ES2588705T3 - Uso de liposomas en un vehículo que comprende una fase hidrófoba continua para la entrega de polinucleótidos in vivo - Google Patents

Uso de liposomas en un vehículo que comprende una fase hidrófoba continua para la entrega de polinucleótidos in vivo Download PDF

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ES2588705T3 ES08800369.4T ES08800369T ES2588705T3 ES 2588705 T3 ES2588705 T3 ES 2588705T3 ES 08800369 T ES08800369 T ES 08800369T ES 2588705 T3 ES2588705 T3 ES 2588705T3
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Abstract

Una composición que comprende: un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba; liposomas; y un polinucleótido capaz de afectar la expresión de un gen y/o el nivel de un polipéptido.

Description

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DESCRIPCION
Uso de liposomas en un vehiculo que comprende una fase hidrofoba continua para la entrega de polinucleotidos in vivo
Campo de la invencion
La presente solicitud se refiere al uso de una composicion que comprende liposomas y una fase hidrofoba continua como un vehiculo para entregar polinucleotidos in vivo.
Antecedentes de la invencion
Ha habido mucha investigacion sobre la introduccion eficaz de acidos nucleicos dentro de celulas y tejidos diana para su uso por ejemplo en terapia genica. Tales acidos nucleicos pueden ser por ejemplo secuencias que codifican un producto genico o en su lugar secuencias de nucleotidos cortas que se corresponden con la secuencia sentido o antisentido de genes especificos o sus productos y por tanto tienen un efecto directo sobre la expresion de estos genes y/o sus productos.
Continuan existiendo problemas en la entrega de acidos nucleicos al sitio diana correcto y a un numero suficiente de celulas diana. Los acidos nucleicos se someten al ataque de nucleasas y son frecuentemente incapaces de cruzar las membranas celulares. Se han propuesto una amplia variedad de procedimientos de entrega, que incluyen microinyeccion, carga de raspaduras y endocitosis mediada por receptor. Los sistemas de vehiculo basados en lipidos, que incluyen aquellos que implican el uso de liposomas, se usan frecuentemente para encapsidar los acidos nucleicos terapeuticos. Sin embargo, el uso de liposomas puede plantear problemas tales como mala eficacia de encapsulacion y rapida eliminacion de la circulacion. Tambien puede haber problemas en encapsidar nucleico suficiente sin aumentar el tamano del liposoma hasta el punto en el que se altere la entrega a los tejidos diana. Por consiguiente, existe una necesidad de desarrollar sistemas de entrega basados en liposomas para dirigir acidos nucleicos al tejido diana correcto.
Sumario de la invencion
En un aspecto, la invencion proporciona una composicion que comprende: un vehiculo que comprende una fase continua de una sustancia hidrofoba; liposomas; y un polinucleotido.
En otro aspecto, la invencion proporciona una composicion como se ha definido anteriormente, para su uso como un medicamento para entregar un polinucleotido a un sujeto.
Otros aspectos y caracteristicas de la presente invencion seran evidentes para aquellos expertos habituales en la tecnica tras la revision de la siguiente descripcion de realizaciones especificas de la invencion conjuntamente con las figuras adjuntas.
Breve descripcion de las figuras
En las figuras, que ilustran realizaciones de la invencion a modo de ejemplo solo:
La figura 1 ilustra el potencial de expresion de IL-12 en celulas aisladas de ganglios linfaticos 8 dias despues de la inyeccion.
La figura 2 ilustra el potencial de expresion de IL-12 en celulas aisladas de ganglios linfaticos 8 dias despues de la inyeccion. Se promediaron los niveles de proteina de IL-12 detectados a partir de cada grupo de ratones.
La figura 3 ilustra el potencial de expresion de la proteina verde fluorescente (GFP) en celulas aisladas de ganglios linfaticos 8 dias despues de la inyeccion. Las celulas de los ganglios linfaticos de animales del Grupo 1 (GFP en PBS), Grupo 2 (GFP/liposoma/vehiculo hidrofobo), Grupo 3 (GFP/vehiculo hidrofobo) y Grupo 4 (GFP/liposoma) contuvieron celulas que expresan GFP detectable por encima de la fluorescencia de fondo representada por una linea horizontal. La fluorescencia de fondo se estimo usando recuentos de fluorescencia de celulas de los ganglios linfaticos de animales de control del Grupo 5 (liposoma/vehiculo hidrofobo, sin GFP) y el Grupo 6 (ratones sin tratar). Se calcularon valores de p usando la prueba de la t de Student.
La figura 4 ilustra celulas de los ganglios linfaticos CD11b/CD11c positivas que muestran expresion de GFP 8 dias despues de la vacunacion. Los datos presentados en la figura 1 se re-analizaron para comparar el numero de celulas CD11 b/CD11c y GFP positivas en los ganglios linfaticos de animales de los Grupos 1 -6 (descritos en la figura 1). El numero de celulas CD11b/CD11c positivas, GFP positivas se calculo como un porcentaje de celulas de los ganglios linfaticos totales.
La figura 5 ilustra la inhibicion de la expresion de proteinas IL-12 inducida por el plasmido de IL-12 en celulas
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aisladas de ganglios linfaticos, tras la inyeccion de ARNip de IL-12. Se promediaron los niveles de proteina IL-12 detectados de cada grupo de ratones. Las celulas de los ganglios linfaticos son del Grupo 1 (plasmido pORF-mIL12 solo, sin ARNip), Grupo 2 (plasmido pORF-mIL12, IL12-ARNip en PBS), Grupo 3 (plasmido pORF-mIL12, IL12- ARNip en liposoma/vehiculo hidrofobo) y Grupo 4 (ratones sin tratamiento previo sin tratar). Se calcularon valores de p usando la prueba de la t de Student.
La figura 6 ilustra la inhibicion de la expresion de proteinas IL-12 inducida por ovoalbumina en celulas aisladas de ganglios linfaticos, tras la inyeccion de ARNip de IL-12. Se promediaron los niveles de proteina IL-12 detectados a partir de cada grupo de ratones. Las celulas de los ganglios linfaticos son del Grupo 1 (ovoalbumina en CFA en el dia 0, sin ARNip), Grupo 2 (ovoalbumina en CFA, IL12-ARNip en PBS, dia menos 1), Grupo 3 (ovoalbumina en CFA, IL12-ARNip en liposoma/vehiculo hidrofobo, dia menos 1), Grupo 4 (ovoalbumina en CFA, IL12-ARNip en PBS, dia mas 1), Grupo 5 (ovoalbumina en CFA, IL12-ARNip en liposoma/vehiculo hidrofobo, dia mas 1) y Grupo 6 (ratones sin tratamiento previo sin tratar). Se calcularon valores de p usando la prueba de la t de Student.
Descripcion detallada
La invencion proporciona composiciones utiles para entregar un polinucleotido a un sujeto.
Polinucleotidos
El uso de polinucleotidos como se describe en el presente documento se refiere especificamente a polinucleotidos que contienen secuencias que se corresponden en gran medida con la secuencia sentido o antisentido de genes especificos o sus productos y por tanto tienen un efecto directo sobre la expresion de estos genes y/o sus productos. Por ejemplo, el uso de polinucleotidos que contienen secuencias codificantes de genes afecta la transcripcion y/o traduccion de los genes de interes en celulas que captan tales polinucleotidos. Similarmente, el uso de polinucleotidos de interferencia por ARN afecta la expresion de genes especificos de interes afectando directamente los niveles de ARNm en celulas que captan tales nucleotidos. Esto se diferencia significativamente de otras moleculas basadas en polinucleotidos tales como adyuvantes de CpG y polyIC, que no actuan mediante la presencia de secuencias especificas de genes. Ademas, se cree que los adyuvantes basados en polinucleotidos modulan una respuesta inmunitaria de una manera no especifica y sus acciones empiezan en el sitio de vacunacion donde interaccionan con receptores extracelulares para potenciar la actividad de celulas inmunitarias de una manera no especifica. En algunos casos, los adyuvantes basados en polinucleotidos se internalizan por lo que ejercen sus efectos interaccionando con receptores intracelulares, que conducen similarmente a la activacion de rutas aguas abajo y que producen conjuntamente la potenciacion de la actividad de celulas inmunitarias para ayudar en la generacion de una respuesta inmunitaria. Tales adyuvantes no afectan directamente la expresion de genes especificos que estan siendo elegidos como diana por las construcciones polinucleotidicas como se contempla en el presente documento. Tales adyuvantes no interaccionan directamente con los productos de expresion de genes elegidos como diana, ni contienen secuencias que se correspondan con la secuencia sentido o antisentido de los genes elegidos como diana.
En una realizacion, la composicion es util para potenciar la expresion de un polinucleotido que codifica polipeptido in vivo. En otras realizaciones, el polinucleotido puede no codificar un polipeptido, pero puede en su lugar ser por ejemplo un polinucleotido que comprende o que codifica un ARN antisentido u otra molecula que no es un polipeptido. En algunas realizaciones, las composiciones comprenden un polinucleotido de interes, opcionalmente operativamente ligado a secuencias reguladoras adecuadas para dirigir la expresion de proteinas del polinucleotido (por ejemplo un promotor), liposomas y un vehiculo que comprende una fase continua de una sustancia hidrofoba. Se demostro que las composiciones de la invencion aumentaban la expresion de polipeptidos a partir de ADN plasmidico, como se mide por ELISA, en un modelo murino, con respecto a ADN plasmidico suspendido en solucion salina tamponada con fosfato. Tambien se demostro que las composiciones de la invencion aumentaban la expresion de polipeptidos a partir de ADN plasmidico, como se mide por inmunofluorescencia, en un modelo murino, con respecto al ADN plasmidico suspendido en solucion salina tamponada con fosfato, adyuvante incompleto de Freund (IFA) o en liposomas sin aceite.
Como se usa en el presente documento, el termino “polinucleotido” engloba una cadena de nucleotidos de cualquier longitud (por ejemplo 9, 12, 18, 24, 30, 60, 150, 300, 600, 1500 o mas nucleotidos) o numero de cadenas (por ejemplo, monocatenaria o bicatenaria). Los polinucleotidos pueden ser ADN (por ejemplo, ADN genomico o ADNc) o ARN (por ejemplo, ARNm) o combinaciones de los mismos. Pueden existir de forma natural o ser sinteticos (por ejemplo, sintetizarse quimicamente). Se contempla que el polinucleotido puede contener modificaciones de una o mas bases nitrogenadas, azucares de pentosa o grupos fosfato en la cadena de nucleotido. Tales modificaciones son muy conocidas en la tecnica y pueden ser con el fin de por ejemplo mejorar la estabilidad del polinucleotido.
Como se usa en el presente documento, el termino “polipeptido” o “proteina” significa cualquier cadena de aminoacidos, independientemente de la longitud (por ejemplo, 4, 6, 8, 10, 20, 50, 100, 200, 500 o mas aminoacidos) o despues de la modificacion traduccional (por ejemplo, glucosilacion o fosforilacion). Ambos terminos se usan indistintamente.
Las composiciones de la invencion son utiles para entregar polinucleotidos de todos los tipos a un sujeto in vivo. En
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algunas realizaciones, el polinucleotido no se expresa como una proteina en el sujeto, sino que codifica, por ejemplo, un ARN antisentido, un ARN interferente, un ARN catalitico, o una ribozima. En algunas realizaciones, el polinucleotido codifica un polipeptido que va a expresarse in vivo en un sujeto. La invencion no se limita a la expresion de cualquier tipo de polipeptido particular. El polipeptido puede ser, simplemente a modo de ejemplos ilustrativos, un antigeno, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, una enzima, una citocina, una proteina terapeutica, una quimiocina, una proteina reguladora, una proteina estructural, una proteina quimerica, una proteina nuclear, un factor de transcripcion, una proteina virica, una proteina TLR, un factor regulador de interferon, una proteina angiostatica o angiogenica, una proteina apoptosica, un receptor gamma de Fc, una proteina hematopoyetica, un supresor tumoral, un receptor de citocina, o un receptor de quimiocina.
Antigenos representativos incluyen, sin limitacion: aquellos derivados de toxoide del colera, toxoide tetanico, toxoide difterico, antigeno de superficie de la hepatitis B, hemaglutinina, neuraminidasa, proteina de la gripe M, PfHRP2, pLDH, aldolasa, MSP1, MSP2, AMA1, Der-p-1, Der-f-1, adipofilina, AFP, AIM-2, ART-4, BAGE, alfa-fetoproteina, BCL-2, Bcr-Abl, BING-4, CEA, CPSF, CT, ciclina D1Ep-CAM, EphA2, EphA3, ELF-2, FGF-5, G250, hormona liberadora de gonadotropina, HeR-2, carboxil esterasa intestinal (iCE), IL13Ralfa2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MART-1, MART-2, M-CSF, MDM-2, MMP-2, MUC-1, NY-EOS-1, MUM-1, MUM-2, MUM-3, p53, PBF, PRAME, PSA, PSMA, RAGE-1, RNF43, RU1, RU2AS, SART-1, SART-2, SART-3, SAGE-1, SCRN 1, SOX2, SOX10, STEAP1, survivina, telomerasa, TGFbetaRII, TRAG-3, TRP-1, TRP-2, TERT o WT1; aquellos derivados de un virus, tales como virus de la viruela vacuna, virus de la variolovacuna, virus de la paravacuna, virus del herpes 1 humano, virus del herpes 2 humano, citomegalovirus, adenovirus A-F humanos, virus del polioma, virus del papiloma humano, parvovirus, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la inmunodeficiencia humana, Orthoreovirus, rotavirus, virus del Ebola, virus paragripal, virus de la gripe A, virus de la gripe B, virus de la gripe C, virus del sarampion, virus de las paperas, virus de la rubeola, Pneumovirus, virus respiratorio sincitial humano, virus de la rabia, virus de la encefalitis de California, virus de la encefalitis japonesa, hantavirus, virus de la coriomeningitis linfocitica, coronavirus, enterovirus, rinovirus, virus de la poliomielitis, Norovirus, flavivirus, virus del dengue, virus del Nilo occidental, virus de la fiebre amarilla y varicela; aquellos derivados de una bacteria, tales como carbunco, Brucella, Candida, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Cholera, Clostridium botulinum, Coccidioides immitis, Cryptococcus, Diphtheria, Escherichia coli O157: H7, Escherichia coli enterohemorragica, Escherichia coli enterotoxigenica, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Legionella, Leptospira, Listeria, Meningococcus, Mycoplasma pneumoniae, Mycobacterium, Pertussis, Pneumonia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus pneumoniae y Yersinia enterocolitica; o aquellos derivados de un protozoo, por ejemplo, Plasmodium falciparum.
La interferencia por ARN (iARN) es un mecanismo de silenciamiento de genes postranscripcional especifico de secuencia, que es desencadenado por ARN bicatenario tal como ARN interferente pequeno (o corto) (ARNip) y ARN intracelular monocatenario tal como microARN (miARN), ambos de los cuales pueden producir la degradacion de ARNm homologos en secuencia a ARNip o miARN (Fire et al, 1998, Nature, 391:806-811; Montgomery et al, 1998, PNAS, 95:15502-15507; Elbashir et al, 2001, Nature, 411:494-498). La iARN es una via conservada comun a plantas y mamiferos que suprimen la expresion de genes con secuencias complementarias (Hannon y Rossi, 2004, Nature, 431:371-378; Meister y Tuschl, 2004, Nature, 431, 343-349). La iARN se observo por primera vez en organismos inferiores, tales como plantas o nematodos. En estos sistemas, los ARNbc largos sirven de desencadenantes eficaces de iARN. Los ARNbc largos no son los desencadenantes reales, pero son degradados por la endorribonucleasa Dicer en moleculas efectoras pequenas llamadas ARNip. En mamiferos, el procesamiento por Dicer se produce como un complejo con la proteina de union a ARN TRBP. El ARNip naciente se asocia a Dicer, TRBP y Ago2 para formar el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que media en el silenciamiento genico (Chendrimada et al, 2005, Nature, 436:740-744). Una vez en RISC, una hebra del ARNip (la hebra pasajero) es degradada o se desecha, mientras que la otra hebra (la hebra guia) sigue dirigiendo la especificidad de secuencia del complejo de silenciamiento. El componente de Ago2 de RISC es una ribonucleasa que escinde un ARN diana sometida a la direccion de la hebra guia.
Aunque los ARNbc largos (varios cientos de pb) se emplean comunmente para desencadenar el iARN en C. elegans o D. melanogaster, estas moleculas activaran el sistema inmunitario innato y desencadenaran respuestas de interferon (IFN) en organismos superiores. La iARN puede realizarse en celulas de mamifero usando ARN cortos, que generalmente no inducen respuestas de IFN. Muchos investigadores emplean hoy en dia duplex de ARN 21- meros sinteticos como sus reactivos de iARN, que imitan a los ARNip naturales que resultan del procesamiento por Dicer de ARN de sustrato largos. Un enfoque alternativo es usar duplex de ARN sintetico que son mayores de 21- mero en longitud, que son sustratos para Dicer (Tuschl, T. 2002, Nature Biotechnology, 20:446).
Dicer-ARN de sustrato (D-ARNip) recientemente desarrollados son duplex de ARN quimicamente sintetizados que tienen potencia elevada en la interferencia por ARN (Kim et al, 2005, Nat Biotechnol, 23:222-226). Los D-ARNip se procesan por Dicer en ARNip 21-meros y se disenan de manera que la escision produzca un unico producto deseado. Esto se logra mediante el uso de un diseno asimetrico novedoso en el que el duplex de ARN tiene un unico nucleotido protuberante en 3' de 2 bases en la cadena AS y es romo en el otro extremo; el extremo romo se modifica con bases de ADN. Este diseno proporciona Dicer con un unico sitio de union PAZ favorable que ayuda a dirigir la reaccion de escision. La polaridad funcional se introduce por este evento de procesamiento, que favorece la carga de cadena AS dentro de RISC y se cree que el aumento de potencia de estos reactivos se refiere al enlace
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entre procesamiento por Dicer y carga de RISC (Rose et al, 2005, Nucleic Acids Res, 33:4140-4156). El enfoque de Dicer-sustrato puede producir reactivos que tienen como mucho una potencia 10 veces mayor que los ARNip 21- meros tradicionales en el mismo sitio.
El miARN, descrito por primera vez en 1993 (Lee et al, 1993, Cell 75:843-854), son moleculas de ARN monocatenario de aproximadamente 21-23 nucleotidos de longitud, que regulan la expresion genica. Los miARN estan codificados por genes que se transcriben a partir de ADN, pero no se traducen en proteina (ARN no codificante); en su lugar se procesan a partir de transcritos primarios conocidos como pri-miARN dando estructuras de tallo-lazo cortas llamadas pre-miARN y dando finalmente miARN funcional. Las moleculas de miARN maduras son parcialmente complementarias a una o mas moleculas de ARN mensajero (ARNm) y su funcion principal es regular por disminucion la expresion genica. Aunque el miARN se genera dentro de la celula y esta altamente conservado, raramente tiene complementariedad perfecta con secuencias de ARNm. Sin embargo, el miARN puede afectar la traduccion de proteina y la degradacion de ARNm uniendose a sus sitios diana imperfectamente correspondientes en la region 3' UTR de ARNm, que tambien requiere la proteina Ago (no necesariamente Ago2 como se observa en ARNip). El comparar y contrastar el ARNip con el miARN muestra que si el ARNip alcanza una diana complementaria imperfecta en 3 uTr, se comporta similar a microARN y si un miARN alcanza una diana perfectamente complementaria sobre un ARNm, puede comportarse como un ARNip. Por lo tanto, aunque sean estructuralmente diferentes, tanto el ARNip como el miARN podrian poseer funciones biologicas similares en las celulas del animal huesped, con algunas diferencias en el mecanismo de accion.
Asi, las moleculas de iARN, ARNip y/o miARN proporcionan una herramienta poderosa para inhibir la expresion de genes endogenos y asi podrian proporcionar un medio para modular eficazmente respuestas biologicas. Estudios han mostrado que el iARN puede inducirse en celulas dendriticas presentadoras de antigeno (DC) para polarizar respuestas inmunitarias. Transfectando DC con ARNip sintetico especifico para la sub-unidad p35 de la citocina IL- 12, fue posible inhibir IL-12 bioactiva que posteriormente condujo a la polarizacion de Th2 (Hill et al, J Immunology, 2003, 171:691). Similarmente, se ha usado la modificacion de celulas presentadoras de antigenos profesionales con ARNip in vivo para potenciar la potencia de la vacuna del cancer (Kim et al, Cancer Research, 2005, 65:309-316). En este estudio, se mostro que la co-administracion de vacuna de ADN que codifica el virus del papiloma humano tipo 16 E7 con ARNip que se dirige a las proteinas pro-apoptosicas clave Bac y Bax prolongaba la vida de las DC que expresan antigeno en los ganglios linfaticos, mejorando las respuestas de linfocitos T CD8 especificas de antigeno que tenian potentes efectos antitumorales contra un modelo de tumor que expresa E7 en ratones vacunados. Asi, hay una buena perspectiva del uso de ARNip para silenciar respuestas especificas no deseables durante la vacunacion eficaz contra enfermedades infecciosas/autoinmunitarias, cancer y durante el trasplante. La eficiente entrega de ARNip al compartimento intracelular de celulas de interes es critica para el exito de tales estrategias, requiriendo el uso de formulaciones de entrega mejoradas.
El ARNip puede ser una cadena de nucleotidos bicatenaria (ARN) que existe de forma natural o sintetica de longitud variable. El ARNip puede ser duplex, normalmente pero no siempre limitado a, 20 a 25 nt de longitud que tienen un dominio bicatenario central de 19 pares de bases con nucleotidos protuberantes en 3' de 2 bases terminales. El ARNip puede modificarse adicionalmente quimicamente para potenciar su eficacia in vivo, inducir resistencia a nucleasa para impedir la degradacion y potenciar la estabilidad. A este respecto, la hebra no codificante puede tener tanto un extremo 5'-OH como 5'-fosfato libre, el ultimo produce procesamiento por Dicer natural y representa la forma activa de la molecula. El ARNip puede tener modificacion por fosforotioato o boranofosfato del enlace internucleosidico para mejorar la estabilidad de nucleasas y prolongar la vida del duplex cuando se expone a suero y otras fuentes de nucleasa. El ARNip puede tener modificaciones en la posicion 2', por ejemplo, incorporacion en el residuo de ARN 2'-O-metilo para retener la potencia completa en comparacion con el ARN no modificado, reteniendo la estabilidad en suero y reduciendo significativamente el riesgo de posibles respuestas de IFN en la celula. El ARNip puede tambien tener modificacion de 2'-fluoro, que normalmente se incorpora selectivamente en bases de pirimidina, para mejorar la estabilidad y potencia.
El ARNip y el miARN usados como mediadores de iARN pueden usarse como dianas en, pero no se limitan a, diversas enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes/alergicas, enfermedades cardiacas, trastornos metabolicos, tumores solidos/canceres, trastornos hematologicos/canceres.
En realizaciones de la presente invencion, el polinucleotido en la composicion puede ser un polinucleotido para su uso en iARN, que incluye, sin limitacion, un ARNip, un miARN, un ARNbc largo para la escision por Dicer, o un D- ARNip, todos como se han descrito anteriormente.
Se ha demostrado en la presente invencion que la inyeccion de secuencias de nucleotidos de ARNip de IL-12 in vivo cuando se formula en un liposoma/vehiculo hidrofobo continuo produjo mejor inhibicion de la expresion de proteinas IL-12 inducida por el plasmido IL-12 que el ARNip de IL-12 formulado en un vehiculo de PBS. Se lograron resultados similares en experimentos referentes a la inhibicion de la expresion de proteinas IL-12 inducida por ovoalbumina en celulas aisladas de ganglios linfaticos, tras la inyeccion de ARNip de IL-12. Nuevamente, el ARNip de IL-12 formulado en un liposoma/vehiculo hidrofobo continuo dio resultados superiores al ARNip de IL-12 formulado en un vehiculo de PBS.
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El sujeto puede ser cualquier sujeto al que se desea entregar un polinucleotido. El sujeto es preferentemente un vertebrado, tal como un ave, pez o mamifero, preferentemente un ser humano.
El polinucleotido puede entregarse en diversas formas. En algunas realizaciones, puede usarse un polinucleotido desnudo, tanto en forma lineal como insertado dentro de un plasmido, tal como un plasmido de expresion. En otras realizaciones, puede usarse un vector vivo tal como un vector virico o bacteriano.
Dependiendo de la naturaleza del polinucleotido y el uso previsto, pueden estar presentes una o mas secuencias reguladoras que ayudan en la transcripcion de ADN en ARN y/o la traduccion de ARN en un polipeptido. Por ejemplo, si esta previsto o no se requiere que el polinucleotido se transcriba o traduzca, tales secuencias reguladoras pueden estar ausentes. En algunos casos, tales como en el caso de un polinucleotido que es una molecula de ARN mensajero (ARNm), no se requieren secuencias reguladoras relacionadas con el proceso de transcripcion (por ejemplo, un promotor) y la expresion de proteinas puede efectuarse en ausencia de un promotor. El experto puede incluir secuencias reguladoras adecuadas segun lo requieran las circunstancias.
En algunas realizaciones, el polinucleotido esta presente en un casete de expresion, en el que esta operativamente ligado a secuencias reguladoras que permitiran que el polinucleotido se exprese en el sujeto al que se administra la composicion de la invencion. La eleccion del casete de expresion depende del sujeto al que se administra la composicion, ademas de las caracteristicas deseadas para el polipeptido expresado.
Normalmente, un casete de expresion incluye un promotor que es funcional en el sujeto y puede ser constitutivo o inducible; un sitio de union a ribosoma; un codon de iniciacion (ATG) si fuera necesario; el polinucleotido que codifica el polipeptido de interes; un codon de terminacion; y opcionalmente una region del extremo 3' (terminador de la traduccion y/o transcripcion). Pueden incluirse secuencias adicionales tales como una region que codifica un peptido senal. El polinucleotido que codifica el polipeptido de interes puede ser homologo o heterologo a cualquiera de las otras secuencias reguladoras en el casete de expresion. Secuencias que van a expresarse junto con el polipeptido de interes, tales como una region codificante del peptido senal, normalmente se localizan adyacentes al polinucleotido que codifica la proteina que va a expresarse y estan puestas en el marco de lectura apropiado. El marco de lectura abierto constituido por el polinucleotido que codifica la proteina que va a expresarse unicamente o junto con cualquier otra secuencia que va a expresarse (por ejemplo, el peptido senal), se pone sometido al control de un promotor de manera que se producen la transcripcion y la traduccion en el sujeto al que se administra la composicion.
Promotores adecuados para la expresion de polinucleotidos en un amplio intervalo de sistemas de huesped se conocen bien en la tecnica. Promotores adecuados para la expresion de polinucleotidos en mamiferos incluyen aquellos que funcionan constitutivamente, ubicuamente o son especificos de tejido. Ejemplos de promotores no especificos de tejido incluyen promotores de origen virico. Ejemplos de promotores viricos incluyen promotor del virus del tumor mamario de raton (MMTV), promotor de la repeticion terminal larga del virus de la inmunodeficiencia humana (LTR del VIH), virus de Moloney, virus de la leucosis aviar (ALV), promotor/potenciador temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), virus del sarcoma de Rous (RSV), promotores de virus adeno-asociados (AAV); promotores adenoviricos y promotores del virus de Epstein-Barr (EBV). La compatibilidad de promotores viricos con ciertos polipeptidos es una consideracion, ya que su combinacion puede afectar a los niveles de expresion. Es posible usar promotores/potenciadores sinteticos para optimizar la expresion (vease, por ejemplo, la publicacion de patente de EE.UU. 2004/0171573).
Un ejemplo de un promotor especifico de tejido es el promotor de desmina, que conduce la expresion en celulas de musculo (Li et al. 1989, Gene 78:243; Li y Paulin 1991, J. Biol. Chem. 266:6562 y Li y Paulin 1993, J. Biol. Chem. 268:10403). Otros ejemplos incluyen promotores artificiales tales como un promotor especifico de musculo sintetico y un promotor quimerico especifico de musculo/del CMV (Li et al. 1999, Nat. Biotechnol. 17:241-245; Hagstrom et al. 2000, Blood 95:2536-2542).
Vectores utiles se describen en numerosas publicaciones, especificamente el documento WO 94/21797 y Hartikka et al. 1996, Human Gene Therapy 7:1205.
Como se observa anteriormente, el polinucleotido de interes, junto con cualquier secuencia reguladora necesaria, puede entregarse desnudo, por ejemplo, bien solo o bien como parte de un plasmido, o puede entregarse en un vector virico o bacteriano o bacteriano.
Si se usa un vector de tipo plasmido, o un vector bacteriano o virico, puede ser deseable que el vector sea incapaz de duplicarse o integrarse sustancialmente en el sujeto. Tales vectores incluyen aquellos cuyas secuencias estan libres de regiones de identidad sustancial con el genoma del sujeto, como para minimizar el riesgo de recombinacion huesped-vector. Una forma de hacer esto es usar promotores no derivados del genoma del receptor para conducir la expresion del polipeptido de interes. Por ejemplo, si el receptor es un mamifero, el promotor es preferentemente no derivado de mamifero, aunque debe poder ser capaz de funcionar en celulas de mamifero, por ejemplo, un promotor virico.
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Vectores viricos que pueden usarse para entregar el polinucleotido incluyen, por ejemplo, adenovirus y poxvirus. Vectores bacterianos utiles incluyen, por ejemplo, Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae, Lactobacillus, Bacille bilie de Calmette-Guerin (BCG) y Streptococcus.
Un ejemplo de un vector de adenovirus, ademas de un procedimiento de construccion de un vector de adenovirus capaz de expresar un polinucleotido, se describe en la patente de EE.UU. N.° 4.920.209. Los vectores de poxvirus incluyen virus de la variolovacuna y de la viruela del canario, descritos en la patente de EE.UU. N.° 4.722.848 y la patente de EE.UU. N.° 5.364.773, respectivamente. Tambien vease, por ejemplo, Tartaglia et al. 1992, Virology 188:217 para una descripcion de un vector de virus de la variolovacuna y Taylor et al. 1995, Vaccine 13:539 para una referencia de una viruela de canario. Vectores de poxvirus capaces de expresar un polinucleotido de interes pueden obtenerse por recombinacion homologa como se describe en Kieny et al. 1984, Nature 312:163, de manera que el polinucleotido se inserta en el genoma virico en condiciones apropiadas para la expresion en celulas de mamifero.
Con respecto a vectores bacterianos, se conocen cepas mutantes de Vibrio cholerae no toxicogenicas que son utiles para expresar un polinucleotido extrano en un huesped. Mekalanos et al. 1983, Nature 306:551 y la patente de EE.UU. N.° 4.882.278 describen cepas que tienen una cantidad sustancial de la secuencia codificante de cada uno de los dos alelos ctxA delecionados de manera que se produzca toxina de cholerae no funcional. El documento WO 92/11354 describe una cepa en la que el locus irgA se inactiva por mutacion; esta mutacion puede combinarse en una unica cepa con mutaciones ctxA. El documento WO 94/01533 describe un mutante de delecion que carece de secuencias de ADN de ctxA y attRS1 funcionales. Estas cepas mutantes estan geneticamente manipuladas para expresar proteinas heterologas, como se describe en el documento WO 94/19482.
Cepas atenuadas de Salmonella typhimurium, geneticamente manipuladas para la expresion recombinante de proteinas heterologas, se describen en Nakayama et al. 1988, Bio/Technology 6:693 y el documento WO 92/11361.
Otras cepas bacterianas que pueden usarse como vectores para expresar una proteina extrana en un sujeto se describen para Shigella flexneri en High et al. 1992, EMBO 11:1991 y Sizemore et al. 1995, Science 270:299; para Streptococcus gordonii en Medaglini et al. 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:6868; y para Bacille Calmette Guerin en Flynn 1994, Cell. Mol. Biol. 40 (suppl. I):31, documentos WO 88/06626, WO 90/00594, WO 91/13157, WO 92/01796 y WO 92/21376.
En vectores bacterianos, el polinucleotido de interes puede insertarse en el genoma bacteriano y seguir en un estado libre como parte de un plasmido.
Liposomas
Los liposomas son membranas bicapa de lipidos completamente cerradas que contienen un volumen acuoso atrapado. Los liposomas pueden ser vesiculas unilaminares (que poseen una unica membrana bicapa) o vesiculas multilaminares caracterizadas por bicapas multimembrana, cada bicapa puede o puede no separarse de la siguiente por una fase acuosa. Una discusion general de liposomas puede encontrarse en Gregoriadis G. Immunol. Today, 11:89-97, 1990; y Frezard, F., Braz. J. Med. Bio. Res., 32:181 -189, 1999. Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones, el termino “liposomas” pretende englobar todas las estructuras vesiculares tales como se han descrito anteriormente, que incluyen, sin limitacion, aquellas descritas en la tecnica como “niosomas”, “transfersomas” y “virosomas”.
Cualquier liposoma puede usarse en la presente invencion, que incluye liposomas hechos de lipidos arqueobacterianos. Puede usarse cualquier lipido anfipatico con al menos una cadena de acido graso que contenga al menos 4 carbonos, normalmente aproximadamente 4 a 28 carbonos de longitud. La cadena de acido graso puede contener cualquier numero de enlaces saturados y/o insaturados. Los lipidos anfipaticos contemplados pueden ser fosfolipidos, esfingolipidos, esfingomielina, cerebrosidos, gangliosidos. Liposomas particularmente utiles usan fosfolipidos y colesterol no esterificado en la formulacion liposomal. El colesterol se usa para estabilizar los liposomas y cualquier otro compuesto que estabilice los liposomas puede sustituir al colesterol. Otros compuestos estabilizadores de liposomas se conocen por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, los fosfolipidos saturados producen liposomas con mayores temperaturas de transicion que indican elevada estabilidad.
Los fosfolipidos que se usan preferentemente en la preparacion de los liposomas son aquellos con al menos un grupo de cabeza seleccionado del grupo que consiste en fosfoglicerol, fosfoetanolamina, fosfoserina, fosfocolina y fosfoinositol. Son mas preferidos los liposomas que comprenden lipidos que son aproximadamente el 94-100 % de fosfatidilcolina. Tales lipidos estan disponibles comercialmente en la lecitina Phospholipon® 90 G (Phospholipid GmBH, Alemania) o en la lecitina S100 (Lipoid GmBH, Alemania). Otros fosfolipidos preferidos incluyen lipidos cationicos tales como 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano (DOTAP) y cloruro de 1-[2-(oleoiloxi)etil]-2-oleil-3-(2- hidroxietil)imidazolinio (DOTIM).
Cuando tambien se usa colesterol no esterificado en la formulacion de liposomas, el colesterol se usa normalmente en una cantidad equivalente a aproximadamente el 10 % de la cantidad de fosfolipido. Si se usa un compuesto
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distinto de colesterol para estabilizar los liposomas, un experto en la tecnica puede determinar facilmente la cantidad necesaria en la composicion.
Las composiciones de liposoma pueden obtenerse, por ejemplo, usando lipidos naturales, lipidos sinteticos, esfingolipidos, lipidos de eter, esteroles, cardiolipina, lipidos cationicos y lipidos modificados con poli(etilenglicol) y otros polimeros. Los lipidos sinteticos pueden incluir los siguientes constituyentes de acidos grasos: lauroilo, miristoilo, palmitoilo, estearoilo, araquidoilo, oleoilo, linoleoilo, erucoilo, o combinaciones de estos acidos grasos.
Vehiculos
El vehiculo de la composicion comprende una fase continua de una sustancia hidrofoba, preferentemente una sustancia hidrofoba liquida. La fase continua puede ser una sustancia hidrofoba esencialmente pura o una mezcla de sustancias hidrofobas. Ademas, el vehiculo puede ser una emulsion de agua en una sustancia hidrofoba o una emulsion de agua en una mezcla de sustancias hidrofobas, siempre que la sustancia hidrofoba constituya la fase continua. Ademas, en otra realizacion, el vehiculo puede funcionar como adyuvante.
Sustancias hidrofobas que son utiles en las composiciones como se describen en el presente documento son aquellas que son farmaceuticamente y/o inmunologicamente aceptables. El vehiculo es preferentemente un liquido, pero ciertas sustancias hidrofobas que no son liquidas a temperatura atmosferica pueden licuarse, por ejemplo, calentando y tambien son utiles en la presente invencion. En una realizacion, el vehiculo hidrofobo puede ser una emulsion de PBS/FIA.
Aceite o emulsiones de agua en aceite son vehiculos particularmente adecuados para su uso en la presente invencion. Los aceites deben ser farmaceuticamente y/o inmunologicamente aceptables. Ejemplos preferidos de aceites son aceite mineral tal (especialmente aceite mineral ligero o de baja viscosidad), aceite vegetal (por ejemplo, aceite de soja), aceite de nuez (por ejemplo, aceite de cacahuete). En algunas realizaciones se prefiere un aceite mineral de baja viscosidad tal como Drakeol® 6VR. En otra realizacion, el aceite es un oleato de manida en solucion de aceite mineral, comercialmente disponible como Montanide ISA 51. Tambien pueden usarse grasas animales y materiales polimericos hidrofobos artificiales, particularmente aquellos que son liquidos a temperatura atmosferica o que pueden licuarse relativamente facilmente. Pueden usarse mezclas de diferentes sustancias hidrofobas, tales como mezclas que incluyen uno o mas aceites, grasas animales o materiales polimericos hidrofobos artificiales diferentes.
Componentes adicionales
La composicion puede comprender ademas uno o mas componentes adicionales que pueden complementar o potenciar la funcion del polipeptido que va a expresarse en el sujeto. Por ejemplo, si el polipeptido codificado es un antigeno de vacuna, puede estar presente un componente adicional, tal como un adyuvante. El termino “adyuvante” se refiere a un compuesto o mezcla que potencia la respuesta inmunitaria a un antigeno. Un adyuvante puede servir como un deposito de tejido que libera lentamente el antigeno y tambien como un activador del sistema linfoide que no potencia especificamente la respuesta inmunitaria (Hood et al, Immunology, 2d ed., Benjamin/Cummings: Menlo Park, C.A., 1984; vease Wood y Williams, en: Nicholson, Webster y May (eds.), Textbook of Influenza, Capitulo 23, paginas 317-323). Frecuentemente, una exposicion primaria a un antigeno solo, en ausencia de un adyuvante, dejara de provocar una respuesta inmunitaria humoral. Debe observarse que el polinucleotido de interes que va a entregarse al sujeto puede por si mismo funcionar como un adyuvante, o puede codificar un polipeptido que constituye un adyuvante (por ejemplo, IL-12, IFN-gamma, o factor estimulante de colonias de granulocitos- macrofagos (“GmCsF”)).
En algunas realizaciones, adyuvantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, alumbre, otros compuestos de aluminio, Bacillus de Calmette y Guerin (BCG), TiterMax®, Ribi®, adyuvante incompleto de Freund (IFA), saponina, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles pluronicos, polianiones, peptidos, Corynebacterium parvum, QS-21 y adyuvante completo de Freund (FCA), adyuvantes de la familia de los agonistas de TLR tales como CpG, polyIC, falgelina, lipopeptidos, peptidoglicanos, imidazoquinolinas, ARN monocatenario, lipopolisacaridos (LPS), proteinas de choque termico (HSP) y ceramidas y derivados tales como alfa Gal-cer. Adyuvantes adecuados tambien incluyen citocinas o quimiocinas en sus formas codificantes de polipeptido o de ADN tales como, pero no limitadas a, GM-CSF, TNF-alfa, IFN-gamma, IL-2, IL-12, IL-15, IL-21.
La cantidad de adyuvante usada depende de la cantidad de antigeno y del tipo de adyuvante. Un experto en la tecnica puede determinar facilmente la cantidad de adyuvante necesaria en una aplicacion particular.
Se conocen en la tecnica una amplia gama de adyuvantes, excipientes, etc. farmaceuticamente aceptables y pueden usarse en las composiciones de la invencion: vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985) y The United States Pharmacopoeia: The National Formulary (USP 24 NF19) publicada en 1999.
Si un componente adicional en la composicion es un polipeptido, en su lugar puede proporcionarse un polinucleotido
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que codifica el polipeptido adicional, del mismo modo que para el polinucleotido que codifica el polipeptido de interes primario. Tales polipeptidos podrian expresarse a partir de los mismos vectores de expresion o de vectores de expresion distintos, o podrian expresarse en forma de una proteina de fusion.
Formulacion de composiciones
Los procedimientos de preparacion de liposomas son muy conocidos en la tecnica: vease, por ejemplo, Gregoriadis (1990) y Frezard (1999), ambos citados previamente. Cualquier procedimiento adecuado para preparar liposomas puede usarse en la practica de la invencion. Los liposomas normalmente se preparan hidratando los componentes liposomales que formaran la bicapa de lipido (por ejemplo, fosfolipidos y colesterol) con una solucion acuosa, que puede ser agua pura o cualquier otra solucion fisiologicamente compatible tal como solucion salina, por ejemplo, solucion salina tamponada con fosfato (PBS).
En una realizacion, un componente de liposoma o mezcla de componentes de liposoma, tal como un fosfolipido (por ejemplo, Phospholipon® 90G) y colesterol, puede solubilizarse en un disolvente organico, tal como una mezcla de cloroformo y metanol, seguido de filtrar (por ejemplo, un filtro de 0,2 pm de PTFE) y secar, por ejemplo, mediante evaporacion rotatoria, para eliminar los disolventes.
La hidratacion de la mezcla de lipidos resultante puede efectuarse, por ejemplo, inyectando la mezcla de lipido dentro de una solucion acuosa o sonicando la mezcla de lipido y una solucion acuosa. Durante la formacion de liposomas, los componentes de liposoma forman bicapas individuales (unilaminares) o bicapas multiples (multilaminares) que rodean un volumen de la solucion acuosa con la que se hidratan los componentes del liposoma.
En algunas realizaciones, los liposomas se hidratan entonces, tal como por secado por congelacion o liofilizacion y posteriormente se reconstituyen con una solucion acuosa.
Los liposomas se combinan con el vehiculo que comprende una fase hidrofoba continua. Esto puede hacerse en una variedad de formas.
Si el vehiculo esta esencialmente libre de agua y esta compuesto unicamente de una sustancia hidrofoba o una mezcla de sustancias hidrofobas (por ejemplo, uso de un vehiculo de aceite mineral al 100 %), los liposomas pueden simplemente mezclarse con la sustancia hidrofoba, o si hay multiples sustancias hidrofobas, mezclarse con una cualquiera o una combinacion de ellas.
Si en lugar de comprender el vehiculo una fase continua de una sustancia hidrofoba contiene una fase acuosa discontinua, el vehiculo normalmente tomara la forma de una emulsion de la fase acuosa en la fase hidrofoba, tal como una emulsion de agua en aceite. Tales composiciones pueden contener un emulsionante para estabilizar la emulsion y para promover una distribucion uniforme de los liposomas. A este respecto, los emulsionantes pueden ser utiles aunque se use vehiculo libre de agua, con el fin de promover una distribucion uniforme de los liposomas en el vehiculo. Emulsionantes tipicos incluyen oleato de manida (Arlacel™ A), lecitina, Tween™ 80 y Spans™ 20, 80, 83 y 85. Normalmente, la relacion de peso con respecto a volumen (peso/volumen) de la sustancia hidrofoba con respecto al emulsionante esta en el intervalo de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 15:1, prefiriendose con una relacion de aproximadamente 10:1.
Los liposomas pueden anadirse a la emulsion acabada, o pueden estar presentes tanto en la fase acuosa como en la fase hidrofoba antes de la emulsion.
El polinucleotido que va a expresarse puede introducirse en diversas etapas diferentes del proceso de formulacion. En esta seccion, el termino “polinucleotido” incluye el polinucleotido en forma desnuda que se incluye en un plasmido tal como un plasmido de expresion, o en un vector vivo tal como una bacteria o virus.
Mas de un polinucleotido puede incorporarse en la composicion. Por ejemplo, dos o mas polinucleotidos que codifican diferentes proteinas pueden incorporarse en la composicion, o puede estar presente un polinucleotido que codifica una proteina, ademas de un polinucleotido que codifica un ARN antisentido o ARN interferente. Las proteinas pueden expresarse como el producto de fusion de dos polinucleotidos diferentes. Mas de un polinucleotido puede estar sometido al control de los mismos elementos reguladores, por ejemplo, dos o mas polinucleotidos sometidos al control transcripcional de un unico promotor.
En algunas realizaciones, el polinucleotido esta presente en la solucion acuosa usada para hidratar los componentes que se usan para formar las bicapas de lipido de los liposomas (por ejemplo, fosfolipido(s) y colesterol). En este caso, el polinucleotido se encapsulara en el liposoma, presente en su interior acuoso. Si los liposomas resultantes no se lavan o secan, de forma que haya solucion acuosa residual presente que en ultimo lugar se mezcla con el vehiculo que comprende una fase continua de una sustancia hidrofoba, es posible que el polinucleotido adicional pueda estar presente fuera de los liposomas en el producto final. En una tecnica relacionada, el polinucleotido puede mezclarse con los componentes usados para formar las bicapas de lipido de los liposomas, antes de la hidratacion con la solucion acuosa.
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En un enfoque alternative), el polinucleotido puede en su lugar mezclarse con el vehiculo que comprende una fase continua de una sustancia hidrofoba, antes, durante o despues de combinar el vehiculo con los liposomas. Si el vehiculo es una emulsion, el polinucleotido puede mezclarse con cualquiera o ambos de la fase acuosa o fase hidrofoba antes de la emulsion. Alternativamente, el polinucleotido puede mezclarse con el vehiculo despues de la emulsion.
La tecnica de combinar el polinucleotido con el vehiculo puede usarse junto con la encapsulacion del polinucleotido en los liposomas como se ha descrito anteriormente, de forma que el polinucleotido este presente tanto dentro de los liposomas como en el vehiculo que comprende una fase continua de una sustancia hidrofoba.
Generalmente, la composicion puede comprender aproximadamente 0,1 a 5 mg de polinucleotido por ml de la composicion y aproximadamente 1 mg a 300 mg de liposomas por ml de la composicion.
Si la composicion contiene uno o mas componentes adicionales (por ejemplo, un adyuvante), el (los) componente(s) adicional(es) puede(n) incorporarse en la composicion junto con el polinucleotido en la misma etapa de procesamiento, o por separado, en una etapa de procesamiento diferente. Por ejemplo, el polinucleotido y el componente adicional pueden ambos estar presentes en la solucion acuosa usada para hidratar los componentes que forman la bicapa de lipido, de forma que tanto el polinucleotido como el componente adicional lleguen a encapsularse en los liposomas. Alternativamente, el polinucleotido puede encapsularse en los liposomas y el componente adicional mezclarse con el vehiculo que comprende una fase continua de una sustancia hidrofoba. Se apreciara que son posibles muchas de tales combinaciones.
En algunas realizaciones, el polinucleotido y el componente adicional pueden estar en forma de un complejo, en el que estan en contacto intimo, al menos antes de la incorporacion dentro de la composicion. La complejacion puede implicar pero no necesita necesariamente implicar un enlace quimico, tal como enlace covalente.
Las composiciones como se describen en el presente documento pueden formularse en una forma que es adecuada para la administracion oral, nasal, rectal o parenteral. La administracion parenteral incluye modos de administracion intravenosa, intraperitoneal, intradermica, subcutanea, intramuscular, transepitelial, intrapulmonar, intratecal y topica. Las vias preferidas son intramuscular, subcutanea e intradermica para lograr un efecto de deposito. En la practica, se logra un efecto de deposito cuando el agente terapeutico sigue en el sitio de inyeccion durante mas de aproximadamente una hora.
El sitio de inyeccion puede estar, por ejemplo, en cualquier sitio proximo a, o directamente dentro de, un ganglio linfatico. Alternativamente, el sitio de inyeccion puede estar directamente dentro de un bazo, un tumor u otro tejido enfermo. El volumen que puede inyectarse esta dentro del criterio profesional del profesional clinico. El volumen depende del dispositivo de inyeccion usado y del sitio de inyeccion. Cuando la inyeccion es por via intramuscular o subcutanea, el volumen de inyeccion puede ser aproximadamente 2 ml. Cuando se usa inyeccion sin aguja, el volumen puede ser de tan solo 0,05 ml. El volumen puede aumentarse inyectando multiples sitios.
Kits y reactivos
La presente invencion se proporciona opcionalmente a un usuario como un kit. Por ejemplo, un kit de la invencion contiene una o mas de las composiciones de la invencion. El kit puede comprender ademas uno o mas reactivos adicionales, material de envasado, recipientes para contener los componentes del kit y un conjunto de instrucciones o manual de usuario detallando procedimientos preferidos de uso de los componentes del kit para un fin deseado.
Usos
La invencion encuentra aplicacion en cualquier caso en el que se desee la entrega de un polinucleotido a un sujeto. Muchas de tales aplicaciones estaran en el tratamiento o la prevencion de enfermedad. Aplicaciones representativas de la invencion incluyen tratamiento y prevencion del cancer, terapia genica, terapia auxiliar, tratamiento y prevencion de enfermedades infecciosas, tratamiento y prevencion de alergias, tratamiento y prevencion de enfermedades autoinmunitarias, tratamiento de enfermedades degenerativas de las neuronas y tratamiento de aterosclerosis.
La prevencion o el tratamiento de enfermedad incluye obtener resultados beneficiosos o deseados, incluyendo resultados clinicos. Resultados clinicos beneficiosos o deseados pueden incluir, pero no se limitan a, alivio o mejora de uno o mas sintomas o afecciones, reduccion del grado de enfermedad, estabilizacion del estado de enfermedad, prevencion del desarrollo de la enfermedad, prevencion de la diseminacion de la enfermedad, retraso o ralentizamiento de la progresion de la enfermedad, retraso o ralentizamiento de la aparicion de la enfermedad, conferir inmunidad protectora contra un agente causante de enfermedad y mejora o paliacion del estado de enfermedad. La prevencion o el tratamiento tambien puede significar prolongar la supervivencia de un paciente mas alla de la esperada en ausencia de tratamiento y tambien puede significar inhibir la progresion de la enfermedad temporalmente, aunque mas preferentemente, implica impedir la aparicion de enfermedad tal como impidiendo la
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infeccion en un sujeto.
El experto puede determinar pautas de tratamiento, vias de administracion, dosificaciones, etc., adecuadas para cualquier aplicacion particular con el fin de lograr el resultado deseado. Factores que pueden tenerse en cuenta incluyen, por ejemplo: la naturaleza de un polipeptido que va a expresarse; el estado de enfermedad que va a impedirse o tratarse; la edad, condicion fisica, peso corporal, sexo y dieta del sujeto; y otros factores clinicos.
La invencion se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1
Con el fin de demostrar la capacidad para potenciar la expresion de una secuencia de nucleotidos codificante de proteinas in vivo usando una formulacion que comprende liposomas y un vehiculo hidrofobo continuo, se selecciono un plasmido de expresion modelo manipulado con la secuencia codificante completa de IL-12. El plasmido de IL-12 se formulo en el liposoma primero y la preparacion de plasmido de IL-12/liposoma resultante se emulsiono en una emulsion de agua en aceite modelo con el vehiculo hidrofobo continuo que consiste en aceite mineral. Se determino la expresion in vivo examinando el potencial de expresion de IL-12 en celulas aisladas de ganglio linfatico en la proximidad del sitio de inyeccion.
Se obtuvieron ratones C57BL/6 hembra, libres de patogenos, de 6-8 semanas de edad, de Charles River Laboratories (St Constant, Quebec, Canada) y se alojaron segun la directriz institucional con agua y comida a voluntad, con circulacion de aire controlada con filtro.
Se adquirio plasmido de IL-12 murina, pORF-mIL-12 de InvivoGen, San Diego, California, EE.UU. El plasmido, suministrado como liofilizado en bacterias GT100 de E. coli transformadas por pORF-mIL-12, se reconstituyo en medio LB y se extendio sobre una placa de ampicilina-agar LB y se incubo durante la noche a 37 °C. Se cultivaron bacterias a partir de una unica colonia en medio TB complementado con uso de ampicilina. Se purifico ADN plasmidico de cultivos bacterianos a gran escala usando kits de Maxi- o Mega-prep libres de endotoxinas (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada) para garantizar la eliminacion completa de LPS.
Se prepararon liposomas multilaminares hidratando una mezcla 10:1 (PESO/PESO) de dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) y colesterol usando solucion salina tamponada con fosfato (PBS) que contenia plasmido de IL-12 a una concentracion final de 1 miligramo/mililitro. Los liposomas se extrudieron luego a traves de una membrana de policarbonato de 200 nm usando una prensa extrusora manual (Avanti lipids, Alabaster, Al, EE.UU.). La preparacion de liposoma final se emulsiono posteriormente en adyuvante incompleto de Freund (Sigma, Oakville, Ontario, Canada), un vehiculo de aceite basado en aceite mineral, mezclando un volumen igual de liposomas que contienen el plasmido de IL-12 y adyuvante incompleto de Freund.
Tres grupos de ratones que contenian tres ratones cada uno (n=3) se inyectaron por via subcutanea en el flanco derecho por encima de la base de la cola del siguiente modo: el Grupo 1 se inyecto con solucion salina tamponada con fosfato, el Grupo 2 con 50 microgramos de plasmido de IL-12 en PBS y el Grupo 3 con 50 microgramos de plasmido de IL-12 formulado como se ha descrito anteriormente en un liposoma/vehiculo hidrofobo continuo. Todas las inyecciones fueron de 100 microlitros de volumen. Se recogieron los ganglios linfaticos drenantes de todos los ratones 8 dias despues de la inyeccion. Los ganglios linfaticos se diseccionaron y se cultivaron suspensiones de celulas individuales in vitro a una concentracion de 2 x 106 celulas/ml en medio RPMI complementado con 10 % de FBS, penicilina/estreptomicina, 2-^-mercaptoetanol y L-glutamina en placas de 6 pocillos durante 48 h. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular y se guardaron congelados en alicuotas hasta que se usaron para la cuantificacion de la proteina IL-12.
Se determino la eficacia de la expresion genica de IL-12 en los ganglios linfaticos cuantificando los niveles de proteina IL-12 secretada en los sobrenadantes de cultivo celular. Se realizo la cuantificacion de la proteina IL-12 por enzimoinmunoanalisis de adsorcion (ELISA), usando un kit de ELISA especifico de IL-12 comercial (Peptrotech, Rocky Hill, NJ, EE.UU.). Brevemente, se recubrio anticuerpo de captura anti-IL-12 durante la noche sobre placas de ELISA y se anadieron muestras e IL-12 patron. Despues de lavados minuciosos, se anadio anticuerpo de deteccion anti-IL-12 biotinilado y se incubo durante 2 h a temperatura ambiente y se lavo. Tras la incubacion con conjugados de avidina-HRP y lavados, se uso sustrato liquido ABTS (Sigma, St Louis, MO) para el desarrollo de color. Las absorbancias se leyeron a 405 nm usando un lector de placas de microtitulacion y las concentraciones de IL-12 se extrapolaron usando una curva patron que se genero usando patrones de IL-12 suministrados en el kit.
Los niveles de IL-12 secretada por las celulas de los ganglios linfaticos aisladas de los Grupos 1-3 se muestran en la figura 1. Las celulas de los ganglios linfaticos aisladas de ratones inyectados con PBS (Grupo 1) no secretaron proteina IL-12 detectable en los sobrenadantes de cultivo. Se secretaron niveles bajos de proteina IL-12 por las celulas de los ganglios linfaticos aisladas de ratones inyectados con plasmido de IL-12 en PBS. Sin embargo, celulas de los ganglios linfaticos aisladas de ratones inyectados con el plasmido de IL-12 en una formulacion que
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comprende liposomas en un vehiculo hidrofobo continuo secretaron un nivel significativamente mayor de IL-12, sugiriendo una entrega mejorada de las secuencias de nucleotidos codificantes de proteina in vivo y produciendo expresion potenciada de proteinas.
Ejemplo 2
Se obtuvieron ratones C57BL/6 hembra libres de patogenos, de 6-8 semanas de edad, de Charles River Laboratories (St Constant, Quebec, Canada) y se alojaron segun la directriz institucional con agua y comida a voluntad, con circulacion de aire controlada con filtro.
Se adquirio plasmido de IL-12 murina, pORF-mIL-12 de InvivoGen, San Diego, California, EE.UU. El plasmido, suministrado como liofilizado en bacterias GT100 de E. coli transformadas por pORF-mIL-12, se reconstituyo en medio LB y se extendio sobre una placa de ampicilina-agar LB y se incubo durante la noche a 37 °C. Se cultivaron bacterias a partir de una unica colonia en medio TB complementado con uso de ampicilina. Se purifico ADN plasmidico de cultivos bacterianos a gran escala usando kits de Maxi- o Mega-prep libres de endotoxinas (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada) para garantizar la eliminacion completa de LPS.
Se prepararon liposomas multilaminares hidratando una mezcla 10:1 (PESO/PESO) de mezcla derivada de soja purificada de fosfolipidos (fosfolipido S100, proporcionado por Lipoid GmbH) y colesterol usando solucion salina tamponada con fosfato (PBS) que contenia el plasmido de IL-12 a una concentracion final de 0,8 miligramos/mililitro. Luego los liposomas se extrudieron a traves de una membrana de policarbonato de 200 nm usando una prensa extrusora manual (Avanti lipids, Alabaster, Al, EE.UU.). La preparacion de liposoma final se emulsiono posteriormente en adyuvante incompleto de Freund (Sigma, Oakville, Ontario, Canada), un vehiculo de aceite basado en aceite mineral, mezclando un volumen igual de liposomas que contienen el plasmido de IL-12 y de adyuvante incompleto de Freund. El volumen inyectado final para cada raton fue 100 microlitros.
Seis grupos de ratones que contenian cinco ratones cada uno (n=5) se inyectaron por via subcutanea en el flanco derecho por encima de la base de la cola del siguiente modo: los ratones del Grupo 1 se inyectaron con 40 microgramos de plasmido de IL-12 en PBS, los ratones del Grupo 2 con 40 microgramos de plasmido de IL-12 formulado como se ha descrito anteriormente en un liposoma/vehiculo hidrofobo continuo, los ratones del Grupo 3 con 40 microgramos de plasmido de IL-12 formulado en un vehiculo hidrofobo continuo (emulsion de agua en aceite de adyuvante incompleto de Freund) sin liposomas, los ratones del Grupo 4 con 40 microgramos de plasmido de IL- 12 formulado en liposomas como se ha descrito anteriormente pero sin un vehiculo hidrofobo continuo, los ratones del Grupo 5 con una formulacion de control que consiste en liposoma/vehiculo hidrofobo continuo sin plasmido de IL- 12 y los ratones del Grupo 6 permanecieron sin tratar. Todas las inyecciones fueron de 100 microlitros de volumen. Se recogieron los ganglios linfaticos drenantes de todos los ratones 8 dias despues de la inyeccion. Los ganglios linfaticos se diseccionaron y las suspensiones de celulas individuales se cultivaron in vitro a una concentracion de 2 x 106 celulas/ml en medio RPMI complementado con 10 % de FBS, penicilina/estreptomicina, 2-^-mercaptoetanol y L-glutamina en placas de 6 pocillos durante 48 h. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular y se guardaron congelados en alicuotas hasta que se usaron para la cuantificacion de la proteina IL-12.
Se determino la eficacia de la expresion genica de IL-12 en los ganglios linfaticos cuantificando los niveles de proteina IL-12 secretada en los sobrenadantes de cultivo celular. Se realizo la cuantificacion de la proteina IL-12 por enzimoinmunoanalisis de adsorcion (ELISA), usando un kit de ELISA especifico de IL-12 comercial (Peptrotech, Rocky Hill, NJ, EE.UU.). Brevemente, se recubrio anticuerpo de captura anti-IL-12 durante la noche sobre placas de ELISA y se anadieron muestras e IL-12 patron. Despues de lavados minuciosos, se anadio anticuerpo de deteccion anti-IL-12 biotinilado y se incubo durante 2 h a temperatura ambiente y se lavo. Tras la incubacion con conjugados de avidina-HRP y lavados, se uso sustrato liquido ABTS (Sigma, St Louis, MO) para el desarrollo de color. Las absorbancias se leyeron a 405 nm usando un lector de placas de microtitulacion y las concentraciones de IL-12 se extrapolaron usando una curva patron que se genero usando patrones de IL-12 suministrados en el kit.
Los niveles de IL-12 secretada por las celulas de los ganglios linfaticos aisladas de los Grupos 1-6 se muestran en la figura 2. Las celulas de los ganglios linfaticos aisladas de ratones inyectados con el plasmido de IL-12 en PBS (Grupo 1) no secretaron proteina IL-12 detectable en los sobrenadantes de cultivo. Sin embargo, las celulas de los ganglios linfaticos aisladas de ratones inyectados con el plasmido de IL-12 en una formulacion que comprende liposomas en un vehiculo hidrofobo continuo (Grupo 2) secretaron un nivel considerablemente mayor de IL-12. Las celulas de los ganglios linfaticos aisladas de ratones del Grupo 3, Grupo 5 y Grupo 6 secretaron niveles significativamente mas bajos de proteina IL-12 y las celulas de los ganglios linfaticos aisladas de ratones del Grupo 4 no secretaron proteina IL-12 detectable en los sobrenadantes de cultivo. En este experimento, se logro expresion de proteinas IL-12 superior usando una formulacion de liposoma/vehiculo hidrofobo con respecto a las formulaciones que carecen de cualquiera o ambos de los liposomas y el vehiculo hidrofobo continuo.
Ejemplo 3
Con el fin de demostrar la capacidad para potenciar la expresion de una secuencia de nucleotidos codificante de proteinas in vivo usando una formulacion que comprende liposomas y un vehiculo hidrofobo continuo, se selecciono
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un plasmido de expresion modelo manipulado con la secuencia codificante completa de la proteina verde fluorescente (GFP). El plasmido de GFP se formulo en el liposoma primero y la preparacion de plasmido de GFP/liposoma resultante se emulsiono en una emulsion de agua en aceite modelo con el vehiculo hidrofobo continuo que consiste en aceite mineral. Se determino la captacion y la expresion in vivo examinando el potencial de expresion de GFP en celulas aisladas de ganglio linfatico en la proximidad del sitio de inyeccion.
Se obtuvieron ratones C57BL/6 hembra libres de patogenos, de 6-8 semanas de edad, de Charles River Laboratories (St Constant, Quebec, Canada) y se alojaron segun la directriz institucional con agua y comida a voluntad, con circulacion de aire controlada con filtro.
Se adquirio plasmido de GFP sintetico, pMOD-GFPSh (nombre de catalogo, pmod-zgfpsh) de InvivoGen, San Diego, California, Ee.UU. El plasmido se transformo en la cepa XL1 de bacterias E. coli, se cultivo en medio LB y se extendio sobre una placa de ampicilina-agar LB y se incubo durante la noche a 37 °C. Se cultivaron bacterias a partir de una unica colonia en medio TB complementado con ampicilina. Se purifico ADN plasmidico de cultivos bacterianos a gran escala usando kits de Maxi- o Mega-prep libres de endotoxinas (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada) para garantizar la eliminacion completa de LPS.
Se prepararon liposomas multilaminares hidratando una mezcla 10:1 (PESO/PESO) de mezcla derivada de soja purificada de fosfolipidos (fosfolipido S100, proporcionado por Lipoid GmbH) y colesterol usando solucion salina tamponada con fosfato (PBS) que contenia el plasmido de GFP a una concentracion final de 0,8 miligramos/mililitro. Luego los liposomas se extrudieron a traves de una membrana de policarbonato de 200 nm usando una prensa extrusora manual (Avanti lipids, Alabaster, Al, EE.UU.). La preparacion de liposoma final se emulsiono posteriormente en adyuvante incompleto de Freund (Sigma, Oakville, Ontario, Canada), un vehiculo de aceite basado en aceite mineral, mezclando un volumen igual de liposomas que contienen el plasmido de GFP y adyuvante incompleto de Freund. El volumen inyectado final para cada raton fue 100 microlitros que entrego 40 microgramos de plasmido por dosis por raton.
Seis grupos de ratones que contenian cuatro ratones cada uno (n=4) se inyectaron por via subcutanea en el flanco derecho por encima de la base de la cola del siguiente modo: los ratones del Grupo 1 se inyectaron con 40 microgramos de plasmido de GFP en PBS, los ratones del Grupo 2 con 40 microgramos de plasmido de GFP formulado como se ha descrito anteriormente en un liposoma/vehiculo hidrofobo continuo, los ratones del Grupo 3 con 40 microgramos de plasmido de GFP formulado en un vehiculo hidrofobo continuo (emulsion de agua en aceite de adyuvante incompleto de Freund) sin liposomas, los ratones del Grupo 4 con 40 microgramos de plasmido de GFP formulado en liposomas como se ha descrito anteriormente, pero sin un vehiculo hidrofobo continuo, los ratones del Grupo 5 con una formulacion de control que consiste en liposoma/vehiculo hidrofobo continuo sin plasmido de GFP y los ratones del Grupo 6 permanecieron sin tratar. Todas las inyecciones fueron de 100 microlitros de volumen. Se recogieron los ganglios linfaticos drenantes de todos los ratones 8 dias despues de la inyeccion. Los ganglios linfaticos se diseccionaron y se prepararon suspensiones de celulas individuales. Se determino la eficacia de la expresion genica de GFP en los ganglios linfaticos por tincion de inmunofluorescencia de dos colores para detectar celulas GFP-positivas. Las celulas se tineron con anticuerpos CD11b y CD11c conjugados con ficoeritrina para identificar celulas presentadoras de antigenos en el canal FL2 junto con la deteccion de GFP en el canal FL1. Las muestras se ejecutaron a traves de un citometro de flujo (FACSCalibur, BD Biosciences, San Jose, CA). Se recogieron al menos 3 x 105 eventos para cada muestra para potenciar la exactitud de deteccion de las celulas GFP positivas.
Se muestran en la figura 3 el numero de celulas de los ganglios linfaticos aisladas del Grupo 1 al Grupo 6, que expresan GFP (y asi se identifican positivamente en el analisis de citometria de flujo). Los ganglios linfaticos aislados de ratones inyectados con el plasmido de GFP en PBS (Grupo 1) mostraron bajo nivel de celulas que expresan proteina GFP (<10). Sin embargo, los ganglios linfaticos aislados de ratones inyectados con plasmido de GFP en una formulacion que comprende liposomas en un vehiculo hidrofobo continuo (Grupo 2) mostraron un aumento de casi cuatro veces en las celulas gFp positivas. Ademas, las celulas de los ganglios linfaticos aisladas de ratones del Grupo 3 y Grupo 4 mostraron un numero significativamente mas bajo de celulas que expresan proteina GFP en comparacion con ratones en el Grupo 2. Entre los ratones en el Grupo 5 y el Grupo 6, se detecto fluorescencia minima, que se atribuyo a los eventos de auto-fluorescencia de fondo ya que estos ratones no recibieron inyecciones de plasmido de GFP. Ademas, la mayoria de las celulas GFP positivas se detectaron en la poblacion de celulas de los ganglios linfaticos CD11b/CD11c positivas. Los resultados de un re-analisis de las celulas de los ganglios linfaticos que se dirigen especificamente a celulas que son CD11b/CD11c y GFP doble positivas se correlacionan con el hallazgo presentado en la figura 3, con al menos un aumento de 4 veces en la expresion de GFP en celulas CD11b/CD11c positivas del Grupo 2 (figura 4). Este re-analisis tambien confirmo que puede detectarse fluorescencia no especifica en las celulas de los ganglios linfaticos de los Grupos 5 y 6 de control. Esta observacion confirmo la especificidad de la deteccion de celulas GFP positivas en este experimento. Asi, en el presente experimento, se logro captacion de plasmido de GFP y expresion de proteinas superior usando una formulacion de liposoma/vehiculo hidrofobo con respecto a formulaciones que carecen de cualquiera o ambos de los liposomas y el vehiculo hidrofobo continuo.
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Con el fin de demostrar la capacidad para inhibir la expresion de una secuencia de nucleotidos codificante de proteinas in vivo por ARNip contra la secuencia de nucleotidos codificante de proteinas dada, usando una formulacion que comprende liposomas y un vehiculo hidrofobo continuo, se selecciono un plasmido de expresion modelo manipulado con secuencia codificante completa de IL-12 y secuencia de ARNip para IL-12. El plasmido de IL-12 se formulo en el liposoma primero y la preparacion de plasmido de IL-12/liposoma resultante se emulsiono en una emulsion de agua en aceite modelo con el vehiculo hidrofobo continuo que consiste en aceite mineral. Un dia antes de la inyeccion del plasmido de IL-12, se inyecto ARNip bien en PBS o bien en liposoma/emulsion de agua en aceite con el vehiculo hidrofobo continuo que consiste en aceite mineral. Se determino la actividad de ARNip in vivo funcional examinando el potencial de expresion de IL-12 en celulas aisladas de ganglio linfatico en la proximidad del sitio de inyeccion.
Se obtuvieron ratones C57BL/6 hembra libres de patogenos, de 6-8 semanas de edad, de Charles River Laboratories (St Constant, Quebec, Canada) y se alojaron segun la directriz institucional con agua y comida a voluntad, con circulacion de aire controlada con filtro.
Se adquirio plasmido de IL-12 murina, pORF-mIL-12 de InvivoGen, San Diego, California, EE.UU. El plasmido, suministrado como liofilizado en la cepa GT100 de bacterias E. colitransformadas por pORF-mIL-12, se reconstituyo en medio LB y se extendio sobre una placa de ampicilina-agar LB y se incubo durante la noche a 37 °C. Se cultivaron bacterias a partir de una unica colonia en medio TB complementado con ampicilina. Se purifico ADN plasmidico de cultivos bacterianos a gran escala usando kits de Maxi- o Mega-prep libres de endotoxinas (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada) para garantizar la eliminacion completa de LPS.
Se adquirio ARNip contra IL-12 murina de Ambion Applied Biosystems, Austin, TX, EE.UU. Este producto liofilizado fue >95 % puro por HPLC analitica y contuvo menos de 10 UE de endotoxina por ensayo de LAL. Se disolvio ARNip en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) esteril antes de formular para inyeccion.
Se prepararon liposomas multilaminares hidratando una mezcla 10:1 (PESO/PESO) de dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) y colesterol usando solucion salina tamponada con fosfato (PBS) que contenia plasmido de IL-12 a una concentracion final de 1,6 miligramos/mililitro. Los liposomas se extrudieron luego a traves de una membrana de policarbonato de 200 nm usando una prensa extrusora manual (Avanti lipids, Alabaster, Al, EE.UU.). Por cada 500 microlitros de una suspension de liposoma/IL-12, se anadio un volumen igual de un vehiculo de aceite mineral (Montanide™ ISA 51, Seppic, Francia) para formar una emulsion de agua en aceite con la suspension de liposoma contenida en la fase acuosa de la emulsion y el aceite que forma la fase continua, que actua de vehiculo hidrofobo.
Con el fin de inducir niveles eficaces de expresion de IL-12, tres grupos de ratones que contenian tres ratones cada uno (n=3) se inyectaron todos por via subcutanea en el flanco derecho por encima de la base de la cola en el dia -0 con 40 microgramos de plasmido de IL-12 formulado como se ha descrito anteriormente en un liposoma/vehiculo hidrofobo continuo en 50 microlitros de volumen. Adicionalmente, en el dia menos 1, los ratones del Grupo 1 se inyectaron con vehiculo solo, los ratones del Grupo 2 se inyectaron con 40 microgramos de ARNip de IL-12 en PBS y los ratones del Grupo 3 se entregaron con 40 microgramos de ARNip de IL-12 en un liposoma/vehiculo hidrofobo continuo, similar a la formulacion usada para entregar el plasmido de IL-12. Todas las inyecciones se entregaron por via subcutanea en el flanco derecho por encima de la base de la cola en un volumen de 50 microlitros.
Se recogieron los ganglios linfaticos drenantes de todos los ratones inyectados y ganglios linfaticos correspondientes de tres ratones sin tratamiento previo (Grupo 4) 8 dias despues de la inyeccion. Se diseccionaron los ganglios linfaticos y las suspensiones de celulas individuales se cultivaron in vitro a una concentracion de 2 x 106 celulas/ml en medio RPMI complementado con 10 % de FBS, penicilina/estreptomicina, 2-^-mercaptoetanol y L-glutamina en placas de 24 pocillos durante 48 h. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular y se guardaron congelados en alicuotas hasta que se usaron para la cuantificacion de la proteina IL-12.
Se determino la eficacia del ARNip inyectado en diversas formulaciones midiendo el grado de inhibicion en la expresion de proteinas IL-12 inducida por el plasmido de IL-12 por celulas de los ganglios linfaticos. La cuantificacion de la proteina IL-12 en sobrenadante de cultivo celular se realizo por enzimoinmunoanalisis de adsorcion (ELISA), usando un kit de ELISA especifico de IL-12 comercial (Peptrotech, Rocky Hill, NJ, EE.UU.). Brevemente, se recubrio anticuerpo de captura anti-IL-12 durante la noche sobre placas de ELISA y se anadieron muestras e IL-12 patron. Despues de lavados minuciosos, se anadio anticuerpo de deteccion anti-IL-12 biotinilado y se incubo durante 2 h a temperatura ambiente y se lavo. Tras la incubacion con conjugados de avidina-HRP y lavados, se uso sustrato liquido ABTS (Sigma, St Louis, MO) para el desarrollo de color. Las absorbancias se leyeron a 405 nm usando un lector de placas de microtitulacion y las concentraciones de IL-12 se extrapolaron usando una curva patron que se genero usando patrones de IL-12 suministrados en el kit.
Los niveles de IL-12 secretada por las celulas de los ganglios linfaticos aisladas de los Grupos 1-4 se muestran en la figura 5. Las celulas de los ganglios linfaticos aisladas de ratones inyectados con plasmido de IL-12 solo, pero no ARNip contra IL-12 (Grupo 1), secretaron 270,4 picogramos por mililitro de IL-12 en los sobrenadantes de cultivo. En los ratones del Grupo 2, inyectados con ARNip de IL-12 en PBS, no se observo inhibicion significativa en la
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secrecion de protefna IL-12. En contraste, cuando el ARNip se entrego en liposoma/barrera hidrofoba continua, se observo una marcada disminucion en la IL-12 secretada, que fue tan baja como la observada con ratones sin tratamiento previo. Ademas, las celulas de los ganglios linfaticos de los ratones en el Grupo 3 secretaron significativamente menos IL-12 en comparacion con los ratones en el Grupo 2 que recibieron ARNip en PBS. Esto demostro una entrega mejorada de las secuencias de nucleotidos de ARNip in vivo cuando se inyectaron en un liposoma/vehiculo hidrofobo continuo que produjo mejor inhibicion de la expresion de proteinas IL-12 inducida por el plasmido de IL-12.
Ejemplo 5
Como otro ejemplo, para probar la capacidad de ARNip de IL-12 entregado en un liposoma/vehiculo hidrofobo continuo para inhibir la secrecion de IL-12, se uso antigeno de ovoalbumina en adyuvante completo de Freund (CFA) para inducir la secrecion de IL-12 por celulas de los ganglios linfaticos. Se ha mostrado previamente que el antigeno de protefna ovoalbumina indujo la secrecion de la citocina IL-12 en ratones (Yotsumoto et al, 2007, Vaccine, 25:5256-5262), que podria inhibirse usando ARNip especifico para IL-12 p35 (Hill et al, Journal of Immunology, 2003, 171:691; Ichim et al, Journal of Translational Medicine, 2006, 4:2, 1-11). En este ejemplo, los ratones inyectados con ovoalbumina en CFA por via subcutanea se inyectaron con ARNip de IL-12 por via subcutanea (bien en PBS o bien en liposoma/vehiculo hidrofobo continuo) un dia antes o un dia despues de la inyeccion de ovoalbumina.
Se obtuvieron ratones C57BL/6 hembra libres de patogenos, 6-8 semanas de edad, de Charles River Laboratories (St Constant, Quebec, Canada) y se alojaron segun la directriz institucional con agua y comida a voluntad, con circulacion de aire controlada con filtro.
Los ratones se inmunizaron por via subcutanea en el flanco derecho por encima de la base de la cola con 5 microgramos de ovoalbumina emulsionada en CFA (Difco Laboratories, Detroit, MI) en un volumen de 50 microlitros.
Se prepararon liposomas multilaminares hidratando una mezcla 10:1 (PESO/PESO) de mezcla derivada de soja purificada de fosfolipidos (fosfolipido S100, proporcionado por Lipoid GmbH) y colesterol usando solucion salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene ARNip de IL-12 a una concentracion final de 1,6 miligramos/mililitro. Los liposomas se extrudieron luego a traves de una membrana de policarbonato de 200 nm usando una prensa extrusora manual (Avanti lipids, Alabaster, Al, EE.UU.). Por cada 500 microlitros de una suspension de liposoma/IL12-ARNip, se anadio un volumen igual de un vehiculo de aceite mineral (Montanide™ ISA 51, Seppic, Francia) para formar una emulsion de agua en aceite con la suspension de liposoma contenida en la fase acuosa de la emulsion y el aceite que forma la fase continua, que actua de vehiculo hidrofobo.
Cinco grupos de ratones (n=4) se inmunizaron todos por via subcutanea en el dia 0 con ovoalbumina formulada en adyuvante completo de Freund (CFA) y cada grupo se trato por via subcutanea en el flanco derecho por encima de la base de la cola del siguiente modo: los ratones del Grupo 1 no se trataron, los ratones del Grupo 2 con 40 microgramos de ARNip de IL-12 en PBS en el dia menos uno, el Grupo 3 con ARNip formulado como se ha descrito anteriormente en un liposoma/vehiculo hidrofobo continuo en el dia menos uno, el Grupo 4 con ARNip en PBS en el dia mas uno y el Grupo 5 con ARNip en liposoma/vehiculo hidrofobo continuo en el dia mas uno, mientras que el Grupo 6 consistio en ratones no vacunados y sin tratamiento previo no tratados. Todas las inyecciones fueron 50 microlitros de volumen. Se recogieron los ganglios linfaticos drenantes de todos los ratones 8 dias despues de la inyeccion de ovoalbumina. Se diseccionaron los ganglios linfaticos y se cultivaron suspensiones de celulas individuales in vitro a una concentracion de 2 x 106 celulas/ml en medio RPMI complementado con 10 % de FBS, penicilina/estreptomicina, 2-^-mercaptoetanol y L-glutamina en placas de 24 pocillos durante 48 h. Se recogieron los sobrenadantes de cultivo celular y se guardaron congelados en alicuotas hasta que se usaron para la cuantificacion de protefna IL-12.
Se determino la eficacia del ARNip inyectado en dos formulaciones diferentes midiendo el grado de inhibicion en la expresion de proteinas IL-12 inducida por ovoalbumina por celulas de los ganglios linfaticos. La cuantificacion de la protefna IL-12 se realizo por enzimoinmunoanalisis de adsorcion (ELISA), usando un kit de ELISA especifico de IL- 12 comercial (Peptrotech, Rocky Hill, NJ, EE.UU.). Brevemente, se recubrio anticuerpo de captura anti-IL-12 durante la noche sobre placas de ELISA y se anadieron muestras e IL-12 patron. Despues de lavados minuciosos, se anadio anticuerpo de deteccion anti-IL-12 biotinilado y se incubo durante 2 h a temperatura ambiente y se lavo. Tras la incubacion con conjugados de avidina-HRP y los lavados, se uso sustrato liquido ABTS (Sigma, St Louis, MO) para el desarrollo de color. Las absorbancias se leyeron a 405 nm usando un lector de placas de microtitulacion y las concentraciones de IL-12 se extrapolaron usando una curva patron que se genero usando patrones de IL-12 suministrados en el kit.
Los niveles de IL-12 secretada por las celulas de los ganglios linfaticos aisladas de los Grupos 1-6 se muestran en la figura 6. Las celulas de los ganglios linfaticos aisladas de ratones en el Grupo 1, que no recibieron inyeccion de ARNip contra IL-12, secretaron mas de 300 picogramos por mililitro de IL-12 en los sobrenadantes de cultivo. En los ratones del Grupo 2, inyectados con ARNip de IL-12 en PBS en el dia menos uno o en los ratones del Grupo 4 inyectados con ARNip de IL-12 en PBS en el dia mas uno con respecto a la inmunizacion con ovoalbumina, no se
observo inhibicion significativa en la secrecion de proteina IL-12. En contraste, cuando se entrego ARNip en liposoma/barrera hidrofoba continua bien en el dia menos uno (Grupo 3) o bien en el mas uno (Grupo 5), se observo una marcada disminucion en la IL-12 secretada (p=0,003 y p=0,004 respectivamente), que fue tan baja como la observada con las celulas de los ganglios linfaticos de ratones sin tratamiento previo. Ademas, las celulas de los 5 ganglios linfaticos de los ratones en el Grupo 3 y el Grupo 5 secretaron significativamente menos IL-12 en comparacion con los ratones en el Grupo 2 y el Grupo 4 que recibieron ARNip en PBS. Esto muestra una entrega eficaz y mejorada de secuencias de nucleotidos de ARNip in vivo cuando se inyectan en un liposoma/vehiculo hidrofobo continuo que produjo la inhibicion completa de la expresion de proteinas IL-12 inducida por el antigeno de ovoalbumina.
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Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “una”, “el” y “la” incluyen referencia plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comunmente se entiende por un experto habitual en la tecnica a la que pertenece la presente invencion.

Claims (24)

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    REIVINDICACIONES
    1. Una composicion que comprende:
    un vehiculo que comprende una fase continua de una sustancia hidrofoba; liposomas; y
    un polinucleotido capaz de afectar la expresion de un gen y/o el nivel de un polipeptido.
  2. 2. La composicion segun la reivindicacion 1, en la que el vehiculo es un aceite o una emulsion de agua en aceite.
  3. 3. La composicion segun la reivindicacion 2, en la que el aceite es un aceite natural o un aceite sintetico.
  4. 4. La composicion segun la reivindicacion 3, en la que el aceite es aceite mineral, un aceite vegetal o un aceite de nuez.
  5. 5. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el vehiculo comprende una mezcla de aceites.
  6. 6. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que los liposomas comprenden un fosfolipido y/o colesterol.
  7. 7. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que los liposomas comprenden dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) y colesterol.
  8. 8. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el polinucleotido codifica un ARN antisentido, un ARN interferente, un ARN catalitico, una ribozima, o un polipeptido.
  9. 9. La composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el polinucleotido codifica el polipeptido.
  10. 10. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende ademas un adyuvante.
  11. 11. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el polinucleotido esta operativamente ligado a un promotor funcional en celulas de mamifero.
  12. 12. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que dicho polinucleotido se inserta en un plasmido de expresion.
  13. 13. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende un vector bacteriano o virico que contiene dicho polinucleotido.
  14. 14. La composicion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que dicho polinucleotido esta presente:
    (a) encapsulado dentro de dichos liposomas;
    (b) exterior a dichos liposomas; o
    (c) tanto encapsulado dentro de dichos liposomas como exterior a dichos liposomas.
  15. 15. La composicion segun la reivindicacion 10, en la que dicho adyuvante esta presente:
    (a) dentro de dichos liposomas;
    (b) exterior a dichos liposomas; o
    (c) tanto dentro de dichos liposomas como exterior a dichos liposomas.
  16. 16. Un kit, que comprende: una composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15; e instrucciones para usar dicha composicion para entregar un polinucleotido a un sujeto.
  17. 17. La composicion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 para su uso como un medicamento.
  18. 18. La composicion segun la reivindicacion 17, para su uso como un medicamento en un mamifero, preferentemente un ser humano.
  19. 19. Un procedimiento de preparacion de una composicion que comprende combinar liposomas, un polinucleotido capaz de afectar la expresion de un gen y/o el nivel de un polipeptido y un vehiculo que comprende una fase continua de una sustancia hidrofoba.
    5
  20. 20. El procedimiento segun la reivindicacion 19, en el que dicho polinucleotido esta encapsulado en dichos liposomas.
  21. 21. El procedimiento segun la reivindicacion 19 o 20, en el que los liposomas se deshidratan antes de combinarse 10 con dicho vehiculo.
  22. 22. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en el que dicho polinucleotido es un polinucleotido como se define en cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
    15 23. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en el que dichos liposomas son
    liposomas como se definen en cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
  23. 24. El procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en el que el vehiculo es un vehiculo como se define en cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
    20
  24. 25. Una composicion producida por el procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24.
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