UA73082C2 - Водна домішка до кормів для тварин з умістом лізину і спосіб її одержання - Google Patents

Abstract

Водна домішка до кормів для тварин з умістом L-лізину, що необов’язково містить біомасу мікроорганізмів, одержану в процесі ферментації, яка має значення рН, що не досягає 7, а також спосіб одержання цієї домішки.

Description

Опис винаходу

Даний винахід стосується водних домішок до кормів для тварин з умістом лізину й, разі потреби, 2 мікроорганізмів, бажано в інактивованій формі, що застосовуються в процесі ферментації, а також способу одержання такої композиції.

Передумови створення винаходу

Незамінна амінокислота І -лізин знаходить широке застосування як домішка до кормів для тварин.

Відомо, що І-лізин одержують шляхом ферментації з використанням штамів коринебактерій, насамперед 70 Согупебрасіегішт дішатісицит. Унаслідок великого значення цього продукту постійно ведуться роботи з удосконалювання способу його одержання. Удосконалення даного способу можуть стосуватися поліпшення властивих самому мікроорганізмові характеристик продуктивності, наприклад, шляхом мутагенезу та селекції, технологічних сторін процесу ферментації, таких, як перемішування та забезпечення киснем, складу поживних середовищ, наприклад, концентрації цукру в процесі ферментації, або оброблення продуктів, наприклад, за 12. допомогою іонообмінної хроматографії або кристалізації.

З рівня техніки відомо про три різні групи форм продуктів з умістом І-лізину, які одержують із ферментаційного бульйону, що містить І -лізин.

Найбільш розповсюджена група включає порошкоподібну або кристалічну форми продукту з очищеного або чистого І -лізину, що зазвичай знаходиться у формі солі, такого, як моногідрохлорид І -лізину.

Інша група твердих форм продукту, наприклад, така, яку описано в ЕР-В 0533039, містить поряд із | -лізином домішки, які використовуються в процесі ферментації, та, у разі потреби, інактивовану біомасу застосовуваного мікроорганізму.

Порошкоподібна, кристалічна, а також гранульована форми продукту мають явні недоліки з погляду зручності у використанні та застосуванні. На якість продукту в значній мірі впливають метеорологічні умови, такі, як с висока вологість повітря, оскільки внаслідок можливого грудкування й злипання погіршується стійкість під час Ге) зберігання й утрудняється дозування продукту під час його використання. З іншого боку, оброблення сухих порошкоподібних продуктів з умістом І -лізину може призводити до небажаного пилоутворення.

Третя група продуктів з умістом І -лізину включає концентровані водні лужні розчини і тому є позбавленою вищенаведених недоліків (ЕР-В 0534865). сч

Для різних форм існують різноманітні способи одержання продуктів з умістом І -лізину з ферментаційного с бульйону, що містить І -лізин.

З метою одержання твердого чистого І -лізину в цей час, в основному, використовуються два різні методи. о

Лізин можна одержувати у форму моногідрохлориду (ІГузеНСІ) шляхом кристалізації з відповідного со ферментаційного бульйону після відділення інактивованої біомаси придатними методами. Очищення фільтрату перед подальшим концентруванням, як правило, здійснюють за допомогою іонообмінної хроматографії у кілька - стадій. З цією метою відділений від біомаси ферментаційний бульйон у бажаному варіанті підкислюють шляхом додавання соляної кислоти (НС) або сірчаної кислоти (Н»ьБО)), щоб полегшити адсорбцію лізину іонообмінною смолою. Поряд з одержаним шляхом ферментації І -лізином також неспецифічно зв'язуються різноманітні інші « дю катіони, присутні у ферментаційному бульйоні. В цілому для одержання чистого продукту необхідно -о використовувати різні обмінні, послідовно підключені колонки. Наприкінці адсорбований лізин бажано елюювати с лужним розчином аміаку й регенерувати іонообмінну колонку. Після цього одержаний у такий спосіб розчин :з» лізину концентрують і, здійснивши нейтралізацію з використанням соляної кислоти, одержують лізин еНСІ у кристалічній формі. 415 Інший метод дозволяє одержувати лізин у формі кристалічної солі після очищення активованим вугіллям (ЗИ -1 183581). Для цього ферментаційний бульйон, що містить лізин, інактивують стандартним методом, шляхом нагрівання у вологій атмосфері, і відокремлюють фільтрацією від біомаси. Після підкиснення фільтрату при о постійному перемішуванні при температурі 50-552С до рН 5 додають 4-595 активованого вугілля для видалення з о фільтрату небажаних домішок та уникнення фарбування кристалізата. Шляхом наступної додаткової фільтрації 5р Відокремлюють активоване вугілля й потім, шляхом додавання гідроксиду кальцію, осаджують розчинений бо сульфат у формі сульфату кальцію. Цей продукт фільтрують, видаляють аміачний компонент у вакуумі за

ГЕ допомогою роторного випарника й потім розчин концентрують доти, поки при охолодженні не відбудеться кристалізація.

Недолік обох цих технологій оброблення полягає в наявності численних окремих стадій обробки та у використанні дорогих методів очищення за допомогою іонообмінної хроматографії. У процесі видалення небажаних солей або під час використання різних елюючих середовищ утворюються додаткові потоки відходів, (Ф) що вимагають або трудомісткого очищення, або дорогої утилізації. ко Як описано в ЕР-В 0533039, ці недоліки вдається усунути завдяки тому, що весь ферментаційний бульйон, а в разі потреби, й біомасу, концентрують та сушать розпиленням при високій температурі. во У 05 5990350 описано спосіб одержання гранулята з умістом І -лізину, в якому відсутня біомаса. За цим способом, спочатку, за допомогою ультрафільтрації, біомасу відокремлюють від ферментаційного бульйону та відкидають. Потім одержаний у такий спосіб фільтрат концентрують шляхом майже повного випарювання присутньої у ньому води. Після цього одержаний у такий спосіб концентрат сушать і переробляють дорогим методом грануляції шляхом розпилення у псевдозрідженому шарі з одержанням цільового гранулята. в5 В ЕР-В 0534865 описано спосіб одержання водних основних розчинів з умістом І -лізину з ферментаційного бульйону. За описаним у вищенаведеній заявці способом, біомасу відокремлюють від ферментаційного бульйону й відкидають. З використанням основи, такої, як гідроксид натрію, калію або амонію, значення рн стабілізують на 9-11. Мінеральні компоненти (неорганічні солі) відокремлюють від бульйону після концентрування й охолодження шляхом кристалізації та використовують як добриво або відкидають (спрямовують у відходи).

Мета даного винаходу полягає в розробленні нових водних, придатних як домішки до кормів, композицій з умістом І -лізину та його солей.

Крім того, метою даного винаходу є розроблення способу одержання таких композицій, який був би більш економічним та ефективнішим, ніж способи, про які відомо з рівня техніки. 70 Незамінна амінокислота лізин знаходить широке застосування як домішка до кормів для тварин.

Мікроорганізми роду Согуперасіегішт відрізняються здатністю виділяти Іі-лізин у відповідному ферментаційному середовищі протягом порівняно короткого проміжку часу у високій концентрації. З цією метою зазвичай здійснюють періодичний процес із підживленням. На даний момент одержуваний ферментативним шляхом І! -лізин переробляють у бажаному варіанті в кристалічний продукт, порошок або гранулят.

Об'єктом даного винаходу є домішка до кормів для тварин, яка одержується на основі ферментаційного бульйону й відрізняється тим, що вона містить а) І -лізин і/або його солі, б) одержану в процесі ферментації біомасу в кількості від 0 до 10095, бажано від 50 до 10095 Її в оптимальному варіанті від 90 до 10095, в) принаймні переважну частину інших розчинених та суспендованих інгредієнтів ферментаційного бульйону, г) знаходиться в рідкій формі, у разі потреби, у формі суспензії, та д) має значення рнН, що 7.

Уміст лізину (чистого) в домішці до кормів для тварин становить від їОмас.Уо до З5мас.9о, у бажаному варіанті від 15мас.9о до З5мас.9о, ще бажаніше від 18мас.95 до Зб5мас.бо і в оптимальному варіанті від 21мас.9о с ов до Замас.бо у перерахуванні на загальну кількість домішки. Значення рН не досягає 7, зокрема, становить від 2 до 6,5, ще бажаніше від 2,5 до 6 й в оптимальному варіанті від 2,5 до 5. (8)

Загальний уміст сухої маси в домішці становить від 1Омас.9о до 55мас.95, зокрема, від 20мас.9о до 55мас.об, бажаніше від Зб5мас.бо до 55мас.о і в оптимальному варіанті від 45мас.9о до 54мас.95. До складу сухої маси поряд із лізином входять: с зо - у бажаному варіанті біомаса мікроорганізму-продуцента, - неорганічні й органічні компоненти ферментаційного бульйону й со - побічні продукти, що утворюються в процесі ферментації, якщо їх не відокремлюють відповідними о методами, такими, як сепарація або фільтрація.

Якщо біомасу повністю або частково залишають у домішці, вона містить протеїн мікроорганізму в ме) концентрації максимум до 4мас.Оо. М

У функції неорганічних компонентів поряд з іншими домішка містить кальцій, магній, фосфор у формі фосфату й сірку у формі сульфату, а як органічні компоненти - вітаміни, такі, як біотин і тіамін, або цукри, наприклад, ізомальтозу.

До органічних побічних продуктів, що утворюються в обмеженій кількості в процесі ферментації, відносяться «

Ї-амінокислоти з групи, до якої належать Іі -аланін, І-аспарагін, І-глутамін, І-метіонін, І-треонін і І-валін. з с Крім того, до них відносяться органічні кислоти, що несуть від однієї до трьох карбоксильних груп, такі, як молочна кислота, оцтова кислота й яблучна кислота. До них належать також цукри, наприклад, трегалоза. ;» Наявність цих сполук є бажаною в тому випадку, якщо вони підвищують корисність домішки.

Наступним об'єктом даного винаходу є спосіб одержання водних розчинів/суспензій з умістом лізину і/або його солей, який відрізняється тим, що -І а) шляхом ферментації одержують бульйон, що містить І -лізин, б) у разі потреби, шляхом додавання речовини з умістом І-лізину концентрацію лізину стабілізують на о бажаному рівні, о в) значення рН розчину/суспензії стабілізують на відмітці, нижчій ніж 7 г) одержаний у такий спосіб бульйон, у разі потреби, концентрують у вакуумі, при цьому послідовність со стадій б), в) і г) може бути змінено.

Ге Ще одним об'єктом даного винаходу є спосіб одержання водних розчинів/суспензій з умістом лізину і/або його солей, який відрізняється тим, що а) шляхом ферментації одержують бульйон, що містить І -лізин 5Б б) значення рН одержаного у такий спосіб бульйону стабілізують на відмітці, нижчій ніж 7 в) у разі потреби, із розчину/суспензії повністю або частково виділяють біомасу,

Ф) г) якщо необхідно, шляхом додавання речовини з умістом І!-лізину концентрацію лізину стабілізують на ка бажаному рівні й д) одержаний у такий спосіб бульйон, у разі потреби, концентрують у вакуумі, при цьому послідовність бо стадій б), в), г) і д) може бути змінено.

Мутанти коринебактерій, що продукують І -лізин, детально описано у відомих публікаціях, наприклад, у О5 4657860.

З метою продукування І -лізину ці штами можна культивувати безперервно або періодично з використанням періодичного процесу (культивування партій) або періодичного процесу з підживленням, чи періодичного 65 процесу з повторюваним підживленням. Огляд відомих методів культивування наведено у підручнику Сптіе!

ІВіоргогезвіесппік 1. Еіпіййгипоу іп діе Віомепапгепвіесппік (видавництво Сизіам Різспег, Зішщодаг, 1991)) або в підручнику Біогаз |ІВіогеакіогеп па регірпеге Еіпгіспнпдеп (видавництво Мігмед, Вгашпзспм/еід///езбадеп,

Використовуване культуральне середовище необхідно відповідним чином адаптувати до вимог конкретного штаму. Як джерело вуглецю можна використовувати цукор і вуглеводи, такі, як глюкоза, цукроза, лактоза, фруктоза, мальтоза, меляса, крохмаль і целюлоза, олії та жири, наприклад, соєву олію, соняшникову олію, арахісову олію й кокосову олію, жирні кислоти, наприклад, пальмітинову кислоту, стеаринову кислоту й лінолеву кислоту, спирти, наприклад, гліцерин і етанол, і органічні кислоти, наприклад, оцтову кислоту. Кожна з цих речовин може застосовуватися окремо або у формі суміші з іншими. Як джерело азоту можна застосовувати 70 органічні азотовмісні сполуки, такі, як пептон, дріжджовий екстракт, м'ясний екстракт, солодовий екстракт, кукурудзяний екстракт, соєве борошно й сечовина, або неорганічні сполуки, такі, як сульфат амонію, хлорид амонію, фосфат амонію, карбонат амонію й нітрат амонію. Джерела азоту можуть застосовуватися окремо або у суміші. Як джерело фосфору можна застосовувати кислий фосфат калію чи дикалійгідрофосфат, або відповідні натрієві солі. Крім того, культуральне середовище повинне містити необхідні для росту солі металів, такі, як /5 Сульфат магнію або сульфат заліза. На додаток до вищенаведених сполук можна використовувати також такі важливі для росту речовини, як амінокислоти й вітаміни. Крім того, у культуральне середовище можна додавати відповідні попередники. Вищенаведені домішки можна вводити в культуральне середовище одноразово або додавати відповідним чином у процесі культивування.

Для контролю значення рН культурального середовища відповідним чином застосовують основні сполуки, такі, як гідроксид натрію, гідроксид калію, аміак або кислі сполуки, такі, як фосфорна кислота або сірчана кислота. З метою контролю піноутворення додають антиспінювачі, такі, як полігліколеві ефіри жирних кислот. З метою стабілізації плазмід можна додавати відповідні конкретному середовищу речовини, які діють селективно, наприклад, антибіотики. Щоб підтримати аеробні умови, в культуру вводять кисень або кисневмісні газові суміші, наприклад, повітря, й перемішують за допомогою відповідних систем або з використанням потоку газу. Як сч ов правило, температура культивування знаходиться у діапазоні від 252 до 372С. Культивування продовжують доти, поки не утвориться максимальна кількість І -лізину. Як правило, на це потрібно від 10 до 160 годин. і)

Приклади придатних ферментаційних середовищ наведено, наприклад, у ЕР-В 0532867, 05 5840551 і 05 5990350.

Аналіз І -лізину можна здійснювати за допомогою аніонообмінної хроматографії з наступною дериватизацією су зо З використанням нінгідрину за методом, який описано у ЗрасКктап та ін. |(Апаїуїса! Спетівігу, 30, 1190 (1958)), або за допомогою ЖХВР із зворотною фазою за методом, описаним у Ііпагоїй та ін. |Апаїуїісаї со

Спетівігу 51:1167-1174 (1979). о

У бажаному варіанті вміст І-лізину (чистого) у застосовуваних за даним винаходом ферментаційних бульйонах перевищує боОг/л, причому вміст цукрів, які не беруть участь у метаболізмі, не досягає 5,0г/л. Якщо і.

Зз5 Загальний умісті сухої маси перевищує 1Омас.9о, бажано, щоб частка сухої біомаси знаходилася в інтервалі від 1 ча до 4мас.9о. При цьому вміст побічних продуктів і вітамінів (амінокислоти, органічні кислоти) у ферментаційному бульйоні у бажаному варіанті не досягає 2мас.9р.

В цілому, під час здійснення запропонованого способу спочатку у ферментаційному бульйоні інактивують або вбивають, наприклад, шляхом теплового оброблення, біомасу. Проте, у разі потреби, інактивацію можна не « проводити. Після цього рН ферментаційного бульйону стабілізують на значенні, що не досягає 7, зокрема, шщ с знаходиться у діапазоні 2-6,5, ще бажаніше 2,5-6 й в оптимальному варіанті 2,5-5. Це здійснюють із й використанням неорганічної кислоти, такої, як, сірчана кислота, соляна кислота або фосфорна кислота, або «» органічної кислоти, такої, як лимонна кислота, оцтова кислота або мурашина кислота, або використовуючи їхні суміші. Якщо необхідно, перед або після підкиснення біомасу повністю або частково відокремлюють за допомогою широко відомих методів сепарації або фільтрації. Відділення мінеральних компонентів зазвичай -і здійснювати не потрібно. Після цього кислий розчин з умістом І-лізину або суспензії концентрують відомими методами (наприклад, із використанням таких пристроїв, як роторний випарник, тонкоплівковий випарник або о випарник із падаючою плівкою), бажано у вакуумі, доти, поки не одержать рідкий продукт з умістом лізину ав! (виходячи з чистого І -лізину) від їОмас.96 до З5мас.95, зокрема, від 15мас.уо до ЗбБмас.95, ще бажаніше від 2Омас.бо до Зо5мас.бо і в оптимальному варіанті від 21мас.9о до Замас.бо, причому загальний уміст сухої маси

Со становить від 1Омас.9о до 55мас.9о5, зокрема, від 20мас.95 до 55мас.бо, ще бажаніше від Збмас.о до 55мас.Ор і в

Кз оптимальному варіанті від 45мас.9о до 54мас.9о. Як правило, бульйон потрібно концентрувати у такий спосіб, щоб мінеральні компоненти (неорганічні солі) не осаджувалися з ферментаційного бульйону, а лізин залишався в розчиненому стані. У разі потреби, бажаної концентрації І -лізину в продукті можна досягти шляхом додавання

На будь-якій стадії способу речовини з умістом І -лізину.

Одержуваний(-а) у такий спосіб розчин/суспензія має кисле значення рН, легко транспортується, легко іФ) піддається дозуванню, є стабільним(і-ою) по відношенню до мікроорганізмів і характеризується підвищеною ко стабільністю під час зберігання в порівнянні з лужним розчином.

Підкиснення можна також здійснювати після або в процесі концентрування. Аніони, що володіють бо функціональною активністю, такі, як сульфат, хлорид, фосфат, цитрат та інші, можна вводити в середовище у формі звичайних солей, які надходять у продаж, ще перед початком ферментації.

Під терміном "суспензія" мається на увазі, що в бажаному варіанті інактивовані мікроорганізми знаходяться у продукті за даним винаходом у нерозчиненій формі.

Приклади 65 Нижче даний винахід детальніше пояснюється на прикладах.

Приклад 1

Одержання ферментаційного бульйону з умістом І -лізину

Методи ферментації з метою одержання ферментаційних бульйонів з умістом лізину, які обробляють у спосіб за даним винаходом, детально описано в різноманітних патентах (ЕР-В 0532867 і 05 5840551).

Приклад 2

Одержання продукту, що не містить біомаси

За прикладом 1 виготовляють 20кг ферментаційного бульйону з умістом чистого лізину, що становить приблизно 9,5мас.9о. Спочатку присутню у ферментаційному бульйоні біомасу інактивують шляхом теплового оброблення протягом ЗОхв. при температурі 80 С. Після цього інактивовану біомасу відокремлюють шляхом 7/0 центрифугування протягом 20хв. при 400боб./хв. (лабораторна центрифуга типу Віоїиде-зігаювз, фірма Негаеив,

Дюссельдорф, Німеччина). Значення рН 1,0л очищеної у такий спосіб надосадової рідини, шляхом послідовного додавання порцій концентрованої сірчаної кислоти, стабілізують приблизно на 4. Потім уміст рідини в центрифугаті зменшують у вакуумі за допомогою роторного випарника (лабораторний роторний випарник типу

Виспі Коїамарог КЕ-120, фірма Виспі-І аропгесппік СтьН, Констанц, Німеччина) приблизно до 5095 сухої маси.

Уміст І -лізину (чистого) в одержаному у такий спосіб рідкому продукті становив 31,5мас.9о при значенні рн 4. Загальний уміст сухої маси становив 49,Змас.9о.

Приклад З

Одержання продукту з умістом біомаси

За прикладом 1 виготовляють 20кг ферментаційного бульйону з умістом чистого лізину приблизно 9,5мас.об. Присутню у ферментаційному бульйоні біомасу інактивують безпосередньо в біореакторі шляхом теплового оброблення протягом ЗОхв. при температурі 802С. Значення рН 1,0л цього ферментаційного бульйону з умістом біомаси, шляхом послідовного додавання порцій концентрованої сірчаної кислоти, стабілізують приблизно на 4.

Потім уміст рідини й лізину в цьому кислому ферментаційному бульйоні зменшують у вакуумі за допомогою роторного випарника (лабораторний роторний випарник типу Висні Коїамарог КЕ-120, фірма Виспі-їаропесптк с

ОтрН, Констанц, Німеччина) приблизно до 5095 сухої маси.

Уміст І -лізину (чистого) в одержаному у такий спосіб рідкому продукті становив 21,8мас.9о при значенні рн о 4. Загальний уміст сухої маси становив 50,7мас.95. Зберігання протягом 16 місяців при температурі 20 С не призвело до будь-яких змін у складі. с

Claims (5)

Формула винаходу со «в)

1. Домішка до кормів для тварин на основі ферментаційного бульйону, приготовленого з використанням коринебактерій як продуцентів І -лізину, яка відрізняється тим, що о а) містить І-лізин і/або його солі в кількості від 10 до 35 мас.бо (чистого І-лізину ) у перерахунку на |з загальну масу домішки, б) містить біомасу, одержану в процесі ферментації з використанням коринебактерій як продуцентів Ї -лізину, в кількості до 10095, бажано від 50 до 10095 і в оптимальному варіанті від 90 до 10095, « в) містить принаймні переважну частину інших розчинених і суспендованих інгредієнтів ферментаційного бульйону, - с г) знаходиться в рідкій формі, якщо необхідно, у формі суспензії, та ц д) має значення рН, що не досягає 7. и"?

2. Домішка до кормів для тварин за п.1, яка має значення рН, що знаходиться у діапазоні від 2 до 6,5.

3. Спосіб одержання домішки до кормів для тварин, що містить І -лізин і/або його солі, який відрізняється ТИМ, ЩО -І а) шляхом ферментації з використанням коринебактерій як продуцентів І -лізину готують бульйон, що містить Ї -лізин, о б) значення рН одержаного бульйону стабілізують на відмітці, нижчій ніж 7. ав!

4. Спосіб одержання домішки до кормів для тварин, що містить І-лізин і/або його солі, за п.З3, який відрізняється тим, що додатково передбачає стадію в), на якій концентрацію стабілізують на бажаному со рівні шляхом додавання І -лізину або розчину, що його містить, Кз при цьому послідовність здійснення стадій б) і в) може бути довільною.

5. Спосіб одержання домішки до кормів для тварин, що містить І-лізин і/або його солі, за п.3 або 4, який відрізняється тим, що додатково передбачає стадію г), на якій одержаний бульйон концентрують, при цьому послідовність здійснення стадій б), в) і г) може бути довільною.

б. Спосіб одержання домішки до кормів для тварин, що містить І!-лізин і/або його солі, за п.З3, іФ) який відрізняється тим, Що ко а) шляхом ферментації з використанням коринебактерій як продуцентів І -лізину готують бульйон, що містить Ї -лізин, во б) значення рН одержаного бульйону стабілізують на відмітці, нижчій ніж 7, в) якщо необхідно, із цього бульйону повністю або частково видаляють біомасу, г) У разі потреби концентрацію стабілізують на бажаному рівні шляхом додавання І -лізину або розчину, що його містить, і д) якщо необхідно, одержаний бульйон концентрують, при цьому послідовність здійснення стадій б), в), г) і 65 д) може бути довільною.

Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2005, М 6, 15.06.2005. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. с о с со «в) со м. ші с ;» -І (95) («в) о 50 Ко) Ф) іме) 60 б5