UA77153C2

UA77153C2 - Method for determining the presence of leptin and leptinomimetic

Info

Publication number: UA77153C2
Application number: UA2002053825A
Authority: UA
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 1999-10-11
Filing date: 2000-05-10
Publication date: 2006-11-15
Also published as: IL132313A0; WO2001027319A2; JP2003511057A; ZA200202155B; CA2386365A1; EE200200189A; DE60027031D1; HK1048514B; KR20020048416A; US7247427B1; WO2001027319A3; DK1222467T3; EP1222467A2; IL149021A; EA200200435A1; AU778727B2; PT1222467E; EA004709B1; AR025995A1; ES2256045T3

Description

Опис винаходу

Даний винахід пов'язаний з системами аналізу для визначення активності лептину. Більш конкретно, винахід 2 пов'язаний з аналізом іп міго лептину або агентів, які імітують біологічну активність лептину (тут: лептин імітуючі агенти, або лептиноміметики). Такий аналіз придатний для застосування, наприклад, при широкому скринінгу бібліотек молекул.

Ожиріння, що визначається як надлишок жиру в організмі по відношенню до "пісної" маси тіла, асоційоване з психологічною та медичною хворобливістю, причому останнє включає у себе гіпертонію, підвищений рівень 70 ліпідів у крові та інсулінонезалежний цукровий діабет або цукровий діабет типу ПП (МІООМ). У США нараховується 6-10 мільйонів індивідуумів з МІООМ, включаючи 18905 популяції у віці 65 років |Катеї, ОК, еї а!., Сійп. СегіаїМ. Мей. 1999, 15, 265). Приблизно 4595 чоловіків та 7095 жінок з МІООМ мають ожиріння, причому при зниженні ваги вияви діабету у них суттєво полегшуються або ж зникають |(Наїтіз 1991, Оіарей(ез

Саге, 14, 639). 12 Лептин, продукт гена гладкості (7папо, У., ей аїЇ.,, 1994, Маїшге 372, 425), функціонує як периферичний сигнал для мозку, який регулює поглинання їжі та енергетичний обмін. Вважають, що лептин діє на гіпоталамус через свій рецептор, ОВ-К |Тападіїа, І. А., еї аїЇ.,, 1995, Сеї! 83, 1263). У гризунів з мутаціями, які запобігають нормальній експресії або лептину, або повнорозмірного ОВ-К, спостерігаються сильне ожиріння, діабет та зниження швидкості метаболізму (СоіІетап, О. І. 1978, Оіарейфіодіа 14, 141). Однак у людини ожиріння виникає, імовірніше за все, не у зв'язку з мутаціями в генах, що кодують лептин або ОВ-К |Сопвзіаіпе, К. М., еї аІ,, 1995, 9. Сііп. Іпмеві. 95, 2986: Сопвідіпе. МК. М., еї аіІ.,, 1996, Оіарефез 19, 992). Незважаючи на те, що мишам з мутантним геном гладкості можна повернути нормальну вагу шляхом введення рекомбінантного лептину (РеїМПеутоипіег, М, А., еї аїЇ.,, 1995, Зсіепсе 269, 540: Наїаав, 9. Ї., еї аЇ, 1995, Зсіепсе 269, 543;

Сатріїєїа, І. А., еї аЇ, Зсіепсе 269, 546), малоймовірно, щоб такий підхід був успішним у застосуванні до с людини з ожирінням, оскільки у неї рівні лептину у сироватці хронічно підвищені (Майеї, М., еї аї., 1995, Ге)

Майте Мей. 1, 1155; Сопвідіпе, К. М., еї аї., 1996, М. ЕпоіЇ. У. Мед. 334, 292; Біппа, М. К., еї аї., 1996,

У. Сіїп. Іпмеві. 98, 1277)Ї. Таким чином, люди з ожирінням, імовірніше за все, є "лептин-резистентними"

ІМайеї, М., еї аІ., 1995, Майте Мей. 1, 1155; Рііег, У. 5. 5 ЕІтацівї, У. К. 1997, Маїшге Віоїесп. 15, 20;

Сатріїєїа, |. А., еї аїЇ.,, 1996, Ногт. Мейар. Кевз. 28, 619| у тому відношенні, що у них не виробляється Ше сигнал, пропорційний рівню лептину в їх сироватці, можливо, через дефект транспорту лептину через (о гематоенцефалічний бар'єр |Саго, 9. Р., еї аІ.,, 1996, Іапсе( 348, 159) або неадекватну відповідь ОВ-К.

Кількісні аналізи шляхів передачі сигналу ОВ-К можуть виявити альтернативні терапевтичні підходи до -- посилення відповідей ОВ-К для подолання резистентності до лептину та оборотності ожиріння. Лептин та ОВ-К ча є, відповідно, членами суперсімейств чотрьохспірального пучка цитокінез та рецепторів (Тагіадіа, Ї. А., еї 325 аі,, 1995, Сей 83, 1263; Маадеї), Т., ей а. 1995, РЕВ5 Їей. 373, 13). ОВ-К має найбільшу схожість з - передаючим сигнал рецептором орізЗо, який активується цитокінами, такими як інтерлейкін 6 та СМТЕ, шляхи передачі сигналів яких інтенсивно досліджувалися |Ківзпітоїо, Т., е( аїЇ.,, 1992, Зсіепсе 258, 593; -еФанп. М. «

Уапсороціов. С. ЮО. 1994, 9). Меийгоріоїюду 25, 1454). Рецептори лептину транслюються у вигляді продуктів « декількох альтернативних сплайсингів з різними цитоплазматичними доменами (|Тагіадіїа, |. А., еї аї., 1995, З 70 Се 83, 1263; Іеє, С-Н., єї а, 1996, Майте 379, 632; Спеп, Н., еї аї., 1996, Сеї 84, 491; Сіой, .. с А., еї аІЇ.,, 1996, Маїшге Мей. 2, 585; Ууапо, М. М., еї аІЇ.,, 1996, РЕВЗ І ей. 392, 87), але ймовірно, тільки

Із» одна ізоформа, відома як довга форма, або ОВ-КЬ, здатна до опосередкування контролюючих вагу ефектів лептину (ее, 0О.-Н., еї аі., 1996, Майте 379, 632; Спеп, Н., еї аїЇ.,, 1996, Се 84, 491; ОПіагаї, М., еї аІ., 1996, Рос. Май. Асай. сі. ОБА 93, 6231; Вацтапп, Н., еї аїЇ.,, 1996, Ргос. Май. Асай. сі. ОБА 93, 8374). У діабетичних (05) мишей з ожирінням є мутація в ОВ-К, яка запобігає експресії довгої сплайсованої це. ізоформи ОВ-К, що робить їх нездатними відповідним чином опосередковувати дію лептину (І ее, .-Н., еї аї., -і 1996, Машге 379, 632; Спеп, Н., еї аі!., 1996, Сеї! 84, 4911. з Вивчення нових біологічно активних молекул, які використовуються як лікарські засоби для лікування небезпечних для життя захворювань, включає у себе дві основні операції: (їі) більш або менш випадковий вибір сл 20 молекули-кандидата, одержаної або шляхом хімічного синтезу, або шляхом виділення з природних джерел, і (ії) тестування молекули-кандидата на предмет виявлення у неї властивості або властивостей, що представляють с» інтерес. Цикл тестування незалежно повторюється доти, доки не буде ідентифікована молекула, яка має необхідні властивості. У більшості випадків типи молекул, які вибираються для тестування, частіше за все належать вузько визначеним хімічним класам. Наприклад, вивчення нових пептидних гормонів включає у. себе 29 роботу з лептидами; вивчення нових терапевтичних стероїдів включає у себе роботу зі стероїдними ядрами. У

ГФ) результаті вивчення нових функціональних молекул, яких у природі безліч, майже завжди є надзвичайно тривалим, стомлюючим, непередбачуваним та дорогим підприємством. о У нових теоріях про біологічну активність стверджується, що біологічна активність, а отже, і фізіологічні стани, є результатом явища молекулярного пізнавання. Наприклад, нуклеотиди здатні утворювати 60 комплементарні пари основ, так, що комплементарні одноланцюгові молекули гібридизуються, утворюючи структури подвійної та потрійної спіралі, які, імовірніше за все, беруть участь в регуляції експресії генів.

Як інший приклад, біологічно активна молекула, названа лігандом, зв'язується з іншою молекулою, звичайно макромолекулою, названою акцептор ліганду (наприклад, рецептор або фермент), і таке скріплення спричиняє цілий ряд молекулярних явищ, які обов'язково позначаться на фізіологічному стані, наприклад, нормальному бо зростанні та диференціюванні клітин, аномальному зростанні клітин, яке веде до канцерогенезу, регуляції тиску крові, вироблення та поширення нервового імпульсу та ін. Скріплення між лігандом та акцептором ліганду є геометричною характеристикою, виключно специфічною, що включає в себе відповідне аранжування трьохмірної структури та хімічні взаємодії.

Відтепер переважна стратегія розвитку агентів, які можуть бути використані для лікування захворювань, включає у себе виявлення форм лігандів біологічних рецепторів, ферментів або споріднених макромолекул, які імітують такі ліганди і або посилюють (тобто діють на зразок агоністів), або гальмують (тобто діють як антагоністи) активність, що виявляється акцептором або рецептором. Виявлення таких лігандів звичайно здійснюється або шляхом випадкового скринінгу молекул (які продукуються шляхом хімічного синтезу або 70 виділених з природних джерел, |див., наприклад, К. МакКапівзпі, Асіа Рпагт. Мога., 1992, 4, 319-328), або за допомогою так званого "раціонального" підходу, що включає в себе ідентифікацію ведучої структури - звичайно, як правило, структури нативного ліганду, і оптимізацію її властивостей внаслідок численних циклів структурних перебудов та біологічного тестування |див., наприклад, Тезіа, В. 5 Кіег, Ї.В. Мед. Кев. Кеу. 1991, 11, 3548 апа Коївівіп, 5.Н. 5 Мигеко, М.А., У. Мед. Спега. 1993, 36, 1700). Оскільки більшість корисних лікарських засобів була відкрита не внаслідок "раціонального" підходу, а шляхом скринінгу випадково вибраних сполук, в цей час з'явився змішаний підхід до відкриття лікарських речовин, який заснований на застосуванні комбінаторної хімії для побудови величезних бібліотек побудованих наздогад хімічних структур, які зазнають скринінгу з метою виявлення специфічної біологічної активності. |Вгеппег, 5. 8 І етег, К.А. Ргос. Маї). Асавд.

Зсі. ОБА 1992, 89, 5381). Будь-який скринінг таких величезних бібліотек створених наздогад хімічних структур 2о повинен являти собою виправданий з точки зору грошових витрат ефективний біологічний кількісний, аналіз, який піддавався б автоматизуванню.

Традиційно випробування лептину проводили іп мімо, ін'Єєкуючи його мишам обр/об, а потім спостерігаючи за їх втратою ваги. Таке біологічне випробування є дуже обтяжливим, що не відтворюється та віднімає багато часу.

Воно також не підходить для застосування при широкомасштабному скринінгу бібліотек, що містять мільйони сч ов сполук. Крім цього, були описані також деякі простіші системи аналізу. Наприклад, виявлення того, що довга форма ОВ-К містить послідовність УХХО |Тападіїа, |. А., еї аї., (1995) СеїІ 83, 1263), що є мотивом, який в і) точності зумовлює активацію ЗТАТЗ |-їанйі, М., еї аї., (1995) Зсіепсе 267, 1349), дає можливість передбачити, що ЗТАТЗ є критичним для відповідей, опосередкованих лептином. Результати недавніх досліджень дозволили виявити, що ЗТАТЗ активується як у клітинах (СпПійагаї, М., еї аїЇ., (1996) Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 93, с зо 6231; Ваштапп, Н., еї аї., (1996) Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА 93, 8374; Козепрішт, С. !., еї аї., (1996)

Епдосгіпоїюду 137, 5178), що культивуються, так та іп мімо |Маївзе, С, еї аІ., (1996) Маїшге Сеп. 14, 95| за о допомогою довгої форми ОВ-К, але не укороченої (внаслідок процесінгу) форми ОВ-К та не довгою формою -« др

ОВ-К з мутантним мотивом УХХО |Ваштанпп, Н., еї аї., (1996) Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА 93, 8374; М/пйе, 0. МУ., еї аї., (1997) 9. Вісі. Спега. 272, 4065). (У патентній заявці РСТ Мо. М/09857177| пропонується застосування ї- активації ЗТАТЗ як основи для простого біологічного аналізу лептину іп міго. Однак ЗТАТЗ активується також ї- і багатьма іншими гормонами та цитокінами, включаючи 1-6, СМТЕ, інтерферон альфа та бета, гормон росту і багато інших цитокінів та поліпептидних гормонів. Отже, активація ЗТАТЗ не може бути використана як специфічний маркер активності лептину.

ІУ заявці РСТ М/УО9740380)| описується застосування касети ДНК, так званого "елемента лептинової відповіді". «

Прикріплення цієї касети ДНК до промотору, такого як промотор тимідинкінази, та репортерного гену, такого як з с (ген! люциферази, забезпечить відповідний репортерний вектор: Клітини, які експресують рецептор лептину . ОВ-КЬ, трансфікуються репортерним вектором. Такі клітини пропонуються як засіб для аналізу лептину іп міїго. и? Однак згідно (з заявкою РСТ УУО9740380)Ї), що пропонується "елемент лептинової відповіді" ідентичний "послідовності гамма-активації", добре відомому елементу, який активується багатьма іншими цитокінами, і

Зокрема, інтерфероном гамма, інтерфероном альфа та інтерфероном бета; Отже, в аналізах, заснованих на -І послідовності гамма-активації, не можна буде відрізнити активність лептиноміметика від активності, наприклад, інтерферономіметика.

Ш- Ще один спосіб аналізу іп міго заснований на химерному рецепторі, що складається з позаклітинного домену - ОВ-К, злитому з трансмембранним доменом та з позаклітинним доменом репортерного рецептора, такого як 5ор рецептор 1-3. Показано, що 1І-З-залежні клітини, які експресують вказаний химерний рецептор, можуть бути о використані для кількісного визначення лептину, який здійснює промоцію клітинної проліферації. Таким чином, 4) при експозиції з лептином вказані клітини будуть проліферовувати, і їх проліферацію можна буде визначити шляхом забарвлення МТТ або ж шляхом включення радіоактивно міченого тимідину (Мегріоедеп 5А, еї аї!., 1997,

ЕЕВЗ І ей. 405, 237). Така система аналізу надійна, вона використовується. для кількісного визначення лептину дв | придатна для широкомасштабного скринінгу. Однак молекули, відібрані у результаті такого широкомасштабного скринінгу на основі вказаного аналізу, можуть взагалі не бути лептиноміметиками. Було показано, наприклад, що

Ф) агент, який є дійсним інсуліноміметиком, виявлений у результаті широкомасштабного скринінгу, реалізовує свою ка дію шляхом взаємодії з цитоплазматичним доменом інсулінового рецептора (папа В., еї аі!., 1999, Зсіепсе 284, 974). Отже, існує ризик, що молекули, відібрані за допомогою химерних рецепторів, таких як вказаний химерний бо рецептор лептин-1І-3, будуть взаємодіяти з цитоплазматичним доменом, одержаним з химерного І -3, а отже, будуть являти собою швидше міметики ІІ -3, ніж лептиноміметики. Отже, такий шлях аналізу не придатний для скринінгу імітуючих лептин агентів, лептиноміметиків.

Лептин, продукт гена гладкості, експресується в адипоцитах та регулює поглинання їжі та енергетичний обмін через свій гіпоталамічний рецептор ОВ-КЬ. Відсутність лептину, як у випадку мишей обр/ор, або ж 65 відсутність ОВ-КЬ, як у випадку мишей ар/40, приводить до хворобливої повноти. Однак найбільш поширені випадки ожиріння у людини, не пов'язані з дефіцитом лептину. Фактично рівень лептина у сироватці корелює з показником маси тіла, а отже, гладкі індивідууми мають високий рівень лептину у сироватці. Така кореляція дає підставу вважати, що ожиріння асоціюється з деякою формою резистентності до лептину. Одним з можливих механізмів резистентності до лептину є нездатність лептину долати гематоенцефалічний бар'єр. Дійсно, інтрацеребровентрикулярне введення лептину було значно більш ефективним у зменшенні маси жирової тканини у гризунів в порівнянні з периферичними шляхами введення лептину.

Одержання лептиноміметиків, які можуть долати гематоенцефалічний бар'єр, може вирішити проблему лептинорезистентності. Для цієї цілі корисно зробити скринінг бібліотек, що складаються з нікомолекулярних агентів, з метою ідентифікації індивідуальних агентів, які мають активність лептиноміметиків. Для такого 7/0 скринінгу потрібний простий та специфічний біологічний аналіз активності лептину. Таким чином, як описано вище, біологічна активність лептину може бути визначена тільки шляхом випробування на тваринах. Такі випробування є вельми обтяжливими, і отже, не підходять для скринінгу бібліотек, які складаються з мільйонів різних речовин. Було описано декілька варіантів випробувань іп міго, але вони не були лептиноспецифічними.

Отже, існує необхідність створення простого та специфічного методу аналізу активності лептину, який легко /5 Можна буде автоматизувати.

Даний винахід, таким чином, забезпечує спосіб визначення наявності лептину або агента, що імітує дію лептину (лептиноміметика), який включає в себе приведення проби у контакт з клітиною або клітинною лінією, яка у відповідь на лептин експресує Апо-2, і кількісне визначення або Апо-2 у культуральному середовищі, або клітинної РНК, що кодує Апо-2, або активації промотору Апа 2.

Переважно використати еукаріотичну клітину або клітинну лінію, більш переважно - клітину або клітинну лінію ссавця.

Відповідними лініями клітин є, наприклад, лінії клітин диференційованих адипоцитів миші, наприклад,, лінія мишачих преадипоцитів Змізз ЗІЗ Е442А, або лінії клітин людини, наприклад, лінія стромальних клітин кісткового мозку людини пПМ52-12. сч

Відповідно до винаходу, кількісне визначення Апд-2 проводять звичайним способом у культуральному середовищі з використанням твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГ ІЗА), який включає в себе і) моноклональні та поліклональні антитіла проти Апод-2.

Такий метод ЕГІЗА можна адаптувати до сучасних методів скринінгу, таких як широкомасштабний скринінг.

Наявність Апд-2-РНК визначається у клітинах, що культивуються, або клітинних лініях звичайним способом з с

Зо Використанням ланцюгової реакції полімерази зворотної транскрипції (КТ-РСК).

Активацію промотору АМО-2 реєструють, відповідно до даного винаходу, шляхом створення конструкції, яка о містить область промотору Апд-2, яка включає в себе промотор і щонайменше один елемент лептинової «- відповіді, а також репортерний ген, оперативно зв'язаний з областю промотору, переважно вбудованою у відповідний вектор, трансфікуючий клітину хазяїна, яка експресує Апд-2 у відповідь на лептин, шляхом ї- інкубування'з пробою та кількісного визначення експресії репортерного гена звичайним способом. ї-

Даний винахід також забезпечує вектор, який містить нуклеотидну послідовність, що кодує промоторну область Апд-2, яка містить промотор і щонайменше один елемент лептинової відповіді, і репортерний ген, оперативно зв'язаний з областю промотору.

Відповідно до даного винаходу, одержані способи аналізу лептину іп міго. Такі способи підходять для « широкомасштабного скринінгу лептиноміметиків. Виявлено, що лептин специфічно індукує експресію гена з с ангіолоетину-2 у жирових клітинах, що культивуються. Широкомасштабний скринінг агентів, що імітують дію . лептину, досягається шляхом кількісного визначення рівня, секреції ангіопоетину-2, що індукується лептином, и?» за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІЗА). Альтернативно, активність лептину може бути встановлена шляхом вимірювання активації промотору ангіопоетину-2, зв'язаного з репортерним геном та Вбудованого у жирові клітини, що культивуються. -І Відповідно до даного винаходу, одержані способи аналізу лептину, іп міго. Такі способи - підходять також для широкомасштабного скринінгу лептиноміметиків. (У патентній заявці Ізраїлю Мо.131739, що спільно

Ш- розглядається, поданій 5 вересня 1999), описано, що лептин специфічно індукує експресію гена ангіопоетину-2 в - адипоцитах, що культивуються. У відсутність лептину ангіопоетин-2 в адипоцитах, що культивуються, не 5р експресується, а індукція ангіопоетину-2 під дією лептину є дуже інтенсивною і дуже специфічною. Отже, можна о кількісно визначити активність лептину та лептиноміметика, обробивши відповідні еукаріотичні клітини різними 4) дозами лептину або агентів, що імітують лептин, і потім визначивши або рівень ангіопоетину-2 у культуральному середовищі, або визначивши клітинну мРНК, що кодує ангіопоетин-2, або вимірявши активацію промотору ангіопоетину-2. Вказаними відповідними клітинами ссавців можуть бути будь-яка клітина або лінія клітин, ов експресуючих ангіопоетин-2 у відповідь на обробку лептином. Звичайно переважними клітинами хазяїв є зручні для культивування еукаріотичні клітини, переважно клітини ссавців, і в особливо переважному варіанті це

Ф) диференційовані мишачі адипоцити. Найбільш переважною лінією клітин є лінія Змізз ЗІЗ Р442А мишачих ка преадипоцитів |Сгееп, Н., апа Кепіпае, О., 1975, СеїІ 5, 191, які-диференціюються в зрілі адипоцити в умовах підтримки конфлуентних клітин у середовищі, доповненому 1095 ембріональною бичачою сироваткою (ЕБС), бо протягом шести днів. Іншою найбільш переважною лінією клітин є лінія стромальних клітин кісткового мозку, людини, пПМ52-12, які експресують рецептор лептину і можуть бути індуковані до диференціювання в.адипоцити (Ппотаз Т., еї аї., 1999; Епдосгіпоіоду 140, 1630).

Багато із загальнодоступних способів, що звичайно застосовуються можуть бути адаптовані фахівцями для визначення ангіопоетину-2 у культуральному середовищі, клітинної МРНК, що кодує ангіопоетин-2, або для 65 Кількісного визначення активації промотору ангіопоетину-2. В одному з аспектів даного винаходу розроблений метод твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІЗА) для кількісного визначення мишачого ангіопоетину-2.

Для розробки методу ЕПІЗА потрібне мишаче моноклональне антитіло для захоплення ангіопоетину-2 на планшеті ЕГІЗБА. Очищене моноклональне антитіло використовується як первинне покриття планшета Е ІЗА, щоб захопити Апд-2 з культурального супернатанта. У тварин-хазяїв (наприклад, у кролика) одержане поліклойальне антитіло проти ангіопоетину-2. Потрібно зазначити, що ангіопоетин-2, що використовується при отриманні антитіл, повинен бути одержаний у того ж самого виду, що і клітинна лінія, яка використовується для його індукції під дією лептину. Для виконання аналізу клітини, які експресують ангіопоетин-2 у відповідь на дію лептину, вирощують, наприклад, у 9б-ямкових планшетах. Зразок лептину (позитивний контроль) або передбачуваний лептиноміметик додають до культури, і протягом 24-96 годин проводять інкубування. Потім 70 відбирають аліквоти культурального середовища і переносять їх на планшети ЕЇГІ5А, які були заздалегідь покриті вказаним захоплюючим моноклональним антитілом, специфічним у відношенні ангіопоетину-2. Планшети

ЕПІЗА інкубують протягом 1-16 годин, промивають і додають вказане поліклональне антитіло проти ангіопоетину-2. Планшети ЕЇІЗА інкубують протягом 1-16 годин, промивають, і додають кон'югат фермент-антитіло. Звичайно як кон'югати використовують козячі антитіла проти імуноглобуліну кролика, /5 Кон'юговані з пероксидазою або з лужною фосфатазою. Планшети ЕГІЗА інкубують протягом 1-16- годин, промивають і виявляють додаванням відповідного субстрату. Після цього вказані планшети ЕГІ5ЗА піддають автоматизованому широкомасштабному скринінгу.

В іншому втіленні даного винаходу у вказаних клітинах, що культивуються, оброблених лептином або лептиноміметиком, визначали мРНК, що кодує ангіопоетин-2. Специфічну мишачу мРНК, що кодує ангіопоетин-2, го Можна визначити за допомогою ланцюгової реакції полімерази зворотної транскрипції (КТ-РСК).

Широкомасштабну КТ-РСК можна реалізувати, наприклад, з використанням специфічних "молекулярних маяків" (Кезеагсп Сепеїйісв; Нипівмійе АіІарата, О5БА). Існують одноланцюгові олігонуклеотиди, що містять одночасно і флуоресцентну мітку, і гасник (флуоресценції) на їх 5- та 3З3-кінцях, відповідно. Олігонуклеотид сконструйований таким чином, щоб включати в себе послідовність шпилькової петлі, комплементарну с ов послідовності КДНК ангіопоетину-2. Крім того, конструкція олігонуклеотида повинна включати у себе стовбурову" структуру шпилькової петлі, так. що коли молекулярний маяк не зв'язаний з РСК-ампліфікованою кКДНК і) ангіопоетину-2, флуорофор гаситься 3-гасником внаслідок передачі енергії, і флуоресценція не виникає. Однак якщо додати РСК-ампліфіковану кКДНК ангіопоетину-2, комплементарна петля молекулярного якоря утворює більш сильний зв'язок з РСК-продуктом-мішенню, ніж зі стовбуром. Така гібридизація приводить до с зо конформаційної зміни, яка відділяє стовбур і яка приводить до виникнення флуоресценції (Туаді 5., апа Китаг

Е.К., 1996, Майшге Віогесн., 1649). що)

Для виконання аналізу клітини, які експресують ангіопоетин-2 у відповідь на обробку лептином, вирощують, «- наприклад, у Уб-ямкових планшетах. Зразок лептину (нозитивний контроль) або передбачуваний лептино-міметик додають до культури, і протягом 24-96 годин проводять інкубування. Потім планшети ї- зв промивають, і з моношару клітин екстрагують тотальну РНК. Проводять зворотну транскрипцію РНК за ї- допомогою випадково вибраного праймера, і одержану у результаті кКДНК піддають кількісній РСК зі специфічними о мишачими ангіопоетин-2-праймерами. Кількість ангіопоетин-2-МмРНК відображає кількість

РСЕК-продукту-мішені, яка вимірюється за допомогою вказаного молекулярного маяка. Всі стадії такого аналізу допускають проведення автоматизованого широкомасштабного скринінгу. «

В іншому переважному втіленні людський або мишачий промотор ангіопоетину-2 ідентифікували та пт) с клонували з геномної ДНК способом, відомим фахівцям у даній області. Вказаний промотор та репортерний ген переважно об'єднували у тандем у реплікованому експресуючому векторі ссавців. Однак можуть зустрічатися ;» послідовності, які не заважають функціонуванню промотору ангіопоетину-2. Репортерним геном може бути будь-який ген, що кодує пептид, який легко піддається реєструванню або ж дозволяє легко реєструвати транскрипцію або трансляцію. Звичайно він кодує білок, який у клітині-хазяїні у природі не існує або ж -І продукується у клітині-хазяїні в малих кількостях. Приклади добре відомих репортерних генів включають у себе ген хлорамфеніколацетилтрансферази (САТ), зелений флуоресцентний білок (СЕР), люциферази (або

Ш- бактерійної, або люциферази світляка), та інші системи реєстрації на основі ферментів, таких як - бета-галактозидаза, лужна фосфатаза та їм подібних. В особливо переважному втіленні репортерним геном є 5ор Ген люциферази. о Конструкція репортерного гена включає в себе а) область промотору ангіопоетину-2, яка містить промотор і 4) щонайменше один елемент лептинової відповіді, та Б) репортерний ген, оперативно зв'язаний з областю промотору. її переважно вміщують у відповідний вектор, що, використовується для трансфекції клітини-хазяїна.

Вектором може служити будь-який відомий вектор, включаючи плазміди, косміди та вірусні вектори, які можуть ов функціонувати. у вибраній клітині-хазяїні. Такий вектор складає ще один аспект даного винаходу. Клітиною хазяїном може бути буд-яка клітина або клітинна лінія, яка експресує ангіопоетин-2 у відповідь на обробку (Ф, лептином. Така клітина стабільно або транзитно трансфікується вказаним репортерним вектором. Звичайно ка переважною клітиною-хазяїном є зручна для культивування еукаріотична клітина, переважно клітина ссавця, і в особливо переважному втіленні це диференційований адипоцит миші. Найбільш переважною лінією клітин є во лінія преадипоцитів миші Зм/ізз ЗТЗ3 Е442А (Огееп, Н., апа Кепіпае, О., 1975, СеїІ 5, 19), яка диференціюється у зрілі адипоцити при підтриманні конфлуентних клітин у середовищі, доповненому 1095 ембріональною бичачою сироваткою (ЕБС), протягом шести днів.

Для проведення аналізу клітину або клітинну лінію, яка експресує ангіопоетин-2 у відповідь на обробку лептином, стабільно" або транзитно трансфікують вказаним репортерним вектором. Вказані клітини зростають у 65 9б-ямкових планшетах та диференціюються. Зразок лептину (позитивний контроль) або передбачуваний лептиноміметик додають до культури, і інкубація продовжується. Через 24-96 годин у ямках визначають рівень продукту репортерного гена. У цьому аналізі активацію промотору ангіопоетину-2 визначають шляхом кількісного визначення продукту гена вказаної конструкції репортерного гена. Таким чином, рівень продукту гена відповідає рівню активності лептину або лептиноміметика.

Далі даний винахід ілюструється наступними прикладами, які ніяким чином не закликають обмежити обсяг винаходу. Навпаки, вони наведену для кращого з'ясування того, що дане рішення може включати в себе і інші питання, модифікації та їх еквіваленти, які після ознайомлення з даним описом можуть самі напрошуватися фахівцям у даній області, не виходячи за рамки даного винаходу і/або обсягу прикладеної формули винаходу.

Приклади 70 Приклад 1

Кількісний аналіз лептину та лептиноміметиків за допомогою ЕЇ ІЗА ангіогіоетину-2

Мишачі клітини Зм/ізв ЗТЗ3 Е442А піддавали зростанню та диференціюванню у 96б-ямкових планшетах. Зразок лептину (позитивний-контроль) або передбачуваний лептиноміметик додавали до культури у кінцевій концентрації Ммікрограм/мл, і продовжували інкубувати протягом 24 годин. Потім відбирали аліквоти 7/5 індукованого лептином або лептиноміметиком культурального середовища та переносили їх на планшети ЕП ІЗА, які були заздалегідь покриті вказаним захоплюючим моноклональним антитілом, специфічним у відношенні мишачого ангіопоетину-2. Мікротитраційні планшети (Оупаїесп ог Махізого, Бу Мипс) покривали антимишачим моноклональним антитілом проти ангіопоетину-2 (безсироватковий супернатант гібридомних клітин або імуноглобуліни асцитної рідини) та витримували протягом ночі при 4С. Планшети промивали РВ5, який містить ЕБС (0,595) та Тмеєп 20 (0,0590), і замикали у тому самому розчині щонайменше на дві години при 3720. Потім відбирали аліквоти індукованого лептином або лептиноміметиком культурального середовища, і переносили їх на планшети ЕГІ5ЗА (10Омікролітрів/ямку) на 4 години при 372С. Потім планшети тричі промивали РВ5, який містить Тжмееп 20 (0,0595), а потім додавали кролячу антисироватку проти мишачого ангіопоетину-2 (1:1000, 100 мікролітрів/'ямку) і продовжували інкубувати протягом ночі при 4 «С. Планшети тричі промивали, після чого у Ге кожну ямку додавали кон'югат антикролячих козячих антитіл з пероксидазою хрону (НЕР, дасквгоп І арв. 1:10,000, (5) 10Омікролітрів/'ямку), і інкубували протягом 2 годин при кімнатній температурі. Планшети чотири рази промивали, після чого забарвлення розвивалося під дією АЕТ5 (2,2'-азино-біс(З-етилбензтіазолін-б-сульфонової кислоти, Зідта), з використанням Н 205 як субстрату. Планшети готові для зчитування за допомогою автоматичного зчитуючого пристрою для ЕЇГ ІЗА. (зе)

Приклад 2 ю

Аналіз лептину та лептиноміметиків за допомогою КТ-РСК ангіопоетину-2

Мишачі клітини Змізз ЗТЗ Е442А піддавали зростанню та диференціюванню у 9б-ямкових планшетах. Перед ч- стимуляцією лептином клітини підтримували у середовищі з низьким вмістом сироватки (0,595) протягом 16 М годин. Лептин (1Імікрограм/мл (позитивний контроль)) або, передбачуваний - лептиноміметик додавали до культури та продовжували інкубувати протягом 24 годин. Планшети осушували, і за допомогою набору реагентів їх»

ТК ш(Моіесціаг Кезеагсп Сепіег пс.) виділяли тотальну РНК. Зворотну транскрипцію проводили у 2Омікролітрових об'ємах за допомогою зворотної транскриптази ЕТ-РНКази (Зирегзосгірі ІІ, СІВСО-ВКІ, ОА), використовуючи 1мкг випадково вибраного праймера (М)б (Мем Еподіапа Віоїарв. ОА). Аліквоту (2мікролітри) « продукту зворотної транскрипції використовували для РОК з ДНК-полімеразою МЕМТ (Мем Епадіапа Віоіарв) та зі смисловим та антисмисловим праймерами: ти-ангіопоетин-2-МРНК, АР4326.94р го, нуклеотиди 637-657 та З с 1147-1167, відповідно. Термінування реакцій РСК проводили до насичення. Продукти РОК виділяли, у 1М Масі "» денатурували при 722С та проводили гібридизацію при 522 з утворенням молекулярного маяка, що має " наступну структуру: 5'-родамін-ССТОАО-СТОСАСААСААОСТООТОАСА-СТСАСС-3'-дабцил.

Петля відповідає нуклеотидам 898-918 мишачої мРНК ангіопоетину-2, реєстраційний МО.АРО04326, а ш- температура плавлення (Тт) структури стовбур-петля становить 61,620. -І Флуоресцентна проба відповідає тим культурам, які у відповідь на дію лептину експресували мРНК ангіопоетину-2. - Приклад З «сл 20 Аналіз лептину та лептиноміметиків за допомогою репортерного вектора

Мишачі преадипоцити Змізз ЗТЗ3 Е442А стабільно трансфікували репортерним вектором, що складається з с» повної області, промотору мишачого ангіопоетину-2 навпроти гена зеленого флуоресцентного білка (СЕР).

Клітини піддавали зростанню та диференціюванню у 9б-ямкових планшетах. Зразок лептину (позитивний контроль) або передбачуваного лептиноміметика додавали до культури та продовжували інкубувати. Поява 22 зеленої флуоресценції вказувала на те, що клітинна культура відповідала на дію лептину або агента, що імітує (ФІ дію лептину.

Приклад 4 о Аналіз лептину або лептиноміметиків за допомогою репортерного вектора

Стромальні преадипоцити людини пМ52-12 стабільно трансфікували репортерним вектором, що складається 60 з повної області промотору людського ангіопоетину-2 навпроти гена зеленого флуоресцентного білка (СЕР).

Клітини піддавали зростанню та диференціюванню у 9б-ямкових планшетах. Зразок лептину (позитивний контроль) або передбачуваного лептиноміметика додавали до культури та продовжували інкубувати. Поява зеленої флуоресценції вказувала на те, що клітинна культура відповідала на дію лептину або лептиноміметика. б5

Claims

Формула винаходу

1. Спосіб визначення присутності лептину або лептиноміметика, який включає в себе приведення у контакт проби з клітиною або клітинною лінією, яка експресує ангіопоетин-2 (Апод-2) у відповідь на лептин, і кількісне визначення або Апд-2 у культуральному середовищі, або клітинної РНК, що кодує Апо-2, або активації промотору Апад-2.

2. Спосіб за пунктом 1, де використовується еукаріотична клітина або клітинна лінія.

3. Спосіб за пунктом 2, де еукаріотична клітина або клітинна лінія є такою ссавця.

4. Спосіб за пунктом 3, де клітинна лінія вибрана з ліній клітин диференційованих адипоцитів миші.

5. Спосіб за пунктом 4, де клітинна лінія являє собою лінію мишачих преадипоцитів Зм/ізз ЗТЗ Е442А.

6. Спосіб за пунктом 3, де клітинна лінія вибрана з ліній клітин людини.

7. Спосіб за пунктом 6, де клітинна лінія являє собою лінію стромальних клітин кісткового мозку людини пмМ52-12.

8. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де Апд-2 кількісно визначають у культуральному середовищі 75 звичайним способом за допомогою імунного аналізу.

9. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де Апд-2 кількісно визначають у культуральному середовищі звичайним способом за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу (ЕПІЗА), який включає в себе моноклональні та поліклональні антитіла проти Апод-2.

10. Спосіб за пунктами 8 або 9, адаптований для широкомасштабного скринінгу.

11. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-7, де присутність Апд-2-РНК визначають у клітинах, що культивуються, або клітинних лініях звичайним способом за допомогою полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскрипцією (КТ-РСК).

12. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-7, де активацію промотору Апд-2 реєструють шляхом конструювання вектора, що містить область промотору Апд-2, яка включає в себе промотор і щонайменше один елемент Ге! лептинової відповіді, і репортерний ген, оперативно зв'язаний з областю промотору, трансфекції (5) клітини-хазяїна, яка експресує Апд-2 у відповідь на лептин, інкубування у присутності зразка та кількісного визначення експресії репортерного гена звичайним способом.

13. Вектор, який включає у себе нуклеотидну послідовність, що кодує промоторну область Апд-2, яка містить промотор і щонайменше один елемент лептинової відповіді, і репортерний ген, оперативно зв'язаний зобластю (9 промотору. р рУ ю Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних ж мікросхем", 2006, М 11, 15.11.2006. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і м науки України. і -

- . и? -і -і - 1 сю» іме) 60 б5