UA73743C2 - A method for the production of l-amino acids from their racemic n-acetyl-d,l-derivatives using enzymatic racemate cleavage by means of isolated recombinant enzymes - Google Patents
A method for the production of l-amino acids from their racemic n-acetyl-d,l-derivatives using enzymatic racemate cleavage by means of isolated recombinant enzymes Download PDFInfo
- Publication number
- UA73743C2 UA73743C2 UA2002021417A UA2002021417A UA73743C2 UA 73743 C2 UA73743 C2 UA 73743C2 UA 2002021417 A UA2002021417 A UA 2002021417A UA 2002021417 A UA2002021417 A UA 2002021417A UA 73743 C2 UA73743 C2 UA 73743C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- acetyl
- derivatives
- amino acids
- racemic
- differs
- Prior art date
Links
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 39
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 230000007017 scission Effects 0.000 title claims abstract description 16
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 6
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 title abstract 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 15
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 8
- 108010093701 hippurate hydrolase Proteins 0.000 claims description 6
- 238000012876 topography Methods 0.000 claims 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 abstract description 2
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 abstract 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 10
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N N-benzoylglycine Chemical group OC(=O)CNC(=O)C1=CC=CC=C1 QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 3
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004296 chiral HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHCKPJGJQOPTLB-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-4-imidazoleacetic acid Chemical compound CN1C=NC(CC(O)=O)=C1 ZHCKPJGJQOPTLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010003977 aminoacylase I Proteins 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 229930182852 proteinogenic amino acid Natural products 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036632 reaction speed Effects 0.000 description 1
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
- C12P41/007—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving acyl derivatives of racemic amines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Опис винаходу
Одержання непротеїногенної амінокислоти І-РРТ (І -фосфінотрицин) за допомогою розщеплення рацемата з 2 високою чистотою і виходом досі було описане тільки за допомогою розщеплення фенацетил-фосфінотрицину за допомогою пеніцилін-с-ацилазою з Езспегіспіа соїї (ОЕ-А-3048612). Але синтез фенацетил-РРТ в порівнянні з
М-Ас-РРТ є більш трудомістким і дорогим. Однак С-ацилаза не володіє специфічністю до аліфатичних ацильних залишків і, тим самим, також до М-Ас-РРТ. Інші відомі ацилази також не мають або мають лише незначну специфічність субстрату до М-Ас-РРТ і досі використовувалися тільки в мікробних біотрансформаціях без 70 очищення ферментів (як, наприклад, описано в заявці ОЕ-А-2939269). Внаслідок цього були досяжні тільки дуже незначні виходи об'єм/час. З заявки на патент ЕР-А-0382113 відомо І -специфічне розщеплення складних ефірів карбонових кислот М-Ас-РРТ за допомогою ацилази І. Цей фермент також не володів специфічністю до вільних карбонових кислот, і тому як додаткова стадія синтезу при приготуванні субстрат була потрібна етерифікація.
Заявка на патент ЮЕ-А-19652284 описує цільове виділення мікробних деатилаз з грунтових проб зі 12 специфічністю до М-ацетил-амінокислот, переважно М-ацетил-фосфінотрицину (М-Ас-РРТ), а також клонування відповідних генів з ЄЇепоїгорпотопаз зр. і Сотатопаз асідомогапзв.
На основі виявленої гомології послідовності і проведених тестів специфічності субстрату змогли показати, що описані деацетилази відносяться до групи гіпурат-гідролаз (ЕС 3.5.1.32), природним субстратом яких є
М-бензоїл-гліцин, похідне амінокислоти з однією ароматичною М-ацильною функціональною групою. Тому представляло інтерес те, що ці ферменти як субстрат також можуть зв'язувати М-ацетильовані амінокислоти, особливо М-ацетил-фосфінотрицин, причому мова йде про похідні амінокислот з аліфатичними М-ацильними функціональними групами. З заявок на патенти ЮОЕ-А-2939269 і ЮЕ-А-2717440 відомо, що гербіцидна дія рацемічного фосфінотрицину викликається тільки його І -енантіомером (І-РРТ).
У зв'язку з цим представляло інтерес, що виявлені деацетилази розщеплюють виключно І -енантіомери с
М-ацетил-РРТ, а також М-ацетил-похідні деяких протеїногенних амінокислот з високою специфічністю. Тому ці (У ферменти чудово підходять для одержання І -амінокислот, особливо гербіцидної біологічно активної речовини
ІЇ-фосфінотрицину з його рацемічних М-ацетил-похідних за принципом розщеплення рацемата, як це описується, наприклад, в заявках на патенти ЕР-А-0304021, ЮЕ-А-2939269 і ЮЕ-А-3048612. Істотні недоліки способів, описаних у вище вказаних заявках однак полягають в тому, що (1) можуть використовуватися тільки незначні о концентрації субстрату (близько 0,595 у випадку заявки ОЕ-А-2939269), внаслідок чого технічна придатність «Її оцінюється як незначна, що (2) працюють з не виділеними ферментами, внаслідок чого проблема побічних реакцій і подальших стадій очищення не вирішується або є такою, що дуже дорого коштує і що (3) одержання в продукту вимагає великих матеріальних витрат (як у разі заявки на патент ОЕ-А-3048612). со
Задача винаходу полягає в тому, щоб експресувати одну або більше нових деацетилаз (як вже 3о охарактеризовано в ОЕ-А-19652284) у відповідних формі і кількості, і за допомогою цих ферментів забезпечити в одержання І-РРТ, а також деяких протеїногенних І-амінокислот з хімічно дуже легко доступних рацемічних
М-ацетил-О,| -похідних за допомогою розщеплення рацемата з високим виходом і чистотою енантіомерів.
У випадку, якщо ферментативна активність вже приблизно відома, і якщо вже сталося клонування « послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує фермент, перша дія полягає в тому, що відповідний фрагмент З нуклеїнової кислоти переводять у відповідний вектор, для того, щоб потім або здійснити надпродукування в с придатному штамі бактерії, і/або щоб виділити протеїн після надпродукування. Виділений таким чином фермент
Із» може або безпосередньо використовуватися для ферментативної реакції, або через відповідні зв'язуючі групи фіксуватися на матриці.
Перший ферментативний тест може бути рекомендований для того, щоб одержати основне підтвердження, 49 чи протікає бажана реакція. Всі подальші заходи служать для оптимізації параметрів відносно специфічності і реакції (по відношенню до початкової речовини і продукту), швидкості реакції, ефективності реакції, періоду со напіврозпаду ферменту, що використовується, а також можливих концентрацій субстрату. У випадку якщо окремі параметри не точно відповідають вимогам, потрібно виробити необхідні зміни в послідовності нуклеїнової 7 кислоти, що кодує фермент, які спричинять подальшу оптимізацію природного ферменту, що є. «їз» 20 Клонування окремих деацетилаз, що використовуються вже описувалося в заявці ОЕ-А-19652284. Фрагменти нуклеїнової кислоти, що кодують відповідні деацетилази були переклоновані, як нижче приведено в прикладі 1, у с» відповідні вектори експресії, для того щоб таким чином забезпечити необхідну міру певної специфічності субстрату і відсутність побічних реакцій. Так, в заявці ОЕ-А-19652284 змогли показати, що М-ацетил-0О-РРТ деацетилюється, однак не змогли показати, що М-ацетил-О-РРТ не деацетилюється. Виняткове перетворення 29 М-ацетил-їі -амінокислот і М-ацетил-Ї-РРТ являє собою, однак, елементарну попередню умову для технічного
ГФ) застосування, що розглядається тут.
Винахід відноситься до способу одержання протеїногенних або непротеїногенних І-амінокислот з їх о рацемічних М-ацетил-О,| -похідних, який відрізняється тим, що а) за допомогою ферментативного розщеплення рацемата за допомогою виділених рекомбінантних бо ферментів селективно деацетилюють М-ацетил-!Ї -похідні відповідних і-амінокислот, в той час як
М-ацетил-ЮО-похідні відповідних О-амінокислот не деацетилюються, і
Б) отримані деацетильовані і-амінокислоти препаративно відділяють від не деацетильованих
М-ацетил-О-похідних і/або не повністю деацетильованих М-ацетил-їі -похідних.
Винахід відноситься, особливо, до способу одержання І-фосфінотрицину (І-РРТ) з бо М-ацетил-О,ІЇ -фосфінотрицину за допомогою ферментативного розщеплення рацемата за допомогою виділених рекомбінантних ферментів.
Далі, винахід стосується способу одержання І-глутамінової кислоти, І -гістидину, І -лейцину, І-глутаміну іабо І-фенілаланіну з їх відповідних М-ацетил-О,|-похідних за допомогою ферментативного розщеплення рацемата.
Далі, винахід стосується способу, який відрізняється тим, що здійснюють енантіоселективне одержання однієї або декількох І -амінокислот з їх відповідних рацемічних М-ацетил-О,І - похідних з однією або декількома деацетилазами з групи гіпурат-гідролаз, причому особливо здійснюють енантіоселективне одержання
ІЇ-фосфінотрицину, І-глутамінової кислоти, І-гістидину, І-лейцину, І-глутаміну і/або І-фенілаланіну з їх 7/о Відповідних рацемічних М-ацетил-О,І -похідних з однією або декількома деацетилазами з групи гіпурат-гідролаз.
Особливо винахід стосується способу, який відрізняється тим, що здійснюють енантіоселективне одержання однієї або декількох І-амінокислот з їх відповідних рацемічних М-ацетил-О,| - похідних з ферментами деас 1 з
Зіепоїгорпотопаз зр. і/або деас 2 з Сотатопаз асідомогапзе (обидві деацетилази описані в заявці
ОЕ-А-19652284), і при цьому особливо стосується способів, які відрізняються тим, що здійснюють /5 енантіоселективне одержання І-фосфінотрицину, І-глутамінової кислоти, І-гістидину, Ї-лейцину, І-глутаміну мМабо І-фенілаланіну з їх відповідних рацемічних М-ацетил-О, І-похідних з ферментами деас 1 з
Зіепоїгорпотопаз зр. і/або деас 2 з Сотатопаз асідомогапзе (обидві деацетилази описані в заявці
ОЕ-А-19652284). Обидва ферменти характеризуються значною гомологією послідовності, яка забезпечує ідентичну або, принаймні, схожу функцію при розщепленні М-ацетил-О, І -похідних.
Далі, винахід стосується застосування одержаних рекомбінантних деацетилаз як біокаталізаторів, які дозволяють проводити відповідні реакції з високими концентраціями субстрату і/або забезпечують високі виходи об'єм/час, особливо при застосуванні рекомбінантних деацетилаз в імобілізованій формі.
Далі, винахід стосується проведення вище описаних способів при температурі реакції від близько 2590 до 65С, переважно при температурі від близько 302С до 4590 і особливо переважно при температурі від близько с 359 до 4096.
Далі, винахід стосується проведення вище описаних способів при концентраціях субстрату від близько 10ММ о до 1500мММ, переважно при концентраціях субстрату більше ніж 5ОММ, особливо переважно при концентраціях більше ніж 250мМ і вкрай переважно при концентраціях більше ніж 500ММ.
Далі, винахід стосується відділення І-амінокислот або Ї-РТС, отриманих за допомогою вище описаних со прийомів, від відповідних М-ацетил-О,І -похідних, які або, як у випадку М-ацетил-О-похідного, не зазнавали перетворення, або, як у випадку М-ацетил-і! -похідних, не повністю зазнавали перетворення. З
Придатними способами при цьому є використання іонообмінної хроматографії на кислому іонообміннику або /- Їч« екстракція М-ацетил-О,Ї - похідних за допомогою органічних розчинників, як, наприклад, метилізобутилкетон, причому вище згадані отримані І -амінокислоти або І -РТС переходять у водну фазу, з якої потім концентруються о висушуванням. у
Приклади: 1. Одержання деас-ферменту як рекомбінантного протеїну в ЕзспПегіспіа соїї:
Ген структури деас 1 з 5іепоїорпотопаз зр., що кодує М-Ас-РРТ-специфічну деацетилазу, клонували у « вигляді фрагмента 1,4-КО Ват Ні/ЗаїІ (описані в ОЕ-А-19652284) в сайт Ват Ні/За! 1 Нівз-міченого вектора експресії рОЕЗО фірми Омчіадеп (Оціаєхргезз Кі Туре ІМ, Каїваюд Мг. 32149, ЗіШрег і співр. (1990), -й с Іттипоіодіса! Мейпосдв, І еїкоміїв5, І. апа Регпів, В., т М, Асадетіс Ргезв, Мем/ ХогК, стор.121-1521). а Всі молекулярно-біологічні роботи проводили по стандартних методиках, як, наприклад, описано: А!йзирвеї і "» співр. (1995), Сипепі ргоїосоЇїв іп тоіесціаг Бріоіїоду, дойп УМпеу апа Зоп5з, Мем/ Могк. Утворений фрагмент трансформували в штам бактерії Е.Соїїї М15, рекомендованому виробником (Оіадеп), і рекомбінантні клони відбирали в 1ООмкг/мл ампіциліну і 25мкг/мл канаміцину. Експресія рекомбінантного злитого протеїну -і індукувалася за допомогою додання 1мМ інозинфосфотригліцериду (ІРТО). Клітини відбирали через 4-5 годин о після індукції і зберігали для розділення протеїну при -2026.
Завдяки додецилсульфат натрію (505)/поліакриламідному електрофорезу аліквоти клітин індукованих клонів - і змогли виявити Ніз-мічений -- деаз1-злитий протеїн у вигляді додаткової смуги 49-кДа. їх 50 Доказ ферментативної активності злитого протеїна-деацетилази здійснювали радіоактивним аналізом з
ГИСІ1-М-ацетил-І-РРТ як субстрату. Для цього здійснювали проникнення 200мкл індукованих культур 0,595 с» толуолом, 0,596 етанолом протягом ЗОхв. при 372. Потім грануляти клітин ресуспендували в 25мкл 0,1мММ
Г"С1І-М-ацетил-І-РРТ, 10мМ Масі, 10ММ фосфату натрію, рН-7,5 і інкубували 1 годину при 372С. Для якісного 5 визначення утвореного | "С1-І-РРТ аналізували по Бмкл аліквоти суміші, що тестується за допомогою тонкошарової хроматографії на целюлозних пластинах ВЕТРХ (МегсК) з розчинником: н-пропанол: 2590 (Ф) аміак-3:2. Радіоактивні зв'язки виявляли на рентгенівській плівці за допомогою радіографії.
Ге Для кількісного визначення перетворення ферментів суміші, що тестується вимірювали радіо-»ВЕРХ з зЗрпегізогяю ЗАХ як розділовою колонкою (розчинник: 5ММ КНОРО,, 1095 метанол, рН-1,92, витрата О,5мл/хв.). во У цих умовах Г"СІІ-РРТ елюювався через 4, 5хв. і | 7С|-М-ацетил-І -РРТ через 6,5хв.
Клон експресії продукував протеїн-деацетилазу з дуже високої М-ацетил-Ї-РРТ специфічною активністю деацетилази, згідно з кількісним визначенням із вмістом близько 1095 на загальний протеїн і використовувався для очищення ферменту і подальших описаних біотрансформацій. 2. Очищення деацетилази за допомогою афінної хроматографії. 65 Виділення протеїну-деацетилази з наново названого РОЕОЕАС штаму експресії після клонування, описаного в прикладі 1, відбувалося по методиці Оціадеп (Оіаехргез8-КІ) за допомогою афінної хроматографії на нікель-нітрилтриацетатній матриці (Мі- МТА) в нативних умовах. Для цього 800мл культури штаму експресії
РОЕОЕАС ферментувати, як описано в прикладі 1 і індукували. Зібраний гранулят клітин (4г) ре-суспендували в 20мл лізинового буферу і обробляли ультразвуком. Після центрифугування змішували прозорий протеїнолізат (120мг загального протеїну) з 4мл 5095-ної суспензії Мі-МТА для скріплення Ніз-міченого злитого протешу і потім матеріал завантажували в ферментативну колонку. Розділову матрицю промивали 10 об'ємами водного буфера і потім елюювали за допомогою 4мл елюатного буфера. Для перевірки чистоти розділення аналізували аліквоту оброблених ультразвуком клітин, промивного розчину і елюату за допомогою додецилсульфат натрію /поліакриламідного гель-електрофорезу. Активність деацетилази різних протеїнвмісних фракцій визначали 70 радіоактивним аналізом, описаним в прикладі 1 (реакційні суміші: Омкл розчину протеїну - Тімкл їмМ
Г"СІ-М-ацетил-І-РРТ, умови реакції описані вище). Для кількісного визначення ферменту інкубували протеїнові фракції з 5ХОММ М-ацетил-О,| -РРТ (Умкл розчину протеїну ї- їмкл 500мММ М-ацетил-О,| -РРТ) протягом ЗОхв. при 3726. РРТ, що утворився потім вимірювали в амінокислотному аналізаторі (Віоїгопіс І С 5001).
Протеїн в сирому екстракті після обробки клітин мав специфічну активність відносно деацетилази Знмоль 75 субстрат/сек/мг протешу. З 8О0Омл культури штаму експресії змогли виділити за допомогою афінної хроматографії 1Омг Ніз-міченого -деаз-злитого протеїну зі специфічною активністю 2Онмоль субстрат/сек./мг протеїну і чистотою близько 80965. 3. Специфічність субстрату і стереоселективність деацетилази.
Для дослідження специфічності субстрату і стереоспецифічності деасі-протеїну інкубували по 5мкг очищеного ферменту в 20Омкл сумішей 10мММ МасСі, л1ОмМмМ фосфату натрію, рН-7,;5 і 25мММ
М-ацетил-і -амінокислот або відповідних Ю-енантіомерів, вказаних в таблиці 1. Для порівняння використали гіпурову кислоту (М-бензоїлгліцин), природний субстрат деацетилази. Реакційні суміші інкубували 1 годину при 372С, і потім визначали на утворення вільних амінокислот в амінокислотному аналізаторі (Віоїгопіс С 5001).
У таблиці 1 вказана відносна активність у відношенні деацетилази для І! -енантіомерів різних субстратів. Крім Ге гіпурової кислоти і М-Ас-Ї-РРТ також деасі-фермент розщеплює ще М-ацетил-похідні ряду природних (5) амінокислот, особливо М-Ас-І-глутамінову кислоту, М-Ас-гліцин, М-Ас-Ї -гістидин, М-Ас-ІЇ -орнітин,
М-Ас-І-лейцин, М-Ас-І-глутамін і М-Ас-І -фенілаланін. У всіх випадках фермент був виключно активний з
І -енантіомерами, в той час як відповідні О-сполуки ні в одному випадку не могли зазнавати перетворення. У всіх інших випадках, що тестуються (дивись таблицю 1) перетворення М-ацетил-їі -похідних мало місце тільки в Ге) дуже незначній мірі або взагалі було відсутнім. « м о з5 м млеіметенно 5 « 2 не; с су ' 2 в. с і. млестояно 000016 2. специфічну активність, виміряну з гіпуровою кислотою |нмоль гліцину/хв./мг протеїну) приймали за 10095, і інші значення с» співвідносилися до цієї величини. 4. Розщеплення рацемата М-ацетил-О,Ї-фосфінотрицину за допомогою біотрансформації клітинами штаму-виробника - деас: 40Омл культури штаму експресії РОЕЮОЕАС ферментувати як описано в прикладі 1 і індукували. Вирощені о клітини потім промивали в т0мМ Масі, ї0ММ фосфату натрію, рН-7,5 і після витримування протягом ночі іме) ліофілізували. Оброблені таким чином клітини могли зберігатися понад декількох тижнів при 42С, зберігаючи високу специфічну активність у відношенні деацетилази, і служили в подальших дослідах як біокаталізатор; бо 2мг ліофілізованих клітин ресуспендували в мл наступних розчинів субстрату різної концентрації: (1) 7ОмММ динатрієвої солі М-апегага-ЮІ-РРТ (0,395) (дубом тт» (1,396) (уломм тн» (2,695) 65 (добБОоММ тт» (6,795) (ББООмМ тет» (13396)
Суміші містили як реакційний буфер 10мМ Масі, 10мММ фосфату натрію, рН-8,0 і були інкубовані 48 годин на качалці 1О0об./хв. і 372С. Вільний РРТ, утворений при реакції гідролізу, визначали в амінокислотному аналізаторі (Віоїгопіс С 5001). Результати приведені в таблиці 2. Чистоту енантіомерів продукту реакції аналізували за допомогою хиральної ВЕРХ з розділовою колонкою СпПігех? (0) РепісПатіп (Рпепотепех). Як розчинник використали 2мММ Сизо,, 10905 метанол з витратою 0,5мл/хв. Визначення відбувалося фотометрично при 254нм. У цих умовах елююються еталонні розчини І-РРТ через 17хв. і 0-РРТ через 21хв. У всіх пробах, що тестуються змогли довести виключно наявність І-РРТ як продукту реакції. Досягнуті міри конверсії 70 (Іпродукований І-РРТ/М-ацетил-І-РРТ в субстраті х 100) знаходилися між 10095 при низьких концентраціях субстрату (10ММ, 5ОММ) і 6695 при самій високій концентрації субстрату (500ММ). й ян нн нн НИ пи ши нини нини ши юю
У наступному експерименті підвищували концентрацію на біокаталізатор і знімали кінетику реакції ря розщеплення субстрату. 1Змг ліофілізованих клітин ресуспендували в їмл розчину субстрату, що складається з см 500ММ динатрієвої солі М-ацетил-О1-РРТ (13,395 вага./об.), 10мМ Масі, 10МмМ фосфату натрію, рН-8,0 і о інкубували на качалці при 100об./хв. і 372С. Для визначення утвореного І-РРТ через 55 годин відбирали по
БОмкл аліквоти з реакційної суміші, центрифугували і супернатант заморожували аж до аналізу при -2096.
Кількісний аналіз продукту реакції І-РРТ, а також визначення чистоти енантіомерів проводили, як було описано со зо вище. Результати приведені в таблиці 3. При вибраних умовах І-специфічне розщеплення субстрату через приблизно 55 годин було завершено. При цьому досягнуті міра конверсії близько 9095 і вихід об'єм/час 483 |мг «
ІГ-РРТ/г біокаталізатору/годину). їм-
Фо з щ нини ши ч 4 нн ни НЕ ТИ З с . » й о юнетеиювютнютю тт -І 1; концентрація на біокаталізатор: 13 мг/мл. і Концентрація субстрату 5Х00ММ М-ацетил-О,І -РРТ. 5. Імобілізація очищеного деас-протеїну. -І Щоб можна було провести ферментативну реакцію з виділеним деас-протеїном, імобілізували фермент, очищений як Ніз-мічений-злитий протеїн в прикладі 2, на полімерний носій МІМА-Ероху Віозупіпе (Ківде! де ве Наеп). Для цього концентрували деас-протеїн за допомогою осадження сульфатом амонію до 15мг/мл і після сю витримування протягом ночі проводили діаліз проти 1М фосфату Ма, рН-8,0. Для стандартної реакції скріплення повільно струшували 1Омг протеїну з 100мг носія-МІМА протягом 2 днів при кімнатній температурі. Потім імобілізат центрифугували і по 1 промивали в імобілізованому буфері, а також в 5ХОММ фосфату Ма, рн-7,0. 5Б Потім для блокування вільних епоксигруп носій інкубували 1 годину при кімнатній температурі з 50 мМ фосфату
Ма, рН - 7,0, 50мММ 2-меркаптоетанолу. Після цього біокаталізатор знаходився в їмл 5ММ фосфату Ма, рн-7,0, (Ф. 0,029 азиду натрію при 42С. Для визначення скріплення протеїну визначали вміст протеїну в розчині до і після ко імобілізації, а також в промивних розчинах за допомогою способу Бредфорда |(|Вгадіога (1976), Апа!. Віо-спет. 72: 248-254). Специфічна активність деацетилази вимірювалася до і після імобілізації радіоактивним аналізом, бо описаним в прикладі 1. Відносна активність ферменту після скріплення становила 29095 величини, визначеної для розчиненого протеїну. 6. Розщеплення рацемата Н-ацетил-О,Б-фосфінотрицину з імобілізованим деас-протеїном в колонковому реакторі. 1г імобілізату ферменту (волога вага) завантажували в колонку і використовували як біокаталізатор для 65 розщеплення рацемата різних концентрованих розчинів субстрату з різними витратами. Розчини субстрату містили концентрацію діаммонієвої солі М-ацегап-О, І-РРТ, приведену в таблиці 4 в 10мМ Масі, 10МмМ фосфату
Ма, рН-8,0. Реакції проводили при 372 протягом понад 10 днів. Перетворення кількісно оцінювали за допомогою визначення Г-РРТ, що є в проточному засобі колонки за допомогою амінокислотного аналізу і хиральної ВЕРХ (дивись приклад 4). Результати представлені в таблиці 4. Найвища міра конверсії 8390 досягалася з найвищою концентрацією субстрату (500ММ) і самим низьким потоком субстрату (0,ОЗмл/хв.).
Виходи об'єм/час збільшувалися з витратою і концентрацією субстрату і досягали найвищого значення 181 |мг
І-РРТ/г біокаталізатору/годину)| при концентрації субстрат 500мММ і потоку 0,Змл/хв. Імобілізована деацетилаза демонструвала протягом тривалого часу експерименту хорошу стабільність і володіла через 10 днів при 372 ще приблизно 80905 початкової активності. з імобілізованим деас-протеїном в колонковому реакторі
ІмМ) Імл/хв.) (мМ) Го біокаталізатору/годину) 5 нн хни ни ни п сл вв нн нн нн У и о НН ю вою ввів 11в
ППО ПИСЕ ЗННЯ ПОО Я ПО ТНЯ вв сч о
Claims (11)
1. Спосіб одержання протеїногенних або непротеїногенних І-амінокислот з їх рацемічних М-ацетил-О, чн ІЇ-похідних, який відрізняється тим, що (а) шляхом ферментативного розщеплення рацемата за допомогою виділених рекомбінантних о 35 гіпурат-гідролаз селективно деацетилюються М-ацетил-! -похідні відповідних І-амінокислот, в той час як чн М-ацетил-ЮО-похідні відповідних О-амінокислот не деацетилюються, (5) рацемічні М-ацетил- О,| -похідні знаходяться у концентрації від більше 50 мМ до 1500 мМ, (с) одержані деацетильовані І-амінокислоти препаративно відділлють від недеацетильованих М-ацетил-О-похідних і/або не повністю деацетильованих М-ацетил-їі -похідних. «
2. Спосіб за пунктом 1, який відрізняється тим, що призначений для одержання І -фосфінотрицину (І-РРТ) з з с М-ацетил-О, І -фосфінотрицину.
З. Спосіб за пунктом 1, який відрізняється тим, що призначений для одержання І -глутамінової кислоти, :з» І-гістидину, І -лейцину, І -глутаміну і/або І -фенілаланіну з їх відповідних М-ацетил-О, І -похідних.
4. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-3, який відрізняється тим, що здійснюють енантіоселективне одержання однієї або декількох І-амінокислот з їх відповідних рацемічних М-ацетил-О, І-похідних з ферментами деас -І 1 з єїТепоорпотопаз зр. і/або деас 2 з Сотатопаз» асійсуогапв.
5. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-3, який відрізняється тим, що здійснюють енантіоселективне одержання о ІЇ-фосфінотрицину, І-глутамінової кислоти, І-гістидину, І-лейцину, І-глутаміну і/або І-фенілаланіну з їх -І відповідних рацемічних М-ацетил-О, І-похідних з ферментами деас 1 з Є/елойорпотопавз зр. іМабо деас 1 з Сотатопав асійсуогапв.
- 6. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-5, який відрізняється тим, що одержані рекомбінантні гіпурат-гідролази с» використовують в іммобілізованій формі.
7. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-6, який відрізняється тим, що температура реакції складає приблизно від 2590; до 6590. 5Б
8. Застосування однієї або декількох гіпурат-гідролаз в способі за будь-яким з пунктів 1-7 для енантіоселективного одержання однієї або декількох І-амінокислот з їх відповідних рацемічних М-ацетил-О, (Ф; Ї-похідних. ка
9. Застосування за п. 8, яке відрізняється тим, що як І-амінокислоти енантіоселективно одержують ІЇ-фосфінотрицину, І-глутамінової кислоти, І-гістидину, І-лейцину, І-глутаміну і/або І-фенілаланіну з їх 60 відповідних рацемічних М-ацетил-бр, І -похідних.
10. Застосування деас 1 з б/елоорротопав зр. і/або деас 2 з Сотатопавз ас/йоуогап5 в способі за будь-яким з пунктів 1-7 для енантіоселективного одержання однієї або декількох І -амінокислот з їх відповідних рацемічних М-ацетил-б, І -похідних.
11. Застосування за п. 10, яке відрізняється тим, що як І -амінокислоти енантіоселективно одержують 65 ІЇ-фосфінотрицину, І-глутамінової кислоти, І-гістидину, Іі-лейцину, Іі-глутаміну, І-фенілаланіну з їх відповідних рацемічних М-ацетил-бр, І -похідних.
Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2005, М 9, 15.09.2005. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. с (8) со « ча со м. ші с з -І (95) -І їз 50 сю» Ф) іме) 60 б5
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19933362A DE19933362A1 (de) | 1999-07-20 | 1999-07-20 | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren aus ihren racemischen N-Acetyl-D,L-Derivaten durch enzymatische Racemat-Spaltung mittels isolierter, rekombinanter Enzyme |
| PCT/EP2000/005586 WO2001005982A1 (de) | 1999-07-20 | 2000-06-17 | Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren aus ihren racemischen n-acetyl-d,l-derivaten durch enzymatische racemat-spaltung mittels isolierter, rekombinanter enzyme |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA73743C2 true UA73743C2 (en) | 2005-09-15 |
Family
ID=7915003
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA2002021417A UA73743C2 (en) | 1999-07-20 | 2000-06-17 | A method for the production of l-amino acids from their racemic n-acetyl-d,l-derivatives using enzymatic racemate cleavage by means of isolated recombinant enzymes |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6686181B1 (uk) |
| EP (1) | EP1200601B1 (uk) |
| JP (1) | JP4723778B2 (uk) |
| KR (1) | KR100672146B1 (uk) |
| CN (1) | CN1175108C (uk) |
| AT (1) | ATE319836T1 (uk) |
| AU (1) | AU778206B2 (uk) |
| BR (1) | BR0012572A (uk) |
| CA (1) | CA2379849A1 (uk) |
| CO (1) | CO5310578A1 (uk) |
| CZ (1) | CZ2002224A3 (uk) |
| DE (2) | DE19933362A1 (uk) |
| DK (1) | DK1200601T3 (uk) |
| ES (1) | ES2258011T3 (uk) |
| HU (1) | HU229651B1 (uk) |
| IL (1) | IL147398A (uk) |
| MX (1) | MXPA02000623A (uk) |
| NZ (1) | NZ516710A (uk) |
| PL (1) | PL203870B1 (uk) |
| RU (1) | RU2270869C2 (uk) |
| SK (1) | SK402002A3 (uk) |
| TW (1) | TWI238193B (uk) |
| UA (1) | UA73743C2 (uk) |
| WO (1) | WO2001005982A1 (uk) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2537649T3 (es) * | 2002-02-26 | 2015-06-10 | Syngenta Limited | Método para producir selectivamente plantas estériles masculinas o femeninas |
| JP4970249B2 (ja) | 2005-03-29 | 2012-07-04 | Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａファルマ株式会社 | Ｌ−２−アミノ−４−（ヒドロキシメチルホスフィニル）−ブタン酸の製造法 |
| CA2662391C (en) | 2006-09-04 | 2015-10-06 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Process for production of optically active aminophosphinylbutanoic acids |
| EP2065391B1 (en) * | 2006-09-20 | 2014-06-18 | Meiji Seika Pharma Co., Ltd. | Method for producing phosphorus-containing a-amino acid and production intermediate thereof |
| WO2012154483A1 (en) * | 2011-05-06 | 2012-11-15 | Gilead Sciences, Inc. | Dry powder fosfomycin/tobramycin formulation for inhalation |
| CN109988806B (zh) * | 2017-12-29 | 2023-02-28 | 弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司 | 一种n-乙酰-草铵膦盐的消旋方法 |
| CN108690854B (zh) * | 2018-04-16 | 2022-03-18 | 浙江工业大学 | 一种利用化学-酶法生产l-草铵膦的方法 |
| US20240270768A1 (en) * | 2021-06-11 | 2024-08-15 | Upl Limited | A method for obtaining l-glufosinate |
| US20250257383A1 (en) * | 2021-07-19 | 2025-08-14 | Josho Gakuen Educational Foundation | Material detection method using aminoacylase |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5547630A (en) * | 1978-10-02 | 1980-04-04 | Meiji Seika Kaisha Ltd | Optical resolution of phosphorus-containing amino acid |
| DE3048612C2 (de) * | 1980-12-23 | 1982-12-02 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "Verfahren zur enzymatischen Trennung von L-2-Ami no-4-methylphosphinobuttersäure" |
| US5081024A (en) | 1988-09-05 | 1992-01-14 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Process for producing optically active amino acids |
| DE4308061A1 (de) * | 1993-03-13 | 1994-09-15 | Hoechst Ag | Neue Aminosäure-Deacetylase mit Spezifität für L-N-Acetyl-Phosphinothricin, ihre Herstellung und Verwendung |
| DE4422045A1 (de) * | 1994-06-26 | 1996-01-04 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Verfahren zur enzymatischen Spaltung von 2-Amino-4-methylphosphinobutansäureamid-Derivaten |
| DE69738080T2 (de) | 1996-04-25 | 2008-06-05 | Novartis Ag | Biokatalysatoren mit amin-acylase aktivität |
| DE19652284A1 (de) * | 1996-12-16 | 1998-06-18 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Neue Gene codierend für Aminosäure-Deacetylasen mit Spezifität für N-Acetyl-L-Phosphinothricin, ihre Isolierung und Verwendung |
-
1999
- 1999-07-20 DE DE19933362A patent/DE19933362A1/de not_active Ceased
-
2000
- 2000-06-17 PL PL357347A patent/PL203870B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-06-17 EP EP00943826A patent/EP1200601B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-17 CN CNB008105103A patent/CN1175108C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-17 WO PCT/EP2000/005586 patent/WO2001005982A1/de not_active Ceased
- 2000-06-17 DE DE50012368T patent/DE50012368D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-17 AT AT00943826T patent/ATE319836T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-06-17 MX MXPA02000623A patent/MXPA02000623A/es active IP Right Grant
- 2000-06-17 CA CA002379849A patent/CA2379849A1/en not_active Abandoned
- 2000-06-17 RU RU2002104355/13A patent/RU2270869C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-06-17 AU AU58156/00A patent/AU778206B2/en not_active Ceased
- 2000-06-17 ES ES00943826T patent/ES2258011T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-17 NZ NZ516710A patent/NZ516710A/xx unknown
- 2000-06-17 KR KR1020027000746A patent/KR100672146B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-17 HU HU0201850A patent/HU229651B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-06-17 BR BR0012572-5A patent/BR0012572A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-06-17 UA UA2002021417A patent/UA73743C2/uk unknown
- 2000-06-17 CZ CZ2002224A patent/CZ2002224A3/cs unknown
- 2000-06-17 SK SK40-2002A patent/SK402002A3/sk not_active Application Discontinuation
- 2000-06-17 IL IL14739800A patent/IL147398A/xx active IP Right Grant
- 2000-06-17 DK DK00943826T patent/DK1200601T3/da active
- 2000-06-17 US US10/031,356 patent/US6686181B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-17 JP JP2001511194A patent/JP4723778B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-12 CO CO00052026A patent/CO5310578A1/es not_active Application Discontinuation
- 2000-07-18 TW TW089114376A patent/TWI238193B/zh not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CO5310578A1 (es) | 2003-08-29 |
| PL203870B1 (pl) | 2009-11-30 |
| ES2258011T3 (es) | 2006-08-16 |
| JP4723778B2 (ja) | 2011-07-13 |
| AU778206B2 (en) | 2004-11-25 |
| TWI238193B (en) | 2005-08-21 |
| IL147398A (en) | 2005-12-18 |
| RU2270869C2 (ru) | 2006-02-27 |
| EP1200601B1 (de) | 2006-03-08 |
| SK402002A3 (en) | 2002-04-04 |
| EP1200601A1 (de) | 2002-05-02 |
| HU229651B1 (hu) | 2014-03-28 |
| US6686181B1 (en) | 2004-02-03 |
| ATE319836T1 (de) | 2006-03-15 |
| WO2001005982A1 (de) | 2001-01-25 |
| CN1371422A (zh) | 2002-09-25 |
| MXPA02000623A (es) | 2002-07-02 |
| CZ2002224A3 (cs) | 2002-06-12 |
| HUP0201850A2 (en) | 2002-09-28 |
| NZ516710A (en) | 2002-11-26 |
| CA2379849A1 (en) | 2001-01-25 |
| BR0012572A (pt) | 2002-04-16 |
| DK1200601T3 (da) | 2006-07-17 |
| CN1175108C (zh) | 2004-11-10 |
| IL147398A0 (en) | 2002-08-14 |
| PL357347A1 (en) | 2004-07-26 |
| AU5815600A (en) | 2001-02-05 |
| JP2003505031A (ja) | 2003-02-12 |
| KR20020020943A (ko) | 2002-03-16 |
| DE19933362A1 (de) | 2001-02-08 |
| DE50012368D1 (de) | 2006-05-04 |
| KR100672146B1 (ko) | 2007-01-19 |
| HUP0201850A3 (en) | 2005-01-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR0170365B1 (ko) | 아미노기 전달 효소, 이의 제조방법 및 용도 | |
| CN105603015B (zh) | 一种l-草铵膦的生产方法 | |
| Hummel et al. | Isolation of L-phenylalanine dehydrogenase from Rhodococcus sp. M4 and its application for the production of L-phenylalanine | |
| CN106916857B (zh) | 一种生产l-草铵膦的方法 | |
| CN109750009A (zh) | 一种草铵膦脱氢酶突变体及其应用 | |
| US20250043323A1 (en) | Biocatalysts and methods for the synthesis of pregabalin intermediates | |
| RU2270869C2 (ru) | Способ получения l-аминокислот из их рацемических n-ацетил-d, l-производных посредством ферментативного расщепления | |
| WO1997015682A1 (en) | Process for producing optically active amino compounds | |
| EP0330695B1 (en) | Process for preparation of organic chemicals | |
| CN114606221B (zh) | 固定化酶、其制备方法及应用 | |
| US7629154B2 (en) | Deinococcus N-acylamino acid racemase and use of preparing L-amino acid | |
| US5916774A (en) | D-aminoacylase | |
| CN116042560A (zh) | 一种重组转氨酶的突变体及其应用 | |
| CA2252616C (en) | Biocatalysts with amine acylase activity | |
| KR987001034A (ko) | D-N-카르바모일-알파-아미노산의 제조법(Process for Producing D-N-Carbamoyl-Alpha-Amino Acid) | |
| Cassimjee et al. | Silica‐immobilized His6‐tagged enzyme: Alanine racemase in hydrophobic solvent | |
| Suzuki et al. | Purification and Properties of Thermostable Tryptophanase from an Obligately Symbiotic Thermophile, Symbiobactevium thermophilum | |
| JP4502295B2 (ja) | 耐熱性ｄ−アミノアシラーゼ | |
| CN118931985A (zh) | 一种化学-生物级联合成l-草铵膦的方法及突变体 | |
| CN106086107A (zh) | 海藻糖的生产方法 | |
| CN120485167A (zh) | 一种α-氨基酸酯酰基转移酶固定化酶的固定化方法及应用 | |
| CN116042599A (zh) | 一种用于生产5-羟基色氨酸的体外多酶体系 | |
| CS240818B1 (cs) | Způsob výroby opticky aktivních </ -aminokyselin z racemických směsi |