UA77157C2 - Polypeptide anti-egfrviii scfvs with improved cytotoxicity and output, molecule of nucleic acid, that codes the indicated polypeptide, and method of cell destructure with using of this polypeptide - Google Patents

Description

Опис винаходу

Мутантна форма рецептора епідермального фактора росту, позначеного як "ЕСЕКМІЇЇ", експресується на 2 високому рівні у 50-609о гліобластом та, як було показано, присутня у 70-80956 карцином молочної залози та яєчника, а також у приблизно у 1695 недрібноклітинних карцином легень |(М/іКквігапа еї аї. // Сапсег Кез. - 1995/ - 55/ - Р. 3140-3148; Мозсайейо еї аЇ. // Сапсег Кев. - 1995. - 55. - Р. 5536-5539). Мутація складається з делеції у рамці екзонів 2-7 поблизу амінотермінального кінця екстрацелюлярного домену, що приводить до експресії МРНК ЕСЕК з делецією 801 основи. Мутантний білок містить новий гліциновий кодон у місці 70 сплайсингового злиття ІМозсаїйїейо еї а). // Сапсег Кевз. -1995. - 55. - Р. 5536-5539). Мутантний рецептор експресується на поверхні клітин та створює новий специфічний для пухлин епітоп (послідовність) на поверхні клітин при делеційному злитті. Рецептор має конститутивну тирозинкіназну активність, що посилює онкогенність гліобластоми іп мімо |Мізпікаула еї аїЇ. // Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА. - 1994. - 91. Р. 7727-7731). Завдяки наявності пухлиноспецифічної екстрацелюлярної послідовності, мутантний рецептор представляє собою 12 привабливу потенційну мішень для терапії пухлин, зокрема, шляхом використання імунотоксинів.

Імунотоксини одержують при злитті націлювального залишку, такого, як антитіло або частина антитіла, з білковим токсином таким, як екзотоксин Рзецдотопаз. Як було продемонстровано, імунотоксини мають активність проти солідних пухлин у людини, що було показано при клінічному дослідженні фази І, в якому імунотоксин, одержаний при використанні антитіла, специфічного для У-асоційованого антигену Левіса, надекспресувався у багатьох пухлинах, демонструючи регресію пухлини |Раї еї аї. // Маї Меа. - 1996. - 2. - Р. 350-353). Імунотоксини, такі, як один з описаних у дослідженні Раї, що були створені на основі мишиного моноклонального антитіла, проте, мали певні недоліки. Вони є відносно великими, що обмежує їх проникнення у пухлину. Крім того, часто існує гетерогенність зв'язку антитіла та токсину, і важко одержувати кон'югати у великій кількості. Подібно до цього, різноманітні антитіла проти ЕСЕКМІЇЇ, що відомі у даній галузі, мають с 29 обмеження для конструювання імунотоксинів (05, 5,212,290; МО, 96/16988; Кеїві еї аї. / Сапсег Кев. - 1995. - Ге) 55. - Р. 4375-4382). Спроби подолати ці проблеми шляхом створення повністю рекомбінантних імунотоксинів, в яких клонований Ем використовували для націлювання, були затруднені, оскільки більшість варіабельних доменів антитіла слабо функціонує як Ем або оскільки існує нестабільність завдяки ослабленню асоціації М н-М. або з причини слабкої зв'язувальної активності. в

МА є одноланцюговим варіабельним доменом антитіла (зсЕм), що специфічно зв'язується з ЕСЕЕМІІ. МК1 ю

ЗСЕМ було ізольовано з бібліотеки фагового виявлення антитіл (І огітег еї аЇ. // Ргос. Май. Асад. сі. О5А. 1996. - 93/ - Р. 14815-14820). Бібліотеку зсЕм, що містить МК1, готували з мРНК селезінки миші, яку було -- імунізовано за допомогою ЕСЕКМІЇЇ специфічного пептиду плюс екстрацелюлярний домен ЕСЕКМІЇЇ, очищений ча шляхом афінної хроматографії з пухлинних ксенотрансплантантів, що експресують ЕСЕРМІЇ (І огітег еї аї. //

Сп. Сапсег Кев. - 1995. - 1. - Р. 859-864). МК1 удосконалювали як перспективний препарат для одержання в терапевтичного агента, який буде специфічно націлений на ЕСЕКМІІІ-позитивні пухлинні клітини. Послідовність

МА було депоновано у СепВапкК під депозитним номером 076382.

Імунотоксин МК1(Ем)-РЕЗ8 було сконструйовано шляхом злиття МК1 зсЕм з вкороченою формою екзотоксину «

А Рзепйдотопаз, РЕЗ8, в якому увесь домен Іа та амінокислоти 365-380 домену ІБ було делетовано | огітег еї а). З у Рос. Май. Асай. Зсі. О5А. - 1996. - 93. - Р. 14815-14820). Декілька інших рекомбінантних імунотоксинів с РЕЗ8 зараз піддають клінічним дослідженням (|Кгейтап еї аїЇ. // Віоса. - 1999. - 94(10). - Р. 3340-3348; з» Раі-Зспепт ей а). // Сп. Сапсег Кев. (готується до друку) (1999); Раї ей аїЇ. // Сііп. Арріїсайоп

Іттипоїохіпе. - 1998. - 234. Р. 83-96). Взагалі, гени зсЕбм поєднують з геном РЕЗ8 за допомогою короткого лінкеру та клонують в експресійний вектор, що базується на 17. Рекомбінантні імунотоксини експресували в

Е.соїї, де вони акумулювались у тільцях включення. Після інтенсивного промивання тілець включення їх і розчиняли у гуанідин гідрохлориді, а білок піддавали ренатурації та очищали за допомогою іонно-обмінної -І хроматографії та гель-фільтрації. Одержані молекули є активними та спрямовані на специфічний клітинний антиген за допомогою зсгУ. Загибель клітин було спричинено активністю токсину. - Для того, щоб бути корисними як терапевтичні агенти, імунотоксини повинні мати високу афінність для с 20 антигену, що приводить до високої цитотоксичності по відношенню до клітин, що експресують антиген. Для полегшення обробки та заощадження коштів також бажано, якщо імунотоксин має можливість вироблятись з тм високим виходом. МК1(зсЕм)-РЕЗ8 володіє найвищою афінністю, представляє собою найбільш цитотоксичний імунотоксин, спрямований проти клітин, що експресують ЕСЕЕМІЇ, але він далекий від ідеалу. Він має Ка 8нм та вихід менше, ніж 395. Таким чином, було б бажаним розвивати антитіла, які зв'язуються з ЕСЕРМІЇЇ з більшою 29 афінністю, та які, коли зливаються з РЕЗ8 або іншими токсинами, утворюють імунотоксини з високою

ГФ) цитотоксичністю по відношенню до клітин, що експресують ЕСЕКМІЇЇ. Крім того, було б корисним одержати антитіла, які утворюють імунотоксини з високим виходом. о Деякі спроби вирішити ці проблеми шляхом розвитку додаткових зсЕм з моноклональних анти-ЕСЕЕМІЇ антитіл не були успішним. МК! залишається єдиним зсЕм, доступним у даній галузі для націлювання 60 анти-ЕСЕВМІЇ імунотоксинів.

В одному аспекті винахід забезпечує антитіла з поліпшеним зв'язуванням для мутантної форми рецептора епідермального фактора росту, що відомий як ЕСЕКМІІІ. Зокрема винахід забезпечує поліпептиди з мутованими варіабельними ділянками важких ланцюгів (Му) антитіла або з мутованою ділянкою легких ланцюгів (М,), такий поліпептид має Ка для ЕСЕКМІ 7нНМ, бнНМ, 5нНМ, 4нМ, 3.5нМ, ЗНМ або нижче, мутовані Мн або М, мають бо послідовності, які відрізняються від таких (М н або М,) МК1 вихідного антитіла, відповідно, амінокислотними замінами, принаймні, однієї амінокислоти у ділянці, що визначає комплементарність (СОК), при цьому амінокислота кодується кодоном, який включає нуклеотид, що належить до ділянки гарячої точки, вибраний з

АСУ або КОСУМУ, дек є А або 0, У є С або Т, та МУ є А або Т. У деяких втіленнях заміна може відбуватись у М н

СОМ або М. СОКЗ. В інших втіленнях заміни можуть відбуватись у Мн СОКІ1 або Мн СОК2 або обох, або у М

СОК! або М, СОКЗ, або обох, або у будь-якій комбінації Мн та М. СОКТ, 2, та 3. Наприклад, в одному втіленні заміни можуть виникати у М. СОКЗ, М СОК2 та Мн СОМ.

У бажаному втіленні поліпептид має заміну у Мн СОКЗ, принаймні, однієї амінокислоти, вибраної з групи, яка складається з 598 та 799. В інших бажаних втіленнях заміни вибрані з РО8-УХ99, РО8-М99, РОВ8-КМУ99, РОВ-199, 7/0. Р98-Е99 та РУ8-У99. Поліпептид також може мати заміну у М. СОКЗ, де УУ заміщує Е у положенні 92. В особливо бажаному втіленні поліпептид має заміни у важкому ланцюгу 598Р-Т99У та у легсому ланцюгу, що включає заміну Е92МУ (що визначає антитіло, позначене "МК1-1").

Поліпептид, описаний вище, може бути одноланцюговою варіабельною ділянкою антитіла ("взсгУ"), дисульфідно стабілізованим Ем, Раб, Е(арБ)» або іншим фрагментом антитіла, який, зберігає здатність /5 впізнавати антиген та зв'язуватись з ним. Вони можуть також включати поверхневий білок бактеріофага.

У бажаних втіленнях поліпептиди, описані вище, мають Ка для ЕСЕКМІЇ, принаймні, на 1НМ нижче, ніж таке для МК. Поліпептиди можуть мати Ка 7, 6, 5, 4, 3,5, З або нижче.

Поліпептиди, описані вище, можуть також бути злиті, приєднані або іншим чином зв'язані з молекулою ефектора, терапевтичним залишком, або міткою, що детектується. Терапевтичним залишком може бути токсин або цитотоксична частина токсину ("токсичний залишок"), який перебуває у зв'язку з поліпептидними формами імунотоксину. Токсичний залишок може бути дифтерійним токсином або цитотоксичним фрагментом останнього, сапорином, противірусним білком фітолакки американської рицином або цитотоксичним фрагментом останнього, та бріодином 1. У бажаних втіленнях токсин є екзотоксином Рзепдотопаз ("РЕ") або цитотоксичним фрагментом РЕ. В особливо бажаних втіленнях РЕ представляє собою РЕЗ8. Імунотоксини, що утворюються сч комбінацією поліпептиду та токсичного залишку, можуть мати ІСво 7нг/мл або нижче, бнг/мл або нижче, 5нг/мл або нижче, 4нг/мл або нижче, близько З,Б5нг/мл або нижче. Імунотоксин може мати вихід при рекомбінантній (8) експресії, принаймні, 395, та може бути 495, 5905, 690, 790, 895, 995, 1095 або вище.

Винахід також забезпечує молекулу нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид з мутованими ділянками варіабельного важкого ланцюга (Мн) або мутованою ділянкою легкого ланцюга (М |), або обох, кожний М зо поліпептид має Ка для ЕСЕРМІЇ 7 або нижче, мутовані Мн або М,, мають послідовність, яка відрізняється від Мн або М, вихідного антитіла МК, відповідно, амінокислотною заміною, принаймні, однієї амінокислоти у ділянці, що) що визначає комплементарність (СОК), при цьому амінокислоти кодується кодоном, який включає нуклеотид, що «с ди належить до ділянки гарячої точки, вибраний з АСУ або КОСУМУ, дек є А або б, У є С або Т, а МУ є А або Т. У деяких втіленнях заміна може відбуватись у МН СОКЗ або М. СОКЗ. В інших втіленнях заміни можуть відбуватись ї- з5 У Мн СОКТ або Му СОК2О, або обох, або в М. СОК1 або М. СОК2, або обох, або у будь-якій комбінації Мн та Мі ча

СОКТ, 2 та 3. Наприклад, в одному втіленні заміни можуть відбуватись у М. СОКЗ та Мн СОК1.

У бажаному втіленні молекула нуклеїнової кислоти кодує поліпептид, що має заміни у Мн СОКЗ у порівнянні з МК1 принаймні однієї амінокислоти, вибраної з групи, яка складається з 598 та 799. В інших бажаних втіленнях заміни вибрані з РО8-УХ99, РО8В-МО9, РО8-М/99, РОВ8-І99, РО8-Г99 та РО8-У99. Молекула нуклеїнової «

Кислоти може також кодувати поліпептид, що має заміну у М. СОКЗ порівняно з МК, та включає Р, заміщенена с МУ, у положенні 92.

Молекули нуклеїнової кислоти можуть кодувати поліпептиди, які є одноланцюговими варіабельними ;» ділянками антитіла ("зсЕУ"), дисульфідно стабілізованими Ру, Раб, К(аб')», або іншими фрагментами антитіла, що зберігає здатність до впізнання та зв'язування антигену. Поліпептиди можуть також включати поверхневий білок бактеріофага. Молекули нуклеїнової кислоти, описані вище, можуть бути оперативно зв'язані з промотором. -І В іншому наборі втілень винахід забезпечує способи знищення клітини, що несе антиген, включаючи контакт клітини з імунотоксином, що містить токсичний залишок та залишок для націлювання, який включає поліпептид з

Ш- мутованими варіабельними ділянками важкого ланцюга антитіла (Мн) або мутованою ділянкою легкого ланцюга - (Му), або обох, при цьому ці поліпептиди мають Ка для ЕСЕКМІЇЇ 7НМ або нижче, мутовані М та Мі мають послідовності, які відрізняються від таких для М н та М, вихідного антитіла МК, відповідно, амінокислотною о заміною, принаймні, однієї амінокислоти у ділянці що визначає комплементарність (СОК), при цьому

І амінокислота кодується кодоном, що включає нуклеотид, який належить до ділянки гарячої точки, вибраний з групи, що включає АСУ або КОУМУ, де К є А або б, У є С або Т, а МУ є А або Т. У деяких втіленнях заміни можуть відбуватись в Мн СОКІ або Мн СОК2, або обох, або в М. СОКІ або М. СОК2, або обох, або у будь-якій 5Б комбінації Мн та М. СОМ, 2, З.

У бажаному втіленні спосіб передбачає націлювання залишку, що включає поліпептид, який має заміну у Мн (Ф) СОКЗ, принаймні, однієї амінокислоти, вибраної з групи, яка складається з 598 та 799. В інших бажаних ка втіленнях націлювальний залишок включає поліпептид, що містить заміни, вибрані з РО8-99, РО8-М99, РО8-М/99,

РОВ8-199, РО8-Е99 та РУО8-У99. В особливо бажаному втіленні націлювальний залишок є МК1-1. во Націлювальний залишок може бути одноланцюговою варіабельною ділянкою антитіла ("зсгУ"), дисульфідно стабілізованим Ем, Раб, К(аб)» або іншим фрагментом антитіла, який зберігає здатність до впізнання антигену та зв'язування з ним.

Клітина, що несе антиген, може бути пухлинною клітиною, такою, як клітина гліоми, клітина карциноми молочної залози, клітина карциноми легень, або клітина карциноми яєчника. 65 Короткий опис малюнків

Фіг.1. Стратегія для ПЛР конструювання мутантних бібліотек: А. РСАМТАВ5ОЕ-МКІ може застосуватись як матриця для ампліфікації при використанні розміщеного вище праймера 51 та розміщеного нижче праймера

СОКЗН Ь, а або ї, що містять вироджені ділянки (ММ5) у націлювальних зонах. В. рСАМТАВБЗЕ-МА1 застосовували як матрицю для ампліфікації, використовуючи продукти реакції етапу А як розміщені вище праймери та нижче розміщений праймер АМВМ. С. Продукти реакції В перетравлювали та клонували у рРСАМТАВ5БЕ.

Фіг.2. ВІАсоге сенсограмма МК1, МК1-1 та МК1 з З98Р-Т99У мутаціями у Мн СОКЗ.

Фіг.3. Виживання атимічних пацюків з інтракраніальними пухлинами людських клітин гліобластоми, трансфікованих ЕСЕРЕМІЇЇ, обробленим МК1-1-націленим імунотоксином. Вісь У показує процент тварин, що 7/0 вижили у даній точці часу. Вісь Х показує час виживання у днях. Напис МК1-1 означає МК1-1-РЕЗ8 імунотоксин.

Заштриховані ромби - тварини, яким вводили бмкг МК1-1-РЕЗ8 імунотоксину протягом 7-денного періоду шляхом 24-годинної інфузії. Незаштриховані трикутники - тварини, яким вводили 2мкг МК1-1-РЕЗ8 імунотоксину протягом того самого періоду часу. Незаштриховані кола - тварини, яким вводили фізіологічний розчин у той самий період часу.

Фіг4. Виживання атимічних пацюків з інтракраніальними пухлинами людських клітин гліобластоми, трансфікованих ЕСЕКМІІ, обробленим МЕК1-1-націленим імунотоксином або контрольним фізіологічним розчином. Вісь У показує процент тварин, що вижили у даній точці часу. Вісь Х показує час виживання у днях.

Напис МЕК1-1 означає МК1-1-РЕЗ8 імунотоксин. Незаштриховані ромби - тварини, яким вводили 0,2мкг

МЕ1-1-РЕЗ8 імунотоксину (у 200О0мкл РВБ5) протягом 7-денного періоду шляхом 24-годинної інфузії. Незаштриховані трикутники - тварини, яким вводили 0,бмкг МК1-1-РЕЗВ імунотоксину протягом того самого періоду часу. Незаштриховані кола - тварини, яким вводили 2,0мкг МК1-1-РЕЗ8 імунотоксину тим самим чином. "Х" - тварини, яким вводили контрольний фізіологічний розчин тим самим чином.

Фіг.5. Виживання атимічних пацюків з неопластичними менінгітами з одержаних за допомогою інтратекальної ін'єкції людських клітин гліобластоми, трансфікованих ЕСЕКМІІІ, обробленим МК1-1-націленим імунотоксином сч або фізіологічним розчином як контролем. Вісь У показує процент тварин, що вижили у даній точці часу. Вісь Х показує час виживання у днях. Напис МК1-1 означає МК1-1-РЕЗ8 імунотоксин. Трикутники - тварини, яким і) вводили 2мкг МК1-1-РЕЗ8 імунотоксину у 40мкл РВ5 з 0,295 гемаглютиніну на 3, 5 та 7 дні після пухлинної ініціації, при загальній дозі бмкг. Ромби - тварини, яким вводили їмкг МК1-1-РЕЗ8 імунотоксину у 40мкл РВ5 з 0,295 гемаглютиніну на З, 5 та 7 дні після пухлинної ініціації при загальній дозі Змкг імунотоксину. Кола - М зр тварини, яким вводили 4Омкл РВ5З з 0,295 гемаглютиніну на 3, 5 та 7 дні після пухлинної ініціації, як контрольні.

Фіг6. Об'єми пухлин протягом періоду часу у атимічних мишей, яких піддавали ін'єкції у правий бік о людськими клітинами гліобластоми, трансфікованими ЕСЕРМІЇ, та обробці МК1-1-націленим імунотоксином або -« др фізіологічним розчином як контролем. Вісь У показує об'єм пухлини у мм 3. Вісь Х показує час у днях від ініціації обробки (тварин піддавали ін'єкції клітинами пухлини протягом 7 днів перед днем "0"). Напис МК1-1 - означає МК1-1-РЕЗ8 імунотоксин. Площі - тварини, яким вводили мкг болюсної ін'єкції МЕК1-1-РЕЗВ - імунотоксину у 20мкл на 0, 2 та 4 дні для загальної дози Змкг імунотоксину. Праві верхні трикутники - тварини, яким вводили 2мкг болюсної ін'єкції МК1 -1-РЕЗ8 імунотоксину на 0, 2 та 4 дні для загальної дози бмкг імунотоксину. Нижні трикутники - тварини, яким вводили Змкг болюсної ін'єкції МК1-1-РЕЗ8 імунотоксину у « 20мкл фізіологічного розчину на 0, 2 та 4 дні для загальної дози Умкг імунотоксину. Ромби - тварини, яким 70 вводили 20мкл болюсної ін'єкції фізіологічного розчину на 0, 2 та 4 дні, як контрольні. - с Даний винахід забезпечує зсЕм антитіла та інші антитіла з вищою афінністю для ЕСЕРМІЇ, ніж така для МА. ц Він також забезпечує імунотоксини з вищою цитотоксичністю для клітин, що експресують ЕСЕРМІЇЇ, ніж така тих "» самих імунотоксинів при використанні МК1 як націлювальної частини молекули. Антитіла створюють з МК1, але вони є мутованими у зонах гарячої точки ділянок, що визначають комплементарність (СОК). На подив, імунотоксини, що містять ці мутовані форми МАК1 як націлювальний залишок, не тільки мають високу афінність -І для ЕСЕКМІЇ, але також можуть бути одержані зі значно вищими виходами, ніж подібні імунотоксини, що використовують МК як націлювальну частину молекули. 7 Лімітуючим фактором для конструювання бібліотек антитіл з рендомізацій у СОК є велика кількість залишків, - що складають СОК. Оскільки структури рентгенівського проміння недоступні для більшості антитіл, звичайно не було спроб ідентифікувати кілька СОК залишків, в яких мутації можливо використовувати для забезпечення і-й вищої афінності варіантів. Тому необхідно сконструювати гранично великі рендомізовані (випадкові) бібліотеки "І для забезпечення ізоляції варіантів з високою афінністю.

В ілюстративних вивченнях мутації проводили у СОКЗ варіабельної ділянки (М н) важкого ланцюга МК1. Ун

СОМКЗ МК1 має одинадцять амінокислотних залишків. Кінцеві два залишки Мн ділянки, 0101 та М102, були

ВИиКЛЮЧені з дослідження мутагенезу, оскільки їх вважають неможливими для участі у антигенному зв'язуванні з двох причин. Перша полягає у тому, що ці два залишки, звичайно, лежать на межі розділу М, ланцюга. В

Ф, результаті, їх не піддавали обробці. По-друге, ці залишки роблять свій внесок до .) сегменту та подальшої ко 3З-з'єднувальної ділянки Мн СОК2. В результаті цього вони є відносно більш консервативними, ніж решта Мн

СОокЗ. во Інші дев'ять амінокислот у кожному положенні М я СОМКЗ були заміщені кожною з інших природних амінокислот. Вивчення показало, що тільки мутації у ділянках, відомих як гаряча точка (ділянки, відомі як такі, що піддаються гіпермутації під час розвитку афінності антитіла, найкраще характеризуються ділянками

КОУМ та АСУ, дек є А або 0, У є С або Т, та МУ є А або Т), що приводить до утворення антитіл з вищою цитотоксичністю, ніж для вихідного антитіла МК1. Мутації також були знайдені для підвищення виходу 65 імунотоксину, коли ці мутовані зсЕм були вбудовані в імунотоксини, у порівнянні з подібним імунотоксином, що був одержаний з зсЕм вихідного МК7І. У подальших дослідженнях одержували мутації СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга МК. У цих дослідженнях мутації були зроблені тільки стосовно амінокислот усередині гарячої точки. Мутації приводили до утворення антитіл з вищою цитотоксичністю та виходом, ніж для вихідного антитіла МК1.

Базуючись на цих результатах, немає необхідності рендомізувати кожний залишок у СОК для ідентифікації тих, де мутації будуть приводити до утворення варіантів з більшою афінністю. Передбачається, що мутації у гарячих точках Мн та М. СОКІ1 або СОК2 будуть також приводити до утворення антитіл з поліпшеною афінністю для ЕСЕКМІ, поліпшеною цитотоксичністю для клітин, що експресують ЕСЕКМІІЇ при вбудовуванні в імунотоксини, та покращувати вихід імунотоксинів, що містять такі зсЕм у порівнянні з імунотоксинами, що 70 базуються на МК1. Оскільки поліпшені властивості забезпечуються завдяки замінам амінокислот, такі самі позитивні ефекти будуть виявлятись у випадку, коли ці мутовані форми МК (включаючи такі, що мутовані у Мн та Му СОКЗ) вбудовані у дисульфідно стабілізовані Ем (азу), або у Раб", (аб) або Раб.

Збільшена цитотоксична активність необов'язково корелює зі збільшеною афінністю (табл. 4 та табл. 5).

Немає очевидного пояснення цій відсутності кореляції. Окрім зв'язувальної афінності, яка звичайно вимірюється 7/5 при 222С, існує багато аспектів у токсичному процесі, на які впливають мутації у гарячій точці. Такі аспекти включають стабільність при 372С, величину засвоєння, протеолітичну обробку та перенос до компартментів, що необхідні для транслокації. Можливо, що вплив буде поширюватись на один з цих або більше аспектів. Проте, антитіла з вищою афінністю для ЕСРЕМІЇЇ є корисними для різноманітних цілей, особливо для діагностичних цілей та при аналізах іп мйго для визначення присутності або відсутності клітин, що експресують ЕСЕКМІЇІ у зразку. Наприклад, при використанні іп міго такого антитіла як зсЕм, що має з вищу афінність для ЕСЕКМІЇ, воно може бути кон'юговане з радіонуклідами або з будь-якими іншими мітками, що визначаються та можуть використовуватись для визначення присутності клітин, що експресують ЕСЕКМІЇ у зразках біопсії від пацієнтів для визначення того факту, що пухлина ще не була знищена у пацієнта, який, як відомо, мав таку пухлину.

Подібно до цього, при використанні іп мімо зсЕм, азЕм або інших антитіл згідно з винаходом, вони можуть бути Га

Кон'юговані з радіонуклідами або іншими мітками, що детектуються, та використовуватись для визначення присутності клітин, що експресують ЕСЕКМІІ у пацієнта, і таким чином, діагностики, чи має пацієнт пухлину, і) що характеризується присутністю таких клітин, або, що пухлина не була знищена у пацієнта, який, як відомо, мав таку пухлину.

На завершення однією визначною відмінністю, що спостерігається серед СОК мутантів, був заключний вихід ч- активного мономерного білка. Рекомбінантні токсини акумулюються у тільцях включення як нерозчинний агрегований білок. Активні мономери одержують шляхом розчинення тілець включення у ЄМ Гуанідин НОЇ, після юю цього проводять контрольовану ренатурацію у редокс-системі та відокремлення мономерів від мультимерів та «-- агрегатів. Вивчення показало, що мутації у 1 або 2 амінокислотах у СОК можуть значно збільшувати вихід імунотоксину (табл. 6), як визначається та пояснюється нижче. Вихід МК1(Рм)-РЕЗ8 складає тільки 295, але т значно збільшується до 17905 при використанні СОКЗ важкого ланцюга, що містить мутації ЗО8Р-Т995. Очевидно, /-|че ці мутації мають глибокий вплив на спосіб зборки. Взагалі, усі мутанти важкого ланцюга, ізольовані при початковому мутагенезі важкого ланцюга, мали більший вихід, ніж вихідний МК1. Таким чином, СОКЗ важкого ланцюга є дуже важливим для процесу самозборки, а фагові експресійні системи можуть вибиратись певним « чином для білків, що збираються більш ефективно. Таким чином, фаг буде містити кращим чином зібрані Гм, які будуть присутніми у більшій кількості, і вони будуть переважно збагаченими під час пенінгу антигену. - с Базуючись на цих результатах, можна очікувати, що фаг може використовуватись для вибору Ру, мутованих у ц СОКІ або СОК2 Мун та М, ланцюгах, які подібним чином демонструють збільшення продукційного виходу у "» порівнянні з вихідним МК зсгЕм.

Тести іп мімо проводили для визначення ефекту зразкових імунотоксинів, націлених за допомогою МК1-1 на тваринних моделях людських пухлин. Для введення пухлин атимічним пацюкам та мишам вводили -І інтракраніально, інтратекально або підшкірно клітини людської гліабластомної клітинної лінії (087Мо), яку трансфікували для експресії ЕСЕРМІіІ (трансфікована клітинна лінія, що експресує ЕСЕМКМІЇЇ, позначена як

О87МО.АЄСЕКМІЇЇ, вона була описана у |Мізпікажма еї аї. // Ргос Май. Асад. Зсі. ОБА. - 1994. - 91(16). - Р. - 7727-1731) Після утворення пухлин пацюків та мишей лікували за допомогою болюсних ін'єкцій або безперервних інфузій різних доз імунотоксину. Як описано у прикладах нижче та Фіг.3-6, незважаючи на

Мн локалізацію пухлини та спосіб призначення імунотоксину, тварини, що одержували імунотоксин у дозах мкг або "А 2мкг, показали помітно менший пухлинний ріст та більший період виживання, ніж тварини, яким вводили контрольний фізіологічний розчин.

Одиниці, слова та символи наведені У Міжнародній Системі Одиниць (СІ) у прийнятній формі. Нумераційні інтервали є такими, що включають номери, визначені у інтервалах. Якщо інше не зазначене, нуклеїнові кислоти записані зліва направо у 5-3" орієнтації; амінокислотні послідовності записані зліва направо у напрямку від о аміно- до карбокси кінця. Заголовки, що наведені у заявці, не є обмеженнями різних аспектів або втіленнями іме) винаходу і можуть вводитись як посилання на опис у цілому. Таким чином, терміни, визначені безпосередньо нижче, більш повно визначаються посиланнями на опис в його цілісності. во Мутовані залишки відомих послідовностей умовно позначають за допомогою однобуквеного коду залишку, що звичайно знаходиться у визначеному положенні послідовності, положення у послідовності мутованих залишків, та залишку, що заміщує вихідний залишок. Таким чином, відносно СОКЗ Му МК термін "З98Р" вказує, що серін, який у нормі знаходиться у положенні 98 нормального СОКЗ важкого ланцюга МК, було мутовано у пролін. Позначення, таке, як "598", в якому після номера не вказується посилання на залишок, означає, що 65 залишок у нормі знаходиться у цьому положенні нормальної послідовності пептиду, або, що цей специфічний залишок зараз присутній у цьому положенні (тобто, що позначений залишок був заміщений на залишок, що у нормі присутній у цьому положенні). Яке використання розуміють у даній заявці буде ясно з контексту заявки.

Посилання у даній заявці на певні пронумеровані амінокислотні залишки МАК1-1 відносяться до залишків, пронумерованих згідно з Кабат. Послідовність білків, що представляють імунологічний інтерес, Департамент здоров'я та обслуговування населення США (1987). Це посилання далі вказується як "Кабраї", зміст якого введений у дану заявку як посилання, при цьому послідовність зсЕм вирівняна та пронумерована згідно з системою Кабат. "ЕСЕКМІІ" означає мутантну форму рецептора епідермального фактора росту, позначеного як МКІ1 зсЕм та яка характеризується делецією 801 п.о. екзонів 2-7 поблизу амінотермінального кінця. Ця форма рецептора 70 відома у даній галузі, та була описана Вікстрандом та інш., Москателло та інш. та Лорімером та інш., посилання на яких містяться у розділі "Передумови винаходу". Завдяки зміні в термінології, ЕСЕКМІЇ був спочатку позначений як мутація ІІ типу у деяких більш ранніх роботах у даній галузі, як, наприклад, згадано у (5, 5,212,2901).

Як такий, що використовується у контексті даної заявки, термін "антитіло" включає посилання на молекулу імуноглобуліну, що є імунологічно реактивною з певним антигеном, та включає як прийнятні поліклональні, так і моноклональні антитіла. Термін також включає одержані за допомогою генетичної інженерії форми, такі, як химерні антитіла (наприклад, олюднені мишині антитіла), гетерокон'югати антитіл (наприклад, біспецифічні антитіла). Термін, зокрема, відноситься до рекомбінантних одноланцюгових фрагментів Ем (зсЕм), дисульфідно стабілізованих фрагментів Ем (азЕм) (див. (0.5.5.М. 08/077,252), що введений у дану заявку як посилання), або ВЕМ фрагментів |див. ОЗ, 60/042,350; 05, 60/048,848). Термін "антитіло" також включає антиген-зв'язувальні форми антитіл, включаючи фрагменти з антиген-зв'язувальною здатністю (наприклад, Раб", К(аб)», Раб та прдо

Ідив. (Каталог та керівництво Пірса 1994-1995 (Ріегсе Спетіса! Со., Боскіога, І; Кибу, У. Іттипоіоду, З Ед. -

Мем Могк: М/У.Н.Ргеетап 4 Со., 1998). Який особливий зміст або змісти вкладаються у термін буде ясно із контексту. с

Антитіло, імунологічно реактивне з певним антигеном, може бути одержане за допомогою рекомбінантних методів, таких як селекція бібліотек рекомбінантних антитіл у фагових або подібних векторах |див. (Низе еї і9) аІ., // Зсіепсе/ 1989. - 246. - Р.1275-1281); МУага еї аїЇ. // Майте. - 1989. - 341. - Р. 544-546; Мацдпап еї аІ. // Майшге Віоїесп. - 1996. - 14. - Р. 309-314), або імунізацією тварини антигеном або за допомогою ДНК, що кодує антиген. -

Типово, імуноглобулін має важкий і легсий ланцюги. Кожний важкий та легкий ланцюг містить постійну ділянку та варіабельну ділянку (ці ділянки також відомі як "домени"). Варіабельні ділянки легкого та важкого о ланцюгів містять чотири структурні ділянки, що перериваються трьома гіперваріабельними ділянками, які також «ч- називаються "ділянками, що визначають комплементарність" або "СОК". Протяжність структурних ділянок та

СОК була визначена з системою Кабат. Послідовності структурних ділянок різних легких або важких ланцюгів є -

Відносно консервативними усередині видів. Структурна ділянка антитіла, що є комбінацією структурних ділянок - складових легких та важких ланцюгів, служать для позиціювання та вирівнювання СОК у тривимірному просторі.

СОК, головним чином, відповідають за зв'язування з епітопом антигену. СОК кожного ланцюга типово називається як СОК1!, СОК2, СОКЗ, що пронумеровані послідовно, починаючи від М-термінального кінця, вони « також типово визначаються ланцюгом, в якому розміщений певний СОК. Таким чином, СОКЗ М н розміщений у варіабельному домені важкого ланцюга антитіла, в якому він знаходиться, у той час, як СОКІ М | є СОВК1І з 0 У с варіабельного домена легкого ланцюга антитіла, в якому він знаходиться. ц Позначення "М д" або "МН" відноситься до варіабельної ділянки важкого імуноглобулінового ланцюга и"? антитіла, включаючи Гм, зсЕм, да5Ем або Рар важкого ланцюга. Позначення "М," або "МІ" відноситься до варіабельної ділянки легкого імуноглобулінового ланцюга антитіла, включаючи Гм, зсЕм, дзЕм або Рар легкого 5 ланцюга. -І Фраза "один ланцюг Ру" або "зсЕУ" відноситься до антитіла, в якому варіабельні домени важкого ланцюга та легкого ланцюга традиційного дволанцюгового антитіла з'єднані між собою для формування одного ланцюга. і Типово, лінкерний пептид вбудований між двома ланцюгами для того, щоб дозволити проводити самозборку та - створення активного зв'язувального сайту.

Термін "лінкерний пептид" включає вказівку на пептид усередині зв'язувального фрагменту антитіла і-й (наприклад, Ем фрагмент), який служить для безпосереднього зв'язування варіабельного домену важкого "І ланцюга з варіабельним доменом легкого ланцюга.

Термін "вихідне антитіло" взагалі відноситься до антитіла, що представляє інтерес, яке було мутовано або змінено для одержання антитіл або фрагментів останнього, що зв'язує той самий епітоп, що і вихідне антитіло.

Як такий, що використовується у контексті заявки, термін "вихідне антитіло" відноситься до 8сЕМ, що позначається як "МК1" |номер доступу СепВапк 076382), якщо інше не зазначене, або не вимагається по о контексту. ко Термін "гаряча точка" означає частину нуклеотидної послідовності СОК або структурну ділянку варіабельного домену, який представляє собою сайт особливо високої природної мутації. Незважаючи на те, що СОК самі по бо собі вважаються ділянками гіперваріабельності, було вивчено, що мутації не є визначально розподіленими у

СОК. Певні сайти, або гарячі точки, були ідентифіковані у цих позиціях, які піддавали концентрованим мутаціям. Гарячі точки характеризується рядом структурних ознак або послідовностями. Ці фрагменти "гарячих точок" можуть використовуватись для ідентифікації гарячої точки. Дві консенсусні послідовності ділянок, які є особливо добре охарактеризованими, є тетрануклеотидною послідовністю КОУМУУ та сериновою послідовністю 65 АСУ, дек єлАабоб, У є С або, а МУ є А або Т. "Націлювальний залишок" або "націлювальна молекула" є частиною імунокон'югату, який має здатність до націлювання імунокон'югату на клітини, що представляють інтерес. Типово, націлювальні залишки є антитілом, зсгУ, азгм, або К(абр')», який впізнає специфічний антиген на клітинах, що представляють інтерес. "Токсичний залишок" є цитотоксином або частиною цитотоксину, який при вбудовуванні в імунотоксин надає імунотоксину цитотоксичності по відношенню до клітин, що представляють інтерес. "Імунотоксин" є молекулою, що включає націлювальну молекулу, таку як зсЕм, та токсичний залишок, такий як екзотоксин Рзепдотопаз ("РЕ") або цитотоксичний фрагмент останнього.

Імунотоксини, що обговорюються у даній заявці, є такими, що типово експресуються як тільця включення в

Е.соїї, після цього тільця включення очищають, розчиняють у 6М Гуанідин НСЇ, та білок піддають повторній 70 зборці. Як такий, що використовується у контексті даної заявки, термін "вихід" відноситься до кількості мономерно імунотоксину, що правильно збирається під час цього способу. Вихід виражають як співвідношення міліграмів білка після Мопос) іоннообмінної хроматографії до міліграмів повторно зібраного білка тілець включення. "Терапевтичний залишок" є частиною імунокон'югату, призначеного діяти як терапевтичний агент.

Термін "терапевтичний агент" включає будь-який ряд сполук, що на сьогоднішній день відомі або пізніше поліпшені для впливу як антинеопластики, протизапальні агенти, цитокіни, антиінфекційні агенти, активатори ферментів або інгібітори, алостеричні модифікатори, антибіотики або інші агенти, які призначаються для індукції бажаного терапевтичного ефекту у пацієнта. Терапевтичний агент може також бути токсином або радіоізотопом, при цьому терапевтичний ефект полягає, наприклад, у руйнуванні пухлинної клітини. "Мітка, яку детектують" означає у зв'язку з імунокон'югатом частину імунокон'югату, яка надає властивості виявляти його присутність. Наприклад, імунокон'югат може бути міченим радіоактивним ізотопом, що дозволяє клітинам, в яких імунокон'югат присутній, виявлятись у імуногістохімічних аналізах.

Термін "ефекторний залишок" та "ефекторна молекула" означає частину імунокон'югату, призначеного мати вплив на клітину націлювання за допомогою націлювального залишку або для ідентифікації присутності сч ов імунокон'югату. Таким чином, ефекторний залишок може бути, наприклад, терапевтичним залишком, токсином, радіоміткою або флуоресцентною міткою. і)

Термін "імунокон'югат" означає химерну молекулу, що включає націлювальну молекулу (таку як зсЕм), приєднану безпосередньо (наприклад, через ковалентний зв'язок) або опосередковано (наприклад, через лінкерний пептид) до ефекторної молекули. У наборі імунокон'югатів ефекторна молекула є токсином, химерною М зо молекулою, що більш специфічно називається Йімунотоксином".

Термін "ефективна кількість" або "кількість, ефективна для" або "терапевтично ефективна кількість" о включає посилання на дозу терапевтичного агента, достатню для одержання бажаного результату, такого як «- інгібування синтезу клітинних білків, принаймні, на 5095, або руйнування цих клітин.

Термін "токсин" включає посилання на абрин, рицин, екзотоксин Рзейдотопазг (РЕ), дифтерійний токсин (ОТ), ї-

Зв ТОКСИН ботулізму або їх модифіковані токсини. Наприклад, РЕ та ОТ є високо токсичними сполуками, що типово ї- викликають смерть від печінкової токсичності. РЕ та ОТ, проте, можуть бути модифіковані у форму, придатну для використання як імунотоксину, шляхом видалення нативного націлювального компоненту токсину (наприклад, домену Іа РЕ або В ланцюга ОТ) та заміни їх різними націлювальними залишками, такими, як антитіло.

Термін "ІСьво" відноситься до концентрації токсину або імунотоксину (вираженому у нг/мл), що необхідний для « інгібування білкового синтезу на 5095. з с Термін "контакт" включає посилання на розміщення у безпосередньому фізичному сполученні. . "Експресійна плазміда" включає нуклеотидну послідовність, що кодує молекулу, яка представляє інтерес, та а яка оперативно зв'язана з промотором.

Як такий, що використовується у контексті заявки, "поліпептид", "пептид" та "білок" використовуються почергово та включають посилання на полімер амінокислотних залишків. Термін використовується для -І амінокислотних полімерів, в яких один або більше амінокислотних залишків є штучними хімічними аналогами відповідної одержаної з природи амінокислоти, а також до одержаних з природи амінокислотних полімерів.

Ш- Терміни також використовуються для полімерів, що містять консервативні амінокислотні заміни, такі, що білок - залишається функціональним.

Термін "залишок" або "амінокислотний залишок" включає посилання на амінокислоту, що введена у білок, 1 поліпептид, або пептид (які всі називаються "пептидом"). Амінокислота може бути такою, що одержана з

І природи, якщо інше не передбачено, може охоплювати відомі аналоги природних амінокислот, що можуть функціонувати таким самим чином, як і амінокислоти, одержані з природи.

Амінокислоти та аналоги відносяться до вказаних та описаних за допомогою коротких позначень, як ов Наведено у Таблиці 1. о ю 5

Авінно | яю |в спартмова кислот ле вв

Глутамін СІп ІФ зелено 117611 пе 0116018 о "Консервативна заміна" при описі білка відноситься до зміни в амінокислотному складі білка, що суттєво не змінює білкову активність. Таким чином, "консервативно модифіковані варіації" певної амінокислотної послідовності відносяться до амінокислотних замін таких амінокислот, що не є вирішальними для білкової активності або до заміни амінокислот іншими амінокислотами, що мають подібні властивості (тобто, кислотні, основні, позитивно чи негативно заряджені, полярні або неполярні тощо), такі, що заміни навіть вирішальних амінокислот не змінюють суттєво активність. Таблиці консервативних замін, що забезпечують функціонально подібні амінокислоти, добре відомі у даній галузі Кожна з наступних шести груп у Таблиці 2 містить амінокислоти, що є типово консервативними при заміні однієї на іншу |див. також |Стгеідніоп, Ргоїеїіпв,

М/.Н.Ргеетап апа Сотрапу, Мем Хогк, 19841. с 7 о ча зо в - 116 Фенілаланін(Є) тирозин (Ю, Триптофан М) ї- і -

Слід зазначити, проте, що хоча фенілаланін та триптофан взагалі вважаються консервативними при заміні один на інший, заміна фенілаланіну на триптофан у гарячій точці М. СОКЗ зсЕм МК1 приводить до утворення імунотоксину, який буде більш активним, ніж вихідний зем. Згідно з цим, оскільки ці амінокислоти вважаються консервативними замінами для частин антитіла за межами СОК у контексті цього винаходу ці дві амінокислоти « 70 Не є консервативними замінами одна на іншу усередині гарячої точки. Базуючись на цих результатах, ніякі -о с амінокислотні заміни усередині гарячої точки не можуть вважатись консервативними замінами за винятком, коли вони тестуються, наприклад, за допомогою аналізів, наведених у даній заявці для визначення того факту, чи :з» впливають вони, чи ні на зв'язувальну афінність одержаної молекули, на вихід імунотоксину, одержаного при використанні цієї молекули як націлювального залишку, або обох.

Термін "суттєво подібний" у контексті пептиду позначає, що пептид включає послідовність з принаймні 9095, -І а бажано 9595, ідентичністю з референс-послідовністю при порівнянні ділянки розміром 10-20 амінокислот.

Значення ідентичності послідовності визначали шляхом порівняння двох оптимально вирівняних послідовностей і більших за ділянку порівняння, де частина полінуклеотидної послідовності порівнюваної ділянки може включати - вставки або делеції (тобто, пробіли) при порівнянні зі згаданою послідовністю (яка не включає вставок або замін) для оптимального вирівнювання двох послідовностей. Значення вираховують шляхом визначення номера о положення, в якому ідентична основа нуклеїнової кислоти або амінокислотний залишок має місце в обох "м послідовностях, для одержання номера прийнятних положень, ділення отриманого прийнятного положення на загальний номер положення у ділянці порівняння та множення результату на 100 для одержання значення ідентичності послідовності. 5Б Фраза "дисульфідний зв'язок" або "цистеїн-цистеїновий дисульфідний зв'язок" відноситься до ковалентної взаємодії між двома цистеїнами, в яких атоми сірки цистеїнів окислені для утворення дисульфідного зв'язку. (Ф) Середня енергія зв'язування дисульфідного зв'язку складає приблизно боккал/мол, порівняно з 1-2ккал/мол для ка водневого зв'язку. У контексті даного винаходу цистеїни, що утворюють дисульфідний зв'язок, знаходяться у середині структурних ділянок одноланцюгового антитіла та служать для стабілізації конформації антитіла. 60 Терміни "кон'югація", "поєднання", "сполучення" та "зв'язування" відносяться до створення двох поліпептидів в одній сумісній поліпептидній молекулі. У контексті даного винаходу, терміни включають посилання на приєднання залишку антитіла до ефекторної молекули (ЕМ). Зв'язок може бути створений хімічно або рекомбінантним чином. Хімічні способи відносяться до реакції між залишком антитіла та ефекторною молекулою, завдяки якому ковалентний зв'язок утворюється між двома молекулами для створення однієї 65 Молекули.

Як такий, що використовується у контексті даної заявки, "рекомбінант" включає посилання на білок,

одержаний при використанні клітин, що не мають у своєму активному стані ендогенної копії ДНК, здатної до експресії білка. Клітини виробляють рекомбінантний білок, оскільки вони були генетично змінені шляхом вбудовування прийнятної ізольованої послідовності нуклеїнової кислоти. Термін також включає посилання на клітину, або нуклеїнову кислоту або вектор, який було модифіковано вбудовуванням гетерологічної нуклеїнової кислоти або зміни нативної нуклеїнової кислоти для створення неприродної для цієї клітини, або такий, що клітина, яка походить від цієї клітини, є модифікованою. Таким чином, наприклад, рекомбінантні клітини експресують гени, що не містяться у нативній (нерекомбінантній) формі клітини, експресують мутанти генів, які не містяться у нативній формі, або експресують нативні гени, що в іншому випадку ненормально експресуються, /о надекспресуються або не експресуються взагалі.

Як такий, що використовується у контексті даної заявки, термін "нуклеїнова кислота" або "послідовність нуклеїнової кислоти" включає посилання на дезоксирибонуклеїновий або рибонуклеїновий полімер в одно- або дволанцюговій формі, та, якщо інше не вказано, охоплює відомі аналоги природних нуклеотидів, що гібридизуються з нуклеїновими кислотами способом, подібним до того, що має місце для природних нуклеотидів.

Якщо інше не вказано, певна послідовність нуклеїнової кислоти включає комплементарну їй послідовність, а також консервативні варіанти, тобто, нуклеїнові кислоти, присутні у положенні, що може змінюватися, Її кодонів та варіантів, так, що при трансляції у білок це приводить до консервативної заміни амінокислоти.

Як такий, що використовується у контексті даної заявки, термін, "той, що кодує" по відношенню до специфічної нуклеїнової кислоти включає посилання на нуклеїнові кислоти, які містять інформацію для 2о трансляції у специфічний білок. Інформація задається використанням кодонів. Типово, амінокислотна послідовність кодується нуклеїновою кислотою при використанні "універсального" генетичного коду. Проте, варіанти універсального коду, такі як ті, що присутні у деяких рослинах, тваринах та мітохондріях грибів, бактерії Месоріазта саргісоїшт (Ргос. Май. Асай. Зсі. БА. - 1985. - 82. Р. 2306-2309), або у війках

Масгописіегиз, можуть використовуватись, якщо нуклеїнова кислота експресується при використанні с ов трансляційного механізму цих організмів.

Фраза "злиття у рамці" відноситься до поєднання двох або більше нуклеїновокислотних послідовностей, які (8) кодують поліпептиди, так, що приєднана послідовність нуклеїнової кислоти транслюється в одноланцюговий білок, який включає оригінальні поліпептидні ланцюги.

Як такий, що використовується у контексті даної заявки, "експресований" включає посилання на трансляцію М

Зо Нуклеїнової кислоти. у білок. Білки можуть експресуватись та залишатись інтрацелюлярними, ставати компонентом клітинної поверхневої мембрани або бути секретованими у екстрацелюлярний матрикс або юю середовище. «-

Під "хазяйською клітиною" розуміють клітину, яка може підтримувати реплікацію або експресію експресійного вектора. Хазяйські клітини можуть бути прокаріотичними клітинами, такими як Е.соїї, або еукаріотичними ї- клітинами, такими як дріжджі, комахи, амфібії або клітинами ссавців. ї-

Фраза "фагова бібліотека" відноситься до популяції бактеріаофагів, кожний з яких містить сторонню кКДНК, рекомбінантно злиту у рамці з послідовністю поверхневого білка. Після реплікації у бактеріальному хазяїні, типово Е.соїї, фаг, який містить сторонню кКДНК, що представляє інтерес, вибирають за допомогою експресії стороннього білка на поверхні фага. «

Термін "ідентичний" або процент "ідентичності" у контексті двох або більше нуклеїнових кислот або пт») с поліпептидних послідовностей відноситься до двох або більше послідовностей, або субпослідовностей, які є такими самими або мають вказаний процент амінокислотних залишків або нуклеотидів, що є такими самими, при ;» порівнянні та вирівнюванні для максимальної відповідності, як це роблять при використанні одного з наступних алгоритмів порівняння послідовностей або візуального огляду.

Фраза "суттєво ідентичний" у контексті двох нуклеїнових кислот або поліпептидів відноситься до двох або -І більше послідовностей або субпослідовностей, що мають принаймні 6095, бажано 8095, а більш бажано - 90-9596, ідентичності нуклеотидів або амінокислотних залишків при порівняння та вирівнюванні для максимальної

Ш- відповідності, як це роблять при використанні одного з наступних алгоритмів порівняння послідовностей. - Бажано, щоб суттєва ідентичність існувала понад ділянку послідовності, що містить принаймні близько 50 залишків, більш бажано понад принаймні 100 залишків, та найбільш бажано, якщо послідовності є суттєво 1 ідентичними принаймні 150 залишків. У найбільш бажаному втіленні, послідовності є суттєво ідентичними понад

І повну довжину кодувальних ділянок.

Для порівняння послідовностей, звичайно, одна послідовність виступає як референс-послідовність, з якою порівнюються тестові послідовності. При використанні алгоритму порівняння послідовностей тестові та референс-послідовності вводяться в комп'ютер, субпослідовності координують, та визначають, якщо необхідно, після цього визначають програмні параметри алгоритму порівняння послідовностей. Алгоритм порівняння (Ф) послідовностей потім визначають як процент ідентичності для тестової послідовності(ей), споріднених з ка референс-послідовністю, базуючись на визначених програмних параметрах. У даній галузі техніки відомий цілий ряд програм для такого вимірювання. во Подальше визначення того факту, що дві послідовності нуклеїнової кислоти або поліпептидів є суттєво ідентичними, полягає у тому, що поліпептид, який кодується першою нуклеїновою кислотою, є імунологічно перехресно реактивним з поліпептидом, що кодується другою нуклеїновою кислотою, як описано нижче. Таким чином, поліпептид є типово суттєво ідентичним до другого поліпептиду, наприклад, якщо два поліпептиди відрізняються тільки консервативними замінами. Інше визначення того факту, що дві послідовності нуклеїнової 65 Кислоти є суттєво ідентичним, полягає у тому, що дві молекули гібридизуються одна з одною у жорстких умовах, як описано нижче.

Термін "іп мімо" включає посилання на те, що процес відбувається усередині тіла організму, з якого одержана клітина. "Ех мімо" та "іп міго" означає, що мова йде про процеси поза тілом організму, з якого одержана клітина.

Фраза "злоякісна клітина" або "злоякісність" відноситься до пухлин або пухлинних клітин, які є інвазивними та/або здатні піддаватись метастазу, тобто, мається на увазі пухлинна клітина.

Як такий, що використовується у контексті даної заявки, термін "клітини ссавця" включає посилання на клітини, що походять від ссавців, включаючи людину, щурів, мишей, гвінейських свиней, шимпанзе, або макак.

Клітини можуть культивуватись іп мімо або іп мікго. 70 Термін "селективно реактивний" відноситься у зв'язку з антигеном до бажаної асоціації антитіла, як у цілому, так і частини, до клітини або тканини, що несе цей антиген, та не відноситься до клітин або тканин, що не мають цього антигену. Звичайно визнається, що певна ступінь неспецифічної взаємодії може виникати між молекулою та ненаціленою клітиною або тканиною. Проте, селективна реактивність може бути визначною, як така, що опосередковується через специфічне впізнання антигену. Незважаючи на те, що селективно реактивні /5 антитіла зв'язують антиген, вони можуть робити це з низькою афінністю. З іншого боку, специфічне зв'язування приводить до набагато сильнішої асоціації між антитілом та клітинами, що несуть антиген, ніж таке між зв'язаним антитілом та клітинами, які не мають цього антигену. Специфічне зв'язування типово приводить до двократного збільшення, бажано до п'ятикратного збільшення, ще більш бажано до десятикратного збільшення та найбільш бажано понад стократного збільшення кількості зв'язаного антитіла (на одиницю часу) з клітиною або тканиною, що несе ЕСЕРМІЇЇ, у порівнянні з клітиною або тканиною, в якій відсутній ЕСЕМКМмІІІ. Специфічне зв'язування з білком при таких умовах вимагає антитіла, яке вибране за його специфічність до певного білка.

Різноманітність методів імунологічного визначення є прийнятною для вибору антитіл, специфічно реактивних з певним білком. Наприклад, твердофазні імуноаналізи ЕГІЗА, звичайно, використовуються для вибору моноклональних антитіл, специфічно імунореактивних з білком. Опис методів імуноаналізу та умов, що можуть сч об ВИикористовуватись для визначення специфічної імунореактивності, наведено у |(Нагіом/ 8. ІГапе, Апіїроаіев, А

І арогаюгу Мапиаї, Соїд Зргіпд Нагрог Рибіїсайопв. - Мем Хогк, 19881. і)

Термін "імунологічно реактивні умови" включає посилання на умови, які дозволяють генерувати антитіло до певного епітопу для зв'язування з цим епітопом для значно більшого рівня детектування, ніж та/або для суттєвого виключення зв'язування з суттєво усіма епітопами. Імунологічно реактивні умови залежать від методу М зо проведення реакції зв'язування антитіла та типово є такими, що використовуються у прописах імунологічних аналізів або тими умовами, що зустрічаються іп мімо |Нагіом 4 Іапе, Апіїродіез, А І арогаїогу Мапиаї, Соїа о

Зргіпд Нагрог Рибіїсайопе. - Мем/ ХогКк, 1988). Бажано, щоб імунологічно реактивні умови, які використовуються «- у способах згідно з даним винаходом, були "фізіологічними умовами", які включають посилання на умови (наприклад, температура, осмотичний тиск, рН), що є типовими усередині тіла живих ссавців або клітин ссавців. ї- з5 Незважаючи на те, що визнається, що деякі органи є об'єктами крайніх умов, середовище всередині організмута М. інтрацелюлярне середовище у нормі мають рН близько 7,0 (тобто від рН 6,0 до рН 8,0, більш типово рН 6,5-7,5), містять воду як переважний розчинник, та існують при температурі вище 02С та нижче 5022. Осмотичний тиск лежить всередині інтервалу, що є таким, який забезпечує підтримання клітинної життєздатності та проліферації.

Створення антитіл з вищою афінністю для ЕСЕКМІЇ, ніж така для МК1 «

Антитіла зв'язуються з антигенами через залишки у їх СОК. Тому мутагенез СОК широко використовується шщ с для збільшення афінності Рар та Ем фрагментів антитіл. Існує велика кількість різноманітних підходів до й мутагенезу СОК. Більшість з них, такі як мутагенез, що базується на кодонах (Меп еї аї. // 9). Іттипої. - «» 1995. - 155. - Р. 1994-2004, метод скринінгу СОК ІВаграз еї аїЇ. // Тгепаз Віоїеси. - 1996. - 14. - Р. 230-234; Мапд еї аї. // 9. Мої. ВіоІї. - 1995. - 254. - Р. 392-403), помилкова протяжна реплікація | ому еї аї. 7/3. Мої. Віої. - 1996. - 260. - Р. 359-368), конструювання синтетичних СОМ |де Кий еф аї. // У). Мої. -і Віо!. - 1995, - 248. Р. 97-105) вимагають конструювання великих бібліотек, що є технічно утрудненим та важким для виконання. Основний напрямок розвитку афінності антитіл полягає в ізоляції високоафінних зв'язувальних - агентів з відносно невеликих бібліотек |Ріпі ек аїЇ. / 9. Віої. Спет. - 1988. - 273. Р. 21769-21776; Ми еї - аі. / Ргос. Май. Асай. сі. ОБА. - 1998. - 95. - Р. 6037-6042; Споманпигу еї аїЇ. // Маїшге ВіобФесппої. - 1999. - 17. - р. 568-572). Усі з цих підходів передбачають конструювання експресійних бібліотек антитіл з іні мутаціями у СОК та селекцію кращих зв'язувальних агентів. "З Технологія фагового виявлення стала корисним знаряддям для скринінгу великих пептидних або білкових бібліотек |МУіпіег еї аїЇ. / Аппи. Кем. ІттипоЇї. - 1994. - 12. - Р. 433-455; МесСаПепу // 9). Маїшге. - 1990. - 348. 0 - Р. 552-554; Вагравз еї а). // Ргос. Май. Асай. Зсі ОБА. - 1991. - 88. - Р. 7978-7982). Одноланцюгові Ем можуть експресуватись у фагових частинках як злиття з геном З білка М1З у фагемідному векторі. Білки злиття експресуються в Е.соїї та у присутності фагового хелпера виявляються на поверхні фага іФ) М13, який може збиратись з культурального середовища. Фаг, який виявляє зсЕм злиті білки, що зв'язуються зі ко специфічним антигеном, піддають селекції шляхом пенінгу фагових бібліотек на клітинах, що експресують антиген, або на поверхні, з якою зливається антиген, такою як магнітні кульки. Фаг, який не зв'язується, бо Вимивається, зв'язаний фаг елюють та ампліфікують шляхом повторного інфікування Е.соїї. Декілька кіл пенінгу приводять до збагачення специфічних зв'язувальних агентів. Шляхом створення умов пенінгу більш жорсткими кращі зв'язувальні агенти можуть більш ефективно відокремлюватись від слабких зв'язувальних агентів.

Технологія фагового виявлення може використовуватись для одержання антитіл, які зв'язують ЕСЕКМІЇ з вищою афінністю, ніж МК1. Як добре відомо у даній галузі техніки, непошкоджене антитіло включає два важких б5 ланцюга та два легких -ланцюга. Кожний ланцюг має три СОК, позначені як 1, 2, З відповідно. Кожний СОК, як відомо, робить свій внесок у процес антигенного зв'язування, але вони роблять це не в рівній мірі (Кибу 9.

Іттипоіоду. З Ед, - Мем Могк: МУ.Н.Егеетапа:Со., 19981. Незважаючи на те, що амінокислоти будь-якого СОВ можуть бути мутовані для виявлення мутацій, які збільшують афінність, взагалі СОКЗ кожного ланцюга робить більший внесок у антигенне зв'язування, ніж це робить СОК1 або СОК2 цього ланцюга. Крім того, Мнта М. СОКЗ

МК! є відносно більш довгими для мишиного СОКЗ, який може робити свій внесок у відносну стабільність МК1 8зсЕм відносно інших зсгм.

Після виключення останніх двох амінокислот Мн СОКЗ, що є слабоймовірними стосовно впливу на антигенне зв'язування з причин, що обговорювались у Вступі, дев'ять залишків, що залишились у Мн СОКЗ, були заміщені кожною з 19 природних амінокислот. Тільки мутації серину та треоніну в амінокислотних положеннях 98 та 99, 70 Відповідно, приводили до поліпшення цитотоксичності одержаного імунотоксину (амінокислотні послідовності М н та М. СОКЗ представлені в однобуквеному коді у табл. 5-7. Послідовність, що представляє Мн, не показує двох залишків, 0101 та 102, які вважають такими, що малоймовірно впливають на процес антигенного зв'язування).

Бажаними замінами у Мн СОКЗ були РО8-М99, які давали ІСьо у РЕЗ8 імунотоксині З,5нг/мл, РО8-МО9, РОВ-ЮМ/99 та РО8-У99, усі з яких давали ІС 5о 4,5нг/мл, РО8-Е99 з ІСьо бнг/мл та РУО8-У99, які давали ІСво б,5нг/мл чотири 75 Клони, РО8-599, М/98-У99 та РО8-Т99, які давали значення ІС 50, рівне такому для вихідного клону. (Звичайно, термін, такий як "РО8-Уу99", означає, що амінокислота пролін виявляється у положенні 98 вказаного поліпептиду, у даному випадку у Мн СОКЗ МК, і що тирозин з'являється у положенні 99, але, що решта молекули така сама, як і у нормального поліпептиду, у даному випадку, вихідного антитіла МК1).

Відносно мутації М. СОКЗ, то слід сказати, що тільки одна мутація Г92МУ дає імунотоксин, що є більш активним, ніж вихідний. Його ІСьо складає 1,Знг/мл. У цьому випадку "вихідною" молекулою є МК1 з замінами

РОУ8-/99 у Му СОКЗ, яка при відсутності додаткових замін у М. СОКЗ має ІСьо З,5нг/мл. Це мутоване МК, яке поєднує мутації у СОКЗ як у Му, так і у Му. ланцюгах (Мн 598Р-Т99У.М| Е92М/) було найбільш цитотоксичною формою при тестуванні як націлювальної частини імунотоксину, і зараз називається "МК1-1".

Ці результати показують, що мутації у різних СОК можуть мати додатковий ефект та можуть збільшувати су Ццитотоксичність одержаного імунотоксину. Беручи до уваги ці результати мутації амінокислот у гарячій точці

СОКІ1 та СОКО2 Мр та М, ланцюгів МКІ1 будуть, очевидно, приводити в антитілах до подальшого поліпшення о афінності для ЕСЕРМІЇЇ та до створення імунотоксинів з ще більш поліпшеною цитотоксичністю у порівняння з

МА.

Найкращим часом для аналізу клонів є початок процесу. Пенінг після збагачення піків може бути шкідливим, рч- оскільки виникає ризик загублення клонів. Можливо, що Ем з низькою афінністю, але з високою експресією, може бути відповідним чином збагачений, тоді як добрий зв'язувальний агент може бути загублений. Докази, що це о підтверджують, одержували при пенінгу бібліотек легких ланцюгів СОКЗ: мутант Р925 з низькою афінністю (Ка -"чее 22НМ) було знайдено у 7 з 10 клонів, перевірених після третього кола, у той час, як кращий зв'язувальний агент, Е92МУ, був присутній тільки один раз. На противагу цьому, у другому колі Е925 було знайдено у 2-ох з 17 -

Клонів, у той час як Е92МУ був присутній у 6 з 17 клонів. ча

Анти-ЕСЕРЕМІЇ антитіла

Даний винахід забезпечує антитіла, які зв'язуються з ЕСЕКМІІ з вищою афінністю, ніж антитіла, відомі з рівня техніки, та які селективно реагують з ЕСЕКМІЇІ. Зокрема, винахід забезпечує антитіла, які мають нижче « значення Ка по відношенню до ЕСЕКМІЇЇ, ніж МК, найкращі відомі зсЕм, націлені на цей антиген. Крім того, ці 70 антитіла формують імунотоксини, які мають вищу цитотоксичність для клітин, що експресують ЕСЕКМІЇ, ніж той - с самий імунотоксин, одержаний на основі МК1. Винахід також забезпечує спосіб одержання антитіл з вищою ц афінністю та більшою цитотоксичністю для ЕСЕРКМІЇЇ, ніж має МК. Імунокон'югати, розкриті нижче, націлюють "» ЕСЕКМІЇЇ при використанні антитіл згідно з даним винаходом. Ці антитіла є селективно реактивними при імунологічних умовах до тих детермінант ЕСЕКМІЇЇ, що виявляються на поверхні клітин ссавців, та доступні для 75 антитіла з екстрацелюлярного середовища. -І У бажаному втіленні даного винаходу анти-ЕСЕРКМІЇЇ антитіло є рекомбінантним антитілом, таким, як зсЕм або дисульфідно стабілізованим Ем оантитілом. Ем антитіло типово має вагу 25кДа та містить повний 7 антиген-зв'язувальний сайт з трьох СОК як у важкому, так і в легсому ланцюгах. Якщо М н та М; ланцюги - експресуються несумісно, ланцюги Ем антитіла типово тримаються разом за допомогою нековалентних взаємодій. Проте, ці ланцюги мають тенденцію до дисоціації під час розчинення, і таким чином, були розвинуті і-й способи для зшивання ланцюгів за допомогою глютаральдегіду, внутрішньомолекулярних дисульфідів або "І пептидного лінкеру. Дисульфідно стабілізовані Ем вивчаються, наприклад, у (5, 5,747,6541.

В особливо бажаному втіленні антитіло є одноланцюговим Ем (зсЕм). Мн та М, ділянки зсЕм антитіла включають один ланцюг, який зібраний для створення антиген-зв'язувального сайту, подібного до того, що знайдений у дволанцюгових антитілах. При зборці нековалентні взаємодії стабілізують єдиний ланцюг антитіла.

У більш бажаному втіленні зсЕм одержують рекомбінантним способом. Будь-який спеціаліст у даній галузі зможе

Ф, зрозуміти, що можуть бути одержані консервативні варіанти антитіл згідно з даним винаходом. Такі ко консервативні варіанти, що використовуються у фрагментах зсЕм, будуть зберігати критичні амінокислотні залишки, необхідні для правильної зборки та стабілізації між Мн та М, ділянками. во У деяких втіленнях даного винаходу зсЕм антитіло безпосередньо зв'язане з ефекторною молекулою (ЕМ) через легкий ланцюг. Проте, зсЕм антитіла можуть бути зв'язані з ЕМ через аміно- або карбокси-термінальний кінець.

Оскільки Мн та М, ділянки у деяких втіленнях антитіл можуть бути безпосередньо сполучені разом, будь-який спеціаліст у даній галузі, може оцінити, що ділянки можуть бути відокремлені пептидним лінкером, який 65 складається з однієї або більше амінокислот. Пептидні лінкери та їх використання добре знайомі спеціалістам у даній галузі техніки, наприклад, (Нивіоп еї аїЇ. // Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА. - 1988. - 8. - Р. 5879; Віга еї аІ. / Зсіепсе. - 1988. - 242. - Р. 4236; Сіоскепибрег еї аї. // Віоспетівігу. - 1990. - 29. - Р. 1362; 05, 4,9466778; 05, 5,132,405; біеттег еї аїЇ. // Віоїесппідцез. - 1993. - 14. - Р. 256-265). Взагалі пептидний лінкер не буде мати специфічної біологічної активності іншої, ніж сполучення ділянок або для збереження мінімальної відстані або інших просторових взаємозв'язків між М н та Мр. Проте, постійні амінокислоти пептидного лінкера можуть бути вибрані для впливу на деякі властивості молекули, такі як зборка, загальний заряд або гідрофобність. Одноланцюгові Ем (зсЕм) антитіла необов'язково включають пептидний лінкер, що має розмір не більше 50 амінокислот, та більш бажано, не більше 40 амінокислот, бажано не більше 30 амінокислот, та найбільш бажано не більше 20 амінокислот у довжину. У деяких втіленнях пептидний лінкер є конкатамером 70 послідовності (Сїу-(с1у-сїІу-сІу-Зег, бажано 2, 3, 4, 5 або 6 таких послідовностей. Проте, необхідно оцінити, що можуть бути зроблені деякі амінокислотні заміни усередині лінкера. Наприклад, гліцин може бути заміщений на валін.

Одержання взсЕм

Як описано вище, у бажаних втіленнях антитіло (наприклад, для націлювання залишку імунотоксину) /5 представляє собою зсЕм. Способи для одержання зсЕм антитіл були описані у (Низе еї аї. // Зсіепсе. - 1989. - 246. - Р. 1275-1281; МУага еї аїЇ. // Майте. - 1989. - 341. - Р. 544-546; Мацдпап еї аїЇ. // Маїшге Віоїесп. 1996. - 14. - Р. 309-314). Коротко, була ізольована мРНК з В-клітин та було приготовлено кДНК, яку ампліфікували за допомогою відомих способів, таких як ПЛР, за допомогою праймерів, специфічних для варіабельних ділянок важкого та легкого ланцюгів імуноглобуліну. Продукти ПЛР очищали за допомогою, 2о наприклад, електрофорезу в агарозному гелі, та поєднували послідовності нуклеїнових кислот. Якщо лінкерний пептид є бажаним, послідовності нуклеїнових кислот, що кодують пептид, вбудовували між послідовностями нуклеїнових кислот важкого та легкого ланцюгів. Послідовності можна поєднувати за допомогою способів, відомих у даній галузі техніки, таких як лігування тупих кінців, вбудовування рестрикційних сайтів на кінцях продуктів ПЛР або шляхом сплайсингу за допомогою перекриваючого подовження |(Споуапигу еї аї. // Мої. сч об іттипої. 1997. - 34. - Р. 9). Після ампліфікації нуклеїнові кислоти, що кодують зсгУ, вбудовували у вектор, знову за допомогою способів, добре знайомих спеціалісту у даній галузі. Бажане, щоб вектор був здатний до і) реплікації у прокаріотах та для того, щоб експресуватись як у прокаріотах, так і в еукаріотах. У бажаному втіленні зсЕм гени поєднують з РЕЗ8 геном за допомогою короткого лінкера та клонують в експресійний вектор, що базується на 17. В особливо бажаних втіленнях зсЕм експресується під контролем промотора 17 у Е.соїї ВІ 21 М зо ООЕЗ).

Як було зазначено у попередніх розділах, зсЕм, що специфічно зв'язується з ЕСЕРМІЇЇ, знаходять за о допомогою пенінгу. Пенінг можна проводити одним з наступних способів. У бажаному способі у зв'язку з Даним -/-с де винаходом, пенінг може відповідно виконуватись при використанні клітин, які представлені у прикладах нижче.

Пенінг можна також проводити на твердій поверхні шляхом покриття твердої поверхні ЕСЕЕМІЇ та при інкубації - фага на поверхні протягом прийнятного періоду часу при прийнятних умовах. Зручно, коли поверхня буде че поверхнею магнітної кулькою.

Відкриття антитіла з найвищою афінністю визначається ефективним селекційним процесом та залежить від ряду клонів, що можуть піддаватись скринінгу, та від жорсткості умов, в яких проводять цей процес. Типово, висока напруженість відповідає більш селективному пенінгу. Проте, якщо умови є дуже суворими, фаг не буде « зв'язуватись. Після першого кола пенінгу фаг, який зв'язався з вкритими ЕСЕКМІЇЇ планшетами або з клітинами, шщ с що експресують ЕСЕЕМІЇ на своїй поверхні, розмножують в Е.соїї та піддають іншому колу пенінгу. Таким чином, й збагачення у багато разів відбувається протягом З кіл пенінгу. Отже, навіть, коли збагачення у кожному колі є «» низьким, багаторазові кола пенінгу будуть приводити до ізоляції рідкісного фага та генетичного матеріалу, що міститься усередині, та який кодує зсЕм з найвищою афінністю або один з яких найкраще експресується у фагові.

Незважаючи на те, що спосіб пенінгу вибраний, фізичний зв'язок між генотипом та фенотипом, що -і забезпечується фаговим виявленням, робить можливим тестування кожного члена бібліотеки кДНК для зв'язування з антигеном, навіть з великими бібліотеками клонів.

Ше Зв'язувальна афінність антитіл - Антитіла згідно з даним винаходом зв'язуються з епітопом ЕСЕРЕМІЇ з Ка принаймні на 1нНМ нижче, ніж така 5р для вихідного антитіла МК1. Зв'язувальна афінність для цільового антигену типово вимірюється або і-й визначається стандартними методами антиген-антитіло, такі як конкурентні аналізи, аналізи насичування, або "І аналізи, такі як ЕГІ5ЗА або КІА.

Такі аналізи можуть використовуватись для визначення константи дисоціації антитіла. Фраза "константа дисоціації" відноситься до вимірювання афінності антитіла для антигену. Специфічність зв'язування між антитілом та антигеном існує, якщо константа дисоціації (Ка-л1/К, де К є константою афінності) антитіла лежить у мікромолярному інтервалі, бажано « 100НМ, найбільш бажано « 0,1нМ. Молекули антитіл будуть типово мати іФ) ка у низьких інтервалах. Ка-(АБ-АЯ| АВІА, де (АБ представляє собою концентрацію при рівновазі антитіла, ко Аді є концентрацією при рівновазі антигену, а Ц(АБ-Ад| є концентрацією при рівновазі комплексу антитіло-антиген. Типово, зв'язувальні взаємодії між антигеном та антитілом включають двосторонні бо нековалентні асоціації, такі як електростатичне притягування, сили Ван дер Ваальса та водневі зв'язки. Цей метод визначення зв'язувальної специфічності застосовується до одноланцюгових важких та/або легких ланцюгів, СОК, злитих білків або фрагментів важкого та/або легкого ланцюгів, що є специфічними для ЕСЕЕМІЇ.

Імуноаналізи

Антитіла можуть бути визначені та/або кількісно оцінені при використанні ряду добре відомих аналізів б5 імунологічного зв'язування, наприклад, (5, 4,366,241; 05, 4,376,110; 05, 4,517,288; 05, 4,837,168). Для огляду загальних імунологічних аналізів, дивись також |Меїйодвз іп Сеї/! Віоіоду, МоІ.37, Аваі, - Мем/ Могк:

ед.Асадетіс Ргезв, Іпс., 1993; Вавіс апа Сіїпіса! Іттипоіоду 7 Еайіоп, (Шев 5 Теїт, ейв., 1991). Аналізи імунологічного зв'язування (або імуноаналізи) типово використовують ліганд (наприклад, ЕСЕРКМІЇЇ) для специфічного зв'язування та часто мобілізації антитіла. Антитіла, що використовуються у імуноаналізах згідно

З даним винаходом, обговорювались більш детально вище.

Імуноаналізи також часто використовують мітку при специфічному зв'язуванні, мітка зв'язувального комплекса утворюється лігандом та антитілом. Мітка може сама по собі бути одним з залишків, що включає комплекс антитіло/аналіт, тобто анти-ЕСЕРМмІЇЇ антитіло. Альтернативно, мітка може бути третім залишком, таким як інше антитіло, що специфічно зв'язується з комплексом антитіло/ЕСЕЕМІЇ білок. 70 В одному аспекті конкурентний аналіз проводять, якщо мітка є другим анти-ЕСЕКМІЇЇ антитілом, що несе мітку. Два антитіла потім конкурують за зв'язування з імобілізованим ЕСЕКМІ. У втіленнях, де питання полягає у порівнянні афінності першого антитіла з таким МК, друге антитіло може бути МК1. Альтернативно, у неконкурентних умовах ЕСЕКМІЇЇ антитіло не має мітки, але друге антитіло, специфічне для антитіл різних видів, від яких одержане ЕСЕЕМІЇЇ антитіло, наприклад, мишине, та яке зв'язується з анти-ЕСЕКМІіЇЇ антитілом, 75 є міченим.

Інші білки, здатні до специфічного зв'язування з імуноглобуліновими постійними ділянками, такі як Білок А або Білок б, можуть також використовуватись як агент для мічення. Ці білюмим є нормальними складовими клітинних стінок стафілококової бактерії. Вони демонструють сильну неімуногенну реактивність з постійними ділянками імуноглобуліну з різних видів |(Ктгопуга! еї аї. // У. Іттипої. 1973. - 111. - Р. 1401-1406; АКегвігот 2о екаї. // 9. Іттипої. 1985. - 135. - Р. 2589-2542).

Під час аналізів етапи інкубації тал'або промивання можуть бути необхідними після кожної комбінації реагентів. Етапи інкубування можуть варіювати від приблизно 5с до кількох годин, бажано від бхв. до приблизно 24год. Проте, час інкубації буде залежати від виду аналізу, антитіла, об'єму розчину, концентрацій, тощо.

Звичайно, аналізи будуть виконуватись при температурі навколишнього середовища, незважаючи на те, що їх су

Можна проводити за межами інтервалу температур, при температурах від 42С до 4020.

Оскільки деталі імуноаналізів згідно з даним винаходом можуть варіювати в залежності від певного способу, о що використовується, спосіб визначення анти-ЕСЕРКМІЇІ антитіл у зразку, що містить антитіла, взагалі включає етапи приведення-зразку у контакт з антитілом, яке специфічно реагує при імунологічно реактивних умовах з комплексом ЕСЕКМмМІП/антитіло. че

Одержання імунокон'югатів

Анти-ЕСЕЕМІЇ антитіла, одержані у даному винаході, можуть приєднуватись до ефекторних молекул (ЕМ) за о допомогою карбокситермінального кінця, амінотермінального кінця ЕМ, через внутрішній амінокислотний - залишок ЕМ такий, як цистеїн, або за допомогою їх комбінації. Подібно до цього ЕМ може зв'язуватись безпосередньо з важкою, легкою, Ес (постійною ділянкою) або структурними ділянками антитіла. Зв'язок може - утворюватись через аміно- або карбокси-термінальний кінець антитіла, або через внутрішній амінокислотний /-|Їч« залишок. Якщо РЕ або його цитотоксичний фрагмент використовуються як ЕМ, зв'язки у або поблизу карбокситермінального кінця будуть створені таким чином, щоб підтримувати або додавати (якщо зв'язок знаходиться на С-термінальному кінці) послідовність, яка функціонує як сигнальна послідовність для « направлення молекули до цитозолю. Прийнятні сигнальні амінокислотні послідовності, такі як КЕБІК (послідовність природного РЕ в однобуквенному коді), КОЕЇ, КОЕЇ та повтори КОЕЇ, відомі у даній галузі - с техніки, наприклад, (МО, 91/18099). Крім того, багаточисельні ЕМ молекули (наприклад, будь-яка від 2 до 10) ц можуть зв'язуватись з анти-ЕСЕКМІЇ антитілом та/або багаточисельними антитілами (наприклад, будь-яким від 2 ,» до 5), що можуть бути зв'язані з ЕМ. Молекула, утворена шляхом зв'язування ефекторної молекули з антитілом, відома як імунокон'югат.

Терапевтичний агент є агентом з певною біологічною активністю, направленою проти певної цільової - І молекули або клітини, що несе цільову молекулу. Будь-який спеціаліст у даній галузі може оцінити, що терапевтичні агенти можуть включати різноманітні лікарські засоби, такі як вінбластин, дауноміцин та подібні, цитотоксини, такі як природний або модифікований екзотоксин Рзепдотопаз або дифтерійний токсин, - інкапсульовані агенти (наприклад, ліпосоми), які самі по собі містять фармакологічні композиції, радіоактивні со агенти, такі як 125|, 32р, 14С, ЗН, 355 та інші мітки, націлювальні залишки та ліганди.

Вибір певного терапевтичного агенту залежить від конкретної цільової молекули або клітини та біологічного "ч ефекту, який бажано викликати. Таким чином, наприклад, цитотоксичний агент може бути цитотоксином, який використовується для руйнування певної цільової клітини. Навпаки, якщо бажано викликати тільки нелетальну біологічну відповідь, терапевтичний агент може бути кон'югований з нелетальним фармакологічним агентом або ліпосомою, що містить нелетальний фармакологічний агент. о З терапевтичними агентами та антитілами, що забезпечуються у даному винаході, будь-який спеціаліст у даній галузі легко зможе сконструювати різноманітність клонів, що містять функціонально еквівалентні іме) нуклеїнові кислоти, такі нуклеїнові кислоти, які відрізняються послідовностями, але які кодують ту саму послідовність ЕМ або послідовність антитіла. Таким чином, даний винахід забезпечує нуклеїнові кислоти, що 60 кодують антитіла та кон'югати, а також їх злиті білки.

Рекомбінантні способи

Послідовності нуклеїнових кислот згідно з даним винаходом можуть бути приготовлені будь-яким прийнятним способом, включаючи клонування прийнятних послідовностей або прямим хімічним синтезом за допомогою методів, таких як фосфодіестеровий спосіб |Магапу ей аї. // Мей. Еплутої. - 1979. - 68. Р. 90-99); 65 фосфодіестеровим способом |Вгом/п еї аї. // Мей. Епгутої. - 1979. - 68. - Р. 109-151); ді(егилфосфорамідатним способом |Веаисаде еї аїЇ. // Тема. Гей. - 1981. - 22. - Р. 1859-1862); твердофазним фосфорамідатним триестеровим способом |Веаисаде 5 Сагційпеге // Тейга. Іейв. - 1981. - 22(20). - Р. 1859-1862), наприклад, використовуючи автоматичний синтезатор |Меедпатап-МапОемапіег еї аї. // Мисі. Асідз Кев. - 1984. - 12. - Р. 6159-6168); та способом при використанні твердої основи згідно з (05, 4,458,066). Хімічним синтезом одержують одноланцюговий олігонуклеотид. Він може бути перетворений у дволанцюгову ДНК шляхом гібридизації з комплементарною послідовністю, або шляхом полімеризації з ДНК-полімеразою при використанні одного ланцюга як матриці. Будь-який спеціаліст у даній галузі знає, що оскільки хімічний синтез ДНК обмежений послідовностями довжиною приблизно 100 пар основ, довші послідовності можуть бути одержані лігуванням коротших послідовностей. 70 У бажаному втіленні послідовності нуклеїнових кислот згідно з винаходом готують при використанні методики клонування. Приклади прийнятних методик клонування та секвенування та інструкції, достатні для того, Щоб дати підказки спеціалістові що має навички у клонуванні, можуть бути знайдені у ІЗатргооК еї аї. //

Моїесшаг Сіопіпда; А Іарогаїгу Мапиа! (279 Ей.). Соїд бргіпд Нагрог І арогаїогу. - 1989, - Моїв. 1-3.; Вегдег,

Кіттеї (едв.), Сціде Моїіесшаг Сіопіпд Тесппідцез, Асадетіс Ргевзв, Іпс., Зап Оівдо СА, 1987; А!йзвибеї еї 75 аї. «(едв.), Сиптепі Ргоїосоіїв іп Моїіесшаг Віооду, ОСгеепе Рибіїзпіпя апа УМіеу-Іпіегвсіепсе, МУ, 1987).

Інформація виробників стосовно біологічних реагентів та експериментального обладнання також може забезпечити корисну інформацію. Такі виробники включають хімічну компанію ЗІСМА (зЗаїпі І оціз, МО), КО

Зузвіетв (Міппеароїїз, ММ), Рпагтасіа І КВ ВіоїесппоЇоду (Різсаїажау, МОУ), СГОМТЕСН І арогагієев, Іпс. (Раїо

Ай, СА), Спет Сепез Согр., АіІагісн Спетіса! Сотрапу (Мім'"ашКее, МУТ), СіІеп Кезеагсі, Іпс., ОПІВСО ВК. І Ге го Тесппоіодіев, пс. (Сайпегерегд, МО), Ріка СПНетіса-Віоспетіка Апаїуйка (Ріка Спетіеє Ас, Висв,

Зм/їгепапа), Іпийгодеп (Зап Оіедо, СА) та РЕ Арріїей Віозувіетв (РБовіег Спйу, СА), а також стосуються багатьох інших комерційних джерел, відомих спеціалісту у даній галузі.

Нуклеїнові кислоти, що кодують природні ефекторні молекули (ЕМ) або анти-ЕСЕКМІЇ антитіла, можуть бути модифіковані для створення ЕМ, антитіл, або імунокон'югатів згідно з даним винаходом. Модифікації при Га використанні сайт-направленого мутагенезу добре відомі у даній галузі техніки. Нуклеїнові кислоти, що кодують

ЕМ або анти-ЕСЕРМІЇ антитіла, можуть ампліфікуватись за допомогою способів іп міго. Способи ампліфікації і9) включають полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР), лігазну ланцюгову реакцію (ЛЛР), ампліфікаційну систему, що базується на транскрипції (ТА5Б), самопідтримувану систему реплікації послідовностей (35К). Широка різноманітність способів клонування, хазяйських клітин та ампліфікаційних методик добре відомі спеціалісту у рч- даній галузі.

У бажаному втіленні імунокон'югати готують вбудовуванням кДНК, яка кодує анти-ЕСЕРМІЇ зсЕм антитіло, у о вектор, який включає кКДНК, що кодує ЕМ. Інсерція була зроблена таким чином, що зсЕм та ЕМ зчитуються у «ч- рамці, і містяться в одному поліпептиді, який має функціональну ділянку Ем та функціональну ділянку ЕМ. В особливо бажаному втіленні КДНК, що кодує фрагмент дифтерійного токсину, лігують до зсЕм. У найбільш - бажаному втіленні КДНК, що кодує РЕ або його цитотоксичний фрагмент, лігується до зсЕм так, що токсин - розташовується на карбоксильному кінці зсЕм. У найбільш бажаному втіленні цитотоксичний фрагмент представляє собою РЕЗ8.

Нуклеїнова кислота, яка кодує ЕМ, анти-ЕСЕКМІЇЇ антитіло, або імунокон'югат згідно з даним винаходом « ізолюють та клонують, при цьому будь-яка особа може експресувати бажаний білок у клітині, одержаній за 70 допомогою генетичної інженерії. Очікується, що спеціаліст у даній галузі має достатньо знань стосовно - с багаточисленних експресійних систем, доступних для експресії білка, включаючи Ес.соїії, інших бактеріальних ц хазяїв, дріжджі та різноманітні вищі еукаріотичні клітини, такі як СО5, СНО, Неї а та мієломні клітинні "» лінії. Не може бути зроблено жодної спроби описати у деталях різноманітні способи, відомі для експресії білків у прокаріотах або еукаріотах. Коротко, експресія природних або синтетичних нуклеїнових кислот, що

Кодують ізольовані білки згідно з винаходом, буде типово досягатись за допомогою оперативного з'єднання ДНК -І або кДНК з промотором (який є або конститутивним або індуцибельним), після цього проводять вбудовування в експресійну касету. Касети можуть бути придатними для реплікації та інтеграції або у прокаріотах, або в 7 еукаріотах. Типові експресійні касети містять термінатори транскрипції та трансляції, послідовності - ініціювання, промотори, корисні для регуляції експресії ДНК, що кодує білок. Зручно, коли касети вводять у плазміди, які також містять один або більше генів стійкості до антибіотиків. Для одержання високого рівня і-й експресії клонованого гена бажано конструювати експресійні касети, які містять, як мінімум, сильний промотор "І для керування транскрипцією, сайт, що зв'язує рибосому для ініціації трансляції та термінатор транскрипції/трансляції. Для Е.соїї такий включає промотор, такий як промотор 17, ігр, Іас або фага лямбда, сайт зв'язування рибосоми та бажано сигнал термінації транскрипції. Для еукаріотичних клітин контрольні послідовності можуть включати промотор та бажано енхансер, що має походження від імуноглобулінових генів,

ЗМ40, цитомегаловірусу та послідовності поліаденілування, а також може включати донорні та акцепторні о послідовності сплайсингу. Касети згідно з винаходом можуть бути перенесені у вибрану хазяйську клітину добре ко відомими способами, такими, як опосередкована хлоридом кальцію трансформація або електропорація для

Е.соїї, обробка фосфатом кальцію, електропорація або ліпофекція для клітин ссавців. Клітини, трансформовані бор касетами, можуть піддаватись селекції на стійкість до антибіотиків, що забезпечується генами стійкості, що містяться у касетах, такими як атр, Кап, орі, пео, пуд генами. Стійкість до канаміцину та стійкість до ампіциліну є бажаними втіленнями при роботі з фагом.

Будь-який спеціаліст у даній галузі повинен визнати, що модифікації можуть бути проведені з нуклеїновою кислотою, яка кодує поліпептид згідно з даним винаходом (тобто, анти-ЕСЕКМІ антитіло, РЕ, або 65 імунокон'югат, утворений їх комбінацією) без зменшення їх біологічної активності. Можуть бути зроблені деякі модифікації для поліпшення клонування, експресії, або вбудовування цільової молекули у злитий поліпептид.

Такі модифікації добре відомі спеціалісту у даній галузі та включають, наприклад, метіонін, який додається до амінотермінального кінця для забезпечення сайту ініціації, або додаткові амінокислоти (наприклад, полі Нів), які розміщують або на кінці для створення зручних рестрикційних сайтів, або кодонів термінації, або послідовностей очистки.

Додатково до рекомбінантних способів, імунокон'югати, ЕМ та антитіла згідно з даним винаходом можуть також бути сконструйовані взагалі та зокрема при використанні стандартного способу синтезу пептидів.

Твердофазний синтез поліпептидів згідно з даним винаходом менших, ніж 50 амінокислот у довжину, може виконуватись шляхом приєднання С-термінального кінця амінокислотної послідовності до нерозчинної основи, 7/0 Після цього проводять послідовне додання у послідовність амінокислот, що залишились. Методики для твердофазного синтезу описані |Вагапу 8: Мегтійєій. Те Реріідев: Апаїузіз, Зупіпевів, Віоіоду. Мої.2:

Зресіаї Меїйодз іп Реріїде Зупіпевзіз, Рай А. Р. 3-284; Мегтійей еї аї. / 9). Ат. Спет. Бос. - 1963. - 85. - Р. 2149-2156; іемаг еї аіЇ.,, Зоїд Рпазе Рерііде Зупіпевів, 27 Рієгсе Спет. Со., Боскога, І. (1984)).

Білки більшої довжини можуть бути синтезовані шляхом конденсації аміно- та карбокси-термінальних кінців 75 Коротших фрагментів. Способи формування пептидних зв'язків шляхом активації карбокситермінального кінця (наприклад, шляхом використання зв'язувального реагенту М, М'-дициклогексилкарбодиіміду) відомі спеціалісту У даній галузі.

Очистка

Після експресії рекомбінантні імунокон'югати, антитіла та/або ефекторні молекули згідно з даним винаходом повинні бути очищені згідно зі стандартними способами, відомими у даній галузі, включаючи преципітацію сульфатом амонію, афінні колонки, іон-обмінні колонки, колонки для гель-фільтрації та серійної хроматографія, тощо ІК.Зсоревз, Ргоїеіп Ригійсайоп, Зргіпдег-Мепад. - М.М., 1982). Суттєво чисті композиції, принаймні ті, що мають приблизно 90-9595 гомогенність, є бажаними, а ті, що мають гомогенність 98-9995, є найбільш бажаними для фармацевтичного використання. Очищені частково або до бажаної гомогенності поліпептиди, Га якщо використовуються терапевтично, будуть суттєво вільними від ендотоксину.

Способи для експресії одноланцюгового антитіла та/або повторної зборки до прийнятно активної форми, і9) включаючи одноланцюгові антитіла, одержані від бактерій, таких як Е.соїї, описані та добре відомі, вони є такими, що застосовуються до антитіл згідно з даним винаходом, та введені у заявку як посилання |ІВисппег еї аІ. // Апаї. Віоспет. - 1992. - 205. - Р. 263-270; РінсК(йит // ВіоїесппоІоду. - 1991. - 9. - Р. 545; Низе єї |"- зо а. // Зсіепсе/ - 1989. - 246. - Р. 1275; Мага еї а). // Майиге. - 1989. - 341. - Р. 544).

Часто функціональні гетерологічні білки з Е.соїї або інших бактерій, ізольовані з тілець включення, о потребують розчинення при використанні сильних денатурантів, та подальшої повторної зборки. Під час етапу -(ч- розчинення, що добре відомий у даній галузі техніки, відновлювальний агент може бути присутнім для відновлення дисульфідних зв'язків. Типовий буфер з відновлювальним агентом містить 0,1М Трис, рН 8, ЄМ - 3з5 Ггуанідин, 2иМ ЕДТА, 0,3М ОТЕ (дитіоеритритол). Повторне окислення дисульфідних зв'язків може відбуватисьу присутності тіолових реагентів з низькою молекулярною вагою у редукованій та окисленій формі, як описано у

Ізахепа еї аї. // Віоспетівігу. - 1970. - 9. - Р. 5015-5021), що введене у дану заявку як посилання, та зокрема описане у |Висппег еї аї. // Апа!. Віоспет. -1992. - 205. - Р. 263-270). «

Ренатурація типово супроводжується розведенням (наприклад, 100-кратним) денатурованого та редукованого білка у буфері для самозборки. Типовий буфер має склад 0,1М Трис, рН 8,0, 0,5М І-аргінін, 8мМ с окислений глутатіон (3555) та 2ММ ЕДТА. й Як модифікація пропису, що стосується очистки дволанцюгового антитіла, ділянки важкого та легкого "» ланцюгів окремо розчиняють та редукують, а потім комбінують у розчині для повторної зборки. Бажаний вихід одержували, коли ці два білюи перемішували у молярному співвідношенні, такому, що 5-кратний молярний надлишок одного білка понад іншим, не було перевершено. Бажано додавати надлишок окисленого глутатіону -І або інших окислювальних сполук з низькою молекулярною вагою до середовища зборки після закінчення окисно-відновлювального перерозподілу. і Екзотоксин Рзейдотопазг та інші токсини - Для одержання імунотоксинів токсини можуть використовуватись разом з антитілами згідно з даним винаходом. Типові токсини включають рицин, абрин, дифтерійний токсин або їх субодиниці, а також токсини і-й ботулізму від А до РЕ. Ці токсини є легкодоступними з комерційних джерел ІЗідта Спетіса! Сотрапу, ЗК оців, "І МОЇ. Дифтерійний токсин ізольований з Согуперасіегішт аірпіНегіае. Рицин представляє собою лектин КСАбО з

Кісіпиз соттипіз (Савіог Ббеап). Цей термін також відноситься до його токсичних варіантів, наприклад, (5, 5,079,163; 05, 4,689,401). Аглютинін Кісіпиз соттипів (КСА) існує у двох формах, позначених як КСАбО та РСА120, У відповідності з їх молекулярною вагою приблизно б5кДа та 120кДа, відповідно |(Міспоївоп 8: Віаийзіевїп

Лу. Віоспіт. Віорпуз. Асіа. - 1972. - 266. - Р. 543). Ланцюг А відповідає за інактивацію білкового синтезу о та руйнування клітин. Ланцюг В зв'язує рицин з галактозними залишками на поверхні клітини та покращує ко транспорт А ланцюга у цитозоль |ОіІвзпезз еї аї. // Майиге. - 1974. - 249. - Р. 627-631; 05, 3,060,1651.

Абрин включає токсичні лектини з Абгиз ргесаїйогіи5. Токсичні складові абрину а, б, с та ай мають бо молекулярну вагу 63-67/кДа та складаються з двох поліпептидних ланцюгів А та В, з'єднаних за допомогою дисульфідного зв'язку. Ланцюг А інгібує білковий синтез, В-ланцюг (абрин-б) зв'язується з залишками

О-галактози |Рипаїви еї аї. // Адг. Віої. Спет. - 1988. - 52. - Р. 1095; ОІвпевзв // Меїйодз Епгутої. 1978. - 50.- Р. 330-335).

У бажаних втіленнях даного винаходу токсин є екзотоксином А Рзейдотопаз (РЕ). Нативний РЕ представляє 65 собою дуже активний мономерний білок (молекулярна вага ббкДа), що секретується Рзейдотопаз аегидіповза, який інгібує синтез білків в еукаріотичних клітинах. Нативна РЕ послідовність забезпечується відповідно до

(О5, 5,602,095). Спосіб дії полягає в інактивації фактора 2 елонгації (ЕБР-2) за допомогою АДФ-рибозилування.

Екзотоксин містить три структурні домени, які впливають узгоджено на цитотоксичність. Домен Іа (амінокислоти 1-252) опосередковує клітинне зв'язування. Домен Ії (амінокислоти 253-364) відповідає за транслокацію у ЦИтозолЬ, а домен Ш (амінокислоти 400-613) опосередковує АДФ рибозилювання фактора 2 елонгації. Функція домена б (амінокислоти 365-399) залишається невизначеною, незважаючи на те, що він складає велику частину, амінокислоти 365-380, можуть бути делетовані без втрати цитотоксичності.

Термін "екзотоксин Рзепдотопавз", як такий, що використовується у контексті даної заявки, відноситься до нативної послідовності, цитотоксичного фрагменту нативної послідовності та консервативно модифікованих /о варіантів нативного РЕ та їх цитотоксичним фрагментам. У бажаному втіленні молекула РЕ модифікується для делетування домену Іа, для зменшення або руйнування неспецифічного зв'язування токсину. Цитотоксичні фрагменти РЕ включають ті, які мають цитотоксичність з або без відповідним протеолітичним або іншим процесуванням у цільовій клітині (наприклад, як білок або попередник білка). Цитотоксичні фрагменти РЕ включають РЕ40, РЕЗ5. РЕ40 є вкороченою похідною РЕ, як було раніше описано у даній галузі техніки ІРаї еї 7/5 81. // Ргос. Май. Асай. Зсі ОЗА. - 1991. - 88. - Р. 3358-3362; Копао еї а. // У. Віої. Спет. - 1988. - 263. - Р. 9470-9475). РЕЗ5 є карбокситермінальним фрагментом РЕ з молекулярною вагою З5кДа, що відповідає амінокислоті 280, після якої йдуть амінокислоти 281-364 та 381-613 нативного РЕ. РЕЗ8 є вкороченим попередником РЕ, що складається з амінокислот 253-364 та 381-613 РЕ. РЕЗ8 активується до своєї цитотоксичної форми при процесуванні усередині клітини (05, 5,608,0391.

В особливо бажаних втіленнях РЕЗ8 є токсичним залишком імунотоксину згідно з винаходом. Проте, цитотоксичні фрагменти РЕЗ5 та РЕ40 також можуть використовуватись. Ці фрагменти розкриті у (05, 5,602,095; 5, 4,892,827)|, кожний з яких введений у дану заявку як посилання. Спираючись на роботу, що проводилась з імунотоксинами, які базуються на МК1, КОЕЇ. є бажаною модифікацією С-термінальної послідовності | огітег еї а). // Ргос. Май). Асад. Зсі ОБА. - 1996. - 93. - Р. 14815-14820). с

Консервативно модифіковані варіанти РЕ

Консервативно модифіковані варіанти РЕ або його цитотоксичні фрагменти мали принаймні 8095 подібність і) до послідовності, бажано принаймні 8595 подібності до послідовності, більш бажано принаймні 9095 подібності до послідовності, та найбільш бажано принаймні 9595 подібності до послідовності на амінокислотному рівні з РЕ, що представляє інтерес, таким як РЕЗ8. М зо Термін "консервативно модифіковані варіанти" застосовується як до амінокислотних послідовностей, так і для послідовностей нуклеїнових кислот. Стосовно певних послідовностей нуклеїнових кислот консервативно юю модифіковані варіанти відносяться до тих послідовностей нуклеїнових кислот, які кодують ідентичні або суттєво «- ідентичні амінокислотні послідовності, або, якщо нуклеїнова кислоти не кодує амінокислотної послідовності, то до суттєво ідентичних послідовностей нуклеїнових кислот. З причини виродженності генетичного коду велика - кількість функціонально ідентичних нуклеїнових кислот кодує будь-який даний поліпептид. Наприклад, кодони ї-

ССА, СС, СО та ОС усі кодують амінокислоту аланін. Таким чином, у кожному положенні, де аланін визначається кодоном, кодон може бути змінений на відповідні кодони, що описують без зміни поліпептид, що кодується. Такі варіації нуклеїнової кислоти є "мовчазними варіаціями", що представляють собою один з видів консервативно модифікованих варіацій. Кожна послідовність нуклеїнової кислоти у даній заявці, що кодує « поліпептид, також описує кожну можливу мовчазну варіацію нуклеїнової кислоти. Будь-який спеціаліст у даній з с галузі визнає, що кожний кодон у нуклеїновій кислоті (за винятком АОС, який звичайно є єдиним кодоном для . метіоніну, та ОО, який є єдиним кодоном для триптофану) може бути змінений для одержання функціонально и?» ідентичної молекули. Таким чином, кожну мовчазну варіацію нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид, мають на увазі у кожній описаній послідовності.

Щодо амінокислотних послідовностей, то слід сказати, що будь-який спеціаліст знає, що індивідуальні -І заміни, делеції або вставки у послідовність нуклеїнової кислоти, пептиду, поліпептиду або білка, які змінюють, додають або делетують одну амінокислоту або невеликий процент амінокислот у послідовності, що - кодується, є "консервативно модифікованими варіантами", в яких заміна приводить до заміни амінокислоти - хімічно подібною амінокислотою.

Аналіз цитотоксичності РЕ о Екзотоксини Рзепдотопаз, що використовуються у даному винаході, можна визначати для бажаного рівня "М цитотоксичності за допомогою аналізів, що добре знайомі спеціалісту у даній галузі. Наприклад, цитотоксичність часто вимірюють при використанні інгібування білкового синтезу за допомогою екзотоксину

Рзейдотопаз як заміщувального засобу, наприклад, | огітег еї аЇ. // Ргос. Май. Асад. сі ОБА. - 1996. - 93. дво З Р. 14815-14820). Зручно, щоб це можна було зробити вимірюванням поглинання радіоактивно міченої амінокислоти клітинами як показано у (|Ргоїг еї аїЇ. // Сей. - 1991. - 64. - Р. 1017-1023), що у нормі не

Ф) експресують ЕСЕЕМІЇ, але які було трансфіковано за допомогою кКДНК ЕСЕЕМІЇ. ка У прикладах, наведених нижче, надходження лейцину, міченого тритієм, вимірювали в МКЄМ клітинах (Зм/із5

ЗТЗ клітини, вибрані завдяки відсутності експресії мишиного ЕСЕКМІЇЇ та трансфіковані КДНК ЕСЕКМІЇІЇ людини). бо Таким чином, цитотоксичні фрагменти можуть бути легко проаналізовані на цитотоксичність.

Велика кількість кандидатних РЕ молекул може бути перевірена одночасно на цитотоксичність за допомогою способів, що добре відомі у даній галузі техніки. Наприклад, підгрупи кандидатних молекул можуть бути перевірені на цитотоксичність. Підгрупи кандидатних молекул, що мають позитивну реакцію, можуть бути розділені та повторно проаналізовані до тих пір, поки не буде ідентифіковано бажаний цитотоксичний 65 фрагмент(и). Такі способи дозволяють проводити швидкий скрінінг великої кількості цитотоксичних фрагментів або консервативних варіантів РЕ.

Інші терапевтичні залишки

Антитіла згідно з даним винаходом можуть також використовуватись для націлювання будь-якої кількості різноманітних діагностичних або терапевтичних сполук на клітини, які експресують ЕСЕКМІЇ на своїй поверхні.

Таким чином, антитіло згідно з даним винаходом, таке, як анти-ЕСЕКМІІЇ всЕмМ, може бути приєднане безпосередньо або за допомогою лінкера до препарату, який прямо доставляється до клітин, що несуть

ЕСЕРМІЇІ. Терапевтичні агенти включають такі сполуки як нуклеїнові кислоти, білки, пептиди, амінокислоти або їх похідні, глікопротеїни, радіоіїзотопи, ліпіди, вуглеводи або рекомбінантні віруси. Нуклеїнова кислота терапевтичних та діагностичних залишків включає антисмислові нуклеїнові кислоти, дериватизовані 7/0 олігонуклеотиди для ковалентного перехресного зв'язування з одноланцюговою або дволанцюговою ДНК та олігонуклеотиди, що формують триплети.

Альтернативно, молекула, зв'язана з анти-ЕСЕКМІЇ антитілом може бути інкапсуляційною системою, такою як ліпосома або міцела, що містить терапевтичну композицію, таку як лікарський препарат, нуклеїнова кислота (наприклад, антисмислова нуклеїнова кислота), або інший терапевтичний залишок, що бажано захищений від 7/5 прямої дії циркуляторної системи. Способи приготування ліпосом, приєднаних до антитіл, добре відомо спеціалісту у цій галузі, наприклад, (5, 4,957,735; Соппог еї аї. // Рпагт. Тпег. - 1985. - 28. - Р. 341-365).

О. Мітки, що детектують

Антитіла згідно з даним винаходом можуть бути необов'язково ковалентно або нековалентно зв'язані з міткою, що детектується. Мітки, що детектуються, та які придатні для такого використання, включають будь-яку Композицію, що визначається спектроскопічними, фотохімічними, імунохімічними, електричними, оптичними способами. Корисні мітки у даному винаході включають магнітні кульки (наприклад, ОЮММАВЕАЮЗ5), флуоресцентні барвники (наприклад, флуоресцеїн ізотіоціанат, техаський червоний, родамін, зелений флуоресцентний білок тощо), радіомітки (наприклад, УЗН, 7291, 355, б або ЗР), ферменти (наприклад, пероксидазу хрону, лужну фосфатазу, люциферазу та інші що широко використовуються в ЕЕГ ІЗА) та Га Колориметричні мітки, такі як колоїдне золото або кульки з кольорового скла або з пластику (наприклад, полістерину, поліпропілену, латексу тощо). і9)

Засоби для визначення таких міток добре знайомі спеціалісту у даній галузі. Таким чином, наприклад, радіомітки можуть детектуватись при використанні фотографічної плівки або сцинтиляційного лічильника, флуоресцентні маркери можуть визначатись за допомогою фотодетектора для визначення випромінюваного - світла. Ферментативні мітки типово детектуються при забезпеченні ферменту та субстрату та визначенні реакції продукту, що утворюється при дії ферменту на субстрат, та колориметричних міток, які визначаються простою юю візуалізацією кольорової мітки. «ч-

Кон'югація з антитілом

У нерекомбінантному втіленні винаходу ефекторні молекули, наприклад, терапевтичні, діагностичні, або - детектувальні залишки, зв'язуються з анти-ЕСЕКМІІ антитілом згідно з даним винаходом при використанні - будь-якого з цілого ряду засобів, що добре відомі спеціалісту у даній галузі. Засоби як ковалентного, так і нековалентного приєднання, можуть використовуватись з анти-ЕСЕКМмІіЇЇ антитілами за даним винаходом.

Процедура приєднання ефекторної молекули до антитіла буде варіювати в залежності від хімічної структури «

ЕМ. Поліпептиди типово містять різноманітність функціональних груп; наприклад, карбоксильну кислоту (СООН), 70 вільний амін (-МН2) або сульфгідрильні (-5Н) групи, які є доступними для реакції з прийнятною функціональною - с групою антитіла для того, щоб приводити до зв'язування ефекторної молекули. й Альтернативно, антитіла дериватизують для піддання дії або приєднання додаткових реактивних "» функціональних груп. Дериватизація може включати приєднання будь-якого числа лінкерних молекул, таких, як ті, що доступні від Ріегсе Спетіса! Сотрапу, КоскКога ПШіпоів. "Лінкер" як такий, як використовується у контексті даної заявки, є молекулою, що використовується для -І приєднання антитіла до ефекторної молекули. Лінкер здатний до формування ковалентних зв'язків як з антитілом, так і з ефекторною молекулою. Прийнятні лінкери добре знайомі спеціалісту у даній галузі та і включають, але не обмежені, вуглецеві лінкери з нерозгалуженими або розгалуженими ланцюгами, - гетероциклічні вуглецеві лінкери або пептидні лінкери. Якщо антитіло та ефекторна молекула є поліпептидами, лінкери можуть приєднуватись до складових амінокислот через їх бічні групи (наприклад, через дисульфідний і-й зв'язок до цистеїну). Проте, у бажаному втіленні лінкери будуть приєднуватись до альфа-карбонову аміно- та "І карбоксильну групу термінальних амінокислот.

У деяких випадках бажано вивільнити ефекторну молекулу з антитіла, коли імунокон'югат досягне свого цільового сайту. Розщеплення лінкера для вивільнення ефекторної молекули з антитіла може бути викликане ферментативною активністю або умовами, дії яких піддається імунокон'югат або усередині цільової клітини або поблизу цільового сайту. Коли цільовий сайт є пухлиною, то може використовуватись лінкер, який розрізується

Ф, при умовах, які присутні у пухлинному сайті (наприклад, коли піддається дії асоційованих з пухлиною ферментів ко або кислого рН).

З огляду на велику кількість способів, які були викладені для приєднання різноманітності бо радіодіагностичних сполук, радіотерапевтичних сполук, лікарських препаратів, токсинів та інших агентів, до антитіл будь-який спеціаліст у даній галузі здатний визначити прийнятний спосіб для приєднання даного агенту до антитіла або іншого поліпептиду.

МІЇ. Фармацевтичні композиції та введення

Композиції антитіла та/або імунокон'югату згідно з винаходом (тобто РЕ, зв'язані з антитілом, з Ка для 65 епітопу ЕСЕРЕМІЇ, що є принаймні на їнНМ нижче, ніж таке для МК), є корисними для введення у мозок.

Використання імунотоксинів для терапії мозкових пухлин було нещодавно розкрито в огляді (Оїатйеїа, Е., Мошціе,

К. // бит. Тор. Місгоріої. ІттипоЇї. 1998. - 234. - Р. 997-114). Невеликі поліпептиди долають гемато-енцефалічний бар'єр. Для довших поліпептидів, які не можуть подолати гемато-енцефалічний бар'єр, добре відомі способи введення білків у мозок. Наприклад, білки, поліпептиди та інші сполуки клітин можуть Доставлятись до мозку ссавців за допомогою інтрацеребровентрикулярної (ІСМ) ін'єкції або через канюлю

Мона 5: Мапйіпі / Ргос. Бос. Ехр. Віої. Меа. 1981. - 168. - Р. 62-64); Рейфегвоп еї аїЇ. // Віоспет.

Рпагтасої. 1982. - 31. - Р. 2807-2810; Клгерсгупекі еї аї. // Мейар. Вгаіїп Оів. - 1988. - 3. - Р. 211-216;

Ї еіром/й? еф а). / Вгаійп Кез. Ви. - 1988. - 21. - Р. 905-912; БгатКа сеї аїЇ. // Біегеоїасі. Еипсі.

Меогізигу. - 1992. - 58. - Р. 79-83; Репд еї аїЇ. // Вгаіїп Кев. - 1993. - 632. - Р. 57-67; Спет еї аї. // Ехр. 70 Меийгої. - 1994, - 125. - Р. 72-81; МікКНайп еї аїЇ. // Мейгозсіепсе. - 1994. - 63. - Р. 57-72; Апдегзоп еї аї.

ЛП). Сотр. Меигої. - 1995. - 357. - Р. 296-317; Вгескпеї! 5 Рам/сей // Ехр. Меигої. - 1996. - 138. - Р. 338-344).

Таким чином, гліобластома може лікуватись за допомогою локалізованої доставки через канюлю або шприц до тканини, що оточує пухлину, або більш загально усередину компартменту центральної нервової системи шляхом ІСМ. Додатково, імунокон'югати можуть вводитись системно, якщо, наприклад, гліобластома пацієнта зруйнувала епітеліальні клітини достатньо для того, щоб дозволити порушення гемато-енцефалічного бар'єру.

Антитіло або імунокон'югати за даним винаходом можуть також вводитись локально або системно для лікування карциноми молочної залози, яєчника, легень. Наприклад, ці злоякісні утворення можуть лікуватись шляхом прямої ін'єкції у пухлини, які не можуть бути видалені хірургічно. Ці карциноми можуть також лікуватись шляхом парентерального введення імунокон'югатів, наприклад, локалізуватись та руйнувати будь-які 2о метастатичні клітини, що ще не сформували пухлини достатнього розміру для того, щоб лікуватись радіацією або хірургічними способами, або бути такими, що легко визначаються.

Композиція для введення буде взагалі включати розчин антитіла та/або імунокон'югату, розчиненого у фармацевтично прийнятному носії, бажано водному носії. Може використовуватись різноманітність водних носіїв, наприклад, забуферений фізіологічний розчин, тощо. Ці розчини є стерильними та, звичайно, вільні від сч небажаних речовин. Ці композиції можуть стерилізуватись за допомогою традиційних, добре відомих способів стерилізації. Композиції можуть містити фармацевтично прийнятні ауксилярні речовини, як вимагається для і) наближення до фізіологічних умов, такі як агенти для доведення рН та забуферювальні агенти, агенти для доведення токсичності тощо, наприклад, ацетат натрію, хлорид натрію, хлорид калію, хлорид кальцію, лактат натрію тощо. Концентрація злитого білка у цих композиціях може дуже широко варіювати та буде вибиратись, ї-

Зр Головним чином, базуючись на рідких об'ємах, в'язкості, вазі тіла, тощо, згідно зі специфічним вибраним способом призначення та потребами пацієнта. юю

Таким чином, типова фармацевтична композиція імунотоксину згідно з даним винаходом для введення у «- мозок буде складати приблизно 1,2-1200мкг на день. Типова композиція для інтравенозного призначення при лікуванні карциноми молочної залози, яєчника, або легень буде складати приблизно 0,1-10мг на день для в. пацієнта. Дози 0,1-100мг на пацієнта на день можуть використовуватись, зокрема, якщо лікарський препарат ї- вводиться до віддаленого сайту та не потрапляє у циркуляторну або лімфатичну систему, як наприклад у порожнину тіла або у просвіт органу. Існуючі способи для приготування композицій для введення є відомими та зрозумілими для спеціаліста у даній галузі, а також описані у деталях у таких публікаціях, як (Кетіпдіоп'з

Рпагтасеціїса! Зсієпсе, 1917 Ед., Маск Ривіїзпіпд Сотрапу, Еазіоп, Реппзуїмапіа, 1995). «

Композиції згідно з винаходом можуть вводитись для терапевтичного лікування. При терапевтичних - с застосуваннях композиції вводяться пацієнтові що страждає на захворювання, такого як гліобластома, й карцинома молочної залози, карцинома яєчника або легенева карцинома, у кількості, достатній принаймні для "» уповільнення розвитку або частинного затримання захворювання або його ускладнень. Кількість, необхідна для досягнення цього, визначається як "терапевтично ефективна доза". Кількості, ефективні для цього використання, залежать від тяжкості захворювання та загального стану здоров'я пацієнта. Ефективна кількість сполуки є -І такою, що забезпечує або суб'єктивне позбавлення від симптомі, або поліпшення стану, що об'єктивно визначається клінічними або іншим кваліфікованим обстеженням.

Ше Одноразове або багаторазове введення композиції призначають в залежності від дози та частоти, які - необхідні та допустимі для пацієнта. У будь-якому випадку композиція буде забезпечувати достатню кількість білків за винаходом для ефективного лікування пацієнта. Бажано, щоб доза вводилась один раз, але може і-й застосовуватись періодично або до тих пір, поки не буде досягнуто терапевтичного результату, або до тих пір, "І поки побічні ефекти не призведуть до закінчення терапії. Взагалі, доза є достатньою для лікування або полегшення симптомів або ознак захворювання без продукування неприйнятної для пацієнта токсичності.

Контрольоване вивільнення парентеральних композицій імунокон'югатних композицій за даним винаходом

Може бути досягнуто при використанні як імплантату, так і масляних ін'єкцій, або сипучих систем. Системи білкової доставки розглянуті у (Вапда, А.)., ТНегареціїс Рерііїдез апа Ргоїеіпе: ЕРогтиїайоп, Ргосезвіпд апа

Ф, Оеїїмегу Зувіетв, Тесппотіс Рибіїзпіпд Сотрапу, Іпс., І апсавзіеєг, НЕ, 1995). Специфічні системи включають ко мікросфери, мікрочастинки, мікрокапсули, нанокапсули, наносфери та наночастинки. Мікрокапсули містять терапевтичний білок як центральне ядро. У мікросферах терапевтична речовина диспергується у частинці. бо Частинки, мікросфери та мікрокапсули менші, ніж приблизно Імкм, взагалі називаються як наночастинки, наносфери, нанокапсули, відповідно. Капіляри мають діаметр приблизно 5мкм, таким чином, тільки наночастинки призначаються внутрішньовенно. Мікрочастинки мають розмір 10О0мкм у діаметрі та призначаються підшкірно або внутрішньом'язово, наприклад, у джерелах |Кгецшіег, )., СоПоіїда! Огид Оеїїмегу Зувіетв, у. Кгеціег, еад,

Магсе! ОекККег, Іпс., Мем Могк, ММ, рр.219-342 (1994); Тісе 5 Тарірі, Тгеайзе оп Сопігойей Огид Оеїїмегу, 65 А.Кудопіецз, ед., Магсе! Оеккег, Іпс., Мем/ ХогКк, МУ, рр.315-339 (1992)), що введені у дану заявку як посилання.

Полімери можуть використовуватись для іон-контрольованого вивільнення імунокон'югатної композиції за даним винаходом. Різноманітні полімерні матрикси, які є такими, що піддаються деградації, або ті, що не піддаються деградації, можуть використовуватися при контрольованій доставці препарату і є відомими у даній галузі техніки (апдег, К. // Ассоцпіз Спет. Кев5. - 1993. - 26. - Р. 537-542). Наприклад, блок сополімеру, полаксамеру 407 існує як густа, ще мобільна рідина при низьких температурах, але утворює напівтвердий гель при температурі тіла. Було показано, що він є ефективним носієм для створення та підтримання доставки рекомбінантного інтерлейкину-2 та уреази Юоппзіоп еї а). / Рпагт. Кев. - 1992. - 9. - Р. 425-434); Рес еї а). // У. Рагепі. Зсі. Тесп. - 1990. - 44(2). - Р. 58-65). Альтернативно, гідроксиапатит використовувався як мікроносій для контрольованого вивільнення білків (піета еї аїЇ. / Іпб 9. Ріагт. - 1994. - 112. - Р. 7/0. 215-224). Ще в одному аспекті, ліпосоми використовуються для контрольованого вивільнення, а також для націлювання ліпід-інкапсульованих лікарських засобів |Вейадегі ей а). Іірозоте ЮОгид ОЮеїїмегу Зувіетв,

Тесппотіс Рибіїзпіпд Со., Іпс., Іапсазіег, РА (1993)). Відомі багато чисельні додаткові системи для контрольованої доставки терапевтичних білків, наприклад, введені у дану заявку як посилання (5, 5,055,303; 5, 5,188,837; 5, 4,235,871; 05, 4,501,728; 05, 4,837,028; 05, 4,957,735; 05, 5,019,369; 05, 5,055,303; 5, 75. 2514,670; 05, 5,413,797; ОЗ, 5,268,164; 05, 5,004,697; 05, 4,902,5055 05, 5,506,206; 05, 5,271,961; 05, 5,254,342; 5, 5,534,496).

Різноманітні способи використання імунотоксинів за даним винаходом включають симптоми захворювання, спричинені специфічними людськими клітинами, що експресують ЕСЕКМІЇ, ці симптоми можуть бути усунені за допомогою токсичної дії імунокон'югату. Одним бажаним застосуванням для імунотоксинів за винаходом є

Лікування пухлинних клітин, що експресують ЕСЕРМІЇ. Типові пухлинні клітини включають клітини гліобластоми, карциноми молочної залози, карциноми яєчника та карциноми легень.

Діагностичні набори для використання іп мйго

В іншому втіленні цей винахід забезпечує набір для детектування ЕСЕКМІ у біологічному зразку. "Біологічний зразок", як використовується у контексті даної заявки, є зразком біологічної тканини або рідини, сч ру) містить ЕСЕМКМІЇЇ. Такі зразки включають, але не обмежені, тканину, одержану шляхом біопсії, слину, амніотичну рідину, кров та клітини крові (наприклад, лейкоцити). Рідкі зразки можуть представляти деякий і) інтерес, але вони звичайно не є бажаними, оскільки концентрації ЕСЕКМІЇЇ, що визначаються, рідко знаходять у зразку. Біологічні зразки також включають фрагменти тканин, такі як заморожені фрагменти, узяті для гістологічних досліджень. Біологічний зразок типово одержують з багатоклітинних еукаріот, бажано ссавців, М зо таких як щури, миші, корови, собаки, гвінейські свині, або кролі та більш бажано від приматів, таких як макаки, шимпанзе. Більш бажаними є біологічні зразки, одержані від людини. що)

Набори будуть типово включати анти-ЕСЕКМІІЇ зсЕм за даним винаходом, що має вищу афінність для «-

ЕСЕКМІЇ, ніж така для МК1 5сгЕУ.

Крім того, набори будуть звичайно включати інструкційні матеріали, що розкривають способи використання - антитіла за даним винаходом (наприклад, для детектування клітин, що містять ЕСЕРМІЇЇ, у зразку). Набори ї- можуть також включати додаткові компоненти для поліпшення специфічного застосування, для якого призначений набір. Таким чином, наприклад, набір може додатково містити мітку для детектування (наприклад, ферментні субстрати для ферментативних міток, комплекти для визначення флуоресцентних міток, прийнятні вторинні мітки, такі як баранячі анти-мишині-НРЕ, та інші). Набори можуть додатково включати буфери та інші « 0 реагенти, що звичайно використовуються на практиці для певного способу. Такі набори та прийнятні складові в с добре відомі спеціалістам у даній галузі. . В одному втіленні даного винаходу діагностичний набір включає імуноаналіз. Як описано вище, хоча деталі и?» імуноаналізів за даним винаходом можуть варіювати в залежності від специфічного способу, що використовується, спосіб детектування ЕСЕКМІ у біологічному зразку типово включає етапи контакту біологічного зразка з антитілом, яке специфічно реагує в імунологічно реактивних умовах з ЕСЕКМІЇЇ з вищою -І афінністю, ніж така, для МК1 зсЕм. Антитілу дозволяють зв'язуватися з ЕСЕРКМІЇЇ в імунологічно реактивних умовах, а присутність зв'язаного антитіла визначають безпосередньо або опосередковано. - Завдяки збільшеній афінності антитіл, одержаних за допомогою методів, описаних у даній заявці, та, - зокрема зсЕм, який позначається як МК1-1, антитіла, які забезпечуються даною заявкою, будуть особливо 5р Корисними як діагностичні агенти та в аналізах іп міго для визначення присутності ЕСЕКМІЇ! у біологічних 1 зразках. Наприклад, МК1-1 та інші антитіла, одержані за допомогою способів, описаних у даній заявці, можуть "М використовуватись як націлювальні залишки імунокон'югатів у імуногістохімічних аналізах для визначення, чи містить зразок клітини, що експресують ЕСКЕМІІЇ. Якщо зразок узятий з тканин пацієнта, які не здатні до нормальної експресії ЕСЕКМІІ, визначення ЕСЕКМІ буде показувати або, що пацієнт має пухлину, що ов характеризується присутністю клітин, що експресують ЕСЕБМІЇ, або, що лікування такої пухлини ще не було успішним у знищенні пухлини. Спеціалісти у даній галузі також зможуть оцінити, що анти-ЕСЕЕМІЇ антитіла за (Ф, винаходом, злиті з прийнятною міткою, можуть, очевидно, використовуватись іп мімо для визначення присутності ка клітин, що експресують ЕСЕКМІЇЇ надаючи, таким чином, можливість індикації того факту, що пацієнт має пухлину, або, що лікування такої пухлини ще не було успішним у знищенні пухлини. во Приклади

Приклад 1. Одержання антитіл з кращим зв'язування, ніж таке для МК1

Для відкриття антитіл з кращим зв'язуванням з ЕСЕЕМІЇЇ, ніж МАК, з використанням МК1 зсЕм були створені бібліотеки фагового виявлення. Випадкові мутації були введені у ділянку-3, яка визначає комплементарність, важкого ланцюга (Мн СОКЗ), у зону, яка відіграє основну роль у зв'язуванні антигену МасСайчт еї аї. // 9. 65 Мої. Віої. 1996. - 262. - Р. 732-745). Пенінг на клітинах, що експресують ЕСЕКМІЇЇ, дав змогу одержати декілька мутацій, які, якщо використовуються для конструювання імунотоксинів, дають поліпшені афінність,

цитотоксичність та вихід. Аналіз цих варіантів виявив, що вони усі мають мутації, локалізовані у ділянці Мн СОКЗ, яка визначена як гаряча точка для гіпермутації (Мейрегдег еї аїЇ. // Си. Оріп. Іттипої. - 1995. - 7. - Р. 248-254; ОоПуУ, С. 9. / Зетіп. ІттипоЇ. - 1996. - 8. - Р. 159-168; Меийбрегдег еї аїЇ. // Іттипоіодіса! Кем. - 1998. - 62. - Р. 107-116). Гаряча точка визначаються консенсусними послідовностями (з/А-5-Т/С-АЯ або

А-05-СЛ. Остання містить серинові кодони, які знаходять у варіабельному домені генів антитіл |Соуепеснеа еї а). // Ргос. Май. Асад. осі. ОБА. - 1996. - 93. - Р. 13979-13984). Гарячі точки є ділянками, які піддаються мутаціям з великою частотою під час формування антитіл. Пенінг М н СОМКЗ бібліотеки не приводить до одержання клонів, що містять мутації за межами гарячої точки. Цей результат підтверджує нещодавні відкриття, 7/0 що рендомізуючі гарячі точки більш сприятливі для одержання мутантів з поліпшеною афінністю (Споуапигу еї а). // Майцге Віогесппої. - 1999, - 17. - Р. 568-572). Найкращі зв'язувальні агенти, одержані шляхом пенінгу М н

СОКЗ бібліотеки, використовувались для створення бібліотеки фагового виявлення при рендомізації гарячої точки у легсому ланцюгу СОКЗ. Пенінг цієї бібліотеки дав змогу одержати ще декілька мутантних клонів з більш бажаними характеристиками.

Приклад 2. Конструювання мутантної бібліотеки Мн

Мн СОКЗ МК складається з одинадцяти амінокислот. Як було зазначено у вступі, малоймовірно, щоб дві з цих амінокислот приймали участь в антигенному зв'язуванні. Інші дев'ять амінокислот у Мн були мутовані шляхом заміщення усіх інших природних амінокислот, як визначено для амінокислотного залишку, який у нормі присутній у цьому положенні. Олігомери ДНК призначені для одержання трьох бібліотек кожного з дев'яти рендомізованих нуклеотидів (три послідовні амінокислоти). МК1 фагемід використовували як матрицю для вбудовування трьох амінокислотних рендомізацій СОКЗ важкого ланцюга у З окремих двоетапних полімеразних ланцюгових реакціях (ПЛР) (Фіг.1). Використовуються наступні олігомери: ВИ Що песни сне нинн нанні наніс т с 7 о

Фе вен с В сн сло г ї-

Щ о - -

У першій ПЛР, 5Опг фагеміди рСАМТАВ 5Е-МК1 застосовували як матрицю у трьох окремих реакціях, ї- використовуючи 20пмоль ДНК олігомеру 51 разом з 20пмоль ДНК олігомеру СОКЗНЬ, СОМКЗНа ог СОКЗНІ.

Матрицю та олігомери перемішували з 2 Кеаду-То-сСо РОК Веадвз (РНагтасіа) в об'ємі 5Омкл, а потім піддавали циклізації, використовуючи наступні профілі: 1 цикл при 95923 протягом 5хв., після цього виконували ЗО циклів « при 942 протягом 1хв., при 5593 протягом хв. та при 722 протягом хв. Ці реакції приводили до одержання продукту, який містить мутації. Продукти, одержані на першому етапі, потім застосовували як праймери у трьох т с окремих реакціях з праймером АМВМ, використовуючи МК1 фагеміду як матрицю. У цих реакціях Тмкл продукту "» з першої реакції використовували з 2о0пмоль ДНК олігомеру АМВМ з 5О0пмоль фагеміди рСАМТАВ 5Е-МК1 як " матриці. Праймери та матриці перемішували з 2 Кеаду-То-бо РСК Веайдз (Ріаптасіа) в об'ємі 5Омкл, та піддавали циклізації, використовуючи описаний вище спосіб. Кожна реакція генерувала бібліотеку 876 п.о.

Продукти ПЛР перетравлювали за допомогою рестрикційних ферментів ЇЇ та Мої І та очищали. 15Онг - очищеного продукту ПЛР лігували з 250нг ДНК вектора фагового виявлення рРСАМТАВ5БЕ (попередньо -І перетравленого, як забезпечується РНагтасіа). Суміші лігування обезсолювали, та 4Онг кожної використовували для трансформації Е.сої ТО1. Кожна трансформація приводила до одержання приблизно 1,5х10 59 клонів. - Фагові бібліотеки були потім вивільнені з трансформованих бактерій. Клітини, одержані від кожної «сл 20 трансформації, вирощували у 1Омл 2хУТ (16г бакто-триптону, 10г бактерійно-дріжджового екстракту, 5г МасСі/на літр НО), що містить 2956 глюкози при 372 при струшуванні при 250об./хв. Через одну годину додавали з ампіцилін (100мг/мл заключна концентрація) та 1х10 79 бляшкоутворювальних одиниць (БУС) М1ЗКО7 хелперного фага. Культури вирощували протягом однієї години, осаджували, а потім ресуспендували у 10 мл 2ХУТ плюс ампіцилін (1О0Омкг/мл) та канаміцин (5Омкг/мл) та вирощували протягом 1бгод. при 37 9С, при струшуванні при 250о0о6./хв. Бактерії осаджували шляхом центрифугування у Зогуа! 5534 роторі при 8000об./хв.

ГФ) протягом 20хв. Супернатанти, що містять фаг, фільтрували, використовуючи зугіпде фільтр 0,45мкм. Фаг потім г) піддавали преципітації шляхом додання 2мл ПЕГ, Масі (2095 ПЕГ8000 у 2,5М Масі вага/об'єм), інкубували на льоду протягом ЗОхв. Преципітований фаг осаджували шляхом центрифугування у Зогуа! 5534 роторі при во 10000об./хв. протягом 20Охв., потім ресуспендували в мл МТЕ (100мМ Масі, 1ї0мММ Трис рН 7,5 ЕДТА).

Ресуспендовані фагові бібліотеки титрували та зберігали при 490.

Пенінг Мн СОКЗ бібліотеки

МАМ клітини, вирощені у середовищі ОМЕМ, що містить 1095 фетальної сироватки великої рогатої худоби плюс 75Омкг/мл 5418, збирали, використовуючи 0,02956 ЕДТА (Зідта МоЕ-8008). 2х10" клітин осаджували та б5 ресуспендували у 1б0мл холодного буфера блокування (295 ВЗА, 0,0295 МамМм3 у ОРВ5) та піддавали повільному центрифугуванню протягом год. при 42. Клітини осаджували та ресуспендували уб мл холодного буфера блокування. 1х109 фагів з кожного важкого ланцюга СОКЗ бібліотек додавали до клітинної суспензії та суміш повільно центрифугували при 42С протягом 2год. Клітини промивали двічі за допомогою 1О0мл холодного буфера блокування. Зв'язаний фаг елюювали шляхом ресуспендування промитих клітин у 1,5мл льодяної 5ОмММ НС, та інкубували на льоду протягом 10хв. МКЄМ клітини осаджували та елюйований фаг титрували для визначення кількості захопленого фагу. Потім О0,бмл елюйованого фага ампліфікували шляхом повторного інфікування Е.соїї

ТО1 для використання у наступному колі пенінгу.

Конструювання М, мутантної бібліотеки

Важкий ланцюг СОКЗ мутанта (598Р-Т99У) використовували як матрицю у двоетапній ПЛР, за допомогою 70 якої вбудовували рендомізації у гарячу точку, розташовану у легсому ланцюзі СОМКЗ. У першій реакції, 5Опг фагеміди, що містить мутант важкого ланцюга (598Р-Т99У), перемішували з 20пмоль ДНК олігомерів ММОТ (5-САТТАСТАСТО ТТ ТОСААММЗММЗААСОТОССТСТТАСА-3) та АМВМ у БОмкл об'єму. Суміш піддавали циклізації, використовуючи той самий спосіб, який застосовували для одержання бібліотеки важкого ланцюга

СОКМКЗ. За допомогою реакції одержували продукти розміром 150 пар основ, що містять рендомізацію "гарячої 75 точки" у легкому ланцюзі СОМКЗ. Після очистки мкл продукту реакції, одержаного у першій ПЛР, використовували з 20пмоль ДНК олігомеру (598Р-Т99У) як матриці. Матрицю та праймери перемішували з 2

Кеаду-То-со РСК Веадз (Ріаптасіа) в об'ємі 5Омкл, а потім піддавали циклізації, використовуючи описаний вище спосіб. Реакції давали змогу одержати бібліотеку з 876 п.о., яка містила Мн СОКЗ мутацію (598Р-Т99У) та рендомізації гарячої точки СОКЗІ. Продукти ПЛР перетравлювали за допомогою рестрикційних ферментів 51 та Мої І, очищали та лігували за допмогою рРСАМТАВ5БЕ вектора як і з бібліотеками важкого ланцюга СОКЗ.

Лігаційну суміш обезсолювали та одну десяту (4Онг) реакційної суміші використовували для трансформації Е.соїї

ТО1. Фагову бібліотеку, яка містить З3Х109 клонів, виділяли, як описано для конструювання важкого ланцюга

СОКЗ. Одну четверту її ампліфікували та використовували для першого етапу пенінгу.

Пенінг бібліотеки М. СОМКЗ с

МАЄМ клітини збирали, як і для процедури пенінгу Мн СОКЗ. Усі етапи та промивання проводили у холодному о буфері блокування за винятком, як зазначено нижче. 5х10 9 клітин ресуспендували в їмл буфера блокування та центрифугували протягом год. Клітини осаджували та ресуспендували, додавали вивільнену фагову бібліотеку та суспензію повільно центрифугували при 42С протягом 2год. Клітини промивали тричі, потім ресуспендували у буфері блокування, що містить 21М мутанта важкого ланцюга МЕК1 (598Р-Т99У) всЕм-РЕЗ8 та повільно -

Ццентрифугували при 42С протягом 2год. Клітини промивали тричі, а зв'язаний фаг елюювали та нейтралізували, ю як описано для бібліотеки важкого ланцюга СОКЗ. Елюйований фаг титрували та зберігали для наступного кола пенінгу. --

Вивільнення фагу ча

Захоплений після кожного кола пенінгу фаг ампліфікували для використання у наступному колі пенінгу - Для вивільнення Е.соїї ТО1 вирощували у ТОмл 2ХхУТ, що містить 295 глюкозу, інкубували при 372С, при 250об./хв. -

Коли оптична щільність (ООвоо) досягала 0,3, О,5мл захопленого фага додавали до культури та продовжували інкубацію. Через 1год. додавали ампіцилін (100мкг/мл кінцева концентрація) та 1х10 79 бляшкоутворювальних одиниць М1З3КО?7 хелперного фага, та інкубацію продовжували протягом 1год. Культуру потім центрифугували, а « 20 осаджені бактерії ресуспендували у 1Омл свіжого середовища 2ХУТ, що містить ампіцилін (10Омкг/мл) та ву с канаміцин (5Омкг/мл), та інкубували при 372С та 250об./хв протягом 1бгод. Бактерії осаджували шляхом центрифугування у ЗогумаІ 5534 роторі при 8000об./хв. протягом 20 хвилин. Супернатанти, що містять фаг, з фільтрували, використовуючи зугіпде фільтр 0,45 одиниць. Фаг потім преципітували доданням 2мл ПЕГ/Масі (2095 ПЕГ 8000 у 2,5М Масі вага/об'єм) та інкубували на льоду протягом ЗОхв. Преципітований фаг осаджували центрифугуванням у Зогмаї! 5534 роторі при 10000об./хв. протягом 20хв., потім ресуспендували у тїмл МТЕ -І (100мл Масі, 10мМ Трис, їмМ ЕДТА рн 7,4). Вивільнену фагову бібліотеку титрували та зберігали при 426.

Визначення позитивних клонів - Після третього кола пенінгу 48 клонів бібліотеки важкого ланцюга СОКЗ аналізували на зв'язування з - ЕСЕРМІЇ пептидом (ЕЕККОМУУУТОнВОоОК-біотин), використовуючи ЕГІЗА. Двадцять два клони, які давали найсильніший сигнал, піддавали ДНК-секвенуванню та аналізували далі. Після четвертого кола пенінгу 48 клонів о аналізували за допомогою ЕГ ІЗА та визначали ДНК послідовності 10 клонів з найсильнішим сигналом ЕГІЗА. Для "І бібліотеки легкого ланцюга після другого кола пенінгу 48 клонів аналізували за допомогою ЕЇ ІЗА, та 17 клонів, які давали найсильніший сигнал, піддавали ДНК-секвенуванню. Після третього кола пенінгу 20 клонів аналізували та 10 клонів з найсильнішими сигналами ЕГІЗА піддавали секвенуванню. Для вивільнення фагу з індивідуальних клонів, відбирали один клон з заключних титрувальних планшетів для пенінгу та інокулювали в 15О0мкл 2хМТ з 295 глюкози та 100мкг/мл ампіциліну у планшеті на 96 комірок. Планшет інкубували при 372С при іФ) 150об./хв. Через Згод. 20мкл культури переносили до комірок другого планшету, що містить 100мкл 2ХУТ з 290 іме) глюкози та 100мкг/мл ампіциліну плюс 1х109 МІЗКО7 хелперного фага та інкубували протягом 2год. Культури осаджували та ресуспендували та у 50-100мкл супернатантів, що містять фаг, піддавали ЕГІЗА. Фаговий ЕП ІЗА 60 виконували, як описано (І огітег ей аЇ. // Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА. - 1996. - 93. - Р. 14815-14820), за винятком наступного: ТООмкл 3, 3, 5, 5-тетраметил бензидину (ВМ голубий, Воепйгіпдег Мапппеїіт) використовували як субстрат для детектування. Після розвинення забарвлення у голубий/зелений колір 100мкл 2М Н2504 додавали для зупинки розвитку забарвлення. Поглинання вимірювали при 45Онм.

Секвенування ДНК 6Е Секвенування ДНК проводили, використовуючи РЕ Арріїейд Віозувіетв (Ровієег Су, СА) Кподатіпе Тептіпайог

Сусіе Зедцепсіпд Кії. Зразки розганяли та аналізували на РЕ автоматизованому секвенсері Арріїєд Віозузіетв

Моавеїі.

Плазмідна конструкція зсЕм імунотоксину, експресія та очистка

ЗсЕм з відібраних фагемідних клонів піддавали ампліфікації, використовуючи праймери, в які вводили Мае та НіпаїІЇ рестрикційні сайти. Продукти потім піддавали перетравлюванню та клонували в експресійний вектор, що базується на Т7, в якому зсЕм злитий з вкороченим варіантом екзотоксину А Рзецдотопаз. Плазміди трансформували в експресійного хазяїна ВІ 21(Х0ОЕЗ). МК1 мутантні імунотоксини експресували та готували так, як описано раніше |Висппег еї аї. // Апаї. Віоспет. - 1992. - 205. - Р. 263-270).

Поверхневий плазмонний резонанс 70 Кінетику зв'язування вимірювали, використовуючи ВіАсоге 2000 біосенсор (Віасоге, Іпс., Різсаїамжау, М).

Стрептавідин зв'язували з СМ5 дослідницьким ступінчастим сенсорним чіпом, використовуючи аміно зв'язувальні реагенти, що забезпечуються Віасоге. Біотинильований ЕСЕКМ пептид зв'язували зі стрептавідином шляхом внесення 1Омкл 1ОНМ розчину пептиду на чіп. Імунотоксини розводили до концентрації 25мкг/мл у забуфероному Нерез фізіологічному розчині (НВ5). Значення усередині інтервалу та поза ним 75 Вимірювали шляхом внесення 50мкл розведеного імунотоксину на поверхню чіпа при швидкості 1Омкл/хв., а потім давали можливість зв'язаному матеріалу дисоціюватись протягом бхв. або більше. Матеріал, що залишився після зв'язування, видаляли з ЕСЕКМІЇЇ пептиду шляхом введення 5мкл 100мММ фосфорної кислоти.

Кінетику зв'язування аналізували, використовуючи ВІА оцінку 2.1 Зоїмаге.

Культура клітин та аналізи цитотоксичності

МАМ клітини культивували у ОМЕМ плюс 1095 фетальної сироватки великої рогатої худоби, забезпеченої 75Омкг/мл 5418. Аналізи цитотоксичності передбачали вимірювання інгібування вбудовування | ЗНІ-лейцину, як було описано вище (|Ргіог еї аї. // СеїІ. - 1991. - 64. - Р. 1017-1023).

Лінії бактерій та клітин

Е.соїї ТО1; К12 А (Іас-рго), зирЕ, (пі, за А 5/Егаюрзб, ргоАВ, Іасіб, Іас/ А МІ 51. Е.соїї ВІ212ОЕЗ; Р отрї СІ

Ц(оп| нзазв (гВ'тВ' штам Е.соїї В) з ОЕЗ, Х-профаг, що несе РНК-полімеразний ген Т7. МКб був Змізз ЗТЗ3 о мишиною фібробластною варіантною клітинною лінією, в якій не визначався ЕСЕК. МКбЄМ була МКб клітинною лінією, трансфікованою за допомогою кКДНК для мутантного ЕСЕКМІІЇ рецептора під контролем Др-актинового промотора. Джерела МК та МК6М були раніше описані | огітег еї а!., Сіїп. Сапсег Кев. 1: 859-864 (1995).

Приклад 3. Конструювання бібліотеки Мі СОКЗ -

Для збільшення афінності МК1(Ру) та активності відповідного імунотоксину МК1(Ем)-РЕЗ8, ми мутували М н ю

СОКЗ та М. СОКЗ оскільки ці частини антитіла мають значні контакти з антигеном |МасСаїйчт еї аї. // 9. Мої.

Вісі. - 1996. - 262. - Р. 732-745). Перші дев'ять з одинадцяти амінокислот М я СОКЗ представлені в табл. 5 -- (останні два, 0101 та 102 виключались, оскільки вони, як вважається, малоймовірно роблять свій внесок у че зв'язування антигену). Оскільки повна бібліотека, в якій дев'ять рендомізованих амінокислотних залишків

Зо вимагали більше, ніж 5х107! індивідуальних клонів, то ми готували три різні бібліотеки, що містили залишки - 95-97, 98-100 та 101А-101С, як описано у прикладі 1. Бібліотека Н-СОМКЗ 95-97 містила 1,6х10 6 клонів, бібліотека Н-СОКЗ 98-100 містила 4х10? клонів, бібліотека Н-СОБЗ 100А-100С містила 1,6х109 клонів. Для того, щоб впевнитись, що бібліотеки складені правильно, п'ять клонів з кожної бібліотеки були секвеновані. Як « 20 і очікувалось, кожний клон мав різні амінокислотні комбінації у ділянках, що є цільовими для мутацій. - с Оскільки повна відмінність бібліотеки, що рендомізує З амінокислоти, буде вимагати тільки 8х103 незалежних й клонів, розмір бібліотек підтверджував, що усі можливі послідовності ДНК добре представлені. и? Пенінг Мн СОКЗ бібліотеки та аналіз відібраних клонів

Оскільки заключна ціль поліпшення МК1 мутанта полягала у націлюванні токсину на ЕСЕКМмІІІ-позитивні пухлинні клітини, ми використовували ЕСЕКМІ-позитивні МЕКбМ клітини для пенінгу. Пенінг виконували. у -І присутності імунотоксину МЕА1(Рм)-РЕЗ8, який, як очікувалось, діє як конкурент проти селекції дикого типу

МЕМ у бібліотеці. Фаг з кожної бібліотеки був вивільнений та рівні кількості фагу (1х107) з кожної бібліотеки ї поєднували для початку першого кола пенінгу. Елюйований фаг титрували та вивільняли для наступного кола - пенінгу. Відповідні пенінги виконували без визначення титру вивільненого фага, до тих пір, поки не закінчувався пенінг. Це було зроблено для економії часу, та для зменшення можливості, що нестабільні о зв'язувальні агенти можуть бути загублені протягом 24год., необхідних для титрування вивільненого фагу. що Типово вивільнення давало вихід 1х10 7 КУО/мл. Таблиця підсумовує кількість фага, захопленого протягом кожного з чотирьох кіл пенінгу. Збагачення було досягнуто, у четвертому колі відбувалося зменшення.

Початково ми перевіряли фаг, відібраний після чотирьох кіл пенінгу. 48 клонів було проаналізовано для зв'язування у фаговому ЕГІЗА, та було визначено послідовності ДНК десяти клонів, що мали найсильніший о сигнал. У табл. 6 показано, що у положеннях 98 та 99 тільки відновлені мутації були. Аналіз послідовності ДНК показав клони, які відносяться до п'яти різних груп: вихідного 598-199 та мутантів РО8-М99, РО8-У99, РОВ8-Е99, їмо) РО8-М/99. Ми також перевіряли фаг, вибраний після третього кола для демонстрації того, що добрі зв'язувальні агенти були загублені між З та четвертим колами. Ми аналізували 48 індивідуальних клонів на зв'язування з 60 ЕСЕРМІІ-пептидом шляхом ЕЇ ІЗА, та 22 з них, які виявили найсильніший сигнал, піддавали ДНК-секвенуванню. знову, тільки відновлені мутації були у положеннях 98 та 99 (табл. 6). Цілий ряд амінокислот було відновлено у цих положеннях. Частіше за інших зустрічався 598-199 (дикий тип), після якого йшли РО8-599, РО8-У99,

РО8-М99 та А9О8-099. Четверте коло пенінгу приводило до збагачення клонів РО8-М99 та РО8-799 понад диким типом (598-199), до втрати кількох клонів, а також до одержання нового клону, що містить РО8-Р99. 65 Цитотоксичність та афінність мутантів УНСОКЗ

Кожний з 12 мутантів, що були одержані шляхом пенінгу МКІ1І Му СОКЗ бібліотеки використовували для створення імунотоксину. Кожний імунотоксин конструювали за допомогою ПЛР, ампліфікуючи Ем з фагового вектора та субклонуючи їх в експресійний вектор для експресії імунотоксину. Усі імунотоксини (за винятком одного, що містив А98-099 мутацію Мн СОКЗ) можуть бути очищені до більш, ніж 90-9595 гомогенності, очищені імунотоксини використовували для визначення їх цитотоксичності на МКбЄМ клітинах. Зв'язувальну афінність вимірювали шляхом способу Оіасоге, використовуючи або пептид, іммобілізований на чіпі, або мутантну форму екстрацелюлярного домену ЕСЕК, приєднаного до чіпу. Результати однієї серії експериментів представлені у табл. 6; у порівнянні з вихідним клоном (598-199), який мав ІС 5о 8,Онг/мл, існували шість клонів, які були найбільш токсичними. Це були РО8-У99, який мав ІСво З,5нг/мл, після нього йшли РО8-МО99, РОВ8-М/99, РОВ-199, 70 які мали ІС во 4,5нг/мл, РО8-Р99 з ІСво бнг/мл та РО8-М99 з ІСво б,5нг/мл. Чотири клони, РО8-5ОЗ9, М/98-Е99, 598-М/99 та РО8-199 мали ІСьо, ідентичне для вихідного клону.

Конструювання М, СОКЗ бібліотеки

Усі мутанти, вивільнені після пенінгу МН СОКЗ бібліотек локалізувались у положеннях 98 та 99. Послідовність

ДНК цих двох залишків складає гарячу точку, яка є ділянкою, що піддається мутаціям під час іп мімо афінного /5 дозрівання антитіла. Мутант з найвищою цитотоксичною активністю з бібліотеки М н використовували та піддавали мутагенезу, націлюючи тільки гарячу точку М. СОКЗ. Послідовність М. СОКЗ представлена у табл. 3.

Бібліотека вводить рендомізації у гарячу точку, що кодує залишки 91 та 92. М. СОКЗ фагова бібліотека з 400 клонів необхідна для досягнення усіх можливих амінокислотних комбінацій у двох положеннях, що вибрані для мутації, таким чином, можна очікувати, що усі можливі послідовності ДНК були охоплені у цій бібліотеці.

Пенінг М. СОКЗ бібліотеки та аналіз вибраних клонів

Виконували три кола пенінгу та фаг, захоплений на кожному етапі, показано у табл. 3. Для цієї бібліотеки ми одержали більше збагачення у другому колі пенінгу, ніж у третьому колі. Після другого кола пенінгу 48 індивідуальних клонів було вивільнено, зв'язування пептиду вимірювали шляхом ЕЇІЗА, та визначали послідовність ДНК сімнадцяти клонів, що мали найсильніший сигнал. Як показано у табл. 7, були одержані п'ять сч ов різних мутантів. Усі зберігали залишок серину дикого типу у положенні 91, та мали мутацію у положенні 92.

Найчастіше спостерігали Е92МУ (6 з 17), після неї йшли Г92К (З з 17), 925 (2 з 17), Е921І (1 з 17) та Е92М (1 і) з 17). З 17 проаналізованих 4 були знайдені такими, що відповідають вихідному типові.

Також аналізували властивості клонів, ізольованих після третього кола пенінгу (Таблиця 7). Двадцять клонів відбирали випадково, фаг вивільняли та перевіряли на зв'язування з пептидом за допомогою ЕЇ ІА. М зо Десять клонів, що мали найсильніший сигнал, були відібрані для аналізу ДНК послідовності. Послідовність ДНК виявила, що були присутні З різні клони, усі з яких були представлені у третьому колі. Крім одного вихідного о клону, ці клони були Р925 (7 з 10), Р92ММ (1 з 10) та Р92К (1 з 10). Не було знайдено нових мутантів та не "де було знайдено мутантів Е92І. та г92М. ча 7 й, юю 00000000 їх не, - хз» ' тс: ПИНИИ НИ - -І - Цитотоксичність та зв'язувальні властивості мутантів М. СОКЗ

Різноманітні ЕМ, які одержували, використовували для одержання імунотоксинів, а їх цитотоксичні о активності та зв'язувальні афінності вимірювали, використовуючи очищені рекомбінантні білки. Тільки один «м мутант Г92МУ давав імунотоксин, який був більш активним, у порівнянні з вихідними. Його ІСво складало 1,Знг/мл у порівнянні з З,5нг/мл для вихідного (Таблиця 7). Інші мутанти мали нижчі активності. Дані Таблиці 7 також показують, що Е92М/ має найвищу афінність (Ка ЗнМм), ніж вихідний клон Р92 (Ка бнм). Інший мутант, Е92І, мав слабко збільшену афінність (Ка 4нМ), але не мав збільшення цитотоксичності. Фіг.2 показує ВІіАСоге сенсограмму, що порівнює зв'язувальні властивості вихідного клону з найбільш активним імунотоксином, (Ф) одержаним з Ем, яке одержували з М н СОКЗ бібліотеки (МНБОВ8Р-Т99У) та найбільш активним клоном, г одержаним з бібліотеки М. СОКЗ (МНБОВР-Т99У-МІ Е92МУ), що зараз називається МК1-1. Фігура показує, що два мутанти мають менші значення дисоціації, ніж вихідний Ру. Аналіз імунотоксину (МК1-1-(Ем)-РЕЗ8) з обома М во та Му мутаціями показав, що вони мають зменшення у К викл, та слабко збільшене у Кал, Що приводить до Ка

ЗНМ.

В Таблиці 4 представлені результати двох експериментів, в яких цитотоксичні активності МК1(Рм)Резв порівнювали з двома поліпшеними варіантами: МА1(РУХМНЗОвР-Т99У)-РЕЗВ та МК1-1(РМ)-РЕЗ8. В обох експериментах МК1(Ем)-РЕЗ8 був принаймні активним, а МК1-1(Ем)-РЕЗ8 був найбільш активним. бо Таблиця 4

МАТ(Рк)-РЕЗ8 з двома мутантами зі збільшеною афінністю для ЕСЕКМІЇЇ

Ю) ІСво підраховували з аналізів, використовуючи різні кількості імунотоксинів; 7) В Досліді 1 значення, виражені як - 8.0, мали значення Р « 0,01 при порівнянні МАЕ1(ЕМ)-РЕЗ8 з МЕ1-1(ЕУ)-РЕЗ8 та МА1(РУХУН 598Р-Т99У)-РЕЗ8 з МВ1-1(ЕМ)-РЕЗ8; 77) В Досліді 2 значення, виражені як - 5.0, мали значення Р. « 0,01 при порівнянні МА1(РМ)-РЕЗ8 з МВ1(ЕУХУн 898Р-Т99У)-РЕЗ8 та МА1(ЕУХУН 598Р-Т99У)-РЕЗ8 з МА1-1(ЕМ)-РЕЗВ 15

Приклад 4. Одержання імунотоксину

Значне збільшення виходу різних мутантних імунотоксинів спостерігали під час процесів очистки. Після повторної зборки білки діалізували та очищали хроматографією (Виснпег еї аї. // Апаї. Віоспет. - 1992. - 205. -рР. 263-270). Білок спочатку серійно очищають на О-сефарозній аніонно-обмінній смолі, яка видаляє великі 20 білкові агрегати, нуклеїнові кислоти та інші контамінанти. Після цього елюйований білок завантажували у Монос) колонку, а білюим елюювали за допомогою суцільного градієнту 0-0,3М Масі. На цьому етапі видаляють менші агрегати. Правильно зібраний мономерний імунотоксин елюють з Моно при характеристичній концентрації масі 280нМ. Чистоту зібраних фракцій Монос) підтверджують спостереженням одного мономерного піку, елюйованого з Т8К ОЗ0005МУ колонки для виключення за розмірами та за допомогою 5БО5-РАСЕ. Вихід кожного мутантного с 25 імунотоксину МК1(Ем)Рез8 вираховували, базуючись на кількості білка, зібраного з пікових Монос) фракцій, та на о присутності єдиного піку за розмірами хроматограмах (ТЗКЗ000). Таблиці 6 та 7 показують виходи, коли 100мг білка тілець включення піддавали очистці. Очевидно, що вихід імунотоксину піддається значному впливові мутацій у СОК та збільшується з 295 для вихідного МК1(Ем)Рез8 до більше, ніж 10-17,595 для багатьох мутантів.

Приклад 5 - 30 ЕСЕРМІЇ інтракраніальні пухлини ініціювали у атимічних щурів шляхом ін'єкції 105 0О870.ДЕСЕРВМІЇ клітин ю (людська гліобластомна клітинна лінія, створена шляхом трансфекції О87МО клітин ЕСЕЕМІЇ |Мізпікама еї а). //

Ргос. Май. Асад. Зсі ЗА. - 1994. - 91. - Р. 7727-7730) через катетер, розміщений на їмм вперед та 4мм (77 латеральніше до брегми. Пухлини оброблювали шляхом інфузії МК1-1РЕЗ8 імунотоксину або контрольного ї- фізіологічного розчину через катетер безпосередньо у пухлину. Імунотоксин призначали при дозах або 2мкг або 35 мкг у 200мкл забуференого фосфатом фізіологічного розчину (РВ5) з 0,295 людського сироваткового альбуміну в (НБА) протягом семиденного періоду, використовуючи АІге( 9 2МІ осмотичний насос (ЮОигесі Согр., Сирепіпо,

СА), контрольним тваринам вводили 200мкл РВ5-Н5А розчину. Лікування починали через З дні після інокуляції пухлини. Як показано на Фіг.3, усі тварини, що одержували контрольний фізіологічний розчин, помирали « протягом 20 днів. Десять процентів тварин, що одержували дозу бмкг, залишались живими протягом 160 днів. 70 Більше тридцяти процентів тварин, оброблених дозою 2мкг, залишались живими протягом 160 днів. Різниця у не) с виживанні між дозами 2мкг та бмкг передбачає, що при інтракраніальну введенні імунотоксин у дозі бмкг може з» бути достатньою для спричинення деякої неспецифічної токсичності для мозкових тканин, яка зменшувалась або не була присутня при дозі 2мкг, але обидві дози імунотоксину забезпечували подовження виживання.

Приклад 6 -1 75 ЕСЕРМІЇ інтракраніальні пухлини ініціювали у атимічних щурів шляхом ін'єкції 105 08705.ЛЕСЕРМІЇ клітин через катетер, розміщений на їмм вперед та 4мм латеральніше до брегми. Пухлини оброблювали шляхом -і інфузії МК1-1РЕЗ8 імунотоксину або контрольного фізіологічного розчину Через катетер безпосередньо у - пухлину. Імунотоксин (0,2мкг, О,бмкг та 2,О0мкг) вводили у 200мкл РВЗ з Н5БА протягом 7 днів, використовуючи

АїІге( 2МІ осмотичний насос, як описано у прикладі 5. Лікування починали через З дні після інокуляції пухлини. 1 20 Як показано на Фіг.4, тільки десять процентів тварин, що одержували дози 0,2мкг або 0,бмкг імунотоксину -Ч виживали після 25 днів, у той час як виживало близько 2295 тварин, що одержували контрольний фізіологічний розчин. На противагу цьому, з тварин, які одержували дозу 2мкг, виживало близько 5595, що у два рази більше, ніж процент тварин, які одержували контрольний фізіологічний розчин. Результати дають змогу запропонувати, що дози 0,2мкг та 0,бмкг були достатньо низькими для спричинення виживання, у той час як доза 2,0мкг 55 імунотоксину значно подовжувала період виживання.

ГФ) Приклад 7

ГІ ЕСЕРМІЇ неопластичні менінгіти ініціювали у атимічних щурів шляхом ін'єкції 5х109 0О870.ЛЕСЕРМІЇ клітин у 4Омкл розчину РВЗ-НЗА через постійно введений інтратекальний катетер. Обробку усіх тварин, що несли бор пухлину, починали через З дні після інокуляції пухлини. МК1-1-РЕЗ8 імунотоксин давали у 40мкл РВ5-Н5А на 3, 5 та 7 день після пухлинної ініціації. Контрольним тваринам вводили 40мкл РВ5-Н5А у ті самі дні.

Як показано на Фіг.5, усі тварини, які одержували контрольний фізіологічний розчин, помирали приблизно на день. На противагу цьому, тварини, які одержували імунотоксин, мали подовжений час виживання принаймні до 14 дня, а 3096 тварин, що одержували дозу мкг, та 50956 тварин, що одержували дозу 2мкг, виживали 65 протягом 60 днів.

Приклад 8

Пухлини ініціювали у атимічних мишей шляхом ін'єкції 08703. ЛЕСЕКМІІ гомогенату пухлинних клітин за 7 днів перед початком лікування (початок лікування позначали як день "0" для цього вивчення). Пухлини оброблювали за допомогою трьох болюсних внутрішньопухлинних ін'єкцій МК1-1-РЕЗ8 імунотоксину при дозах мкг, 2мкг, З мкг, або контрольного фізіологічного розчину (РВ5-НЗА розчин, описаний у попередніх прикладах) на 0, 2 та 4 дні. Пухлини мали середній об'єм бООмм на початку лікування на 0 день. Як показано на Фіг.б, ріст розмірів пухлин у тварин, яких піддавали лікуванню будь-якою дозою імунотоксину, що залишалась приблизно сталою, при вимірюванні на 2 день після першого введення, ефективно призупинявся. На противагу цьому, тварини, яким вводили тільки контрольний фізіологічний розчин, показали швидке збільшення росту 70 пухлини з об'ємом пухлини, що збільшувався настільки, що сягав 7500мм? на 7 день.

Усі публікації та патенти, згадані у цьому описі, введені у дану заявку як посилання в описі для деякого розширення, і кожна індивідуальна публікація або патент, є специфічними та індивідуальними як посилання.

Таблиця 5

Амінокислотні послідовності та послідовності ДНК важкого ланцюга СОКЗ та легкого ланцюга СОКЗ МАК1ЕМУ дів га жуть вики са т зи де Й с, Бої я я 95 ок СУМ чу і А, ОВ щас яка г. ци Мб їх сх

ХО, иди Я зви ве ще х ЗЕ БЕН. ЩЕ ве прерій НУ. св Я ут Е Р ре з 1 -- їн

Б Я ЩЕ гай ре з Я че рес ХЕ ь

Ж ній. ні Я: й Бе 55 ва 57 (о)

Примітка: - Гарячі точки, що мають послідовності Ри о Ру А/І, підкреслені

Таблиця 6

Послідовності та властивості мутантного фага, ізольованого з бібліотеки важкого ланцюга СОКЗ, та імунотоксинів, одержаних з і - зо використанням мутантного всЕгУ ю о потяжня (вві ог вві во | о юри | ков | оо

Виюдне змкоюстт (5 У|8 8 т 85 У | А М 1111101 801 во зо - зва 001000831101001015861890 20 м 01111110 в Ка 8 в5во т в.

Кз зв 160 то пп 11111121 мо | ою пи ПИ ПИ ПО ПЕС ПИ ПОН ПОН НАННЯ ПООЄННЯ ПО УСИННЯ ПУ НЕТУ ввів « лю РГС 1во ою З с воно

РМ 11111111 не то .

І» ПП 111во не |в вової 15 ПП 11111101омзамеюмию! 17711171 - юю 00100851 9616 20 11311610

В. вн ща ни ЕС то

РТ з5 | бо | то - во 1вю во сі пп 11111111 | ою "м Примітки: - 7 Дикий тип; 7) Не можна одержати імунотоксин

Таблиця 7 й й й й 50 й й

Послідовності та властивості мутантного фага, ізольованого з бібліотеки легкого ланцюга СОКЗ, та імунотоксинів, виготовлених з

ГФ) використанням мутантного всЕгУ й о пожюжюни (ве во||92 вер вк 5 ев | зу | мета меканитт | во німи | ка ям | викдль видна вмножютют | 112 5 МІУ Р ОСІ з38 161 еюлюзляк | 11811 10101011 351 5 щ ні вм 61 з 131 вм т з 7 ввів вв 111111111111211вог1 в вв її де вм 11111111

Мо за межами 10

151 її

ПОП ПОЛ ПО НО КОХ ОНИ КОНЯ КОН КОН ОН ПО ОНИ КО ПАК КОХ вв во |в в 111 в 1111118

Claims (1)

1. Формула винаходу

   1. Поліпептид, що включає варіабельну ділянку важкого ланцюга (М н) антитіла і варіабельну ділянку легкого ланцюга (М) антитіла, кожен з яких має три ділянки, що визначають комплементарність (СОК), які пронумеровані відповідно від СОКІ до СОКЗ, починаючи з амінокінця, поліпептид, перетворений в імунотоксин з 75 38 ко фрагментом екзотоксину А Раемдотопав, у якому був вилучений домен І ("РЕЗ8"), утворює імунотоксин, який проявляє цитотоксичність по відношенню до клітин, які мають антиген типу рецептора до епідермального фактора росту типу ПШ (ЕСЕК мії), яка як мінімум дорівнює цитотоксичності вихідного антитіла МКІ в порівнянні з імунотоксином РЕЗ8, та має вищий вихід, коли експресується злитий білок з РЕЗ8, ніж вихід МК, перетвореного в імунотоксин із РЕЗ8, та де СОК 1-3 ділянки М ланцюга поліпептида мають амінокислотні послідовності СОК 1-3 антитіла МК1 відповідно та СОК 1-3 ділянки М, ланцюга поліпептида мають амінокислотні послідовності СОК 1-3 ділянок М, ланцюга антитіла МК відповідно за винятком: (а) заміни амінокислоти, яка вибрана з групи, яка включає Рго, Тр для бег у положенні 98 СОКЗ варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла МК, та (б) заміни амінокислоти, яка вибрана з групи, яка включає Туг, Азп, Тгтр, Пе, Рпе та МаЇ для ТНиг у положенні 99 СОКЗ варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла МК. см

   2. Поліпептид за пунктом 1, що включає заміну у СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга антитіла для Го) СОКЗ варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла МК1 Тгр на Рпе у положенні 92.

   3. Поліпептид за пунктом 1, що включає заміну у СОК1 або СОК2 варіабельної ділянки легкого ланцюга.

   4. Поліпептид за пунктом 1, що включає заміну у СОК1 або СОК2 варіабельної ділянки важкого ланцюга. М

   5. Поліпептид за пунктом 1, в якому вказаний поліпептид є зсгУ.

   30 . У й

   6. Поліпептид за пунктом 1, в якому вказаний поліпептид є азЕм, Раб або К(аб)». Іо)

   7. Поліпептид за пунктом 1, в якому замінами у важкому ланцюгу є 598Р-Т99У та заміною у легкому ланцюгу - є Е92МУ (антитіло МК 1-1).

   8. Поліпептид за пунктом 1, який додатково включає ефекторну молекулу, терапевтичний залишок або мітку, - яку визначають. м

   9. Поліпептид за пунктом 8, в якому терапевтичний залишок є токсичним залишком.

   10. Поліпептид за пунктом 9, в якому токсичний залишок є екзотоксином А Рзепдотопаз або його цитотоксичним фрагментом.

   11. Поліпептид за пунктом 9, в якому токсичний залишок є цитотоксичним фрагментом, який є РЕЗ8. « 20 12. Поліпептид за пунктом 10, в якому вказаний поліпептид має ІСво 7 нг/мл або нижче. з

   13. Поліпептид за пунктом 10, в якому вказаний поліпептид має ІСво 5 нг/мл або нижче. с 14. Поліпептид за пунктом 10, в якому вказаний поліпептид має ІСво 3,5 нг/мл або нижче. :з» 15. Поліпептид за пунктом 10, в якому вказаний поліпептид має принаймні одну амінокислотну заміну у Мн, де вказана заміна вибрана з групи, яка складається з: РО8-599, МУ98-МУ99, 598-799 та РО8-Т99.

   16. Поліпептид за пунктом 10, в якому вказаний поліпептид експресує злитий білок з 38 КО фрагментом -1 15 екзотоксину А Рзейдотопазг, в якому був видалений домен І, та має вихід принаймні З 95.

   17. Поліпептид за пунктом 10, в якому вказаний поліпептид експресує злитий білок з 38 КО фрагментом - і екзотоксину А Рзейдотопазг, в якому був видалений домен І, та має вихід принаймні 7 95. - 18. Поліпептид за пунктом 9, в якому вказаний токсичний залишок вибраний з групи, яка складається з дифтерійного токсину або його цитотоксичного фрагмента, сапорину або його цитотоксичного фрагмента, 1 20 антивірусного токсину фітолакти американської або його цитотоксичного фрагмента, рицину або його -ч цитотоксичного фрагмента та бріодину або його цитотоксичного фрагмента.

   19. Поліпептид за пунктом 10, в якому замінами у важкому ланцюгу є 598Р-Т99У, у легкому ланцюгу Е92М/ (антитіло МК1-1).

   20. Поліпептид за пунктом 1, який є злитим з геном З білка М13 бактеріофага.

   21. Молекула нуклеїнової кислоти, яка включає нуклеотидну послідовність, яка кодує поліпептид, що включає ГФ) варіабельну ділянку важкого ланцюга (М у) антитіла і варіабельну ділянку легкого ланцюга (М,) антитіла, кожен з з яких має три ділянки, що визначають комплементарність (СОК), які пронумеровані відповідно від СОКІ до СОКЗ, починаючи з амінокінця, поліпептид, перетворений в імунотоксин з 38 КО фрагментом екзотоксину А во Рзейдотопаз, у якому був вилучений домен І ("РЕЗ38"), утворює імунотоксин, який проявляє цитотоксичність по відношенню до клітин, які мають антиген типу рецептора до епідермального фактора росту типу І (ЕСЕК МІЇ|), яка як мінімум дорівнює цитотоксичності вихідного антитіла МК1 в порівнянні з імунотоксином РЕЗ8, та має вищий вихід, коли експресується злитий білок з РЕЗ8, ніж вихід МК1, перетвореного в імунотоксин із РЕЗ8, та де СОК 1-3 ділянки М у ланцюга поліпептида мають амінокислотні послідовності СОК 1-3 антитіла МК1 відповідно та СОК 1-3 ділянки М, ланцюга поліпептидна мають амінокислотні послідовності СОК 1-3 ділянок М, бо ланцюга антитіла МК1 відповідно за винятком:

   (а) заміни амінокислоти, яка вибрана з групи, яка включає Рго, Тр для бег у положенні 98 СОКЗ варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла МК, та (б) заміни амінокислоти, яка вибрана з групи, яка включає Туг, Азп, Тгр, Пе, Рпе та МаЇ для ТНиг у положенні 99 СОКЗ варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла МК.

   22. Молекула нуклеїнової кислоти за пунктом 21, що включає заміну як мінімум однієї амінокислоти у СОК1 або СОК2 вказаного варіабельного регіону важкого ланцюга, амінокислота кодується кодоном, який включає нуклеотид, що знаходиться у ділянці гарячої точки, вибраний з АСУ або КОУМУ, де К є А або 0, У є С або Т та Му є А або Т. 70 23. Молекула нуклеїнової кислоти за пунктом 21, в якій поліпептид має заміну 92 СОКЗ ділянки М, ланцюга.

   24. Молекула нуклеїнової кислоти за пунктом 23, в якій заміни у М н ланцюгу вибрані з 5О8Р-ТО99У, 5ОВР-ТООМУ, 598Р-Т99І, 598Р-ТО9М.

   25. Молекула нуклеїнової кислоти за пунктом 23, в якій замінами у важкому ланцюгу є 598Р-Т99У та заміною у легкому ланцюгу є Е92МУ (антитіло МК 1-1).

   26. Молекула нуклеїнової кислоти за пунктом 21, оперативно зв'язана з промотором.

   27. Молекула нуклеїнової кислоти за пунктом 22, оперативно зв'язана з промотором.

   28. Молекула нуклеїнової кислоти за пунктом 23, оперативно зв'язана з промотором.

   29. Молекула нуклеїнової кислоти за пунктом 24, оперативно зв'язана з промотором.

   30. Молекула нуклеїнової кислоти за пунктом 25, оперативно зв'язана з промотором.

   31. Спосіб руйнування клітини, яка має антиген ЕСЕК мії, який передбачає контакт клітини з імунотоксином, що включає токсичний залишок та націлювальний залишок, при цьому націлювальний залишок включає поліпептид, що містить варіабельну ділянку важкого ланцюга (М н) антитіла і варіабельну ділянку легкого ланцюга (М) антитіла, кожен з яких має три ділянки, що визначають комплементарність (СОК), які пронумеровані відповідно від СОКІ до СОКЗ, починаючи з амінокінця, поліпептид, перетворений в імунотоксин з сч ов 38 КО фрагментом екзотоксину А Рзейдотопаз, у якому був вилучений домен І ("РЕЗ8"), утворює імунотоксин, о який проявляє цитотоксичність по відношенню до клітин, які мають антиген типу рецептора до епідермального фактора росту типу ПШ (ЕСЕК мії), яка як мінімум дорівнює цитотоксичності вихідного антитіла МКІ в порівнянні з імунотоксином РЕЗ8, та має вищий вихід, коли експресується злитий білок з РЕЗ8, ніж вихід МК, перетвореного в імунотоксин із РЕЗ8, та де СОК 1-3 ділянки М ланцюга поліпептида мають амінокислотні М зо послідовності СОК 1-3 антитіла МК1 відповідно та СОК 1-3 ділянки М, ланцюга поліпептида мають амінокислотні послідовності СОК 1-3 ділянок М, ланцюга антитіла МК1 відповідно за винятком: що) (а) заміни амінокислоти, яка вибрана з групи, яка включає Рго, Тр для бег у положенні 98 СОКЗ «- варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла МК, та (б) заміни амінокислоти, яка вибрана з групи, яка включає Туг, Азп, Тгтр, Пе, Рпе та МаЇ для ТНиг у ї- положенні 99 СОКЗ варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла МК. ї-

   32. Спосіб за пунктом 31, в якому вказаний поліпептид має заміну як мінімум однієї амінокислоти у СОК1 або СОК2 вказаного варіабельного регіону важкого ланцюга, амінокислота кодується кодоном, який включає нуклеотид, що знаходиться у ділянці гарячої точки, вибраний з АСУ або КОУМУ, де К є А або 0, У є С або Т та Му є А або Т. «

   33. Спосіб за пунктом 31, в якому СОМКЗ варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла включає з с амінокислотну заміну, вибрану з групи, яка складається з: РО8-У99, РО8-МО99, РО8-М/99, РОВ8-199, РО8-Е99, РєРО8-М99, ;» 34. Спосіб за пунктом 31, в якому СОКЗ варіабельної ділянки легкого ланцюга містить фенілаланін, заміщений на триптофан у положенні 92.

   35. Спосіб за пунктом 31, в якому націлювальний залишок є МК 1-1. -І 36. Спосіб за пунктом 31, в якому клітина є злоякісною клітиною.

   37. Спосіб за пунктом 31, в якому злоякісна клітина є клітиною гліоми. Ш- 38. Спосіб за пунктом 31, в якому злоякісна клітина є клітиною карциноми молочної залози. - 39. Спосіб за пунктом 31, в якому злоякісна клітина є клітиною карциноми легень.

   40. Спосіб за пунктом 31, в якому злоякісна клітина є клітиною карциноми яєчника. 1 що Ф) іме) 60 б5