WO1991000107A1 - Vaccins et vecteurs de principes actifs fluides contenant une huile metabolisable - Google Patents

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Bernard Brancq
Gérard Trouve
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    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59

Definitions

  • Vaccines and vectors of fluid active ingredients containing a metabolizable oil are included in the production of a metabolizable oil.
  • the present invention relates to new vaccine compositions and fluid injectables, containing an oily phase totally or partially metabolizable, which can be used in veterinary or human medicine.
  • Vaccination is a means of preventive fight against infections aimed at awakening the immune defense system, by injection of antigens, which are often very specific fractions of the viral or bacterial walls.
  • the adjuvant resulting from the combination of mineral oil and a mannitol ester is known under the name of Freund's incomplete adjuvant (FIA: "Freund's incomplete adjuvant” in the literature); its composition is:
  • FCA Freund's adjuvant "complete” which contains, in addition to the above-mentioned elements, a tuberculin mycobacterium which potentiates the immune effect.
  • FCA is however limited due to the difficulty of their use in injectable vaccine preparations and their poor tolerance by the vaccinated subjects.
  • oily emulsions obtained from FIA and FCA are viscous like mayonnaise and release oil. Consequently, these preparations are difficult to inject through syringes with a small needle diameter (0.2 mm).
  • FCA diphtheria vaccine preparations made with FCA injected into women have even caused severe intolerance, abortion syndromes which have prohibited these adjuvants for common use in humans.
  • a vaccine preparation for the treatment of foot-and-mouth disease in cattle is produced from Freund incompLet's adjuvant (FIA) by mixing, with mechanical stirring, a part of FIA and a part of inactivated antigenic medium.
  • the preparation of the antigenic medium was the subject of particular care during the culture, the purification and the concentration of the antigens which are diluted in an Eagle type medium in the presence of phosphate buffer.
  • the composition of the preparation is therefore (weight / weight):
  • Antigenic medium 50 7. Mineral oil 42.57.
  • a histological examination reveals the presence of oily residues in the tissues and a notable increase in the size of the external nodes.
  • a known technique consists in incorporating, in the antigenic medium, a small proportion of a hydrophilic emulsifier, Polysorbate 80 (described in the pharmacopoeias).
  • polysorbate 80 used in biochemistry as a defatting agent, is aggressive with respect to the cell walls and therefore potentially toxic.
  • Example 2 The vaccine preparation carried out in Example 1 was modified by adding 1% of Polysorbate 80 to the FIA adjuvant. The composition of The preparation becomes
  • Antigenic medium 49.5% Hui Mineral 42.5% Mannide monooleate 7.5% Polysorbate 80 0.5%
  • the measurement of the immune response to intramuscular injection in cattle is substantially equivalent to that obtained with the preparation of Example 1, when using a preparation according to Example 2, carried out for less than 1 month .
  • Vaccine preparations are sold commercially according to the method of Example 2, combining FIA adjuvant and a hydrophilic emulsifier.
  • Belgian patent BE-A-648053 from Philips describes a brucellosis vaccine produced under similar conditions, and which exhibits a notable reduction in viscosity compared to the preparations made with the FIA adjuvant alone.
  • the vaccines (or injectable preparations) of the invention are characterized by 4 important physicochemical quantities:
  • the viscosity measured by a rotating mobile device of the BR00KFIELD type must be less than 800 centistokes at 20 C to be injectable through a syringe needle whose diameter is 0.2 mm;
  • the emulsified preparation must not phase out, that is to say release the internal antigenic phase or the oily phase under normal storage conditions for this type of product;
  • - conductivity it determines the oily or aqueous character of the continuous phase of the emulsion. For values less than about 20 microsiemens, an oily continuous phase is obtained at room temperature; - microscopic aspect: the dispersed anti-gene phase droplet sizes are less than 10 ⁇ m and little dispersed.
  • the other constituents (oils, emulsifiers) must meet specific criteria defined below.
  • Oil Fluid oils are chosen from mineral, vegetable or animal oils known for their low toxicity. They must be liquid at storage temperature (+4 C) or, at least, give liquid emulsions at this temperature. In particular, straight chain mineral oils having a number of carbon atoms greater than 16 and free of aromatic compounds will be chosen.
  • MARC0L 52 produced by ESS0 France
  • DRAKE0L 6VR produced by PENREC0 USA
  • oils which are biodegradable and known for their immunogenic power, for example peanut, olive, sesame, soybean, wheat germ oils, etc. .
  • unsaturated oils rich in oleic acid which are biodegradable and known for their immunogenic power, for example peanut, olive, sesame, soybean, wheat germ oils, etc.
  • animal oils the same criteria of tolerance and immunological efficacy allow the use of, for example, squalene, squalane, spermaceti oil.
  • Definition of the emulsifier system IL must be adapted to give injec ⁇ table preparations of W / O type which are fluid and stable.
  • HLB Hydrophilic - Lipophilic - Balance
  • the emulsifiers are preferably obtained by condensing a liquid fatty acid at 20 ° C. on a sugar (mannitol, glucose, sucrose) or glycerol.
  • Preferred fatty acids are those having at least 16 carbon atoms and in particular oleic, linoleic, ricinoleic, ketostéa ⁇ ' acids.
  • the mannitol esters are preferably used, in particular the oleates obtained under specific synthesis conditions, by anhydrisation of the polyhydroxylated carbon chain of mannitol which cyclizes in 1-4 or 2-6.
  • the hydrophilicity of the esters obtained can be modified by grafting hydrophilic functions such as alcohol, polyols, ethylene oxide, propylene oxide, carboxylic acid, amine, amide. All the emulsifiers used must be highly acceptable for an injectable use, in particular being free of Heavy metals, and having very low acid or peroxide indices. It is also desirable that they meet the standards for safety tests such as, for example, that described by S.S. BERLIN (annals of allergy 20, 473 1962).
  • the emulsifiers used form with the chosen oil a homogeneous, clear and stable phase which will be emulsified with the aqueous medium specific to each injectable prepa ⁇ ration.
  • the emulsifiers described in Table B meet the above requirements. They are used in the injec ⁇ table preparations described in examples 3 to 9 to form fluid and stable emulsions.
  • Table B Physico-chemical characteristics of emulsifiers usable in the invention
  • Example 3 This example shows the importance of the fluency of vaccines on their tolerance by animals.
  • Vaccine A is characterized by low viscosity, good injectability: it contains the ulcer 2 described in table (B).
  • Both vaccines contain the same fluid mineral oil.
  • the experiment took place on 2 Lots of 6 pigs to which were administered 2 times, 15 days apart, 2 ml of vaccine by IM route Serological analysis and histological examination took place 59 days after The first vaccination.
  • a foot-and-mouth disease vaccine for cattle is produced by mixing, with mechanical agitation, a portion of adjuvant containing the emulsifier 1 and a portion of the inactivated antigenic medium.
  • the adjuvant contains 5 7. of a vegetable oil.
  • the activity is maintained on preparations stored up to 2 years.
  • the tolerance of the preparation injected intramuscularly in cattle is good. Histological examination reveals a slight inflammation of the tissues at the injection site with the presence of few nodules and granulomas. The absorption of the inflammation and the microscopic disappearance of the injected product are obtained within 15 days of the injection.
  • EPP Injected dose 5 ml.
  • the results (EPP) are expressed as a percentage of animals protected against Valences 0, A and C viruses over a period of 3 months post-vaccination, with vaccines from several lots stored for several months at 4 C .
  • Example 5 Mice are vaccinated with vaccines made up
  • Example 6 An injectable preparation containing hormonal active ingredients is produced by mixing a part of an aqueous suspension and a part of an oily adjuvant containing metabolizable oils (squalene and sweet almond oil 84%) and a non-metabolizable oil (squalane: 5%) and The emulsifier (3): 11%.
  • the preparation according to the invention has sufficient efficacy and causes Le primate only a slight redness at the injection site which disappears after a few days.
  • Example 7 An Aujeszky vaccine is produced by mixing 30 parts of an inactivated viral medium titrating 2.10 9 DCP 50 / ml and 70 parts of an oily adjuvant containing a vegetable oil and the emulsifier 3.
  • Table 7-1 gives the characteristics of the adjuvant and the vaccine obtained. 2 ml of vaccine are injected into a batch of 5 pigs followed by a booster at 15 days. A resistance test is performed 15 days after recall. The slaughter and the histological examination took place 5 weeks after the recall. The results of the Experimentation show in all areas a very good tolerance of the vaccine. These results can be compared with those obtained with a conventional oily vaccine containing an adjuvant type FIA and presented in Example 3 (vaccine B).
  • Example 8 The same experiment as that described in Example 7 was carried out with a vaccine containing 70 parts of an adjuvant composed of squalane of a fatty acid ester and of a slightly hydrophilic emulsifier described under reference 2 in the Table B and 30 parts of Aujeszky antigen medium.
  • the vaccine obtained is very fluid and is easily injected. Its performance and characteristics are given in Tables 8 - 1 and 8 - 2.
  • Antibody level expressed in Log base 2 of The last agglutinative dilution - Geometric mean.
  • Example 9 An ILar anti-collaboration vaccine was produced for vaccination in rabbits.
  • the antigenic medium is a suspension of attachment factor K 88 ab in physiological saline, at a concentration such that the D 0 of this suspension is from 0.5 to 540 n.
  • the adjuvant used is that described in Example 7 and in Table 7-1.
  • the vaccine contains 1/3 of antigenic medium and 2/3 of adjuvant. Its characteristics are as follows.
  • New Zealand rabbits of 6 weeks are vaccinated with 1 ml of vaccine then a booster is given at 29 days.
  • Antibody levels are measured by a micro-aggLutination technique. Table 9 gives the results obtained with this vaccine as well as with a conventional oily vaccine formulated with incomplete Freund's adjuvant (formula 50/50; viscosity> 3000 mPa.s).
  • the antibody levels with the vaccine according to the invention are greater than or equal to those measured with the conventional vaccine. Reactions at the injection site are very important with the classic vaccine, especially after the booster.
  • an adjuvant consisting of:
  • Fluid mineral oil DRA E0L 6VR 82 7. Soybean oil 5%
  • Emulsifier 2 13% This liquid, clear adjuvant has the following characteristics:
  • the vaccine is produced by mixing, with mechanical agitation, 7 parts of adjuvant and 3 parts of allantoic medium containing the inactivated Newcastle antigens.
  • the preparation also remains stable at 37 C for more than a week.
  • Vaccines stored 12 months at 4 ° C. and 1 month at room temperature, as well as a control consisting of inactivated viral antigens without adjuvant and a vaccine with live virus are injected into the animals.
  • the study is carried out on 3 series of 10 E0PS chickens of the LEGH0RN type, 4 weeks old. The injection is made subcutaneously in the neck region in a 0.5 ml dose.
  • the measurement of the immunological efficacy is carried out by titration of the inhibition of he agglutination. Blood from vaccinated poultry is drawn from the wing vein at time To, 4, 8, 12, 18 weeks and the hemagglutinin content is measured. - Title of inhibition of heoagglutination
  • the superiority of the immunological activity obtained with the vaccine of the invention is noted compared to the control. Contrary to what is observed with the live virus vaccine. The activity persists after more than 4 months, which ensures the immune protection of chickens against Newcastle fever throughout their lifespan.

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Abstract

La présente invention concerne une émulsion injectable utilisable comme vaccin ou vecteur de principe actif ayant une phase continue huileuse présentant une bonne tolérance dans les conditions normales d'injection à un homme ou un animal, caractérisée par: une viscosité inférieure à 800 mPa.s à 20°C et constituée d'au moins: 20 à 90 % d'un adjuvant huileux liquide à 4°C contenant au moins un ou plusiers émulgateurs, appropriés et pharmaceutiquement acceptables, un mélange en toute proportion d'une ou plusieurs huiles métabolisables avec une ou plusieurs huiles non métabolisables, 10 à 80 % d'une phase hydrophile contenant les principes actifs ou antigènes.

Description

Vaccins et vecteurs de principes actifs fluides contenant une huile métabolisable.
La présente invention concerne de nouvelles compositions de vaccins et d'injectables fluides, contenant une phase huileuse totalement ou partiellement métabolisable, qui peuvent être uti¬ lisés en médecine vétérinaire ou humaine.
La vaccination est un moyen de Lutte préventive contre les infections visant à mettre en éveil le système de défense immuni¬ taire, par injection d'antigènes, qui sont souvent des fractions très spécifiques des parois virales ou bactériennes.
Les progrès du génie génétique font que Les antigènes disponibles sont de plus en plus purifiés, voire totalement synthé¬ tiques. Cette pureté est un atout incontestable sur le plan de la sécurité du vaccin, mais elle s'accompagne en général d'une dimi- nution de L'efficacité immunologique.
Aussi, La demande d'adjuvants d'immunité, permettant d'accroître Les réponses du système immunitaire à un antigène, est- elle de plus en plus forte. Cependant, La présence de ces adjuvants ne doit pas aller à l'encontre de La bonne innocuité des prépara- tions antigéniques modernes.
De très nombreux adjuvants d'immunité ont été décrits ; mais seuls queLques-uns d'entre eux sont utilisés au stade des vaccins industriels, et seuls l'hydroxyde et Le phosphate d'alu¬ minium sont autorisés en médecine humaine. IL est cependant reconnu que Les vaccins "huileux", dans lesquels Le milieu antigénique est émulsionné avec une huile miné¬ rale contenant un é ulgateur, sont les plus efficaces, notamment Lorsque ces vaccins sont de type E/H.
L'adjuvant résultant de l'association d'huile minérale et d'un ester du mannitoL est connu sous L'appellation d'adjuvant incomplet de Freund (FIA : "Freund's incomplète adjuvant" dans la littérature) ; sa composition est :
- huile minérale fluide (type BayoL F) : 85 % - (Arlacel A) monooléate de mannide : 15 '/. Par distinction, on nomme FCA, L'adjuvant de Freund "complet" qui contient, outre Les éléments précités, une mycobac- térie tuberculineuse qui potentialise L'effet immunitaire.
Ces adjuvants FIA et FCA, connus de Longue date, restent aujourd'hui les produits de référence dans Le monde entier pour des études i munologiques de laboratoire.
On Les trouve en particulier associés à des adjuvants injectables originaux, tels que Les muramyL dipeptides (MDP) ou des antigènes obtenus par synthèse chimique ou génétique (VP1, etc.). L'utilisation industrielle des vaccins contenant FIA et
FCA est toutefois Limitée en raison de La difficulté de Leur mise en oeuvre dans des préparations vaccinales injectables et de Leur mauvaise tolérance par Les sujets vaccinés.
En effet, il est connu que Les émuLsions huileuses obtenues à partir de FIA et FCA sont visqueuses comme de La mayon¬ naise et relarguent de L'huile. En conséquence, ces préparations sont difficilement injectables à travers des seringues de faible diamètre d'aiguille (0,2 mm).
De plus, elles créent, au niveau du site d'injection chez Les animaux, des réactions Locales avec oedèmes et abcès non acceptables par Les Autorités Sanitaires qui rendent l'animal impropre à la consommation en boucherie.
Des préparations vaccinales antidiphtériques réalisées avec FCA injectées à des femmes ont même provoqué des intolérances graves, des syndromes d'avortement qui ont prohibé ces adjuvants pour une utilisation courante chez L'être humain.
L'exemple d'un vaccin contre la fièvre aphteuse contenant du FIA est décrit ci-dessous afin de mettre en évidence l'effica¬ cité immunologique. Les propriétés physico-chimiques et La mauvaise tolérance de ce type de préparation.
Exemple 1 On réalise une préparation vaccinale pour le traitement de La fièvre aphteuse chez les bovins à partir d'adjuvant de Freund incompLet (FIA) par mélange sous agitation mécanique d'une partie de FIA et d'une partie de milieu antigénique inactivé. La préparation du milieu antigénique a fait l'objet d'un soin particulier lors de La culture, de la purification et de la concentration des antigènes qui sont dilués dans un milieu type Eagle en présence de tampon phosphaté. La composition de La préparation est donc (poids/poids) :
Milieu antigénique 50 7. HuiLe minérale 42,57.
Monooléate de annide 7,5 %
Les caractéristiques physico-chimiques obtenues sur cette préparation sont :
Conductivité à 20 C : 12 microsiemens Viscosité à 20°C : 6 500 centistokes pH : 7,6
S Sttaabbiilliittéé : rreelargage d'huile au stockage à 4 C
Aspect microscopique : gouttelettes de taille supérieure à 2 μ
Les tests d'efficacité i munologique chez le bovin montrent une bonne réponse immunitaire avec production persistante d'anticorps circulant 30 jours après la vaccination intramuscu- laire.
Expérimentation :
Résultats immunitaires fièvre aphteuse bovins
- vaccins huileux adjuvant FIA - Dose injectée 5 ml - les résultats (EPP) sont exprimés en pourcentage de nombre d'ani¬ maux protégés vis-à-vis des virus de valences 0, A et C, sur une durée de 3 mois, avec des vaccins de plusieurs Lots, stockés à 4°C. TABLEAU 1
Figure imgf000006_0001
mesure de La protection 30 et 90 jours après vaccination pour mesurer L'effet prolongé de l'immunité.
L'examen microscopique des effets toxiques sur L'animal de la préparation vaccinale au point d'injection montre la présence importante de nodules et de granulomes et même d'abcès ouverts. L'étendu des régions lésées est importante.
Un examen histologique met en évidence la présence de résidus huileux dans les tissus et une notable augmentation de la taiLle des ganglions externes. Pour améliorer l'injectabi lité de tels vaccins huileux, une technique connue consiste à incorporer, dans Le milieu antigé¬ nique, une faible proportion d'un émulgateur hydrophile, le Polysorbate 80 (décrit dans les pharmacopées).
La présence de ce produit réduit de façon importante la viscosité de vaccins comme il est montré dans L'exemple 2.
Toutefois, on sait que Le polysorbate 80, utilisé en biochimie comme agent délipidant, est agressif vis-à-vis des parois celLuLaires et donc potentiellement toxique.
Exemple 2 La préparation vaccinale réalisée dans L'exemple 1 a été modifiée en ajoutant 1 % de Polysorbate 80 à L'adjuvant FIA. La composition de La préparation devient
Milieu antigénique 49,5 % Hui Le minérale 42,5 % Monooléate de mannide 7,5 % Polysorbate 80 0,5 %
Les caractéristiques physico-chimiques obtenues sont
Conductivité à 20 C 10 mi crosiemens Viscosité à 20°C 350 centistokes PH 7,6 Stabilité Léger anneau d'huile au stockage à 4°C
La mesure de La réponse immunitaire à L'injection intra¬ musculaire chez le bovin est sensiblement équivalente à celle obtenue avec la préparation de l'exemple 1, Lorsque L'on utilise une préparation selon l'exemple 2, réalisée depuis moins de 1 mois.
Par contre, lorsque l'on utilise une préparation selon l'exemple 2 réalisée depuis 1 an et stockée à 4 C dans des condi¬ tions stériles, on constate une altération de La phase antigénique et une diminution de la réponse immunitaire avec un taux d'anti¬ corps circulants moins élevé.
Ces résultats sont expliqués par la présence de l'émuL- sionnant hydrophile Polysorbate 80 (caractérisé par HLB de 15) qui exerce un pouvoir mouillant sur les enveloppes ceLLulaires des antigènes et solubilise les protéines de surface. Ceci a pour effet de les dénaturer et de modifier leur aptitude à La création d'anti¬ corps.
Ce mécanisme des agents tensioactifs hydrophiles vis-à-vis des micro-organismes est connu et décrit en particulier dans la Littérature.
Au niveau des résultats de toxicité à l'injection chez L'animal, on observe des phénomènes similaires à ceux obtenus avec la préparation de l'exemple 1, qui sont caractéristiques d'une mauvaise tolérance du vaccin.
On trouve des préparations vaccinales commercialisées selon le procédé de L'exemple 2, associant de l'adjuvant FIA et un émulsionnant hydrophile. Le brevet belge BE-A-648053 de Philips décrit un vaccin contre La brucellose réalisé dans des conditions similaires, et qui présente une notable réduction de la viscosité par rapport aux préparations réalisées avec l'adjuvant FIA seul.
L'utilisation d'huiles metabolisables telles qu'huiles végétales, squalène, squalane à la place d'huiles minérales a permis dans certains cas d'obtenir des vaccins de type E/H bien mieux tolérés. Weilbel et coll. ne notent que de petits nodules de 3 à 4 mm chez les humains vaccinés au moyen d'un vaccin grippal contenant de l'huile d'arachide (P.S.E.B.H 143, 1053 - 1056 (1973), cependant. Les réponses immunitaires enregistrées sont en général plus faibles et La protection moins longue avec ce type de vaccins qu'avec les vaccins sur huile minérale. Ceci peut être expliqué par une dégradation plus rapide du vaccin dans L'organisme.
Les exemples rapportés dans Le brevet anglais 1 081 796 (1965) de L.B H0LT sont bien représentatifs de ce phénomène (tableau A)
Tableau A Evolution du taux d'anticorps avec 2 vaccins huileux adjuvés FIA ou huile d'amande douce.
Figure imgf000008_0001
Une autre caractéristique particulièrement désavantageuse de ces vaccins sur huile métabolisable est leur viscosité qui rend Leur injection difficile et douloureuse. Les vaccins adjuvés par du squalène ou du squalane décrit dans le brevet européen 0 117 934 ont une viscosité supérieure à 4 000 mPa.s.
De même, ceux décrits dans l'article de W00DH0UR (PSEBM 116, 516-523, 1964) et contenant de l'huile d'arachide et du monostéarate d'aluminium sont présentés comme "hiqhly1 viscous WATER-in-oil emulsion". II a été trouvé, de façon tout à fait inattendue, que l'adjonction d'une huile métabolisable aux vaccins contenant une huile minérale (ou de manière générale non métabolisable) permet¬ tait d'en améliorer considérablement la tolérance sans en modifier de façon significative l'efficace immunologique à condition que les vaccins obtenus soient stables et très fluides.
L'obtention de ces préparations fluides, stables, tota¬ lement ou partiellement metabolisables, a été rendue possible grâce à L'utilisation d'émulgateurs non toxiques, faiblement hydrophiles, obtenus à partir d'acides gras liquides, de annitol ou de glycé- roL.
Les vaccins (ou préparations injectables) de L'invention sont caractérisés par 4 grandeurs physico-chimiques importantes :
- fluidité : La viscosité mesurée par un appareil à mobile tournant du type BR00KFIELD doit être inférieure à 800 centistokes à 20 C pour être injectable à travers une aiguille de seringue dont Le diamètre est de 0,2 mm ;
- stabi lité : la préparation émulsionnée ne doit pas déphaser, c'est-à-dire Libérer La phase antigénique interne ni La phase huileuse dans des conditions de stockage normales pour ce type de produit ;
- conductivité : elle détermine le caractère huileux ou aqueux de la phase continue de L'émuLsion. Pour des valeurs inférieures à 20 microsiemens environ, on obtient une phase continue huileuse à température ambiante ; - aspect microscopique : les tailles de gouttelettes de phase anti¬ génique dispersées sont inférieures à 10 μm et peu dispersées.
Mis à part le milieu antigénique, ou les principes actifs spécifiques à chaque préparation injectable, les autres consti¬ tuants (huiles, émulgateurs) doivent répondre à des critères précis définis ci-après.
Définition de L'huile Les huiles fluides sont choisies parmi les huiles miné¬ rales, végétales ou animales connues pour Leur faible toxicité. Elles doivent être liquides à la température de stockage (+4 C) ou, au moins, donner des émuLsions liquides à cette température. On choisira en particulier des huiles minérales à chaîne linéaire ayant un nombre d'atomes de carbone supérieur à 16 et exemptes de composés aromatiques.
Des exemples connus sont Le MARC0L 52 (produit par ESS0 France) et Le DRAKE0L 6VR (produit par PENREC0 USA).
On peut également utiliser des huiles minérales synthé- tiques telles que les polyisobutènes ou Les polyisoprènes.
Parmi Les huiles végétales, on choisira des huiles insa¬ turées riches en acide oléique qui sont biodégradables et connues pour leur pouvoir immunogène, par exemple les huiles d'arachide, d'olive, de sésame, de soja, de germe de blé, etc. Pour les huiles animales, les mêmes critères de tolérance et d'efficacité immunologique permettent d'utiliser par exemple du squalène, du squalane, de L'huile de spermaceti.
Un mélange des huiles citées précédemment est avantageu¬ sement utilisé dans le cadre de La présente invention.
Définition du système émulgateur IL doit être adapté pour donner des préparations injec¬ tables de type E/H fluides et stables.
Il se compose d'un ou plusieurs agents tensioactifs ayant en mélange un caractère Lipophile ou faiblement hydrophile carac- térisé par un nombre HLB (Hydrophile - Lipophile - Balance) compris entre 2 et 9.
Les émulgateurs sont de préférence obtenus par condensa¬ tion d'un acide gras Liquide à 20 C sur un sucre (mannitol, glucose, saccharose) ou du glycérol. Les acides gras préférés sont ceux ayant au moins 16 atomes de carbone et en particulier Les acides oléique, linoléique, ricinoléique, cétostéaπ'que.
On utilise de préférence les esters de mannitol notamment Les oléates obtenus dans des conditions de synthèses particulières, par anhydrisatîon de la chaîne carbonée polyhydroxylée du mannitol qui se cyclise en 1-4 ou en 2-6. L' hydrophi Lie des esters obtenus peut être modifiée par greffage de fonctions hydrophiles telles qu'alcool, polyoLs, oxyde d'éthylέne, oxyde de propylène, acide carboxylique, aminé, amide Tous Les émulgateurs uti Lises doivent être phar aceuti- quement acceptables pour un usage en injectable, notamment être dépourvus de métaux Lourds, et présenter des indices d'acide ou de peroxyde très faibles. Il est également souhaitable qu'ils satis¬ fassent les normes de tests d'innocuité tels que, par exemple, celui décrit par S.S. BERLIN (annals of allergy 20, 473 1962).
Il est également souhaitable que les émulgateurs utilisés forment avec l'huile choisie une phase homogène, limpide et stable qui sera émuLsionnée avec le milieu aqueux propre à chaque prépa¬ ration injectable. Les émulgateurs décrits dans Le tableau B répondent aux exigences ci-dessus. Ils sont utilisés dans Les préparations injec¬ tables décrites dans les exemples 3 à 9 pour former des émulsions fluides et stables. Tableau B Caractéristiques physico-chimiques d'émulgateurs uti lisables dans l' invention
Figure imgf000012_0001
S = Soluble - I = Insoluble - D = Dispersible.
(1) marque déposée SEPPIC France
(2) marque déposée LIP0ID R.F.A.
11
Exemple 3 Cet exemple montre l'importance de la fluidité des vaccins sur leur tolérance par des animaux.
On réalise deux vaccins porcins contre la maLadie d'AUJESZKY contenant le même milieu antigénique inactivé à la β- propiolactone. Les caractéristiques du vaccin A selon l'invention et du vaccin B (contenant un adjuvant type FIA sont mentionnées dans Le tableau 3 - 1.
Le vaccin A se caractérise par une faible viscosité, une bonne înjectabi lité : il contient L'é ulgateur 2 décrit dans le tableau (B) .
Les deux vaccins contiennent La même huile minérale fluide.
L'expérimentation a eu Lieu sur 2 Lots de 6 porcs auxquels ont été administrés 2 fois, à 15 jours d'intervalle, 2 ml de vaccin par voie I.M. L'analyse séroLogique et l'examen histologique ont eu Lieu 59 jours après La première vaccination.
Les résultats sont consignés dans le tableau 3 - 2. On peut y remarquer que Les taux d'anticorps sont voisins pour Les 2 vaccins, mais que Le vaccin A est beaucoup mieux toléré que le vaccin B, pour lequel 2 porcs ont présenté des comportements anoi— maux après chaque vaccination. Aux niveaux des sites d'injection, nécroses et suppurations - totalement inacceptables par Les auto¬ rités sanitaires - sont pratiquement absentes du groupe A. Les granulomes macrophagiques et les infiltrats inflammatoires observés sont les témoins d'une réaction immunitaire intense.
Tableau 3 - 1
Caractéristiques des vaccins porcins Aujeszky
Figure imgf000014_0001
Tableau 3 - 2
Résultats de la vaccination
Figure imgf000015_0001
14
Exemple 4
On réalise un vaccin antiaphteux pour bovins par mélange sous agitation mécanique d'une partie d'adjuvant contenant l'émul- gateur 1 et d'une partie du milieu antigénique inactivé. L'adjuvant contient 5 7. d'une huile végétale.
Les caractéristiques physico-chimiques de l'adjuvant et du vaccin obtenu sont donnnées ci-dessous (tableau 4 - 1).
Le test d'efficacité immunologique donne les résultats résumés dans le tableau 4 - 2 qui peuvent être comparés à la prépa¬ ration de l'exemple 1.
L'activité est maintenue sur des préparations stockées jusqu'à 2 ans.
La tolérance de la préparation injectée par voie intramus¬ culaire chez le bovin est bonne. L'examen histologique révèle une inflammation légère des tissus au point d'injection avec présence de peu de nodules et de granulomes. La résorption de l'inflammation et La disparition microscopiques du produit injecté sont obtenues dans Les 15 jours suivant L'injection.
Tableau 4 - 1 Caractéristiques du vaccin antiaphteux
Figure imgf000016_0001
15
Tableau 4 - 2 Résultats immunitaires fièvre aphteuse bovine
Dose injectée 5 ml. Les résultats (EPP) sont exprimés en pourcentage d'animaux protégés vis-à-vis des virus de Valences 0, A et C sur une durée de 3 mois post-vaccinale, avec des vaccins de plusieurs lots stockés durant plusieurs mois à 4 C.
Figure imgf000017_0001
Exemple 5 On vaccine des souris avec des vaccins constitués
d'un milieu antigénique à 100 μg/ l d'albumine bovine d'un adjuvant huileux contenant
soit une huile de synthèse (vaccin 5A), soit une huile de synthèse et une hu le végétale
(vaccin 5B) .
Ces deux vaccins sont fluides et stables. Leurs caracté¬ ristiques physico-chimiques sont données dans le tableau 5 - 1. 16
Des Lots de 10 souris SW SS sont vaccinés par 0,1 ml de ces vaccins. Un lot témoin reçoit le milieu antigénique non adjuvé. Les taux d'anticorps, mesurés au cours du temps par une technique ELISA, sont donnés dans le tableau 5 - 2. On constate que les deux vaccins adjuvés se comportent de la même façon bien que Le vaccin 5B contienne une huile métabolisable, et sont nettement plus efficaces que Le vaccin non adjuvé. On remarquera L'apparition rapide des anticorps avec Le vaccin contenant L'huile métaboli¬ sable.
Tableau 5 - 1 Caractéristiques physico-chimiques du vaccin BSA
Figure imgf000018_0001
Tableau 5 - 2 Taux d'anticorps chez la souris vaccinée par les vaccins BSA
Figure imgf000018_0002
Exemple 6 Une préparation injectable contenant des principes actifs hormonaux est réalisée par mélange d'une partie d'une suspension aqueuse et d'une partie d'un adjuvant huileux contenant des huiles metabolisables (squalène et huile d'amandes douces 84 %) et une huile non métabolisable (squalane : 5 %) et L'émulgateur (3) : 11 %.
Le vaccin obtenu a Les caractéristiques suivantes :
SENS E/H
CONDUCTIVITE 0,14 μS
VISCOSITE 305 mPa.s
STABILITE 4°C et 20°C > 6 mois
Ces caractéristiques, en particulier viscosité et stabi¬ lité, ne peuvent être obtenues que grâce à La formulation spéci¬ fique de l'adjuvant huileux. En effet, un vaccin ayant le même rapport eau/huile mais formulé à partir de squalène et de mono- oléate de mannitol traditionnel est très visqueux (4400 mPa.s) d'injection extrêmement difficile et douloureuse, et peu stable (exsudation d'huile importante à 4 et 20 C).
La préparation selon l'invention a une efficacité suffi¬ sante et ne provoque chez Le primate qu'une légère rougeur au point d'injection qui disparaît au bout de quelques jours.
Exemple 7 On réalise un vaccin Aujeszky par mélange de 30 parties d'un milieu viral inactivé titrant 2.10 9 DCP 50/ml et de 70 parties d'un adjuvant huileux contenant une huile végétale et l'émulgateur 3.
Le tableau 7 - 1 donne les caractéristiques de l'adjuvant et du vaccin obtenu. 2 ml de vaccin sont injectés à un Lot de 5 porcs suivi d'un rappel à 15 jours. Une épreuve de résistance est pratiquée 15 jours après rappel. L'abattage et L'examen histolo- gique ont eu Lieu 5 semaines après Le rappel. Les résultats de L'expérimentation montrent dans tous les domaines une très bonne tolérance du vaccin. Ces résultats peuvent être comparés à ceux obtenus avec un vaccin huileux classique contenant un adjuvant type FIA et présentés à l'exemple 3 (vaccin B) .
Il convient de noter tout particulièrement L'absence d'hyperthermie excessive, de nécroses et suppurations, La présence de granulomes macrophagiques discrets traduisant la réponse immu¬ nitaire et confirmant la bonne résistance à l'épreuve infectieuse.
Tableau 7 - 1
Caractéristiques physico-chimiques du vaccin et de son adjuvant
Caractéristiques de L'adjuvant
Composition Huile minérale fluide 44 % Huile d'arachide raffinée 44 % Emulgateur 3 12 %
Aspect liquide huileux, jaune paille, limpide, stable, homogène.
Viscosité à 20°C 20 mPa.s
Indice de réfraction 1,466
Indice d'hydroxyle 13
Indice de saponification 105
Caractéristiques du vaccin Sens E/H
Conductivité à 20 C 1,9 μS Viscosité à 20 C 38 mPa.s Aspect microscopique homogène - gouttes de 1 μm Stabilité à 4°C > 12 mois Tableau 7 - 2
Résultats expérimentaux de La vaccination porcine
Hyperther ie à La vaccination 0 au rappel brève chez 2 animaux à l'épreuve intense mais brève (< 48 h)
Réactions générales à la vaccination ) légère inflammation point au rappel ) d'injection disparaissant
) en 48 h à l'épreuve 0
Mortalité (après L'épreuve) 0
Histologie (fréquence sur 5 porcs) (Nécrose 0
(Suppuration 0
(Fibrose
(Atrophie musculaire 5 (Légère)
(Granulomes macrophagiques 5 (disséminés, discrets) Exemple 8 La même expérimentation que celle décrite à l'exemple 7 a été réalisée avec un vaccin contenant 70 parties d'un adjuvant composé de squalane d'un ester d'acide gras et d'un émulgateur légèrement hydrophile décrit sous référence 2 dans le tableau B et 30 parties de milieu antigénique Aujeszky. Le vaccin obtenu est très fluide et s'injecte facilement. Ses performances et ses carac¬ téristiques sont données dans Les tableaux 8 - 1 et 8 - 2.
On notera à nouveau l'absence de réactions d'intolérance importantes comparativement au vaccin classique de L'exemple 1B.
Tableau 8 - 1
Caractéristiques physico-chimiques du vaccin porcin Aujeszky
Figure imgf000022_0001
Tab leau 8 - 2
Résultats expérimentaux de la vaccination porcine
Figure imgf000023_0001
Tableau 9
Résultats d'une vaccination anticollibaci Liaire chez le Lapin
Figure imgf000023_0002
Taux d'anticorps exprimé en Log base 2 de La dernière dilution agglutinante - Moyenne géométrique.
**
Diamètres moyens des érythèmes observés (mm) au point d'injec¬ tion. Exemple 9 Un vaccin anticollibaci ILaire a été réalisé pour une vaccination chez le Lapin.
Le milieu antigénique est une suspension de facteur d'attachement K 88 ab dans du sérum physiologique, à une concentra¬ tion telle que La D 0 de cette suspension soit de 0,5 à 540 n .
L'adjuvant utilisé est celui décrit à L'exemple 7 et au tableau 7 - 1.
Le vaccin contient 1/3 de milieu antigénique et 2/3 d'adjuvant. Ses caractéristiques sont Les suivantes.
SENS E/H
CONDUCTIVITE à 20°C 2,0 μS VISCOSITE â 20°C 40 mPa.s
Des Lapins néozélandais de 6 semaines sont vaccinés par 1 ml de vaccin puis un rappel est effectué à 29 jours.
Les taux d'anticorps sont mesurés par une technique de micro-aggLutination. Le tableau 9 donne les résultats obtenus avec ce vaccin ainsi qu'avec un vaccin huileux classique formulé avec adjuvant de Freund incomplet (formule 50/50 ; viscosité > 3 000 mPa.s).
Les taux en anticorps avec le vaccin selon l'invention sont supérieurs ou égaux à ceux mesurés avec le vaccin classique. Les réactions au site d'injection sont très importantes avec Le vaccin classique, surtout après le rappel.
Elles le sont beaucoup moins et régressent plus rapidement avec Le vaccin de cet exemple.
Exemple 10
Pour réaliser une préparation vaccinale contre la maladie de Newcastle chez Les volailles, nous avons utilisé un adjuvant constitué de :
Huile minérale fluide DRA E0L 6VR 82 7. Huile de soja 5 %
Emulgateur 2 13 % Cet adjuvant liquide, limpide présente les caractéris¬ tiques suivantes :
Indice acide inférieur à 0,5 Indice hydroxyle voisin de 11
Indice de réfraction de 1,459
Le vaccin est réalisé par mélange sous agitation mécanique de 7 parties d'adjuvant et de 3 parties de milieu allantoïdien contenant les antigènes Newcastle inactivés.
Les caractéristiques physico-chimiques du vaccin sont :
Conductivité à 20 C inférieure à 1 microsiemens Viscosité à 20 C 45 centistokes Stabilité pas de relargage d'huile, ni de ddéépphhaassaage du milieu à 4°C après 3 mois.
La préparation reste également stable à 37 C durant plus d'une semaine.
Des vaccins stockés 12 mois à 4 C et 1 mois à température ambiante, ainsi qu'un témoin constitué des antigènes viraux inac¬ tivés sans adjuvant et un vaccin à virus vivants sont injectés aux animaux. L'étude est effectuée sur 3 séries de 10 poulets E0PS du type LEGH0RN âgés de 4 semaines. L'injection se fait par voie sous- cutanée dans La région du cou par dose de 0,5 ml.
La mesure de l'efficacité immunologique est effectuée par titrage de l'inhibition de L 'hé agglutination. On prélève le sang de la volaille vaccinée dans la veine de L'aile au temps To, 4, 8, 12, 18 semaines et on mesure la teneur en hémagglutinine. - Titre d'inhibition de l'hé atoagglutination
To 4 sem. 8 sem. 12 sem. 18 sem. 1 (témoin) 10 9 10 8 8 2 (vaccin selon l'invention) 210 230 190 150 160
3 (vaccin virus vivants) 305 210 120 70 50
On constate La supériorité de L'activité immunologique obtenue avec le vaccin de l'invention par rapport au témoin. Contrairement à ce qui est observé avec Le vaccin à virus vivants. L'activité persiste après plus de 4 mois, ce qui permet d'assurer la protection immunitaire des poulets vis-à-vis de la fièvre de Newcastle tout au long de leur durée de vie.
Sur Le plan toxicité, on ne révèle aucune mortalité de la volaille vaccinée avec Le vaccin selon l'invention, alors qu'un certain nombre de poulets (5 %) sont morts peu après injection du vaccin à virus vivants.

Claims

REVENDICATIONS
1. Emulsion injectable utilisable comme vaccin ou vecteur de principe actif ayant une phase continue huileuse présentant une bonne tolérance dans les conditions normales d'injection à un homme ou un animal, caractérisée par : une viscosité inférieure à 800 mPa.s à 20 C et constituée d'au moins :
- 20 à 90 % d'un adjuvant huileux liquide à 4 C contenant au moins
- un ou plusieurs émulgateurs, appropriés et phar aceuti- quement acceptables,
- un mélange en toute proportion d'une ou plusieurs huiles metabolisables avec une ou plusieurs huiles non métabo- lisables,
- 10 à 80 % d'une phase hydrophile contenant Les principes actifs ou antigènes.
2. Emulsion selon la revendication 1, dont l'huile métabo- lisable est d'origine végétale.
3. Emulsion selon La revendication 1, dont L'huile métabo¬ lisable est d'origine animale.
4. Emulsion selon la revendication 1, dont L'huile métabo¬ lisable est un ester résultant de La condensation d'un acide gras contenant de 12 à 24 atomes de carbone avec un alcool ou de la condensation d'un alcool gras contenant de 12 à 24 atomes de carbone avec un acide.
5. Emulsion selon la revendication 1, dont l'huile métabo¬ lisable est une huile de synthèse de type alcane, alcène ou alcyne dont Le nombre d'atomes de carbone moyen est d'au moins 16.
6. Emulsion selon La revendication 1, dont l'huile non métabolisable est d'origine minérale ou animaLe et possède un nombre moyen d'atomes de carbone au moins égal à 16.
7. Emulsion seLon L'une des revendications 1 à 7, dont L'huile non métabolisable représente de 2 à 95 %, de préférence 10 à 50 % de l'adjuvant huileux.
8. Emulsion selon L'une des revendications 1 à 6, dont Le ou les émulgateurs sont obtenus par condensation d'un acide gras liquide à 20 C contenant au moins 16 atomes de carbone avec un polyoL.
9. Adjuvant huileux limpide et stable constitué d'au moins une des huiles décrites dans L'une des revendications 1 à 7 et d'un ou de plusieurs émulgateurs décrits dans la revendication 8.
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