтІ Аза Агд ТБПт бі ге Авп Уа1і -Щ1У 355 360 365
І1е Авр Рібе Авп Тгр Сі Тут Рго бек бет пув Нів біп Ніз Кпув Гув 370 375 380 теп Маі Авп Акуд Авр оГецп Гуз ТП біп бек біу бет бі Меєсє Гув Гув 385 390 395 400
Рпе Гецп бек ТПх Гецп ТПг Іїе Авр с1і1у УМаі ТПхг Акд бБет Авр сбіп ШУ 405 410 415
Те Тут ТПхї Сув Аї1а Аза бек бек біу Гей Меє ТПІ Гув Гув Авп бег 420 425 430
ТПЕ Рпе Уаї Агд Уа1ї Нів сій Гуз 435 440 «2105 52 «2115 425 «2125 БІЛОК
«213» Штучна послідовність «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 52 зект Авр ТПх бі1у Агд Рго Рпе Уа1і Сі Мес Тут бБехт сіц Іїе Ркго с1ц 1 5 10 15
І1е І1ї1е Нів Месє ТІ Сі б1у Агд Сі їец Уа1ї І1е Рго Суз Агд Уаї
ТПк о бБет Рко Авп І1е ТПх Уаі1! ТПкх Гецп Гув Пув Рпе Рго Гец Авр ТПг теп І1їе Ркго Авр с1у пув Агуд Іїе Іїе Тгр Авр бБет Агд Гув О1Уу РПе бо
І1їе Іїе бБегт Авп Аїа ТПтІ Тут Гпузв бі Іїе сі1у Гец їец ТПг Сув с1цЦ 65 70 75 80
А1їа ТПт Уаї Авп сіу Нів їец Тут КПув ТБтІ Авп Тут їец ТПртІ Нізв Агд 85 90 95
Сіп ТБт Авп о ТБг о І1е І1е Азр Уаї Уаї Ггец бетг Рго бек Нів с1у І1е 100 105 110 сбіЧ Гей бек Уаії с1у сіц Гпув Гец Уаії Ггец Авп Сув ТПї Аза Агд ТіК 115 120 125 бі гей Авп Уаії с1у Іїе Авр Рпе Авп Ткр біц Тут Рго бек бек Гуз 130 135 140
Ніз с1іп Нів пув Гпув їец Уа1і Авзп Агд Авр їеєц Гуз ТПт Сіп бехг О1У 145 150 155 160
Ззек бі Меє гув Кпув РіПе Гпецй бет ТПтІ Гей ТПІ Іїе Авр сіу Уаї ТПг 165 170 175
Атдуд бБегхт Авр сіп сіу Гец Тут ТПїІ Сув Аїа Аза бет бек б1у Гей Мес 180 185 190
ТПЕ Кпуз пув Авп о бег ТПг Ропе Уа1і Агкд уа1ї Нів сбі1цш туз сС1у б1у Ф1У 195 200 205 сіу бек б1у с1у сіу сіу бБет сіу сі1у сі1у біу бБет бек Авр ТПг 01У 210 215 220
Атд Рго Рпе Уа! сі Меє Туг Бек Сі Іїе Рго Сі І1їе І1їе Ніз Мебс 225 230 235 240
ТПк сі с1у Акд бі Ге Уа1ї Іїе Рго Сув Атд Уаі ТПтг 5бБетг Рго Авп 245 250 255
І1е ТПкг Уаї ТПт еп пув Гпув РпПе Рго Ггец Авр ТПтІ Гей Іїе Рго Авр 260 265 270 сіу гув Агуд Іїе Іїе Тгр Авр бБет Агкуд Гуз біу Рпе Іїе Іїе 5ет Авп 275 280 285
А1їа ТПІ Тут Ггув сіц І1ї1е с1у Гецп Гей ТПх Сув біц Аїа ТПг Уаї Авп 290 295 300
СсСіу Нів Гец Тук Пув ТПтІ Авзп Тут їец ТП Ніз Агд Сіп ТБІ АвБп ТЕГ 305 310 315 320
І1е І1їе Азр Уаї Уаї гец бег Рго бек Нів сС1у І1е бій Гєц бек Уаї 325 330 335 сіу біш Гув Гец Маі Гецп Авп Сув ТПтІ Аза Акуд ТПгх бій Гей Авп Уаї 340 345 350 сСіу І1е Авр Рбе Авп Тгр Сі Туг Рго бек бБет Кпув Нів біп Ніз Гув 355 360 365
Туз Ггец Уаі Авп Агуд Авр о Гей Гуз ТБбт біп бет біу бет біц Меє Гуз 370 375 380
Туз Рпе Гец бет ТПтї Гей ТПх Іїе Авр сіу Маі ТПІ Агуд 5етг Авр сіп 385 390 395 400 сіу Гей Тут ТПт Сув Аза Аїа бек бБет біу Гей Меєс ТПтІ пув Гув Авп 405 410 415 бек ТПк Роре Уаї Агд Уаї Ніз січ Гув 420 425 «2105 53 «2115 455 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 53 зект Авр ТПх бі1у Агд Рго Рпе Уа1і Сі Мес Тут бБехт сіц Іїе Ркго с1ц 1 5 10 15
І1е І1ї1е Нів Месє ТрІ сі б1у Агд Сі Гец Уаї І1е Рго Суз Агд Уаї1ї
ТПк о бБет Рко Авп І1е ТПх Уаі1! ТПкх Гецп Гув Пув Рпе Рго Гец Авр ТПг
Тецп І1їе Ркго Авр сСі1у пув Агуд Іїе Іїе Тгтр Авр 5Бетї Агд Ггув с1Уу Ре бо
І1їе Іїе бБегт Авп Аїа ТПтІ Тут Гпузв бі Іїе сі1у Гец їец ТПг Сув с1цЦ 65 70 75 80
А1їа ТПт Уаї Авп сіу Нів їец Тут КПув ТПг Авп Тут їец Трт Нів Агд 85 90 95
Сіп ТБт Авп о ТБг о І1е І1е Азр Уаї Уаї Ггец бетг Рго бек Нів с1у І1е 100 105 110 сіЧ Гей бехт Уаії сіу сіц пув гец Уаії гей Авп Сув ТПтІ Аїа Аг9д ТПг 115 120 125 бі гей Авп Уаії с1у Іїе Авр Рпе Авп Ткр біц Тут Рго бек бек Гуз 130 135 140
Ніз сіп Нів пув Гпув їец Уа1і Авп Агд Авр їєц Гуз ТПт Сіп бехг 01У 145 150 155 160
Ззек бі Меє гув Кпув РіПе Гпецй бет ТПтІ Гей ТПІ Іїе Авр сіу Уаї ТПг 165 170 175
Атдуд бБегхт Авр сіп сіу Гецп Тух ТПх Сув Аї1а Аза бет бБет біу Гец Меє 180 185 190
ТПЕ Кпуз пув Авп о бег ТПг Ропе Уа1і Агкд уа1ї Нів сбі1цш туз сС1у б1у Ф1У 195 200 205 сіу бек б1у с1у сі1у сіу бБехт сіу сі1у сі1у с1у Бех б1у б1у С1у щЩ1Уу 210 215 220 бек сі1у сбіу бі1у б1у бек біу с1у сб1у с1у Бех с1і1у сіу сіу с1у 5бег 225 230 235 240 сіу сб1у б1у с1у Бек сіу сіу сіу сіу бБет бБехкт Авр ТПг С1у Агд Рго 245 250 255
Рпе Уаї біцш Меє Тук бег Сіц Іїе Рго сСіц І1їе І1їе Ніз Меє ТБг с1ц 260 265 270 с1у Акд бій Гец Маі Іїе Рго Сув Акуд Уаі! ТПт бек Рго Авп І1е ТіК 275 280 285 уаї ТПг Гецп Гпув Гпув РпПе Ркго Гей Авр ТПх їец Іїе Рго Авр о1У Гув 290 295 300
Атуд чІї1е Ії1е Тгр Авр бБет Акуд пув біу Рпе Іїе Іїе бБегхт Авп Аїа ТПг 305 310 315 320
Тут пузв Січ І1е сС1у Гец Гец ТПтї Сув б1ц Аїа ТПг Уаї Авп сС1у Нів 325 330 335
Пец Тут Гпув ТПт Авп Тугк Гей ТПІ Нів Агд Сіп ТПт Авп ТІ І1е І1е 340 345 350
Авр уаї Уаї їец Бек Рго Бех Нів С1у І1їе сі Іїец бБег Уа1і С1у с1ц 355 360 365
Туз Гец Уаї Ггец Авп Сув ТПї Аза Агуд ТПх біц Гец Авп Уаї О1Уу Ії1е 370 375 380
Авр Рпе Авп Тгр сі Тут Рго бБет бБет Кув Нів Сіп Нів Гуз Ппув Іец 385 390 395 400 уаї Авп Агтуд Авр о ТГец пув ТПтІ біп бек біу бек біц Меє Гув пув РІПе 405 410 415 теп бБет ТПтї Ггецп ТПї І1їе Авр сіу Уа1 ТПг Агуд бБет Авр сіп сіУ Гец 420 425 430
Тук ТПпхтІ Сув А1ї1а А1їа бек бек біу Пец Меєсє ТПтІ пув Гув Авп бБет ТПг 435 440 445
Рпе Уаї Агд Уаї Нів сіц Гуз 450 455 «2105 54 «2115 470 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 54 зект Авр ТПх бі1у Агд Рго Рпе Уа1і Сі Мес Тут бБехт сіц Іїе Ркго с1ц 1 5 10 15
І1е І1ї1е Нів Месє ТІ Сі б1у Агд Сі їец Уаї І1е Рго Суз Агд Уаї
ТПк о бБет Рко Авп І1е ТПх Уаі1! ТПкх Гецп Гув Пув Рпе Рго Гец Авр ТПг теп І1їе Ркго Авр с1у пув Агуд Іїе Іїе Тгр Авр бБет Агд Гув О1Уу РПе бо
І1їе Іїе бБегт Авп Аїа ТПтІ Тут Гпузв бі Іїе сі1у Гец їец ТПг Сув с1цЦ 65 70 75 80
А1їа ТПт Уаї Авп сіу Нів їец Тут КПув ТБтІ Авп Тут їец ТПртІ Нізв Агд 85 90 95
Сіп ТБт Авп о ТБг о І1е І1е Азр Уаї Уаї Ггец бетг Рго бек Нів с1у І1е 100 105 110 сбіЧ Гей бек Уаії с1у сіц Гпув Гец Уаії Ггец Авп Сув ТПї Аза Агд ТіК 115 120 125 бі гей Авп Уаії с1у Іїе Авр Рпе Авп Ткр біц Тут Рго бек бек Гуз 130 135 140
Ніз с1іп Нів пув Гпув їец Уа1і Авзп Агд Авр їеєц Гуз ТПт Сіп бехг О1У 145 150 155 160
Ззек бі Меє гув Кпув РіПе Гпецй бет ТПтІ Гей ТПІ Іїе Авр сіу Уаї ТПг 165 170 175
Атдуд бБегхт Авр сіп сіу Гец Тут ТПїІ Сув Аїа Аза бет бек б1у Гей Мес 180 185 190
ТПЕ Кпуз пув Авп о бег ТПг Ропе Уа1і Агкд уа1ї Нів сбі1цш туз сС1у б1у Ф1У 195 200 205 сіу бек б1у с1у сіу сіу бБехт сіу сі1у сі1у сС1у Бех б1у С1у СШ1у щу 210 215 220 бек сі1у сбіу бі1у б1у бек біу с1у сб1у с1у Бех с1і1у сіу сіу с1у 5бег 225 230 235 240 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сі1у с1у бек біу бі1у б1у с1у Бех -щЩ1Уу 245 250 255 сіу б1у б1у бек с1у сіу сіу сіу бБет бБет Авр ТПг С1у Агд Рго РіПе 260 265 270 уаї біц Меє Туг Бек Сі Іїе Рго сі Іїе І1їе Нів Месє Трт сі 01Уу 275 280 285
Атд бі Гец Маі Іїе Рко Сув Акд Уаі1і ТПх бет Рго Авп І1е ТПг Уаї 290 295 300
ТПЕ Ггец пув Гпув РіПе Рго Ггецп Авр ТПх Тецй Іїе Рго Авр сіу Гув Агд 305 310 315 320
Іїе Іїе Тгр Авр бБет Акуд пув Сіу Рпе Іїе Іїе бБет Авп Аїа ТПт Туг 325 330 335 пуз с1п Іїе с1у їец Гец ТПт Суз Сі Аїа Тр Уаї Авп с1у Нів Іец 340 345 350
Тут пув ТПг Авп Тут Гец ТПт Ніз Агд біп ТБг Авзп ТІ І1е І1е Авр 355 360 365
Ууаї Маї теп бек Рго Бех Нів сіу І1ї1е Сі Гец бек Уа1і! с1у січ Гув 370 375 380 теп Уаії Ггец Авп Сув ТПх Аза Агд ТПх бій Тец Авзп Уаі с1у І1е Авр 385 390 395 400
Рпе Авзп Тгр Сіц Тук Рго бБет бек Пув Нівз Сіп Ніз Ппуз Ппув Гец Уаї1 405 410 415
Авп Атуд Авр оТГец Гув ТПт сіп бехт сіу бек біц Меє пув пув РпПе ТІец 420 425 430
Зек ТПї Гей ТПх Іїе Авр сіу Уа1і ТПг Агуд бБет Авр сіп сіу Гец Туг 435 440 445
ТПкх Сув Аї1а А1їа бБет бек біу пгец Меє ТПг Гув Гпув Авп бек ТПх Ріе 450 455 460 уаї Агд Уаї Нів сіц Гуз 465 470
«2105 55 «2115 432 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 55 зект Авр ТПх бі1у Агд Рго Рпе Уа1і Сі Мес Тут бБехт сіц Іїе Ркго с1ц 1 5 10 15
І1е І1ї1е Нів Месє ТІ Сі б1у Агд Сі їец Уа1ї І1е Рго Суз Агд Уаї
ТПк о бБет Рко Авп І1е ТПх Уаі1! ТПкх Гецп Гув Пув Рпе Рго Гец Авр ТПг теп І1їе Ркго Авр с1у пув Агуд Іїе Іїе Тгр Авр бБет Агд Гув О1Уу РПе бо
І1їе Іїе бБегт Авп Аїа ТПтІ Тут Гпузв бі Іїе сі1у Гец їец ТПг Сув с1цЦ 65 70 75 80
А1їа ТПт Уаї Авп сіу Нів їец Тут КПув ТБтІ Авп Тут їец ТПртІ Нізв Агд 85 90 95
Сіп ТБт Авп о ТБг о І1е І1е Азр Уаї Уаї Ггец бетг Рго бек Нів с1у І1е 100 105 110 сіЧ Гей бехт Уаії сіу сіц пув гец Уаі Гей Авп Сув ТПхт Аїа Агд ТПг 115 120 125 бі гей Авп Уаії с1у Іїе Авр Рпе Авп Ткр біц Тут Рго бек бек Гуз 130 135 140
Ніз сіп Нів пув Гпув їец Уа1і Авп Агд Авр теп Гуз ТПт біп бехг 01У 145 150 155 160
Ззек бі Меє гув Кпув РіПе Гпецй бет ТПтІ Гей ТПІ Іїе Авр сіу Уаї ТПг 165 170 175
Атдуд бБегхт Авр сіп сіу Гец Тут ТПїІ Сув Аї1а Аза бБег бБет біу Гец Меє 180 185 190
ТПк пувз пув Авп бет ТПк Ріобе Уаї Агд Уаї Нів Сі Пув Авр Гув ТЕГ 195 200 205
Ніз ТПпг Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго бій Іїєц їєц бі1у с1у Рго 5бег 210 215 220 маї Рпе Гецп Рпе Рко Рко Ппув Ркго Гуз Авр ТПтІ Ггец Меєсє Іїе 5бБег Аг4д 225 230 235 240
ТБПЕ Рго сі Уа1ї ТрІ Сув Уаї Уаї Уаї Авр Уа1ї! бБег Ніз с1цп Авр Рго 245 250 255 сСіш Маї пуз Рібе Авп Тгр Тук Уаї Авр сС1іу Уа1 с1іц Уаї Нів Авп А1а 260 265 270
Туз ТПт Кпув Рго Агд бі бі біп Тук Авп обет ТПІ Тут Акд Уаі1ї Уаї 275 280 285 бек Уаї Пец ТрПтї Уаї Гецш Ніз Сіп Авр Тгр їец Авп с1у Ппув бій Туг 290 295 300
Туз Сув пув Уаї бБет Авп гув Аза Гей Рго Аїа Рго Іїе сі Гув ТПкК 305 310 315 320
І1е Бек ув Аїа пув сі1іу біп Рго Агд бі Рго біп Уа1 Тук ТПг Ієц 325 330 335
Ркто Рго Бек Агд Авр бі Гей ТПг Гув Авп о сіп Уаії бек Гец ТПтг Сув 340 345 350 теп Уаї пув с1у Ррбе Тук Рго бек Авр Іїе Аїа Уаі сіц Ткгр січ 5ег 355 360 365
Авп о б1у біп Рго сі1ц Авп Авп Тут Гуз ТБПї ТБбт Рго Рго Уаі Іецй Авр 370 375 380 зект Авр біу бек РпПе РпПе їпецй Тут бет пув Ге ТПтї Уаії Авр Гпув 5ег 385 390 395 до
Атуд Тгр сб1іп біп с1у Азп Уа! Рібе Бех Сув бек Уаії Меєсє Ніз Сс1цп Аї1а 405 410 415
Пец Нів Авп Нів Тут ТПг с1іп Гпуз бек Гей бек Гей бетг Рго СсС1у Гув 420 425 430 «2105 56 «2115 6 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 56
Іїе Ії1е Тгр Авр 5ет Агд 1 5 «2105 57 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 57
Сі І1е с1у Гец Пец ТПтІ Сув б1іц Аїа ТПк Уаї Авп сС1у Нів Ієц Туг 1 5 10 15
Туз «2105 58 «2115 23 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид
«4005 58
Сіп ТБт Авп о ТБг о І1е І1е Азр Уаї Уаї Ггец бетг Рго бек Нів с1у І1е 1 5 10 15 сбіЧ Пец бек Уаії о1у с1Ч Гуз «2105 59 «2115 21 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 59
ТПкх січ Гец Авзп Уаії Сіу Іїе Авр Рпе Авп Ттр бі Тут Рко бБет 5бег 1 5 10 15 пуз Нів Сіп Нів Гуз 20 «2105 60 «2115 16 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 60
Авр Гув ТПх Нів ТБт Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго Сбіц Іец Ієцш 01У 1 5 10 15 «2105 61 «2115 7 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 61
ТЕ Авп Тугк Гей ТрІ Нізв Агд 1 5
«2105 62 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «2225 (7)..(7) «223» Може бути карбоксиметильований «4005 62 сСіш І1е сС1у Гец Пец ТПтІ Сув б1ц Аїа ТПк Уаї Авп сС1у Ніз Ієц Туг 1 5 10 15
Туз «2105 63 «2115 23 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 63
Сіп ТБт Авп о ТБг о І1е І1е Азр Уаї Уаї Ггец бетг Рго бек Нів с1у І1е 1 5 10 15 сбіЧ Гей бек Уаї о1у сіц Гув «2105 64 «2115 24 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид
«2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (10)..(10) «223» Може бути окиснений «4005 64 зект Авр ТПх бі1у Агд Рго Рпе Уа1і Сі Мес Тут бБехт сіц Іїе Ркго с1ц 1 5 10 15
І1е І1е Нів Месє ТрІ сі с1у Агд «2105 65 «2115 24 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (20)..(20) «223» Може бути окиснений «4005 65 зект Авр ТПх бі1у Агд Рго Рпе Уа1і Сі Мес Тут бБехт сіц Іїе Ркго с1ц 1 5 10 15
І1е І1е Нів Месє ТрІ сі с1у Агд 20 «2105 66 «2115 8 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215 ІНШ ОЗНАКИ «2225 (7)..(7) «223» Може бути окиснений
«4005 66
ТПк сіп бет сі1у Бек бі Меє Гуз 1 5 «2105 67 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (8)..(8) «223» Може бути карбоксиметильований «2205 «2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (15)..(15) «223» Може бути окиснений «4005 67 зехт Авр біп бі1у Ггецп Тухк ТПг Сув Аза Аїа бБет бБет сіу Гец Меє ТПг 1 5 10 15
Туз «2105 68 «2115 24 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 68 зект Авр ТПх бі1у Агд Рго Рпе Уа1і Сі Мес Тут бБехт сіц Іїе Ркго с1ц 1 5 10 15
І1е І1е Нів Месє ТрІ сі с1у Агд
«2105 69 «2115 10 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «2225 (9)..(9) «223» Може бути окиснений «4005 69 сіу Рпе Іїе Іїе бБег Авп Аїа ТПтІ Тут Гуз 1 5 10 «2105 70 «2115 12 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «2225 (2)..(2) «223» Може бути окиснений «4005 70
Туз Рпе Рко Гец Авр ТПїх Ггец Іїе Рго Авр О1У Гув 1 5 10 «2105 71 «2115 12 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «2225 (1)..(1)
«223» Може бути окиснений «4005 71
Рпе Гецп бет ТПх Гец ТПт Іїе Авр с1і1у Уаі ТПхК Акгд 1 5 10 «2105 72 «2115 165 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 72
А1ї1а Рго Меє Аїа сіцшц сС1у сС1у с1у сб1іп Авп Ніз Нів Сі Уа1ї Уа1ї! Ггув 1 5 10 15
Рпе Меє Авр Уаї Тук біп Агуд бек Тут Сув Нів Рго Іїе Сі ТПг Ієц уаї Авр Іїе Рпе сіп сі Тух Рго Авр бі Іїе біц Тут Іїе РпПе Гуз
Рко Бек Сув Уаі1і Рго пгец Меє Агуд Сув с1у с1у Сув Сув Авп Авр с1ц бо сі1у їец біц Сув Маії Рго ТПт сіц сід бБет Авп І1е ТПг Меєсє сбіп Те 65 70 75 80
Мес Агуд І1е пув Рго Ніз Ссіп сі1у Сіп Нів І1ї1е сС1у Сі Меєс бек РБре 85 90 95
Пец сб1іп Нів Авп Гуз Сув біц Сув Агд Рго Ппув Гув Авр Агд А1їа Агд 100 105 110 сСіп бі Авп о Рго Сув С1у Рго Сув Бех Сі Агуд Агд Гув Нів Тец РБе 115 120 125 уаї біп Авр Рго сіп ТПт Сув пув Сув Бек Сув Гув Авп ТПг Авр 5ег 130 135 140
Атуд Сув гув Аїа Акд сіп Гец бій Гей Авп о біц Агуд ТБПг Сув Агд Сув 145 150 155 160
Авр ув Рго Аг Агд 165 «2105 73 «2115 451 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 73 сі Маї б1іп Гец Маії сіц бБехт сі1у с1у Авр Гей Уаії пув Рго б1у Щ1У 1 5 10 15
Ззек гей Гуз Ггецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у РПпе ТПтІ РПе бет бет 5ег сіу Меє бБет Ттр Маі Агд сіп ТПт Ркго Авр Гуз Акд Гей бій Тгр Уаї
А1їа ТПІ Іїе ТПт бБет сіу сі1у бБет Тук ТПх Тут Тут Рго Авр бБетг Уаї бо туз с1у Акуд РпПе ТПї Іїе бек Агд Авр Авп Аїа Гпув Авп ТПт Гец Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє бет бБет Гей Ггуз бек бі Авр ТПтІ Аїа Меєсє РпПе Тук Сув 85 90 95
Аза Атд Гец с1у Авп Тут сіу с1у Тут Тут Аїа Мес Авр Тут Тгр 01Уу 100 105 110 сбіп сб1у ТПг бБет УМаії ТПт Уаії бБет бБет Аїа бек ТПт Гуз С1у Рго бек 115 120 125 уаї Рпе Рго Гец Аїа Рко бет бек Гуз бек ТПтІ бет біу с1у ТПтї А1а 130 135 140
А1їа тїецшц с1у Сув Гец Уаї пув Авр Тут РіПе Рго біц Рго Уаії ТПг Уаї 145 150 155 160 бек Тер Авп бБехт С1у Аїа їеєц ТПт бегт с1у Уаї Ніз Трк Ріе Рго А1а 165 170 175
Ууаї Гей біп бБет бБет сіу Гецп Тут Бек Гей бет бБет Уа1 Уаї ТПг Уаї 180 185 190
Рго бек бет бек Гец біу ТПтї Сіп Тіт Тут І1їе Суз Авп Уаї Авп Нівз 195 200 205
Тув Рко бБет Авп ТПтІ Гпузв Уа1і Авр гув пув Уаії біц Рго Пув бек Сув 210 215 220
Авр Гув ТПт Нів ТБт Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго Сіц Ієц Ієц С1У 225 230 235 240 сіу Рго бБет Маії РПпе Гец Рпе Рко Ркго Гуз Рго гув Авр ТПг Івц Мес 245 250 255
ІТ1е бБег Агд ТПт Рго Сі Уа1ї ТрІ Сув Уаї Уа1 Уаї Авр Уа1ї бек Нів 260 265 270 січ Авр Рго біц Маії Ппув Рпе Авп Тктр Тут Уа1і1 Авр сСіу Уа1 сі Уаї 275 280 285
Ніз Авп Аїа пув ТПтї Гпув Рго Агд Сі бі б1іп Туг Авп бБет ТПк Туг 290 295 300
Атд Уаї Уаї бек Уаі1ї їец ТБг Уаї їец Нів сіп Азр Тер Іеєц Азп 01УуУ 305 310 315 320
Туз січ Тут пув Сув пув Уаії Бек Авп ув Аїа їец Рго Аїа Рго Іїє 325 330 335 біц пув ТПІ Іїе Бех Гув Аїа Гпув сіу сіп Рго Акд бі Рго біп Уаї1ї 340 345 350
Тук ТПт Ггец Рко Рго Бек Агуд Авр бій Тецй ТПтІ пув Авп сіп Уаї 5ег 355 360 365 теп ТПт Сув Гец Уаії пуз б1у Рпе Тук Рго бБет Авр Іїе Аїа Уаї сіц 370 375 380
ТЕр сіц бБет Авп б1у біп Рго бі Авп Авп Тут Пув ТПтг ТПтг Ркго Ркго 385 390 395 400 уаї гейш Авр бБет Авр сіу бБет РПе РПбе Гей Тут бет Ппув Гей ТПг Уаї 405 410 415
Авр Гув бБет Агуд Тгтр сіп сіп с1у Авп Уа1і Рібе бет Сув бБехт Уаї Меєс 420 425 430
Ніз с1п АТїа Пец Нів Авп Нів Тут ТПг бСіп Гпув бБет Пец бБет Гец 5бег 435 440 445
Рхго с1У Гувг 450 «2105 74 «2115 213 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 74
Авр Іїе сбіп Меєсє ТПтІ сіп бет Рко бБетї бБекїк ІТецй бБег Азїа бБет Іец 01Уу 1 5 10 15 сіу пув Маї ТПІ Іїе ТПг Сув ТПт ТПт бБет біп Авр бек Авп Авп Тукг
І1ї1е Аїа Тгр Тут сіп Нів Пув Рго СсС1у Пув сС1у Рго Агд Ієц Ієц Ії1е
Ніз Тут АТїа бБетг ТПтї Іец сбіп Рго б1у І1їе Рго бБет Агуд Роре бег 01У бо
Ззек біу Бек б1у Агд Авр Тут бет РПе бБег Іїе 5Бегт Авп Гей с1ц Рго 65 70 75 80 січ Авр Іїе Аїа ТПтІ Тут Рпе Сув Гец сіп Тут Авр Тух Іецп Тгр ТЕПкг 85 90 95
Рпе сі1у біу б1у ТПк пув їецп біцп Тей Гув Агуд ТПтї Уаі Аїа Аїа Ркго 100 105 110
Ззек Уаі Рібе Іїе Рбе Рго Рго бегхт Авр біц сіп Гей Гув бет с1у ТПг 115 120 125
А1ї1а бБет Уаії Уаії Сув Гец Гец Авп Авп Робе Тут Рго Агуд біц Аїа Гуз 130 135 140 уаї біп Тер гув Уаі Авр Авп Аїа Гей біп бегт біу Авп бек біп с1ц 145 150 155 160
Ззек Уа1і ТПх бі біп Авр бек пув Авр бБет ТПІ Тут бБет Гец бет 5бег 165 170 175
ТЕ Гец Тбг Гей бег гув АЗїа Авр Тук біцш пув Нів Пув Уаї Тугк Аї1а 180 185 190
Суз сі Уаї ТПг Нівз сСіп с1у Гїец бек бБетг Рго Уаії ТПтІ Кгуз бек РІГе 195 200 205
Авп Атуд о1у сі Сув 210 «2105 75 «2115 451 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 75 сі Маї б1іп Гец Маі сіц бехт с1у с1у Авр Гей Уаії пув Рго С1у -Щ1У 1 5 10 15
Ззек Гей Гуз Ггецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у РПпе ТПтІ РПе 5ет Авр бек сіу Меє бБет Ттр Маі Агд сіп ТПт Ркго Авр Гуз Агкд Гей бі Тгр Уаї1ї
А1їа ТПІ І1їе бБет бБет сіу сі1у с1у Тут ТПх Тут Тут бБет Авр бБет Уаї бо бі б1у Атуд Рпе ТПІ Іїе 5Бегт Агуд Авр Авп Аїа Авп Авп ТПх Гей Ріе 65 70 75 80 теп сіп Меє бет бБет Гей Ггуз бек бі Авр ТПтІ Аїа Меє РпПе Тут Сув 85 90 95
Аза Атд Гец с1у Авп Тут сіу с1у Тут Тухк біу Меєс Авр Тух Тгтр Щ1У 100 105 110 сбіп сб1у ТПт бБет Маі! ТПт Уаї бБет бек Аїа бет ТПтІ пув б1іу Рго 5бБег 115 120 125 уаї Рпе Рго Гец Аїа Рко бет бБет Гуз бек ТПтІ бет б1іу с1у ТПг Аї1а 130 135 140
А1їа тецшц с1у Сув Гец Уаії пув Авр Тут РпПе Рго біц Рго Уаі1і! ТПт Уаї 145 150 155 160 бек Тер Авп бБехт С1у Аїа їеец ТПг бегт с1у Уаї Ніз ТрІ Ріе Рго Аї1а 165 170 175
Ууаї Гей сбіп бБет бБет сіу Ге Тут бБетк Гец бет бБет Уаі1і Уаі1і ТПг Уаї 180 185 190
Рго бек бет бБет КГец біу ТПтї Сіп ТПт Тут І1е Суз Авп Уаї Авп Ніз 195 200 205
Тув Рко Бек Авп ТПтІ Гпузв Уаі Авр гув пув Уаії біц Рго Гув бек Сув 210 215 220
Авр Гув ТПт Нів ТБт Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго Сб1іцш Ієц Ієц С1У 225 230 235 240 сіу Рго бБет Маії РПпе Гец Рпе Рко Рго Гуз Рго гув Авр ТПг Іц Мес 245 250 255
ІТ1е бБег Агд ТПт Рго Сі Уа1ї ТрІ Сув Уаї Уа1 Уаї Авр Уа1ї бек Нів 260 265 270 січ Авр Рго біц Маії Ппув Рпе Авп Тктр Тут Уа1і1 Авр сСіу Уа1 сі Уаї 275 280 285
Ніз Авп Аїа пув ТПтї Гпув Рго Агд Сі бі б1іп Туг Авп бБет ТПк Туг 290 295 300
Атд Уаї Уаї бек Уаі1ї їец ТБг Уаї їец Нів сіп Азр Тер Іеєц Азп 01УуУ 305 310 315 320
Туз січ Тут пув Сув пув Уаії Бек Авп ув Аїа їец Рго Аїа Рго Іїє 325 330 335 біц пув ТПІ Іїе Бех Гув Аїа Гпув сіу сіп Рго Акд бі Рго біп Уаї1ї 340 345 350
Тук ТПт Ггец Рко Рго Бек Агуд Авр бій Тецй ТПтІ пув Авп сіп Уаї 5ег 355 360 365 теп ТПт Сув Гец Уаії пуз б1у Рпе Тук Рго бБет Авр Іїе Аїа Уаї сіц 370 375 380
ТЕр сіц бБет Авп б1у біп Рго бі Авп Авп Тут Пув ТПтг ТПтг Ркго Ркго 385 390 395 400 уаї гейш Авр бБет Авр сіу бБет РПе РПбе Гей Тут бет Ппув Гей ТПг Уаї 405 410 415
Авр Гув бБет Агуд Тгтр сіп сіп с1у Авп Уа1і Рібе бет Сув бБехт Уаї Меєс 420 425 430
Ніз с1п АТїа Пец Нів Авп Нів Тут ТПг бСіп Гпув бБет Пец бБет Гец 5бег 435 440 445
Рхго с1У Гувг 450 «2105 76 «2115 213 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 76
Авр Іїе сбіп Меєсє ТПт сіп бет Рко бБетї бБеїт Гей бегт Аїа бек Іїей ЩШ1Уу 1 5 10 15 сіу пув Маї ТПтІ Іїе ТПт Сув пув ТПтї Бек біп Авр бБет Авп Гув Тут
Ії1е Аїа Ткгр Тут сіп Нів Пув Рго СсС1у Пув сС1у Рго Агд Ієц Ієц І1е
Ніз Туг ТПг бБет ТПтї Іїец сбіп Рго б1у І1їе Рго бБет Агд Роре бехг 01У бо
Зек біу Бек б1у Агд Авр Тут бек РПе бБег Іїе 5Беїт Авп Гец с1іц Ркго 65 70 75 80 січ Авр Іїе Аїа ТПт Тук Тук Сув Гецп біп Туг Авр Авп їец Тгр ТПг 85 90 95
Рпе сі1у сбіу б1у ТПкх пув їецп бій Іїе Гув Агуд ТПїІ Уаі Аза Аїа Ркго 100 105 110
Ззек Уаі Рібе Іїе Рбе Рго Рго бехт Авр бій сбіп Гей Гуз бек с1у ТПк 115 120 125
А1ї1а бБет Уаії Уаії Сув Гец Гец Авп Авп Робе Тут Рго Агд бій Аїа Гув 130 135 140 уаї біп Тер гув Уаі Авр Авп Аїа Гей біп бегт біу Авп бек біп с1ц 145 150 155 160
Ззек Уа1і ТПх бі біп Авр бек пув Авр бБет ТПІ Тут бБет Гец бет 5бег 165 170 175
ТЕ Гец Тбг Гей бег гув АЗїа Авр Тук біцш пув Нів Пув Уаї Тугк Аї1а 180 185 190
Суз сі Уаї ТПг Нівз сСіп с1у Гїец бек бБетг Рго Уаії ТПтІ Кгуз бек РІГе 195 200 205
Авп Атуд о1у сі Сув 210 «2105 77 «2115» 445 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 77 сі Маї б1іп Гец Маії сіц бБехт сі1у с1у Авр Гей Уаії пув Рго б1у Щ1У 1 5 10 15
Ззек гей Гуз Ггецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у РПпе ТПтІ РПе бет бет 5ег сіу Меє бБет Ттр Маі Агд сіп ТПт Ркго Авр Гуз Акд Гей бій Тгр Уаї
А1їа ТПІ Іїе ТПт бБет сіу сі1у бБет Тук ТПх Тут Тут Рго Авр бБетг Уаї бо туз с1у Акуд РпПе ТПї Іїе бек Агд Авр Авп Аїа Гпув Авп ТПт Гец Тук 65 70 75 80 теп сіп Меє бет бБет Гей Ггуз бек бі Авр ТПтІ Аїа Меєсє РпПе Тук Сув 85 90 95
Аза Атд Гец с1у Авп Тут сіу с1у Тут Тут Аїа Мес Авр Тут Тгр 01Уу 100 105 110 біп сб1у ТПг бБет УМаії ТПт Уаії бБет бБет Аїа Гуз ТПтї ТПхї Рго Рго бек 115 120 125 уаї Тук Рго Гец Аїа Рко сіу бек Аїа Аза біп ТПт Авп бет Меє Уаї 130 135 140
ТпПЕ Гец сіу Сув Гец Уаі пуз б1у Тухк Рпе Рго біц Рго Уаії ТПг Уаї 145 150 155 160
ТЕ Тгр Азп бетг Сіу бБет Пец бек бек біу Уа1! Нів ТПтІ Роре Рго Аї1а 165 170 175 уаї гейш біп бБет Авр Гец Тут Тіт Гецп бек бет бБет Уаі1 ТПг Уаї Рго 180 185 190 бек бек ТПтІ Тгр Рго бБет біц ТПк Уаї ТртІ Сув Авп Уаї Аїа Нів Рго 195 200 205
А1а бБет бБет ТПтІ Гув Уаі Авр Гпув Гпув І1е Уаї Рго Агд Авр Сув Щ1Уу 210 215 220
Сув Ппув Рко Сув І1е Сув ТПїх Уа1і Рго бі Уаії бет бБет Уаї РпПпе Іїє 225 230 235 240
Рпе Рго Рго пув Рго пув Авр Уаї їецй ТПІ Іїе ТПх Гецп ТПт Ркго Гуз 245 250 255 уаї ТПгІ Сув Уаі Уаії Уаії Авр І1е бБеїт Гуз Авр Авр Рго бій Уаї сіп 260 265 270
Рпе бек Тгр Рпбе Уаї Авр Авр Уаї біцш Уаї Нів ТБІ АТїа сіп ТБг с1п 275 280 285
Рго Акд бі бі біп Рбе Авп о бет ТПтІ Рпе Агуд бБет Уаі! бБет сіц Гец 290 295 300
Рго Іїе Меє Ніз СсСіп Авр Тгр Гец Авп с1у пув біц Рбе Кпувз Сув Агд 305 310 315 320 уаї Авп Бех Аза Аза Рпе Рго Аїа Рго Іїе біц пув ТПг Іїе Бек Гув 325 330 335
ТПЕ пув с1у Акд Рго Гуз Аза Рго біп Уа1! Тут ТПІ Іїе Рго Рго Ркго 340 345 350 туз сі сіп Меє Аїа гуз Авр пув Уаі1і бек Гецп ТПтІ Сув Меє І1е ТПг 355 360 365
Авр Рпе Рпе Рго сіц Авр І1е ТПїІ Уаї бі Тгр біп Тгр АвБп о1у сіп 370 375 380
Рго Аії1а бі Авп о Тухк пув Авп оТПт біп Рго І1е Меєс Авр ТІ Авр ШУ 385 390 395 400
Зек Тут РПе Уаі1ї Тук бек пув Гей Авп Уаії сіп Гув бБет Авп Тгр с1ц 405 410 415
А1їа с1у Авп ТПг Робе ТПтї Сув бБет Уаї їецш Нів Сі С1у Іеєц Нів Авп 420 425 430
Ніз Нізв ТПг бі Гпуз бек Гей бет Нів бБет Рго С1у Гув 435 440 445 «2105 78 «2115 213 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 78
Авр Іїе сбіп Меєсє ТПт сіп бет Рко бБетї бБеїт Гей бегт Аїа бек Іїей ЩШ1Уу 1 5 10 15 сіу пув Маї ТПІ Іїе ТПг Сув ТПт ТПт бБет біп Авр бек Авп Авп Тукг
Ії1е Аїа Ткгр Тут сіп Нів Пув Рго СсС1у Пув сС1у Рго Агд Ієц Ієц І1е
Ніз Тут АТїа бБетг ТПтї Іец сбіп Рго б1у І1їе Рго бБет Агуд Роре бег 01У бо
Зек біу Бек б1у Агд Авр Тут бек РПе бБег Іїе 5Беїт Авп Гец с1іц Ркго 65 70 75 80 січ Авр Іїе Аїа ТПтІ Тут Рпе Сув Гец сіп Тут Авр Тух Іецп Тгр ТЕПкг 85 90 95
Рпе сі1у сбі1у б1у ТПкх пув еп бій Тей Гув Агуд Аїа Авр Аїа Аїа Ркго 100 105 110
ТПкї Уаї бБет І1е Рібе Рго Рго бек бек бі біп Гецп ТПг Бех с1у с1У 115 120 125
А1їа бБет Уаї УМаії Сув Рпе Гец Авп Авп Рбе Тут Рго пув Авр І1е Авп 130 135 140
Уаї пув Тер ув І1їе Авр сіу бБет бій Агд біп Авп біу Уаі1ї! Іецй Авп 145 150 155 160
Ззек Тгр ТПх Авр біп Авр бек пув Авр бБет ТПІ Тут бБет Меїс бек бек 165 170 175
ТЕ Гец Тбг Гей ТрПтї Ггув Авр біц Тугк бі Агуд Нів Авп о бет Тук ТЕГ 180 185 190
Сузв б1п АТа ТПт Нівз Гпув ТПт бБет Тіт бет Рго І1е Уа1ї! Гуз бБег РБГе 195 200 205
Авп Атуд о1у сі Сув 210 «2105 79 «2115» 445 «2125 БІЛОК
«213» Штучна послідовність «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 79 сі Маї б1іп Гец Маі сіц бехт с1у с1у Авр Гей Уаії пув Рго С1у -Щ1У 1 5 10 15
Ззек гей Гуз Ггецп бек Сув Аїа Аїа бек с1у РПпе ТПтї РПе ет Авр 5ег сіу Меє бБет Ттр Маі Агд сіп ТПт Ркго Авр Гуз Агкд Гей бі Тгр Уаї1ї
А1їа ТПІ І1їе бБет бБет сіу с1у с1у Тук ТПх Тут Тут бБегт Авр бБетг Уаї бо бі б1у Атуд Рпе ТПІ Іїе 5Бегт Агуд Авр Авп Аїа Авп Авп ТПх Гей Ріе 65 70 75 80 теп сіп Меє бет бБет Гей Ггуз бек бі Авр ТПтІ Аїа Меєсє РпПе Тук Сув 85 90 95
Аза Атд Гец с1у Авп Тут сіу с1у Тут Тухк біу Меєс Авр Тух Тгтр Щ1У 100 105 110 біп сб1у ТПг бБет УМаії ТПт Уаії бБет бБет Аїа Гуз ТПтї ТПхї Рго Рго бек 115 120 125 уаї Тук Рго Гец Аїа Рко сіу бБехт Аїа Аза біп ТПт Авп бегт Мес Уаї 130 135 140
ТпПЕ Гец сіу Сув Гец Уаі пуз б1у Тухк Рпе Рго біц Рго Уаії ТПг Уаї 145 150 155 160
ТЕ Тгр Авзп бетг С1іу бек Гец бет бек біу Уа1 Нів ТіПг Роре Рго Аїа 165 170 175 уаї гейш біп бБет Авр Гец Тут Тіт Гецп бек бет бБет Уаі1 ТПг Уаї Рго 180 185 190 бек бек ТПт Тгр Рго бБет біц ТПк Уаї ТртІ Сув Авп Уаї Аїа Нів Рго 195 200 205
А1їа бБет бБет ТПт Гув Уаі Авр Гпув Ггпув І1е Уаї Рго Агд Авр Сув 01У 210 215 220
Сув Ппув Рко Сув І1е Сув ТПїх Уа1і Рго бі Уаії бБет бБетк Уаї РпПпе Іїє 225 230 235 240
Рпе Рго Рго пув Рго пув Авр Уаі! їецй ТПІ Іїе ТПї Гец ТПк Рко Гуз 245 250 255 уаї ТПгІ Сув Уаі Уаії Уаії Авр І1е бБеїт Гуз Авр Авр Рго бій Уаї сіп 260 265 270
Рпе бек Тгр Рпбе Уаї Авр Авр Уаї біцш Уаї Нів ТБІ АїТа сіп ТПг с1п 275 280 285
Рго Акд бі бі біп Рбе Авп о бет ТПтІ Рпе Агуд бБет Уаі! бБет сіц Гец 290 295 300
Рго Іїе Месє Ніз СсСіп Авр Тгр Гец Авп с1у пув біц Рбе Ппув Суз Агд 305 310 315 320 уаї Авп Бех Аза Аза Рпе Рго Аїа Рго Іїе біц пув ТПг Іїе Бек Гув 325 330 335
ТПк пув с1у Акд Рго Гуз Аза Рго біп Уа! Тут ТПІ Іїе Рго Рго Рго 340 345 350 туз сі сіп Меє Аїа гуз Авр пув Уаі1і бек Гецп ТПтІ Сув Меє І1е ТПг 355 360 365
Авр Рпе Рпе Рго сіц Авр І1е ТПтх Уаї бій Тгр біп Тгр Авп с1у сіп 370 375 380
Рго Аії1а бі Авп о Тухк пув Авп оТПт біп Рго І1е Меєс Авр ТІ Авр ШУ 385 390 395 400
Ззек Тут РПе Уаії Тук бек пув Гей Авп Уа! сіп пувз бек Авп Тгр бій 405 410 415
А1їа с1у Авп ТПг Робе ТПтї Сув бБет Уаї їецш Нів Сі С1у Іеєц Нів Авп 420 425 430
Ніз Ніз ТПг бі Гпуз бек Гей бБет Нів бБет Рго СсС1у Гуз 435 440 445 «2105 80 «2115 200 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 80
Авр Іїе сбіп Меєсє ТПтІ сіп бет Рко бБетї бБеїт Гей бегт Аїа бБет їецшй 01У 1 5 10 15 сіу пув Маї ТПІ Іїе ТПтг Сув Гпув ТПт бБет біп Авр бек Авп Ггув Тукг
І1ї1е Аїа Тгр Тут сіп Нів Пув Рго СсС1у Пув сС1у Рго Агд Ієц Ієц І1е
Ніз Тук ТПг бБет ТПжї Іїец сбіп Рго б1у І1їе Рго бБет Агуд Роре бег 01У бо
Зек біу Бек б1у Агд Авр Тут бек РПе бБег Іїе 5Беїт Авп Гец с1іц Ркго 65 70 75 80 січ Авр Іїе Аїа ТПтІ Тут Тут Сув Гец сіп Тут Авр Авп Гей Тгр ТЕПкг 85 90 95
Рпе сі1у сбі1у б1у ТПкх пув Гей бій Іїе ув Агуд Аїа Авр Аїа Аїа Ркго 100 105 110
ТПкї Уаї бБет І1е Рібе Рго Рго бек бек бі біп Гецп ТПг Бех с1у с1У 115 120 125
А1їа бБет Уаї УМаії Сув Рпе Гец Авп Авп Ропе Тут Рго пув Авр І1е Авп 130 135 140
Уаї пув Тер ув І1їе Авр сіу бБет бій Агд біп Авп біу Уаі1ї! Іецй Авп 145 150 155 160
Ззек Тгр ТПх Авр біп Авр бек пув Авр бБет ТПІ Тут бБет Меє бет 5ег 165 170 175
ТЕ Гец Тбг Гей ТрПтї Ггув Авр біц Тугк бі Агуд Нів Авп о бет Тук ТЕГ 180 185 190
Суз б1п АТа ТіПт Ніз Кпув Тіт 5ег 195 200 «2105 81 «2115 7 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 81 січ Гей Маії Іїе Рго Сув Агд 1 5 «2105 82 «2115 8 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 82 теп Уаї Ггец Авп Сузв ТПх Аза Агд 1 5 «2105 83 «2115 14 «2125 БІЛОК
«213» Штучна послідовність «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «2225 (2)..(2) «223» Може бути окиснений «4005 83
ТПЕ Нів ТПг Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго Сіц Іец Ієц С1У 1 5 10 «2105 84 «2115 24 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 84 січ пец Маї Іїе Рго Сув Агд сіц І1е с1у Гец Гей ТПх Сув бі Аїа 1 5 10 15
ТПЕ Уаї Авп сі1у Ніз Гец Туг Гуз «2105 85 «2115 26 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «222» (26)..(26) «223» Може бути присутнім або відсутнім «4005 85 теп Уаії Ггец Авп Сув ТПї Аза Агд бек Авр біп сіу Гей Тугк ТПкг Сув 1 5 10 15
А1їа Аїа бБет Бек сіу Гец Меє ТПтІ Ггув Гуз «2105 86 «2115 28 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «222» (28)..(28) «223» Може бути присутнім або відсутнім «4005 86
ТПЕ Нів ТБг Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго С1ц їй їец С1у Тік Нів 1 5 10 15
ТПЕ Сув Рко Ркго Сув Рго Аза Рго бі Гей їец 01У 20 25 «2105 87 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 87
Сі І1е с1у Гец Пец ТПтІ Сув б1іц Аїа ТПк Уаї Авп сС1у Нів Ієц Туг 1 5 10 15
Туз «2105 88 «2115 23 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 88
Сіп ТБт Авп о ТБг о І1е І1е Азр Уаї Уаї Ггец бетг Рго бек Нів с1у І1е 1 5 10 15 сбіЧ Гей бек Уаї о1у сіц Гув «2105 89 «2115 24 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «222» (10)..(10) «223» Може бути окиснений «4005 89 зект Авр ТПх бі1у Агд Рго Рпе Уа1і Сі Мес Тут бБехт сіц Іїе Ркго с1ц 1 5 10 15
І1е І1е Нів Месє ТрІ сі с1у Агд 20 «2105 90 «2115 24 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «222» (20)..(20) «223» Може бути окиснений «4005 90 зект Авр ТПх бі1у Агд Рго Рпе Уа1і Сі Мес Тут бБехт сіц Іїе Ркго с1ц 1 5 10 15
І1е І1е Нів Месє ТрІ сі с1у Агд «2105 91 «2115 54 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «2205 «2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (40) ..(40) «223» Може бути окиснений «4005 91 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сі1у с1у бек біу бі1у б1у с1у Бех -щЩ1Уу 1 5 10 15 сіу б1у б1у бек с1у сіу сіу сіу бБет сіу с1у с1у с1у Бек Бек Авр 20 25 30
ТПЕ с1у Акуд Рко РпПе Уаі Сі Меєс Тухк бек біц Іїе Рго бій І1ї1е Ії1е
Ніз Меє ТК сі с1у Агд «2105 92 «2115 54 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «2205 «2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (50)..(50)
«223» Може бути окиснений «4005 92 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сі1у с1у бек біу бі1у б1у с1у Бех -щЩ1Уу 1 5 10 15 сіу б1у б1у бек с1у сіу сіу сіу бБет сіу с1у с1у с1у Бек Бек Авр
ТПЕ с1у Акуд Рко РпПе Уаі Сі Меєс Тухк бек біц Іїе Рго бій І1ї1е Ії1е
Ніз Меє ТК сі с1у Агд «2105 93 «2115 8 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (7)..(7) «223» Може бути окиснений «4005 93
ТПк сіп бет сі1у Бек бі Меє Гуз 1 5 «2105 94 «2115 17 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (15)..(15) «223» Може бути окиснений
«4005 94 зехт Авр біп бі1у Ггецп Тухк ТПг Сув Аза Аїа бБет бБет сіу Гец Меє ТПг 1 5 10 15
Туз «2105 95 «2115 14 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 95
ТПЕ Нів ТПг Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго Сіц Іец Ієц С1У 1 5 10 «2105 96 «2115 23 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 96
Сіп ТБт Авп о ТБг о І1е І1е Азр Уаї Уаї Ггец бетг Рго бек Нів с1у І1е 1 5 10 15 сбіЧ Гей бек Уаї о1у сіц Гув «2105 97 «2115 7 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «223» Див. опис, як подано для детального опису заміщень та переважних варіантів здійснення «4005 97
ТЕ Авп Тугк Гей ТрІ Нів Агд 1 5 «2105 98 «2115 54 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 98 сіу б1у б1у с1у Бек сіу сіу сі1у с1у бек біу б1у б1у бі1у бБех 01УуУ 1 5 10 15 сіу б1у б1у бек с1у сіу сіу сіу бБет сіу с1у с1у с1у Бек Бек Авр
ТПк с1у Акд Рго Рпе Уаії бі Меє Тук бек б1іц Іїе Рго сі І1е Ше до 45
Ніз Меє ТК сі с1у Агд «2105 99 «2115 24 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 99 зект Авр ТПх бі1у Агд Рго Рпе Уа1і Сі Мес Тут бБехт сіц Іїе Ркго с1ц 1 5 10 15
І1е І1е Нів Месє ТрІ сі с1у Агд 20 «2105 100 «2115 12
«2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «2225 (1)..(1) «223» Може бути присутнім або відсутнім «4005 100
Атуд УМаії ТПт бек Рго Авп І1е ТПї Уаі1ї ТПКх Гец Гуз 1 5 10 «2105 101 «2115 11 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «2225 (1)..(1) «223» Може бути присутнім або відсутнім «4005 101 туз сіу Рпе І1е І1е бБегт Авп Аза ТПх Тук Гув 1 5 10 «2105 102 «2115 9 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «2225 (1)..(1) «223» Може бути присутнім або відсутнім
«4005 102
Туз Гец Уаї Ггец Авп Сузв ТПх Аза Агд 1 5 «2105 103 «2115 7 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «2225 (1)..(1) «223» Може бути присутнім або відсутнім «4005 103
Тув Авп бБет ТПтІ РіПе Уа1і Агд 1 5 «2105 104 «2115 60 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «222» (1)..(60) «223» Ця послідовність може охоплювати 1-15 одиниць «Сі1іу біу СсС1у бег». «4005 104 сіу б1у б1у бек с1у сіу сіу бБехт сіу сіу с1у бек бі1у сС1у с1у бек 1 5 10 15 сіу б1у б1у бек с1у сіу сіу бБехт сіу сіу с1у бек бі1у сС1у с1у бек сіу б1у б1у бек с1у сіу сіу бБехт сіу сіу с1у бек бі1у сС1у с1у бек до 45 сіу б1у б1у Бек сіу сіу сіу бБехт сі1у сС1у б1у бБекг 50 55 бо «2105 105 «2115 21 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «2225 (7)..(21) «223» Ця послідовність може охоплювати 1-5 одиниць повтору "Рго Рго Сув'. «4005 105
Авр Гув ТПх Нів ТПт Сув Рго Рго Сув Рго Рго Сув Рго Рго Сув Рго 1 5 10 15
Рко Сув Ркго Рго Суз «2105 106 «2115 226 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «2225 (212)..(226) «223» Ця послідовність може охоплювати 1-5 одиниць повтору "Рго Рго Сув'. «4005 106 зект Авр ТПх бі1у Агд Рго Рпе Уа1і Сі Мес Тут бБехт сіц Іїе Ркго с1ц 1 5 10 15
І1е І1ї1е Нів Месє ТІ Сі б1у Агд Сі їец Уа1ї І1е Рго Суз Агд Уаї 20 25 30
ТПк о бБет Рко Авп І1е ТПх Уаі1! ТПкх Гецп Гув Пув Рпе Рго Гец Авр ТПг теп І1їе Ркго Авр с1у пув Агуд Іїе Іїе Тгр Авр бБет Агд Гув О1Уу РПе бо
І1їе Іїе бБегт Авп Аїа ТПтІ Тут Гпузв бі Іїе сі1у Гец їец ТПг Сув с1цЦ 65 70 75 80
А1їа ТПт Уаї Авп сіу Нів їец Тут КПув ТБтІ Авп Тут їец ТПртІ Нізв Агд 85 90 95
Сіп ТБт Авп о ТБг о І1е І1е Азр Уаї Уаї Ггец бетг Рго бек Нів с1у І1е 100 105 110 сіЧ Гей бехт Уаії сіу сіц пув гец Уаії Гей Авп Сув ТПхт Аїа Агд ТПг 115 120 125 бі гей Авп Уаії с1у Іїе Авр Рпе Авп Ткр біц Тут Рго бек бек Гуз 130 135 140
Ніз сіп Нів пув Гпув їец Уа1і Авп Агд Авр теп Гуз Тіт Сіп бехг 01У 145 150 155 160
Ззек бі Меє гув Кпув РіПе Гпецй бет ТПтІ Гей ТПІ Іїе Авр сіу Уаї ТПг 165 170 175
Атдуд бБегхт Авр сіп сіу Гец Тут ТПїІ Сув Аїа Аза бет бБет біу Гец Меє 180 185 190
ТПк пувз пув Авп бет ТПк Ріобе Уаї Агд Уаї Нів Сі Пув Авр Гув ТЕГ 195 200 205
Ніз ТПпг Сув Рго Рго Сув Рго Рго Сув Рго Рго Сув Рго Рго Сув Рго 210 215 220
Рко Суз
«2105 107 «2115 15 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 107 сіу сб1у б1у с1у Бек сіу сіу сіу сі1у Бех сі1у с1у С1у с1у бек 1 5 10 15 «2105 108 «2115 30 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 108 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сі1у с1у бек біу бі1у б1у с1у Бех -щЩ1Уу 1 5 10 15 сіу сб1у б1у Бех с1і1у сіу сіу сіу бБехт сі1у с1у сб1у С1уУу бек
«2105 109 «2115 45 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 109 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сі1у с1у бек біу бі1у б1у с1у Бех -щЩ1Уу 1 5 10 15 сіу б1у б1у Бек сіу сіу сіу с1у Бех сіу сб1у бі1у б1у бек С1у У
20 25 30 сіу сб1у бек с1у сіу сіу сіу бБехт сіу сі1у сб1у с1у бек до 45
«2105 110 «2115 60 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «4005 110 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сі1у с1у бек біу бі1у б1у с1у Бех -щЩ1Уу 1 5 10 15 сіу б1у б1у Бек сіу сіу сіу с1у Бех сіу сб1у бі1у б1у бек С1у У сіу сб1у бек с1у сіу сіу сіу Бех сіу сі1у сС1у біу бек б1у СШ1у щу до 45 сіу бек б1у с1у сіу сіу бБехт сі1у сі1у с1у б1у бБег бо
«2105 111 «2115 5 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 111 сіу б1у с1у о1у 5бБег 1 5 «2105 112 «2115 485 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид
«2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (206)..(280) «223» Ця послідовність може охоплювати 1-15 одиниць повтору "сС1у сб1у С1У сіу бек". «4005 112 зект Авр ТПх бі1у Агд Рго Рпе Уа1і Сі Мес Тут бБехт сіц Іїе Ркго с1ц 1 5 10 15
І1е І1ї1е Нів Месє ТІ Сі б1у Агд Сі їец Уа1ї І1е Рго Суз Агд Уаї
ТПк о бБет Рко Авп І1е ТПх Уаі1! ТПкх Гецп Гув Пув Рпе Рго Гец Авр ТПг
Тецп І1їе Ркго Авр сСі1у пув Агуд Іїе Іїе Тгтр Авр 5Бет Агд Гув с1у РПе бо
І1їе Іїе бБегт Авп Аїа ТПтІ Тут Гпузв бі Іїе сі1у Гец їец ТПг Сув с1цЦ 65 70 75 80
А1їа ТПт Уаї Авп сіу Нів їец Тут КПув ТБг Авп Тут їец Трт Нів Агд 85 90 95
Сіп ТБт Авп о ТБг о І1е І1е Азр Уаї Уаї Ггец бетг Рго бек Нів с1у І1е 100 105 110 сіЧ Гей бехт Уаії сіу сіц пув гец Уаії гей Авп Сув ТПтІ Аїа Аг9д ТПг 115 120 125 бі гей Авп Уаії с1у Іїе Авр Рпе Авп Ткр біц Тут Рго бек бек Гуз 130 135 140
Ніз сіп Нів пув Гпув їец Уа1і Авп Агд Авр їєц Гуз ТПт Сіп бехг 01У 145 150 155 160
Ззек бі Меє гув Кпув РіПе Гпецй бет ТПтІ Гей ТПІ Іїе Авр сіу Уаї ТПг 165 170 175
Атдуд бБегхт Авр сіп сіу Гец Тут ТПх Сув Аїа Аза бет бБет біу Гец Меє 180 185 190
ТПЕ Кпуз пув Авп о бег ТПг Ропе Уа1і Агкд уа1ї Нів сбі1цш туз сС1у б1у Ф1У 195 200 205 сіу бек б1у сб1у сі1у сіу Бек сі1у сі1у сі1у сС1у Бех біу б1у С1у 1У 210 215 220 бек сі1у сбіу бі1у б1у бек біу с1у сб1у с1у Бех с1і1у сіу сіу с1у 5бег 225 230 235 240 сіу б1у сб1у с1у Бек сіу сіу сі1у с1у Бех бі1іу б1у біу б1іу бех Щ1У 245 250 255 сіу б1у б1у Бек сіу сіу сіу с1у Бех сіу сб1у бі1у б1у бек С1у У 260 265 270 сіу сб1у бек сб1у с1у сіу сіу бБет бБет Авр ТПт с1у Аг Рго РіПе Уаї1 275 280 285
Сі Месє Туг бек біц І1їе Рго Сбі1цш І1їе І1їе Ніз Меє ТбкЕ сі с1у Агд 290 295 300 січ пец Маї Іїе Рго Сув Агкд Уаі ТПт бБет Рго Авп І1е ТПх Уа1ї Тік 305 310 315 320 теп Гпув Ппув РпПе Ркго Гей Авр ТПх Гецп Іїе Рго Авр с1у Гув Агд Іїє 325 330 335
І1е Тгр Авр бБет Акуд пув Сіу Рпе Іїе Іїе бБет Авп Аїа ТПтІ Тук Гув 340 345 350
Сі І1е с1у Гец Пец ТПтІ Сув б1іц Аїа ТПк Уаї Авп сС1у Нів Ієц Туг 355 360 365 пуз ТПт Авп Тут їец ТПг Нів Агуд Сбіп ТБт Авп ТБбт І1е І1їе Авзр Уаї 370 375 380
Ууаї Гец бек Рго Бет Нів бі1у Ії1е сі їеєц бек Уа1ї б1у сіц Ппув Іец 385 390 395 400 уаї гейш Авп Сув ТПтІ Аза Акуд ТПтї бі Ггеп Авп Уа! с1у Іїе Авр РПе 405 410 415
Авп о Тгр Сі Туг Рго бБет бетг КТув Нів біп Нів Ппув Гув Іец Уаї Авп 420 425 430
Ат Авр Гецп Гув ТПт сіп бет сіу Бек бі Меєсє пув пув Рпе Гей 5ег 435 440 445
ТпПЕ Гец ТПІ І1е Авр сСіу Уа1і ТПхг Агуд бегт Авр біп с1і1у Гец Тут ТПг 450 455 460
Сув Аїа Аїа бет бБет Сіу Гей Меє ТП пув пув Авп о бет ТПт РПе Уаї 465 470 475 480
Атд уаї Ніз січ Гув 485 «2105 113 «2115 211 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний поліпептид «2205 «221» МО ВЕ5 «222» (157)..(157) «223» Будь-яка амінокислота «4005 113 сіу Рго бБет Маії РПпе Гец Рпе Рко Ркго Гуз Рго гув Авр ТПг Івц Мес 1 5 10 15
ІТ1е бБег Агд ТПт Рго Сі Уа1ї ТрІ Сув Уаї Уа1 Уаї Авр Уа1ї бек Нів січ Авр Рго біц Маії Ппув Рпе Авп Тктр Тут Уа1і1 Авр сСіу Уа1 сі Уаї
Ніз Авп Аїа пув ТПтї Гпув Рго Агд Сі бі б1іп Туг Авп бБет ТПк Туг бо
Атд Уаї Уаї бек Уаі1ї їец ТБг Уаї їец Нів сіп Азр Тер Іеєц Азп 01УуУ 65 70 75 80
Туз січ Тут пув Сув пув Уаії Бек Авп ув Аїа їец Рго Аїа Рго Іїє 85 90 95 біц пув ТПтІ Іїе бБегт Гпув Аїа Гпув сіу сіп Рго Акд бій Рго біп Уаї 100 105 110
Тук ТПт Ггец Рко Рго Бек Агуд Авр бій Тецй ТПтІ пув Авп сіп Уаї 5ег 115 120 125 теп ТПт Сув гец Уаії пуз б1у Рбпе Тук Рго бБет Авр Іїе Аїа Уаї1ї с1ц 130 135 140
ТЕр сіц бБет Авп б1у біп Рго бі Авп Авп Тут пув Хаа ТПт Рго Ркго 145 150 155 160 уаї гейш Авр бБет Авр сіу бБет Рко Рго Гей Тут бБет пув Гец ТПтІ Уаї 165 170 175
Авр Гув бБет Агуд Тгтр сіп сіп с1у Авп Уа1і Рго бБет Сув бБетхт Уаї Меєс 180 185 190
Ніз с1п АТїа Пец Нівз Авп Нів Тут ТПг біп Гуз бБетг Пец бек Ієц 5ег 195 200 205
Рхго с1У Гувг 210 «2105 114 «2115 7 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2215» ІНШ ОЗНАКИ «2225 (3)..(3) «223» Може бути окиснений «4005 114
Ії1е Ії1е Тгр Авр 5Бет Аг9д Гуз 1 5 «2105 115 «2115 7 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «2225» (4)..(84) «223» Може бути окиснений «4005 115
Атуд ч1І1е Іїе Тгр Авр 5ет Агд 1 5 «2105 116 «2115 12 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 116 сбіу Ркго бек Маії Рпе Гецп Рпе Ркго Ркго Ппув Ркго Гуз 1 5 10 «2105 117 «2115 16 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (9)..(9) «223» Може бути окиснений «4005 117
Ууаї уаї бек Уаї Гец ТПтї Уаї Гецшц Ніз Сіп Авр Тгр Гец Авп с1у Гув 1 5 10 15 «2105 118 «2115 26 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (2)..(2) «223» Може бути окиснений «2205 «2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (4)..(84) «223» Може бути карбоксиметильований «2205 «2215 ІНШ ОЗНАКИ «222» (7)..(7) «223» Може бути карбоксиметильований «4005 118
ТПЕ Нів ТБбг Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго С1і1ц їй їец сС1у С1у Рго 1 5 10 15 зек Уа1і Рпбпе Ггецп Рпе Рго Рго Пув Рго Гув «2105 119 «2115 16 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність
«223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «2225 (9)..(9) «223» Може бути окиснений «4005 119
Ууаї уаї бек Уаї Гец ТПтї Уаї Гецшц Ніз Сіп Авр Тгр Гец Авп с1у Гув 1 5 10 15 «2105 120 «2115 10 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 120 зект Авр ТПх б1у Агд Рго Рпе Уа1і! сій Меєс 1 5 10 «2105 121 «2115 11 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «4005 121 уаї ТПг Бек Рго Авп І1е ТПтї Уаі1ї ТПїх Гец Гуз 1 5 10 «2105 122 «2115 6 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид
«4005 122
Авп обет ТПт Рпе Уаї Агд 1 5 «2105 123 «2115 14 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «222» (14)..(14) «223» Може бути присутнім або відсутнім «4005 123
ТПЕ Нів ТПг Сув Рго Рго Сув Рго Аїа Рго Сіц Іец Ієц С1У 1 5 10 «2105 124 «2115 7 «2125 БІЛОК «213» Штучна послідовність «2205 «223» Опис штучної послідовності: Синтетичний пептид «2205 «2215» ІНШ ОЗНАКИ «2225» (4)..(84) «223» Може бути окиснений «4005 124
Іїе І1е Іїе Тгр Авр 5ет Агд 1 5 ри кю ї ЕК ема Картка пиві гтиукм МІДДЮ ЛУННХ ВОК ХК уУ КИОЖеКХ : і ВУ икортневк: Пл кврех Киаеких : ї 3 ї Ехо : ї : і ї ся -, іме і УЖЕ ВІ се Ж ХУ К Ж З і ї . . 1 ї ЛІТНЯ ЕВ Но КУЛИ Мія як ї й п й . ше їх
І ЕЕ КК ек ВВІМЕ НН МО УВ КВУ ЕТ ККЕРІ ЮК КІВ Я ї
Зррятяевт КН МакУКЕКТСЕАРУВИВО КОХ ВАТ О МИ : зріє Ї
ДИКИХ і УМ НВЕ У ВКО ТАКУ КО ВІК ХЕ КІВ пот :
І ОКЕК КК ВТК вк ТАНОК КЖНЕХ. у
К г - хх
ТКОКТИТСЕВСРаРЕЬОЄ ох ї їх , : ї ї
ЕК КІВ ВК ТУТ МАКОМ КК ЕВ КЕМУ СУТ ВХ Не АКТЮВИКЕУУ : 1
КЕ ІТК УВУ ТСН ЧК КОСУ АТАК ТОМ ОКУ ТЕ ТРЕК ТУЕСКНЕ і і ТЕМУ МІС УКЛ КАЖЕМО МУЮТ ТРУНУ ВН ПАХУ : . о родом уки МНЕ МОЛ З
Біде 3
Фрагненийсс | ! і ;
Фіг. 1
С дадия нн ан
ЕК ї вач -е дн : | жі вн х-МН м 0» РУ МАМ дм в 5 ЦЕ 5- Го шк ше свати сел
Ні Зшнвка НіБ- НІВ
І. 4 п сно ж - 7 КУ Щ 7 планктон ЩЕ
АХ пе ск НВ ; !
А й о! ме Мом . щи по | 7 ! Мч он 7 Що | НВ я най п ВІ М
Ендопероксид Ї МН : нм ки чих ШЕ ут що : я т 00000 Нуклеофільне ка М " «он : г Б -
Б й 1 - зе 1 " зх (У й о ї ра дю що : 4 Й р я - 0
Г МНН ший Шх бок
І : " і уакиткеих З и лияйклея Й До
Бідроперокеня | хо божео-НіІх Нивз--3о 13,98 Да
Фіг. 2
/ й ,
ШИ: й сш - попів р НО сн «г і с з / і пла к ПІ жа МІ
Му МН й ше т і " КК Кк са ц В нон «свя | «С ши : я Є щі с г ром з я і в: опері, : "ераннннюкннн Ж
ОНКО ОМИ. е-к М. МН Є М М
І шко ЯМ, Фари г -
ОТ ! ща них "ОН 0: Он ши НИ -- пани Схема |. 15,99 Да
Фіг. 3
Об - М іпоглинає УФ. Й зу 2 0 Кув
СВІТЛО, ее ур зн - т прозорнмі й ж
НН я й . Ж я н мнииМ я Кулон т з м що чи геї р ша и я ,
Птн що У На Ї й : С п Знай МНС Мне --й аж МН о ? Же
І-триптофан те-ай я Обввосбіпоглинає
Тер ши шщ- д) ЄнНнє світло, виглялає днк кі
НМ жовтим й і | ;
ОМ ЖЕК
Фіг. 4
Експресія афліцерценту в клітнн: господарі в ХНН
НАВ
Сталін захоплення хроматограєія
Фіг. 5
І Бкспресія афлішернепту я клітнні-госполая в ХВ
І Єталпія захоплення
ФЧилтпептлчента напів планту
Відшенлення зфлібернепту і Сталін захоплення
АнонорсоМмінна
Фіг. в
Ко бкитоами лот купати р
Експресія збліберненпту в жлітнні-тосподарі в ХхНС -тадія гахопла ЕХ
Стадія захоплення Є тк чер с кітттт
АнснсесСОоМміннНа хваматоговоня
Фіг.
! Експресія афліберцепту В.) шлЕТННІ-ГОСПОдЯрІ В АВК іЄтадія захоплення СЕХ
Відшеплення афліжрнецту
С талія захоплЕННЯ і ОБ ЛЕ сис ть гіч
Аночовомінна о хроматогодоія
Фіг. 8 бідносторивнів наль) Б" ха довго екаловвого стянаашкх ВУ х ї : і 1. З ун. і
Є ї З ї
З ж : ще З і 3 : Е 3 ї хЇ 3 а... НИ 3
Ву Ми 3
В З і ї Ж. 3 ї т ї
З і 3 Я ї ї ї - З тек ї і А ї
З -Щ- 3 хх ЗХ шк З хе З -Е : ї з ш ! ня З
Та і 3 1
З
З 3 3 й і
І Ж і ї ї «3 3 щ- і т їх ей ; сх ї 4 В ї ї : : ши ї ї режи щр-я ій ня і
ЕС і і ї 3 ен в М щшУк 0 йВж» 0 шщУуз 0 ойях 00 щук пк ЩЕ ту
МТ те МІ ще МУ МТВ Я? Контроль
ЕтазложЕнЕ станлярт В Ж
Фріг. м в к Ре 2 - ск щ шо м її морі
І ЕЕ «ах 9
Тв : ка дО 0 ок 0 ЕХ
Б дк з хр в кВ в х г ІЗ їм де ве м ще . ке ку Ем їв Е ї3 ща ще щ т вк ж 2 хо Кя ко ей ве їі
Воно ся хм Ге що т в пе - Ей е її У я г З щИЗ ки во ОК Кк В ї Ж ЕВ КВ пок СКК т ; І КЕ Е хе 7 ам 3 і В ї М. г рехмтени 5 же косе ВХ
В х . о З ЗУ мА ММК Б НК І
Ж ОВЕ ї В ІЗ М | зп ЯдУщВ її Ії х, й щі СО ОанНнве Я ке окр ВЕК о Конні еачаюхис Кік ода жо кв Мо ій ВК КІ Зо ож кит ТИ Км й ше ї ще Й ї з ї М МІНЕТ ЕНфха КН
У: . 5 З М дує сити Ж жи помефокюнонн КИТА «М І й і Ше ой «б шо МКШННЯ Х Ба доня АХ повік хо океан Скук ікло нні коки нат ку кита фо ор унюванкх Коник и меивну Му ккк куюмет , у ЩЕ Й | х ї З с ХОВЕКЗН НАЕК З ПОМУД ВЕ уя її ї х з х Кк . Й ї пли з : ї ХМ Ж кохамиукюми. ЗХ миє ох змуюю МЕ 5 ЩЕ и і і Зо меномих у ве дохо ВХ
Я поет ані Мнкіками палкою я снквнн інди діжі Гакбойк най у КАМ Ак я ц .
КЗ Й ї З т ЗЕУВВеНЕВОКеВНН З ВЕК: ЗВКеННЕВ
М 5 К Н й Кк М М М евеменмя З хв ее: ВХ
Ж Я Н ко, й В у М СОТ ЗОЦІНМЯ З В КК ЕМ ре жів» Цим» ті екривовнюо с вбовсікюнв кс хх реє ках жу кк ки пишно
М МЕ ї х з І Ко . ті
НК Н і. й І . ГІ ЗИ сін Ду кн Вони Минко фоні нав інт ей с ово мн о о кобил УЗ кикнлкикт онов о
Зо бе і м пеня нею ово з У саке , ї ші . ти ТЕТ ІТТ, яп ошлп ож а дл ода ша ап ме ма кл аа пд дол вад дл деп да ой п да ква див дов ва дп са ТВ
ВИ БІМ о во шо о ЖОВ а ло КО М Б ОО У Я С Вед ЗНО о
Ханлини
Фіг. 10
Н Н і ПУ АХ дачнадоредту дО тн АК ВНТУ ння
З : с Али КА ДАК ОДЕСУ ДЕрА У
І ртамехня РОЮ Р ОО ОО КОЖ 1 Хдхкюку, цими ба Її умо планок Улта фу цує ! ее НОЯ ЗНО ово ВО Ноні
З т . с БАК зламі ЛК дю З безнадії Кк
ФМ авт Пептидна Моди ТЕЛЕ ЗОВ ж свв ЗВ фо юсвиж ду вомем
Кп ОЯКИ - є М : - ї т
Ким ц с жи зт гЗсузеїь З Шеюмм ди Я Мллолі й 3 ШУурніє 5
І послідовність каш Розд.) РОБ 2) Роздн, Я Код Я) Розм я
Й Е ек стихне ММК ск ст бле счуютову» Ду мам : ; МЕ ОКОМ та ДИМОМ 35 ДопОвО-Еа допомо За ПЕТ з к їх т т
З т те ТОЖ о дм ДІ" пак ДЕ а Ж мем ВЕ і ; не К і ою АХ Мо АЕХ Р оз АКХ | юю АХ ї 1 КАТ, ТЕМ А ВИТ ТИКИ мав ; і КА ОО, М я
Зі МУК мк УюкоУ У м и м ДА Кий ах, тоді ий м, Ой а КО А
ІНіб: БІОЛ УВМЕ КІВ ЕМ БК ЯКО ОЦищІ «МНО З кН ЕТ ЕЕ Ак
ОБЖ й во КТК ЕК за ми ху тя Мк ах: йлячи ПІКУ СДМ з ТМ и ЛАДИ я КК
ОН ЕЕХЬБЛСТБАТУВОНЬХЕ ОО а МЕ чу и НВ ЯН
З ул Кт її Хепачих лупа жо Ух ЛАК УМ с що НО ТЕЛА «МО се «МИ З КИ 3 МИ Р ОоєИ Ок,
Гухх Тех маже сучмм пли У ціх й ин ІК их А хОМІ ск МА дисц вЕ 0 ХТО ТОВКИ КБУ УК емо «оп Це З «МВ З бе РО І НЕ скан НО хв кп аю тут сте Кит Ки СЕК КК я мл ях я й "еще їх КО а ра о В МАННОЮ Те КУКИ
З 0 ТЕЛА ОУМКЕТРОВКНУВК «о его не МАМО У В КО
Миски висиОоИ и че її Макс в і а и В В
ЗВ ТЕТ РАС РАМКОКООРЯУКБИВРКУК оо МАЮ ЕП ЧОЛ МЕ ЕН 1 1 р. щу с х Х.
ЧУ Зм КИ и ах зі пк КЛ г ках Ол. кому, и дя
Кифла м Я Оу, ОМ ий МИ и, і во ев в МНК ро с Кя
З ВЕ А СО АОАнк скін дк ко мо лю
Н ки о п А а и ОН пе свт «ОО свер ои Е К Ме пт СД СО МОВ
ТМ ТОК ВИК А КК Ер Ки
Ух - А їй Яд Я пн Зп Ух З ВИК ПАК я. ї 1 й ким я о жа ТІМ у Ем УМО т З АЙ ННЯ ря ох «Я Мк, еп едожевие 3 т М чи т ЗИ З - МЕ МА У «НА КМ
ВА и и ти ТМ КОМ у 7 Млин ЖІ дв Я ло КА АВК КОХ
І Яга КОВО, пдв треки кеУ и ій гдз А пт о ж М ИХИМ Китий оли мИХ УЖ
Мет ІЕІМУСІНКВК УТА ОО Я у ЯН ТИЛ Я МАКОМ 1 У клала ти Види КИМ Ки Алі МОХ ОКА
З чи ладу т КЕ ПА МИ М КА 1 Не НИМ ДУМ ТКУ ММ УАНМ КИТ ТИЖ й ЗОМ птн пот плоті вн ВК и ЕТ кАНКЛЬОСНаНУЙ ЦУБУ ЧИ
Фіг. 11
Повний оглял
ЧУ ШК і НІВ здойни дв кава ен ГЕ; Я г кт хай трР ОЗ ВЕТі її і
Е п ШИ: "дві ШК: ії х Кі о 1: З ї їі вк: ко Кк: КН ІІ зі РБМКЕЗДОНЬНТ З я
Ї гі ох М зач «І зі НУ хи є
Її : ь хх ' Ух т чзкийй х
Ї кі сі си К- 1 хі БЕ оршау х: Й
Бо " їх: 16 р 5.
Ї ГИ ран 7 хі т ех як Я
Е корі . ї їі га зва ха і ові Кі хі і ще мк їх : ий, І М пи я хр і ж ка її ЩА я боб дн й іт. хіх і
Й ГО ! ; «КІ КК дк кан Модне жа орні зу. Я
Б: щи Вова и одне ОН уро ю В зве одеці
Й ' х НУК 1 її І: фо
Ї КІ 'х й: жи ' г: ЕІ 1.4 ї
Е кі РІЇ : ще о: з її ла
Е кі і з КИ хІ й й й ше. Ммті(хВс тво ав МтТіЇХВСІ
Є
Е Ще Де тях Я
М сих ті -К Я вк за нм юю : Кт р : кій : Кл : . т : х . ! і т і КИ і ох х 7 г ск ж внк вче а жк хм ек с, га с тк
Ме Ж ж 0 АБО МИ ОБ ЦО БЮ ОТО
КОБЮ За о оещИ 001 еВ ФА Я, емо Кдх Гу МА завилини
Жак старе 1656-30 хв. щел !
МТА тАТНе ПР ВВДОКЮ створення кітрекіку дна ку . пуаюч УНІ АХ ве у з «
МмтісхвсВ МИ и інн
МЕТА тідполізятсов 1 домени НТ
НЕ Я (плролізат сої) ж «Ак ВЕвНКНЯ щи !
Ж. рев, - сх ШЕ МЕ: кв НК :
КІ св розв, АД кт КУКИ шо не ЕТ ТтТя У БУ Ту На ЧУТИ ТТ НК ин ках а ия 4 те хіх ль г чи ле пд злу те у 585 з х п 2 Кі в А пс кл ия З чи
ЩО В ж Же МО аю Ж І Же В ВО 0 Ме
ХЕнлини
Фіг. 126 кі БОБ БЕ МНеможннво ке 5 з о 7 с кої пуд ках с нах ж и ,
ЗВ а Ба Я В ще А
МЕ М їх ве -- о ще : г бух 0 ва дитя з .
Е й дих ск ї ї ух тех . : З ай Ї тк тятнй 1 От, жі ої ці
Е. й ВЖК кі 5 ЖУК а хз : я " ія КО Я
МАНСМ; т Бодай З М ц ! ; Я фев сода КТ ЦК о Код
Е з я | її м Не пед с ЗІ й кн й С щі не ее ї 15 «ою се Ж ЖІ 53 :
Е і ЦЕ же т зе НИ ТЕ ох тк : ! ше ак ШИ г. ! ! шк КО тео ! ! і вріМ Бі ЗК ПДОСОНКЕ СНІ
МЕЖА дмох с Т ее, клинки кевни нка кни нини сек нки ники ЕТРЕрУРт проек ртю не
Хвилини
Фіг. 125С і кі в ще тх
В т : во Б ва ; З ку т З ж и вад З кв ня Ок Я : Го хх жКЯ о ех кі! я Жхі Км ; во В ж
БО в БВ г
З со ше Є -ї - є. ГЕ ока ж в їж Бо кі Її З
Гсвн - вах -
Б я- жк Б-ка С і 1,1 пін їх "зах її виш а
З З я - з:
ЛШ г 7 ві я ря 1.1 з: Ша з: й ен з павсці К: рр
Оп їй Жаши 11 .- тої по з Па Кз я: уся я 1: БА їз і хг й її 2 "Дамо. ка хі 3.1 й жі а ЧИЙ НН 5 11 і: пада, хі хі з її я "У й Кк сум хай 142 1: ча вада Іза ЖЖ - 1: ан снві, «Очищення АХ ІЗ їх г ві оду то зо 7 ; г хз: ва 10 во за ВТ
І раї чи і ПТО ОННК з як: з Межі кі хі . ; зм 138 Кі кру Ж ЖК Я ки не іі «Блю Аа В
Ж сек Бі ї -
Тк Кі з мне М
У МІХ то з
Хот т нертттрттчея ет пн с п ОН тт в вт т яп ЗЕ их БИ зай я их А и щ п ЕК ЯЗ тих що КМ ТІК М 1325 БІ їх ї КАК щу М кое що БОЮ ще о ЗК БЮ Це що
Фіг. 13 м а кА пе М . м - м кл 23 І щ- -3 У ща Ук м КЕ ЕЕ що
ГУ їх в ГУ
Ж Бо З що щ с д Ех ща г Е
ЕК В в - ЕХ 5
КЕ ко КК КЕ п Б з ОО І СЕ я : ши ШЕ я Б 5 п а НІ БВ 1400 КЩЕМК АЕХ,
І КЕ: ї тла Ії їх: НУ - ко муч у. 01 о, й с ОХ до м ДУЖЕ МИЖТА дуккт ек ком ВК кі Поеми ек ЖЕ МУК М ку т і ли КТК ік ких
То т І гі 7 НЕ Ше 13 и 7
Ще р і ТІ Її її А ПЕРБ ФТРММАННЯ дттттттттттттн т Доти фот Діти тк
Е ; 1 1 о й НЯ т 1 дю АТО АКТІВ ВИ ї КІ 1 і І І ко :СДЖУТА ТЯ СТЯМЮ
Ї шо у о ПИ Во дклек МОБНЯ МІХ ВЖЕ удкканонк КМ дв осот Цапко АКА ККУ ох о У УК еф м ак днк чо в ТА ЕК АК умо ї ще ЦІ 11 Й І: І іФЕЕТЯ ПожТБВТЕиХ ї г и: ї т 1: 1 хі " ї ше ої : ва КН НУ п мАнмя ті вух ї її 1 4 т З ВО ЖЕНА КС ї БІ Б: гі хі і РОТІ НиДІаЧ
Ї Не 1 х т Но ці 2. ДВК МВКУВІ МІ ЖИ ї. НЕ ди кал, ї я кухкаМх шк сажі Мк, схжх, п с В в с КК В п в о КО ЕК ОП в С НИ ї г р: з ті рі КО ВЕЧКИНАСовЕцІМ
Е Нй БИ ; 11 1 РІ пі оптфрцютиле ї 20 НЯ ї т Щи Не 00, КУТеКУНиНа МАВ в КЕ в В с п п п п п В С ВАК СТІН
Е 1 7 ТІ 1 Кт ОЇ ЖУЖШКМ М МХНК їх І би . т Б 5 Тк пре ї Бі ЦП ? ги То їй іо слюшмеми ї 2, п тя СЛ с с ої пл зак, с : дух и, - удкорнте пн Код жа осоки КАК о о КО В. нмуги палки о До АК уми зу дл Кн ЕК ем ко м нм
ТТ тт тир тр тт тт тих о шВ ЩІ Же У о ОМ ще ОА ХО ОЩАО05ЕО От фа щої ОО ЩА БА А б 2 що де БІ БІ Же МОМ ВЕ ще 0Х ОЇ РА ЖИ Хе ЖЖ жо щя ЩЕ РО ЇМ ЕМ 9 БУ 09А А 8 Є: сг 453
ХВИПМНИ
Фіг. 14
Сюроока
Ї салілазою А при
В протягом нечі
Єчніення ЗЕ
Бпрегаєх 200 ргер ота ХЕ ТОЮ
ІХ ОР ВН
Снльний катіонний обмін
МоепоВ НОЮ
Ереольовий гралієнт (ОА 5,3 я ЗА
Фіг. 15 га сх
Ж.
КИ
БЕК
ОО й
ПК
КЕ
ОК нн
М. РР й їх вия хх а и І Б т Й с Ї ри БОСЖЯ НА
Кін рня Я ТІ : І-й хх є ї т з ра й ОЧНВОМ и 00орта родити нн с ОЕ
Фіг. 15 в й І тя щ
З р-н кантраль спосоОову
ОО ві оамлкиттєсьу учи их ване КОТОМ додання шляхи кт няня жи ух чуємо сту ох Е2 шиття няня ня няня нн в с хажу жим м ж кю йти 7 г т -й мч и с не понят с фот екю етнтествстнтнят -- тям Ще:
ОА РА
Косяк хх хх ол т ета тркх и в в здох ж юю ях хх: ххх сх що : Ж. Е5 шпон ннюнн хо же хю ння ню вною шия лк ня чіфуння пл ст В КК ую тю в ТО вою жо мВ ння нта ж нею тою в жен жи миши ше Еб хост тідотит тт тт и тюотт пудтняюнттнннми ти ЖИТ тен оееесоєсесото ТОЖ отр туя туда пт пдетечнгі - ем утоми шоломі оттоюомотя т Мддддддн ДЮ 00 репер ут ач хяячию Ж єння кололи ! не ! " 7 ли ! ! т : по 48 во 120 16.0 200 24.0
Часіхвилинні
Фіг. 17 тт :
Неоракшонований вихідний контроль МТ шлях з пд юн яИТ пох птн в пня дв птн а Ж М Ся
С. С. -ЖШ їх дв шен ш і ш- що п. вет - що Е м 3 чо ЕОМ ще - Ж і п п. шт г у ї Зк ЕКО ду К ЩШ ї т КК соска ду ї ШОУ і их СОТ Е не с я г Фа
МК КК ЕТ ше
ВИ ро Кит 0 де е за й ІК В ВЕ ОМ СО бик Я п М
Дай с 5 а ве ни і 5 ше 7 од нн, шо сш в 5 т она ; ву ЖЕ парео Кия Як 60 чай гри НЕ ни Та Й вик о з КВ що
Ловжнна хвилі 4 з В Час (3-11 хв (280-450 нм) ит сріг. 18А
" зюаКкці х
Ве Ця і ті є
МтічЕ но
МЕ
Е Мак ЩА тн
І х хе ЕЙ й т я ех -- УКХ хх пкт,
ОЕМ У - о Фея Я Шння х во аКОКЕ но посту
СОМИ ВОМ й 4 теж БІ п пере
Е Те В ще ВИ зе : ма і М ЕІ Я не ч же ї- - і у я М Й, у ди г -
КОКО, туту пан х хх
Ск, Оп он ща к. Гоогуда м ї а ше ж ПО я. 3, - ще Пеня ож у ї мах . о ОМ ТІ НУ м. шо їд
ОВ І ЗИ МК ЯН КЕ Ії "у ! й Ох ПІН ХВ им ЕЛ и КК 1 ххх гей ЛАК а, ше пулу НВ са КО г Ж ве я сх п плете о я Ж ОКХ М за її щ
ЕД їх с п ПЕК ВУЗ п ах я НВО тва ТЕО ц 1 -
КО же шк ик в ше ІЕЕ ВОК г м - Б етнтт Ве дих пон яо пеКЕ ЕВ дин с ее і. ж
З щі ЧИ Ен НН М ККУ в. шия КВК ЕВ Ова (Й с як лоно ШО З що п п пен щи й че ще з пн Її пи й йо , ве я а п и Бий пий чих в -к ве нини ще попи ОК шт 5 ; ще ке я спо а З «Ф : - і в. ше п А кт иа о ЗК беии З
ОК - МАПИ КА З Я ще ОО Бе зу
Пов: що Г ша 15
Нива з вггрлю ох Ен я ве їх вищ па хвилі З ща ще ке 14 т
Іди ех БЕ КК Ши ІЗ й 2 У нм ЗАОКХ Й ат шт им да й 0 « сг, щи 48 часія - Ї Іагій
Ей Її і хв ї іг. 8
ЩІ пре ле : - їдкі тро ж
ВА й 7 У з Є т
АЖ. ак
ТІ) кит й МИ ХК пеки оте ПА Шен ро пев ше
М с шле вн,
Ї - Бий ношу к СИС БИ сет,
ЖК зе ї Ше ОХ х як оо 5 кох БОБ ет р їй -
КОКО: пов шт ї- і - б ся а дет 7 Е « і я ОЇ Ко Ж не дк шт і. -
А пт пе ех ї зе о м ФО яю МК ді Е 5
Ще с «а ЕЕ Мш МАМ Кон ж Па х Тех сок її -
Кн 5 ОХ Кт НЕ ЖОВ ЖЕ ою ох КЕ х ща 7 С Ме ші кеш кш щеня БОКОМ М па ее Ж М Тож ї- пам яТУ ОК ОВО ях Мч т ох Х щ кеВ ня ОО ЕЕ Ше пк: ах Пл КК Ов - кг. с
ПМК, днини ЛКК Хешитшт пе с їхЯ АК И ШНМ ЗО ТИ т 7 . спуиту че р ПОШИ п у прик У ОКХС М ІВ І ої я а і! ви лих МИЛЕ ОВО ти Кт Опов и п У ЖИТ х х 1 Ах
І ринв Кс ШІ ан НИ ХК Не КО ННХ Мі Кн - зад Ж КОНЯ ВЕ Я п ОМ ЕВ ЩО о ци «ха і хорє ев У киш ПОКИ Н В я и Кая вх дн ши КВЕСТ От ПУЛ Ху ми йо до ие КК МЕТІ ХХ З ж па В юГЕВ КЗ кре, ТЕ ви 5 шт ИОЕ ооо й о ке й й що до при я пІОЖ С.- де - й ев о ту шо мс т 2 ак З рон ОО и й шк я
Я г по й В чек
З ї паст ВК ОКО ПЕ . дви» ї й ша. п 16 д Як зехя КЕ - до щЕ не вій ще 4 з М ся Є их ІМЯ МН ДИ 1 довжина ше а гі Ол пе я ха з студ вшнахвилі бо Я о. ї В: п 14 ей сОщО-Ао Е Я У лю пааи х й ОО 7 З ня КК ке Щн іч В 4
У малю шо і ой 18 Мамі її : с (8-11 хв) і
Фіг. і іг. 18
Фра стін ОЗ чн нІя о Мт стела
І я 111 ія
А 1Е 3 де тт г г один кю ся я Я непу рн че шо в ОК; шо
ІЕЕЖЕКИЙ о 1 ж Я МОВ Ск Щ у сх МЕ ща пд ЕЕ щі
ПЕД А ее ї - те ПК СІ й де и М хх ' о АД оо Ки я
Ї а Шосе ква : ол КОКЕК МК Х. М
Я дв ОО У Я ОХ ТК НК люде ж хх й м шення що я БО ОКО з ЧЕ « В - а ен п в МОВ Яке 5. З. г Ж їз ши КК ПЕК ЖК ее КУКА КОКО Ї се 5 т кв сво ке пк Кв С ПКЕЕ ка же їх ще
БО М ВО і хау о ПЕ мне ноя У пеню В щі з ЖИ КВН шо ШОЇ ро М ЕХ КІ МОМ поОЖЕ ПИ ка Повх їх У,
ОКХ соки ОО пох оо пути пе і де рен КН ВЕК мк Жрей ВОК МО ЕТ В ПВХ во дЕ у НК ПК Ко ПОВЕ ОВ СЕК МЕНША ппони шк ово о се і а Ка о ікон ОБО У М ВИМ ше
ХАКІ пики, ТУМИТЕХ ХЕ ДИНЯ м ПООДЕ ди КК БО Я й ; жа и а Полон ВИ КОЖНЕ ие дого ще жна 5 їх з М бно ши Іо п др ОО : Бех вд еВ АН ЕЕ ВНІ ОО НКЕВИХ де я те " пад ки ер ред ВЕК М хи МНЕ М й «0 шив я що ТК ит «І пд шк ТИ пі сю і НІ - ДЯДЯ ЕВ Ви Пт 12
В я СЕ пошк ев нок М --
Довжина хвилі я. ЧпВ ска кя Се і ч4 и
Ще ахвилі З 795 схе Би ад ше тертю кт вок ов ох , ,
СВО Я5О нм 43 що їе пт 1 о тя шою то» ся з
УА 15 їж (411 х я - Ї хв «ріг. 80
ЖК нзлтт зе й ті ств
Фракція З МТ Б; дня що Од пеохжк о НЯ кет
Ше с ню ро поло Ши за г Ше ОБО де - ї бе пи ЕК житя К - х ска ДНИНИ Ь денне Е х
Ме шу ден М Щ ї Те ДНК ; понжкінни МО ї у «ПО Х ди Кк вмах ї у, о с ях ях ЕЕ пи т. З ї ! ш і ко В ВК ХК КЕ їж їх КМ ох КН їх ї ше. ах що ШЕ Ди М їх ї що «ВВ І ДЕ КО ж В
З ШО ВК Ти ПИСК М ПИОКККМИ : КІ х свв р ори КУ. полон що ЕОБК р ль ї ХО В І тя Кеш Ж отх ие. п в ХВОЯ св г ся
БА МЕ Ви ЗДО о орошния о ПЕД Кен ї- їх
М дО ВЕ КЕКВ по по а еВ КЕ о
ЖЕ дик МЛИНИ ТНЕНХ ЕК ПТ КИ ПО ЕЕ КИ КоеВ КА Ве ЧА -
ЕН с ПИ ДИКУ ППЛІВКІ п о ПИ, ПЕТ т г хм «ЕМО М НН ПОЕМ КИ ЛК ПК ПІКЕТ ПЕ х й о о ПИ КК ПЕ ж ВХ бах вно ен сов Кх
М ВИНИ ВМ ВН сов щ че ші КИ ОН ЕД МЕ ТЯ ІКП ЕЕ їх
ЖІ в В ДИН ОКО З: 5
Ж 0 КЕ т ДЕ «ПЕН ні сивини ПНО ие же ях у Овен КИ ПЕН аг ж аа 3 по о ее сь КО ; ам пу т - їх Ше МЕККА М
З. ЕН, Х соту пе ща М
ОВ шу я ОЇ сх са В ше я
Довжина хвилю б кое ї6 ся Кн ж тт ри зе шив ЛОКК си її Щ
СЯ щМЕНнМО ав ОВ їдсЯ- її хв ї й З Де хЖХ й те за
Фіг. 15
Фіг. 15Е
Єнот шов тих
Фодкція 5 МТУ м-н Шк пиши ЩІ днк п - я атом мити пе зонпе, хх, КМ лк, те ПЕВ, тснржр лах
Ше |! ля В і - ПИСК Есе тя Її ш і -щ ПАКОШО ше К М
Я з ТЕ ХМ МК. вн г 2 і 7 ОСА Шен 1 ш
ПЕ ЕТК що т Бен : те а ш- ше те ЕК дн КАН ! І ! они ке ен, іш ї Б ее ! /
КМ З я ООП КК лей не КО ЕМКОН МКК ОККО КЕ ОККО КОЖ Те. ь. ще т с Я й пох я К ї, з КВ ЕК КК Кр ПКТ КК КК я ШИЯ І Кох ї- Уа
Чх ШЕ АВК СОН НЯ пИхН пом ПК і у ; ОВ ОВ ЕНН ЕХ ом о Ж Зх
ЕХ З ЕЕ КК Боя КОНІ МЕЖ НЕ АТХ и В ВО хх сх
Кз ОН Ж ев оКЖС КВК ех в ве й КЕ нн КОМИ НК ШИ ко КРИК КВ З я дея те ви ши ее Її яке
ЗА пов ой ІЙ в
Я) б зване й г ши «КІВ В КК
ЗВ : ще ! ж пап ро дув : у
МО аю що
Повжина хвилі з п Кн
Ловжина хвилі до В шт
Док з НК Жтан і 1 - не ач при Яд ас 11 хв і у З ІВ
Фіг. 18Е
Фолкшя С МІ ГЕС шин х ї ззраке нан Пестотюжц пн ВК Ж т одн ООН Пен ; : ЕВ нкт В -- й Кв о Кк - і ет поет, ван А-Я ах
ЕКО п КО КЗ, ривки - щ
Шо В, ДЕ ВО " х й Й Ох тут ВК КВ ов В ОВ Же МЕ її ? 7 - ЕК Кк М в Я ОК
ОЗ о - в Ж
Довжина хвилі і ек Час з поп Якт т и їв СЕ 1 хво)
ГЗВО ак нм К ; І 2
Фіг. 185 т Я се У оди Тк, дини "М ж днини т Ка ї Сттчяя в ше Ше що і і Пр, Е п ТОК ; М ж ' т з, сет Не с КО раси де 1 ок й ие ж, ект 7 Е х і - В ОО ОК дет Є взух ее -х. а ОХ ВХ У к межи я, НЕ - і Кн ев і ОК М тя Ь З ї «КМУ ОХ А Ка в Ех
Й ай до НН г Ї 5 ї а г ал «ВК ОК нов КК т іа а ик о ОО БО х з
ДО Ки ше од ХК Пи ни КЕ Щ еВ шо ння г ЕЕ ; се у тую ОПЕК пн вен в АЙ с- і 5 Ох ОО ЖИЛИ Б о Й ! пат" У я дню нан ЛЕК В В сах В
Ме В тн пр и Ким зе я я з ЛИ КИ я опян ОВК ши ши у А КК се ек п да не уми ПЕК МЕ МЛ ся ! й
Я Ач че по ря ЕЕ КК и 15 че Кт тя М ДОМ я Пн ож я ЕКО слоти ШЕ Ешн вех З З т . щу шк 14 рей
ТЕрувсястятт я ее яра ов їх за
ЛДовжнинахвит з ЗО в й ту се коди - 1280-4550 нм) я Час у і 150 нм 423 щей 18 часі 11 хво пе
Фіг. тн
ЕлектроферограмнісБ в кА я ві 5,85 х
С Ме я Й вою ї Ми сна в 5 ДВ
Ж дом діодні ит ти КЕ . сл
НИ : З
Е М с п» м т є Б як , тесту жнтижиянтяня тя МЕ духу у. я 1 У кдідоД нати тоюули тими шви мк «лм ще соджхю
Я х ОБЖ у к ЕВ я и : зе ак хх Є У з
Мун ет пе юю ж люлі ж дн житя яжои т т тт ки х т беоесхожжанлж ння кн у
Не й « Ки ї я. жк
С дн, є нт схуд таттнюися Птн о ЖЖ ок - ам - й ясну, » га - ти жу з ї я
БО 550 70 75 80 85 50 95 0 рі фодинкНі БНО
Фіг. 19
ШЕ М
7 пу х
І в ка ! ї Б Що . В це о Й пе - : а и М, БУХ ке В ї- ск КОЛУ МЕ - ; х паж БоУ Ж п ї - о мо ва . ; . с Б тд Її БО й . . с - ПЗ М І Ж й . о ою -тФб6 ії: Кк ї ;
Е о ш Мої що ї - : ї реоЯ ке пи рах с :
К п сх Ми м м. -е-н-я Бо сш ї Вт й Ту Ще х т ЩЕ сне ї шо шко хх ІЙ т КЕ Ще
І 5 В щ ТК КІ КРБ де ї ко ка ПЕ т ре ох Ж як іш сх п. лу пух лих р. дені єкт тк хе : Ж ОН М Я х ще ї ще щ ІЙ хх хцх й зенжх КК В ІК З. оо. Моз га МЕ Ж шо х 3 де ; мод Мои п -- КІ З строгі шо М Ж... їх САС
Ком МЕ мох сон; щ ж о М пес Ве . хор І п Її ЗЕ пу Х М т по КЕ а пнях - ЖИ сих ї
Н п І г ОО Її ж І що. --- М . Щ-- ре ния щ і.
КОКО КА Ук Її Ба Б.В М Е пн й і. .
Кия ЕН НН те х В В. и, З | ЕІ
У Ган лк Ед - й с н- Хе ц ЖЕ і 7 В. . . ви « ща ся Сода зі ей їх Шо . - | с 7 Се Ол с. дитя и тикю 3... НІ хх ЗХ. ш г .
Е КЕ Ох Зх тин В «і ХЕ "СКК с рих " з М Но ї шк ше що пре зе Пенні Б : з Є пе М... г ТНК гли г ст о
КМ даю Б ії талих Ов Я МИХ... ІЙ тх ен КЕ Те і ї Ше в К М зе КК. Мо... ш В ТЕЖ ЕН ї ОК зи З. речи ЕВ Мети їх хо. ї щш с " 7 шо 2. Кг т ХЕ ххх ХК ях У пах : 8. ї пі. НОСИН ї ЕНН ! шо І
БІ о Е В як Я я М Ме ї- СУЯ 5 гехюкежех Її ї Ма ТМ х й- чт х ке ік Ж
Е ЩО... Е ния ВМ. В... ї ИН т Яра . що
З но ща Х ПХя й котик УК ОХ ї..- й В Дреня пет В Мая ке т | н . м І лк й кю р (й пох інв а зи и Ух ім ; я : ЩОБ. ї сечо Бе | т | ї | . к дет іх жк зт ї Є С Пд: г ях їх : ТЕ ; рі В зад і пеня й с І То г | ши Бр я М у. ш хМестхех Б дет
В... Е М. --- люофу Ко М МО І пеня в
КОТ НУ і тен пк хи як РОК Мен. т Мито : і т | Що В воО-- ШУ тай питеюююкєт КИ З пляек НИ ТУЯ ї : х пік щі. т ха спнуие й | ї п - | щ ї М т сеюкоттттн Т ве о
Кн Мо Кіля ян ї К ї не В ре леннккжкжкня й КН «В . ш ших а В Кр КХ Ж ее Ти зах : ЩО. М... сту МАВ... ГУ МК тюків Кр вкнаьу НК» п ще
Е к нав Бе 15 жд сей " М МЕ ден й зутучнвенья ши
НК. й рано шин КЕ «фр У ннезтнвн повен пе | шо в т вх Несе ОБО ВЕ
Ко - ренти -йре-В М М - СЕРЕ я ЕК БЕ ВІ
І М В ЕЕ я ов Мой твнетнння нення шк ЦЕ нев сна ща я кН я ї оз М сккккккки І ся - - нен М Щ до гткетвее ня та ОА Я і о / ака ан для ща ОЗ Я к з с Кк есе ї пе; її У щі порт НЕ НИ З жо ж дз ее Ек на неинее їх МИ ща й я НЕННЯ 5 ЖЕ 5 З ЖЕК ї Що. мае «а м ще вена за же ЗЕ З 5 жа ва хв чо жа ЩО
Мч
Оскекні
ЗЕ і ГО хх | АТ вах.
Я ІТ пити ХМХХ ІА я нн ПЕ мах Те ї фо ньо, Її хх ХЕ АК з
ДИ пн З ОКХ ж и кн з
ОО вн лк ДЕ ЕП ВИПИВ з о КИ Бій КК щі - ЛИПИ ПЕСЕН ДККМи 7 ЛИПИ ППП Подати пове АК лот КК рн х, ДИЛИ ень
М еМЕКК УМО ПЕ ИПИПИШИИИИК ПДАА содою ЕК КС о рови стаю ЖЕ ох КИ ЖАН дих дит
Ме М ВК лек В сов МО рн с З х х ко хх : з
ЗЕ ща
І п кан х : ПЕ МНК.
Я 5 бе сек КЕ ик шив я Енн
ОД
; 3 : : : ї ї
ЕПОС ера. З ХК Є ЖЖ 5 ХК шкая
ПППИИИИИИ ММ МЕДИ МИ ТВА вжи ТИШІ тич С У и пух с ПШПИЙИМИТИТИКИХ
ОО ЕВ КЗ : я ЕІ ПЕ
ПО МЕМЕЖИ СО ув ВСЕ МІС В І ХВ чо З ММ ан
ШИШКИ ПО ЄВННЄ СЕМ ВЖЕ н Ж ик у ше ск и 7 Пп ПИШНИХ нн Жейнх ШЕ о с скниккі ї Не : МЕ ІБ І зе д і ї ! ша ї, я І СИЛИ ЛЕН Кок,
КИ КВ ни, і АК ф-ннй Ще Ше В В бо шо 0:
Нахжени хни а нан ях що
Декжен но ВОК ооддекнни я ОК дян
ТАКИ щі птн ше сяк МК х Б ї шен ше і :06Д6Д6ДЙ0
БО шо. тт тет і НН ОХ З ХК Те СХ ЕЕ, В
ЕМ КВ НН плн І. 0 АСВ КЕНО хм ЗБ КНО Хек о ха 0 ЖАВ) жона Уфа бйняї Аве 0 льну в в
Фіг. 22
Підпаний влпляИивБУ ХОЛОДНОГО біпого світла : екз МНЕ ОК, Скот ДІА НО с | вайлошеа ЗОНА ОВО «з ЗИСОТа АЗАМАСЯО «Е т . я З в Ж: їх оо пий і ті інте ді хто кто вух ТЯ окт Ох чить «ОО Й ЧТО хітів чоти Ух и Е «ХК : бе що, що с о що МАМ н- по ТК щі Е щ т ГБ я КО х і ща г ЯК г
С тя І Б жк й З вся КУ ТО КМ Ск ок
ЖЕ | ше щі щі що
ГК е« ЕЕ як Ме ЕХ ве я к
КЕ Ех Ох я ши ше. 3 ще тА ка кх КО .
ТЗ З ех сх ви СХ і В КМ ж о п х їз тод 75тодо год од 00 год.
Фіг. 23А жа - ях 2 ї к така кі сх учи ВЕ щ он УНМАЙ 0яееее ДММЕро ям: ЗАВЯД я ММ ск п» ; з
В З еле» хх З в і 25 ще Др теси желе де ук м кутю ор і екю дюожехр єю ЖиЖю що ж ЛО ща тіні
В сш дк я ДК Пенн 1 сн Ге режи ке т фл джен Кт ги бард ше АХ дбронужиютн мити ки дярсстн лю яя є ще ша шу х дод ет Е т ен я» т і
НК е я З
З ф-т 7
ХХ, хх її м з як Д.Д, «нення евннетнтвнтвнттнерттнінею кінноти - - у 5 що то о 2 Зо зу Й дахи ко зв
Мас (години!
Фіг. 236
Тідданнй впливу УФ-А ! вміло що Зростання
ОМ х З т З т щи Вон КУ р Би Я г Е
Х й й же те Ех шо т м -| ТЯ о т ка - тт ІБ Е ія Б 0 ВЕ я 8 чі я в в Б ЩЕ в 5 Б і150 Ягод й голіб года года гол.
Фіг. 24А т О-О-УНМУЄ -- Лимер --0--Зарял --3- МА І
З сь се
Ж А й 0 х пла Ї І ун перу но, г. .
НЯ Птн хор холі лика шити о й 5 т 15 20 25 30 45 А
Часігалинні «ріг. 248
Ї : точок ку чекнняя х
Масіивтабні сцінки і
ДУ У УК УКУУУУУУУУУУУУУУУУУУУУУУУУУМУУУУУУУУУУУУУУМУУМУУУУУУМУУУУУУУМУУУУУУУУУУУУУХУМУХУУУМУ УУУУУМУУУУУУУУУУКУУМУМи ! тврмін Масштаб. Станд; ї- Ймовір-; ї лк тів й оо тяж ча
Р оцінка помилка коєфо ність руку мк КУ М КК Ж КУ єн Ук У КУМ мкм мою о поро фос ооо ооо поро осот осот
Січі з еуєіке «о гам ОЇ ОЇ 7 Ї Божим х хххххх За мих
ЕМІДЛІЯОК, ЩО ВІДКІКЕЮТЬСЯ івана г у Би ІН ява едМ: ть Нр оде ТЕМНІ фест БАВННИВ ЩО ОКО і ї, ва : БІБ: ОБО : 5Х Нагегемі 1 ійлеазн оо 1 ВУСА вка ЗЕ а ж ЕКМІ "Цистеінібї) ПЕН с бою МНЕ ООН
КУ 2. дім з Її НЕ зас крита діт - Е ї 3! ї вазах сл І 3 адииких 5 дидк: група вітанче гр; ВІВ) ОК КО МО, ж їх хх ох У ша т хх
Как ВУ іа 11 Б 3 пада хх е ЕНН
З о: : ТИП її У її 3 ПНТ В ФІ гална КІ; ПЕК 1 АНЯ МО ОМОЇ
С Уа іжАхзажАЮ І 1 3 ЖЕ Ох вхідних хи о ЕМ:
За рі ТИП ХКОЇ 1 ЖЖ З ІЧ, ж Ж І:
Цинк ШИ ЕЕ 11:11 ЧИ НщМе ее КУМ і ї г ск. г. се ж ї вва Її Ж т її за с пИММІ ї с сх вже ї ТО ОВІУКМК Її 1:05 255 1 23 1 3 пд хх ІІжНОІ "Фолієва кислота (9/3 ЩИХ МО п масті с В тА Її: 5 3 г дик - ех й щ КІ
СЕ фуУпа цистеу темне м. в ПН 1:11: В 3
З антен вавиу ї давзии 11111 5111 дв ча «ЛЕ
З истеін'залво РОБ: Я: ПИ БОЮ І с, : Ж рр ЕяІ І но сек
ТЕ аечеїня нац ід 11131 :: 1 аа хай 0 ПІБАЇ
ІцИСТеН ЧЕК ПО 1111 АКМНЮ аЯО0К : я - Н далі 12 ЖІ: се ПІЦ: т Бах | "вай «ктуху МНТУ ТД: хо ЩІ: вла ща ІА т іх " х Ж з (а ІІЗМУМЕК її: їх хх хіт КК МІ МОЖ Ж
Цистеін фропрюва кислота ; ві Кі 7 І я Е М НХ їв я тк ей і те г хі ; - І доми 11211 МІ 211 1 оадиків хх хо цх ї "Група-вітамінів гр. В'"заліа ПН 551: ВХ й
ПУ т з 7 ТОЖ 1 ЖІ 011 ЖЖ Ж й і ї- . . г - : ІІ т с й Нд і уєех жі в кі г мері ЛІКИ Її 3 пащу з Щі а ї п рупа вітаміни, Бчоалювог кислоти Ям 11 НА ОО МКК.
ХУ ооо
Фіг. 25А
Гоадик Фбактичного та прогнозованого значення ж й Ї не 9 - я щ В ! ши мк ж ча з ти т К
Ф : «Кт ча 8 пи : ще КО ан Е з 6 од й 7 я К з у ої Е - в кю
Як ! «ДК Е с ее ОА, Е г ! ще ; к й : ТК Е
ОО ше
Вик Я
КО й ««КМососогоосоосоооо ооо ооо ооо рю ооо ооо ооо оо ооо ооо сухо і оаюо овес ооо овоча оон
ІЗ ї ї х : ї т т І ц з ху ї г Я ж у і 2 і й З й і
День 7 протгноловане значення В РЕ «ОО Зоо ЗО КМ аа у з йо я . кою х лк З
Фіг. 2585 нн но нн нн
Ії ке Ме зАхЯ СВК Ям зді Х ро МИЗОКИМ ЗВАНО БКСТВНУ В 3 х я ї і жк х ї т о хм а ка В х : ще пе Є ре Низький вміст металів зу бух КЕ заз МЖрдудттлт ! бань 179 АОНТОЛЬ фено З 7 ? ме З КОТ : Її ох: хо Ж: і 1 і : і ї ї ї ї ї і : ЖІ пі : ; ї і Ї : : і ї : Ї яв: ха КІ : З і : ц 1 ї с ї ї і КУ й ах З ЕК еф р фе р ув В Ем я : ! : : і ї Ї ; і бр
З : : ї : Е : ей УКХ :
ФІ рр тот нт уттютт ско тке ето р егететкн рн кет рен ЯК ден еюнененнтю 3 ї З : ї ! З Н : Ек ее ї ! кв жк Ж : ї Н : ї : ї Бо ок ї З : ї Н ! : : ї ОО ї ; ї ї : ме ШЕ: : 1 : ї і ї ек: ї і і В : «шо В : ! : : і ой : і ; З З :
КУ ї і ї ї З оди Я ; ї 5 : бе і 1 : : і ШО : ї : і ї : с. 5 г : 1 і ї 1 ЕЕ ї : ї ї Її 7 : як 5: З | : ї р ї : ї : : 1 :
У г ї Ї і ї і: : Ї Її ї ї З : щодо 5 : : У її : : ї 1 ї ї З :
ТЕ : і і : : : : ї : : ї і
Я х : Ї ! : : Кі : ї з ; ї 1 З : 5: ї ! : і 5 ї : ї : Ї З : хе де ї : 1 : ях З Е і : ї ї ї ї : ше 3 дк : х ї ї : 1 ї :
ЩЕ: ї пін 3 ї ; ї ї в ! І 1 ї : 3 ї 1 ї ї ї Ї ї 1 ї ї В ї :
Ж -Х Са т хх їх шк КеЯ 5 їх «5 Ж СЯ х тк -ї ЗЕ щ ож ЕВ то щи - З дрхог а и кВ сСоерецй нІднОоСсниВ чес їдНО зва а кн мання їй х 7 га
Ні Я Зіану кжіх мк і Хр:
Бонн МУЗЬКИХ ВМІСТ ПИСТеНу : їх. Минай вимі ката ролях МАМИ ВМТ МЕТЯМВ 1
У и фот ге суч жіаькіх м с З дх ки х Я ПЕЕЬАЧЕ В Й ї ї ї 1 їх ї сх : ї : ї : КЕ х У гуд фр нн нннннкюнркнно ненні ЯМ дну пн енн онксюникннтй ї ї ї 1 т Ї КОТ: ї : їх : ї хх ї : ї 1 ї ОК: кої ї : ї : ї хх кн ї ї ї і ї гот ож КУ ї ! ї : х 18 шо а
ЯК я фо ех на фе рек фо ЕК еме Кутис оди стежині жнив кино нон В жом ї ї ї ї ї УЖ: 7 ї : х 15 зх : ї ї ї : КРАВ: Й В : ї 13
М і : ї 1 Ко Куй ! : : ї Я: з : ї : і тя як ОК : ї : : І - 1 ї ї 1 що и ки МЕ Б : ї : ї їх її: ж : ї я ху ї ТЕ ї : ї І:
Ек. і : ї Уа В: В ; : ; 13 че : : ї ТОЖ ою у ї : щ М х : ї І;
Фа я мя їм ї ї Її КУН ї ї : х ее ЕН ї ї Ї В че Ви ї ї ї с ї Ї ї : ї : СХ, ї ї х х ак пу 4 1 : отих ї х ї : ї ' ОК з я І тий перенесе офі трете нт еттєек фестете р оенК
ІЗ і : 2 Е і їх : : І х : их ке ї їх - 1 ї Її ї : ї : їх : М яна В че ї ; Я : ї : ї : ї : 7 : ЖЕ я ї 3 ї я ї ї х : ї. : ї : х ї ї 15
Как
ОН ї : : і ї : : ! х : ї хз
СЕ ї : : : : : ї Я ї : : 13 ї 7 ї 3 х " ї : : : т : х у вм в вх й о хх м Сх в ї їх 3 я ж З п ях яв яЯ йВюНх ше. дека ші ух мкВ стих й ш-2шинй ВБІДНОСсеиМЙ час ДНО
Фіг. 2865 ум УААКАКААМАМААХАКАААМАКААМАКААМАКАКМАМАКААМАМАМААМАКХ ї : - й
Х дююімх В ЯМИ ет ВЕ сто х Я х 1 За Х НЕ з Не и ВЕ : ' КАБАН КЕ МАХЖЕТЬНІ вужтвиХ ЗКУ ЗУ х : ке Я тах . ее ск Низьке З В ЗК Я ТУ Я х ХУ КОХ "ЩЕ ЯК ,
Що і вх їК я я х м Не М
ЩЕ щї ТЕЗ жеею ух. ї у й тез сх
КК -т ау сама їх Ме «ек;
Ж ху ех ВЗ КО Її 5 дк Ж ї в іт хх ЗІ : т З-зас за тм КО кумі
НЕ Ен форс вс ННЯ . ї : ї З ї т я о МЕ дк ХВ ти КИНЕ доти ттии «еннилиити Мних ї і! ї З я ! : ! ї в - ї : ї пиляння фе тиивти в
У ї- Среда кримі х ї сокоди : і ї : і І : ; а й : ; їх нн нн м Етиннн: У х ї і : й
Щ У й Е В : : 7 я «й фун фрнтнн и Де тир ї. я ВА ж Щ- ї ї : ї ї ду їх ї т ди ти ех щі нн сливи плоти, сгтяої, Ї Сх м х у : :
Кея ги Ох х : ї 7 Її ї ; шоКВ КУ рсткинютвнстняв Ше х
Хнюх БИ о Мирне ник оенионнетих ї : х і ший ї її | | ШЕ , ; шк ї еф нку нн днк ки лі вКЯ ї : і ї і
Ж Вп :ї ї ї 1 і і ї т зе рн Вркрннкчнн ня шк Ка дв н ШЕ ї : ї ї ї ож КО ук кн КВ й-е о: ТЕ «стусукттсс токсин ететого ясен ї : В с Зі | : ! я їх у Дфеєєєєсиєфттииии кни у ї и ї ! і : : : . ! : ї ї з і Дееееиет тет ;. і 3 х фо Її. м що ї : 7 ї 1 : і ди тофеенисестресессссе Кен сх ї Мекки кто ї. : ї Е і в і А ' ' х ; і те і футею ту кн кку кях зн Ї 5 Що ї і : ї і т : : : ; Диня ен ЕК і : З в І НІ : ' ' : ї Е ї ї З кнорфення пек ще як : о я ї : : і й і : :
Б Кк ! З ї З «дрннкяянюфоккккюкефнннкннинк ненні Ка і : Е
Є я | ї ' : : : ! Дек вет ння єкти фкннке конк. хо Е ї рифи Кетле тих нях : ї : і ї я ! Ж фе КОЖ хх ї ї а ши нити винний : х і : ї мя й ї ї ; фе Делимттт и жиди мин ва Б
З ни : : Е й ! ї ї ск дао снннн нн - 5 х сем х ПОС І ї ї ї І х з о іх М 8 хх г Ох 2 ї ї ДК пф ую Дллолнянйя Ї щі плн Ме і. ї й щі з т: Фах Ох ї ї : : їх ї ЗУ оленя з 3 са з шик ї ї ї ї ї ї : ї х У оо нія : щі зни и иа а ї ї Е ; ї : х . Як : ! ? : : о п фаниюртов я снА-Ая З : у ! : х | їх й : ' ! ї З Ще ефір М ри ї я сн еф шиеттнеян ня : Ї ; | . : | з : М » ОО ї ї ! дентин фнттннннннн я ї ї : ож "л : : : З : З еко ф нн нн їх 1 ЧУ ' ї : | ! : : ї ї Фен Ми вд щі не Кен акесенни кання фія песню де нення : ї ! : ї | | х г т 7 нн ооо аа ооо в свя кі З ; : се в т де ї ї ї : З ревом Х
Я В ху с і: х і ї ОО
М ? Е: Ж щ- де - х г Н , , ї Я ; с ї м х їх Т їх х х я З Ж М В КЕ КІ «й «ж Я
З З - ХЕ їх ГУ зх 3 З че У Ка хі Ж ї 5
Ж ок вх х сх х дик в ак мед а со с у 5 я В й Й В ЕЕ дх. 5 ТЕ Ж 3 їх й жк я ва мере 7 ВЕ й : ї Е
М тору ще КО х Ії хЕї х Х "
ДИКО КК КК Кк х чї - х т-е. М
Ж схожих МКК ВІВ Кит фев Я
Ж кормах. кизький Вик пита ну
ЕОМ ТІК МЕМ ї мим ТЕ
Е х Я ї Ж
Х їх т гу2іЗ «ек каре ї :
Ж хро ВЗ я м ЕЕ КВ : х ої МОЗОК ВАК КІ МК Ж
КУ : х Ії ї:
Ж сок. Мо куки : жах Хе Кк ВЕ Уа з :
На це ОНІЗОДЬ жк "а я гу с їя і же есеееетіетіійі 1 ї ї ї фу Би ї КО ї ї У ї Ж 7 ї ї : ї : і ї ї ї : 1 3 КО АЖ Ж
Ж кої х зх ї : ї ї : ї : ї ; хо
Же ї Е ї ї ' ї ї ї ї : Роду їж ж ї ї ї ї і 3 ї ї ї : ти ї х ї ; Е : : ї ї ї я ож сх а і ї : й | і : : ї ФВ ект КЕ ще у ї : : Ї ї ї х Ж ї 1 ї Ж
Мк ї ї х 1 ї 1 ї ї ї СЯКЯ 1 ї ї їх я ї : ї і : і ї ї ОМ і 3 ї хх ск ї ї : 1 : 1 ї ї ШУ Її ї ї їж ке я че Фіооодиткоси футтсо Мого адедаоо о поросо офтиого нн Ки Котов топок наннн кн з Я т ї ї і ї ї НК ї ї ХОЖ ве ї : ї : : : ї : ПЕ Н ї ; Я: дк Я ї : Ї ї Хо дк хх яко о Ме фесту ск т сек снеки кн кекс кт сс т с жк фі ї Ї Я ; 1 ї х ої Н 3 : КЕ
ОЖАКк У ї х ря ї |З ї ї й Я ї 3 ї ї хх кое кефіохкк ххх уки ках хх ххх ххх ххх ххх кА фоксих ккд сих хх кох ххх ххх сх хи й 3 З : ї у ї Ї ї и Ка : І ї Її їж дк : Ох ї ї : і З ї Ж. ей : ї 3 ї хі з 8 Ж ї : 3 ; Н ї ПИ ї ї Її ї хх ше їх форт ет кит ікси сн ду кит ттеефт о ут тететти й
Кк ї ї ї ї Н З Ох ж : ї і ї ї їі
ЖАХ. й ої ї ї 1 і : ї КО ї І ї 3 ї ї сх ЖЕ пф ї нн в в В ОХ скидки теки икінна кину ж. хе 3 їх ї З « 3 їх ЕЕ ї : і ї ї їж па ї : х : : ї Ж ї ї 1 3 І Ж пе х ї х. ї ї х 1 їх. ї ; ї З 2 Т.Ж ох ХО ЕТ А ями фе тя фест ку ато В фран м Ко вант фот фо оф миль аз а ОЇ ї х 1 : Н Ж ї : 1 ї ї їж ї ї ї ї і ї ЕХ ї ї : ї ї ї хо -е ї ї ї З ; З ЕК Ах : : і ї ї ї Ж жк ої Е х ї : ї їО-Е ї ї І 3 ї ї т я ї ї ї ї « і їх т ї : ї ї ї їх Ж ря ї х ї як ї 3 їх ї А :. ї З х Ж зе ої : пи 1 ї З ї ї : 1 1 ї їж т З но о КУ ї ї : 1 ї ї їж хх ки АКТ 3 Я Кох ї ї : ї КОЖ т ОМ: : 1 т : ї ї ї ї 1 ї ї т 3; хо т зх 3 ї Ї т. т х ї ї ї ї ТО сЗ че Б ж ще 2х хе ; х ях ія ооо її в а: З Ж я Кк Ї з 5 ЩІ 5 її ах ТЯ
ЩЕ 5 ЕСя а ЖК че люк ї ї хи У У З жк Ек
ТК у КК Ки и КК
Маки вщ: ЗАЩЕ ЖЕ ТКУКЕ СЮ ЗК
Фіг. 260
Її --Нкькний вміст писте ну --Нкзький вміст металів й ух со а - В Контроль
Ссмоляльність (МОм)
За тя ; : ї т ; : ; з ХК ОК и КО Трек евро
Цех нн а в ВИ ПО В п ВХ
ОЇ ПТК Б
Тр тро и арте ча ЗЕ рот нання фан одн нер рн рен фр ниняняфнннн я
ШОЕ он п
З ЩІК фон дн няня де В ня уютяио |і ння Кіннняфнянин я вфмяні що Уа г дслекіччнної тк і нентістт кт пкт ! т- 3 Зі «офсет тоек тен ДА хе денне фу сту че ек земні ки хе ге могг морю тех од нав хлів ; ! В ї
Ж рт : хи: : : : : : і ї : : і х шо... : Тд : ; : і : : : і І
Гак о хі что Й фену ню ен ут фе гри ї 1 Ї : І : : : ї ! : Н ще ГО 7 : Й : : : 7 ї : :
ЯКЕ У 7 7 т т т т 7 т т ї 7 7 в 34005 800 ЯР я5 З
Єерел. відносний час іні)
Фіг. 20Е - ре о у в - ї ер їх з « 4: 1: 3
Ж в НЕ хі ш В ФВ, Буда тих
М Ж Кут, Ки ик плин І т то 4. У З ннитю ХМ
ЖЕ УБИВ окол КАК
ЕЕ 2-х м -- пт мор и те дня ня нки ник М шо рія з до Б ох днк 1 КК яю
ОБО жьолу хх ЕТ Пи її хі
Вощох БОБОВІ Ом: бури з во з нити І ні о ї - Ех і: хі
КА я ее 1: М вх ши КЕ ї ї ше е й
Її: їх хі з ст шт «х ї ї У км пити ме кк КБ: ш ТЗ - ї ше подія І: в ки в кінтянях - Й : яти Ка о вс ж 5 ЦІЛ 85, о ут ен Юр и те ЯН. АК я зи и ис х ж ш ж я її « Па ай У о нан
БЕ ООН Яни МВА ЕК --ещ 5 4 ри Ми хі в г ЕЕ І ; Я І: их 1 Кене рення нні щоб те птрттетр
От шо обож чок мм сь В с
Е й Я 0.5 06
Е ЗМіеталі Нистеїв і: т " що ш т т ди ЩІ л- те щ те ; с Б- я шо ШІ " щкоаптрОольне значення 0 1
Фіг. 27 і4- і КЕ :
Ем. НЯ ту : 135 ин Пот НЯ аск ДЯ : ш-ш ЗОБА тз ЕСЕ дитккий дотику дужки і . Ж О1УСЯМНіМ 4 и в ик пф Ми о фл м им ниє о з с у ек пк ри прий
А: й г т хх Но 1 в : е ав. : В ! : ї Е : ' рт : 7" нн М и : ож їй ш ХУ хо щш ж МУ я- ще що 5 му ол М
Коха од) З - во БОМ В во кх ОС ее окт с я гі кі в щ- ча ча чи « подай о 0028
Їжу, ТЕ іуетуть Тзутатіон Ки тер
Я Тхтова А Випамін С
ЕК. лротаурнв, кислота тане .
Янка
ПО нн нн 100 Масткайні війни п:
Ко Й філос ке, т ї Термін ЖБкзнтай. Єганд. ПН : НИ ; гос Пюскухкіиче і
М дну М ВВВКА парна " «ві : : : пух р учи у т УМХ. зжкчжжяххюєєтучяххнухух - 1 Вичвіак. про відсікаєтис а бінууе на: ії БИ п пох я дея
Билріжок, но відсікається АН: Ге шо По ВІ ОН оБідвлюК, ; ЛЯ о шо ЕМВ ОО КЕН
І гаупені гіпотаурин сн І І аздуєууцинний і: во ва срок сша (Таурин, гротаурин. сен ЕД КОЛА пи Жи -БО ОДН
І іоктова кмедотв Ві ІННА: хна ооо з
Е ця та У ВА КО вдохна за по і БГдутатктів дак 11: в НК пох ояпляі редут Баян ее И ОВД і Вітваун СІ І аватанді 11 - сад ї ЕН КО ОТ УВ Не БР: айпоЖн пл паші
І Татюмн. гчнипауйниа синно дупи: МАЛІ Яра ти Ам. і вуржн, пнотаурни. сязднн Глутвтивх Га чп ПЕ 15: пДОзіНЕ а Ех палях!
І Тіоктова кислота вурамів поні др РР Не А во, роко ку ВвтнННя Є с аДдвВЯа 1: 1 дяки зпа 0 попдах: ї МАВ і рі ОЛЕНІ о СД:
ЯНГ. 5
І Термін феасттяй. 00000000 дтаня 01000080 бик! й їн ї-кхеф, мен
Коеетитстотистюттсодстттсотсот соток зшнез повЕЗКЯ соня і Нілдрізок во відстається ОЗпиЕН І с роти В В ВІЙН: : З І ОЗОМЯ СКУ Ел ої ЖЕУХухиии м. БМК ОКя ХХХ М КЕ
І орд вк їла 0 ЦІ са ї ї зупнній її ІЛ А 1: ої хи лах Ех з ашї
ПЗУ) в СОДЯ 5 ЯЮООЯВК, ї КТ уї Я БИЗМЕЕАК Іп опт пух де ие з «ложе «С Гіпотатрин 0. НН 1 ВН ОБЛ : , є хи, в ша ТЯ КК Ех : піт зх се фа ЕМВ: бок о ріки їх задовк : Ілікнн СО ТКЮ БІ ТНМК ВІ:
Її практ свя пт ох МІК о Ії ах Кох ср : Такт ОоВО КВОТИ Щі і ДОЛЕ ЗЕ І: 1:11 ІІ ТВ ОВ: ї : ру ї суму ОПІК: 1: дк ки сх ск, пожеж і ВизмінЄТОЛі МН 00 ВМО БИ : . ен ІІ 11 ОК х хх МАКИ МЕК
Ж трдутлевву со втючцнти Ще иа п ОО ОБЛ Її зк ках й ощ й ї і Таурин тнютатурке ОКА сво НО ЯаТ 0 Ме: : пе ММК сотої МІК ОЗ АРТЕК Ж ЖК о. с «Кн - РКК о НИ ОЇ хх т шко ог ої ії іївурни тювктова вислюта ЗОВНІ і БАН Я БУВО: : т 533 же зв ниовия І. о НК ж МАМІ ї ВУ тт чі ЧІ тт с Б: їі пах ЗЕ дяді
І Тахурня вітамін ї; са 0 ВОК : путасу тів до ект Її ж кю 1 12 1 111 їдою дю по щем : Гіпстауркнотіоютова кислота ОЦ ВІКНО Б:
Її Гіпртдолчзут в кіткків бе доня ОС ЖЖ ОВ м сел до пої ії Генотауркн вітамін Є БМ И ско ЗММБОНАН В ВІ:
Иищи З я с пОКуКХ БоподолоОМУмию лої ХОМА м яке ХУСКУУЄМ Її ї ретеуво зоре Квоти Ка ИН дода і Токтова кислота вітамін НМ 111 ЯКО ВІВ:
ЕЕ. : Ж З сш 011 МОВ ШУБА М ї срок рі Кур улєуюовх б ам 1 Жим хаю м я й з. ж ї : Тауркв "ул МІ КК гої КУ х п м жж ух оте виде: і Гідтя оси кі 0 ВА мита ВМ і Іепотаурнногаютаурки ОВ о БНВО Вл? ї стітх Жтлі зх ЇХ м вужі СЕК ТИ миша Ми Мети у і Іліпкн глівке доми о: НИ ОЯ па:
АН НЕ 0 В КК ляти КС он МЛК хх їх ОК Ви : 18 Я ТЕ, : як 4 чат «Ж ТЕ ов пор, : ж 1.5975 Мк ТЕ. З щ лаз сер УК та тд 8: ТлУуд. Ії 5 гуд я. пи, :
ОПО БЕСяй Н. в ОБУ, іх зт
Ж А діа 14 бе К заяв 1 доти
Ж О1ННК г бах БОЛЮ тк 7 р: тий. Ж нфроннянннниняяютт ян ул, в т й в В З 2 4 8 8 4. ій Ко куусттхутт тЩег
ГіпотаУурни шко
Фіг. 280 в
ЕЕ 5
М 5.
ЕЕ
Жив
ВВ. юку 55 р ори рин аконуанонннннс ж Їх БВаІ Ат : щ ГЕ КЕ
Б Ж ОВ пісяє 8: : і г р Е
Ж жах 15 МЕ, ак : . НІ ро г т ож ШІ : рани спите ї ЖІ «и пити ї же ОЗЯОЯТМ суішуки луки ен ВАЖКЕ ккд НЯ,
З З ст ялю ЗК кв я По А ек кто ково А НЕккунус т До КК ВК В Му т ЖИ Кк ХК Мак ш дверки СЕМ ТЕТУ МИ КК ЖЕКи ПМК ж У тлу беж МЕ я фу ; укоготосоонтосегенх У рент Де ее т ка а ! а Б з
Б 0 пт З рено ДАВЕН и ів
ЗОВ охазеюи ря др ДИН ВНИХ КО, мех е ня княя
ВО ЗВ 1 : п її НЕ Б ! як в ' і ШЕ ї ях т. : й с ї ж-к МО дат умдесму антену тона ето нд ан пані аноді она ртесуаацно Й ово поніс урни гі: 11111511: ! ї з
Мт чуєхажієчиива МЛОЖТ Кар КЕН. р ос ев иМм п те ТЕ «ох ТТ : -Е то жЖ о жх - хе Ж ді ль щу ко жави ! 7 ; пуд м м
ЛЕО? БІМОВИ ВІН Я й
Тахрино Гіпстаурнно Глижкн Готова о Битлвцн о кислота
Фіг. 28Е
КО жатичя с тт 0 пе бе ХВС1 А МО, БЕХ іа хі п ;
КОХ туя д хХНСі жк ВСІ Я, я ПВХ
Ж ох рвуть с тт х
ІХС Ме :
ХЕ ру стю дк і БА ХНСя ць, ЕХ
Тищаіглі Готи с тт я ОК б ХВСІ- Мо ;
КЕ ! і ! 5 : ! і ен : п Ї ! Її т т ї 1 : т : 713 : і : і : 1 І і і і 713 в ' і : 5 : і і одн і; ої і і : Е : і : п ГО 0-3 : ! : : : ї | і Ж : роті - КІ і і і Я : І Бо Код
КК | і і т : | Рон ою дик о: ! : : : ї і НИКА ; мс ї ; : ! : : І ї і 7 т у і Х пр нят котки межові ес оо с нн і
Й оефееннійехенісннснодннннтююентіня ефек йехенкотнфнуі ДК фесксене пн
Ко | : ! ї ОБЖ со ах щи ; і І 13
КЕ: | : ! : їегу да - ; : І 13
ЕЕ: : : : : о ПдЕ Ки ї : : і 13
Кт 1 і : си йих : ; і і 13 0 ее ши
Емо зд : : і : ; : ! ії : 1 і : у ї ' : : ! ! ,
В КЕ ЯЯ п ват : тк што рн
Серед відноснин часілні
Фіг. 29
СО ХВСІ ЕЛ. ЕХ
І х Ся я й. ХВ : ! я ХВО ОСМО, ПЕХ ! ХхВеЗ ! сЖЕВОЗА еВ, БЕХ
Життєзлатність а) іа хво ча і ХВО і лХ го ! дах; ле Пак. мк ВХ а Б ші то чу чани чн лох КАК ОО ЕКЕ коті кулак су ех хе в шо ок- -ВуКаННИеВ Вікно ХДАК ен А ни
СИ Пи Див рев : : : : : ; : М я : 4 : хв й 7 й ї : т ї КІТ я прин х х х ї ї х ї тю й і РУ : Ії де : : : : : : Е Рота, і Ех : хі - : і : ї : : ї і Мо Сдо БО І тах : ! : Н : : ї : ги З : ще : ї : й п 7 ї от к : і : : : : : : А га тр фанти ов няння пеня Батон іже рн тр : і : і : : ї : ! БО рак : і : ! : : : ! ї : я : : : : Її : : : БОКУ :ї : : : : : ! І Ї : і : 5 «5. с А - г хе ся їх . й Її 2 й ж Б пише жи и п я
Ж нудту : кт Що дже Я їх
Серед шлиоссник с дн
Фіг. 50
Тит тт 1 Кт іо всі УМО, З БЕХ і с ОХВСІ Ме ї а ХВКі 1 У щі Я: щеотуттл і ха МО З ЕХ йо и тщуи тьлуУх ба хо СМо з шт із ХВСЗ
Товт п ТІВ ух с титя іс ХНоЗ я СМО, я ДЕ 1 тео. тт дих 1 ХВ я, жди ї
ХК
Та пит межи хори: ЕК пет іпдраюунок жнтІсєзлаЕник клітни їм КЛЕМИ - : ! : і : і іх : : : І і я х 1 у і і То, 0 : ї : : нак ШЕ В ши куми ОА і
ЧА слаілллялллллядлаяллллялалі тля фляялля ія у свиня же ШКАЛ
Пт в вв т
Я еДеснйттнх то певну оф Дек ут ну ек унннн ен етно і пеки 1 : і : : ще ЯН ПИСАВ НИ СК ' ї ! і : : МК - : у Н х с хх а ре 515 ї : 1 Зх. 3 КЕча 1 ши Е сю 7 прив див КК ї | : У я Вояж У Н тю х нн рн Ж нн Коен Вс : Н Н ми ит : Бі. ї 5 Н : її
Може обу снн ккючкмчнен ЕВ нти роя оленя Третю яд нютютю ек я : і : СЕТ ж : ї ; ши роя ! чі : і нік : ! і осей рові НЕ й : ї ТА хі ? ? ї : я : Її пута в ВСЕ ля іл клллллллля ддлллллллллдллллллллла в лллллллаод лляні в ов тра ре я еВ
Й моб, Ж олію хакі хтахт АХ А ХААХАААА МАЛА ХАН АК АХА ТА АХА А МА а аж мл - : БЕК : : : : : : : ; : ! - обои ; : ! : ї : ; : : : : ї 7 ! : " : : : : Ї : Т т г т в - . е - з : і с иа т « стріт ттії тт їеред відноснин час іні
Фіг. З я, су жу
Стуса ЗІБ: ількі ши КАВИ ЕЧЕ Я Іво зЗагальна кі: зве ори т іч ІР55О загальна кількість НСР БЕЛА. р НЯ Кк ее Ще й
Ве ня ее ко Е
Б Кк -- їх з Е й З я св й і х
Ж г с : - я -к х їх Я
У і їх їх ї
Бош ж Е хх т а Є ї я ш к
У пе я - Пе -щк х -х щ- г панни ту г роде кто дит
Кк а снннссня сен кх Її х . Н т се 1 10 !
НН 155
Ж Гу 1 ке вдо тече тя 5. з
Я гзаннпат ЕК біщшті з
Єтанларт НеСв нг - «х с ї г з
З Х Кк х-х ер - вх. -
КО ШИК ЕН КУКИ ПЕ Кк ою вою кю я- МК ЕЕ КЕ В
ПК СПК КЕ ЕК СТВ
СКАН о в до ВЕК В КН КК буді рек и ни нео ПЕК ВК и ПКТ КОНИК
КИ ро ок КВ о НН в Кн жд кн в в в:
ЕЕ фак и НЕК КО КК и ши п. КАК Же пононнн оянх ВО он дн в в в Во КК
ТЕ: КОЖ ПДК КЕ КК КВ ПЕК КЕ и і ЕМ М ПК В мк КЗ М о ОК мс
Кі і вн СХ ЕК
Еш и ОО пе
ОККО ОК оо ЗО по с КЕ ОК ОК ОК о о ва що ОКО ОКА КК У КИ ИДИМ,
ЕМО ОЗОН ВХ ще ха я
А В КОХ Я о ях я Се в В фі Вени хе М ЗОН
ТЕО о ЗО С М КК ОК В м о. МК о КК По КК й
МО ОКО и по жу ОО я ши Й кю и ОО о о о КІВ «НІ р о КК В В КЕ
КА ЕК КК по
З пі о ев фо Ко ОН ЕК
Я п В, до ШО КВ КЕН в ОВ зу р ОК о В ОК КК
ОКОМ ДИКЕ КК ОО еВ
УК ООН в КН КК свой
ФО поши о ВККо ПН ; ВІН КК К Ш ШИ , ЕЕ и пий сл Ох ща о Ко ВОВ
ОХ КК В КК КК ОК
АЙ БОМ Б З
ВКМ ОВ МО М
ШЕ ОК о КВ
З а КВК ЕКО о я СЕК
ФО КУКА, М я ОКО
А КЕ Ки ЕК я пн з НН 1 НЕ с ЩО:
ПК о по ек В : Пе а пи ПЕВ п
Пн В пн
ОБОВ Ж е ПЕ
Кк в
А: БЕ оон
ТЕ сх зииженОо
А - а й к й У в: ї С 1 Е і 3 ї ЖЕ їх Ї Ї З ооо оо ко о орконо вк ркноненюн пом есн
АК ЕВ КК КК ви в НК В НК ЕЕ КВК с ВЕН НКИ НИМ Же
ЯщИ Ми в ЕЕ
ДУМКИ ДОК ЕЕ І КК САКЕ КПК ЕК ЕК КК КК ВЕК 3
ЕН ОО В ВО ОВУ
ЕЕ ДОН АВ ВИК ОВК ПК КИ НК КИ МКК КК о
ПЕВ ЗО о о В В о В ВО в о о й хх ДК В КК в я
КЕ ТЕ ПКУ КЕ М МЕН КИНЕ А и
ШЕ Я КАК дю ЖК КВК КК ВКМ ИН
ДОК КК и ЕЕ НК КК он А у МИ и ПЕ о ВК сек ВІДО КК В А КК КК В НВ Ки СО Ед
КК о в М В ОКОМ
Й КК Я пасе МН и В
МИ А М М МК
В Е р ОО х Не
ЗК КИ ОО ЕК КК
КК За СКК КО с Ах соя с о МК С 3 ЕКО ОКХ ОО ХЕ МНК М со
ОКОЛО ОХ ТО ОМ МВ ов
БЕ ВИ ОО МЖК но УМ В КИНЕ
ВОК М ОК ОК ОО НК
ОВ о ЗОВ ОО В
Ж КО В ОКО ОКХ ХМ Кннии
КОКО ПЕК МК ХК ОХ ж КВ Па о нон пня КЕ Ха кг КОХ ЕК КМУ ОО «Ж КІС КО В ОКХ ОК
МКК ПК КК КЕКВ т
М ЕМ А КАНА
КА ЕК ОВ ОВУ
МК КО КО е хг ХОСЕ М КНИШ ЕН ЖИ КК КИ НК МИ ИИ
НЕ М в ОХ и М А М М х ОО и «кт в в р Кв нн п в т я КЕ МК
АН А о
ДК КК КН о
МО ККК М КИМХ КК сх Он ОВ КЕ яром и о м ОВ її: МКК КЕ М КК КЕ т ПО В В В
КМИН КК АК КК КИМ КК КК КМ КК КАК
КОС АК ЕК КК КЕ
М М В
М В М ще
КК о КВК ОК
ЗЕ КО КК НК АК А Х
ХВО АК КЕ А А В о ІОН НО
Фіг. ЗА
Е МК ок : Е Дитя
Женя ШИК о ! Порти а М ей и де сен В ши . пи
ВИ Я бо Копонка 7 сн 7 ОР 8 Колонка | пу ОК - 4 - ПЕС Кия А м ва: - . СИС вини ОМ й Ше ОК и я 2. Ол СУХУ НА ХМ
Е п. ШИНИ КМ иини ОК. ще І х : ї
Завантаження КЕСМІ ШИ КЕСМІВ КЕН т. й і Хеннятну диттнння чи
УБОСЕ Мни-нвр УБОСЕ Мив о ігярв, даопююоки влюйований із ахремих
Фіг. А
- тк У от Кия.
ВО
Я. п ке ОКХ Я ми ОТ г БО ШЕ 1111 с шик; Ми 111
МАЯ ВЖЯ КІ 1: ве КЕ МО ОЗОН я-ко х о Пе БОТЯ БІ 2 Я т ІІ І
Гай й Моя. мок 111 з ОО ОК Х !
Що. Я ках. з ж 3 У ш-е пт
Е з соту Ак 11 я ї ДЯ ІН - ШУ Я р М МІ - є З ока ленню 51 -й я фл ше ях Я Мі Ки 1111 - КК ТУЯ шим 111: ня Кит еЯ С Я Б 1 - ї шик З що М М 2:14
ХЕ т ТЯ Б мм вк Ул ск БТ 1 ; Ми ЕК фея би гу БІЙ Ко 1 шЕ ЕД: Ме МА Ме гг ОБ; є оо м КВК КК, я 11 й ШО ОМ Кия Я КО
З пе я зи В Ки й МЕЖ БР: - КЗ БК м рр Я Я БІ шт БА НІ я ие ши Ки Мк А БА фмя Кий ЛІ Б
Хай: п я і Б ВСЯ ЕК ММ НІ
Ф КН ЗоКир гі тя ВТ) Б ЕМО 1
Що х : Я : ї т Я : ! . я пе ик де 5 че зе ОВУ В Е- я КІ -- . - -х с що Й - щ-- шок ОКО - т де ТЕ ра я, т р яке Її ЩЕ ї т 4. . х - т чо з м ще: но зе сажею ле щас щш- ще їдо не т-Жй ; я -- т. шт шт - т хех сх пе - щ-ї щ- 5 7 . що яке їх як а --е - з -к щ- ре - тк пе п п як -к ще я - - мк Ж я ж За В м щ як як як дк щ Ен ШО х : ж ря -к ре яко щ хх -- - 5 Я т ї п. -к ЩЕ Кк --к -- ж щш -
ХЕ т т Как щ - - ГЕ Що
ЩІ щ Ж - Ж Ж де ще еЕ й 5 -ш хо: хах -- як --к - ми У - за : сх -х --- их ик щ- ї с З а т я я ш ш Ж й 5 г не ме 2 я як - а я ї т га те - ь КЕ жк ще як МЕ - -щЖ ооо щоо - - - - 3 КЗ 3 її - ще їх ї
Фіг. 35
ІС. же
Повнийсглядо 3... злети шо . ШТ МБО Мі ттар шк х ї ні ре 1 і рот Блюдт колонки З ді ; Гененнтня Бпюдт колонки З - ШУ ВЕ . й МК ж ти Кк т 084 й х ! й в ї ї я З - 08 і х і; ж - .
Ко й А їжа х ? ! і ін ак Ех до
Ж І п ОК ЕЛІТИ Кат в ни юки вий рудах вк мижтся г оо й 2 4 5 В 314
Часіхві
Фіг. 36А рен : чех | хек ІК я т
Гозгорнутні внглял о | УБЕСЕ Мним-ікяз
ОД орендні 7-х Етюат колонки 1, ж . ЕЕ рт Елюшт колонки 21 - : г : соя перитечттиту З - і є рення Бштювт калонки 3 - 0б15- З х є Ї щ- З я
Е н ж ! ї ж бо і
Фо р -. КЕ ; ж щ- З и - я Кк Е: Я
Ж хо : з ! в ОО ї ! -- : х з ве ; Ж В з: ї ве і КО, щ а я
КУ чих де За шо онов Пі кі я й п ПЕК КК ект Злі сен Е зу «-к її як У 4; о я 8 б 8 ЩО 0015
Часів)
Фіг. зоб «а ше У, как те а ЯКО ОО УБОв не са ще - 7 с ж
Кей до кА М Ко хе .
З -- ж КК їх ЖЕ ее ка ож я ох ой. же сь о УБШК Міви-Тувр ж -кх я вже ЕМ о
УК ко КЕ Ку пе ММК ШК Х, КУ
ЧА их ЗО КК Ак и же і рр ер сет МА Мних МАВ пе
ХК Х ККУ іш заншаче о вуроже
ЩЕ с ще нако УВС ВІ пидВі
КН КА І ще УА КІ паАВІЇ вія
Фіг. 37
: я от ди свиті я. чх
Блювання колпниев (СУКА Жлюзеавання юоланжн З сь їх с пе тям ри Зх. х Заванит. жаетЕЗЛЬНІВ ДИТЯ хх ФУ пре кк о куккУк т ксют кс, ЩО нн нення «о КУ х
ДО отой ОО дну доп ї й и Кф плафон ре зу еВ Ями ж І ДУХ пл ум ТУ ую
Ід І ї Ж 1 : 5 є ї т. МЕ кое : ї жом х - Ех г ї воля ; ї в У - ї й ок кидки ск я ї що е ; Кнлилиснндкжх . шк рої ЕХ Б оф тотоокім ЕОЯЖИ 4 Декрет фо фо фл хВи Я рт песо фей
ДЕННЯ 3 ї ше ІЗ ; В Де 5 2 хі ж ДЕ кр НИК Як рхиф св ШЕ ОМ рр сок Кок ти
Е З т 7 : ТЕ В Е пеня ВЕ х З З ж те де ку кое меми Ку к 5 : 15 5 х : с Я Я Н
КЗ Ве Пн нав ання рю ях Ж уукооофотиття В омоютткюфетюютю сс «Ж ДК ф осот юю дою
НЕ КК кут фут мно ню ЩО 0 Бордо век МО0 боком
МУ ВМ ЕЕ КЕ КЕНЕ їх У Мф МОУ МАТКИ КАК АКА ПЕТ М а Кухукрхрх ер крути Клео ук ук ук
З Ж ІК Му шо ЖИ І ВЩ Б ООЖЩ МЕНЕ ВОК Ж ЕІ КВ ОО БК ММ ІВ ХО ЖІ ІА фуд с. г? ев юркаих на г т асісектнанх вх сек тниК тає ісекжвав
ХЕ РОДУ Ху гару щ ДК ск клює,
НК х - -Х Х
З ТО З ї й . х З : Я : . - - Х
ШКО Кн ен Ор ВК КК КК КТК Ж ПВ оон КВК кВ ск 1 Ж ШО ї Х
Ж д-ї її: що Х шої ЕД шт ї Х
ЖЕ офоодюєсрооуо юс роко кою А ХК КОКО КК КК дк х «ЖК обохюссрову юр о оо осро росою юс оросоеХ в « шо МОЛ ООЩУ ЩО - жо тм ОХ ще ЩО що КО ню ОМ ЩО щи 55 ще й Зх о ях С, ЛЯ по шт КІ а м КК ех М КК УМ Хе ро "7 Ах, я лк; ПУ х. ху Я, пе ПЖХ
Зо-хо А шЖ ОїХ ЇМО щМ о 0 ЇМ Їх око жо БО ТУЯ їмо ЩО ЖМО ЦЕ Ос Що дк ЩО ЖЖ ФО ФО дм ЇМО ли Ж
Б ж Б ЖОВ ОВ ОО ом о що що МО Бо мою Б Ж ОБУ хе. ча чзЕ
Фіг. ЗО
ІГ. ми тек
ТЕЙ. ле ренернньм ми нанні сиза піша : ! 2 ср ка ра я ; л й оф в 16 - шк - с Га ат Е те С гри и Ох З п я Б те ор чи яв их за р МУК кКО Я Ки 24 Ки й ря що ке Ко ти ри й УК Бе шо хо сяк з -й ! жк В ї ре кер ЕерЕхя усу; РУ ру вже в я ККУ а ЯГНЯ
Б : С и Ша З Ук С и Ки і ї-Е сор Б УМ р М реа й 0 А со з я во їх і КМ КМ і ЯМ М їй і Ми Ї- Я а - 5 БУ їх їх ше Оса Ух ти ЗК раки р ех ЕМ БМ ! ра ре КК ря Кк
ОТ г КА КК ЕМ м ря ки Кий ач Ма Ех я и хутр рея вух ор хх І КК Я КА НЯ и ге; в ЯК МА орав Кк че Ка и р ря их ре З кер ЕМ р ри У я ; Заяв тая я я я ав, 1534 125755:41235123341:514
Мотя мети Метт ти минут
Завантаження Біромивання Блют Промивання БЕлюдт
Колонкзл 1 Колонка 2
Фіг. 539 ери х яТТ т ТМ Ту т ; тпс о овубуттшюаж Криті те
МЕТОКЕНУЮИ ЗЕІЕНОТЯМ сеоваІИЬ БУТОРИОІТ: КАЕРМОТЬ: ОКНОІНОЮ БАК ІІЯКВІ ТККТОСЬТУВ пек Шо
Діка МЕН ЛЕТЬЕРОЕ ІЗ Уько ШОАКТЬ: КМОШЕМНЕУ лОеКНунеАІ УВОБКТ : с У
ЗМКЖИТЬ ТІрОАЗОЮ БСААЄЯЮ ШИКАНОТА УТНЕКОНТК СУБОТА 6 ин, важко жк ОМ Цар інте з ще МК УКОЕ КТ-- в: А / ий УБОК КІ
І о з Кох с фкрижх вх : 4 і
Фіг. 40 ле нлржляюн кед виткі Бенкет шию в тт фі
БОКАХ ММ СНО Ве кБНИИ М еВ Ме Й окре тен се ев шен сикете се 1
МК ОО п о по ве ве по г ще
ОН БОМБ БОРНІ ПК МБНЬОсо собозоєоєя сохесоос» ехо
БАВОБЕ ВЦЕКаже (МІН: ВІАЮВ МШІЩАКА ІОБКХ 1БАМАЬЯ ВО) Кк кт рт корт тя тт тот яння В пня вот вт ов рентою АЛ
СІК ВИК? орав он ДВБ МЖЕЕеОКК свКУюю5 КВК Я
Пн В а - се в тек тт : М сесенетття КО
На к ста вм репо о ПВ у / г ЗК.
Ми Повне ре Ж Є КУ же
Тих Тех ! МЕБЕ КАЄ Е5 -УЄСЕ
Тени Ж регомі ЗІВА Ук с» ее
В . їх і х й ; ві з М :
В Мле зна : дит ІА К с зжлвтА паза МЕ КИ Есе х Ж ї
Фіг. 41
Хбльшеня обазсть нЕЗВКОЇ молекулярно маси
ТІС вивідеова яналізт ЗКК-МУ по Форми з нЕТЬБОВ Вхсяхе Е з Її Мт й Мк меолекуля риски маси її ї її Щх дення нт г
Бо ЩЕ ЯМ, г : ЩІ : ші Ах 1 ЯК вхСатЕ 8 Пн ж 45 овквнвкввкттиия дек с кжнннкх її в Б з МТ х 1 в
ЕН В Ще
ОБ ще М г в т "х я о 7 . х ї ; х Й 4 мах дж ну ша ши 3 5 З ж оветстжю мити Ко пнлнян Тон коли ше
ЗО МТ 5 Кі ї : , З у 4 ненні нен тонни В Я нен рення
КУ 12 14 їв 14 ; 1 7 0 Чакітв) ї Засіві 5
Фіг. 45 ї я з яд
Жов - Ж допит м ОБ СХ ке апа й вд слон У їі ЗА е ї їх йо
Ті ї іч я і - 5 ОавВ 5 У й її З ке га ї а х х и Ж. «2
Боба ТІ | «ОМ.
Ж З те авлви
Ж 4 Ддеж В К Ген
ЕЕ пи ї й ка деЗОоКои КОН ж З зн чк - вгбдеих г 45 ши З їй пе тглЖжаця щВБЮ МОВ М Я о 1едев В -Ж
Ж ватТК -к З се я "Ж чем А ІСТ й АХ ж ї ; З ; КО з
Жоден т їй ТС ю БОбеє т ть пасм. т КА 1
Б ас0вн7 3 Я,
Ум їз -паДОКСсИгпюКОЗоН
Як З Ї бокові ШКТ і г деку її о зх ОКОМ Люко М ядрі су З МеКіНцевий ВБЕТОКРЕУЄМ «З чіз5а т «АНККІ пі 43104 49373,5 їх" Я» . ре х Й з ко ї ТА Я 2 ак . ї ' а Я Я де--кеКацІяЯ
ФЧиг. 45
БД Я й ду
З Її М Я с
Зв я КУ ща чо
АКА Х ї я й ; чи ше я япдахтт Кр МВ 5 ї я ТЯ дн ЗОККСНЕККА УДО ювх
Ж сват р шо МКК 1 тая шк 1: сени СЯ
Ко КТ ще З КЕ тяжаке іддвнх Ех НИМ ЯВНІЯ У я : РОАОЯВЬК Що ; ! . і дя яких ЗНЯВ
ВНУ й . року рококо ую фокусу рол рн пак тратити торлксиКудпкку тин НК нйнидсккюиюкукиюмнку ріг. 44 мм 00 - нене онннененннннненннннн ! хІЄ ї . і ' ї . Я
Ух ї НИ ни г
І ш : ше 7 нененнннннннннннннн чемними і і днями - з х
Кия . ще . ще , ще о ще о ЩО о ЩО о ЩО . НИ їх з МА , хі дк Ех г ща тв га . їз В 3 «й І З і. і х - ї х З » че . ох до Ходи у - і: «о Кона ко тк п Ве Мед тв основ Кн Ко Одеса ноовв оон о З н В дкіммовао - ж
В ях я хі Омум ї КУ
Н
. їх
Б ї ї х во» з . г ; х
З - Я хе я т з шк ж Жедуиюиов
ГЕ А т Кук пк ьо
М ї Є МИ ї ' ї 4 їі Форми З нив а 4 : х малекуляихнока ЕВ
У 1 й 4 ; у дення мианнтннм, тих - . ; хо РМСаве Е
Й ве повій рані тв інки оно рюнкхонюодикноотю сон і іс ііі скіни квт
Чад їхві
Фіг. 45А
Мід
Кічее з м Тед
ХОЛЛА Я дюни
З . с Іа з с щі 15 Я ку зба М . ду і
Й 7 БУ скив ков ху Ах М к
Я зга к 1 З8В т.д Е
ВОЯКА Я і ке й
З Я ї веш Кк
ОС КОХ Х М п
В гає І ї-й 5 ї Х і то я. їх
Ж ялинок г Жиїтчені фара ї е Бу щт Ї 33 : І ек ще Я рн описаному уні дннк я ту 7
МЖК Кт : : : : : Вище це лугветих ту ках стору ект ск кг Засоерх і згм Зм Кр з2оагпй
З ЗБЖЕ ЗВ ЗБ ШО МК ЗОН еВ
З па т : :
СУА К ОТ ат у засів тез
Ман В. с :
ЗЕМНЕ ФС зкщо кллюцю й я Ед Ех
Клин Я і Козак Кт щ Ха ре З 1 ок хя
Б ев це ол ІЧ
Мк ї рої ех є 3 й
Ме Що
Е ФАК й коеф й
Да В г 2 пи то ї й нн нн нан нон нон ні нок нн нон ні пік нок нон нон не нон інте
Кі й МЕНЕ НУ «Жрннкетвнкит т тунтрнн вн уявно нннсннннунк рн нон, оекенннювнюєвнн, й віск т х щ ших ЕК вАхТичН 5 мот ження жа яти авг Зк Яд
БК КО ЧО М ЯКО ХЕ 8 ЖАХ тк ка
Ве з Ж аятив 5 ЕЯЯЯ рана зник З Же ММ еАйАЮ ТІ яї М
ВЗ я НУ
В пу КОХ КЕ її . .
За 5 г її з п тТЕПЕВОІЯ
БОНН 3 - НЕ З дехзиситлювюва нн т 1щре5 З и і оо : КО онА дезоконтдахюдватх ш ІБН 5 З і спе ж х : щи З дати зада:
Одрі. сода А я т щ дов ск : - ПАК З | КПюловнна ватекут їй ІДЕЯ зі ш : ї т х ки али екК шт ши січ дм АКА ато оаїУ: маша лайф Яка г
АБ ше АЛ ЯВИ МАХ ЯщЯ: ЯМОЮ СЯНУ МКК)
Я ря й З
Ще ЕЕ КК гі З да З М г З я ВЕ гі 4 ЕН «пр Е
ВО п 1 її ! 1 Я З
КТ і ї З 4 і у і : ї їх 3 ще З Її 3 НІ оті 7 х 5 я / х
Ж :
Ж 1 г З
ВО щі плоті ;
Фермент ГЗБВАНОАЛОВ т г : ї З ва 2 К з !
Шо в - З І З 4 к є 2 т ж З що но : ї З 40 « о : х З
І ; й ' їй х де 2 - 2 ь З ж ж щ : у - 1 4 й н фррннетеетутете сет ттееттт теоре потопу ЕСЕ ет ето Тееотесес стерео сетететстстретно
З "і їх 13 КУ 15 їв
Заг іх
Фіг. 46 па ЦИМ 1 хі й р! 0 її о й 4 | ПИ
Їх ше
З КЕ ї М У - ЦО з дятих хе а ЦМНАН
Йї -8 : 1 ж З ще
Е ща що
Е м ро
Е -Я г У д | во --- 3 Е ; ї Явні цк
ТС М й 3 гі - Е : 1 Не Форми з низького 0 НИ молекулярною масою -З З ї
З ї У ат п - 1 ; ил нн Вуд ЕЕ 3 щ у Тк вом 2 з 48
Чає хв)
Фіг. 47
ТВО сх в іще ше З І і
У і ; ї ще - Ї ж ж хЕ в МАН : г
У 7 : х я : : У - ж гу ще - «пл х ЕІ сде т жк ї зас Мт Ах БАМ
ЩЕ НН т - : 7 х - за
В ба ОВО ЗО КК Вова КУМ КУ Коха КК КК ОКХ ДЗК кокон хну пе: м ло,
З 2 Форми з низь ню ке З с її мечзекушнранозво зезсак»
ХХ г ї ко : ї ча а . і не й х. з БУбхазе Е (а те я р-н мий пек ЕЕ КК тт тн нн їв 31 р її 14 18 «зе їхві
Фіг. 43
ТЯМ над, ! 00330 НС па 1 Гоповний пік ! ати | й ше О-глікани й З р й
З В ! 0009 І :
З І; і 1 Н ! о 003 н ; во Й 0005 -3 і ї р : поля ПЕ ;
ОМ і !
З і 1 НЕ Неповне ще і ї ДВГЛюЮКОЗИ- : ; і о лювання пд РМбазе Є й | Бо 1 й І: М, шк, адод фр Мнений ! с о 1556 І.О 28.0 о
Фіг. 43А с. с пз я.
Я ; Ти «ден з Головний пік
ОМ
«у пе Жах, ю в ЗІ З ЗУИВВ з ту дик вк роз З Яке т
З зла З і
Ж заКшВ се ї ех пад
Оу . ї
Я ;
Ве є плей ;
Ж ЗААКИМКУ ї до :
З па ! діт мл ;
Й ОКУ НО сення ПК КЕ КВ КВ скукккниннкуккхю зхвкю я дея зай хор «тк кер дай 00 ла до х
МЖК ПИ ЗК ТК ЕЕ ЗЕ ЩІ М ЕК п Не ВА ах мМ ак ММ ВЕК ях ЕК панни
РОМЕН НК як . їла й ч с Я и слиз Снгпікани В од кеди плит
З пов т ХО ПЛКЖУВЦМНОВО КИТА лук ГА паї коденті А о ойме нен д Вода вана ТВА ВИСЛОТА ВІ Дві
Б з Ї ФТАНАЖТВА 80 «ЧЕ Вод | у ЗнорКмм леї : ШИ ї І ЕХ ХВАТ ЧК ВІ тні що ї КОКАЇН М - ЗИ півня - то сив омваА! дя о Е ТИВНІ ОКО т фон с оососсос осо ріюосюсососсв ж ОЗвато атвені я ша бе їв
Ки вало її жов м Ж в ї ще І З В Кк ЗА й ие т з Ж
Ж оодеет я Б гькаА за як КОМІ ІН ДЕ Яудхо -Е У З бо ї «плато ТОН а дови МО р
ЕН НЕ ЩЧЯ ЗОНА НЯ ЯК дев кк ї
З 3 ОК Ти ММК НУ ЩДН х
І І суч Оп ТАКИХ х пловнь сені я о о ес ом но ться 3 пекан я 7 т з е т я я КАК те САЖА СКК, ско да авг зве плн ї :
ЗМО ДЮ ж ЗБОЮ КК ЗК
Фіг. 4902
Кізима Урі я я
ТНК РРОСРАРЕМО ЕМ, є я
Тука 8 Кк Я Я
І зт ах для пуд КИШОК,
ТНЕСРРСВАВЕЦ В УБЦЕ ВТО Од НЕс ді і х о. оби "МКК КІ яд М, ву и
ЖІ Га ші у Ж
Я Ж режи : 115 Зеник І
ТНТСВРОРАВЕН В кок р мі БВ я вер он о ЧЕМ Іі У УКОК ко
ЗЛІВА М Бей й я ПИ «Ко фи ек в
ТНТСРАЄВАРЕЦЬ СІ ша и Ву «г
Фіг. 50
З хх су
АУБ ЕВІТХЬК у х ще- ІЕЕ я Б КУ у ве Х ШІ
МЕ 5 Ж «о» ЖЕ, р" ЗЕМ ж
КЗ З я й, АМОХВ о ї з ще т в'я і ; а шк 5 З
КЕ Кг і ОО Ї Ка с Х ХХ саму і ху Роже їх Не
Я одні ЗК УМ зовано яебма абсо ковкох ще
ВМ, ко ЯКА РО ОЗМТДИВ ж В ЗЛОМУ і в 7 пи
Же. ши
ФАЗ уч я м КВ ХеІя
ГО . кода й шля і кл МИ і й ; :
Е зе желику Каті поса січі
У 2 ВИ М Же Ж сотину ОБЖ МБО МВ
ЕКО в дннннтйовоівеововнйннй я, осо евсвев свое іно восовосі візі носвев ве Догсововассссоіоооюс осгдгфовесьствсвссзеіюсо вх Умка беж ВІ п ТЕ :
КО сдах лев ; й м ха і ВОЛЯ
М : : !
М вд Е Е ї х яв дю швах ВН: зго п прю Я, ВО еЖ де пе МОБКЕЯ РАНИ ТАМ яНе ВІ; - ДОКВОАИ УКХ І ОК і , В Й
Ж
Фіг. 51 тах бо кдвіІснатен? ке М «кт
Во ОРІТЕЖАТК Є : КЗ КЗ мк «до и . х ами : В м меня ий Же Х « з т -х че «Во Од я а ї ча й Арно, я їй. Її ЧА 32 І зи т 5 сш ТІ про" Е З зх І 54 5 хе. 55 дя де
ЖЕ ет Ж тат ге є ї пк лк М - ї ок 5 НА ТИВХ Ек а сакзтеми МАВ о хуле пад ТМ ел у АХ я щк лавці З дІМ КеЖІММ! феЕ ЗИ
М якідю Ї : Ор У ПЕКТИ и ВеЕЩХ ве М
Я Южне у
Фо. Я і
В щш- З о: З як ЖВІВ ВКМ З
Ж ї З зирдую ж К- ц ї 3 Кредо в КК ; З в Р НА зд а млн рих Ж : і МА ТК зелаці кН ой , і ї З В ай х Е ї. т,
У зма в че ше яНКои хі т ЖЕ сту й тя ЩЕ ; ке ї ї
В ї : зв к ї зда
Мт дру : і ши я сх КМУ п се Ванди Н ВИ КК звіт дев м |внаня в Я ро На ЗАЯВ г я МВ ЧИ ЗИ Кі хо тю. Ко г . . г як
Фіг. 52 ше з
С 1 ід "бен кину «вк. МИ мише МАК
Пс Я х х І
М Ж в ; х 24 Х у ЇХ св Е - х у з :Х х Кс і я з т х 15 ї вогнем пі З
М ее Х 2 КІ. б удка пай й же х о з НЕ МЕ я. Я ПКОЯВВ й Ся її Б К К.
СОН КЕІ О Мя шия В ОК М х ї Ч Х
ЩІ ША ї ЗИМИ СВМВААЯ дей у у За в З
Е Ян неодоннісх по І МОН аю бе Мел І! ше. аа а
Б ї у Де хк В ! Р в моли : з до ФЕШАНХ : кж 5 у : завела ж : ласк : ХКБАНВ
З сх КМ какая : з пи : дея «ЛК : з ХО а ЩИХ ДТ м хамсотк КИ ; ї дек ока с: ТТ я КІ МЕН КЕКВ ВЖИ ЕНА ви васежї МЖК да поле шо З К.І 1, 1 МИНЕ ДМШ е х їж о риций з :
Й ха др дих у Нв ще ще
Ж ЗВ : 7 Н Хейлі «3 . 000 ВщеКу зи 73 супе ' : з піде АЖ ІМК ! : пеек ломи
Є г :. ЛІД «ад или й та Н педа
Ж ша НЕК МЖОВ МОНЯМ срдряен | ОХ лез 3 з ЛИ МЖК УЯ ЛЕАХ Я ' ї МЕЛЕ 5 ІЧ І є МКМ В ' ї М
ТД бтнинтя ; : : - з; й і ; :
Да я нини - й ї х ко : «Мі «ЖК лох ай : 1 аа ішквк ? раків в о «Фк: м мо а ЖЕО Ж Же бо бо - ї ти те»
Фіг. 53 135 сх ї х «баки ЗЕ кота -- 1 есть - ; ях ді МЕТИ а З х Мо цем ; Ї» ї яз КИ ке я еВ Я Я - МТ сь в бе В ВВ го. и СОМ у свт що х ; м в к хк я А ж ІчИХ їй яв її. Ме ж 695 5 ; ш З 5 ві х з Н че ї | гЗ й КД, ЖІ й е В х у х я
ЗХ, х 2 315 я Ух х х кі Я ЯЗ мих В ке х з пи ши ен ме й й шва йь| 85 5 01 за СВО хе ака ее ХА Й У ДЕК Х м ух фай ВИДУ ча З
С З НК Ме ту ЖК дк Ку Уту Ж з Бе Зак фе ПИ ЗВ Му ДІКА НЯ бажає Є. КО т З мг я : ли ня ВК ТВА я ехо ди ЯКА а а й - А я з ВЕК МНК Я) СЕТ ел Л Ж . : Марш МАК ее То х
Же ж з не Я - к х т УМО і щи ЕК яра ай ке МІ у ї. т ТМ НК
Ява 1 ях т пл) ката Б р: Гв- г ши як Б В. сов 5 її Я ! і ЕОМ о ! ' Е зв піЗі ї Бе НИ за аи КІ | ! ' Ам МАН ком З яф лют ЗАД пня ЗМ) Я ях вед а нок их ВЕ я ЩА 1 : Ол ие ЗУ МКК Сх ЯЗ ІІ азів: суха ках,
Ж. пенні боннннняінннінніенннньнн пеня о ВЕ, ЗК хх
ПК вик ета іа те ' я МІВ НН ЦК а Є ' жк ик і в. МК з ' ' ЕЛЕ ЛА 3 ! ! ЯККНМИЄ с І ! ї де певні мйеовмІ ВД і СО за58; залили ЯКЕ НВ ке сити МАНЕР ВМУ ВИКО ООМБЛОВ ОК кана м ТОМІ і КО Ж ТЮщЯ ВН; Клея З зада вн Ядкі
В.Я нити ект вні ін нен ігнна кінний ВА Е АХ ЗВИК КЕНАе зага ххх із шк : й ! : Ву коти ут ей іти дня тіней
М ЕТО ЯКА. ОНУК ат щи . : : : т певну ех.
КА О п ПК ОО хе и й смакових й ! ! ' "у ях ТУ ЗО ЕС ФУ МВ Зще Ж Ка ЗО Ще ЗИ «ех к а 0 Ж КО Б Я ЩО МКО ХО
Фіг. 54 ще ко с
З В кх - х соні НО їх
ЩЕ - її їх як ХХ ЖЕ х
ХЕ ; кА Ж ше два ї І ЗК зе
МЕ Ох 5 І Її Х і 55 а 4 х й-шВ х зе ї де ОК РЕ
ХУ од Зв МЕ г
Ве 7 її З. ВО КК ї Ж х Мод х 3 хв їй В й й пок й й «б спосте сосиски Мессі Морок Ми Хожлижжюний ММ Хогежи т ро в жрекекия
КОКО А КК КК КК ІК КК А ї я ща я ХХ
МАК з її ; а :
СУК з . фе и ;
ЩО Я ок ь 7 век 4 4 х Це їх
ІАИІ.ї Я й в Ще п"
Ж ї а М а хм
М Кок КК КТ КО Ок ОК Кеті Кіхота ще. Кк
ВК ЖИ ї їх ек Я Ї
ЕН х : ї їх с зо КУ з жа : :Е А ї З р Її зда. : ї х х І: ХЕ
МІ " 5 м, В я «хо ї 0 к п. А кі
КК АНА а в ОВ ен и НЯ
Маай УА во а АХ ор Ява ча кн р ку ню те а т Аа У АХ З КА КВ КІВ зм. й дл, З ат за см лют ий ша щей м зви ша Зйй зи кт лам ЗЕ Зх КВ ж ще
ЗІ а Ма ШО З Ж М Я и а р мо Ма Ба жна БО Ме Ома
Хвнанни
АК АААКАААКК УК ААААКАААКАААКААААААААКАААКАК : цк
Її ння І їб ЩЕ 3 ре КІ ро ЩІ - ща Фут То пуючеє М
КК ацертлчдекаац Мке і М
КА. ЗОН ВОК КВК М ян ЩА з Кс» Міс овеевтвевванься о еко В) а ; к. меді Е ї В мит ". я
І ЯЛККАНВ сія х Ме її ж В дивна ні р «о КВОТ КОН КИ НЕ. ;
З : У Щи ! і
Тех уци вето Ка 'Е КУ ї їх
НАЯНОВА КНТУ, «ю і 2 М ї У к . у по їх Е 18 ще
Мковии по кМеТА їх х 1Х
ЯК АОВОЛІНОКОО Й Я Її ки | й сх й 1: т
ПК їх РЕК
КМЧНК І шк і і че ії в ШІ тк бручету її х ї ї З
Но Ей 5 ЯР
НН х м ї ї 1 ви - сої І: би я пу 7 Кк. У
ЩЕ ще І з ТУ. - В
НОЯ ІК ОТ ОЦрою 5
НН с: : У ЖІ ї 4 ск їх ! В іЖ х кн: Ко оо. Кан а як о, ц ' Г ж и пеохМ ї
ПВ, ЕТ І и ІМ Я М
Біде я г БЕЖ У и в, т
ЩА Нд 5 ТЕ М ш Іі косі їв ох за
МІ хх ї «І х ТІНІ т. 5 Мо 0 Пат х
Кк у ОБОВ ек а
З Кй де тА НЕ ЯМ Я В й ПЕТ Мо В МІЖ ях ї щ БОБ і: Же ЕНЕ З ОВ Й Мом У : шо ри т АНА В МАК дн в У : 2 ЩО Тс их У ражн дл ТЕ Жак ї ї МОУ жк ТЕ аа ВХ Певну це и
КЕ ке «й МОЖ са в що 1 ї шк АК да МОЖ
Й дона Водний В ШИЯ М ох Зв Йо ХАЙ Ж вк чааойнлаюта лан.
Яд ба адовв ще мо мо о жи жу ве 32 Бай що пе юн ява о БО а ще
Мо шо мое МБ ОХ в ЧЕ о дО Со Б Я ЗО НЕ аоЛ л Я О ЯО п ОМ
Хвилин
! її х її і ; і х нд 4 Ду й «і хай
КК Тек КК Мох кю у юс Мескон ВЕ хккК ПИ КохикК МАХ КОКО КК АХК КАК КК те й, -к х ї " 3 х " 5 . й 5 в хв 5 й ; ко, й сошки вв кожи дк пови кВт дв кни шини вв в що доки Ж вкл вд Полем Ж де. ве рови си дви х и
М ща є «а 5 х к хх « ІЗ Е Ж
У Ж - щей ї са Жах я ще з : МИ
У Мо їх я 5 :
НН НЯ . «В ПИ: ї
Е їх ТЕ В к й хо й х ї й В о ї к 7. . . 1 ТУ г. ай 00 дк дк М дв МВ Кал ПДК ПК КІ ЕЕ ЕКО КК Ід Коди нини ининининннниннинниин нин нин нини нини вини нини нки нини нини нин нн
НВ ОТ ВАК БО ЗБ жа ге еВ Б еВ Ж За В З ЗК Од А ЯКО жо ХВО Я Бе ОБ
Хвилин піка назва і гліклиа . Мб . МВ Ми Ши ; 4 б0-2СІСМАЄ ве 0:00 018 1 096. 199150 2 О0ЗІЄМАЄ ой 009 0034 1 42458
З Мам 0004051 056 062) 138356)
З1еСнеМАЄ й | і вк я дл !
В | я ож роз) ол | вввз
АААЛАААЄААКАТТЯ ДЕ нин п, виш пи пиши 6 я «0055 061 1.76 | 158663 т п | ие 034 | 057099 173089. 8 |Мап5 ев Я ЯВЛІ БЯБЕ ззаднннмвнен ЕЕ КАС зання те п знана мнннь 7 значно ніоннвснніннння т інно нені дні ннераннннннь -- - т
Шок ни Ба 035 098 045 пе 11 153) оейее 0 089 0 088 | 134 17891
В ей | 199279
ОКА | | 13 птрумем. ві з о | 046 1453 мав.
ЗЕ об бе 4 ІБІБЕСЮМАЄ ее 073 120 | 186 ВИЗ 51 ее 000 | 000 | 032 | ее,
Фіг. 58А
Ї ПЕ тт тая вої: Єкеречена (Структура рення ЛЕВКА, нн Теорет. тка назва . глікана Мт . МІ5 МТ зваса (Ла сеччеетнтенн потетосте тот о пе ттттеттетстні по дитя нн тет 46 ОвВОтЕ. же» 0 0О0 1 000 | 040 00213585
Го Мапв Гея | що 1707.66 17 З ннннннннт ннн ВБР 0Ж | 085
ЛУ СІЗЕОІЮМАЄ ее 0 08 0 089 | 104 | 008 б2е0СІЄМАЄ ее 00 028 028 | 057) 215485 21 ов ех 24 1913 | 747 209787 пиття ит ук Дт с пяти их
Мао! ню | | лет 22 Мав 16082 роз 3918.
ОДТЕВ!ен СТО
ВОК І 0 027 1 037 000 2ю0Ф ! пу Ш | 88 243 415
АЗОВ 000 ве 0 нн НН ШО 004 26 Мапб. СО-ртЮв, ев 0 000 1 000 | 053 178783
Й соки ше 400 243 | 167 23055, ди ЗМК Ж" ге Ел до дети 00 т и
І 7.188529 ) 15954 ) 238392
Мел бІВТ Я 0050055 1700001,
СЕ! ее» 0 000 000 1 097 о59200
СО2ЯМОМА ооо і 2258.85
Зі дет 044 0 035 | 0.35 тд
Ше БЮ
Фіг. 588
КД Скеречена | Структура ен НИКА сш Теорет. тка! назва гліканя 0 МТИ 00 Мт я и
У ББЕТЕ шо | Мтв ! Мо | МТ маса (ЛЯ ож же кРШС есе | 08 0 по З
ШМК ин бно / В 238899 нут 25 сени 6 Во НВ
АН пра гав ал оБя3
СЕЕЛДОЕЕИТТТТ вед нн ння
С2ЕВа. тоне 10276 01387 0833 | 88002 ав с шо па ; ВБ--х Се. :
ВВ нн 1 ВТО. ду ВОВІЄМОМА | | | овефв
ШК Ще рук хв ЕЕ прут ва яд че А йо 2880.02
ОК ща | ядер 49: дз па пе.
НЕХЛОЗЕВІ ее ЖОВ ЕВ : : і і ї ш панни о 7 я | 1770 пов ЕЛ : тато Й : і : а ! Ме тт --Я« 05 50 Рус | Кн ШІ | дові й 04104 05 ої.
ДУ ш тати Я пет ри Зав о нн нн чи аз а і з фен е т копначнф екннкмнн У ХК з: аг Са о оо ай бовсововиє емо пла і дод о богвоютьс ех ом по ом мУ ! г ' у ШІ ее : ппитетттттт о нтнте тенет естетично дет
КВ Ве Мел яв ЗЕ ту у нн нен тетюднення
ЛВ ОЗ рен МОЇ 1058 1 збо ст парео - до кон ннен Пентнн енентен рен сснс стннн ки ей 0 0851 029024 ЗИ0оВ ав С4ЕБ3 100083) 040018
Я ВаРБЄ ей 0 би 0 пи Оу ему ! спеттнтн нини ня нн Кит нн няння няння
Фіг. БВС
І Тих то
Ї Збір за допомогою прямої глибинної футьтратії !
Афінне захоплення тя фільтрація
Т х т ї нн тт тетттен В сне стттнттеетоеттетсткттетеетететннст,
ФерменктатнЕне відщеплення
З
:
Р ПосСт-афінна ультрафільтрація проточної фраки (РАВ ! 1 Евресна інактиванія 1 фільтрація
Б ся як іч їі їі ів інків інно в ії ів ів іній інініня іч : 1 М же я м їе мл. ОКУ тя хі щу
Анонооомінна хроматог аа САБЕХ / х й :
Її Хопсматогравія з гілповобнав ваземолию НІ
І Хроматоградія з гідрофобною ваземолию (НІ
І чі так с сертеттовх ж песто 7 ТУ
Фільтрація з утриманням висів УВК з є й й т ! пронесли пояс пня спон ппня пня, ; т пет ттт утекти їс р пі трт тез лптив 0 ПЕ УЮ
Ультрафільтрація та діафільтрація ОКО
Фіг. 59

Claims (3)

1. Композиція для застосування як біомаркера під час виготовлення афліберцепту, що містить оксоафліберцепт, в якій один або більше амінокислотних залишків афліберцепту окиснені і в якій зазначені один або більше амінокислотних залишків вибрані з групи, яка складається з Нів8б, Нівз110, Нів145, Нівз209, НівО5, Нів19, Нівз203, Тгр58, Тгрі38 1 їх комбінації афліберцепту, що містить або складається з БЕО ІЮ МО: 55.
2. Композиція за п. І, в якій зазначений оксоафліберцепт ферментативно розщеплений із забезпеченням одного або більше олігопептидів і зазначені один або більше олігопептидів вибрані з групи, яка складається з ХЕО ІЮ МО: 17, 5ЕО ІЮ МО: 18, 5ЕО ІЮ МО: 19, 5ЕО І МО: 20, 5БО ІЮ МО: 21, 5БО ІЮ МО: 22, 5БО І МО: 23, 5ЕО ІР МО: 28, 5ЕО ІЮ МО: 29, 5ЕО Ю МО: 30, 5БЕО Ю МО: 31, 5ЕО Ю МО: 32 1 їх комбінацій.
3. Композиція за п. 2, в якій зазначене ферментативне розщеплення здійснюють з використанням трипсину.
Те ргезепі дібсіобиге регіаіїп5 (0 сотрозШопе сотргівіпе апи-МЕОЕ ргоїеіп5 апі тефод5 ог ргодисіпе висо сотровшШопв.
UAA202201491A 2019-12-06 2020-08-18 Композиція окиснених варіантів афліберцепту UA130461C2 (uk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962944635P 2019-12-06 2019-12-06
US202063065012P 2020-08-13 2020-08-13
PCT/US2020/046846 WO2021112928A1 (en) 2019-12-06 2020-08-18 Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA130461C2 true UA130461C2 (uk) 2026-02-25

Family

ID=76210828

Family Applications (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA202201491A UA130461C2 (uk) 2019-12-06 2020-08-18 Композиція окиснених варіантів афліберцепту
UAA202201487A UA130459C2 (uk) 2019-12-06 2020-08-18 СПОСІБ ЗМЕНШЕННЯ ВАРІАНТІВ MiniTrap АФЛІБЕРЦЕПТУ З ОСВІТЛЕНОГО ЗБОРУ КЛІТИНИ
UAA202201478A UA130457C2 (uk) 2019-12-06 2020-08-18 Спосіб отримання афліберцепту
UAA202201486A UA130458C2 (uk) 2019-12-06 2020-08-18 Спосіб зменшення кількості варіантів афліберцепту, отриманого в хімічно визначеному середовищі
UAA202201492A UA129709C2 (uk) 2019-12-06 2020-08-18 ПОЛІПЕПТИД З ПРОТЕАЗНОЮ АКТИВНІСТЮ IdeS
UAA202201490A UA130460C2 (uk) 2019-12-06 2020-08-18 Спосіб очищення афліберцепту

Family Applications After (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA202201487A UA130459C2 (uk) 2019-12-06 2020-08-18 СПОСІБ ЗМЕНШЕННЯ ВАРІАНТІВ MiniTrap АФЛІБЕРЦЕПТУ З ОСВІТЛЕНОГО ЗБОРУ КЛІТИНИ
UAA202201478A UA130457C2 (uk) 2019-12-06 2020-08-18 Спосіб отримання афліберцепту
UAA202201486A UA130458C2 (uk) 2019-12-06 2020-08-18 Спосіб зменшення кількості варіантів афліберцепту, отриманого в хімічно визначеному середовищі
UAA202201492A UA129709C2 (uk) 2019-12-06 2020-08-18 ПОЛІПЕПТИД З ПРОТЕАЗНОЮ АКТИВНІСТЮ IdeS
UAA202201490A UA130460C2 (uk) 2019-12-06 2020-08-18 Спосіб очищення афліберцепту

Country Status (19)

Country Link
US (37) US11053280B2 (uk)
EP (11) EP4524237A3 (uk)
JP (13) JP2022547651A (uk)
KR (13) KR20240005206A (uk)
CN (6) CN114423783A (uk)
AU (16) AU2020398830C1 (uk)
BR (1) BR112021025359A2 (uk)
CA (4) CA3129193C (uk)
CO (6) CO2021018234A2 (uk)
IL (18) IL318471A (uk)
MX (10) MX2022006759A (uk)
MY (12) MY190624A (uk)
NZ (6) NZ781136A (uk)
PE (6) PE20221261A1 (uk)
SG (6) SG11202110968VA (uk)
TW (7) TWI867028B (uk)
UA (6) UA130461C2 (uk)
WO (7) WO2021112929A1 (uk)
ZA (6) ZA202107643B (uk)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK4364724T3 (da) 2018-05-10 2025-12-22 Regeneron Pharma Formuleringer med høj koncentration af VEGF-receptorfusionsprotein
CN119264211A (zh) 2018-08-27 2025-01-07 瑞泽恩制药公司 拉曼光谱在下游纯化中的应用
AU2020208360B2 (en) * 2019-01-16 2025-05-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method and system of identifying and quantifying antibody fragmentation
EP3886946A1 (en) 2019-06-05 2021-10-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Devices and methods for precision dose delivery
GB201910697D0 (en) * 2019-07-26 2019-09-11 Binding Site Group Ltd Lonisation control
SG11202110968VA (en) * 2019-12-06 2021-10-28 Regeneron Pharma Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same
AU2021268026A1 (en) 2020-05-08 2023-01-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. VEGF traps and mini-traps and methods for treating ocular disorders and cancer
WO2022234412A1 (en) 2021-05-03 2022-11-10 Lupin Limited A process for purification of fc-fusion proteins
US20230077710A1 (en) * 2021-09-08 2023-03-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. HIGH-THROUGHPUT AND MASS-SPECTROMETRY-BASED METHOD FOR QUANTITATING ANTIBODIES AND OTHER Fc-CONTAINING PROTEINS
AU2022358612A1 (en) * 2021-09-28 2024-04-11 Kashiv Biosciences, Llc An improved process of purification of fusion protein
CN116162148B (zh) * 2021-11-24 2025-09-09 中山光度生物医药有限公司 多特异性配体结合分子及其应用
US20250223313A1 (en) * 2022-01-14 2025-07-10 Shattuck Labs, Inc. Methods of contaminant removal from protein isolates
AU2023275534A1 (en) * 2022-05-23 2024-12-05 Inhalon Biopharma, Inc. Compositions and methods for inhalable therapeutics
USD1120314S1 (en) 2022-11-30 2026-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dose delivery device
CN120322464A (zh) * 2022-12-01 2025-07-15 信达生物制药(苏州)有限公司 三特异性融合蛋白及其用途
WO2024148276A1 (en) * 2023-01-06 2024-07-11 Seismic Therapeutic, Inc. Protease variants and uses thereof
KR20240115650A (ko) 2023-01-19 2024-07-26 주식회사 스카이테라퓨틱스 티로신 키나아제 억제제의 무정형 나노 분자회합체와 이를 포함하는 조성물 및 그의 제조방법
EP4687953A2 (en) * 2023-03-29 2026-02-11 Cyrus Biotechnology, Inc. Ides variant proteins and methods of using the same
WO2025030053A1 (en) * 2023-08-01 2025-02-06 Insmed Incorporated Novel igg proteases and methods of use thereof
US20250206803A1 (en) * 2023-12-20 2025-06-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of characterizing and purifying vegf receptor fusion protein
US12240888B1 (en) 2024-04-29 2025-03-04 QILU Pharmaceutical, Co., Ltd. Composition comprising aflibercept and a variant thereof, and related methods and uses
WO2025227916A1 (zh) 2024-04-29 2025-11-06 齐鲁制药有限公司 包含阿柏西普和其变体的组合物以及相关方法和应用
WO2025245371A1 (en) * 2024-05-22 2025-11-27 Seismic Therapeutic, Inc. Polypeptides comprising protease-resistant fc domain, compositions and uses thereof
CN121270709B (zh) * 2025-12-09 2026-02-24 江苏泰康生物医药有限公司 一种阿柏西普的抗独特型抗体及其应用

Family Cites Families (139)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1522343A (en) 1923-05-02 1925-01-06 Thom Clarence Magnetic separator
US4534972A (en) 1983-03-29 1985-08-13 Miles Laboratories, Inc. Protein compositions substantially free from infectious agents
DE3871206D1 (de) 1987-03-24 1992-06-25 Grace W R & Co Basisnaehrmedium fuer eine zellkultur.
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
GB9022545D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Culture medium
US6811779B2 (en) * 1994-02-10 2004-11-02 Imclone Systems Incorporated Methods for reducing tumor growth with VEGF receptor antibody combined with radiation and chemotherapy
US20030108545A1 (en) 1994-02-10 2003-06-12 Patricia Rockwell Combination methods of inhibiting tumor growth with a vascular endothelial growth factor receptor antagonist
AU3374795A (en) * 1994-08-29 1996-03-22 Prizm Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of vascular endothelial growth factor with targeted agents
US5705364A (en) 1995-06-06 1998-01-06 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process
US5721121A (en) 1995-06-06 1998-02-24 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process for producing a tumor necrosis factor receptor immunoglobulin chimeric protein
US6100071A (en) 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production
AU4330597A (en) 1996-08-30 1998-03-19 Life Technologies, Inc. Serum-free mammalian cell culture medium, and uses thereof
US5804420A (en) 1997-04-18 1998-09-08 Bayer Corporation Preparation of recombinant Factor VIII in a protein free medium
US6475725B1 (en) 1997-06-20 2002-11-05 Baxter Aktiengesellschaft Recombinant cell clones having increased stability and methods of making and using the same
SE519827C2 (sv) 1998-03-30 2003-04-15 Viranative Ab Näringsmedium innehållande metionin samt användning av detta
US6833349B2 (en) 1999-06-08 2004-12-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating inflammatory skin diseases
US7303746B2 (en) 1999-06-08 2007-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating eye disorders with modified chimeric polypeptides
CN101433715B (zh) 1999-06-08 2013-04-17 里珍纳龙药品有限公司 具有改善的药物动力学特性的修饰嵌合多肽
US7070959B1 (en) 1999-06-08 2006-07-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties
US7087411B2 (en) 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
US7306799B2 (en) 1999-06-08 2007-12-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of VEGF inhibitors for treatment of eye disorders
US7396664B2 (en) * 1999-06-08 2008-07-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same
WO2001039793A2 (en) * 1999-11-30 2001-06-07 Smithkline Beecham P.L.C. Pharmaceutical compositions containing sema7a polypeptides
CN101255192A (zh) 2000-05-26 2008-09-03 布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司 可溶性ctla4突变体分子及其应用
EP1360314B1 (en) 2001-02-15 2009-01-14 Centocor, Inc. Chemically defined medium for cultured mammalian cells
BR0208874A (pt) 2001-04-13 2004-06-22 Wyeth Corp Proteìnas superficiais de streptococcus pyogenes
AU2002316230A1 (en) 2001-06-13 2002-12-23 Genentech, Inc. Methods of culturing animal cells and polypeptide production in animal cells
GB0130228D0 (en) 2001-12-18 2002-02-06 Hansa Medica Ab Protein
US8777906B1 (en) 2002-01-24 2014-07-15 Robin Scott Gray Syringe with inspection window
MXPA05006522A (es) 2002-12-23 2006-02-17 Bristol Myers Squibb Co Mejora en la calidad de producto en procesos de cultivo en celulas de mamiferos para la produccion de proteina.
US7399612B2 (en) 2003-06-30 2008-07-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same
CN100537751C (zh) 2004-05-12 2009-09-09 华东理工大学 一种适合中国仓鼠卵巢细胞培养的无血清培养基
US7335491B2 (en) 2004-08-27 2008-02-26 Wyeth Research Ireland Limited Production of anti-abeta
AU2005302516A1 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Centocor, Inc. Chemically defined media compositions
US20060094104A1 (en) 2004-10-29 2006-05-04 Leopold Grillberger Animal protein-free media for cultivation of cells
US7303748B2 (en) 2005-02-02 2007-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating eye injury with local administration of a VEGF inhibitor
ES2633574T3 (es) 2005-03-25 2017-09-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Formulaciones de antagonistas de VEGF
GB0511769D0 (en) * 2005-06-09 2005-07-20 Hansa Medical Ab Treatment
PL1901773T3 (pl) * 2005-06-09 2012-09-28 Hansa Medical Ab Zastosowanie proteinazy IDES (Z S. Pyogenes) do leczenia chorób autoimmunologicznych oraz odrzutów przeszczepu
CN1778903A (zh) 2005-09-29 2006-05-31 华东理工大学 一种动物细胞高密度连续灌注培养方法
BRPI0621124A2 (pt) * 2005-12-22 2011-11-29 Genentech Inc métodos para recuperação de uma proteìna de ligação à heparina
ES2474573T3 (es) 2006-01-04 2014-07-09 Baxter International Inc Medio de cultivo celular sin oligop�ptidos
CN100502945C (zh) 2006-03-31 2009-06-24 成都康弘生物科技有限公司 Vegf受体融合蛋白在治疗眼睛疾病中的应用
CA2654510C (en) 2006-06-16 2015-03-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf antagonist formulations suitable for intravitreal administration
EP3255141B1 (en) 2006-07-13 2021-12-01 Wyeth LLC Production of antibodies with improved glycosylation pattern
WO2008025747A1 (en) * 2006-08-28 2008-03-06 Ares Trading S.A. Process for the purification of fc-fusion proteins
EP3539981A1 (en) 2006-09-10 2019-09-18 Glycotope GmbH Use of human cells of myeloid leukaemia origin for expression of antibodies
AU2007294731B2 (en) 2006-09-13 2014-04-17 Abbvie Inc. Cell culture improvements
US10259860B2 (en) * 2007-02-27 2019-04-16 Aprogen Inc. Fusion proteins binding to VEGF and angiopoietin
JP2010524467A (ja) 2007-04-16 2010-07-22 モメンタ ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 規定の糖タンパク質産物および関連の方法
WO2008154014A2 (en) 2007-06-11 2008-12-18 Amgen Inc. A method for culturing mammalian cells to improve recombinant protein production
AU2008291358A1 (en) 2007-08-31 2009-03-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Glycosylation profile analysis
ES2388017T3 (es) * 2007-12-21 2012-10-05 Roche Glycart Ag Ensayo de estabilidad de anticuerpos
KR101415099B1 (ko) 2008-07-31 2014-07-08 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 불포화 폴리에스테르 수지와 마이크로피브릴화 식물 섬유를 함유하는 성형 재료
MX2011003241A (es) 2008-09-26 2011-04-21 Schering Corp Produccion de anticuerpos con alto titulo.
US20120329709A1 (en) 2009-05-26 2012-12-27 Brian Edward Collins Production of glycoproteins
MY192182A (en) 2009-06-26 2022-08-04 Regeneron Pharma Readily isolated bispecific antibodies with native immunoglobulin format
CN104962539B (zh) 2009-07-31 2019-09-17 百深公司 用于adamts蛋白表达的细胞培养基
ES2813398T3 (es) * 2009-10-20 2021-03-23 Abbvie Inc Aislamiento y purificación de anticuerpos anti-IL-13 usando cromatografía de afinidad a Proteína A
EP2325296A1 (en) 2009-11-20 2011-05-25 LEK Pharmaceuticals d.d. Production of glycoproteins with low N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc) content
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
US8568250B2 (en) * 2010-07-07 2013-10-29 Nike, Inc. Golf ball with cover having zones of hardness
KR20190049934A (ko) 2011-01-13 2019-05-09 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 혈관신생 눈 장애를 치료하기 위한 vegf 길항제의 용도
CN102653729B (zh) 2011-03-04 2014-07-16 上海赛金生物医药有限公司 一种用于中国仓鼠卵巢细胞的培养基
EP2697361A1 (en) 2011-04-11 2014-02-19 Cellcura Asa Protein-free culture media products for manufacturing viral-based vaccines
CN105189735B (zh) 2011-04-29 2019-04-12 拜康研究有限公司 在培养期间减少乳酸累积的方法和生产多肽的方法
KR101591671B1 (ko) 2011-04-29 2016-02-04 바이오콘 리서치 리미티드 항체의 이질성을 감소시키는 방법 및 그 항체의 제조방법
JP6055615B2 (ja) 2011-05-27 2016-12-27 アッヴィ バイオテクノロジー リミテッド Ｄａｃｈｙｐ組成物および方法
US9096648B2 (en) * 2011-08-19 2015-08-04 Emd Millipore Corporation Methods of reducing level of one or more impurities in a sample during protein purification
WO2013054250A1 (en) * 2011-10-10 2013-04-18 Dr Reddy's Laboratories Limited Purification method
CN108771655A (zh) 2011-10-28 2018-11-09 诚信生物公司 含有氨基酸的蛋白质制剂
US20130281355A1 (en) * 2012-04-24 2013-10-24 Genentech, Inc. Cell culture compositions and methods for polypeptide production
CN102757496B (zh) * 2012-06-07 2014-06-18 山东泉港药业有限公司 一种抗vegf抗体片段的纯化制备方法
AU2012101677B4 (en) * 2012-07-03 2012-12-20 Novartis Ag Device
WO2014015098A1 (en) * 2012-07-18 2014-01-23 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. A method of normalizing biological samples
AU2013298521A1 (en) * 2012-08-02 2015-02-26 Sanofi Article of manufacture comprising aflibercept or ziv-aflibercept
HK1211981A1 (en) 2012-09-02 2016-06-03 Abbvie Inc. Methods to control protein heterogeneity
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
EP2722673B1 (en) * 2012-10-17 2017-07-12 Hexal AG Improved method of mapping glycans of glycoproteins
US9365314B2 (en) * 2012-11-16 2016-06-14 Owens-Brockway Glass Container Inc. Product and package with a photosensitive use-evident feature
US9217168B2 (en) 2013-03-14 2015-12-22 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
US8956830B2 (en) 2013-03-14 2015-02-17 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
CN103146648A (zh) 2013-03-14 2013-06-12 北京京蒙高科干细胞技术有限公司 一种无动物源的淋巴细胞无血清培养基
US20140271622A1 (en) 2013-03-14 2014-09-18 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of cell culture
PT3611180T (pt) * 2013-03-15 2022-03-15 Biomolecular Holdings Llc Imunoglobulina híbrida que contém uma ligação não peptídica
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
AU2014233393B2 (en) 2013-03-15 2020-05-28 Genentech, Inc. Cell culture compositions with antioxidants and methods for polypeptide production
CN103773732B (zh) 2013-06-08 2016-05-11 李锋 一种化学成分确定的培养基、其应用及大规模培养哺乳动物细胞的生产工艺
US10154971B2 (en) 2013-06-17 2018-12-18 Adamas Pharma, Llc Methods of administering amantadine
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
WO2015058369A1 (en) * 2013-10-23 2015-04-30 Sanofi (China) Investment Co., Ltd. Use of aflibercept and docetaxel for the treatment of nasopharyngeal carcinoma
WO2015120056A1 (en) 2014-02-04 2015-08-13 Biogen Ma Inc. Use of cation-exchange chromatography in the flow-through mode to enrich post-translational modifications
CN104073464A (zh) 2014-07-08 2014-10-01 西藏天虹科技股份有限责任公司 一种cho细胞无血清培养基及其制备方法
AR101262A1 (es) 2014-07-26 2016-12-07 Regeneron Pharma Plataforma de purificación para anticuerpos biespecíficos
GB201502305D0 (en) * 2015-02-12 2015-04-01 Hansa Medical Ab Protein
GB201502306D0 (en) * 2015-02-12 2015-04-01 Hansa Medical Ab Protein
AU2016228806B2 (en) * 2015-03-12 2020-10-22 Medimmune, Llc Method of purifying albumin-fusion proteins
KR101867134B1 (ko) * 2015-03-23 2018-06-12 한양대학교 산학협력단 포유류 세포를 이용하여 목적 물질을 고효율로 생산하기 위한 세포 배양 배지, 이를 이용한 세포 배양 방법 및 목적 물질의 생산 방법
JP6744324B2 (ja) 2015-04-01 2020-08-19 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 細胞培養培地
CN105002242A (zh) 2015-07-23 2015-10-28 苏州康聚生物科技有限公司 用于cho细胞中高效表达重组人促甲状腺激素的无血清培养基及其应用
TWI870789B (zh) 2015-08-04 2025-01-21 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
CN107922975B (zh) 2015-08-12 2022-06-28 诺华股份有限公司 治疗眼科病症的方法
EP3375873B1 (en) * 2015-10-22 2025-07-02 Protenova Co., Ltd. Immunoglobulin-binding polypeptide
CN108290004A (zh) 2015-11-18 2018-07-17 福尔密孔股份公司 含有vegf拮抗剂的预填充塑料注射器
EP3377100B1 (en) * 2015-11-18 2025-02-26 Formycon AG Pre-filled pharmaceutical package comprising a liquid formulation of a vegf-antagonist
CN105368808B (zh) * 2015-11-30 2019-04-30 苏州康聚生物科技有限公司 一种IdeS蛋白酶、其制备方法及应用
AU2016378573A1 (en) 2015-12-22 2018-07-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bispecific anti-CD20/anti-CD3 antibodies to treat acute lymphoblastic leukemia
LT3394103T (lt) 2015-12-22 2023-09-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antikūnų prieš pd-1 ir bispecifinių antikūnų prieš cd20/cd3 derinys, skirtas vėžiui gydyti
EP3196646B1 (en) * 2016-01-19 2019-12-18 Hexal AG Methods of mapping protein variants
US10576128B2 (en) 2016-01-26 2020-03-03 Formycon Ag Liquid formulation of a VEGF antagonist
CN107025553A (zh) * 2016-01-29 2017-08-08 上海新卡说信息技术有限公司 一种交易处理方法以及交易系统
EP3436473A4 (en) * 2016-03-29 2019-10-23 Navya Biologicals Pvt. Ltd. METHOD FOR PURIFYING FC FUSION PROTEINS
KR101685532B1 (ko) * 2016-04-26 2016-12-13 한국프라임제약주식회사 혈관내피성장인자 수용체 융합단백질
CN106279412A (zh) * 2016-09-12 2017-01-04 广东东阳光药业有限公司 一种抗vegf类单克隆抗体的纯化方法
JP7066690B2 (ja) 2016-09-23 2022-05-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗ｍｕｃ１６（ムチン１６）抗体
MY199468A (en) 2016-09-23 2023-10-31 Regeneron Pharma Anti-steap2 antibodies, antibody-drug conjugates, and bispecific antigen-binding molecules that bind steap2 and cd3, and uses thereof
TWI782930B (zh) 2016-11-16 2022-11-11 美商再生元醫藥公司 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法
JP7116059B2 (ja) 2016-11-21 2022-08-09 ジャスト－エヴォテック バイオロジックス、インコーポレイテッド アフリベルセプト製剤及びその使用
CR20190291A (es) * 2016-12-23 2019-11-05 Serum Institute Of India Pvt Ltd Métodos mejorados para estimular la productividad de anticuerpos en el cultivo de células de mamiferos y reducir la agregación durante los procesos de formulación post-tratamiento (downstream) y formulaciones de anticuerpos estables obtenidas a partir de los mismos
US11266745B2 (en) 2017-02-08 2022-03-08 Imaginab, Inc. Extension sequences for diabodies
WO2018170488A1 (en) * 2017-03-17 2018-09-20 Gilead Sciences, Inc. Method of purifying an antibody
KR101861163B1 (ko) 2017-04-26 2018-05-25 삼천당제약주식회사 안과용 약학 조성물
WO2018215580A1 (en) * 2017-05-24 2018-11-29 Formycon Ag Method for sterilizing prefilled plastic syringes containing a vegf antagonist
US20210228738A1 (en) * 2017-07-17 2021-07-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Compositions and methods for increasing or enhancing transduction of gene therapy vectors and for removing or reducing immunoglobulins
EP3668985B1 (en) * 2017-08-17 2021-06-16 Just-Evotec Biologics, Inc. Method of purifying glycosylated protein from host cell galectins and other contaminants
AU2018350990A1 (en) * 2017-10-18 2020-05-21 Regenxbio Inc. Treatment of ocular diseases and metastatic colon cancer with human post-translationally modified VEGF-Trap
MY202872A (en) * 2017-11-20 2024-05-28 Just Evotec Biologics Inc Aflibercept formulations containing a lysine salt as tonicifying agent and uses thereof
CN109929038B (zh) * 2017-12-15 2020-10-09 山东博安生物技术有限公司 Vegf捕获剂融合蛋白的纯化方法
CN109929027B (zh) * 2017-12-15 2020-10-09 山东博安生物技术有限公司 采用线性洗脱步骤的重组融合蛋白纯化方法
US11426446B2 (en) 2018-03-08 2022-08-30 Coherus Biosciences, Inc. Stable aqueous formulations of aflibercept
EP3761953A1 (en) * 2018-03-08 2021-01-13 Coherus Biosciences, Inc. Stable aqueous formulations of aflibercept
EP4321870B1 (en) 2018-03-13 2025-07-30 Amgen Inc. Methods for the preparation of trypsin-resistant polypeptides for mass spectrometric analysis
DK4364724T3 (da) 2018-05-10 2025-12-22 Regeneron Pharma Formuleringer med høj koncentration af VEGF-receptorfusionsprotein
AU2019373610B2 (en) * 2018-10-29 2024-07-18 Beijing Research Institute Of Chemical Industry, China Petroleum & Chemical Corporation Porous composite material capable of generating electric arc in microwave field, preparation method therefor, and use thereof
WO2020102740A2 (en) * 2018-11-16 2020-05-22 Spark Therapeutics, Inc. Compositions and methods for increasing or enhancing transduction of gene therapy vectors and for removing or reducing immunoglobulins
JP2022523063A (ja) 2019-01-30 2022-04-21 アムジエン・インコーポレーテツド アフリベルセプトの属性、並びにその特性決定及び修飾方法
WO2020229584A1 (en) 2019-05-16 2020-11-19 Formycon Ag Method for reducing methionine oxidation in recombinant proteins
KR102286892B1 (ko) * 2019-07-08 2021-08-06 삼천당제약주식회사 안과용 단백질 제제의 정제방법
SG11202110968VA (en) * 2019-12-06 2021-10-28 Regeneron Pharma Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022547652A (ja) 2022-11-15
TW202128991A (zh) 2021-08-01
US11485770B2 (en) 2022-11-01
NZ781136A (en) 2023-05-26
AU2023201590B2 (en) 2025-07-03
CN114206925A (zh) 2022-03-18
IL288352B (en) 2022-11-01
IL317707A (en) 2025-02-01
US12049489B2 (en) 2024-07-30
US12338274B2 (en) 2025-06-24
KR102519234B1 (ko) 2023-04-10
AU2023201585B2 (en) 2025-08-14
AU2020398547A1 (en) 2021-10-28
MY190625A (en) 2022-04-27
TW202128745A (zh) 2021-08-01
WO2021112927A1 (en) 2021-06-10
MY193351A (en) 2022-10-06
MY193354A (en) 2022-10-06
US20240067701A1 (en) 2024-02-29
US20250289868A1 (en) 2025-09-18
US11958894B2 (en) 2024-04-16
US12077570B2 (en) 2024-09-03
AU2023201585A1 (en) 2023-04-13
IL296893B1 (en) 2024-01-01
WO2021112929A1 (en) 2021-06-10
US12054533B2 (en) 2024-08-06
IL302921B1 (en) 2025-05-01
EP4524237A2 (en) 2025-03-19
AU2020397803A1 (en) 2021-10-28
AU2023201748A1 (en) 2023-06-01
IL296512A (en) 2022-11-01
IL301888B1 (en) 2024-11-01
IL309491B2 (en) 2025-06-01
AU2023201586A1 (en) 2023-04-13
UA130459C2 (uk) 2026-02-25
KR102619866B1 (ko) 2024-01-04
US20220009997A1 (en) 2022-01-13
EP4524147A3 (en) 2025-07-23
SG11202110964QA (en) 2021-10-28
TW202128743A (zh) 2021-08-01
US20230272044A1 (en) 2023-08-31
US11753459B2 (en) 2023-09-12
AU2020398125C1 (en) 2023-05-11
AU2020396490A1 (en) 2021-10-28
US20210371501A1 (en) 2021-12-02
TWI865587B (zh) 2024-12-11
IL309560B2 (en) 2025-05-01
JP2022552052A (ja) 2022-12-15
IL301888A (en) 2023-06-01
JP7681079B2 (ja) 2025-05-21
IL302921B2 (en) 2025-09-01
EP4524237A3 (en) 2025-07-09
PE20221788A1 (es) 2022-11-25
MY193353A (en) 2022-10-06
MX2022012042A (es) 2022-10-27
MX2022006759A (es) 2023-01-30
CO2021018234A2 (es) 2022-01-17
AU2023201588B2 (en) 2025-06-26
US12012444B2 (en) 2024-06-18
TW202134256A (zh) 2021-09-16
IL288367B (en) 2022-10-01
IL288357A (en) 2022-01-01
WO2021112923A1 (en) 2021-06-10
IL304390B2 (en) 2025-05-01
TW202122417A (zh) 2021-06-16
CN114206924A (zh) 2022-03-18
IL309491A (en) 2024-02-01
PE20221790A1 (es) 2022-11-25
US11505594B2 (en) 2022-11-22
AU2023201589B2 (en) 2025-08-28
EP4516800A3 (en) 2025-07-09
AU2020398830C1 (en) 2023-04-27
US20220235116A1 (en) 2022-07-28
IL296893B2 (en) 2024-05-01
IL302538A (en) 2023-07-01
US11098112B2 (en) 2021-08-24
AU2020397865B2 (en) 2022-12-15
WO2021112924A1 (en) 2021-06-10
IL288355B2 (en) 2023-03-01
IL296864A (en) 2022-11-01
IL296893A (en) 2022-12-01
PE20221791A1 (es) 2022-11-25
US12054532B2 (en) 2024-08-06
IL288355A (en) 2022-01-01
IL288351B1 (en) 2024-01-01
US20220396608A1 (en) 2022-12-15
US20230331812A1 (en) 2023-10-19
US11535663B2 (en) 2022-12-27
KR20240005206A (ko) 2024-01-11
US11548932B2 (en) 2023-01-10
US20250197474A1 (en) 2025-06-19
IL296512B1 (en) 2023-08-01
US20220227836A1 (en) 2022-07-21
US11286290B2 (en) 2022-03-29
ZA202208710B (en) 2024-09-25
SG11202110972UA (en) 2021-10-28
US11104715B2 (en) 2021-08-31
US11440950B2 (en) 2022-09-13
MY193355A (en) 2022-10-06
JP2023171771A (ja) 2023-12-05
CA3172625A1 (en) 2021-06-10
US20230235019A1 (en) 2023-07-27
ZA202107644B (en) 2022-03-30
WO2021112926A1 (en) 2021-06-10
MY190624A (en) 2022-04-27
AU2025271412A1 (en) 2026-01-08
UA130457C2 (uk) 2026-02-25
AU2020398830B2 (en) 2022-12-15
CO2021018192A2 (es) 2022-01-17
BR112022001016A2 (pt) 2022-08-16
JP2022548197A (ja) 2022-11-17
CA3129193A1 (en) 2021-06-10
US20220275054A1 (en) 2022-09-01
US11505593B2 (en) 2022-11-22
AU2020396490B2 (en) 2022-12-15
TW202521150A (zh) 2025-06-01
NZ781138A (en) 2023-05-26
US20220389081A1 (en) 2022-12-08
CO2021018181A2 (es) 2022-01-17
JP2023179531A (ja) 2023-12-19
AU2020398125A1 (en) 2021-10-28
US11180540B2 (en) 2021-11-23
AU2025242105A1 (en) 2025-10-23
IL296863B2 (en) 2023-10-01
JP2025114741A (ja) 2025-08-05
JP2024009949A (ja) 2024-01-23
CO2021018214A2 (es) 2022-01-17
US11649273B2 (en) 2023-05-16
EP4516800A2 (en) 2025-03-05
KR20220041083A (ko) 2022-03-31
IL288355B (en) 2022-11-01
US11459373B2 (en) 2022-10-04
IL288367A (en) 2022-01-01
CN114401994A (zh) 2022-04-26
MY190626A (en) 2022-04-27
MX2022006758A (es) 2023-01-30
PE20221789A1 (es) 2022-11-25
US20250034231A1 (en) 2025-01-30
US20220162289A1 (en) 2022-05-26
US11459374B2 (en) 2022-10-04
US11407813B2 (en) 2022-08-09
SG11202110953UA (en) 2021-10-28
US12202883B2 (en) 2025-01-21
KR20220038347A (ko) 2022-03-28
US12319728B2 (en) 2025-06-03
US20230119662A1 (en) 2023-04-20
AU2023201590A1 (en) 2023-04-13
US11299532B2 (en) 2022-04-12
AU2020397803B2 (en) 2022-12-15
CN114423783A (zh) 2022-04-29
IL309560A (en) 2024-02-01
SG11202110958QA (en) 2021-10-28
CA3172631A1 (en) 2021-06-10
JP7846659B2 (ja) 2026-04-15
IL296864B1 (en) 2023-06-01
MX2022006788A (es) 2022-07-11
IL288357B2 (en) 2023-03-01
AU2020397865A1 (en) 2021-10-28
AU2020396490C1 (en) 2023-04-27
CA3172625C (en) 2026-03-17
AU2020398547C1 (en) 2023-05-11
US11542317B1 (en) 2023-01-03
KR20220038348A (ko) 2022-03-28
BR112021025158A2 (pt) 2022-06-21
AU2020397865C1 (en) 2023-04-27
KR102519236B1 (ko) 2023-04-10
SG11202110968VA (en) 2021-10-28
IL288367B2 (en) 2023-02-01
CA3172631C (en) 2024-01-02
CA3129193C (en) 2022-10-04
US11098311B2 (en) 2021-08-24
IL302538B1 (en) 2025-02-01
JP7744391B2 (ja) 2025-09-25
CA3159586A1 (en) 2021-06-10
IL309560B1 (en) 2025-01-01
AU2025263786A1 (en) 2025-11-27
MY190623A (en) 2022-04-27
IL309491B1 (en) 2025-02-01
JP2024167326A (ja) 2024-12-03
US20220227835A1 (en) 2022-07-21
US20220048975A1 (en) 2022-02-17
US11053280B2 (en) 2021-07-06
PE20221261A1 (es) 2022-08-16
US20240294606A1 (en) 2024-09-05
TW202525842A (zh) 2025-07-01
AU2020397803C1 (en) 2023-05-11
KR20220038349A (ko) 2022-03-28
EP4524236A3 (en) 2025-07-23
CN114206907A (zh) 2022-03-18
JP2024119936A (ja) 2024-09-03
IL301888B2 (en) 2025-03-01
US20220098280A1 (en) 2022-03-31
AU2023201589A1 (en) 2023-04-06
IL296864B2 (en) 2023-10-01
EP3931204A1 (en) 2022-01-05
JP2024026116A (ja) 2024-02-28
TW202509053A (zh) 2025-03-01
TW202521567A (zh) 2025-06-01
US20230357357A1 (en) 2023-11-09
KR20240007293A (ko) 2024-01-16
NZ781145A (en) 2023-05-26
UA130460C2 (uk) 2026-02-25
PE20221770A1 (es) 2022-11-11
TWI867028B (zh) 2024-12-21
KR102860764B1 (ko) 2025-09-19
KR20230152810A (ko) 2023-11-03
NZ781137A (en) 2023-05-26
UA129709C2 (uk) 2025-07-09
US20230068199A1 (en) 2023-03-02
IL288360A (en) 2022-01-01
US11732025B2 (en) 2023-08-22
JP2022548818A (ja) 2022-11-22
IL288351A (en) 2022-01-01
MY193350A (en) 2022-10-06
US11186625B2 (en) 2021-11-30
BR112021025438A2 (pt) 2022-06-21
KR20240005222A (ko) 2024-01-11
AU2023201748B2 (en) 2025-08-21
ZA202107647B (en) 2022-03-30
CO2022000660A2 (es) 2022-01-28
IL288351B2 (en) 2024-05-01
AU2020398547B2 (en) 2022-12-22
CN114206914A (zh) 2022-03-18
IL302921A (en) 2023-07-01
US20210214733A1 (en) 2021-07-15
US20220033471A1 (en) 2022-02-03
IL288360B2 (en) 2023-09-01
IL318471A (en) 2025-03-01
MX2022011973A (es) 2022-11-09
EP4524148A2 (en) 2025-03-19
US20210171605A1 (en) 2021-06-10
WO2021112928A1 (en) 2021-06-10
JP2024009950A (ja) 2024-01-23
EP3906303A1 (en) 2021-11-10
US20210214430A1 (en) 2021-07-15
KR20220035393A (ko) 2022-03-22
EP3906249A1 (en) 2021-11-10
EP4524236A2 (en) 2025-03-19
US20210206832A1 (en) 2021-07-08
JP2022547651A (ja) 2022-11-15
EP3906302A1 (en) 2021-11-10
UA130458C2 (uk) 2026-02-25
US11174283B2 (en) 2021-11-16
US20240309064A1 (en) 2024-09-19
IL296863B1 (en) 2023-06-01
MY190627A (en) 2022-04-27
US20210206833A1 (en) 2021-07-08
US20230041349A1 (en) 2023-02-09
JP2022550930A (ja) 2022-12-06
IL288360B1 (en) 2023-05-01
US20220009999A1 (en) 2022-01-13
IL302538B2 (en) 2025-06-01
MY193349A (en) 2022-10-06
ZA202107643B (en) 2026-03-25
IL304390B1 (en) 2025-01-01
IL296512B2 (en) 2023-12-01
JP7673311B2 (ja) 2025-05-08
US11472861B2 (en) 2022-10-18
NZ781143A (en) 2023-05-26
WO2021112925A1 (en) 2021-06-10
KR20230051296A (ko) 2023-04-17
US11306135B2 (en) 2022-04-19
EP4524147A2 (en) 2025-03-19
US20220033472A1 (en) 2022-02-03
MY190686A (en) 2022-05-10
KR20220038062A (ko) 2022-03-25
MX2021014863A (es) 2022-09-28
KR20230051297A (ko) 2023-04-17
MX2023014077A (es) 2023-12-11
SG11202110955VA (en) 2021-10-28
US20210171570A1 (en) 2021-06-10
EP3931303A1 (en) 2022-01-05
ZA202107646B (en) 2022-03-30
EP3906250A1 (en) 2021-11-10
IL288352B2 (en) 2023-03-01
US12012445B2 (en) 2024-06-18
EP4524148A3 (en) 2025-07-23
MX2023005421A (es) 2023-05-23
IL304390A (en) 2023-09-01
AU2023201588A1 (en) 2023-04-13
US20240317835A1 (en) 2024-09-26
ZA202308519B (en) 2025-11-26
US20220127331A1 (en) 2022-04-28
MX2021014862A (es) 2022-09-27
BR112021025432A2 (pt) 2022-06-21
AU2020398830A1 (en) 2021-10-28
AU2023201586B2 (en) 2025-08-28
US20210284684A1 (en) 2021-09-16
KR20250053206A (ko) 2025-04-21
AU2025271405A1 (en) 2026-01-08
CO2021018203A2 (es) 2022-01-17
MX2022006760A (es) 2023-01-30
AU2020398125B2 (en) 2022-12-15
BR112021025769A2 (pt) 2022-04-12
US20220009998A1 (en) 2022-01-13
BR112021025359A2 (pt) 2022-06-21
IL288357B (en) 2022-11-01
IL296863A (en) 2022-11-01
NZ781142A (en) 2023-05-26
IL288352A (en) 2022-01-01
TW202128744A (zh) 2021-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA130461C2 (uk) Композиція окиснених варіантів афліберцепту
RU2778325C1 (ru) Белковые композиции против vegf и способы их получения
RU2795973C1 (ru) Белковые композиции против vegf и способы их получения
RU2788949C1 (ru) Белковые композиции против vegf и способы их получения
RU2785994C1 (ru) Белковые композиции против vegf и способы их получения
RU2824045C2 (ru) Белковые композиции против vegf и способы их получения
HK40123787A (en) Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same
HK40123795A (en) Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same
HK40123130A (en) Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same
HK40123788A (en) Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same