PL203870B1 - Sposób wytwarzania L-fosfinotrycyny i zastosowanie hydrolazy deac-1 - Google Patents
Sposób wytwarzania L-fosfinotrycyny i zastosowanie hydrolazy deac-1Info
- Publication number
- PL203870B1 PL203870B1 PL357347A PL35734700A PL203870B1 PL 203870 B1 PL203870 B1 PL 203870B1 PL 357347 A PL357347 A PL 357347A PL 35734700 A PL35734700 A PL 35734700A PL 203870 B1 PL203870 B1 PL 203870B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- ppt
- acetyl
- deacetylated
- derivatives
- racemic
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 37
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 title abstract description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 title abstract description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 title abstract description 6
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 19
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 claims description 10
- 241000983364 Stenotrophomonas sp. Species 0.000 claims description 8
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 3
- 230000006196 deacetylation Effects 0.000 claims 1
- 238000003381 deacetylation reaction Methods 0.000 claims 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 abstract 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N N-benzoylglycine Chemical compound OC(=O)CNC(=O)C1=CC=CC=C1 QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 10
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 10
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 10
- VZVQOWUYAAWBCP-LURJTMIESA-N N-acetyl-L-phosphinothricin Chemical compound CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCP(C)(O)=O VZVQOWUYAAWBCP-LURJTMIESA-N 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 4
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 4
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 4
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 4
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- ADHAUWMNDHMUMH-UHFFFAOYSA-L 2-[bis(carboxylatomethyl)amino]acetate;hydron;nickel(2+) Chemical compound [Ni+2].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CC([O-])=O ADHAUWMNDHMUMH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001600125 Delftia acidovorans Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 2
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 2
- -1 N-Ac-PPT carboxylic acid esters Chemical class 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004296 chiral HPLC Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 2
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IVWWFWFVSWOTLP-YVZVNANGSA-N (3'as,4r,7'as)-2,2,2',2'-tetramethylspiro[1,3-dioxolane-4,6'-4,7a-dihydro-3ah-[1,3]dioxolo[4,5-c]pyran]-7'-one Chemical compound C([C@@H]1OC(O[C@@H]1C1=O)(C)C)O[C@]21COC(C)(C)O2 IVWWFWFVSWOTLP-YVZVNANGSA-N 0.000 description 1
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 1
- VVNCNSJFMMFHPL-VKHMYHEASA-N D-penicillamine Chemical compound CC(C)(S)[C@@H](N)C(O)=O VVNCNSJFMMFHPL-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001596967 Escherichia coli M15 Species 0.000 description 1
- 101001133633 Escherichia coli Penicillin G acylase Proteins 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical compound CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 108010003977 aminoacylase I Proteins 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 230000000850 deacetylating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 108010093701 hippurate hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012206 semi-quantitative assay Methods 0.000 description 1
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 1
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
- C12P41/007—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving acyl derivatives of racemic amines
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania L-fosfonotrycyny (L-PPT) z racemicznej N-acetylo-D,L-PPT oraz zastosowanie zrekombinowanej hydrolazy hipuranowej deac1 ze Stenotrophomonas sp.
Wytwarzanie nieproteinogennego aminokwasu L-PPT (L-fosfinotrycyny) o wysokiej czystości i z dobrą wydajnoś cią przez rozdzielanie racematu opisano dotychczas tylko w przypadku rozszczepianie fenacetylofosfinotrycyny z użyciem acylazy penicylinowej G z Escherichia coli (DE-A-3048612). Synteza fenacetylo-PPT jest jednak droższa w porównaniu do syntezy N-Ac-PPT. Jednak acylaza penicylinowa G nie jest specyficzna względem alifatycznej grupy acylowej, a zatem nie jest specyficzna także względem N-Ac-PPT. Inne znane acylazy nie są specyficzne lub są tylko w niewielkim stopniu specyficzne względem N-Ac-PPT i dotychczas stosowano je tylko w biotransformacjach mikrobiologicznych, bez oczyszczania stosowanego enzymu (tak jak to opisano np. w DE-A-2939269). Tym sposobem można osiągnąć tylko niewielką wydajność przestrzenno-czasową. Ze zgłoszenia patentowego EP-A-0382113 znane jest L-specyficzne rozszczepianie estrów kwasu karboksylowego N-Ac-PPT z udziałem acylazy I. Również ten enzym nie jest jednak specyficzny względem wolnych kwasów karboksylowych, a więc konieczna jest estryfikacja jako dodatkowy etap syntezy przy przygotowywaniu substratu.
W zgłoszeniu patentowym DE-A-19652284 opisano celowe wyodrębnianie drobnoustrojowych deacetylaz z próbek gleby, o specyficzności względem N-acetyloaminokwasów, a zwłaszcza N-acetylofosfinotrycyny (N-Ac-PPT), jak również klonowanie odpowiednich genów ze Stenotrophomonas sp. i Comamonas acidovorans.
Na podstawie ustalonej homologii sekwencji i przeprowadzonych prób specyficzności względem substratów można było wykazać, że opisane deacetylazy należą do grupy hydrolaz hipuranowych (EC 3.5.1.32), których naturalnym substratem jest N-benzoiloglicyna, pochodna aminokwasu z aromatyczną N-acylową grupą funkcyjną. Interesujące jest, że enzym ten może akceptować jako substraty również N-acetylowane aminokwasy, a zwłaszcza N-acetylofosfinotrycynę, będące pochodnymi aminokwasów z alifatycznymi N-acylowymi grupami funkcyjne. Ze zgłoszeń patentowych DE-A 2939269 i DE-A-2717440 wiadomo, ż e chwastobójcze dział anie racematu fosfinotrycyny pochodzi wyłącznie od enancjomeru L (L-PPT).
W związku z tym interesują ce było, że te deacetylazy rozszczepiają z wysoką specyficznością wyłącznie enancjomery L N-acetylo-PPT, jak również pochodnych N-acetylowych pewnych proteinogennych aminokwasów. Enzymy te doskonale nadają się do wytwarzania aminokwasów L, a zwłaszcza L-fosfinotrycyny stanowiącej chwastobójczą substancję czynną, z racemicznych mieszanin jej pochodnych N-acetylowych, tak jak to opisano np. w zgłoszeniach patentowych EP-A-0304021, DE-A-2939269 i DE-A-3048612. Poważ ne wady sposobów opisanych w trzech wyż ej wymienionych zgł oszeniach patentowych polegają na tym, że (1) można stosować substraty tylko w niewielkim stężeniu (około 0,5% w przypadku zgłoszenia patentowego DE-A-2939269), co ogranicza przydatność techniczną, (2) stosuje się niewyodrębnione enzymy, przy czym nie można rozwiązać problemów związanych z reakcjami ubocznymi i końcowym etapem oczyszczania, względnie można je rozwiązać bardzo wysokim kosztem, oraz (3) konieczna jest kosztowna końcowa obróbka produktu (jak w przypadku zgłoszenia patentowego DE-A-3048612).
Pożądane było eksprymowanie jednej lub większej liczby nowych deacetylaz (scharakteryzowanych już w DE-A-19652284) w odpowiedniej postaci i ilości, oraz umożliwienie wytwarzania z użyciem tych enzymów L-PPT i pewnych proteinogennych L-aminokwasów z łatwo dostępnych drogą chemiczną racemicznych N-acetylo-D,L-pochodnych, przez rozdzielanie racematu, otrzymywanych z wysoką wydajnością i czystością enancjomeryczną.
W przypadku gdy aktywno ść enzymatyczna jest już w przybliż eniu znana i przeprowadzono już klonowanie sekwencji kwasów nukleinowych kodujących enzym, pierwsza czynność polega na tym, że odpowiedni fragment kwasu nukleinowego wprowadza się do odpowiedniego wektora, aby następnie doprowadzić do nadprodukcji w odpowiednim szczepie bakterii i/lub wyodrębnić białko po nadekspresji. Tak wyodrębniony enzym można albo bezpośrednio stosować w reakcji enzymatycznej, albo związać z matrycą przez odpowiednie grupy sprzęgające.
Zalecany jest pierwszy test enzymatyczny, umożliwiający uzyskanie ogólnego potwierdzenia, czy przebiegła pożądana reakcja. Wszystkie dalsze etapy służą do optymalizacji parametrów pod względem specyficzności reakcji (w odniesieniu do substratu i produktu), szybkości reakcji, wydajności
PL 203 870 B1 reakcji, okresu półtrwania stosowanego enzymu oraz możliwego stężenia substratu. W przypadku gdy poszczególne parametry niezbyt odpowiadają wymaganiom, można dokonać odpowiednich zmian w sekwencji kwasu nukleinowego kodują cego enzym, wskutek czego nastę puje dalsza optymalizacja istniejących enzymów naturalnych.
Klonowanie poszczególnych stosowanych deacetylaz opisano w zgłoszeniu patentowym DE-A-19652284. Jak to szerzej omówiono w przykładzie 1 podanym poniżej, fragmenty kwasu nukleinowego kodujące odpowiednie deacetylazy klonuje się w odpowiednich wektorach ekspresji, aby w ten sposób zapewnić potrzebny stopień jednoznacznej specyficzności substratu i braku reakcji ubocznych. W zgłoszeniu DE-A-19652284 można było wprawdzie wykazać, że N-acetylo-L-PPT ulega deacetylowaniu, jednak nie można było wykazać, że N-acetylo-D-PPT nie jest deacetylowana. Wyłączna przemiana N-acetylo-L-aminokwasów i N-acetylo-L-PPT jest jednak elementarnym warunkiem wstępnym dla zamierzonego zastosowania technicznego.
Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania L-fosfinotrycyny (L-PPT) z racemicznej N-acetylo-D,L-PPT, charakteryzującego się tym, że (a) N-acetylo-L-PPT deacetyluje się bez deacetylowania N-acetylo-D-PPT przez enzymatyczne rozdzielanie racematu za pomocą wydzielonej zrekombinowanej hydrolazy hipuranowej deac1 ze Stenotrophomonas sp.,
b) racemiczną N-acetylo-D,L-PPT stosuje się w stężeniu od powyżej 50 mM do 1500 mM,
c) otrzymaną deacetylowaną L-PPT oddziela się preparatywnie od niedeacetylowanej N-acetylo-D-PPT i/lub od niecałkowicie deacetylowanej N-acetylo-D-PPT,
d) przy czym wydajność przestrzenno-czasowa deacetylowanej L-PPT osiągnięta w czasie reakcji 55 godzin wynosi co najmniej 69 mg deacetylowanej L-PPT/g biokatalizatora/h.
Korzystnie zrekombinowaną deac1 stosuje się w postaci unieruchomionej.
Korzystnie reakcję prowadzi się w temperaturze od około 25°C do 65°C.
Wynalazek dotyczy również zastosowania deac1 ze Stenotrophomonas sp. w sposobie enancjoselektywnego wytwarzania L-PPT z racemicznej N-acetylo-D,L-PPT, zdefiniowanym powyżej.
Przez enzymatyczne rozdzielanie racematu można wytwarzać również kwas L-glutaminowy, L-histydynę, L-leucynę, L-glutaminę i/lub L-fenyloalaninę z ich odpowiednich N-acetylo-D,L-pochodnych.
Enancjoselektywne wytwarzanie jednego lub większej liczby L-aminokwasów z ich odpowiednich racemicznych N-acetylo-D,L-pochodnych polega na zastosowaniu jednej lub większej liczby deacetylaz z grupy hydrolaz hipuranowych, przy czym w szczególności wytwarza się L-fosfinotrycynę, kwas L-glutaminowy, L-histydynę, L-leucynę, L-glutaminę i/lub L-fenyloalaninę z ich odpowiednich racemicznych N-acetylo-D,L-pochodnych.
W szczególnoś ci stosuje się enzymy deac1 ze Stenotrophomonas sp. i/lub deac2 z Comamonas acidovorans (obie deacetylazy opisano w DE-A-19652284). Oba enzymy wykazują znaczną homologię sekwencji, co warunkuje identyczną lub co najmniej podobną funkcję przy rozszczepianiu N-acetylo-D,L-pochodnych.
Zrekombinowane deacetylazy stosuje się jako biokatalizatory umożliwiające prowadzenie odpowiednich reakcji przy wysokim stężeniu substratu i/lub osiąganie wysokiej wydajności przestrzenno-czasowej, zwłaszcza w przypadku stosowania zrekombinowanej deacetylazy w postaci unieruchomionej.
W sposobach opisanych powyżej reakcję korzystnie prowadzi się w temperaturze od około 25°C do 65°C, szczególnie korzystnie od około 30°C do 45°C, a zwłaszcza od około 35°C do 40°C.
Reakcję prowadzi się przy stężeniu substratu od około 10 mM do 1500 mM, korzystnie przy stężeniu substratu powyżej 50 mM, szczególnie korzystnie przy stężeniu substratu powyżej 250 mM, a najkorzystniej przy stężeniu substratu powyżej 500 mM.
L-Aminokwasy lub L-PTC wytworzone tymi sposobami oddziela się od odpowiednich N-acetylo-D,L-pochodnych, które albo nie przereagowały - jak w przypadku N-acetylo-D-pochodnej, albo nie w pełni przereagowały - jak w przypadku N-acetylo-L-pochodnej.
Użytecznymi sposobami wytwarzania są przy tym sposoby, w których stosuje chromatografię jonowymienną na kwaśnym wymieniaczu jonowym, albo ekstrakcję N-acetylo-D,L-pochodnych z użyciem rozpuszczalnika organicznego, takiego jak np. keton metylowo-izobutylowy, przy czym uprzednio wytworzony L-aminokwas lub L-PTC przechodzi do fazy wodnej, z której otrzymuje się go w wyniku zatężenia przez suszenie.
PL 203 870 B1
P r z y k ł a d y
1. Wytwarzanie enzymu deac jako zrekombinowanego białka w Escherichia coli
Gen strukturaly deac-1 ze Stenotrophomonas sp., kodujący deacetylazę specyficzną względem N-Ac-PPT, wklonowano jako fragment 1,4-kb BamHI/SalI (opisany w DE-A-19652284) w miejscu cięcia Bam HI/Sal I wektora ekspresji HisTag pQE30 firmy Quiagen [Quiaexpress Kit, typ IV, Katalog nr 32149, Stiiber i in., (1990), w: Immunological Methods, pod redakcją Lefkovits I. i Pernis B., tom IV, Academic Press, New York, str. 121-152].
Wszystkie prace związane z metodami biologii molekularnej prowadzono zgodnie ze standardowymi protokołami, jakie opisali np. Ausubel i in., (1995), Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, New York. Religowany konstrukt transformowano do szczepu bakterii E. coli M15 zalecanego przez producenta (Qiagen) i zrekombinowane klony poddawano selekcji z użyciem 100 μg/ml ampicyliny i 25 μg/ml kanamycyny. Ekspresję zrekombinowanego białka fuzyjnego wywoływano dodatkiem 1 mM IPTG. Komórki zbierano w 4 - 5 godzin po wywołaniu ekspresji i do czasu obróbki przechowywano w -20°C.
Na podstawie analizy próbki komórek indukowanego klonu metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z SDS można było wykazać obecność białka fuzyjnego HisTag-deac1, w postaci dodatkowego pasma 49 kDa.
Aktywność enzymatyczną białka fuzyjnego deacetylazy wykazano w teście radioaktywności z użyciem [14c] -N-acetylo-L-PPT jako substratu. Indukowane hodowle (po 200 μθ poddawano permeabilizacji z użyciem 0,5% toluenu i 0,5% etanolu przez 30 minut w temperaturze 37°C. Osad komórek ponownie przeprowadzano w zawiesinę w roztworze zawierającym 25 μl 0,1 mM [14C]-N-acetylo-L-PPT, 10 mM NaCl, 10 mM fosforan sodu, pH = 7,5, i inkubowano ją przez 1 godzinę w 37°C. W celu jakościowego oznaczenia powstałej [14C]-L-PPT, 5 μl próbki badanej mieszaniny analizowano metodą chromatografii cienkowarstwowej na celulozowych płytkach HPTLC (Merck), z użyciem jako fazy ruchomej roztworu n-propanolu i 25% amoniaku w stosunku 3:2. Pasma radioaktywne uwidoczniano na kliszy rentgenowskiej metodą autoradiografii.
W celu ilościowej oceny przemiany enzymatycznej dokonywano pomiarów badanej mieszaniny metodą radiacyjnej HPLC, z użyciem kolumny rozdzielczej Spherisorb® SAX (faza ruchoma: 5 mM KH2PO4, 10% metanol, pH = 1,92, szybkość przepływu: 0,5 5 ml/min). W tych warunkach [14C]-L-PPT eluuje po 4,5 minuty, a [14C]-N-acetylo-L-PPT po 6,5 minuty.
Eksprymowany klon o największej specyficznej aktywności deacetylazy względem N-acetylo-L-PPT, zgodnie z półilościowym oznaczeniem wytwarza białko deacetylazę w ilości około 10% całkowitej ilości białek i stosuje się go w procesie oczyszczania enzymów i w poniżej opisanych biotransformacjach.
2. Oczyszczanie deacetylazy metodą chromatografii powinowactwa
Wyodrębnianie białka deacetylazy z opisanego w przykładzie 1 klonowania szczepu ekspresyjnego o nowej nazwie pQEDEAC przeprowadzano według protokołu Quiagen (Qiaexpress-Kit) metodą chromatografii powinowactwa na matrycy z nitrylotrioctanem niklu (Ni-NTA). W tym celu 800 ml hodowli szczepu ekspresyjnego pQEDEAC poddawano fermentacji i indukowaniu tak jak to opisano w przykładzie 1. Zebrany osad komórek (4 g) ponownie przeprowadzono w zawiesinę w 20 ml buforu stosowanego do lizy i rozbito pod działaniem ultradźwięków. Po odwirowaniu do klarownego lizatu białka (całkowita zawartość białek 120 mg) dodano 4 ml 50% zawiesiny Ni-NTA, w celu związania fuzyjnego białka HisTag, a następnie materiał ten wprowadzono do kolumny enzymatycznej. Matrycę powinowactwa przemyto 10 objętościami buforu przemywającego, a następnie 4 ml buforu wymywającego. Dla skontrolowania efektywności oczyszczania metodą powinowactwa próbki rozbitych komórek, roztworów przemywających i eluatów analizowano metodą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z SDS. Aktywność deacetylazy różnych frakcji zawierających białka określano w teście radioaktywności opisanym w przykładzie 1 (skład mieszaniny reakcyjnej: 9 μl roztworu białka + 1 μl 1 mM [14C]-N-acetylo-L-PPT; warunki reakcji: patrz opis powyżej). W celu ilościowego oznaczenia enzymu frakcje białkowe inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C z 50 mM N-acetylo-D,L-PPT (9 μl roztworu białka + 1 μl 500 mM N-acetylo-D,L-PPT). Następnie ilość powstałej PPT mierzono w analizatorze aminokwasów (Biotronic LC 5001).
Specyficzna aktywność deacetylazy białka w surowym ekstrakcie po rozbiciu komórek wynosiła 3 nkat/mg (1 nkat = 1 nmol substratu/s). Z 800 ml hodowli szczepu ekspresyjnego metodą chromatografii powinowactwa można było wyodrębnić 10 mg białka fuzyjnego HisTag-deac o specyficznej aktywności 20 nkat/mg białka i czystości około 80%.
PL 203 870 B1
3. Specyficzność względem substratu i stereoselektywność deacetylazy
W celu zbadania specyficzności względem substratu i stereospecyficzności białka deac1, inkubowano po 5 μg oczyszczonego enzymu w 20 μΐ mieszaniny 10 mM NaCl, 10 mM fosforanu sodu, pH = 7,5, z wymienionymi w tabeli 1 N-acetylo-L-aminokwasami lub z odpowiednimi enancjomerami D w stężeniu 25 mM. Dla porównania stosowano kwas hipurowy (N-benzoiloglicynę), naturalny substrat deacetylazy. Mieszaninę reakcyjną inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze 37°C, a następnie oznaczano powstałe wolne aminokwasy w analizatorze aminokwasów (Biotronic LC 5001). W tabeli 1 podano względną aktywność deacetylazy względem enancjomerów L różnych substratów. Oprócz kwasu hipurowego i N-Ac-L-PPT, deac1 rozdziela również N-acetylo-pochodne szeregu naturalnych aminokwasów, a zwłaszcza kwasu N-Ac-L-glutaminowego, N-Ac-glicyny, N-Ac-L-histydyny, N-Ac-L-ornityny, N-Ac-L-leucyny, N-Ac-L-glutaminy i N-Ac-L-fenyloalaniny. We wszystkich przypadkach enzym był aktywny wyłącznie względem enancjomerów L, podczas gdy związki o konfiguracji D w żadnym przypadku nie ulegały reakcji. We wszystkich innych przypadkach przebadanych substratów (patrz tabela 1) N-acetylo-L-pochodne przereagowały tylko w nieznacznym stopniu, albo w ogóle nie wchodziły w reakcję.
T a b e l a 1
Specyficzność enzymu deac względem substratu
| Substrat1 | Aktywność względna2 [%] |
| Kwas hipurowy (N-benzoiloglicyna) | 100 |
| N-Ac-L-Fosfinotrycyna | 43 |
| N-Ac-L-Ornityna | 37 |
| N-Ac-L-Metionina | 0 |
| N-Ac-L-Tryptofan | 0,4 |
| N-Ac-L-Fenyloalanina | 24 |
| N-Ac-L-Tyrozyna | 11 |
| Kwas N-Ac-L-glutaminowy | 100 |
| N-Ac-L-Glutamina | 30 |
| N-Ac-L-Glicyna | 59 |
| N-Ac-L-Histydyna | 43 |
| N-Ac-L-Leucyna | 33 |
| N-Ac-L-Walina | 2 |
| N-Ac-L-Seryna | 4 |
| N-Ac-L-Prolina | 0 |
1 wszystkie zwią zki stanowił y enacjomery L 2 specyficzną aktywność określoną dla kwasu hipurowego [nmole glicyny/min/mg białka] przyjęto za równą 100%, a inne wartości podano w stosunku do tej wartości
4. Rozdzielanie racematu N-acetylo-D,L-fosfinotrycyny przez biotransformację z użyciem komórek szczepu wytwarzającego deac
Hodowlę szczepu ekspresyjnego pQEDEAC (400 ml) poddano fermentacji i indukowaniu. Następnie zebrane komórki przemyto 10 mM NaCl, 10 mM fosforanem sodu, pH = 7,5, i liofilizowano przez noc. Tak potraktowane komórki mogły być przechowywane przez kilka tygodni w temperaturze 4°C, przy zachowaniu wysokiej specyficznej aktywności deacetylazy, i służyły w poniższych doświadczeniach jako biokatalizatory.
Liofilizowane komórki (2 mg) ponownie przeprowadzono w zawiesinę w 1 ml następujących roztworów substratów w różnym stężeniu:
(1) 10 mM N-acetylo-D,L-PPT, sól disodowa (0,3%) (2) 50 mM N-acetylo-D,L-PPT, sól disodowa (1,3%) (3) 100 mM N-acetylo-D,L-PPT, sól disodowa (2,6%)
PL 203 870 B1 (4) 250 mM N-acetylo-D,L-PPT, sól disodowa (6,7%) (5) 500 mM N-acetylo-D,L-PPT, sól disodowa (13,3%)
Zawiesiny zawierały jako bufor 10 mM NaCl, 10 mM fosforan sodu, pH = 8,0, i inkubowano je przez 48 godzin na wytrząsarce przy 100 obr./min w 37°C. Powstałą w reakcji hydrolizy wolną PPT oznaczano w analizatorze aminokwasów (Biotronic LC 5001). Wyniki podano w tabeli 2. Czystość enancjomerów stanowiących produkt reakcji analizowano metodą chiralnej HPLC, z użyciem kolumny rozdzielczej Chirex® (D) Penicillamin (Phenomenex). Jako fazę ruchomą stosowano 2 mM CuSO4, 10% metanol, przy szybkości przepływu 0,5 ml/min. Detekcji dokonywano metodą fotometryczną przy 254 nm. W tych warunkach porównawcze roztwory L-PPT eluowały po 17 minutach, a D-PPT po 21 minutach. We wszystkich badanych próbkach można było wykazać obecność wyłącznie D-PPT jako produktu reakcji. Osiągnięty stopień przemiany [powstała L-PPT/N-acetylo-L-PPT w substracie x 100] jest w zakresie od 100% przy niskim stężeniu substratu (10 mM, 50 mM) do 66% przy najwyższym ze stosowanych stężeń substratu (500 mM).
T a b e l a 2
Rozdzielanie racematu N-acetylo-D,L-PPT w zależności od stężenia substratu
| Roztwór substratu N-acetylo-D,L-PPT [mM] | Roztwór produktu* L-PPT [mM] | Stopień przemiany L-PPT/N-acetylo-D,L-PPT [%] |
| 10 | 5 | 100 |
| 50 | 25 | 100 |
| 100 | 48 | 96 |
| 250 | 108 | 86 |
| 500 | 164 | 66 |
*Stężenie biokatalizatora: 2 mg/ml
W próbie opisanej poniż ej zwię kszano stężenie biokatalizatora i okreś lano kinetykę reakcji. Liofilizowane komórki (13 mg) ponownie przeprowadzono w zawiesinę w 1 ml roztworu substratu, składającego się z 500 mM soli disodowej N-acetylo-D,L-PPT (13,3% wag./obj.), 10 mM NaCl, 10 mM fosforanu sodu, pH = 8,0, i inkubowano ją przez 48 godzin na wytrząsarce przy 100 obr./min w 37°C.
W celu oznaczenia powstałej L-PPT, z mieszaniny reakcyjnej w ciągu 55 godzin pobierano próbki o objętości po 50 μ|, odwirowywano je, a pozostałość zamrażano do -20°C, do czasu przeprowadzania analizy. Ilościową analizę produktu reakcji L-PPT, jak również oznaczenie czystości enancjomeru przeprowadzano w sposób opisany powyżej. Wyniki podano w tabe|i 3. W wybranych warunkach L-specyficzne rozdzie|anie substratu doprowadzono do końca po około 55 godzinach. Osiągnięto przy tym stopień przemiany około 90% i wydajność przestrzenno-czasową 483 [mg L-PPT/g biokata|izatora/h].
T a b e | a 3
Kinetyka reakcji rozdzie|ania racematu N-acety|o-D,L-PPT
| Czas reakcji [h] | L-PPT [mM]* |
| 0 | 0 |
| 1 | 27,7 |
| 4 | 59,7 |
| 9 | 106,0 |
| 23 | 181,6 |
| 31 | 186,5 |
| 47 | 208,6 |
| 55 | 221,8 |
*Stężenie biokata|izatora: 13 mg/m|
Stężenie substratu: 500 mM N-acety|o-D,L-PPT
PL 203 870 B1
5. Unieruchamianie oczyszczonego białka deac
Aby możliwe było przeprowadzenie reakcji enzymatycznej z wyodrębnionym białkiem deac, enzym oczyszczony w przykładzie 2 jako białko fuzyjne HisTag unieruchomiono na polimerowym nośniku VINA-Epoxy Biosynth® (Riedel de Haen). W tym celu białko deac zatężano przez wytrącanie siarczanem amonu do wartości 15 mg/ml i przez noc dializowano wobec 1 M fosforanu sodu, pH = 8,0. Dla standardowej reakcji sprzęgania, 10 mg białka przez dwa dni wolno wytrząsano w temperaturze pokojowej ze 100 mg nośnika VINA. Następnie unieruchomione białko odwirowano i przemyto 1 x buforem stosowanym do unieruchamiania oraz 1 x 50 mM fosforanem sodu, pH = 7. Dla zablokowania wolnych grup epoksydowych nośnik inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 50 mM fosforanem sodu, pH = 7, i 50 mM 2-merkaptoetanolem. Biokatalizator przechowywano w 1 ml 5 mM fosforanu sodu, pH = 7, z 0,02% azydku Na, w temperaturze 4°C. Dla określenia sprzęgania białka, metodą Bradforda oznaczano zawartość białka w roztworze przed unieruchomieniem i po unieruchomieniu [Bradford (1976), Anal. Blochem. 72: 248-254]. Specyficzną aktywność deacetylazy przed unieruchomieniem i po unieruchomieniu określono w teście radioaktywności opisanym w przykładzie 1. Aktywność względna enzymu po sprzęganiu wynosiła >90% aktywności określonej dla rozpuszczonego białka.
6. Rozdzielanie racematu N-acetylo-D,L-fosfinotrycyny z użyciem unieruchomionego enzymu deac w reaktorze kolumnowym
Unieruchomiony enzym w ilości 1 g (masa w stanie wilgotnym) umieszczono w reaktorze kolumnowym i zastosowano jako biokatalizator do rozdzielania racematów w różnych stężonych roztworach substratu, przy różnych wartościach szybkości przepływu. Roztwory substratu zawierały N-acetylo-D,L-PPT w postaci soli diamonowej w 10 mM NaCl, 10 mM fosforanie sodu, pH = 8,0, w stężeniu podanym w tabeli 4. Reakcje prowadzono w temperaturze 37°C, łącznie przez 10 dni. Stopień przemiany oceniano ilościowo przez oznaczanie L-PPT obecnej w cieczy przepływającej przez reaktor kolumnowy, metodami analizy aminokwasów i chiralnej HPLC (patrz przykład 4). Wyniki przedstawiono w tabeli 4. Najwyższy stopień przemiany 83% osiągnięto przy najwyższym stężeniu substratu (500 mM) i najmniejszym przepływie substratu (0,03 ml/min). Wydajność przestrzenno-czasowa rosła wraz z szybkością przepływu i stężeniem substratu i osiągnęła największą wartość [181 mg L-PPT/g biokatalizatora/h], przy stężeniu substratu 500 mM i przepływie 0,3 ml/min. Unieruchomiona deacetylaza wykazywała przez cały czas prowadzenia prób dobrą stabilność i po 10 dniach w temperaturze 37°C wykazywała jeszcze około 80% aktywności wyjściowej.
T a b e l a 4
Rozdzielanie racematu N-acetylo-D,L-fosfinotrycyny z użyciem unieruchomionego enzymu deac w reaktorze kolumnowym
| Roztwór substratu N-acetylo-D,L-PPT [mM] | Szybkość przepływu [ml/min] | Roztwór produktu L-PPT [mM] | Stopień przemiany [%] | Wydajność przestrzenno-czasowa [mg L-PPT/g biokatalizatora/h]* |
| 100 | 0,1 | 29,7 | 59 | 39 |
| 0,3 | 22,0 | 44 | 87 | |
| 0,5 | 13,8 | 28 | 91 | |
| 250 | 0,1 | 38,4 | 31 | 50 |
| 0,3 | 25,0 | 20 | 99 | |
| 0,5 | 18,1 | 14 | 119 | |
| 500 | 0,1 | 71,1 | 28 | 93 |
| 0,3 | 46,0 | 18 | 181 | |
| 0,5 | 26,3 | 11 | 173 | |
| 500 | 0,03 | 208,2 | 83 | 82 |
*Reakcja w temperaturze 37°C
Claims (4)
1. Sposób wytwarzania L-fosfinotrycyny (L-PPT) z racemicznej N-acetylo-D,L-PPT, znamienny tym, że (a) N-acetylo-L-PPT deacetyluje się bez deacetylowania N-acetylo-D-PPT przez enzymatyczne rozdzielanie racematu za pomocą wydzielonej zrekombinowanej hydrolazy hipuranowej deac1 ze Stenotrophomonas sp.,
b) racemiczną N-acetylo-D,L-PPT stosuje się w stężeniu od powyżej 50 mM do 1500 mM,
c) otrzymaną deacetylowaną L-PPT oddziela się preparatywnie od niedeacetylowanej N-acetylo-D-PPT i/lub od niecałkowicie deacetylowanej N-acetylo-D-PPT,
d) przy czym wydajność przestrzenno-czasowa deacetylowanej L-PPT osiągnięta w czasie reakcji 55 godzin wynosi co najmniej 69 mg deacetylowanej L-PPT/g biokatalizatora/h.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zrekombinowaną deac1 stosuje się w postaci unieruchomionej.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w temperaturze od około 25°C do 65°C.
4. Zastosowanie deac1 pochodzącej ze Stenotrophomonas sp. w sposobie enancjoselektywnego wytwarzania L-PPT z racemicznej N-acetylo-D,L-PPT, zdefiniowanym w zastrz. 1 - 3.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19933362A DE19933362A1 (de) | 1999-07-20 | 1999-07-20 | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren aus ihren racemischen N-Acetyl-D,L-Derivaten durch enzymatische Racemat-Spaltung mittels isolierter, rekombinanter Enzyme |
| PCT/EP2000/005586 WO2001005982A1 (de) | 1999-07-20 | 2000-06-17 | Verfahren zur herstellung von l-aminosäuren aus ihren racemischen n-acetyl-d,l-derivaten durch enzymatische racemat-spaltung mittels isolierter, rekombinanter enzyme |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL357347A1 PL357347A1 (pl) | 2004-07-26 |
| PL203870B1 true PL203870B1 (pl) | 2009-11-30 |
Family
ID=7915003
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL357347A PL203870B1 (pl) | 1999-07-20 | 2000-06-17 | Sposób wytwarzania L-fosfinotrycyny i zastosowanie hydrolazy deac-1 |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6686181B1 (pl) |
| EP (1) | EP1200601B1 (pl) |
| JP (1) | JP4723778B2 (pl) |
| KR (1) | KR100672146B1 (pl) |
| CN (1) | CN1175108C (pl) |
| AT (1) | ATE319836T1 (pl) |
| AU (1) | AU778206B2 (pl) |
| BR (1) | BR0012572A (pl) |
| CA (1) | CA2379849A1 (pl) |
| CO (1) | CO5310578A1 (pl) |
| CZ (1) | CZ2002224A3 (pl) |
| DE (2) | DE19933362A1 (pl) |
| DK (1) | DK1200601T3 (pl) |
| ES (1) | ES2258011T3 (pl) |
| HU (1) | HU229651B1 (pl) |
| IL (1) | IL147398A (pl) |
| MX (1) | MXPA02000623A (pl) |
| NZ (1) | NZ516710A (pl) |
| PL (1) | PL203870B1 (pl) |
| RU (1) | RU2270869C2 (pl) |
| SK (1) | SK402002A3 (pl) |
| TW (1) | TWI238193B (pl) |
| UA (1) | UA73743C2 (pl) |
| WO (1) | WO2001005982A1 (pl) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE497538T1 (de) * | 2002-02-26 | 2011-02-15 | Syngenta Ltd | Verfahren zur selektiven herstellung männlich- oder weiblich-steriler pflanzen |
| US7772426B2 (en) | 2005-03-29 | 2010-08-10 | Meiji Seika Kaisha, Ltd. | Method for producing L-2-amino-4-(hydroxymethylphosphinyl)-butanoic acid |
| BRPI0716080B8 (pt) | 2006-09-04 | 2018-02-14 | Meiji Seika Kaisha | processo para produção de ácidos (aminofosfinil) butanóicos oticamente ativos |
| WO2008035687A1 (en) | 2006-09-20 | 2008-03-27 | Meiji Seika Kaisha Ltd. | METHOD FOR PRODUCING PHOSPHORUS-CONTAINING α-AMINO ACID AND PRODUCTION INTERMEDIATE THEREOF |
| WO2012154483A1 (en) * | 2011-05-06 | 2012-11-15 | Gilead Sciences, Inc. | Dry powder fosfomycin/tobramycin formulation for inhalation |
| CN109988806B (zh) * | 2017-12-29 | 2023-02-28 | 弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司 | 一种n-乙酰-草铵膦盐的消旋方法 |
| CN108690854B (zh) * | 2018-04-16 | 2022-03-18 | 浙江工业大学 | 一种利用化学-酶法生产l-草铵膦的方法 |
| UY39808A (es) * | 2021-06-11 | 2023-01-31 | Upl Ltd | Un método de obtención de l-glufosinato |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5547630A (en) | 1978-10-02 | 1980-04-04 | Meiji Seika Kaisha Ltd | Optical resolution of phosphorus-containing amino acid |
| DE3048612C2 (de) * | 1980-12-23 | 1982-12-02 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | "Verfahren zur enzymatischen Trennung von L-2-Ami no-4-methylphosphinobuttersäure" |
| US5081024A (en) | 1988-09-05 | 1992-01-14 | Nissan Chemical Industries, Ltd. | Process for producing optically active amino acids |
| DE4308061A1 (de) * | 1993-03-13 | 1994-09-15 | Hoechst Ag | Neue Aminosäure-Deacetylase mit Spezifität für L-N-Acetyl-Phosphinothricin, ihre Herstellung und Verwendung |
| DE4422045A1 (de) * | 1994-06-26 | 1996-01-04 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Verfahren zur enzymatischen Spaltung von 2-Amino-4-methylphosphinobutansäureamid-Derivaten |
| US6235516B1 (en) | 1996-04-25 | 2001-05-22 | Novartis Ag | Biocatalysts with amine acylase activity |
| DE19652284A1 (de) * | 1996-12-16 | 1998-06-18 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Neue Gene codierend für Aminosäure-Deacetylasen mit Spezifität für N-Acetyl-L-Phosphinothricin, ihre Isolierung und Verwendung |
-
1999
- 1999-07-20 DE DE19933362A patent/DE19933362A1/de not_active Ceased
-
2000
- 2000-06-17 SK SK40-2002A patent/SK402002A3/sk not_active Application Discontinuation
- 2000-06-17 RU RU2002104355/13A patent/RU2270869C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-06-17 HU HU0201850A patent/HU229651B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2000-06-17 US US10/031,356 patent/US6686181B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-17 CN CNB008105103A patent/CN1175108C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-17 WO PCT/EP2000/005586 patent/WO2001005982A1/de not_active Ceased
- 2000-06-17 EP EP00943826A patent/EP1200601B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-17 AT AT00943826T patent/ATE319836T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-06-17 NZ NZ516710A patent/NZ516710A/xx unknown
- 2000-06-17 PL PL357347A patent/PL203870B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2000-06-17 BR BR0012572-5A patent/BR0012572A/pt not_active Application Discontinuation
- 2000-06-17 CA CA002379849A patent/CA2379849A1/en not_active Abandoned
- 2000-06-17 MX MXPA02000623A patent/MXPA02000623A/es active IP Right Grant
- 2000-06-17 ES ES00943826T patent/ES2258011T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-17 JP JP2001511194A patent/JP4723778B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-17 KR KR1020027000746A patent/KR100672146B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2000-06-17 UA UA2002021417A patent/UA73743C2/uk unknown
- 2000-06-17 CZ CZ2002224A patent/CZ2002224A3/cs unknown
- 2000-06-17 IL IL14739800A patent/IL147398A/xx active IP Right Grant
- 2000-06-17 DK DK00943826T patent/DK1200601T3/da active
- 2000-06-17 AU AU58156/00A patent/AU778206B2/en not_active Ceased
- 2000-06-17 DE DE50012368T patent/DE50012368D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-12 CO CO00052026A patent/CO5310578A1/es not_active Application Discontinuation
- 2000-07-18 TW TW089114376A patent/TWI238193B/zh not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6686181B1 (en) | 2004-02-03 |
| ATE319836T1 (de) | 2006-03-15 |
| JP4723778B2 (ja) | 2011-07-13 |
| HUP0201850A2 (en) | 2002-09-28 |
| HUP0201850A3 (en) | 2005-01-28 |
| EP1200601A1 (de) | 2002-05-02 |
| KR100672146B1 (ko) | 2007-01-19 |
| UA73743C2 (en) | 2005-09-15 |
| IL147398A0 (en) | 2002-08-14 |
| CO5310578A1 (es) | 2003-08-29 |
| DK1200601T3 (da) | 2006-07-17 |
| CZ2002224A3 (cs) | 2002-06-12 |
| PL357347A1 (pl) | 2004-07-26 |
| MXPA02000623A (es) | 2002-07-02 |
| TWI238193B (en) | 2005-08-21 |
| WO2001005982A1 (de) | 2001-01-25 |
| CN1175108C (zh) | 2004-11-10 |
| CA2379849A1 (en) | 2001-01-25 |
| NZ516710A (en) | 2002-11-26 |
| DE19933362A1 (de) | 2001-02-08 |
| JP2003505031A (ja) | 2003-02-12 |
| HU229651B1 (hu) | 2014-03-28 |
| SK402002A3 (en) | 2002-04-04 |
| AU5815600A (en) | 2001-02-05 |
| ES2258011T3 (es) | 2006-08-16 |
| EP1200601B1 (de) | 2006-03-08 |
| AU778206B2 (en) | 2004-11-25 |
| CN1371422A (zh) | 2002-09-25 |
| IL147398A (en) | 2005-12-18 |
| RU2270869C2 (ru) | 2006-02-27 |
| KR20020020943A (ko) | 2002-03-16 |
| DE50012368D1 (de) | 2006-05-04 |
| BR0012572A (pt) | 2002-04-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20030113880A1 (en) | DNA for encoding D-hydantoin hydrolases, DNA for encoding N-carbamyl-D-amino acid hydrolases, recombinant DNA containing the genes, cells transformed with the recombinant DNA, methods for producing proteins utilizing the transformed cells and methods for producing D-amino acids | |
| US8460902B1 (en) | DNA encoding hydantoinase, DNA encoding N-carbamyl-L-amino acid hydrolase, recombinant DNA, transformed cell, method of producing protein, and method of producing optically active amino acid | |
| Kikuchi et al. | Peptidoglutaminase. Enzymes for selective deamidation of γ-amide of peptide-bound glutamine | |
| PL203870B1 (pl) | Sposób wytwarzania L-fosfinotrycyny i zastosowanie hydrolazy deac-1 | |
| JP4063400B2 (ja) | Ｄ−アミノアシラーゼ | |
| Arcuri et al. | Resolution of DL-hydantoins by D-hydantoinase from Vigna angularis: Production of highly enantioenriched N-carbamoyl-D-phenylglycine at 100% conversion | |
| KR987001034A (ko) | D-N-카르바모일-알파-아미노산의 제조법(Process for Producing D-N-Carbamoyl-Alpha-Amino Acid) | |
| Syldatk et al. | Biotechnological production of D‐or L‐amino acids from 5‐monosubstituted hydantoins | |
| US5019509A (en) | Method and compositions for the production of l-alanine and derivatives thereof | |
| Joeres et al. | Purification and characterisation of a microbial l-carnitine amidase | |
| US6030823A (en) | D-aminoacylase | |
| Kikuchi et al. | A new enzyme, proline acylase (N-acyl-L-proline amidohydrolase) from Pseudomonas species | |
| El-Dorry et al. | Purification and properties of rabbit heart muscle aldolase | |
| JPH0773508B2 (ja) | Ｌ―アスパラギンのアミド結合の水解方法及び試薬 | |
| JPH09510623A (ja) | ペプチドアミダーゼを含有する微生物の獲得方法、それにより得られた微生物、その中に含有されるペプチドアミダーゼ及びその使用 | |
| WO2003044206A2 (en) | Process for the preparation of an enantiomerically enriched a-amino acid | |
| KR100244055B1 (ko) | 디-엔-카르바모일-알파-아미노산의 제조법 | |
| JPWO1992010579A1 (ja) | Ｄ―α―アミノ酸の製造法 | |
| HASEGAWA et al. | Studies on the. GAMMA.-glutamylpeptides in L-glutamic acid fermentation broths. II.. GAMMA.-Glutamylpeptide formative activity of Corynebacterium glutamicum by the reverse reaction of the. GAMMA.-glutamylpeptide hydrolytic enzyme. | |
| JPS6151879B2 (pl) | ||
| JPH0518551B2 (pl) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20100617 |