UA61955C2 - Novel salts of bpc-peptides with organoprojective activity, a process for preparing and use thereof in therapy - Google Patents

Description

Опис винаходу

Даний винахід відноситься до нових форм для застосування синтетичних ВСР(сполучення для захисту організму) пептидів, що включають від 8 до 15 амінокислотних залишків з молекулярною масою від 900 до 1600 дальтон, які володіють органопротективною активністю, способам їх отримання і їх застосуванню в діагностиці і терапії.

Відомі білки і пептиди, які придатні для лікування різних захворювань людей і тварин. Багато з цих агентів утвориться іп уімо, і їх можна отримувати з тканин тварин або людей для приготування фармацевтичних 70 композицій. Прикладами фармацевтично застосовних білків і пептидів є інсулін, еритропоетин, ВМР, інтерферони і т. д. Іншим прикладом є білок шлункового соку із захисною активністю по відношенню до слизової оболонки, який Нещодавно виділили і назвали ВСР.

МО 92/04368 відноситься до ВСР, яке володіє захисною для організму активністю і має молекулярну масу приблизно 40000 дальтонів, його отриманню і його застосуванню. У УУО 93/24521 і УМО 94/11394 розкриваються

ВСР-пептиди, які володіють органопротективною активністю аналогічного типу, яка відома для вихідного

ВСР-білка. БіКігіс ей а. іп: Оідезіме Оізеазез апа Зсіепсе5, 41(1996)7, 1518 - 1526, описують

ВСР-пентадекапептид 157, який при розчиненні у воді і фізіологічному розчині виявляє лікувальну і профілактичну дію при гострому панкреатиті і супутніх ураженнях шлунку і дванадцятипалої кишки у щурів.

Таким чином, ВСР-пептиди відомі для широкої різноманітності фармацевтичних, застосувань. Однак фізико-хімічна стабільність цих пептидів, наприклад, в фізіологічному розчині, є незадовільною. Крім того, застосування ВСР-пептидів, особливо при ін'єкції у водному розчині або в фізіологічному розчині викликає біль та/або некроз.

У цій області добре відомі солі білків пептидів. Наприклад, Вегпгапа М. ей а). в: "доигпа! ої Реріїде

Кезеагсі", 49(1997)3, 269 - 272 повідомили, що дія конкретних солей дуже виборча відносно стабільності і с к що структури пептидів. Наприклад, додавання одновалентних катионів таких, як МН 4 до кінцевого 0,1 М розчину і) пептиду(полі(сІШ-І еш)) призводить до перетворення у водорозчинну бета-структуру. Навпаки, при використанні іонів Гі", Ма" або Св" перетворення не спостерігається.

Вивчали роль поверхнево-доступних іонних пар для стабільності білка при визначенні впливу доданих ю солей(КСІ, МоСі» і ГасСіз) при нейтральному і кислому значенні рН застосовано до сконструйованих помо дволанцюговими альфа-спіральними згорненими в спіраль клубками. Результати показують, що додані солі юю можуть чинити складну дію на стабільність білка, що включає стабілізацію і дестабілізацію, за допомогою чого ду загальний ефект залежить від природи заряджених залишків і іонних взаємодій, присутньої в білці І(Конп еї аї. в: "Чоигпа! ої МоїІесціаг Віоіоду", 267(1997) 4, 1039 - 10521. -

У попередніх дослідженнях на модельних пептидах також було показано, що сольові містки, розташовані і, Ге) ін4 уздовж пептидного ланцюга є більш стабілізуючими, ніж такі, розташовані і, ії-3 з перевагою для порядку кислота-основа в порівнянні з таким основа-кислота від М- до С-кінця. Однак в цей час невідомо, чи надають поверхневі сольові містки сильну стабілізуючу дію на нативну структуру білків |Вегдег еї аї., в: "оицгпа! ої «

Віо-тоІесшаг Зігисішге апа бупатісв", 14(1996) 3, 285 - 2911.

Таким чином, властивості солей пептидів відносно їх стабільності, структури і функції в дуже багато чому Ше с залежать від конкретних іонів, що беруть участь в утворенні конкретної солі, та інших внутрішніх і зовнішніх ц чинників. У цей час неможливо передбачити, які конкретні властивості може мати конкретна сіль конкретного "» пептиду.

Технічною проблемою, що лежить в основі даного винаходу є: забезпечення ВСР-пептидів в більш стабільній формі і діагностична та/або фармацевтична композиція, яка включає ВСР-пептиди, що проявляють поліпшену

Ге) стабільність і, щонайменше, таку ж фармацевтичну активність, як і самі ВСР-пептиди. Крім того, технічною -3з проблемою, що лежить в основі даного винаходу, є забезпечення фармацевтичної композиції, в якій подолані вищезгадані недоліки, зокрема, ті, що дозволяють робити безболісними ін'єкції ВСР-пептидів. (Се) Даний винахід дозволяє вирішити вказані проблеми шляхом забезпечення солей ВСР-пептидів і фармацевтичної або діагностичної композиції, що включає фармацевтично або діагностично ефективну кількість і-й солей ВСР-пептидів, де аніон солі є негативно зарядженим пептидом, що включає від 8 до 15 амінокислот, що сл має молекулярну масу від 900 до 1600 дальтонів та що має загальну формулу): (7аа Рго Рго Рго Хаа Уаа Рго Аіа)() або(ю) (І) де Хаа є залишком нейтральної аліфатичної амінокислоти, зокрема, Аа, БАПа, І еи, Пе, Су, Маї, Міе або Мма, (Ф; Уаа є залишком основної амінокислоти, зокрема, І уз, Аго, От або Ніз та ко 7аа є залишком кислої амінокислоти, зокрема, Сім, Азр, Аад або Арт і де катіон солі є катіоном неорганічної або органічної нетоксичної та фармацевтично прийнятної основи. бо Зокрема, катіон солі є лужним металом або лужноземельним металом, наприклад, Ма", К", їі", Св", Са?! чи іншим металом, наприклад, 7п" або первинним, вторинним або третинним аміном або органічною сполукою, к такою як МНа, триетаноламін", циклогексиламін", 2-АМП'(2-аміно-1-пропанол) або Трис"(Трис-(гідроксиметил) амінометан), при умові, що ці катіони є фізіологічно прийнятними.

Солі ВСР-пептидів за даним винаходом несподівано виявляють, щонайменше, таку ж фармацевтичну бо активність, як і ВСР-пептиди, і додатково значно підвищену фізіологічну стабільність в порівнянні з вільними

ВСР-пептидами або ацетатами ВСР-пептидів. Застосований за даним винаходом катіон не впливає на активність ВСР-пептидів, але збільшує їх стабільність. Солі ВСР-пептидів за даним винаходом є, наприклад, більш стабільними, ніж ВСР-пептиди або ацетати ВСР-пептидів в фізіологічному розчині або воді. Крім того, болі за даним винаходмо добре придатні для перорального введення і не проявляють небажаних побічних ефектів, таких як біль або некроз у час або після введення, зокрема, шляхом ін'єкцій. Отже, солі ВСР-пептидів за даним винаходом дозволяють поліпшити ентеральне або парентеральне введення. Крім того, солі за даним винаходом більш переважні, внаслідок відсутності яких-небудь ознак токсичності до доз 50мг/кг маси тіла.

Солі за даним винаходом можна отримати розчиненням вільного ВСР-пептиду у водному або 7/0 Водному/спиртовому розчиннику, або інших придатних розчинниках з відповідною основою і потім виділенням отриманої солі за винаходом шляхом випаровування розчинника, заморожування і ліофілізації або додавання іншого розчинника, наприклад, діетілового ефіру, до водного та/або спиртового розчину солі ВСР-пептиду, спричиняючи виділення нерозчинної сирої солі. Для отримання солі звичайно використовують один або максимум два моля основи, тобто катіону, і один моль вільного ВСР-пептиду. Для отримання основних солей 7/5 ВСР-пептиду, переважно використовують карбонати або бікарбонати лужних металів. Отримані солі пептидів добре розчинні у воді. Таким чином, даний винахід також відноситься до способу отримання солей

ВСР-пептидів.

У контексті даного винаходу, основа розглядається, як речовина, що здатна утворювати катіон у розчині, особливо у водному і водному/спиртовому розчині.

У контексті даного винаходу, фармацевтична активність включає профілактичну і терапевтичну активність.

Відповідно, фармацевтична композиція відноситься до композицій, що володіють профілактичної та/або терапевтичною активністю.

Крім того, винахід відноситься до фармацевтичної або діагностичної композиції, що включає солі

ВСР-пептидів за даним винаходом, необов'язково в поєднанні з одним або більш фармацевтично прийнятним сч об Носієм, а також засобом отримання цих композицій. Ці композиції придатні для місцевого і системного застосування, наприклад, в формі ін'єкційних розчинів, таблеток, кремів, капсул, мазей, лосьйонів, таблеток (8) під язик і т. д. Переважна доза знаходиться в межах від 10 - до 10-2мг/кг маси тіла при системному введенні, або при місцевому - в більш високих концентраціях між 0,195 і 0,595. Встановлення оптимальних доз для конкретного виду лікування може бути проведене відповідно до рівня техніки. ю

Даний винахід також відноситься до фармацевтичної або діагностичної композиції згідно вищепредставленому, яка крім однієї або більше солей ВСР-пептидів за даним винаходом, включає трегалозу, о особливо для перорального введення, та/або фармацевтично, або діагностично прийнятні носії, розчинники Ге»! та/або добавки.

Композиція, переважно, водорозчинна композиція, за винаходом в доповненні до солі ВСР-пептиду - додатково включає водорозчинний білок, що інє'ктується в рідині організму без вияву якої-небудь значної Ге) фармакологічної активності в концентрації, застосованій в одній суцільній лікарській формі за даним винаходом(в подальшому "водорозчинний білок"). В якості подібного водорозчинного білка перевага віддається сироватковому альбуміну, глобуліну, колагену та/"або желатину. Цей білок можна додавати в кількості, що « звичайно використовується в ін'єкційних фармацевтичних композиціях. Так, наприклад, масове співвідношення 0 Між водорозчинним білком та сіллю ВСР-пептиду дорівнює приблизно від 0,0001:1 до 100:1, переважно 8 с приблизно від 0,001:1 до приблизно 10:11 або більш переважно приблизно від 0,011 до приблизно 1:1. ц Далі, винахід також відноситься до самих вищезазначених солей ВСР-пептиду і композицій, що містять їх, "» зокрема, в сухій та/або суцільній формі, або у водному або водному/спиртовому розчині. Значення рН розчину, отриманого з водорозчинної композиції, або солі пептиду за даним винаходом, повинне бути таким, щоб згадане значення рН не впливало яким-небудь побічним чином на активність фармакологічно активного пептиду, і

Ге») перебувало всередині прийнятних меж для ін'єкцій загалом і також таким, щоб згадане значення рН не спричиняло значної зміни в'язкості розчину і не давало утворитися осаду і тому подібне. Таким чином, розчин - переважно буде мати рН приблизно від 6 до 9, переважно від 6/5 до 7,5. (Се) Коли водорозчинну композицію за винаходом перетворюють у водний розчин для введення, концентрація фармакологічно активної солі пептиду в згаданому розчині повинна бути приблизно від 0,0000001 до і-й 1096(маса/об'єм), більш переважно приблизно від 0,000001 до 5Боб(маса/об'єм) або найбільш переважно с приблизно від 0,00001 до 195(маса/об'єм).

Композиція за даним винаходом переважно повинна мати разову дозовану форму, що містить фармакологічно активну сіль ВСР-пептиду за винаходом і, якщо необхідно, разом з додатковими добавками, такими як вищезазначений водорозчинний білок. Таким чином, наприклад, два з трьох вищезазначених компонентів призначені для вміщення в ампулу або флакон при їх розчиненні або суспендуванні в стерильній

Ф, воді або стерильному фізіологічному розчині. У цьому випадку, спосіб отримання може включати змішання ко розчину фармакологічно активної солі ВСР-пептиду і додатково, якщо необхідно, розчину добавки, або додавання добавки в формі порошку до розчину фармакологічно активної солі ВСР-пептиду, або іншу бо комбінацію відповіднихфіг.процедур. Лікарську форму можна також приготувати додаванням стерильної води або стерильного фізіологічного розчину до ліофілізату або висушеному у вакуумі порошку, в якому разом присутні фармакологічно активна сіль ВСР-карбонати і, якщо необхідно, добавка. Ця суцільна лікарська форма може містити одну або більше звичайних добавок таких, як регулювальники рН(наприклад, гліцин, соляна кислота, гідроксид натрію), місцеві анестетики(наприклад, ксилокаїн гідрохлорид, хлорбутанол), ізотонізуючі 65 агенти(наприклад, хлорид натрію, маніт, сорбіт), емульгатори, інгібітори адсорбції(наприклад, Твін? 60 або 80), тальк, крохмаль, лактоза і трагакант, стеарат магнію, гліцерин, пропіленгліколь, консерванти, бензиловий спирт, метилгідроксибезоат та/або арахісове гідрогенізоваване масло. Ця суцільна лікарська форма може додатково містити фармакологічно прийнятні наповнювачі такі, як поліетиленгліколь 400 або декстран.

Водорозчинна композиція за даним винаходом переважно має форму препарату для парентерального введення. В якості згаданого препарату для парентерального введення переважними є ін'єкційні розчини, розчини для введення через слизову оболонку, розчини для введення в ніс та вуха.

Згадані ін'єкційні розчини включають розчини для внутрішньовенного введення, підшкірного введення, внутрішньоартеріального введення, внутрішньом'язового введення і внутрішньоочного введення. Ці тривало діючі препарати можна легко набрати з ампули або флаконів в шприци. Якщо при наборі утворяться пухирці, то 7/0 Від них можна легко позбутися при простому стоянні протягом короткого періоду часу.

Композиції за даним винаходом можуть бути в формі розчиненій у воді, або в ліофілізованій формі з кристалізуючою розчинною речовиною такою, як хланіт. Додавання стерильної води або стерильного фармакологічного розчину до ліофілізату призводить до утворення водного розчину.

Тонічність водного розчину водорозчинної композиції за даним винаходом повинна бути в межах /5 переносимості при введенні і регулюватися, наприклад, ізотонічними агентами, такими як хлорид натрію і маніт.

Тонічність переважно від наполовину до двох разів вище такої для фізіологічного розчину, більш переважно складає від трьох чвертей до півтори від такого фізіологічного розчину.

В'язкість водного розчину водорозчинної композиції повинна бути досить низькою для ін'єкційного введення.

В'язкість переважно складає нижче за 500сПз, більш переважно нижче за 400сПз. Значення в'язкості

Відповідають таким заміряним при використанні віскозиметра типу Е(ТОКІМЕС, Японія) з воронкою ГО при 2570.

Коли композиція знаходиться в формі ліофілізату, переважно, щоб в'язкість, тонічність і концентрації компонентів у водному розчині, отриманому з нього, знаходилися всередині відповідних меж, згаданих вище.

Композицію за даним винаходом готують змішанням цих інгредієнтів звичайним способом. Мета зміщення інгредієнтів за даним винаходом повинна бути такою, щоб зберігалася активність фармакологічно активної солі сч ов ВСР-пептиду і утворення пухирців під час способу зводилося до мінімуму. Інгредієнти вміщують в судину(наприклад, бутель або барабан) в один і той же час, або в будь-якому порядку. Атмосферою в судині і) може бути, наприклад, стерильне чисте повітря або стерильний чистий азот. Розчин, що утворився, можна перенести в невеликі флакони або ампули, і його можна потім піддати ліофілізації.

Рідку форму або ліофілізовану порошкову форму композиції за даним винаходом можна розчинити або ю зо диспергувати в розчині біодеградованого полімеру такого, як співполімер полі(молочної-гліколевої) кислоти, полі(оксимасляна кислота), співполімер(поліоксимасляної-гліколевої) кислоти або їх суміші, і потім можна о ввести, наприклад, в плівки, мікрокапсули(сферичні мікрогранули) або нанокапсули(сферичні наногранули), Ге! особливо в формі м'яких або жорстких капсул.

Крім того, композицію за даним винаходом, включену в ліпосоми, що включають фосфоліпіди, холестерин -- або їх похідні, можна додатково диспергувати в фізіологічному розчині і розчині гіалуронової кислоти, «о розчиненій в фізіологічному розчині.

М'яку капсулу можна заповнити рідкою формою композиції за даним винаходом. Тверді капсули можна заповнити ліофілізованим порошком композиції за даним винаходом або ліофілізований порошок за даним винаходом можна спресувати в таблетки відповідно для ректального призначення або перорального введення. «

Звичайно, композицію за даним винаходом можна постачати в заздалегідь наповненому шприці для в с самовведення.

Композицію за даним винаходом можна зберігати при звичайній температурі такій, як від -10"С до «30"С або з в межах звичайного охолоджування, переважно приблизно від 42"С до к87с.

Винахід також відноситься до нових областей застосування та засобів лікування із застосуванням вищезазначених солей та/або композицій, особливо відносно лікування порушень, пов'язаних або з утворенням

Ге» оксиду азоту(МО), або з ослабленням функцій МО-системи, зокрема, гіпертензії, стенокардії, імпотенції, циркуляторного і септичного шоку, інсульту, запалення, респіраторного дистрес-синдрому, адгезії і агрегації - тромбоцитів і лейкоцитів, дисфункції ендотелію, уражень шлунково-кишкового тракту, порушень перистальтики,

Ге) цукрового діабету, панкреатиту, гіпотензії і хвороби Паркінсона; дисфункцій або гіперфункцій соматосенсорних 5о Нервів, зокрема, сенсорної невропатії, постгерпетичної невралгії, атопічного дерматиту, слабого загоєння о травмованої тканини, набутої кропивниці на холод і тепло, псоріазу, бульозного пемфогоїду, екземи, сп фотодерматозів, хронічного артриту і специфічної і неспецифічної гіперактивності верхнього і нижнього відділів дихальних шляхів(бронхіальної астми, риніту); порушень функції ендотелію; ран, виразок; станів, пов'язаних з гострими/або хронічними запаленнями, зокрема, хронічного артриту і захворювань, пов'язаних з дв ГПіперчутливістю уповільненого типу, і уражень шлунково-кишкового тракту; захворювань печінки, уражень органів, індукованих вільними радикалами, особливо, викликаних опроміненням; захворювань, пов'язаних з

Ф) порушеннями катехоламінергійної системи, зокрема, шизофренії, ефектів, викликаних амфетаміном, ка зловживання наркотиками; станів, пов'язаних зі стресом; гострого панкреатиту з додатковим стимулюючим впливом на супутню патологію шлунка і дванадцятипалої кишки; серцевих порушень, зокрема, антиаритмічного, бо антиангінального і кардіопротективного лікування; депресивних розладів; хвороби Паркінсона і патологія, подібна хвороба Паркінсона; температурних порушень; пошкоджень кісток; пошкоджень різних органів, індукованих гіпертензією; порушень коагуляції; больових порушень; судом; травми спинного мозку; алкогольних пошкоджень, індукованих зловживанням алкоголем або підвищеним споживанням алкоголю; ішемічних порушень мозку; пошкоджень периферичних нервів; каталептичних захворювань і нейролептичних розладів; 65 Захворювань, пов'язаних з аномальними або мутантними лімфоцитами; порушень у плодів; атрофії піхви і розвитку остеопорозу, викликаних видаленням яєчників; пухлин; вірусних захворювань, зокрема, СНІД або

СНІД-асоційованого комплексу; порушень пізнавальної здатності; порушень відміни; порушень нирок і порушень клітинної імунної реакції у відповідь.

Крім того, даний винахід відноситься до солі ВСР;-пептиду або фармацевтичної або діагностичної композиції згідно з вищепредставленим, де загальною формулою) є

Хаа 7аа Ро Рго Рго Хаа Уаа Рго Аа Авр 7аа

Аа Хаа Хаа ХаакцІ).

Даний винахід відноситься, зокрема, до солі ВСР;-пептиду або фармакологічної або діагностичної композиції, що включає сіль ВСР-пептиду вищезазначеної загальної формули(І), де пептид вибирається з групи, що /о складається з

Ї еи СіІш Рго Рго Рго Су І уз Рго Аа Авр Агвр Аа ГІ еи Су Маї;

Су Сію Рго Рго Рго Су Гуз Рго Аа Авр Авр Аїа Су І еи Маї (а також зазначений ВРС157):

Ї еи СіІш Рго Рго Рго І еиц І уз Рго Аа Авр Авр Аа І еи Су Маї;

Ї ем СіІш Рго Рго Рго І еи | уз Рго Аїа Авр Аа І еи Су Маї;

Су Сію Рго Рго Рго Су Гуз Рго Аа Азвр Аїа Су ГІ еи Маї;

Сім Рго Рго Рго Г еи | уз Рго Аїа;

Авгр Рго Рго Рго Іе Аго Рго Аїа Агвр;

Сім Рго Рго Рго І еи І уз Рго Аа Агвр;

Ї ем СіІш Рго Рго Рго І еи | уз Рго Аїа Авр Аа І еи Су Маї;

Су СіІш Рго Рго Рго Су Агоу Рго Аа Азр

Та біц Рго Рго Рго І еи І уз Рго Аа Авп.

Ці пептиди відомі з МО 94/11394 і МУО 93/24521, зміст яких включений в дане розкриття відносно сч ов приготування і використання ВСР-пептидів.

Крім того, пептиди можна приєднати до інших функціональних та/або структурних часток таких, як і) вуглеводень, жири, білки або пептиди, антитіла, рецептори, гормони, цитотоксичні речовини, маркери, фарби, радіоактивні мітки, імуномодулятори, лікарські препарати, носії, мішеньові або сигнальні речовини і т. п.

Крім того, винахід відноситься до вищезазначених солей ВСР-пептидів і композицій, де пептид знаходиться в ю зо лінійній або циклічній формі, зокрема, циклізований амідним зв'язком між першим і останнім амінокислотним залишком. юю

Винахід зараз буде пояснений більш детально за допомогою пояснювальних прикладів і супроводжуючих б фігур. На Фігурах показано:

На Фігурі 1 показаний ІК-спектр МавРС157. --

На Фігурі 2 показаний ІК-спектр МагВРС157. «о

На Фігурі З показаний ІК-спектр дицезієвої солі ВРС157(С52ВРС157).

На Фігурі 4 показаний ІК-спектр Трис-солі ВРС157(Тріс-ВРС157).

На Фігурі 5 показаний ІК-спектр ді-Трис-солі ВРС157(Тріс)»ВРС157).

На Фігурі 6 показаний ІК-спектр 2-амінопропанолової солі ВРС157(2-АМП-ВРС157). «

На Фігурі 7 показаний ІК-спектр триетаноламінової солі ВРС157/ТЕАМ-ВРС157). з с Приклад 1: отримання мононатрієвої солі ВРС157(МавРС157). . 0,5((0,35ммоль) пентадекапептиду з послідовністю Су СІш Рго Рго Рго Су Гув Рго АїЇа Авр Агвр Аїа Оу І еи и?» Ууак(вРСІ157) розчиняли в 1Омл води, що містить 29,бмг бікарбонату натрію(0,35ммоль), стерилізували, пропустивши через 0,2у, фільтр і сушили сублімаційною сушкою для отримання 0,48г не зовсім білої твердої речовини.

Ге»! Чистота отриманої солі: 99,49(ВЕРХ). з Мас-спектр(РАВ): 1419, більш високі іони при 1141(М'Ма").

Амінокислотний аналіз отриманої солі пептиду після гідролізу 6Н НОСІ протягом 72 годин в запаяній пробірці (се) при 1107С давав значення, відповідні складу: ЗСУ, 4Рго, 2АПа, 2Агр, СІМ, І ем, Маї, Г ув.

ІК-спектру(КВг): фігура 1. п УФ-спектр(Н20): Хуако 7 19Онм, інших максимумів немає. сл Т. пл.: 288 - 290"С(розкладання).

Приклад 2: отримання динатрієвої солі ВРСІ57(Ма 2ВРС157). 0,5((0,35ммоль) ВРС157 розчиняли в 10 мл етанолу. Додавали 1,4мл 0,5 моль/л метанольного розчину гідроксиду натрію при помірному перемішуванні. Цей розчин стерилізували, пропускаючи через 0,2у фільтр, і повільно додавали при перемішуванні до діетілового о ефіру(5Омл). Відділену білу тверду речовину фільтрували і промивали діетиловим ефіром для отримання 0,52г дінатрієвої солі. іме) Чистота отриманої солі: 99,49(ВЕРХ).

Мас-спектр(ЕАВ): 1419, більш високі іони при 1141(М'Ма"), 14 64(М'Ма?2"), бо Дані амінокислотного аналізу отриманої солі пептиду відповідають ЗУ, 4Рго, 2Аїа, 2Авр, СІМ, І ем, Маї, Гуз

ІК-спектру(КВг): фігура 2

УФ-спектр(Н20): Хуако 7 19Онм, інших максимумів немає.

Т. пл: 275-27776.

Приклад 3: отримання дицезієвої солі ВРС157(С52ВРСІ157) 0,5((0,35ммоль) ВРС157 розчиняли в 8мл води, бо що містить 114мг карбонату цезію(0,7Оммоль), стерилізували, пропускаючи через О,2у фільтр, і ліофілізували для отримання 0,55г не зовсім білої твердої речовини.

Чистота отриманої солі: 99,39(ВЕРХ). з

Мас-спектр(ЕАВ): 1419, більш високі іони при 1551(М'Св"), 1684(М' 82). 2 Дані амінокислотного аналізу отриманої солі пептиду відповідають складу: ЗОу, 4Рго, 2АїЇа, 2Авр, ОМ,

І ем, МаЇ, І ув.

ІК-спектру(КВг): фігура 3.

УФ-спектр(Н20О): Хуако 7 19Онм.

Т. пл.: 26870

Приклад 4: отримання Трис-солі ВРС157(Тріс-ВРС157). 0,5((0,35ммоль) ВРС157 розчиняли в 1Омл метанолу, що містить 42,6мг(0,З35ммоль) трис-(гідроксиметил)- амінометану(Трис), стерилізували, пропустивши через 0,2М(фільтр і сушили при випаровуванні метанолу у вакуумі при 40"С для отримання 0,56бг білої твердої речовини.

Чистота отриманої солі: 99,59(ВЕРХ). 19 Мас-спектр(ЕАВ): 1419(МН).

Дані амінокислотного аналізу отриманої солі пептиду відповідають складу: ЗСУ, 4Рго, 2АїЇа, 2Авр, ОМ,

І ем, МаЇ, І ув.

ІК-спектру(КВг): фігура 4.

УФ-спектр(Н20О): Хуако 7 19Онм.

Т. пл.: 250"С(розкладання).

Приклад 5: отримання ді-Трис-солі ВРС157((Трис) «ВРС157). Сполучення готували способом, описаним в прикладі 1, за винятком того, що використали 85,2мг(0,7Оммоль) Трис. Чистота отриманої солі: 99,59(ВЕРХ).

Мас-спектр(РАВ): 1419(МН"). Дані амінокислотного аналізу отриманої солі пептиду відповідають складу: сч ре ЗОу, 4Рго, 2Аїа, 2Авр, СІМ, І ем, Маї, І ув.

ІК-спектру(КВг): фігура 5. (о)

УФ-спектр(Н20О): Хуако 7 19Онм.

Т. пл.: 188 - 19376.

Приклад 6: отримання 2-амінопропанолової солі ВРС157(2-АМП-ВРС157). ю зо Сполучення готували способом, описаним в прикладі 1. За основу використали 2-амінопропанол(2-АМП).

Чистота отриманої солі: 96,69(ВЕРХ). іт)

Мас-спектр(ЕАВ): 1419(МН). б

Дані амінокислотного аналізу отриманої солі пептиду відповідають складу: ЗСУ, 4Рго, 2АїЇа, 2Авр, ОМ,

І ем, ма, Гув. -

ІК-спектру(КВг): фігура 6. «я

УФ-спектр(Н20): Хуакс 7 19Онм.

Т. пл.: 158"С(розкладання).

Приклад 7: отримання триетаноламіновий солі ВРС157/ТЕАМ-ВРС157).

Сполучення отримували способом, описаним в прикладі 1. За основу використали триетаноламін(ТЕАМ). «

Чистота отриманої солі: 99,29(ВЕРХ). - с Мас-спектр(ЕАВ): 1419(МН). а Дані амінокислотного аналізу отриманої солі пептиду відповідають складу: ЗОу, 4Рго, 2АїЇа, 2Авр, ОМ, "» І ем, МаЇ, І ув.

ІК-спектру(КВг): фігура 7.

УФ-спектр(Н20О): Хуако 7 19Онм. (22) Т. пл.: 202 - 20576. - Приклад 8: отримання таблеток, що містять Тріс-ВРС157.

І«е) Склад: мг/таблетку

ТРИС-ВРС157 0,5 і-й Трегалоза 20,0 сл Лактоза 17,0

Крохмаль 6,5

Тальк 3,0

Трагакант 2,5

Магній стеарат 0,5 о БО Омг іме)

Трис-ВРС157(0О,5мг) і трегалозу(2Омг) розчиняли в 1мл води і сушили при випаровуванні. Після висушування бо сирий залишок змішували з іншими інгредієнтами для приготування таблеток.

Приклад 9: отримання капсул, що містять МавРС157.

Склад: мг/капсулу

МаврРс157 0,5 65 Трегалоза 60,0

Лактоза 39,0

Магній стеарат 0,5 100,Омг мавРС157(0,5мг) і трегалозу розчиняли в 1мл води і сушили при випаровуванні розчинника. Сирий залишок змішували з іншими інгредієнтами для отримання капсул.

Приклад 10: отримання розчину, що містить МавРС157.

Склад: г/25мл

МаврРс157 0,05

Гліцерин 15,00

Бензиловий спирт 0,01 буфер рН 7,0, доданий до 25Бмл 18 Приклад 11: отримання крему, що містить Трис-ВРС157.

Склад: г/25г

Трис-ВРС157 0,05

Емульгатор 2,80

Арахісове гідрогенізоваване масло 7,08

Твін? во 12,08

Пропіленгліколь 3,00 метилгідроксибезоат 0,07 25,00г с

Приклад 12: тести по стабільності. о

Стабільність солей ВСР-пептиду тестували при інкубації солей протягом 76 і 120 днів при 407.

Концентрація солей ВСР-пептиду у водному розчині дорівнювала 0,295(маса/об'єм). Стабільність визначали, використовуючи ВЕРХ: колонка з Кготавзії 100,5М 150х4,бмм, рухома фаза 0,196 трифторооцтова кислота у воді/ацетонітрілі(від О до 50 об'ємних 95), градієнтне елюювання протягом 25хв, швидкість потоку Тмл/хв, юю детектування: ю

УФ при 214нм.

Для порівняння використали вільний ВСР-пептид і його моноацетат. Ме. - зв ЖШ8ВЬ 2 ж (ЩЯ- - 56(6( .Д« Ж Ж Ж ЖЖЖ З 2 «0 - «----- Ф нн « о 2 с їз» 5 здмпальвистї 10000820 5960 вв 95 о -

Дані, що наведені в цій таблиці, чітко показують підвищену стабільність солей ВСР-пептиду за даним і, винаходом в протилежність вільному ВСР-пептиду або його моноацетату. Крім того, можливо, внаслідок «сл 20 високого значення рН розчину солей ВСР-пептиду, ін'єкційне введення цих розчинів не викликає якого-небудь болю або некрозу. сл У іншому окремому досліді додаткове поліпшення стабільності солей ВСР-пептиду за даним винаходом в сирій формі і в розчині спостерігали після додавання трегалози. Отже, додавання трегалози в якості фармацевтично прийнятної добавки для приготування фармацевтичної композиції, зокрема, в формі таблеток 22 або капсул, є іншим важливим аспектом даного винаходу.

ГФ) Наступні приклади описують досліди, що показують фармацевтичну активність солей ВСР-пептиду за даним винаходом. Ці досліди провели, використовуючи різні звичайні моделі в умовах "іп мійго" і "іп мімо". Для ді дослідів використали мононатрієву сіль ВСР-пептиду 157(скор.: МавРС157), якщо не зазначено особливо. У всіх дослідах використали щурів-самців Вістар з масою тіла 250 - 280г, якщо не зазначено особливо. 60 Приклад 13: МО-система

Введення:

Оксид натрію(МО) діє як сигнальна молекула в ендотеліальних і нервових клітках і в якості молекул-вбивць, що активуються клітками імунної системи. Нещодавно проведені дослідження показали, що її можна використати як лікарський препарат при інгаляції. Виявилося, що в основному, або при надлишку, або при ослабленні, МО бо викликає або вносить свій внесок в розвиток різних порушень, зокрема, гіпертензії, стенокардії, імпотенції,

циркуляторного шоку, септичного шоку, інсульту, запалення, респіраторного дистрес-синдрому, легеневої гіпертензії, адгезії і агрегації тромбоцитів і лейкоцитів, цукрового діабету, гіпотензії і хвороби Паркінсона.

Матеріали і методи:

Деякі з ефектів МаВвРС157(1Омкг або 1Онг/кг) такі, як цілющу активність при ураженнях шлунка і активність

МавРС157 відносно підтримки кров'яного тиску, відтворювали на пацюках. Патологічні зміни шлунка викликали обробкою етанолом протягом (1 години(9б95 в/ш(внутрішньошлунково)). Одночасно вводили

МмавРС157(в/ч(внутрішньочеревно)). У досліді по підтримці кров'яного тиску МавВРС157 вводили внутрішньовенно(в/в). 70 Також оцінювали спільне введення метилового ефіру МО-нітро-1! -аргініну( -МАМЕ)Х5мг/кг в/в), конкурентного інгібітору утворення окислу азоту(МО) в ендотелії і попередника МО І -аргініну(20Омг/кг в/в)(О-аргінін був не ефективний). У дослідах з ураженням шлунка МО-агенти вводили за 5 хвилин до впливу етанолу і лікування

МавРС157.

Результати:

На моделі з етанолом, введений один МавРС157 володіє противиразковою дією, як і І -аргінін. МавРС157 запобігав в противному разі сильним патологічним змінам шлунка, що спостерігаються у оброблених етанолом щурів. Ї-МАМЕ не надавав ефекту. /-МАМЕ повністю знімав активність І-аргініну, але тільки ослаблював активність МавРС157. Після застосування комбінації І-МАМЕ «ж І -аргініну, активність МавРС157 додатково ослаблювалася.

У дослідах по кров'яному тиску МавРС157(без дії на основні нормальні значення) в порівнянні з І -аргініном надавав як подібну дію(зменшував підйом кров'яного тиску під дією І -МАМЕ при профілактичному застосуванні і знижував вже високі значення під дією І-МАМЕ при введенні на фоні максимального підйому тиску під дією

ІГ-МАМЕ(тобто через 10 хвилин після І-МАМЕ)), так і профілактичну дію(помірне зниження кров'яного тиску під дією І -аргініну запобігалося МавРС157 перед введенням першого). Коли МавРС157 вводили через 10 хвилин сч ов Після застосування комбінації І-МАМЕ « І -аргініну(що також приводить до підвищення кров'яного тиску) його чіткий ефект(відмічений на оброблених І-МАМЕ пацюках) зник. В умовах іп міїго, в гомогенатах слизової шлунка і) щурів, МавРС157, використаний в тій же дозі(10ОмкМ), що і І -аргінін, індукував порівнянне утворення МО. Але дія МавРС157 не інгібувалася ІЇ-МАМЕ навіть в десятиразовій(10О0 проти 1000мкМ) дозі, яка необхідна для інгібірування ефекту І -аргініну. З іншого боку, синтез МО знижувався при спільному введенні МавРС157 та ю зо І-аргініну. У результаті, Мавес157 може особливим способом надавати дію на ефекти МО як відносно цілісності слизової шлунка, так і підтримки кров'яного тиску особливо в поєднанні з І -аргініном, маючи більш виражену о та/або довершену відрізняючуюся дію на ефекти МО. Ге!

Володіючи більш вираженою дією на МО, ніж це робить І -аргінін, МаВвРС157 може попереджувати надмірне утворення МО, пов'язане з побічними ефектами(порушена дія І -аргініну(наприклад, гіпотензії)). Ці побічні -- ефекти в умовах іп мімо мають зворотний розвиток до нормальних значень, і в умовах іп міго запобігається «о надмірне утворення МО. Крім того, усуваються негативні наслідки інгібірування МО-системи(наприклад, попередження індукованого | -МАМЕ підвищення кров'яного тиску і зворотний розвиток гіпертензії, що вже виникла під дією І -МАМЕ).

Засновуючись на близькій схожості МО-тестів для інших тканин(наприклад, легень, печінки, кровоносних « будин іт. д.) і відмінностей використаних моделей(ураження шлунка і підтримка кров'яного тиску), є очевидною з с відзначена позитивна дія МавРС157 у відношенні як надмірного утворення МО, так і ослаблених функцій . МО-системи. Зокрема, солі ВСР-пептидів за даним винаходом корисні для лікування гіпертензії, стенокардії, а імпотенції, циркуляторного шоку, септичного шоку, інсульту, запалення, респіраторного дистрес-синдрому, легеневої гіпертензії, панкреатиту, адгезії і агрегації тромбоцитів і лейкоцитів, дисфункція ендотелію і

Хвороб Паркінсона.

Ге» Приклад 14: соматосенсорні нейрони

Вступ: - Соматосенсорні нейтрони в основному беруть участь в регуляції гомеостазу, особливо в реакції на зміни

Ге) гомеостазу. Ці нейрони можуть сигналізувати про потенційну небезпеку. Нейрони, самі по собі, здатні відразу ж ініціювати відповідні дії для пом'якшення небезпеки. Таким чином, вазоактивні аферентні нейрони о представляють систему захисту першої лінії від травми. В основному цю захисну здатність спостерігали при сп експериментальному пошкодженні шкіри і слизистої шлунково-кишкового тракту. У розвитку найрізноманітніших захворювань беруть участь як дисфункції, так і гіперфункції, зокрема, природжена сенсорна невропатія, сенсорна невропатія, виникаюча при діабеті, оперізувальному лишаї, невралгії після оперізувального лишая, дв атопічного дерматиту, слабкому загоєнні травмованої тканини(наприклад, стійкі шкірні поранення, погіршення уражень шкіри, що виникли під дією кислоти і утворення кератитоподібних патологічних станів рогівки), набутої

Ф) кропивниці на холод і тепло, псоріазі, бульозному пемфогоїді, екземі, фотодерматозах, порушеннях верхніх і ка нижніх відділів дихальних шляхів, специфічній і неспецифічній гіперактивності, вазомоторному риніті, астмі, хронічному артриті та ураженнях шлунково-кишкового тракту. во Матеріали і методи:

Вивчали гастропротективну дію МавРС157 на дільницях ураження шлунка(відтворені на пацюках обробкою 9695 етанолом, стресом і обробкою індометацином). Оцінювали можливу участь сенсорних нейронів в лікувальних ефектах МавРС157(1Омкг/кг, 1Онг/кг, в/ч) з капсаїцином, який має абсолютно протилежну дію на сенсорні нейрони: введення дорослим тваринам у високих дозах(125мг/кг, п/ш(підшкірно) у віці З місяців) і 65 призначення(5Омг/кг, п/ш) новонародженим(у віці 7 днів) руйнує волокна сенсорних нервів, в той час, як низькі дози(50Омкг/кг в/ч) активують вивільнення нейропередавача і володіють захисною дією для слизової.

Результати:

І) У відсутності капсаїцину МавРС157 захищав слизову шлунка від етанолу, стресу і введення індометацину.

І) У присутності нейротоксичних доз капсаїцину негативний вплив капсаїцину на стрес ділянки ураження під дією етанолу або індометацину, що не подавляється, послідовно негативно вплинув на цілющу активність

МмавРС157. Захисна дія МавРС157 була як і раніше очевидною на моделях, оброблених капсаїцином(як на оброблених дорослих пацюках, так і новонароджених) у всіх цих тестах. Після обробки капсаїцином новонароджених тварин було відмічене повне усунення захисту шлунка під дією МавРС157, якщо МавРС157 вводили одноразово в нг-дозах. Захисна дія повністю відновлювалася, коли препарат вводили в тій же дозі 7/0 ЩОДНЯ.

І) У поєднанні із збуджуючою дозою капсаїцину, корисна активність МавРС157 додатково підвищувалася.

При спільному розгляді ці дані показують складну синергетичну взаємодію між корисною активністю

МмавРС157 і активністю пептицергетичних сенсорних аферентних нейронів. Беручи до уваги близьку схожість дії капсаїцину у тварин і людей і вищеописаний досвід, МавРС157 можна використати для лікування /5 Вищезазначених порушень.

Приклад 15: захист ендотелію.

Вступ:

Відомо, що пошкодження судинного ендотелію передують розвитку і є істотними сприятливими чинниками для великих пошкоджень органів. Захист ендотелію може зменшити ушкоджуючий вплив ішемії на цілісність слизової. В якості придатної моделі широко прийняте використання моностралу синього на щурах незадовго перед застосуванням некротизуючих агентів(наприклад, етанол, що використовується внутрішньошлунково), відомих як такі, що приводять до великих пошкоджень.

Матеріали і методи:

Всім щурам вводили в/в монострал синій(МВ)(Зідта Сотрапу, СШАХ1, Омл/кг маси тіла) за З хвилини до сч ов введення етанолу. Щурів умертвляли через 1 хвилину після застосування етанолу. За 1 годину перед обробкою етанолу вводили МавРС157(10,Омкг/кг, в/ч) або фізіологічний розчин(5,Омл/кг, в/ч). Відразу ж після забою і) витягували шлунок, і незацікавлені спостерігачі оцінювали ділянки ураження. Характерні ділянки шлунка і дванадцятипалої кишки обробляли для подальшого гістологічного аналізу.

Пошкодження судин оцінювали в ранньому періоді(ї хвилина після обробки етанолом), використовуючи ю зо Метод з монастралем синім(МВ). Ареальну щільність забарвленої слизової досліджували ТЕМ.

Результати: о

Сильне зниження забарвлення МВ було послідовно відзначене в групах, оброблених МавРС157. Близька Ге! схожість використаних моделей із захворюваннями людини демонструє застосування МавРС157 для лікування захворювань, пов'язаних з порушеннями ендотелію в медицині. --

Приклад 16: ангіогенез. «о

Вступ:

Ангіогенез має вирішальне значення для утворення грануляційної тканини і загоєння ран та/або виразок.

Використовуючи добре відомий метод, оцінювали ангіогенні властивості.

Матеріали і методи: «

Кожному щуру в поперековій області підшкірно імплантували два стерильних тампони(1см х їсм х 0,25смМ(М - 0/птв) с 0,25мл)) з однаковими кількостями МавВРС157(розчин 5БОмкг, 1Омкг, 1Онг/мл) або стандартних агентів, . циметидину(1Омг, 1О0Омг, 50Омг/мл), ранітидину(2,5мг, 25мг, 25О0мг/мл), фамотидину(1Омг, 5Омг, 1ООмг/мл) і и?» сукралфату(тмг, б5мг, 1Омг/мл). Тампони видаляли через три і сім днів. Потім їх фіксували в формаліні і обробляли для гістологічної і гістохімічної оцінки і морфометрії. Використаний мікроскоп був: І ей, СІАРІГАМ; для морфометричного аналізу застосовували програму "ЗОКМ" МАМ5, Загреб, Стгоайа.

Ге» Результати:

Знов утворену грануляційну тканину навколо імплантованого тампона постійно використовували як цінне - кількісне визначення реакції хазяїна на чужорідне тіло. Досліди на щурах забитих через три дні після

Ге) імплантації, показали наступне: в групах тварин оброблених МавРС157, було виявлено значно більше грануляційної тканини в порівнянні з контрольними значеннями. Аналогічні результати були виявлені у щурів, о оброблених сукралфатом при всьому використаному дозуванні. У протилежність цьому, не спостерігали сп відмінності між контрольними значеннями і агентом, що аналізується в групах, оброблених всіма трьома

Но-блокаторами. Тварини, убиті через сім днів після імплантації, при обробці сукралфатом у всіх трьох дозах і при обробці МавРС157 в найвищій дозі(5Омкг) достовірно відрізнялися в порівнянні з контрольною групою. дБ Контрольні значення значно не відрізнялися по показниках між двома термінами забою.

У грануляційній тканині, що знову утворилася, підраховували кількість ендотеліальних просторів. У

Ф) порівнянні з контрольними значеннями(число знову утворених ендотеліальних просторів в контрольній групі ка через три дні після імплантації становило 7,94-1,23 і через сім днів після імплантації - 14,8:53,12), всі використані речовини приводили до достовірного підвищення показників на обидва інтервали(третій і сьомий во день).

У доповненні до доказу того, що різні противиразкові препарати володіють ангіогенними властивостями, мМавРС157 також стимулював утворення грануляційної тканини, як це робить сукралфат. Отже, МавРС157 можна використати для ініціації і підтримки процесів загоєння, зокрема, загоєння ран та/або виразок.

Приклад 17: запалення. 65 Вступ:

Протизапальні препарати, що використовуються в цей час, звичайно оцінюють на багатьох придатних моделях, що близько представляють гострі та/або хронічні запальні порушення у людей. Однак виявилося, що тяжкі ураження шлунково-кишкового тракту є основним побічним ефектом цих агентів.

Для МавРС157 була відмічена активність проти гострого запалення і болезаспокійлива активність(наприклад, при впливі турпентином, карагіном, оцтовою кислотою або МазО,) (залежне від простагландинів, незалежне від простагландинів, досліди зі стисканням хвоста) нарівні з жарознижуючим ефектом(зниження викликаної дріжджами лихоманки(400Омг/кг, п/ш)). Отже, одночасно на пацюках оцінювали його лікувальну дію на ураження шлунково-кишкового тракту, його дію на хронічне запалення таке, як ад'ювантний артрит; його дію як нестероїдного протизапального агента при ураженнях шлунково-кишкового тракту, що виникли під дією НСПВС. 70 Матеріали і методи:

У дослідах з ураженнями шлунково-кишкового тракту(індометацин(ЗОмг/кг, п/ш), аспірин(4ООмг/кг, в/ш) і диклофенак(125мг/кг, в/ч)) МавРС157(1Омкг або 10Онг/кг, в/ч) вводили відповідно або одночасно та/або за одну годину до введення препарату(індометацин). У разі ад'ювантного артриту(на хвіст наносили по О0,2мл ад'юванту

Фрейнда)(14 днів, ЗО днів, один рік), МавРС157(1Омкг або 1Онг/кг, в/ч) застосовували у вигляді однократного введення(за 1 годину до або після нанесення ад'юванту Фрейнда або один раз на день протягом періоду 0 - 14-й день, 14 -30-й день і 14-й день - один рік).

Результати:

При спільному введенні з НСПВС, що тестується, МавРС157 послідовно зменшував в противному разі виражені дільниці ураження в шлунку контрольних щурів, а також дільниці ураження в тонкому кишечнику в 2о групах тварин, оброблених індометацином. У дослідах з ад'ювантним артритом, розвиток уражень був значно знижений після однократного введення МавРс157 і ще більш ослаблявся у щурів при щоденному застосуванні мавРС157. При лікуванні ад'ювантного артриту, що вже виник, цілющий ефект МавРсС157 послідовно з'явився тільки через два тижні введення, і він чітко був очевидний через один рік застосування. Ці дані показують протизапальну і захисну дію МавРС157 відносно цілісності слизової. сч

Відомо, що в розвитку ад'ювантного артриту беруть участь два різних механізми, запалення і гиперчутливість уповільненого типу. МавРС157 позитивно впливає на обидва. У порівнянні зі стандартами(тобто і) аспірин, індометацин) МавРС157 був ефективний в значно більш низьких дозах(мкг абонг/кг протимг/кг). Ця первинна ефективність в попередженні ад'ювантного артриту ще більш посилюється при щоденному введенні.

Більш високе дозування(1Омкг/день) було ефективним як при однократному, так і щоденному введенні, в той час ю зо як більш низьке дозування(1Онг/кг), раніше неефективне при одноразовому введенні, стає ефективним при щоденній схемі застосування. Виявлення цього факту нарівні з терапевтичною ефективністю МавРС157 на фоні о артриту, що повністю виник, свідчить про його корисне застосування протягом всього періоду протікання б ад'ювантного артриту. Відмічену ефективність МавРС157 при ад'ювантному артриті(профілактичний ефект, невиниклий/виниклий ад'ювантний артрит) не відзначали для терапевтичних засобів, що використовуються в цей (7

Зв Час. Глюкокортикоїди є ефективними в попередженні ад'ювантного артриту при щоденному введенні, але не при «о короткочасному курсі лікування. Імуносупресори(у високих дозах) і нестероїдні анальгетики є ефективними відповідно до і після обробки.

Таким чином, засновуючись на близькій схожості використаної моделі і відповідних розладів у людини, є очевидним, що МавРС157 з його захисними для слизової властивостями можна використати для лікування « захворювань, пов'язаних з гострим запаленням і хронічним артритом. Крім того, МавРС157 можна використати з с для лікування захворювань, пов'язаних з порушеннями гіперчутливості уповільненого типу і уражень шлунково-кишечного тракту, що виникли в різних частинах шлунково-кишкового тракту, особливо індукованих з агентами такими, як М5АЇАзв.

Приклад 18: ефект видалення вільних радикалів.

Матеріали і методи:

Ге» Гепатопротективну дію МавРС157 в порівнянні зі стандартами такими, як бромкриптин, амантадин і сомастатин оцінювали на різних експериментальних моделях ушкодження печінки на щурах: 24 годинне - накладення лігатури на жовчний протік і печінкову артерію, 48-годинний стрес, що подавляється, і введення

Ге) СсСідагент, що індукує утворення вільних радикалів). МавРС157 вводили або внутрішньошлунково, або ВНнутрішньочеревно. о Результати: сп МмМавРС157 в значній мірі попереджував розвиток некрозу печінки або жирових змін у щурів, підданих 24-годинному накладенню лігатури на жовчний протік або печінкову артерію, 48-годинному придушенню стресу і обробці ССІ(Тмл/кг в/ч, забій через 48 годин). Інші стандартні препарати мали або невелику, або захисна дія дв на цих моделях зовсім була відсутня. Лабораторні аналізи на білірубін показали, що 5ООТ та БОРТ повністю корелювали з макро/мікроскопічними даними. Таким чином, МавРС157 можна використати для лікування

Ф) захворювань печінки. Крім того, мієлосупресія, що викликається опроміненням, є моделлю, що відтворюється, ка для вивчення динаміки відновлення гематопоетичних елементів. МавРС157 показує позитивну дію на пошкодження кісткового мозку, що індукуються опроміненням в сублетальних дозах. во Таким чином, МавРС157 можна використати для лікування пошкоджень кісткового мозку, індукованих опроміненням. Беручи до уваги загалом взаємозв'язок, що визнається, ССІ 4 з утворенням вільних радикалів і розвитком патологічних станів, виявилося, що позитивні еректи МавРС157 можна також використати відносно інших уражень органів, індукованих вільними радикалами, зокрема, при опроміненні.

Приклад 19: катехоламінергічна система. 65 Вступ:

Діючі опосередковано, симптоматичні лікарські препарати такі, як амфетаміни, мають загальні властивості такі, як здатність спричиняти підвищене вивільнення катехоламінів і інгібування повторного захоплення катехоламінів(в основному дофаміну) в нервових закінченнях в центральній нервовій системі(ЦНе). Виявилося, що стереотипна поведінка є результатом активації дофамінергетичної системи в смугастому тілі. В основному передбачається, що посилене "лазання" під дією амфетаміну є результатом збудження полоскових дофамінових рецепторів після введення антагоніста дофаміну галоперідолу. Це потім викликає розвиток суперчутливості до амфетаміну. Застосування МавРсС157 не впливає на загальну поведінку і не індукує появу стереотипів.

Матеріали і методи

Вивчали вплив МавРС157 на стереотипи, що викликаються антагоністом дофаміну амфетаміном(1Омг/кг, в/ч) у і чна збудливість. МавРС157 вводили у вигляді профілактичної спільної обробки або за терапевтичною цілющою схемою(1Омкг або 1Онг/кг, в/ч). У щурів була індукована стереотипна поведінка і збудливість.

Результати:

Постійно відмічали помітне ослаблення і зворотний розвиток(лікування в максимумі порушень, індукованих амфетаміном) як стереотипної поведінки, так і підвищеної збудливості(тобто більш сильні і люті судоми, /5 панічне стрибання і метушня).

Потім увага була зосереджена на вплив МавРОС157 на "лазання" у мишей. Мишей заздалегідь обробили антагоністом дофаміну галоперидолом(5,Омг/кг, в/ч) і потім обробили амфетаміном(2Омг/кг в/ч на 1, 2, 4 і 10 день після попередньої обробки галоперідолом), який звичайно використовується для вивчення поведінкової суперчутливості у відповідь на стимулюючу дію амфетаміну. Таким чином, якщо з'явився би антагонізм 2о стереотипів під дією амфетаміну, як результат антагоністичної у відношенні дофаміну активності(прямий або опосередкованої) МавРС157, що тестується, то можна було чекати посилення збільшуючої дії галоперідолу на "лазання" під впливом амфетаміну. У протилежність цьому, при сумісному введенні МавРС157 з галоперідолом була відмічена майже повна нейтралізація дії. При спільному розгляді, ці дані надають доказ наявності взаємодії МавРС157 з дофаміновою системою. Крім того, взаємодія МавРС157 з центральною дофаміновою сч об системою(наприклад, захист від стресових виразок) була показана на інших експериментальних моделях. Для багатьох відомих пептидів(нейротензин, ССК і т. д.) вже була відмічена взаємодія з дофаміновою системою. Крім (8) того використання МавВРС157 також дає зворотний розвиток поведінковим порушенням, індукованим

І зО(наприклад, 0О,Змг/кг, в/ч). МавРС157 має модулюючий ефект на дофамінову систему. В умовах підвищеного вивільнення синтезу і дофаміну, індукованих амфетаміном, МавРОС157 може як запобігати, так і направляти в ю зо зворотну сторону розвиток подальших порушень(тобто стереотипна поведінка). Подібним образом, МавРС157 може помітно ослабляти наслідки блокування дофамінових рецепторів галоперідолом. На основі цього можна о припустити, що модулююча дія МавРС157 залучає також заміщення у іншому разі помітної неповної дофамінової (/(3у системи. Це дозволяє уникнути подальшої суперчутливості дофамінових рецепторів і порушень, виникаючих під дією амфетаміну порушень. --

Таким чином, МавРС157 є корисним агентом для лікування шизофренії, індукованих амфетаміном «о ефектів(шизофренічна форма психозу) і зловживання наркотиками.

Приклад 20: стрес.

Вступ:

Стрес визначається, як неспецифічне явище, що приводить до порушень в різних органах. Стресова реакція « 40. У відповідь визначається, як реакція у відповідь, спрямована проти різних шкідливих явищ. Однією з моделей з с стресу, що найчастіше застосовується на тваринах, є модель подавляемого стресу, що приводить до тяжких стресових уражень шлунка у щурів. Можуть вражатися також інші органи. ;» Матеріали, методи і результати:

Введений в дозі 1Омкг або 1Онг/кг маси тіла, в/ч або в/ш за годину до індукції стресу, МавРС157 в сильній Мірі запобігав в противному разі неминучому розвитку тяжких уражень шлунка. Якщо час між застосуванням

Ге» знижуючих стрес агентів і індукцією стресу(в подальшому тексті означається як "період") подовжується, стандартні противиразкові агенти стають практично неефективними, в сильній мірі контрастуючи з виразною - ефективністю тестованого МавРС157. МавРС157 зберігав свою цілющу активність навіть після дуже тривалого

Ге) періоду в 48 годин. Захисна дія, що виявляється МавРС157, включає ослаблення розвитку уражень в 5ор противному разі постійно з'являючихся в інших органах(наприклад, печінці, надниркових залозах, нирках, 1 сім'яниках, серці, підшлунковій залозі, селезінці). Таким чином, оскільки інші звичайно відомі стресові сп параметри, очевидно, в меншій мірі зазнають порушення(тобто тимуслімфатична інволюція і гіпертрофія коркового шара надниркових залоз), є очевидним, що МавРС157 можна використати при різних стресових захворюваннях. МавРС157 має позитивний цілющий вплив на різні дільниці ураження в інших органах, постійно дв пов'язаних з неспецифічною стресовою патологією. Беручи до уваги такий же ланцюг подій у людей, як і на використаних моделях, цьому надається ще більше значення, оскільки МавРС157 має цілющу дію навіть, якщо

Ф) використовується, коли стресова патологія вже розвивалася(наприклад, через 24 години після індукції стресу). ка Приклад 21: демонстрація цитопротективної дії.

Вступ во Цитопротективна дія спочатку визначалася, як властивість захищати клітки від різних шкідливих агентів, дія, показана в слизовій оболонці шлунка, як незалежний від шлункової кислоти ефект. Пізніше, це визначення було розширене з включенням в значній мірі схожих захисних ефектів поза шлунково-кишковим трактом, включаючи патологічні стани різних органів(цитопротективна дія / органопротективна дія). Вивчали можливі цитопротективні ефекти при використанні МавРС157, засновуючись на його дії на першопочатковій моделі 65 Робертса для скрінінгу цитопротективних агентів при ураженнях шлунка, індукованих етанолом.

Матеріал, методи і результати:

мавРС157(1Омкг або 1Онг/кг, в/ч) мав профілактичний ефект(застосованої або за 1 годину до, або одночасно з 9696 етанолом(Тмл/щур, в/ш)) і цілющу дію(застосований через 1 годину після етанолу в максимумі розвитку ураження).

З метою створення вільного від кислоти навколишнього середовища для вивчення цитопротективної дії за 24 години до процедури, що спричиняє виразку, була проведена гастроектомія. У відсутності шлунка і шлункової кислоти потім оцінювали ушкоджуючу дію цистеаміну(40Омг/кг п/ш, забій через 24 години після введення), який, як вважають, є препаратом, що викликає виразки дванадцятипалої кишки, дія якого пов'язана з кислотою, і цитопротективну дію МавРС157(1Омкг або 1Онг/кг, в/ч) в порівнянні зі стандартними речовинами(циметидин(50), /о ванітидин(10), омепразол(10), бромкриптин(10) і атропін(10)хзначення дані в мг/кг, в/ч, за 1 годину перед введенням цистеамін)), відомими, як також володіючі цитопротективним ефектом. У простих щурів з інтактним шлунком всі застосовані речовини виявляли сильну позитивну дію. У тварин з видаленим шлунком застосування препаратів, що вивчаються(тобто МавРС157 або стандартних агентів перед введенням цистеаміну), в значній мірі попереджувало розвиток у іншому разі тяжких уражень дванадцятипалої кишки, відмічених у контрольних 7/5 Щурів з видаленим шлунком і обробленими цистеаміном. У групах тварин, не оброблених цистеаміном, не було відмічено уражень(лапаротомія і гастроектомія тільки через 24 години або 48 годин після операції), не спостерігали посилення патологічного стану у оброблених цистеаміном, підданих лапаротомії мишей. Виявлення цих фактів(однаковий ушкоджуючий ефект цистеаміну, однакова захисна дія МавРС157 і стандартів у щурів з видаленим інтактним шлунком і без шлунка, ушкоджуючий або захисний ефект не пов'язаний з секрецією шлункової кислоти) вказує на протективну дію. Можна чітко припустити про наявність аналогікураження не пов'язані зі шлунковою кислотою) між травмованим шлунком(наприклад, етанолом) і дванадцдцятипалою кишкою під дією цистеаміну. Очевидна висока "цитопротективна здатність", ймовірно, незалежна від кислоти, спільна для всіх сполучень, що тестуються, але більш виражена для МавРС157.

Внаслідок того, що МавРС157 був ефективний в значно менших дозах, ніж інші сполучення(тобто мкг абонг/кг сч ов протимг/кг), його ефективність(і терапевтичне застосування) можна розповсюдити на ураження інших органів. Це є слідством того факту, що ефективність інших сполучень в інших органах також є результатом їх і) "цитопротективної дії(наприклад, сомастатин: патологічні стани надниркових залоз, підшлункової залози, печінки, легень і шлунково-кишкового тракту).

Приклад 22: демонстрація органопротективної дії. ю зо Вступ

З метою корисного розширення "цитопротективної" дії в "органопротективну дію в основному прийняте о дослідження захисної дії на ендотелій. Широко признається, в якості чіткої вказівки, використати тести зі Ге! слизовою оболонкою шлунка щурів після ушкоджуючої дії етанолу, при забарвленні монастралу синім внаслідок здатності моностралу синього зв'язуватися з пошкодженим ендотелієм. --

Матеріали і методи: «о

Всім щурам вводили монострал синій(МВ)уХЗідта Сотрапу, СШАХ1, Омл/кг маси тіла, в/в) за З хвилини до етанолу, і тварин умертвляли через 1 хвилину після обробки етанолом. За 1 годину до етанолу вводили мавРС157(10,Омкг/кг, в/ч) або фізіологічний розчин(5,Омл/кг, в/ч). Відразу ж після забою витягували шлунок, і незацікавлені спостерігачі оцінювали дільниці ураження шлунка, як описано раніше. Характерні ділянки шлунка і « дванадцятипалої кишки обробляли для подальшого гістологічного аналізу. Ушкодження судин оцінювали в з с ранньому періоді(ічерез 1 хвилину після обробки етанолом), використовуючи метод з моностралем синім.

Ареальну щільність забарвленої слизової оцінювали ТЕМ. ;» Результати:

У групах щурів, оброблених МавРс157, послідовно відмічали сильне зниження МВ-забарвлення. Крім того, при використанні МавРС157 не було відмічено негативних ефектів. Не спостерігали впливу на різні основні

Ге» параметри і токсичності, за винятком високих доз(наприклад, г/кг маси тіла, в/ч).

Беручи до уваги широке поширення ендотеліальної судинної тканини в організмі і вирішальну роль захисту - ендотелію для органопротективної дії, МавРС157 можна використовувати як органопротективний агент при

Ге) ураженнях різних органів.

Приклад 23: гострий панкреатит. 1 Матеріали і методи: сп МмМавРС157 тестували на щурах в якості захисного або лікувального агента при гострому панкреатиті(індукованому накладенням лігатури на жовчний протік). Одночасно вивчали вплив МавРС157 на супутні розвинені ураження шлунка і дванадцятипалої кишки. мавРС157(1Омкг або 1Онг/кг маси тіла, в/ч, в/ш) вводили в профілактичних цілях за 1 годину до накладення лігатури, в той час для лікування препарат застосовували щодня, починаючи через 1 день після накладення

Ф) лігатури(останнє введення за 24 години до забою). Дію оцінювали через добові інтервали аж до кінця п'ятої ка доби після накладення лігатури.

Результати: во При введенні перед обробкою була отримана сильна захисна дія відносно підшлункової залози. Очевидний цілющий ефект послідовно відмічався при введенні препарату на фоні тяжкого гострого панкреатиту, що вже виник. Оцінюючи появу некрозу, набряку, нейтрофілів і одноядерних кліток, у щурів, оброблених МавРС157, послідовно відмічали менший розвиток некрозу, набряку і менше число нейрофілів, але була більша кількість одноядерних кліток. При визначенні рівня сироваткової амілази в порівнянні з контрольними значеннями було 65 відмічене значно менше підвищення(«МавРС157 ввели перед обробкою), а також зниження вже підвищених рівнів(МаВРС157 вводили в лікувальних цілях). Нарівні з цим позитивним впливом на панкреатит, був відмічений позитивний вплив МавРС157 на дільниці ураження шлунка і дванадцятипалої кишки у щурів з перев'язаною жовчною протокою, як при введенні до обробки, так і після обробки. При спільному розгляді даних: МавРС157 можна використати для лікування гострого панкреатиту з додатковим позитивним впливом на супутню патологію шлунка і дванадцятипалої кишки.

Приклад 24: вплив на кардіотоксичністю.

Матеріали і методи:

Досліди проводили на щурах Албіно Вістар і морських свинках Хартлі. Кардіотоксичність індукували призначенням розчину хлориду барію(тОмг/кг маси тіла), десипраміну(1Омг/кг), дигіталісу(загальна доза 7/0 б,5мг/кг) та ізопреналіну(15мг/кг) через канюлю в яремній вені. Крім того, вводили доксорубіцин багато разів(Змг/кг, п/п, один раз в тиждень протягом 13 тижнів) і однократно(7мг/кг, в/в) і провокували кардіоміопатію.Кардіотоксичність також індукували іммобілізованим стресом, як ушкодження міокарда нефармакологічного характеру. МавРС157 вводили, як зазначено нижче: 1.Хлорид барію а) перед обробкою(за 1 годину до): МавРС157 5Омкг/кг, 1Омкг/кг і ТОнг/кг, внутрішньочеревно;

Б) після обробки(через 60 секунд): МавРС157 1Омкг/кг і 1Онг/кг, внутрішньовенно. 2.Десипрамін: МавРС157 5Омкг/кг і БОнг/кг, внутрішньочеревно за одну годину до обробки.

З. Дигіталіс: МавРС157 5Омкг/кг і 5Онг/кг, внутрішньовенно з 15-хвилинними інтервалами. 4. Ізопрепалін: МавРС157 5Омкг/кг і 5Онг/кг, внутрішньовенно за 15 хвилин до обробки. 5. Іммобілізований стрес: МавРС157 1Омкг/кг і 1ТОнг/кг,фіг.внутрішньочеревно за одну годину до і відразу ж після фіксаціїфіг.і при 24- і 48-годинній іммобілізації. б. а) Хронічна токсичність під дією доксорубіцину: МавРС157 ЛОмкг/кг і тОнг/кг, внутрішньочеревно одночасно з доксорубіцином;

Б) гостра токсичність під дією доксорубіцину: сч мавРС157 1Омкг/кг і 1Онг/кг, внутрішньочеревно за одну годину до введення доксорубіцину.

На моделях з аритмією, у анестезованих тварин постійно записували електрокардіограму. Кожні 15 секунд і) або при порушенні ритму, проводили простягнуті записи при 5Омм/сек або 100мм/сек. На інших моделях електрокардіограми записували один раз або повторно у тварин при нетривалій анестезії зі швидкістю паперу

БОмм/сек при простягнутих записах. Токсичність під впливом доксорубіцину оцінювали при макроскопічному і ю зо Мікроскопічному обстеженні серця та інших органів біохімічними аналізами. Аналогічну процедуру проводили в дослідах з іммобілізованим стресом. що)

Результати: Ге!

Була відмічена антиаритмічна дія МавРС157 на моделі з індукованою хлоридом барію аритмією. При попередньому введенні перед обробкою МавРсС157 знижував і попереджував появу аритмії і зменшував тал"або /-/їЖ7 запобігав розвитку ішемії. У дослідах з введенням після обробки, МавРОС157 викликав швидке перетворення в «о синусовий ритм і запобігав повторній появі аритмії.

МмавРС157 повністю запобігав раптовому зменшенню числа ударів серця в хвилину і порушення провідності, індуковані десипраміноміподовження РО і розширення ОК5). МавВРС157 також запобігав розвитку вентрикулярної тахікардії, пов'язаної з проаритмічною дією десипраміну, і тяжкий атріовентрикулярний блок. «

Дія залежала від дози. з с Крім того, МавРС157 володіє селективною дією на індуковану дигіталісом кардіотоксичність. МавРС157 виявляв позитивні ефекти на раптове зниження числа ударів серця в хвилину і порушення ритму(вентрикулярну ;» екстрасистолу, вентрикулярну тахікардію і атріовентрикулярний блок) у вигляді їх попередження або ослаблення. Дія МавРС157 в нг-дозах на сповільнення провідності, індукованої токсичною дозою дигісталіс, була незначною. Ефект був більш вираженим змкг-дозами МавРС157.

Ге» МмМавРС157 виразно запобігав ішемії та інфаркту міокарда. Дія була більш вираженою з мкг-дозами.

Однократне внутрішньочеревне введення МавРС157 перед обробкою призвело до попередження ішемії, що - було показано на електрокардіограмах, і пошкоджень міокарда, дитектованих гістологічно в дослідах з

Ге) іммобілізованим стресом. Введення МавРС157 після обробки вже при наявності електрокардіографічних змін, 5р що реєструються, також привело до ослаблення ішемії. Мкг-дози МавРС157 спричиняли збільшення напруження о комплексу ОК, особливо при попередньому введенні. сп Введення МавРС157 призводить до значно більш менших патоморфологічних змін, що спостерігаються при кардіоміопатії, індукованій антрацикліном(ітяжке пошкодження міоцитів і стінок судин, і вакуолізація) після однократного і в більшій мірі після багаторазового призначення доксорубіцину. Активність ОН значно дв Знижується, незважаючи на помітно підвищені абсолютні значення.

Підсумовуючи, МавРС157 показав себе придатним для використання як антиаритмічного, антиангінального і (Ф, кардіопротективного агента. ка Приклад 25: антидеприсантна активність.

Матеріали і методи: во Різні антидеприсанти володіють противиразковою активністю, і моделі, що використовуються в цей час при дослідженні виразок і депресії, значною мірою схожі. Отже, досліджували можливість того, що спочатку противиразковий агент з цито-/органопротективною активністю, такою як МавРС157, буде ефективно впливати на депресивні розлади, в двох тестах по депресії на щурах: тест з примусовим плаванням(процедура Порсолта) і метод хронічного непередбачуваного стресу(через 5 днів після проведення процедури непередбачуваного 65 стресу, введення препарату один раз на день під час стресової процедури і оцінка нерухомості у відкритому тесті на четвертий і шостий дні лікування).

Результати:

У досліді з примусовим плаванням відмічали зниження часу нерухомості щурів, оброблених мавРС157(1Омкг/кг, тОнг, 1Опг/кг, в/ч), в порівнянні з активністю у тварин, оброблених звичайними антидеприсантами, іміпраміном або ніаламідом, відповідно в дозах 15мг або 40мг(в/ч). Додаткове посилювання умов досліду в процедурах хронічного непередбачуваного стресу призвело до втрати активності іміпраміну(ЗОмл) в той час, як введення МавРС157(1Омкг/кг, 1Онг) призводило до поліпшення мобільності щурів з хронічним стресом в залежності від дози.

Приклад 26: моделі хвороби Паркінсона. 70 Матеріали і методи:

Вводили паркінсонгенні агенти, 1-метил-4-фенил-1, 2, З, б-тетра-гідропіридин(МРТР)(відомий, як препарат, руйнуючий дофамінову систему чорних смужок шляхом утворення вільних радикалів)(ЗОмг/кг маси тіла, в/ч, один раз на день протягом б днів і через 4 дні однократно в дозі 50,Омг/кг маси тіла, в/ч) або резерпін(спричиняє виділення катехоламінових пухирців)(5,Омг/кг маси тіла, в/ч). МавРС157(1,5Омкг/кг або 15,Онг/кг маси тіла, 7/5 В/ч) застосовували за 15 хвилин до або альтернативно через 15 хвилин після кожного призначення МРТР. У дослідах з резерпіном МавРС157(10,Омкг/кг або 10,Онг/кг маси тіла, в/ч) вводили за 15 хвилин до резерпіну або через 24 години на фоні повної каталепсії, що вже виникла.

Результати:

МавРС157 значною мірою поліпшував порушену МРТР соматосенсорну орієнтацію і зменшував індуковану МРТР гіперактивність. Крім того, МавРС157 зменшував МР ТР-моторні аномалії(тремор, акінезія, каталепсія, в противному разі дуже виражені в регуляції солі), призводячи до майже повного усунення звичайно летального курсу введення МРТР для контрольних тварин. У дослідах з резерпіном МавРОС157 значною мірою запобігав розвитку у іншому разі дуже вираженої каталепсії. При введенні через 24 години після обробки МавРС157 давав зворотний хід каталепсії, що вже виникла. У підтримку цього, послідовно спостерігали зменшення індукованої сч ов резерпіном гіпотермі(мМавРС157 вводили до обробки) і зворотний розвиток подальшого вираженого падіння температури(МавРС157 вводили після обробки). і)

Обидві вищезгадані моделі, що звичайно використовуються на тваринах, відомі, як показуючі порушення у людей та їх лікування. Внаслідок того факту, що була продемонстрована висока ефективність при введенні до і після обробки вмкг- і нг- дозах, виявилося, що МавРС157 добре придатний для використання в лікуванні хвороби ю

Паркінсона і патологій, подібних хворобі Паркінсона.

Крім того, ефект, що спостерігається при гипотермії, індукованій резерпіном, дозволяє прийти до висновку, о що МавРС157 добре придатний для лікування температурних порушень. Ге!

Приклад 27: вплив на загоєння кісткових дефектів.

Матеріал і методи: --

На 42 кроликах протягом б тижнів після операції вивчали остеогенну дію кісткового мозку і Тріс-ВРС157 на «о загоєння сегментальних кісткових дефектів. Після індукції травми(в центрі обох променевих кісток зробили 0О,в-сантиметровий остеоперіоститний дефект), досліди з використанням кісткового мозку і Тріс-ВРС157(6 кроликів в групі) виконували таким чином: оброблених фізіологічним розчином(2мл внутрішньом'язово і 2мл місцево в кожний з кісткових дефектів), травмованих тварин використовували як контроль(група 1). У тварин в « другій і третій групі кожний із кісткових дефектів місцево обробили або 2мл аутологічного кісткового (у с мозку(7-й день після операції) або Тріс-ВРС157(1Омкг/кг маси тіла 7-й і 14-й дні після операції). Тваринам четвертої, п'ятої і шостої груп Тріс-ВРС157 вводили внутрішньом'язово(в/м) або на 7-й, 9-й, 14-й і 16-й дні ;» після операції 1Омкг/кг маси тіла), або один раз на день в період між 7-м - 21-м днями після операції 1Омкг або 1Онг/кг маси тіла). В якості стандартної обробки відразу ж після утворення кісткові дефекти у тварин сьомої групи були заповнені аутологічним кістковим трансплантантом.

Ге» Всіх тварин забивали на б тижні після операції. Загоєння сегментальних дефектів оцінювали двічі на тиждень рентгенологічно і гістологічно. - Результати: со Паралельне порівняння рентгенограм, зроблених на чотири тимчасових інтервали(поверхнева кісткова 5р Мозоль, мікрофотоденсиметрія кісткового дефекту), і даних кількісної гістоморфометрії виявило, що кістковий 1 мозок, введений місцево в кістковий дефект, і Тріс-»ВРС157, введений внутрішньом'язово(особливо в добовій сп дозі ТОмкг/кг маси тіла протягом 14 днів), достовірно поліпшували загоєння кістки(р « 0,001). Дія відповідала дії аутологічного кісткового трансплантату.

Беручи до уваги клінічне значення цього досліду, кістковий мозок і Тріс-ВРС157(особливо в щоденній дозі дв ЛОмкг/кг маси тіла протягом 14 діб) приводять до загоєння кісткових дефектів. У зв'язку з їх простим введенням і низьким ризиком ускладнень, аутологічний кістковий мозок, застосований місцево, і особливо

Ф) введені внутрішньом'язово остеогенні речовини такі, як Тріс-ВРС157, мають переваги перед іншими більш ка складними хірургічними способами(тобто кісткові імплантанти, кісткові імплантати з судинами, метод Ілізарова) для лікування загоєння травм у людей. во Приклад 28: вплив на загоєння ран.

Матеріали і методи:

МмМавРС157 використали для того, щоб встановити його вплив на різні елементи, пов'язані з процесом загоєння. Вважають, що елементами, що мають значення для процесу загоєння, є утворення грануляційної тканини, ангіогенез і продукція колагену. Вплив МавРС157 51 на утворення грануляційної тканини, продукцію 65 колагену і ангіогенез, а також розвиток сили натягнення тестували, використовуючи три експериментальні моделі на щурах: 1) шкірні рани у вигляді насічок; 2) анастомози товста кишка - товста кишка і 3) анастомози стравохід - дванадцятипала кишка. Зразки гістологічно оцінювали на колаген і кровоносні судини, використовуючи оціночну систему в балах і морфометрію.

Результати:

У всіх дослідах були встановлені достовірні відмінності між щурами, обробленими МавРС157, і контрольними тваринами. Досліди показали сильний стимулюючий вплив МавРС157 на процес загоєння. Ці ефекти досягалися при різних шляхах введення, включаючи внутрішньошлункове і місцеве застосування. Крім того, оцінка сили натягнення виявила підвищені значення для оброблених МавРС157 щурів.

Засновуючись на близькій схожості між моделями на тваринах і відповідними порушеннями у людей і високій 7/0. Мірі близькості між процесами загоювання у щурів і людей, МавРС157 можна використати для лікування загоєння ран у людей.

Приклад 29: вплив на порушення дихання. Матеріали і методи:

У даних дослідженнях використали морських свинок(Хартлі, обох статей, з масою тіла 500 - 700г) з плетизмографією всього тіла, уретановою анестезією(1,5г/кг, в/ч), штучною вентиляцією при постійному 7/5 тиску(0,98кРа) і релаксацією скелетної мускулатури під дією суксаметонію(0,2мг/кг маси тіла, в/в). Оцінювали об'єм наповнення(мм, середнє значення х стандартне відхилення) до і після застосування спазмогенів(гістамін, серотонін, ацетилхолін, брадикінін, в/в) або МавРС157(за 10 хвилин до повторного введення спазмогену, в/в).

Результати:

Індукуєме під дією серотоніну, гістаміну, ацетилхоліну і брадикініну зниження обсягу наповнення інгібувалося МавРС157(1Омкг/кг маси тіла, в/в та/або 1ТОнг/кг маси тіла, в/в). Засновуючись на цілющій дії мавРС157, що спостерігається, на звуження бронхів, що індукується різними спазмогенами, і відомій близькості між використаною моделлю і захворюваннями людини, є очевидним успішне використання МавРС157 для лікування різних порушень, пов'язаних із звуженням бронхів та/або порушеннями дихальних шляхів.

Приклад 30: вплив на синдром легеневої гіпертонії. сч

Матеріали і методи:

Дані досліди описують ефекти антагоністів і антагоністів окислу азоту(МО) і вплив МавРС157 на розвиток і) синдрому легеневої гіпертоні(РН5) і тканинні ураження у курчат. Проводили досліди по встановленню гострої токсичності. Вони включали однократне введення фізіологічного розчину(Тмл, в/ч), МавРС157(1Омкг/кг маси тіла), І-МАМЕ(антагоніст МО/доза 50, 100, 150мг/кг маси тіла) і І-аргіні(антагоніст МО/10Омг/кг маси тіла) з (З зо їх комбінаціями(! -МАМЕ ї МавРС157, І-МАМЕ ч- І -аргінін). Проводили патологічні дослідження селезінки, серця, печінки і легень і гематологічні аналізи. Крім того, поставили досліди по хронічній токсичності. Тварин що) обробляли щодня протягом п'яти тижнів І -МАМЕ(ТОмг/кг маси тіла), І-аргініном(1ООмг/кг маси тіла), Ге! мавРС157(1Омкг/кг маси тіла) і їх комбінаціями(Ї -МАМЕ ї МавРС157, І-МАМЕ ч" І -аргінін) внутрішньочеревно. По сім тварин з кожної групи, включаючи контрольних(фізіологічний розчин мл, в/ч) умертвляли кожний тиждень. --

Результати: «о

Застосування І-МАМЕ викликало РН5 у оброблених курчат. Ця дія запобігалася при одночасному введенні

І -аргініну і МаВРС157. При патогістологічному дослідженні гострої і хронічної токсичності було виявлено, що

ІЇ-МАМЕ викликав сильні тканинні пошкодження(некроз кліток міокарда і печінки і некроз лімфоїдних кліток в селезінці), в той час, як І-аргінін в основному викликав гіпермію, набряк і крововиливи у всіх органах. «

Гематологічні аналізи показали достовірне зниження рівня гемоглобіну і числа лейкоцитів в групах курчат, з с оброблених І-МАМЕ. Вплив І-МАМЕ успішно інгібувався застосуванням І -аргініну і МавРС157. МавРС157 не викликав ніякого пошкодження тканини або органу. ;» Беручи до уваги схожість між вищезгаданими моделями на тваринах і відповідними порушеннями у людей,

МмМавРС157 можна застосовувати для лікування синдрому легеневої гіпертонії. Крім того, є очевидним його

Корисне застосування в комерційному розведенні.

Ге» Приклад 31: експериментальна гіпертензія.

Матеріали, методи і результати: - У тварин з гіпертензією(гіпертензією Голдблатта) з двома нирками(2КІС) і з однією ниркою(1КІС) МавРС157

Ге) швидко знижували кров'яний тискК(наприклад, через 5 або 10 хвилин після ін'єкції). Ця дія продовжувалася 20 5р Хвилин У щурів КІС або, щонайменше, 12 годин у тварин 2КІС. Дія неодноразово досягалася після другого або о третього введення Через 24 - 48 годин. Подібним чином у щурів, які протягом тривалого періоду часу с знаходилися на раціоні з високим рівнем фруктози(8095) або високим вмістом солі(1595), МавРС157 помітно знижували в противному разі послідовно підвищені значення кров'яного тиску до нормальних показників.

Лікувальний ефект продовжувався довго, і толерантність не розвивалася навіть після шестимісячного періоду. во Не було відмічено впливу МавРС157 на основні показники кров'яного тиску.

У доповненні до зниження у противному разі підвищених значень кров'яного тиску МавРС157 також (Ф, спричиняв помітне ослаблення або навіть усунення уражень і порушень, що звичайно з'являються в різних ка органах, якими були(через три тижні після згодовування раціону з високим вмістом солі в контролі): дуже сильна гіалінова дегенерація з вираженими паренхіматозними крововиливами, дегенерація стінок артерій, бо вакуолізація кліток серця, сильна гіперемія(особливо в мозковому шарі) надниркових залоз, сильна гіперемія, паренхіматозні крововиливи з гематурією в нирках і гемосидероз і еритроцитографія в селезінці. Судини були менш уражені у щурів, оброблених МавРС157, в доповненні до меншої вакуолізації стінок і відсутності кровотечі. Крім того, у щурів при обробці МавРС157 послідовно спостерігалася виразна захисна дія відносно пошкодження очного дна. 65 Використовуючи різні моделі гіпертонії на тваринах, при введенні МавРС157 в дозах 1Омкг або 1Онг/кг маси тіла в/в, в/ч або в/ш, досягалися послідовні результати при різних схемах застосувань. Беручи до уваги явну схожість цих моделей і відповідних захворюваннь у людини, МавРС1157 можна використати для лікування гіпертензії і пошкоджень різних органів, викликаних гіпертензією.

Приклад 32: вплив на час кровотечі

Матеріали і методи:

Вивчали вплив 2-АМР-ВРС157 на час кровотечі у мишей і щурів(з і без попередньою обробкою гепарином) в поєднанні з оцінкою активності в умовах іп міго на параметри згортання людської крові.

Результати:

При основних умовах(2-ДМР-ВРС157, 1Омкг, 1Онг, 1Опг, Тпг, 1ТОнг/кг маси тіла, в/ч одночасно з обрізанням /о хвоста) у мишей і щурів було послідовно показане значне зниження часу кровотечі, яке залежало від дози. У дослідах з попередньою обробкою гепарином(1000 МЕ/кг в/ч)їза 2 години до початку кровотечі) у тварин, оброблених 2-РУРМ-ВРС157 в дозі 1Омкг або ТОнг/кг маси тіла, постійно відмічали значне зниження в противному разі в сильній мірі підвищеного часу кровотечі В умовах іп мйго не було показано впливу(2-АРМ-ВРС157 в концентрації 1Омкг/кг, час інкубації 1 година) на параметри згортання людської крові. /5 Таким чином, передбачається вплив на ендотеліальний шар.

Беручи до уваги схожість в механізмі кровотечі у людей і тварин і значення моделей, що широко визнається, використаних для скринінгу агентів, 2-АРМ-ВРС157 можна застосовувати для лікування порушеної коагуляціїнаприклад, гепаринізації).

Приклад 33: вплив на експериментальний діабет.

Матеріали, методи і результати:

При внутрішньочеревному введенні(тобто 1Омкг/кг маси тіла) було показано, що МавВРС157 запобігає розвитку діабету у щурів, індукованого алоксаном, а також стрептозотоцином. Протягом 14 днів була встановлена знижена глікозурія і менше ураження острівців. У попередніх дослідах авторів МавРС-157 був також ефективним при введенні на фоні 14-денних уражень, під дією алоксану. У подальших дослідах антидіабетичні сч ов ефекти МавРС157 потім вивчалися при особливій концентрації уваги на його можливій активності при внутрішньошлунковому введенні. Застосування МавРС157(доза 1Омкг і 1Онг/кс живої маси) скомбінували з і) введенням алоксану в дозі ЗО0Омг/кг, п/ш або 200Омг/кг маси тіла, п/ш перед(за 2 4 години або за 1 годину до введення алоксаном), разом і після(через 48 годин після введення алоксаном) обробки. В основному МавРС157 знижував підвищені рівні глюкози в сироватці крові і значно підвищував виживання оброблених алоксаном ю зо тварині(дія була особливо очевидною в групах щурів, оброблених більш високими дозами алоксану). Цікаво, що в доповнення до підвищених рівнів глюкози в сироватці крові тварин, яким вводили алоксан, відмічалася що) підвищена поява дільниць ураження шлунка у контрольних діабетичних щурів. При кожній схемі введення Ге! мМавРС157 достовірно зменшувалась тяжкість виразок незалежно від умов обробки. Важливо, що такі ж результати отримували на мишах. --

Беручи до уваги схожість між патологією у людини і використаними моделями і в світі їх широкого «о використання для скринінгу активності сполучень, МавРОС157 можна застосовувати для лікування цукрового діабету.

Приклад 34: антиноцицептивні ефекти.

Матеріали і методи: «

Антиноцицептивні ефекти МавРсС157 оцінювали в порівнянні зі стандартними сполученнями аспірином або з с морфином она різних експериментальних моделях опосередкованого/лрямого сприйняття болю і нейротоксичності/ больові судоми(оцтова кислота/ сульфат магнію), здавлення хвоста, гаряча пластина і ;» введення капсаїцину.

Результати: мМавРС157(введений або в дозах нг, абомкг/кг, в/ч) достовірно знижував реакції при больових

Ге» судомах(запальних і незапальних, залежних від простагландинів і незалежних) і в тестах зі здавленням хвоста.

У тестах з гарячою пластиною МавРС157, на відміну від морфіну, не чинив дії на нормальних тваринах. Крім - того, МавРС157 призначали у вигляді попередньої обробки і один раз а день протягом 14 днів після ін'єкції

Ге) капсаїцину. У дослідах МавРсС157 в сильній мірі знижував індуковану капсаїцином алодинію. Це зниження 5о ефекту капсаїцину неможливо було отримати при введенні МавРС157 на фоні дегенерації сомато-сенсорних о нейронів, що вже виникла під дією капсаїцину дегенерації соматосенсорних нейронів(введення тільки на 14-й сп день після капсаїцину). Таким чином, оскільки в противному разі неминуче виснаження соматонейронів після введення капсаїцину, можна повністю усунути при щоденному введенні МавРС157, можливо, що дію МавРС157 можна специфічно віднести до цілісності чутливих соматосенсорних нейронів, що зазнали впливу капсаїцину, і їх захисту(тобто основних аферентних нейронів, що мають маленький діаметр тіла і непокриті мієліновою оболонкою(С-) або покриті тонкою мієліновою оболонкою(А-8) волокна).

Ф) Беручи до уваги, що капсаїцин індукує в основному однакові порушення у людей і тварин, МавРО-157 можна ка використати для лікування різних больових розладів, а також захворювань, що виникли внаслідок ослаблення функцій соматосенсорних нейронів. во Приклад 35: вплив на судоми.

Матеріали і методи:

Вивчали дію КВРСОС157 на судоми, індуковані бікукуліном, пікротоксином, стрихніном і ізоніазидом.

КБРСОС157(10Омкг, 1Омкг або 1Онг/кг живої маси) вводили(в/ч) одночасно або за 15 хвилин до застосування агентів, що викликають судоми(мг/кг маси тіла, в/б), пікротоксину(3), стрихніну(б, З або 1,5), 65 букукуліну(2,5) і ізоніазиду(8ООмг).

Результати:

КВРСІ157 призвів до послідовно позитивного(залежного від дози і часу) протисудомного ефекту на фоні всіх використаних агентів, що викликають судоми. Беручи до уваги схожість використаних моделей і захворювань людини, КВРС157 можна використати для лікування судом.

Приклад 36: травма спинного мозку.

Матеріали і методи

Травму спинного мозку індукували на щурах-самцях Албіно Вістар при регульованому тиску(затиск для судин

Аезшар 0,10 0,15 М) на оголеному спинному мозку на рівні ТАІ2) протягом ЗО секунд. Тварин обробляли мавРС157(1Омкг, 1Онг/кг маси тіла, в/ч) або фізіологічним розчином відразу ж після травми і один раз на день 7/0 до 10-го дня після травми. Тварин забивали через 24 години після останнього введення.

Результати:

Ретельне обстеження було проведене клінічно(оцінювали щодня в балах 1 - 5) і мікроскопічно. Воно виявило у щурів, оброблених МавРС157, значне ослаблення у іншому разі стійкого параліча(у контрольних щурів).

Беручи до уваги схожість використаних моделей із захворюваннями людини, МавРС157 можна використати для /5 Лікування травми спинного мозку.

Приклад 37: хронічна алкогольна інтоксикація.

Матеріали і методи:

Вивчали вплив МавРС157 на хронічну алкогольну інтоксикацію. Для цих дослідів використали щурів-самців

Албіно Вістар. Щурам спаювали або віскі, що є в продажу, або етанол(10 - 2095 водний розчин) протягом трьох

Місяців. Введення МавРОС-157(1Омкг, ТОнг/кг маси тіла), пропранололу(1Омг/кг маси тіла) І ранітидину(1Омг/кг маси тілаХконтрольні щури отримували рівний обсяг фізіологічного розчину 5/Омл/кг) внутрішньошлунково або внутрішньочеревно проводили в профілактичних цілях(за 10 днів перед початком введення алкоголю) або разом з алкоголем або в терапевтичних цілях(іпочинаючи з кінця двомісячного періоду, тобто протягом останнього місяця експерименту). сч

Результати:

Пряме вимірювання кров'яного тиску в портальній вені чітко показало, що МавРС157, а також і) пропранолол(при всіх схемах введення) помітно запобігали та/"або зменшували в противному разі підвищені значення портального кров'яного тиску у контрольних щурів. У протилежність цьому лікування ранітидином призвело навіть до більш високих значень портального тиску, ніж ті, що були у контрольних тварин. Крім того, МУ зо В більшій мірі, ніж пропранолол, МавРС157 був здатний помітно ослабляти в противному разі виражені ураження в шлунку щурів, що отримали алкоголь. Подібний цілющий ефект був також відмічений при ураженнях інших о органів(тобто нирок, серця). Ге!

Беручи до уваги ці послідовні позитивні ефекти і загальновідомий доказ того, що підвищене споживання алкоголю призводить до аналогічних змін у людей, є очевидним, що МавРС157 корисний для лікування -- з5 порушень, що виникли під дією алкоголю. со

Приклад 38: вплив на ішемічні порушення в мозку.

Матеріали і методи: мавРС157(1Омкг або 1Онг/кг маси тіла, в/ч) або фізіологічний розчин(5/Омл/кг маси тіла/ в/ч) вводили або за 1 годину до, або через 1 годину після накладення лігатури на обидві сонні артерії на період тривалістю З « 70 або 6 годин у щурів. в с Результати:

Є очевидною сильна позитивна дія МавРС157 при введенні як до обробки(за 1 годину до накладення ;» лігатури), так і після обробки(через 1 годину після накладення лігатури). Це було в мкг- і нг-дозах і в дослідах тривалістю З або 6 годин. Крім бальних значень, найбільш чіткими і характерними виявленими фактами була наявність сильного периваскулярного набряку і набряку мозкової тканини поряд з гіпермією мозку. Також

Ге» були відмічені зони демієлінізації, особливо в мозочку. Всі ці ознаки були значно менш виражені в групах тварин, оброблених МавРс157, незалежно від умов обробки. - Беручи до уваги тяжкі ішемічні ураження, відмічені в контролі і явну схожість між ішемічними порушеннями

Ге) у щурів і людей, є очевидним сприятливе застосування МавРС157 для лікування ішемічних порушеннь мозку.

Приклад 39: вплив на пошкодження нерва. 1 Матеріали і методи: сп Вивчали вплив МавРсС157 на регенерацію периферичних нервів. У дорослих щурів-самців Вістар(225 250Гг) під анестезією оголяли правий сідничий нерв, звільняли від з'єднувальної тканини і робили поперечний розріз на 5см дістальніше від сідничої вирізки. Робили три периневрильних шви(10,0 Ефіїоп, Е(Вісоп) для анастомозу дв З метою гарантії правильного збігу пучків. Тварин обробляли місцево в місці анастомозу у вигляді ванночки з 1мл розчину МавРС157(2мкг/кг або 2нг/мл), внутрішньошлунково або внутрішньочеревно(1Омкг або 1Онг/кг маси

Ф) тіла) відразу ж після утворення анастомозу. Контрольні тварини отримували рівний об'єм фізіологічного ка розчину. У вказані дні після операції(З, 6, 9, 12 і ЗО днів) ставили функціональні тести. Ці тести включали тест з гарячою водою(60"С), тест з холодною водою(2"С), тест з дослідженням руху, ЕМО-дистальну латенцію і бо амплітуду СМАР. Також відбирали зразки для гістологічного їі морфометричного аналізів. У інших дослідах з використанням тієї ж хірургічної процедури і того ж іміесгта в нерві мікрохірургічним пінцетом протягом 60 секунд проводили травматичне здавлення, і МавРС157 застосовували місцево. Оцінку проводили через 2, 7, 10, 50, 100 днів.

Результати: 65 При оцінці клінічно або мікроскопічно, особливо в ранньому періоді, застосування МавРС157 помітно поліпшувало загоєння у травмованих щурів.

Приймаючи до уваги близьку схожість травми у тварин із захворюваннями у людини, МавРС157 можна використати для лікування пошкоджень периферичних нервів.

Приклад 40: вплив на нейролептичні розлади.

Оцінювали вплив МавРС157 на різні індуковані нейролептичні розлади.

Матеріали, методи і результати:

Введення МавРС157(1Омкг або 1Онг/кг маси тіла, в/ч) послідовно ослабляло каталепсію, що виникла під дією галоперідолу і флуфеназину(галоперідолу 0,625, 1,25, 2,5, 5,0 і 10,Омг/кг маси тіла, в/ч, флуфеназин 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5 і 5,Омг/кг маси тіла, в/ч(4,О0мл/кг)), при більш низьких дозах обох нейролептиків в подальші 7/0 Інтервали часу. У поповненні до цілющої дії на фоні більш низьких доз нейролептиків, навіть більш сильний корисний антикаталептичний ефект МавРсС157 був відмічений при більш високих дозах обох нейролептиків, що спостерігається як в мкг-, так і нг-дозах МавРС157. Ця дія була також відмічена при соматосенсорній орієнтації у тварин, оброблених сульпіридом(20О, 40, 80 і 16бОмг/кг маси тіла, в/ч), незважаючи на те, що у контрольних мишей при обробці сульпіридом каталепсія не спостерігалася.

Є очевидним позитивне використання МавРС157 при лікуванні порушень, пов'язаних з дофаміновими системами, каталептичними порушеннями і нейролептичними розладами.

Приклад 41: застосування для лікування шоку.

Матеріали і методи:

Вивчали експериментальний геморагічний шок у щурів під анестезією(канюлі в загальній сонній артерії і яремній вені). Контролюєме видалення обсягу крові проводили до падіжу або стабільного низького кров'яного тиску(30 - ЗбБтт На). У цих дослідах СавРС157(1Омкг або 1Онг/кг маси тіла) або фізіологічний розчин вводили внутрішньочеревно(5,Омл/кг) за 15 хвилин до кровотечі або внутрішньовенно(З,Омл/кг) після 5-хвилинного періоду стабільного низького кров'яного тиску.

Результати: сч

У порівнянні з контрольними значеннями достовірно більш висока втрата обсягу крові, що підтримується до падіжу(залежна від дози), була послідовно відмічена у щурів, оброблених СавРС157. У тварин із зниженим і) обсягом крові і гіпотензією, оброблених СавРС157, було показане негайне і підвищення кров'яного тиску при відсутності падіння, що тривало продовжувалося. Це контрастувало з коротким і слабим підйомом кров'яного тиску і падіжом 7595 тварин до кінця 45-хвилинного дослідного періоду в контрольній групі. У щурів, підданих ю

Зо тільки операції після анестезії, але не ексангуляції, СавРС157(в/ч або в/в), введений після 6б5-хвилинного періоду стабілізації, не впливав достовірно на показники артеріального тиску протягом такого ж періоду часу о після обробки. На основі цих даних передбачається, що СавРС157 може бути ефективним в пом'якшенні Ге! наслідків гострої втрати крові. Беручи до уваги явну схожість між використаними моделями на тваринах і порушеннями у людей, СавРС157 можна використати для лікування шоку. --

Приклад 42: вплив на аномальні лімфоцити. «о

Матеріали, методи і результати:

Вивчали імунологічні показники у двох пацієнток, що страждають рідкісним клінічним захворюванням - спадковою еозинофілією, пов'язаною з інтраепідермальним бульозним дерматитом і підгострим склерозивним паненцифалітом. Досліджували дію МавРС157(іп міго) на хромосомну аберацію в лімфоцитах і проліферацію « Т-кліток. МавРС157 індукував достовірне зниження хромосомної аберації грубих типів(тобто нормалізував з с лімфоцитарні показники) і виявив стимулюючий ефект на мітоз.

Приклад 43: вплив на аномалії розвитку. з Матеріали і методи:

Вивчали вплив МавВРС157 на виникнення аномалії розвитку у мишей, індукованих вітаміном А. МавсРІ57(1Онг/кг маси тіла або 1Омкг/кг маси тіла в/ч) або фізіологічний розчин(бмл/кг тіла, в/ч) вводили

Ге» одночасно з вітаміном А(15700МЕ/кг маси тіла, 66 в/м) на 10-й день вагітності. В якості контролю використали мишей, оброблених вітаміном А, але отримавших в тій же дозі і в той же час фізіологічний розчин. - Результати: со При введенні вітаміну А був індукований ряд аномалій розвитку. У групах мишей, оброблених МавРС157, було відмічене достовірне зниження кількості аномалії розвитку. Є очевидним корисне застосування МавРС157 о при лікуванні порушень у плодів. сп Приклад 44: оваріоектомія.

Матеріали і методи:

Проводили звичайну оваріоектомію. МавРС157 вводили(1Омкг або 1Онг/кг маси тіла, в/ч) або один раз на ов день протягом 28 днів, або один раз на день протягом 14 днів, починаючи з 15-го дня після оваріоектомії.

Постійно при тривалій схемі введення останнє застосування було за 24 години до забою. Тварини інших груп

Ф) отримували однократну мкг-дозу препарату на 15-й день післ оваріоектомії. П'ять груп використали в якості ка контролю: тваринам двох груп проводили оваріоектомію, обробляли фізіологічним розчином і забивали на 15-й і 28-й дні після видалення яєчників, тваринам однієї групи не була проведена оваріоектомія, але їх обробляли бо фізіологічним розчином, і тварини двох груп без оваріоектомії були оброблені МавРС157(1Омкг або 1Онг/кг живої маси/ в/ч) один раз на день протягом 28 днів. Від кожної тварини брали вагінальні мазки за 5 хвилин до операції і на 9, 14 і 28 дні експерименту і їх забарвлювали Рар для цитологічного аналізу. Ступінь дозування вагінального епітелію виражали за допомогою показників дозрівання. Після забою відбирали дистальні кінці кісток від кожної тварини для проведення біомеханічного тестування, яке стисло описано нижче. 65 Біомеханічне тестування:

Всі кістки перевірили в залежності від різних моментів згинання(одна точка згинання)момент згинання -

Мт) в різних напрямах, передньо-задньому- і латеро-латеральному. У цьому досліді використали стегнову і великогомілкову кістки. Дистальні частини кісток фіксували кістковим цементом(Раїасоз) в металевих трубках довжиною 1см. Металеві трубки фіксували в системі для навантаження. Кістки постійно тримали вологими.

Вимірювали вільну частину кістки, а також довжину від фіксуючої частини до точки навантаження. Експеримент проводили відповідно принципу згинання палиці, фіксованої в одній точці, в межах еластичності. Навантаження становило 0, 1, 0,2, 0,5, 0,7, 1,0 М. Деформацію або кут згинання визначали, як кут відхилення лазерного променя, який відбивався від невеликого дзеркала, зафіксованого на кінці кістки. Масу дзеркала додавали до прикладеної сили згинання. Міліметрівка, на яку направляли лазерний промінь, була видалена на 1,5 - 1,8см від /о0 Хістки з невеликим дзеркалом, встановленим на ній. Кут деформації визначали, використовуючи тригонометричний метод. При кожному окремому навантаженні замінювали тривалість деформаціїі подальшого відновлення). Після зняття навантаження кістка повернулася в її початкове положення, що свідчить про те, що структурні зміни в кістці були відсутні, і що навантаження було забезпечене межами еластичності по діаграмі

Хука. Це спостереження показало, що було можливим навантажувати одну і ту ж кістку двічі в різному напрямі без зміни її структури. Якщо не спостерігали додаткову деформацію протягом двох подальших хвилин, або якщо досягалося додаткове відновлення, ці точки встановлювалися як кінцеві(в основному час вимірювання становив приблизно 30 секунд(контроль з оваріоектомією) або 16 хвилин(здорові тварини)). Кісткову кутову деформацію(навантаження і відновлення після навантаження) виражали вмм/сек.

Результати:

Щоденне введення МавРС157 в обох дозах призвело до помітно підвищеного значення показників дозрівання в порівнянні з атрофічними зниженими показниками дозрівання у необроблених контрольних щурів.

Таким чином, передбачається, що МавРС157 здатний запобігати атрофії піхви у щурів, викликаній кастрацією.

У тварин контрольних груп при проведенні оваріоектомії спостерігали найнижчу амплітуду згинання з найкоротшим часом, а також найнижчу амплітуду повернення в початковий стан. Однаково низькі значення були с отримані в обох контрольних групах щурів, котрих умертвили через 15 або 28 днів. Це було відмічене в обох групах тварин з видаленими яєчниками, оброблених фізіологічним розчином(забиті або на 15-й, або 28-й дні). і)

Позитивну тенденцію спостерігали в групі, що отримала МавРС157 вмкг-дозах на 15-й день після оваріоектомії.

Достовірно кращі результати отримали у всіх інших групах, оброблених МавРсС157 в нг- або мкг-дозах. Найкращі результати були отримані в групі тварин, які щодня отримували МавРС157 в мкг дозах протягом 28 днів. Всі ю зо параметри у тварин з видаленими яєчниками помітно поліпшилися і міра поліпшення мала тенденцію до досягнення значень, відмічених в групах здорових щурів. Не було відмічено відмінності між здоровими щурами, о незалежно від того, були вони оброблені фізіологічним розчином або МавРС157(мкг- або нг-дози). б

Беручи до уваги загальноприйняте значення цих моделей на тваринах для захворювань, пов'язаних з оваріоектомією у людей, як відносно атрофії піхви, так розвитку остеопорозу, є очевидним, що МавРС157 можна (87 зв Використати для лікування оваріоектомії. «о

Приклад 45: пухлини.

Матеріали, методи і результати:

Однією з моделей експериментальних пухлин, що найбільш використовуються, є оцінка числа метастазів карциноми і меланоми 8-16 у мишей. Подібно різноманітним моделям експериментальних пухлин, ці « експериментальні моделі розділяють значну схожість з порушеннями, що спостерігаються у людей. Було в с показано, що МавРС157, застосований в різних схемах, знижує число метастазів у оброблених мишей в порівнянні з відповідними контрольними значеннями. Асцитна пухлина Ерліха(ЕАТ) є пухлиною, яка може рости ;» у мишей всіх штамів. Вона може рости в асцитній або солідній формі в залежності від шляху введення пухлинних клітин. Незважаючи на те, що звичайно пухлинні моделі на тваринах тільки частково розділяють схожість з хворобами у людей, застосування цієї моделі досягло загального визнання внаслідок її придатності для б вивчення протипухлинних препаратів.

Виживання(дні) у мишей, яким ввели асцитні пухлинні клітини Ерліха в основному зводиться до періоду - менш, ніж 25 днів. Попередня інкубація пухлинних кліток з МавРС157(2мкг/мл) призвела до збільшення

Ге) тривалості життя у тварин, які ввели згадані пухлинні клітини. Більш 9095 тварин вижило до кінця 45-денного 5о періоду спостережень. Крім того, різні цитостатичні препарати індукували нейтропенію у пацієнтів, а також на о експериментальних моделях. Циклофосфамід є загальноприйнятим препаратом, що використовується для сп індукції нейтропенії. Використання циклофосфаміду(18Омг/кг, в/ч) індукувало достовірні порушення. МавРС157 попереджував нейтропенію, зменшував кількість ретикулоцитів і поліпшував показники по гемоглобіну.

Отже, є очевидною протипухлинна дія МавРС157. Беручи до уваги очевидну схожість моделей на тварин і ов Захворювань у людини і позитивні ефекти, отримані як в дослідах іп мімо, так і іп міго, МавРС157 є корисним для протипухлинної терапії. МавРС157 є придатним для ослаблення шкідливих ефектів від застосування

Ф) цитостатиків. ка Приклад 46: антивірусна активність.

Матеріали і методи: во АКВО-віруси(кліцдовий енцефаліт(ТВЕ), Впапіа, Оепдце 1, 2, 3, 4, Зіпрі5, МУеві Міе, Еаомо), гепатит А, лімфатичний хоріоменінгіт(! СМ) і герпес тип 1 вводили в/щ(або п.о. (після операції) - гепатит А) у вигляді вірусних суспензій, в розведенні 107(0,02мг/миша). МаврРС157(2Омкг/кг маси тіла.) або 0,995 Масі(0,02мл/миша) вводили в/ш або в/ч а) перед обробкою, б) одночасно з введенням вірусу або с) через 4 дні після зараження на фоні симптомів захворювання, що вже виникли. 65 Результати:

Після одночасного введення МавРС157 з вірусами було відмічене значне сповільнення в появі симптомів захворювання і подальшого падіжу(в противному разі постійно мав місце на 4-й і 5-й дні після зараження у контрольних тварин). При введенні на фоні тяжкої картини захворювання, послідовно зазначали достовірне збільшення виживання. При введенні МавРС157 перед обробкою вірусом очевидним була повна відсутність або

СИМПТОМІВ, або подальшого падіжу тварин.

У цілях перевірки отриманих результатів тестували також вірулентність використаних вірусних суспензій(заражені АКВО-вірусами) шляхом зараження суспензіями мозкової тканини, приготованими від мишей, яким раніше ввели МавРС157 або фізіологічний розчин, і відповідно які вижили(МмавРС157)(незважаючи на введення вірусу) або загинули спонтанно(фізіологічний розчин). На відміну від мишей, заражених суспензією 7/0 Мозкової тканини з обробкою фізіологічним розчином(які не відрізнялися від мишей, яких заразили вірусною суспензією і обробили фізіологічним розчином) симптоми захворювання або падіж не спостерігали у мишей, яких заразили суспензією мозкової тканини при обробці МавРС157. Після введення суспензії мозкової тканини мишей спостерігали протягом 50 днів.

Позитивні ефекти МавРС157 зберігалися при інкубації при підвищеній температурі(56"С протягом 30 хвилин).

Беручи до уваги, що ці віруси індукують аналогічні порушення у людей, МавРС157 можна використати для лікування, вірусних захворювань, особливо лікування в тих випадках, коли помітно послаблений загальний стан(наприклад, СНІД або пов'язані з СНІДом захворювання).

Приклад 47: ураження кишечника.

Матеріали і методи:

Вивчали ефекти МавРС157(111мкг або 1Онг/кг, в/ш, в/ч) на щурах в порівнянні з декількома стандартними речовинами на декількох експериментальних моделях виразки(48-годинний стрес, що подавляється, тести з виразкою при підшкірному введенні цистеаміну, внутрішньошлунковому введенні 9690 етанолу, дільниці поразки під дією М5ЗАЇА5, ОМЕЕ(динітрофторбензолу), рефлюкс стравоходу з подальшим кінцевим-латеральним анастомозом між стравоходом і порожньою кишкою)(перед-/спільно/після обробки). сч

Результати:

Тільки введення МавРС157 було послідовно ефективним на всіх тестованих моделях. Бромкриптин, (8) аматодин, фамотидин, циметидин і сомастатин були неефективними(стрес, що подавляється) або були тільки частково ефективними(бромкриптин, ураження кишечника під дією ОМЕВ; сукралфат, ранітидин, холестерамін, рефлюкс стравоходу). Розглядаючи результати по стандартним пептидам, захисну дію, залежну від ю зо дози(цистеамін) та/або частковий позитивний ефект(пов'язаний з умовами обробки)(етанол) отримали з глюкагоном, МРУ і секретином в той час, як ССК/2 6-30/ був неефективний. о

Беручи до уваги, що всі ці моделі використовувалися для скринінгу препаратів, що використовуються в цей б час для лікування уражень шлунково-кишкового тракту і послідовні позитивні ефекти МасРС157, є очевидним його корисне застосування для лікування уражень усього кишкового тракту. --

Приклад 48: вплив на розлади пізнавальної здатності «о

Матеріали і методи:

Використання антихолінергічних препаратів(скополаміну, атропіну, ТОмг/кг маси тіла, в/ч) приводило до значного дефіциту пізнавальної здатності у щурів, що успішно відтворюється при оцінці поведінки тварин у водяному Т-лабіринті протягом тривалого періоду часу. «

Результати: з с У порівнянні з контролем у щурів, оброблених скополаміном і атропіном, можна було чітко побачити підвищену кількість помилок. Цей дефіцит пізнавальної здатності усувався(отримані значення були рівні ;» контрольним значенням) при подальшому спільному введенні з МавРС157(1Омкг або 1Онг/кг маси тіла, в/ч).

Беручи до уваги велике значення цих моделей для розладів пізнавальної здатності у людини, є очевидним, що МавРС157 корисний для лікування порушень пізнавальної здатності.

Ге» Приклад 49: вплив на порушення скасування.

Матеріали, методи і результати: - МавРС157 виявив протисудомну дію, взаємодіючи з ГАМК-енергетичною системою, і підвищував

Ге) ефективність діазепаму при спільному введенні(1Омкг/кг, ТОнг/кг, в/ч) з діазепамом(5,Омг/кг, в/ч, двічі на 5р день протягом 10 днів). МавРС157 ослабляв толерантність до діазепаму і віддаляв ефекти скасування і фізичну 1 залежність. У тестах по толерантності через 42 години після кондиційної схеми введення, спостерігали більш сп короткі перед судомами латентні періоди, ніж у здорових мишей після введення ізоніазиду(8ООмг/кг, в/ч), якщо діазепам(5,Омг/кг, в/ч) давали знову мишам, раніше кондиційно оброблених одним діазепамом. У тесті фізичної залежності(оцінювали через б, 14, 42 і 72 години після кондиційної обробки) були відмічені більш короткі ов перед судомами латентні періоди у мишей, кондиціонованих діазепамом в порівнянні з некондиціонованими здоровими мишами після обробки ізоніазидом через 42 і 72 години після періоду кондиціонування. МавРС157(в

Ф) дозі 1Омкг/кг) в поєднанні з діазепамом віддаляв цей ефект до останнього терміну спостережень. У цій групі на ка шість годинних інтервалів, на відміну від мишей, кондиціонованих діазепамом, латентні періоди перед судомами після введення ізоніазиду були як і раніше довшими, ніж у відповідного контролю. МавРС157 не викликав во якої-небудь толерантності.

Беручи до уваги значення цих моделей для захворювань людини, є очевидним, що МавРС157 придатний для лікування порушень відміни.

Приклад 50: вплив на порушення нирок.

Матеріали і методи: 65 Введення хлориду ртуті(!мг/кг, в/в) або цисплатини(1Омг/кг, п/ш) приводить до гострої ниркової недостатності у експериментальних тварин. При відтворенні таким чином ниркоподібна недостатність тісно корелювали з відповідним розладом у людини. Отже, ураження, індуковані у щурів, в значно високій мірі розділяють схожість з відповідними ураженнями у людей.

Результати:

МмМавРС157 помітно ослабляв ураження у щурів при введенні як до обробки, так і після обробки.

Одностороння нефректомія створила помітне функціональне перевантаження і функціональну гіпертрофію нирки, що залишилася. Введення МавРС157 збільшило діурез у тварин після односторонньої нефректомії і знизило гіпертрофію нирки, що залишилася. Таким чином, в поняттях функціональної теорії про компенсаторну ниркову гіпертрофію, ці виявлені факти підкреслюють поліпшену функцію нирки, що залишилася. Це також 70 підтверджується додатковими біохімічними даними. Крім того, ці дані повністю узгоджуються з ефектами, отриманими на щурах з гіпертонією зі стенозом ниркової артерії та/або після односторонньої нефректомії. Є очевидним корисне застосування МавРсС157 для лікування ниркових порушень.

Приклад 51: клітинні імунні реакції у відповідь лімфоцитів периферичної крові.

Дані по вивченню клітинних імунних реакцій у відповідь лімфоцитів периферичної крові на ВРС в контролі і /5 У пацієнтів з різними захворюваннями представлені в таблиці 2. Відповідні реакції Т-клітин периферичної крові на ВСР тестували за допомогою методу, описаного дезтеї еї а). (де5теї МО еї аї. в "Сеїшаг іттипе гезропзев ої райепів м/йй мейів (о геїпа! апідепв апа (Пеїг їадтепів" Ат У.Орпїйа), 110: 135 - 142, 1990) з 7-денними клітинними культурами. Клітини інкубували без антигену і з 2Онг/л антигену( ВРС157-пентадекапептиду). Для кожного пацієнта вирахували індекс стимуляції діленням середнього го числа стимульованих антигеном культур на середнє число контрольних клітинних культур без додавання антигена, тобто ВРС157-пентадекапептиду. Результати представлені в таблиці 2.

Контрольні значення «2, визначені у контрольних суб'єктів(таблиця 2), відповідали значенням, отриманим іншими дослідниками для пептидів схожої молекулярної маси, тобто у контрольних суб'єктів була відсутня сенсибілізація лімфоцитів периферичної крові на ВРС157-пентадекапептид. У пацієнтів з різним с захворюваннями помітні клітинні реакції у відповідь на ВСР, представлені в таблиці 2, вказують на системну сенсибілізації лімфоцитів на цей пептид шлункового соку. Ці дані чітко вказують на наявність ВСР-пов'язаних о порушень у пацієнтів, страждаючих явно від інших захворювань. На основі цього можна припустити про застосування ВСР-пов 'язаних агентів(наприклад, солей ВРС157-пентадекапептиду) в імуномодуляційній терапії відповідних захворювань. юю 7 ю нн Ф нн М з Те « 2 не с . г»

Ф

-

Результати вищеописаних фармакологічних досліджень демонструють корисну активність солей (Се) ВСР-пептидів для захисту організмів від стресу і захворювань і, загалом, нормалізації функцій організму. Солі сл 50 пептидів за даним винаходом також ефективні для профілактики і лікування деяких захворювань і порушень у людини та/або тварин. сл

Claims (19)

Формула винаходу

1. Сіль пептидної сполуки для захисту організму (ВРС), що містить 8 амінокислотних залишків, де аніон і) солі є негативно заряджений пептид, що має загальну формулу ко І/аа Ро Рго Ріо Хаа Уаа Рго Аа) Себо(2, де 60 Хаа є нейтральний аліфатичний амінокислотний залишок, Уаа є основний амінокислотний залишок, і 7аа є кислий амінокислотний залишок, і де катіон солі є катіоном неорганічної або органічної нетоксичної основи.

2. Сіль за п. 1, яка відрізняється тим, що катіон вибраний з групи, що складається з лужних металів, б5 лужноземельних металів, п МН, первинних, вторинних і третинних амінів.

3. Сіль за п. 2, яка відрізняється тим, що катіон лужного металу вибраний з групи, що складається з Ма", К", Пі сСв.

4. Сіль за п. 2, яка відрізняється тим, що катіон лужноземельного металу являє собою Са?".

5. Сіль за п. 2, яка відрізняється тим, що первинний амін вибраний з групи, що складається з циклогесиламіну, 2-АМР (2-аміно-1-пропанолу) і Тріс" (Тріс-(гідроксиметил)амінометану) .

6. Сіль за п. 2, яка відрізняється тим, що третинний амін являє собою триетаноламін".

7. Сіль за п. 1, яка відрізняється тим, що й й І Хаа є Аза, рАїа, Іецп, І1е, сіу, Уа1!, Ме або Ма, аа є їув, Акод, Огп або Нів, їі 2аа є бій, Ар, Аай або Арпи. 19

8. Сіль за будь-яким з пунктів 1-7, яка відрізняється тим, що вона додатково містить фармацевтично або діагностично прийнятний носій.

9. Сіль за будь-яким з пунктів 1-8, яка відрізняється тим, що вона додатково містить трегалозу.

10. Сіль за будь-яким з пунктів 1-9, яка відрізняється тим, що загальна формула є Хаа аа Рго Ркго Рго Хаа Уаа Рго Аі1а Азр аа А1а Хаа Хаа Хаа. 5) 10 15

11. Сіль за будь-яким з пунктів1-10, яка відрізняється тим, що пептид вибраний з групи, що складається з: Ген 911 Ркго Рго Рко сіу цПув Рго Азїа Авр Авр Аїа Пец сіу Ма1; с 5 10 15 о сіу бій Рго Рго Рко сбіу Пув Ркго А1їа Авр Авр А1їа Сіу Іецй Уа1; . ів) зо в 10 15 ІС) пе бій Рго Рго Рко Пец пув Рко А1ї1а Авр Авр Аіїа Гей с1у Уаї1ї; Ф 5 10 15 - Геп бій Рко Рхго Рко Гей Пув Рго А1а Авр А1їа Гец С1іу Уа1; (Се) 5 10 14 с1у бій Рко Рко Рго сіу Пув Рго Аїа Авр Аза Ссіу Ієи Уа1; « то 5 10 14 З с "з бі Рко Рко Рго Тецй Ппув Рго АБта;: 5 8 б Авр Рхо Рко Рко І1е Акуд Рко А1а Авр; - 5 9 ї-о бій Рго Рко Рго Тец Пцув Рго Аза Авр; с 50 І 5 9 сл Пемй бій Рко Рхо Рхо Пей Пув Рго Аїа Авр Аіїа теп с1у Уаі1; 5 10 14 Ф) сіу бій Рко Рко Рго біу Акд Рко Аза Авр; и з 5 10 60 бі Рко Рго Рхго Пец Був Ркго А1а Авп., 5 З 65

12. Сіль за будь-яким з пунктів 1-11, яка відрізняється тим, що пептид циклізований, зокрема, амідним зв'язком між першим і останнім амінокислотними залишками.

13. Сіль за будь-яким з пунктів 1-12, яка відрізняється тим, що сіль розчинена у водному або водно-спиртовому розчині, переважно, при рН 6,0-8,5.

14 . Сумісна стабільна при зберіганні фармацевтична композиція, що містить фармацевтично ефективну Кількість солі пептиду ВРС за будь-яким з пунктів 1-13 і необов'язково фізіологічно прийнятний носій.

15. Фармацевтична композиція за п. 14, яка відрізняється тим, що вона додатково містить трегалозу і використовується для перорального застосування.

16. Фармацевтична композиція за п. 14 або 15, яка відрізняється тим, що вона застосовується для лікування: порушень, пов'язаних або з утворенням оксиду азоту (ІІ) (МО), або з порушеними функціями 7/0 МО-системи, зокрема, гіпертензії, стенокардії, імпотенції, циркуляторного і септичного шоку, інсульту, запалення, респіраторного дистрес-синдрому, адгезії і агрегації тромбоцитів і лейкоцитів, дисфункції ендотелію, ушкоджень шлунково-кишкового тракту, розладів перистальтики, цукрового діабету, панкреатиту, гіпотензії і хвороби Паркінсона; дисфункцій або гіперфункцій соматосенсорних нервів, зокрема, сенсорної нейропатії, постгерпетичної невралгії, атопічного дерматиту, порушеного загоєння пошкодженої тканини, набутої 7/5 ХолодовоЇї або теплової кропивниці, псоріазу, бульозного пемфигоїду, екземи, фотодерматозів, хронічного артриту, ушкоджень шлунково-кишкового тракту, специфічної або неспецифічної гіперреактивності верхнього і нижнього відділів дихальних шляхів, бронхіальної астми і риніту; ран, виразок; порушень, пов'язаних з гострим і/або хронічним запаленням, зокрема, хронічного артриту, порушень, пов'язаних з гіперчутливістю уповільненого типу, і уражень шлунково-кишкового тракту; печінкових порушень, ушкоджень органів, викликаних вільними го радикалами, особливо, викликаних опроміненням; порушень, пов'язаних з розладами катехоламінергічної системи, зокрема, шизофренії, ефектами вживання амфетамінів і зловживання наркотиками; станів, пов'язаних зі стресом; гострого панкреатиту, особливо, з супутньою патологією шлунку і дванадцятипалої кишки; серцевих порушень; депресивних порушень; хвороби Паркінсона і подібної до хвороби Паркінсона патології; температурних порушень; ушкоджень кісток; викликаних гіпертензією ушкоджень різних органів; порушень с ов коагуляції; больових порушень; судорожних порушень; травм спинного мозку; алкогольних ушкоджень, викликаних зловживанням алкоголем або підвищеним вживанням алкоголю; ішемічних порушень головного і) мозку, ушкоджень периферичних нервів; каталептичних порушень і нейролептичних порушень; порушень, пов'язаних з аномальними або мутантними лімфоцитами; порушень плоду; атрофії піхви і розвитку остеопорозу, викликаних видаленням яєчників; пухлин; вірусних захворювань, зокрема, СНІД, САК; ушкоджень ю зо шлунково-кишкового тракту; когнітивних порушень; синдрому скасування; ниркових порушень і порушень клітинної імунної відповіді. що)

17. Фармацевтична композиція за п. 14 або 15, яка відрізняється тим, що вона застосовується для надання Ге! цитопротективної або органопротективної дії.

18. Діагностична стабільна при зберіганні композиція, що містить діагностично ефективну кількість солі -- зв пептиду ВРС за будь-яким з пп. 1-13. «о

19. Спосіб одержання солі пептиду ВРС, охарактеризованої в будь-якому з пп. 1-13, що передбачає змішування, щонайменше, одного пептиду ВРС у водному або водно-спиртовому розчиннику з одним або декількома основами і одержання солі пептиду ВРС, де катіон солі являє собою катіон неорганічної або органічної нетоксичної основи. « - с ;» (22) - се) с 50 сл Ф) іме) 60 б5