WO1992010562A1 - Ganoderma lucidium iy009 which produces proteoglycan (g009) having effect of enhancing antitumor immunity - Google Patents

Ganoderma lucidium iy009 which produces proteoglycan (g009) having effect of enhancing antitumor immunity Download PDF

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WO1992010562A1
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Kwon Haeng Lee
Hoon Chung
Choon Woo Lee
Chun Hee Chung
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Il Yang Pharmaceutical Co Ltd
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Il Yang Pharmaceutical Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • Ganodenorema melesi dam (Ganoderna lucidu ⁇ ) IV 009, which produces a protein polysaccharide (G009) with antitumor ⁇ immune enhancing effect
  • FIG. 1 shows a saccharide analysis chromatogram of the protein polysaccharide G 009 of the present invention
  • FIG. 2 shows an amino acid chromatogram of the protein polysaccharide G 009 of the present invention
  • FIG. 3 shows a chromatogram of the protein polysaccharide G 009 of the present invention.
  • FIG. 4 is a microscopic photograph of the mycelium of the strain of the present invention 009
  • FIG. 5 is a comparison of the specificity of the strain IY 009 of the present invention.
  • the present invention relates to a strain that produces a protein polysaccharide having an anti-vaginal immunity enhancing effect.
  • the present inventors collected a large number of basidiomycetes in each region for the purpose of searching for a new polysaccharide having an anti-killing effect and an immune-enhancing effect, and tried to determine the key to the protein polysaccharide produced by the basidiomycetes. did.
  • Submerged culture medium Glucose 50 g, peptidase tons 20g, KH 2 P0 4 0.87g, MgS0 4 7H 2 0 0.5g, FeCl 2 .6H 2 0 10ng, MnCl z .4H 2 0 7ag, CuSO ⁇ 5H 2 0 LONG, was 1 beta was added to distilled water ZnCl 2 Amg.
  • the ⁇ was adjusted to 5.5 and sterilized with high pressure steam at 121 for 20 minutes.
  • the supernatant (400 1) was added to 100 ml of ethanol, centrifuged and separated, and
  • G2 (0.4) was obtained by depressurizing and drying the resulting precipitate, and ethanol 800B1 was again added to the remaining supernatant 800B1 after removing G2, and the resulting precipitate was decompressed and dried.
  • G3 (l.lg) was obtained.
  • Gl (2.1 g) was dissolved in water, applied to Sephadex G-100, and eluted with water. Freeze-dry the tube ⁇ 25-33 to obtain G4 (1.5 g),
  • G4 was re-dissolved in water, and the same volume of a mixture of 0.15 M Cetavelon (Cetavelon; Cethyl-trimethyl aBBonius bromide) and 0.1 M Borate buffer (Borate buffer PH 8. ⁇ ) was added. Adjust the pH to 9.0 with 0.5 ⁇ NaOH and remove the precipitate (G7) and supernatant (G6).
  • the precipitate obtained here is washed with methanol and acetone and then
  • the activity test of the above-obtained fraction on meat type-180 was carried out as follows. 20-25g ICR male mice were transplanted intraperitoneally at weekly intervals and subcultured for meat type -180 (Sarc O » a -180), which was used as a recommended test material. 180 cells of meat type 1 cultured in the mouse peritoneal cavity for 7 days were ascites
  • the cell suspension O. IBI was subcutaneously transplanted to the left groin in 10 mice per group. 72 hours after tumor cell transplantation. Purification for 10 consecutive days
  • control group received physiological saline
  • treatment group received 0.1 ng of protein polysaccharide dissolved in physiological saline at a concentration of 20 ng / kg.
  • SUBSTITUTE SHEET The mouse was sacrificed on the 30th day after tumor cell transplantation, the induced solid tumor was excised, and its weight was measured to determine the average tumor weight. was calculated.
  • mice 20-25 epsilon was used as the experimental tumor ⁇ cells.
  • mice were transplanted into the left inguinal region of the mice, 10 times muscles every other day system, subcutaneous and intraperitoneal injection zong / kg, Shizu
  • EAT Ehrlich ascite tunors
  • the control group received the same amount of physiological saline at the same time.
  • intraperitoneal administration of G 009 and intravenous administration of G 009 showed almost the same level of anticancer effect, and a more prolonged lifespan effect than the control group.
  • mice 20-25 g were intraperitoneally transplanted at weekly intervals and passaged
  • Injection was performed with saline instead of 15 doses, and the number of mice in the treatment group and the control group was 10 each.
  • the mouse was killed 30 days after the tumor transplantation, and the weight of the tumor was measured.
  • Example 5 Thymectomy of neonatal mice G 009 administration and antithymic globulin effect after 2 days of age Thymectomy of 2-day-old ICR mice was performed by Sjodin method, and 6 weeks after thymectomy Meat type 180 to IxlO 7 cell
  • SUBSTITUTE SHEET The solution was implanted by O. IBI. G 009 was injected intramuscularly at a dose of 20 g / k 10 times every other day at 24 hours after transplantation. To prevent infection of the thymectomized mice, water containing Tetracycline (HC Tetracycline-HIC) was used during the experiment.
  • HC Tetracycline-HIC Tetracycline
  • antithymic serum was removed by removing the thymus from 2-3-week-old mice, separating thymocytes, and then diluting in phosphate buffered saline to prepare cell suspension S. After the production, 3 rabbits were immunized with 1x10 s cells Z1 thymocytes by intravenous injection at 3 week intervals. One week after the last injection, antithymic serum was collected and inactivated at 561C for 30 minutes.
  • igG immunoglobulin G
  • Aged mice were injected intraperitoneally with a dose of O.ln] for 10 days, and G 009 was injected intramuscularly 5 times at a dose of 20 »g / kg every other day one day after 180 transplants of meat species.
  • A.T.M Antithymic globulin-treated mice
  • N.R.G.M Normal rabbit globulin-treated mouse
  • Guinea pig serum and human fresh serum are used for complement, red blood cells are used for «sheep erythrocytes, and antibodies are used for anti-sheep hemolysin.
  • the activity is the amount of complement disappearance (3 ⁇ 4) of the control group and that of G009. As shown in Table 9, the amount of complement disappearance increases in proportion to the concentration of G009.
  • the «sheep erythrocytes 1 X 10 B cells / ml Jodo after immunized by intraperitoneal injection was ⁇ the ⁇ erythrocytes administered 4 days after ⁇ .
  • Splenocytes were put to sleep by grinding with a water-cooled balanced salt solution using a blender.
  • SUBSTITUTE SHEET This was centrifuged at 2000 rp B for 5 minutes to remove the supernatant, suspended in a 0.832 ammonium chloride solution to remove red blood cells, and left at 37 for 3 minutes.
  • the cells were suspended in an ice-cooled balanced salt solution, and the number of spleen cells from which erythrocytes had been removed was measured using a hemocytometer.
  • Arcel solution [20.5 g of glucose, 4 g of sodium chloride, and 8.0 g of sodium citrate are dissolved in distilled water of IL, and then passed through a miripore instrument (0.45 ⁇ n).
  • the sheep erythrocytes suspended in [Use] were washed four times with a balanced salt solution at 2000 ° C for 5 minutes for 5 minutes, and suspended in a balanced salt solution to a final concentration of 10S !.
  • Example 9 Immunostimulatory action Twenty-five weeks old male CR mice of 6 weeks of age were used for 10 animals per group. G 009 is dissolved in saline, and 0.2 ml of each concentration solution is intraperitoneally administered to the mouse. 24 hours after administration 1 B1 peri-drawing ink 17 Black (Perican Drawing Ink 17 Black, manufactured by Gunter-lapner Co., Ltd.) and 3% (V / V) Gelatin
  • mice are administered with 0.2 ml of physiological saline.
  • Co the content of carbon powder in blood at time o.
  • C the content of carbon powder in blood at time t.
  • G009 The acute toxicity test for G 009 was performed on mouse and rat rabbits and was measured 14 days after G 009 administration. As shown in [Table]], G009 is a safe substance with extremely low toxicity, since there was no lethality to the administration route and species (species).
  • the present inventors searched the anticancer effects of Gano-derma lucjdura ⁇ strains collected in various regions all over the time, and found that the four types showed that the pile cancer effect was deemed to be unbalanced.
  • the following experiments were conducted to clarify the phylogenetic differences between the strains and the physiological and genetic differences of the fungal species (available from the Agricultural Technology Agency, Agricultural Technology Agency, Agricultural Technology Agency).
  • the strains used in this experiment were four strains of Ganoder-lucidun, which grows naturally in Japan, which are judged to have an excellent anti-cancer effect.
  • the collection sources are shown in Table 14.
  • the protein under test ( ⁇ bovine serum albumin: BSA) was used as a standard substance, and the BCA protein assay reagent (protein assay reagent) was used.
  • the developed gel was immersed in a 0.2 M phosphate buffer (PH 6.5) for 30 minutes. During the immersion, they changed three times with fresh buffer. After adjusting the acidity of the gel after immersion, a coloring solution (a-naphth acetate 20 mg, ethy 1 ene giyco ⁇ nonomethy 1 ether 2 ml, fast blue RR sa ⁇ t 20 mg, 0,2M phosphate buffer 120m]) was added and the color was developed by gradually shaking at 35 ° C for 30 minutes in a dark place.
  • a coloring solution a-naphth acetate 20 mg, ethy 1 ene giyco ⁇ nonomethy 1 ether 2 ml, fast blue RR sa ⁇ t 20 mg, 0,2M phosphate buffer 120m
  • a coloring solution (102 figCl, 6 ml of solution, fast garnet GBG salt 70 mg, ⁇ -naphtfiyJphosphate 80 mg, ⁇ -nap thythy 1 hospate Omg, 0.1 M acetate buffer lOOml) was added and the color was developed at 37 for 3 minutes.

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Description

明 細 書
発明の名称
抗腫瘙免疫増強効果の有る蛋白多糖体 （G 009)を生成するガノ デノレマ メレシ ダム （Ganoderna lucidu鼉） IV 009
図面の简単な説明
第 1 図は本発明蛋白多糖類 G 009の糖類分析ク ロマ トグラム、 第 2図は本発明蛋白多糖類 G 009のア ミ ノ酸ク ロマ ト グラム、 第 3図は本発明蛋白多糖類 G 009 の I.R 分析、
第 4図は本発明菌株 Π 009 菌糸体の顕撖鏡写真でぁ リ、 第 5図は本発明株菌 IY 009 の特異性比較國である。
発明の詳細な説明
本発明は抗膣瘙免疫増強効果のある蛋白多糖体を生成する菌株に 関するものである。 本発明者等は新しい抗滅糜、 免疫増強効果のあ る蛋白多糖体の探索を 目的に多数の担子菌類を各地域別に採集して その担子菌類が生成する蛋白多糖体の分鍵を試図 した。 その結果、 全羅南道海南郡頭 »山一帯で採集したガノデルマ （Ganoder靈 a)属に 属する担子菌類を適当な培地で培養して、 抗 «瘙及び免疫増強効果
SUBSTITUTE SHEET のある蛋白多糖体を生成することを発見した。 生成された蛋白多糖体 を分簾してその理化学的性質及び生物学的性貧を検討したと こ ろ、 こ れを抗腫瘙、 免疫増強効果のある蛋白多糖体 G 009と命名し、これを 生成する菌株をガノデルマ ルシダム （Ga nod er嵐 a l uci du e ) U 009 と命名した。 このガノデルマ ルシダム I Y 009菌株は社団法人韓国 種菌協会に 1990. 11 . 22日付で寄託番号 KFCC- 1 0709号で寄託された。 本発明は G 009 を生成する株菌 I Y 009 に関するものである。 高等 菌に属する担子菌類から薬効成分である抗菌成分、 幻覚成分、 毒成分 コ レステロール降下成分等に関して研究して来たが最近に到リ抗癌成 分と免疫機能増強作用の研究が活発に進行されているので担子菌類の 重要性が高ぐなつ ている。 こ こに本発明者等は抗癀成分及び免疫機能 機能増強作用のある物貧を分泌する苗株を分塞、 液内培養してその薬 理効果を研究中、現在まで分雜同定されたガノデルマ属の種（speci e s ) よ り卓越した抗癌効果及び免疫増強作用を持つ変種の株菌を分戆し菌 糸体の液内培養方法を確立し、 この培養された菌糸体から抽出した成 分の抗瘙効果及び免疫効果増強を確認した。 これに対し本発明者等は 次の実旃例及び実験例で本発明を説明する。
SUBSTITUTE SHEET m m 蛋白多糖体の分雜
1) 菌株 ： ガノデルマ ルシダム菌株は全羅南道海南郡の顔倫 山ー蒂で採集して分離、 同定した。
2) 保存培地 ： ジャガイモ デキス ト ロ ス 寒天 （ Potato dextrose agar ： PDA) 傾斜培地 ； ジャ ガイモ デキス ト ロ ス 培地（Difco，U.S.A) 39g を蒸留水に溶かして 1 β に し、 121T にお いて 20 分間高圧滅菌の後傾斜培地に作っ た。
液内培養用培地 ： 葡萄糖 50g, ペプ ト ン 20g， KH2 P04 0.87g, MgS04. 7H20 0.5g, FeCl2.6H20 10ng, MnClz.4H20 7ag, CuSO^ . 5H20 lOng, ZnCl2 Amg に蒸留水を加えて 1 β に した.
この ρΗ を 5.5 に調整して 121で、 20 分間高圧蒸気で滅菌した。
3) 培養 ： 保管中の菌株を PDA傾斜培地に移植して 25± 1 に 7日間 成長させた後、 発育された菌糸を無菌的に分離して液内培養用培地 100mlの入っ た 500ml三角 フ ラ スコ に移 し 25± 1 において 180rpmで 菌糸体が直径 3-5»B程度の成熟した菌塊を成すまで 7-10 日間振盪 培養した。 得られた菌塊を微細粉砕機で 10 秒間粉砕した後、 液内
SUBSTITUTE SHEET 铉着 ffl培地 100ml の入った 500ml三角フラスコに 5¾(V八'）ずつ接 種し、 25JS± It:の温度でオビタル振盪培養器 （回転半径 1 吋ビジョ ン科学 Co.)で 170 回転/分で 7 日間振盪培養した。
4) 蛋白多糖類の抽出及び分雜
5 培養の終わった培養液全体を 6000rpm で 15分間遠心分雜した後， 菌糸体た'けを取って 2 倍容量の 2·5Ν aOH 溶液に浸潤させた後、 室溫で 24時間放置して 6000ΓΡ で 15 分間遠心分藩し、 上澄液を取 つて氷醋酸で PH 7.4に中和させた後、 ビスキング チューブ ( Visking tube:Sig疆 a，U.S.)を利用して 3 日透析させた。 透祈の 10 終わった後湊綰して 3 倍のエタ ノールを加え 4T;で 24 時間放置 した後 6000回転で 15 分間遠心分雜して沈殿物を得た。 こ の沈殿 物を脱イオン水で溶解して 6000回転で 15 分間遠心分雜して上澄 液を濃縮し、 凍結乾燥させて蛋白多糖体を分雜した。
5) 蛋白多糖類の精製
15 上記の試料を水に溶解して過量のエタ ノ ールを加えた後得られた沈 殿物 12.5g (菌糸培養物 1300B1 中） を取って水に再ぴ溶解せた。 こ の試料液をディ ィ 一エイ ィーセゾレロ ス （DEAE-Cellu ose'Cl-form)
SUBSTITUTE SHEET Co i umn ( 3cm x 60cm ) に適用させた後、 水で溶出 して得られた溶 出分割 200ml に同量のメタ ノ ールを加え遠心分雜して沈殿物をェ タ ノ ールで洗浄した後滅圧乾燥して Gl (2.1g) を得た。
上澄液 （400 1) はエ タ ノール 100ml 加えて遠心分雜した後、 得ら
5 れた沈殿物を滅圧乾燥して G2(0.4 ）を得， G2を除去して残っ た上 澄液 800B1 に再びエタ ノ ール 800B1 を加えて得られた沈殿物を滅 圧乾燥して G3(l.lg)を得た。 Gl (2.1g)を水に溶解してセ フ アデキ ス ジ -100(Sephadex G- 100)に適用させて水で溶出 した。 チュ一 ブ Νο·25-33 の分割物を凍結乾燥して G4(1.5g) を得、 チューブ
10 No.34- 44の分剷物を合わせた G5(0.3g)を滅圧乾燥して分離した。
G4 を水に再び溶解して 0.15M セタブロ ン （Cetavelon; Cethyl- trimethyl aBBonius bromide) と 0.1M ボレー 卜緩銜液 ( Borate buffer PH 8.ϋ) が同量で混合された溶液を同量加えた後 、 0.5Μ NaOH で pH を 9.0に調整して沈殿物 （G7) と上澄液 （G6) を取つ
IS た。 G7に 2M の氷醋酸を加えて溶解した後、 3 倍のメ タ ノールを 加えて沈殿物を得た。
こ こで得られた沈殿物をメタ ノ ールと ァセ ト ンで洗浄した後
SUBSTITUTE SHEET 滅圧乾燥させた （G8)。 G8 を少量の水に溶解してセフ ァ ロ ス
シ一エル- 4B (Sepharose CL-4B) に適用させた後水で溶出 してチュ
—ブ No.25-30 で G9 を得、 チューブ 1\'ο·31-46 で G10を得た
実 驗 例 1
I 瘙 実 験
上で得た分割物の肉種- 180 に対する活性実験は下記の如く行つ た。 20-25g ICR 雄性マウスの腹腔内で 1週間間隔に移植して継代 した肉種- 180(SarcO»a-180) の細跑を実験用の薦瘙細飽と して使用 した。 マウス腹腔で 7 日間培養された肉種一 180 の細胞を腹水と
10 共に取って永冷、 滅菌した食塩水を加えて 4000rpa で 5 分間遠心 分離して細胞沈殿物を分離した。 分離された細胞を生理食塩水で 3 回洗浄した後 ixlO7 細胞 Zml になるよ う稀釈した
この細胞浮遊液 O. IBI をマ ウス 1群を 10 匹に して左側鼠蹊部皮下 移植した。 腫瘍細胞移植後 72 時間経過後. 連続して 10 日間精製
15 された分劃物である蛋白多糖類を投与した
対照群には生理食塩水を、 処置群には生理食塩水に溶解させた蛋白 多糖類を 20ng/kg の濃度で 0.1ml ずつ投与した
SUBSTITUTE SHEET 腫瘍細胞を移植してから 30日 目 になる 日マウスを致死させ、誘発さ れた固形癌を摘出した後、 その重量を測定して平均腫瘙重量を求め 下記式によ り踵瘪阻止百分率を計算した。
Cw Tw
阻止百分率 （l.R.i) = X 100
Cw
I . R ： Percent Inhibition Rati o
1+
Cw ： 対照群の平均麓瘍重量 Tw ： 処置群の平均腫疡重量 10 このような肉種- 180 を利用 した抗癌実联の結果は表 .1 に表れた如 く対照群に比して処置群において最も優秀な効果のある G9 を選択 して G 009 と称し、 これに対する分析は下記の実験例で行っ た。 記の実験例で行った。
表 1·肉種— ] 80 を移植したマウスに対する蛋白多糖類の抗癌効果
15
平均腫瘍重量 （g) 阻止率（ ) (Mean ± S.E) 対照群 4.66 ± 0.17
20 G1 1.43 ± 0.25 69.3
G2 24.1
G3 3.46 ± 0,39 25.7
SUBSTITUTE SHEET G4 1.05 0.17 77.4
G5 1 .83 土 0. .29 60 n
, t
G6 1. 62 0. 10 65. .2
G7 0. 64 0. 22 86. 2
G8 0. 43 0. 21 90. 7
G9 0. 17 0. 09 96. 3
G10 1. 40 0. 17 69. g
G 009 の化学的分析のため総糖はアン ト ロン発色法、 蛋白貧含量は ローリ一（Lowry) 等の方法で測定した後アミ ノ酸、 構成糖類を分析 し、 結果を表 2.3.4 に表し、 糖類分析ク ロマ トグラムは第 1 図に アミ ノ酸クロマ トグラムは第 2図に. I.Rの分析は第 3 図に表した. 糖類分祈の為の G.L.C. (Shi疆 adzu GC OA, Japan)使用の条件 ： Coluen 3% 0V-17 (80-100) (Mesh shiaalite) όΛΏ l Boronsi丄； icate glass coluan
Temperature Collin 150-180^ Gradient , Detector 190"C
Flow rate 2 ： 50ml/min
H2 ： 60nl/ain. (0.6kg/cm2 ) Air: 60ml/min. (0.6kg/cn2)
SUBSTITUTE SHEET [ Attenuation 102 x 24 a.f.s(aapere full scale) 表 2. G 009 の多糖類及び蛋白質総含量 総含量 多糖類 （50 蛋白質 (%)
G 009 93 5
表 3. G 009 の多糖類部分中単糖類の含量
10 単糖類 相対比 （31)
アルフ ァ ー グルコ ース
ベタ ー グ レコ ース
カ ラ ク 卜一ス 8.03
CO
15 アルフ ァ ーマ ン ノ ース
フ ラ ク 卜一ス 1.11 アミ ノ酸自動分析器 (Beck. an Sis · 6300 , U . S · A )使用の分析条件
Column 2.6 x 200疆應
20 Ion exchange resin ίί 338076(Beck覼 an)
Flow rate Buffer solution 0.33mJ/min
Ninhydrin 0* 17BIノ Din
Analysis cycle time 60 mm
SUBSTITUTE SHEET Column pressure 2100Psi (147kg/cmz)
Ninb drin pressure lOOpsi ( 7kg/cn2)
Column temperature 50 - 70°C Gradient
N2 gas pressure 40psi (2.8kg/cm2)
Reaction bath teeperat ure 130 。C
Wave length 570nm, 440na
表 G 009 の蛋白質部分中総ア ミ ノ酸含量
10
15
Figure imgf000012_0001
20 実 験 例 2
G 009 の投与経路に伴う抗癌効果の変化
ICfi 雄性マウス 20-25ε の腹腔内で 1 週間間隔で移植して耱代した 肉種 -180 細飽を実験用腫腠細胞と して使用 した。 マ ウ ス腹腔で 7 日間培養された肉種 -180 細跑を腹水と共に取って氷冷、滅菌した
SUBSTITUTE SHECT 食塩水を加えて 3000ΓρΒ で 5 分間遠心分難して細胞沈 ¾物を分離 した。
分離された細胞を生理食塩水で 3 回洗浄した後 1 X 〗07 細胞 /ΒΠ になるよう稀釈した。 この細飽懸港液をマウ ス 1群を 10 匹に して 5 1 X 106 細胞 / 0.1Β】をマウスの左側鼠蹊部に移植した後、 隔日制 で 10回筋肉、 皮下及び腹腔注射は zong/kg を、 静 主射隔日制で
5回を 10 g/kgで投与し対照群も同じ方法で生理食塩水 0· 1Β1ずつ投 与して 30日経過後固形癌の重量を測定して比較した.
表 5 に表れた如く、 全ての投与方法において差異が殆ど無く 固形 10 癌の成長を抑制させた。
表 5. G 009 の投与経路に依る抗癌効果の比較
15
20
Figure imgf000013_0001
実 験 例 3
SUBSTITUTE SHEET G 009 の投与に依る寿命延長効果
マウスの生体内で G 00 の抗癌活性を測定するためエルリ ヒカシ ノマ細跑 (Ehrlich ascite tunors ： EAT)を使用 した。 EAT 細胞を 1 X 106, 5 X 107 細胞/ Bl をマウスに腹腔注射して移植し 24時 5 間経過後 G 009 を燐酸緩衝塩溶液に溶解して 100醒 g/kg の投与量 で 12 日間耩続して腹腔、 経口投与し 20 日、 25 日、 30 日、 50日 の平均寿命を測定した。
対照群は生理食塩水を同量、同時に投与した。 表 6 に現れた表れた 如く G 009 の腹腔投与と静脈投与がほぼ似た水準の抗癌効果を表 10 し対照群よ りも顕著な寿命延長効果をもたら した。
表 6. G 009 の投与に依る寿命延長効果
15
20
Figure imgf000014_0001
SUBSTITUTE SHEET 実 験 例 4
ト リ パン ブル一 （ Trypan Bl ue )処理したマ ウ スでの G 009 の抗癘効果
ICR 雄性マ ウ ス 20- 25g の腹腔内で 1 週間間隔で移植して継代し
5 た肉種一 180 細胞を実験用塍疡細胞とて使用 した。
マ ウス腹腔で 7 日間培養された肉種一 180 細胞を腹水と共に取つ て永冷、 滅菌した食塩水を加えて 4000ΓρΒ で 5 分間遠心分難して 細胞沈殿物を分雜した。 分雜された細胞を生理食塩水で 3 回洗浄 した後 1 X 107 細跑/ ] になるよう稀釈して O.latl ずつマ ウ ス
10 鼠蹊部に皮下注射した。
1 H経過後 4i»g/«Ouse(0.4iBl) の Trypan blue を腹腔投与した。 再び 1 H経過後 1 回に lag/ ouse(0.1B】）で 3 日間隔で総 13«g/ mouse となる よ う ト リパン ブルーを皮下注射し、 ト リノ、。ン ブル —の投与直後 G 009 10.g/kg を静艉注射した。 対照群は G 009
15 投与の代わり生理食塩水で注射して処置群と対照群のマウ ス数は各 々 10 匹にした。
腫瘙移植 30 日経過後マ ウスを致死させ膳瘍の重量を測定した
SUBSTITUTE sHeer G 009 に対する ト リパン ブルー効果に対する上の実験結果は表 7 の通リであり、 このような実験結果は大食細胞不活性化因子である 卜 リパン ブルーを ½理するこ と に依り本発明の抽出成分である G 009 が抗癌効果と関連のある大食軔胞を活性化させている こと を 知ることが出来、 又 G 009 が T- 淋巴球の抗疡活性と共に大食細 胞の機能を活性化してやることに依リ抗疡効果を現すものと見られ る。 表 7. ト リパン ブルー ½理したマウスでの G 009の抗瘙効果
o
麗瘙の重量 （0g 0) (Mean 土 S.E )
+1 +1 +1
対照群
o
G 009 処理群 o
S O
ト リパン ブルー処理群
ト リバン ブル一 ½理と 2.69 土 0.17
G 009 処理群
実 施 例 5 新生マウスの胸腺切 P余後 G 009投与と抗胸腺グロブリ ン効果 2 日令 ICR マウスの胸腺切除はスジョ ジン （Sjodin)の方法で施行 し、 胸腺切除の 6週後マウス鼠蹊部に肉種一 180を IxlO7 細胞想揮
SUBSTITUTE SHEET 液を O. IBI ずつ移植した。 移植 24 時間後隔日間隔で 10 回 20 g /k の投与量で G 009 を筋肉注射した。 胸腺切除されたマ ウ ス の 感染防止のため実験期間中テ トラサイ ク リ ン ― HC Tetracycline -HIC) を含んだ耠水を した。
5 抗胸腺血清の分 ¾は Tadaku^a 方法を使用 したと ころ 2-3 週令の マウスから胸腺を切除して胸腺細胞を分離した後、 燐酸塩緩衝溶液 に稀釈して細胞懸 S液に作った後 1x10s 細胞 Z 1 の胸腺細胞を 3 週間隔で 3 家兎に静艉注射して免疫化させた。 最終注射後 I 週間 経過後抗胸腺血清を取って 561Cで 30 分間不活性化させた。
10 この不活性化された抗胸腺血清から igG (免疫グロブリ ン G)分劃 をアンモニゥム スルフ X— 卜で沈殿させて分戆した後 lxlO7 細 胞ノ nl の肉種一 180 が接種されて 1 日経ったマ ウ ス に 10 日間 O.ln] の投与量で腹腔注射し、 G 009 は肉種一 180 移植 1 日後隔 日間隔で 20»g/kg の投与量で 5 回筋肉注射した。
15 上の実狭結果が表 8 に表れた如く G 009 の抗癀効果は T-細胞の 機能と関連して胸腺切除されたマウスが対照群よ リ抗癌効果が顕著 に低く 、 扰胸腺グロブリ ン処理群でも正常の家兎グロプリ ンのシュ
SUBSTITUTE SHEH" ド（pseudo)-処瑪群である对癍群よ リ抗癌効果が滅少されるのを見 ることが出来る。 それ故このような実験結果は G 009 が T-細胞の 機能を活性化させることに依り抗癌効果を表すのと看做される。
表 8. 新生胸腺の切除されたマ ウ ス （実験 1)と抗朐腺グロ ブリ ン処理 （実験 2)されたマ ウ スに肉種一 180 を移植 した後 G 009 の投与に依る抗癌効果の比較
10
15
20
25
Figure imgf000018_0001
N.M ： 正常マ ウ ス
T.H ： 胸腺切除マゥス
A.T.M ： 抗胸腺グロブリン処理マウス
N.R.G.M ： 正常家兎グロブ リ ン処理マ ウ ス
SUBSTITUTE SH 実 験 例 6
G 009 が補体系に及ぼす影礬
補体はギニァ ビグ （Guinea pig)血清と人間の新鮮な血清を使用 し、 赤血球は «羊赤血球を使用 し抗体は抗綑羊溶血素（Anti sheep- hemolysin)を使用 しに
補体系活性実験は下記の如く行った。
試驗管に 150 1のゼラチン ベロナル緩衝液 （GVB2+)と試料 50A】 を加えた後， これに 50μ 1 の補体 （100 units/ 1)を添加し， 37 で 30 分間反 ί&させた後、 を加え 補体濃度を 1 units/al0 に調整した。 これらの混合物を溶血素 （He oJysin ； 2MHU/ml に 感作した橱羊赤血球細胞（5 10β 細胞/ «α)2»1ずつ添加し GVB2+ 溶 液で調整された補体混合物を 1·0, 1.2, 1.6 unit を各々加えた後 GVB 溶液で総量が 5B1 になるように調整した。
37 で 60 分間反応させた後 2500ΓΡΒ で 5 分間遠心分雜した上澄5 液の吸光度を 541nB で測定した。
活性度は対照群と G 009 の補体消费量 （¾)であ り、 表 9 に表れた 如く G 009 の濃度に比例して補体消费量が増加し、 このよ う な結
SUBSTITUTE SHEET 果は G 009 が免疫系の重要防御機能中の一つである補体系 G009が 機能を活性化させてやる こ と に依り免疫増強作用 を表すも のと考え る こ とが出来る。
表 9. 補体系活性化に対する G 009 の効果 濃度 ( g/m.l) 補体消费量（! (Mean± S.D)
10 15.2 ± 0.59
50 27.9 土 0.43
009 100 36.4 土 0.10
200 45.5 土 0.30
600 52.2 ± 0.70 実 験 例 7
15 免疫に闋連した臆器重量に対する G 009 の効果
G 009 を 10Bg の投与量でマウスに静脈注射 した後 5 日後肺、 肝、 脾朦を摘出 して、 これ らの重量を測定 し、 ラ イ ゾザィム （Lysozy e) は烧酸塩緩衝溶液 （PH 6.2) で溶解し たス ト レプ ト コ カ ス リ ソデ イ クス （Streptococcus lysodeicus) を基貧に して反応させた後、
20 その活性は 660I1B1 で吸光度で測定した。
表 10 で表した通 り G 009 の処理群において脾 JKの重量と ラ イ ソ
SUBSTITUTE SHEET ザィ ムの活性度が增加した理由は G 009 が大食細胞を活性化させ てライ ソザィムの活性僮が増加したのであ り， 免疫機能に関連 した 脾臓の重量が増加したものと見られる。
表 10. G 009 投与による血清酵素活性億と器官重量に関す る影響
Figure imgf000021_0001
* 各器官の重量は体重に対する相対値
実 联 例 8
マ ウスの溶血班形成細胞数に G 009 が及ぼす影 g
1) 実联動物と して 20-25g の雄性マウス 1群を 5 匹と して、 試料 を 20g/kg の濃度で速続して腹腔注射した。
最後の投与 7 日後、 «羊赤血球を 1 X 10B 細胞 /ml 襄度を腹腔 注射して免疫させた後、 維羊赤血球投与 4 日後脾臟を镝出た。 プ レ ンダ一（blender) で水冷の平衡塩溶液と共に粉砕して脾臊細胞 を遊睡させた
SUBSTITUTE SHEET これを 2000rpB で 5 分間遠心分雜して、 上澄液を除去し、 赤血球 を除去するため 0.83 2 塩化アンモニゥム溶液に浮遊させて 37 で 3 分簡放置した。
再び遠心分難して氷冷の平衡塩溶液に浮遊させた後、 赤血球除去脾 朦細胞数を血球計で測定した。
2) アルセル溶液 [葡萄糖 20.5g， 塩化ナ ト リ ウム 4· ， 构櫞酸 ナト リ ウム 8.0g を IL の蒸留水に溶解した後、 ミ リポア遽奏器 (0.45 μ n) で滤過して使用] に懸漘された緬羊赤血球を平衡塩溶 液で 2000ΓΡ« で 5 分間 4 回反復して洗浄し、 最終 ¾度が 10S!に なるよう平衡塩溶液に浮遊させた。
3) 平板皿に 1.5? Ύ ii~ (Noble agar.Difco.) lOal を注いで基 底層平板を作った。 再び 0.72 ァガー 2«：1 に 1)の脾饞钿胞 100 Pi 1 と 2)の瓶羊赤血球 100# 1 を混合した後、 平板皿に注ぎ均一 に広がるようにした。
これを 37 で 60 分間感作化させた後、 補体と して吸収されたギ 二ァピグ血清を平衡塩溶液に 10 倍稀釈して 2·5Β1 ずつ加えて 37 で 30 分間培養し後、 形成された溶血班形成細胞数及び脾嗞細胞
fsUBSTITUTE SHEET 全体中の溶血班形成細胞は、 （PFC/脾臓）を計算して表示した„ 表 ϋ に表れた結果から見て G 009が全体脾臟細胞数及び溶血班形 形成細飽数の顕著なる增加原因を招来するので免疫増強作用に関連 している こと を知るこ とが出来る。 表 11. 緬羊赤血球で免疫された ICR マ ウ ス脾朦内の溶液 班形成細胞に及ぼす G 009 の効果 マ ウス 脾臓細胞 PFC/106 脾》 細胞 数 (1 X 107 )
対照群 5 38.6± 2. 1 24 .4± 11.2
G 009 5 42.6± 0. 11 51 .0土 14.5
実 施 例 9 免疫刺戟作用 毎グループ当 10 匹に して生後 6 週になつ た 20- 25g の雄性 ί CR 系マ ウ スを使甩 した。 G 009 を^理食塩水に溶解し各濃度別溶液 0.2ml をマ ウ スに腹腔内投与する。 投与 24 時間後 1B1 のペ リ 力 ン ド ロ一イ ン グ イ ン ク 1 7 ブラ ッ ク （Perican Drawing Ink 17 Black, Gunt er-lapner Co. ,Ltci. 製造） と 3¾(V/V) のゼラチン
SUBSTITUTE SHEET を含有する生理食塩水 2πΰ を混合して製造した炭素懸濁液 0.2ml をマ ウスの尾に静脈注射した後 1， 5, 10 及び 15 分にへパ リ ンで 被覆されたへマ 卜ク リ ト毛細管を利用 して眼窩で血液 0.02mlを採 採取して直ちに G.l (V/V)の炭酸ナ ト リ ヴム水溶液 l。6'ml に稀釈 及び溶血させる。 この溶液を 675nm で比色させ食作用指数 （K値） をハルペルン等
(Halpern et al) の等式によ り測定する。
対照群はマウスに生理食塩水 0.2ml を投与する。
丄 o£ Co 一 log C
K =
to
上記式で
Co = o 時間での血液中の炭素粉末含量であ リ C = t 時間で血液中の炭素粉末含量である。
上の試験に对する結果を表 12 に表し G 009 の濃度に比例して免 疫食作用指数（K)が高く表れており、 このよ う な結果から見て G 009 が免疫反応に関与して免疫増強作用を表すもの と見られる。
表 12. 免疫刺戟作用に対する G 008 の影響
SUBSTITUTE SHEET 投与量 マ ウ ス 食作用指数 （K)
{mg/kg) 数 (Mean 土 S. E)
' δ 対照群 生理食塩水 10 0.0391 ± 0.003
、 0 10 0. I 1 9± 0 , 025
20 10 0.1453± 0.022
10 G 009
50 10 0.1643 ± 0.008
100 10 0.1845± 0.0】 j
実 験 例 10
G 009に対する急性毒性試験はマ ウ ス、 ラ ッ ト 家兎に対 し行い、 G 009 投与後 14 日 に測定 した。 表 ] ] に表れた如 く 投与経路や種 （species) に対 して も致死は無か つ たので G 009は毒性が極めて低い安全な物質であ る 。
、、 表 〗3. G 009 に対する毒性試験結果
験動物 投与量 投与 致死 最大許容量 種類 数 ¾.mg/kg) 経路
10 100 - 300 i . V 0 300
Mice 0 50 - 2000 j . P 0 > 2000
10 50 - 100 i . m 0 > 100
10 1000 - 2000 s . c 0 > 2000
30 10 100 - 300 i . v 0 > 300
Rat 10 500 -1000 i . P 0 > 1000
10 50 - 100 1. m 0 > 100
10 500 - 1000 s . 0 > 1000
«Jレ 1 100 - 200 i . v 0 > 200
SUBSTITUTE SHEET Rabbit 10 100 - - 200 i - P 0 > 200
10 25 - - -50 i . in 0 > 50
10 50 - - 100 s . c 0 > 100
実 験 例 1】
菌種間の特性比較
本発明者等は全頃各地域で採取したガノデルマ ルシダム（Gano - derma lucjdura) 菡株の抗癌効果を検索して見た結果、 杭癌効果が 優禿であると判断される 4 種と標準菌種 （農村振興疔 農業技術 庁研究所 菌茸課保有） の系統間分類及び生理遺伝的差異を糾明 するため次の如き実験を行つた
実験材料及び方法
使用菌株、 培地及び培養
本実験に使用 した菌株は国内で自生する霊芝 （ Ganoder - lucidun)の内抗癌効果が優秀であると判断される 4 菌株を使 用 し、 収集源は表 14 の通りである
試料の抽出
液内培養した培養物を遠心分離して得られた菌糸体を燐酸塩緩衝塩 液 (phosphate buffered saline ： PH 7·5)に 3 回洗浄した後、 菌
SUBSTITUTE SHEET 体を氷冷 して 30 秒間超音波処理した
これを 12000Xg で遠心分離した後、 上澄液を電気泳動試料に使用 た
蛋白質定量
試 中の蛋白赏 {±牛血清ァノレブミ ン ( bovin serum albumin : BSA) を標準物質に使用 して BCA 蛋白分析試薬 （prote in assayreagen t
Pierce Co ·)を使用 して定量 した
電気泳動
電気泳勅は不連続緩衝系 (discontinuous buffer system) を利用
10 した。 分離ゲル（separating gel)は MOmM Tr i s-Cl緩衝液 （ PH 8.48) に 10 T， 10 C 濃度に し、スタ ッ ク ゲル （stacking gel )は Tris 緩衝溶液 （39.5mM Tris, 0.064 H3 P04 , に 3.125$ ϊ， 20% ( 濃度 でゲルを調剤 し た
Gel を固めるために TEMED と ammoniuni persulf ate を使用 し た ン ニ ン グ緩衝 （running buf fer)で陽極には 40mM ト リ ス グ リ シ ン緩衝液 （PH 8.8) を . 陰極には 60mM 卜 リ ス— C】 緩衝液
(pH 7.47) を使用 し、 試料は 70 u g ずつ を ゲルに装塡 （load ing
SUBSTITUTE SHEET して 4°Cで 100V で 2 時間展開 した。
ゲルの染色
(1) エステラーゼ （E. 3， 1， 1， 1)
展開 したゲルを 0.2M 燐酸塩緩衝液 （PH 6.5)に 30 分間沈漬させ た。 沈漬される間、 新しい緩衝液で 3 回交換 してやっ た。 沈漬の 終おつ たゲルの酸度を調整した後、 発色液 （ a -naphth acetate 20mg , ethy 1 ene giyco丄 nonomethy 1 ether 2ml , fast blue RR sa丄 t 20mg， 0,2M phosphate buffer 120m]) を加えて暗い場所で 35 °C で 30 分間徐々 に振っ てや り ながら発色させた。
(2) アン ド ホスフ ァ タ 一ゼ （E. 3， 1， 3， 2)
ゲルを 醋酸塩緩衝液 （PH 5· 2) 沈清してゲル内の酸度を調整 した後、 発色液（102 figCl ,溶液 6 ml, fast garnet GBG salt 70mg， α - naphtfiyJphosphate 80mg , β -nap thy 1 ho spha t e Omg , 0.1 M acetate buffer lOOml) を加え 37 で 3ひ 分間発色させた。
(3) ロ イ シン ァ ミ ノ ぺプチダ一ゼ （E. 3， 1,3， 2) ゲルに発色液 I i-leucyl- β -naphthy lamide HC1 20mg, fast black K salt 20m , distilJed water 50m , 0.2H Tris raa丄 ale buffer- 2了
(PH 5.4) 120 l] を加えて暗い場所で 30 分間発色させた。
(4) ぺ ロ キ シダ一ゼ （Ε· ！， il，l，7)
ゲノレを水洗 しだ後、 発色液 (Benzidine lg, acetic acid 9ml， mi ed solution of 1 part of benzidine solution mi ed with
5 40ni] of distilled water,! art of 0.03¾ HZ0Z and 4 art s o distilled water) ¾加えて暗い場所で発色させた。
このよ う な実験結果を説明すれば下記の通 り であ る 。
エ ステ ラーゼの同位酵素パタ ーン （pattern) 霊芝のエステ ラ一ゼ バン ド （esterase band) は第 1 図 における と
10 阆 じ く 総計 17 個が表れたが、 5 と 15 番 目 のバン ト は全て の菌株 で殆ど共通的に見えた .標準菌株である Fr07004と Fr 0700 及び菡 株のエステ ラーゼ バダーンは極めて類似 して いたが、 U 009 と IY 010 菌株のエステ ラーゼ バタ 一ンは他の菌株と 多 く の差異の ある こ と を知る こ と が出来た。
15 ァシ ド ホスフ ァ タ 一ゼの同位酵素バタ 一ン
第 5 [¾に表れたよ ：） に標準菌株 Fr 07004 , Fr 07008 及び IY 005 Μ株の.ァシ ド ホス フ ァ タ --ゼ のバタ ーン間 には w . 極めて類似 し
SUBSTITUTE SHEET た様相を表したが、 IY 009 と IY 01ひ の場合は他の菌株と は相違 したバン ドのパタ ーンを見せた。
ロ イ シン ァ ミ ノ ぺプチダ一ゼの同位酵素パタ ーン 霊芝では全部 3 個の ロ イ シ ン ア ミ ノ ぺプチダ一ゼ バン ドが現 れ、 この う ち標準菌株である Fr 07004, Fr 07005及び IY 005 は大 大部分同様な様相を表したが、 I Y 009は これ ら と は全然異なる様相 を表した （第 5 図） 。
ぺロ キシダ一ゼの同位酵素パタ 一ン
霊芝菌株では 2 個のぺロ キシダ一ゼ バン ドが表れたが標準菌株 である Fr 07004, Fr 07008 及び IY 005の間には由縁関係が多か つ た （第 5 図） 。
菌種間の由縁闋係
表 14に表れているよ う に、 霊芝の標準菌株であ る Fr 07008と IY 005 の間には 93.8 ， Fr 0700 と IY 005は 82.42 の高い由縁関 係を見せてレゝる が、 Fr 07004 と IY 010 及ぴ Fr 07004 と IY 009 は各々 30.4 と 31.8 の比較的低い 由緣関係 を 見せた。
以上のよ う な結果から同一種内の同位酵素パタ ー ン の差異は地理的
[SUBSTITUTE SHEET 環境の差異に伴う逮伝的変異に依 り生化学的変化を誘発する こ と に 依 り表れる こ と を知る こ と が出来、 こ の よ う な差異が菌株毎に抗癌 活性が異なる蛋白多糖体を生成する こ と と 関連のあ る も の と見 られ る。 表 14. 本実験に使用された菌株の採取地域 種名 菌株番号 採集地 備考
農農京全江全
tranoderma Fr 07004 村村羅羅原畿 興庁保有 標準菌袜 ucidum Fr 07008 振振道南南道興庁保有 標準菌株
IY 005 光陵
ΙΥ 008 道顔倫山
IY 009 道頭倫山
IY 010 雉岳山
表 15. エステラーゼ、 ァシ ド ホス フ ァ タ ーゼ、 ロ イ シ ン、 ァ ミ ノ ぺプチダ一ゼ、 ぺ ロ キシ ダ一ゼ ノ タ ー ン o o に依る霊芝 （Ganoderma lucidun) 菌株間の類似性 比較 國 "ά" _ 類似性 ）
Fr 07004 Fr 07008 IY 005 IY 008 1 Y 010 I Y 009 菌種名
Ganoderma Fr 07004 77.8 82.4 62. 5 31.8 luc idum Fr 07008 93.8 45. 0 32.8 25.0
IY 005 * 45. 0 31.8 25.0
IY 008 * 27.3
IY 010 * 25.0
IY 009
SUBSTITUTE SHEET

Claims

4 . 特許請求の範囲
ガノデルマ ルシダムを培養し、 これから分雜された、 糖成分と し てベタ -ダルコ -ス、 アルフ ァ -グルコ -ス、 ガラ ク ト ース、 アル フ ァ マン ノ -ス、 フ ラ ク 卜 - ス を含有し、 蛋白成分と し てグラ イ シ ン、 i ラ イ シ ン、 ァラ ニン、 ヒ スチジン、 ノ リ ン、 ァスパルチ ッ ク ァ シ ド、 卜 レオニン、 イ ソ ロ イ シン、 セ リ ン、 ロ イ シ ン . グ'ルタ ミ ッ ク ァシ ド、チ ロ シン、 プロ リ ン、 フエ 二ルァラ ニ ン、 メ チ才ニ ン を含 有し、 抗腫瘍免疫增強効果を持つ蛋白多糖体 （G 009)を生成する株 菌、 ガノ デノレマ ノレシダム (Ganoderma lucidum) IY 009.
SUBSTITUTE SHEET
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001032192A1 (en) * 1999-11-01 2001-05-10 Sakamoto Bio Co., Ltd. Active substance in ganoderma lucidum extract and drugs, health foods and cosmetics containing the same
CN117683645A (zh) * 2024-02-04 2024-03-12 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 一种亮盖灵芝菌株l4914及其栽培方法与应用

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2322491C1 (ru) * 2006-06-13 2008-04-20 Общество с ограниченной ответственностью "Сириус" Штамм lecanicillium sp. 347а - продуцент комплекса биологически активных соединений
RU2007145748A (ru) * 2007-12-11 2009-06-20 ОАО Завод экологической техники и экопитания "ДИОД" (RU) Штамм гриба hypsizygus ulmarius (bull.) redhead s-ulm1, используемый для получения средства, обладающего противоопухолевой активностью и антиоксидантным действием и способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью и антиоксидантным действием, на основе этого штамма
RU2373276C1 (ru) * 2008-06-25 2009-11-20 Татьяна Германовна Михеева Штамм гриба penicillium verrucosum, используемый для получения средства, обладающего иммуномодулирующими свойствами, и средство-иммуномодулятор на его основе
RU2416418C1 (ru) * 2009-12-10 2011-04-20 Открытое Акционерное Общество Завод Экологической Техники И Экопитания "Диод" Способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, и средство, полученное этим способом (варианты)
RU2418062C1 (ru) * 2009-12-25 2011-05-10 Лариса Михайловна Краснопольская Способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью, и средство, обладающее противоопухолевой активностью
RU2499040C2 (ru) * 2011-07-15 2013-11-20 Федеральное государственное образовательное бюджетное учреждение высшего профессионального образования "Российский государственный университет нефти и газа имени И.М. Губкина" Способ получения средства, обладающего противоопухолевой активностью
CN106029642B (zh) 2014-01-27 2019-11-29 阿彻丹尼尔斯米德兰公司 含果糖的原料向含hmf的产物的转化
US10208006B2 (en) 2016-01-13 2019-02-19 Stora Enso Oyj Processes for the preparation of 2,5-furandicarboxylic acid and intermediates and derivatives thereof
WO2019014382A1 (en) 2017-07-12 2019-01-17 Stora Enso Oyj PURIFIED PRODUCTS OF THE 2.5-FURANDICARBOXYLIC ACID PATHWAY

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5452796A (en) * 1977-09-30 1979-04-25 Sato Akihiko Production of krebshemmende substance
JPS5775926A (en) * 1980-10-29 1982-05-12 Teikoku Chem Ind Corp Ltd Production of antitumor substance

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chem. Pharm. Bull., Vol. 29, No. 12, 1981, MIYAZAKI T. et al. "Studies on fungal poly saccharides 27. structural examination of a water soluble anti tumor poly saccharido of Ganoderma-lucidum" p. 3611-3616. *
J, Chin. Agric. Chem. Soc., Vol. 26, No. 4, 1988, HSEU R-S. et al. "Identification of Ganoderma-Iucidum and Ganoderma-tsugae by cultural studies and the incompatibility test" p. 588-596. *
J. Pharmaco bio-Dyn., Vol. 12, No. 2, 1989, MARUYAMA H. et al. "Antitumor activity of Sarcodon-aspratus berk. S. ito and Ganoder-malucidum Fr. Karst" p. 118-124. *
Nippon Nogeikagaku Kaishi, Vol. 59, No. 11, 1985, MIZUNO T. et al. "Fractionation Chemical modification and antitumor activity of mater-insoluble polysaccarides of the fruiting-body of Ganoderma-Incidum" p. 1143-1152 *
Nippon Nougeikagaku Kaishi, Vol. 58, No. 9, 1984, MIZUNO T. et al. "Fractionation Structural features and antitumor activity of water-soluble polysaccharide from reishi the fruitbody of Ganoderma-lucidum" p. 871-880. *
See also references of EP0563383A4 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001032192A1 (en) * 1999-11-01 2001-05-10 Sakamoto Bio Co., Ltd. Active substance in ganoderma lucidum extract and drugs, health foods and cosmetics containing the same
JP2001131083A (ja) * 1999-11-01 2001-05-15 Sakamoto Bio:Kk 鹿角霊芝抽出物活性物質及びそれを含む医薬、健康食品、化粧料
CN117683645A (zh) * 2024-02-04 2024-03-12 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 一种亮盖灵芝菌株l4914及其栽培方法与应用
CN117683645B (zh) * 2024-02-04 2024-05-24 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所 一种亮盖灵芝菌株l4914及其栽培方法与应用

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