JPH084494B2 - 抗腫瘍免疫増強効果のある蛋白多糖体（Ｇ００９）を生成するガノデルマルシダム（Ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍ）ＩＹ００９ - Google Patents
抗腫瘍免疫増強効果のある蛋白多糖体（Ｇ００９）を生成するガノデルマルシダム（Ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍ）ＩＹ００９Info
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- JPH084494B2 JPH084494B2 JP4-500088A JP50008892A JPH084494B2 JP H084494 B2 JPH084494 B2 JP H084494B2 JP 50008892 A JP50008892 A JP 50008892A JP H084494 B2 JPH084494 B2 JP H084494B2
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- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は抗腫瘍免疫増強効果のある蛋白多糖体を生成
する菌株に関するものである。本発明者等は新しい抗腫
膓、免疫増強効果のある蛋白多糖体の探索を目的に多数
の担子菌類を各地域別に採集してその担子菌類が生成す
る蛋白多糖体の分離を試図した。その結果、全羅南道海
南郡頭倫山一帯で採集したガノデルマ（Ganoderma）属
に属する担子菌類を適当な培地で培養して、抗腫瘍及び
免疫増強効果のある蛋白多糖体を生成することを発見し
た。生成された蛋白多糖体を分離してその理化学的性質
及び生物学的性質を検討したところ、これを抗腫瘍、免
疫増強効果のある蛋白多糖体G 009と命名し、これを生
成する菌株をガノデルマ ルシダム（Ganoderma lucidu
m）IY 009と命名した。このガノデルマ ルシダムIY 00
9菌株は社団法人韓国種菌協会に1990.11.22日付で寄託
番号KFCC−10709号で寄託された。その後、このIY−009
菌株は、1993年12月１日に韓国種菌協会の国際寄託に切
換えられ、KCCM−10045として国際寄託されている。本
発明はG 009を生成する菌株IY 009に関するものであ
る。高等菌に属する担子菌類から薬効成分である抗菌成
分、幻覚生成、毒成分コレステロール降下成分等に関し
て研究して来たが最近に到り抗癌成10分と免疫機能増強
作用の研究が活発に進行している担子菌類の重要性が高
くなっている。ここに本発明者等は抗癌成分及び免疫機
能増強作用のある物質を分泌する菌株を分離、液内培養
してその薬理効果を研究中、現在まで分離同定されたガ
ノデルマ属の種（species）より卓越した抗癌効果及び
免疫増強作用を持つ変種の株菌を分離し菌糸体の液内培
養方法を確立し、この培養された菌糸体から抽出した成
分の抗癌効果及び免疫増強効果を確認した。これに対し
本発明者等は次の実施例及び実験例で本発明を説明す
る。
する菌株に関するものである。本発明者等は新しい抗腫
膓、免疫増強効果のある蛋白多糖体の探索を目的に多数
の担子菌類を各地域別に採集してその担子菌類が生成す
る蛋白多糖体の分離を試図した。その結果、全羅南道海
南郡頭倫山一帯で採集したガノデルマ（Ganoderma）属
に属する担子菌類を適当な培地で培養して、抗腫瘍及び
免疫増強効果のある蛋白多糖体を生成することを発見し
た。生成された蛋白多糖体を分離してその理化学的性質
及び生物学的性質を検討したところ、これを抗腫瘍、免
疫増強効果のある蛋白多糖体G 009と命名し、これを生
成する菌株をガノデルマ ルシダム（Ganoderma lucidu
m）IY 009と命名した。このガノデルマ ルシダムIY 00
9菌株は社団法人韓国種菌協会に1990.11.22日付で寄託
番号KFCC−10709号で寄託された。その後、このIY−009
菌株は、1993年12月１日に韓国種菌協会の国際寄託に切
換えられ、KCCM−10045として国際寄託されている。本
発明はG 009を生成する菌株IY 009に関するものであ
る。高等菌に属する担子菌類から薬効成分である抗菌成
分、幻覚生成、毒成分コレステロール降下成分等に関し
て研究して来たが最近に到り抗癌成10分と免疫機能増強
作用の研究が活発に進行している担子菌類の重要性が高
くなっている。ここに本発明者等は抗癌成分及び免疫機
能増強作用のある物質を分泌する菌株を分離、液内培養
してその薬理効果を研究中、現在まで分離同定されたガ
ノデルマ属の種（species）より卓越した抗癌効果及び
免疫増強作用を持つ変種の株菌を分離し菌糸体の液内培
養方法を確立し、この培養された菌糸体から抽出した成
分の抗癌効果及び免疫増強効果を確認した。これに対し
本発明者等は次の実施例及び実験例で本発明を説明す
る。
実施例
蛋白多糖体の分離
１）菌株：ガノデルマ ルシダム菌株は全羅南道海南郡
の頭倫山一帯で採集して分離、同定した。
の頭倫山一帯で採集して分離、同定した。
２）保存培地：ジャガイモ デキストロース 寒天（Po
tato dextrose agar:PDA）傾斜培地；ジャガイモ デキ
ストロース培地（Difco,U.S.A.）39gを蒸留水に溶かし
て１にし、121℃において20分間高圧滅菌の後傾斜培
地に作った。
tato dextrose agar:PDA）傾斜培地；ジャガイモ デキ
ストロース培地（Difco,U.S.A.）39gを蒸留水に溶かし
て１にし、121℃において20分間高圧滅菌の後傾斜培
地に作った。
液内培養用培地：葡萄糖50g,ペプトン20g,KH2PO40.87g,
MgSO4.7H2O0.5g,FeCl2.6H2O10mg,MnCl2.4H2O7mg,CuSO4.
5H2O10mg,ZnCl24mgに蒸留水を加えて１にした。
MgSO4.7H2O0.5g,FeCl2.6H2O10mg,MnCl2.4H2O7mg,CuSO4.
5H2O10mg,ZnCl24mgに蒸留水を加えて１にした。
このpHを5.5に調整して121℃、20分間高圧蒸気で滅菌し
た。
た。
３）培養：保管中の菌株をPDA傾斜培地に移植して25±
１℃に７日間成長させた後、発育した菌糸を無菌的に分
離して液内培養用培地100mlの入った500ml三角フラスコ
に移し25±１℃において180rpmで菌糸体が直径３−5mm
程度の成熟した菌塊を形成するまで７−10日間振盪培養
した。得られた菌塊を微細粉砕機で10秒間粉砕した後、
液内培養用培地100mlの入った500ml三角フラスコに５％
（V/V）ずつ接種し、25％±１℃の温度でオビタル振盪
培養器（回転半径１吋ビジョン科学Co.）で170回転／分
で７日間振盪培養した。
１℃に７日間成長させた後、発育した菌糸を無菌的に分
離して液内培養用培地100mlの入った500ml三角フラスコ
に移し25±１℃において180rpmで菌糸体が直径３−5mm
程度の成熟した菌塊を形成するまで７−10日間振盪培養
した。得られた菌塊を微細粉砕機で10秒間粉砕した後、
液内培養用培地100mlの入った500ml三角フラスコに５％
（V/V）ずつ接種し、25％±１℃の温度でオビタル振盪
培養器（回転半径１吋ビジョン科学Co.）で170回転／分
で７日間振盪培養した。
４）蛋白多糖類の抽出及び分離
培養の終わった培養液全体を6000rpmで15分間遠心分離
した後、菌糸体だけを取って２倍容量の2.5N NaOH溶液
に浸潤させた後、室温で24時間放置して6000rpで15分間
遠心分離し、上澄液を取って氷醋酸でpH7.4に中和した
後、ビスキング チューブ（Visking tube:Sigma,U.
S.）を利用して３日透析した。透析の終わった後濃縮し
て３倍のエタノールを加え４℃で24時間放置した後6000
回転で15分間遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物を
脱イオン水で溶解して6000回転で15分間遠心分離して上
澄液を濃縮し、凍結乾燥させて蛋白多糖体を分離した。
した後、菌糸体だけを取って２倍容量の2.5N NaOH溶液
に浸潤させた後、室温で24時間放置して6000rpで15分間
遠心分離し、上澄液を取って氷醋酸でpH7.4に中和した
後、ビスキング チューブ（Visking tube:Sigma,U.
S.）を利用して３日透析した。透析の終わった後濃縮し
て３倍のエタノールを加え４℃で24時間放置した後6000
回転で15分間遠心分離して沈殿物を得た。この沈殿物を
脱イオン水で溶解して6000回転で15分間遠心分離して上
澄液を濃縮し、凍結乾燥させて蛋白多糖体を分離した。
５）蛋白多糖類の精製
上記の試料を水に溶解して過量のエタノールを加えた後
得られた沈殿物12.5g（菌糸培養物1300ml中）を取って
水に再び溶解せた。この試料液をディイーエイイーセル
ロース（DEAE−Cellulose,Cl−form）Coiumn（3cm×60c
m）に適用した後、水で溶出して得られた溶出分劃200ml
に同量のメタノールを加え遠心分離して沈殿物をエタノ
ールで洗浄した後減圧乾燥してG1（2.1g）を得た。
得られた沈殿物12.5g（菌糸培養物1300ml中）を取って
水に再び溶解せた。この試料液をディイーエイイーセル
ロース（DEAE−Cellulose,Cl−form）Coiumn（3cm×60c
m）に適用した後、水で溶出して得られた溶出分劃200ml
に同量のメタノールを加え遠心分離して沈殿物をエタノ
ールで洗浄した後減圧乾燥してG1（2.1g）を得た。
上澄液（400ml）はエタノール100mlを加えて遠心分離し
た後、得られた沈殿物を減圧乾燥してG2（0.42g）を
得、G2を除去して残った上澄液800mlに再びエタノール8
00mlを加えて得られた沈殿物を減圧乾燥してG3（1.1g）
を得た。G1（2.1g）を水に溶解してセファデックスジ−
100（Sephadex G−100）に適用して水で溶出した。チュ
ーブNo.25−33の分劃物を凍結乾燥してG4（1.5g）を
得、チューブNo.34−44の分劃物を合わせたG5（0.3g）
を減圧乾燥して分離した。G4を水に再び溶解して0.15M
セタブロン（Cetavelon;Cethyl−trimethly ammonium b
romide）と0.1Mボレート緩衝液（Borate buffer pH8.
0）が同量で混合された溶液を同量加えた後、0.5MNaOH
でpHを9.0に調整して沈殿物（G7）と上澄液（G6）を取
った。G7に2Mの氷醋酸を加えて溶解した後、３倍のメタ
ノールを加えて沈殿物を得た。
た後、得られた沈殿物を減圧乾燥してG2（0.42g）を
得、G2を除去して残った上澄液800mlに再びエタノール8
00mlを加えて得られた沈殿物を減圧乾燥してG3（1.1g）
を得た。G1（2.1g）を水に溶解してセファデックスジ−
100（Sephadex G−100）に適用して水で溶出した。チュ
ーブNo.25−33の分劃物を凍結乾燥してG4（1.5g）を
得、チューブNo.34−44の分劃物を合わせたG5（0.3g）
を減圧乾燥して分離した。G4を水に再び溶解して0.15M
セタブロン（Cetavelon;Cethyl−trimethly ammonium b
romide）と0.1Mボレート緩衝液（Borate buffer pH8.
0）が同量で混合された溶液を同量加えた後、0.5MNaOH
でpHを9.0に調整して沈殿物（G7）と上澄液（G6）を取
った。G7に2Mの氷醋酸を加えて溶解した後、３倍のメタ
ノールを加えて沈殿物を得た。
ここで得られた沈殿物をメタノールとアセトンで洗浄し
た後減圧乾燥した（G8）。G8を少量の水に溶解してセフ
ァロース シーエル−4B（Sepharose CL−4B）に適用し
た後水で溶出してチューブNo.25−30でG9を得、チュー
ブNo.31−46でG10を得た。
た後減圧乾燥した（G8）。G8を少量の水に溶解してセフ
ァロース シーエル−4B（Sepharose CL−4B）に適用し
た後水で溶出してチューブNo.25−30でG9を得、チュー
ブNo.31−46でG10を得た。
実験例１
抗癌実験
上で得た分劃物の肉腫180に対する活性実験は下記の
如く行った。20−25gICR雄性マウスの腹腔内で１週間間
隔に移植して継代した肉腫180（Sarcoma−180）の細胞
を実験用の腫瘍細胞として使用した。マウス腹腔で７日
間培養した肉腫−180の細胞を腹水と共に取って氷冷、
滅菌した食塩水を加えて4000rpmで５分間遠心分離して
細胞沈殿物を分離した。分離した細胞を生理食塩水で３
回洗浄した後１×107細胞/mlになるよう稀釈した。
如く行った。20−25gICR雄性マウスの腹腔内で１週間間
隔に移植して継代した肉腫180（Sarcoma−180）の細胞
を実験用の腫瘍細胞として使用した。マウス腹腔で７日
間培養した肉腫−180の細胞を腹水と共に取って氷冷、
滅菌した食塩水を加えて4000rpmで５分間遠心分離して
細胞沈殿物を分離した。分離した細胞を生理食塩水で３
回洗浄した後１×107細胞/mlになるよう稀釈した。
この細胞浮遊液0.1mlをマウス１群を10匹にして左側鼠
蹊部皮下に移植した。腫瘍細胞移植後72時間経過後、連
続して10日間精製された分劃物である蛋白多糖類を投与
した。
蹊部皮下に移植した。腫瘍細胞移植後72時間経過後、連
続して10日間精製された分劃物である蛋白多糖類を投与
した。
対照群には生理食塩水を、処置群には生理食塩水に溶解
した蛋白多糖類を20mg/kgの濃度で0.1mlずつ投与した。
した蛋白多糖類を20mg/kgの濃度で0.1mlずつ投与した。
腫瘍細胞を移植してから、30日目になる日マウスを致死
させ、誘発された固形癌を摘出した後、その重量を測定
して平均腫瘍重量を求め下記式により腫瘍阻止百分率を
計算した。
させ、誘発された固形癌を摘出した後、その重量を測定
して平均腫瘍重量を求め下記式により腫瘍阻止百分率を
計算した。
I.R:Percent Inhibition Ratio
Cw :対照群の平均腫瘍重量
Tw :処置群の平均腫瘍重量
このような肉腫−180を利用した抗癌実験の結果は表
１に表わした如く対照群に比して処置群において最も優
秀な効果のあるG9を選択してG 009と称し、これに対す
る分析は下記の実験例で行った。
１に表わした如く対照群に比して処置群において最も優
秀な効果のあるG9を選択してG 009と称し、これに対す
る分析は下記の実験例で行った。
G 009の化学的分析のため総糖はアントロン発色法、蛋
白質含量はローリー（Lowry）等の方法で測定した後ア
ミノ酸、構成糖類を分析し、結果を表2.3.4に表し、糖
類分析クロマトグラムは第１図にアミノ酸クロマトグラ
ムは第２図に、I.Rの分析は第３図に表した。糖類分析
の為のG.L.C.（Shimadzu GC OA,Japan）使用の条件： Column ３％OV−17（80−100）（Mesh shimalite） 3mmφ×1 Boronsilicate glass Column TemperatureColumn 150−180℃ Gradient,Detector 190
℃ Flow rate N2:50ml/min H2:60ml/min.（0.6kg/cm2） Air:60ml/min.（0.6kg/cm2） Attenuation 102×24a.f.s（ampere full scale） アミノ酸自動分析器（Beckman Sis.6300,U.S.A）使用の
分析条件： Column 2.6×200mm Ion exchange resin ＃338076（Beckman） Flow rate Buffer solution 0.33ml/min Ninhydrin 0.17ml/min Analysis cycle time 60min Column pressure 2100psi（147kg/cm2） Ninhydrin pressure 100psi（7kg/cm2） Column temperature 50−70℃ Gradient N2 gas pressure 40psi（2.8kg/cm2） Rcaction bath temperature 130℃ Wave length 570nm,440nm 実験例２ G 009の投与経路に伴う抗癌効果の変化 ICR雄性マウス20−25gの腹腔内で１週間間隔で移植して
継代した肉腫−180細胞を実験用腫瘍細胞として使用し
た。マウス腹腔で７日間培養した肉腫−180細胞を腹水
と共に取って氷冷、滅菌した食塩水を加えて3000rpmで
５分間遠心分離して細胞沈殿物を分離した。
白質含量はローリー（Lowry）等の方法で測定した後ア
ミノ酸、構成糖類を分析し、結果を表2.3.4に表し、糖
類分析クロマトグラムは第１図にアミノ酸クロマトグラ
ムは第２図に、I.Rの分析は第３図に表した。糖類分析
の為のG.L.C.（Shimadzu GC OA,Japan）使用の条件： Column ３％OV−17（80−100）（Mesh shimalite） 3mmφ×1 Boronsilicate glass Column TemperatureColumn 150−180℃ Gradient,Detector 190
℃ Flow rate N2:50ml/min H2:60ml/min.（0.6kg/cm2） Air:60ml/min.（0.6kg/cm2） Attenuation 102×24a.f.s（ampere full scale） アミノ酸自動分析器（Beckman Sis.6300,U.S.A）使用の
分析条件： Column 2.6×200mm Ion exchange resin ＃338076（Beckman） Flow rate Buffer solution 0.33ml/min Ninhydrin 0.17ml/min Analysis cycle time 60min Column pressure 2100psi（147kg/cm2） Ninhydrin pressure 100psi（7kg/cm2） Column temperature 50−70℃ Gradient N2 gas pressure 40psi（2.8kg/cm2） Rcaction bath temperature 130℃ Wave length 570nm,440nm 実験例２ G 009の投与経路に伴う抗癌効果の変化 ICR雄性マウス20−25gの腹腔内で１週間間隔で移植して
継代した肉腫−180細胞を実験用腫瘍細胞として使用し
た。マウス腹腔で７日間培養した肉腫−180細胞を腹水
と共に取って氷冷、滅菌した食塩水を加えて3000rpmで
５分間遠心分離して細胞沈殿物を分離した。
分離された細胞を生理食塩水で３回洗浄した後１×107
細胞/mlになるよう稀釈した。この細胞懸濁液をマウス
１群を10匹にして１×106細胞/0.1mlをマウスの左側鼠
蹊部に移植した。隔日制で10回筋肉、皮下及び腹腔注射
は20mg/kgを、静脈注射は隔日制で５回を10mg/kgで投与
し対照群も同じ方法で生理食塩水0.1mlずつを投与して3
0日経過後固形癌の重量を測定して比較した。
細胞/mlになるよう稀釈した。この細胞懸濁液をマウス
１群を10匹にして１×106細胞/0.1mlをマウスの左側鼠
蹊部に移植した。隔日制で10回筋肉、皮下及び腹腔注射
は20mg/kgを、静脈注射は隔日制で５回を10mg/kgで投与
し対照群も同じ方法で生理食塩水0.1mlずつを投与して3
0日経過後固形癌の重量を測定して比較した。
表５に表れた如く、全ての投与方法において差異が殆ど
無く固形癌の成長が抑制させた。
無く固形癌の成長が抑制させた。
実験例３
G 009の投与に依る寿命延長効果
マウスの生体内でG 009の抗癌活性を測定するためエー
ルリッヒカシノマ細胞（Ehrlich ascite tumors:EAT）
を使用した。EAT細胞を１×106,5×107細胞/mlをマウス
に腹腔注射して移植し24時間経過後G 009を燐酸緩衝塩
溶液に溶解して100mg/kgの投与量で12日間継続して腹
腔、経口投与し20日、25日、30日、50日の平均寿命を測
定した。
ルリッヒカシノマ細胞（Ehrlich ascite tumors:EAT）
を使用した。EAT細胞を１×106,5×107細胞/mlをマウス
に腹腔注射して移植し24時間経過後G 009を燐酸緩衝塩
溶液に溶解して100mg/kgの投与量で12日間継続して腹
腔、経口投与し20日、25日、30日、50日の平均寿命を測
定した。
対照群は生理食塩水を同量、同時に投与した。表６に表
わした如くG 009の腹腔投与と静脈投与がほぼ似た水準
の抗癌効果を表し対照群よりも顕著な寿命延長効果をも
たらした。
わした如くG 009の腹腔投与と静脈投与がほぼ似た水準
の抗癌効果を表し対照群よりも顕著な寿命延長効果をも
たらした。
実験例４
トリパン ブルー（Trypan Blue）処理したマウスでのG
009の抗癌効果 ICR雄性マウス20−25gの腹腔内で１週間間隔で移植して
継代した肉腫−180細胞を実験用腫瘍細胞として使用し
た。
009の抗癌効果 ICR雄性マウス20−25gの腹腔内で１週間間隔で移植して
継代した肉腫−180細胞を実験用腫瘍細胞として使用し
た。
マウス腹腔で７日間培養した肉腫−180細胞を腹水と共
に取って氷冷、滅菌した食塩水を加えて4000rpmで５分
間遠心分離して細胞沈殿物を分離した。分離された細胞
を生理食塩水で３回洗浄した後１×107細胞/mlになるよ
う稀釈して0.1mlずつマウス鼠蹊部に皮下注射した。
に取って氷冷、滅菌した食塩水を加えて4000rpmで５分
間遠心分離して細胞沈殿物を分離した。分離された細胞
を生理食塩水で３回洗浄した後１×107細胞/mlになるよ
う稀釈して0.1mlずつマウス鼠蹊部に皮下注射した。
１日経過後4mg/mouse（0.4ml）のTrypan Blueを腹腔投
与した。再び１日経過後１回に1mg/mouse（0.1ml）で３
日間隔で総13mg/mouseとなるようトリパン ブルーを皮
下注射し、トリパン ブルーの投与直後G 00910mg/kgを
静脈注射した。対照群はG 009投与の代わりに生理食塩
水で注射して処置群と対照群のマウス数は各々10匹にし
た。
与した。再び１日経過後１回に1mg/mouse（0.1ml）で３
日間隔で総13mg/mouseとなるようトリパン ブルーを皮
下注射し、トリパン ブルーの投与直後G 00910mg/kgを
静脈注射した。対照群はG 009投与の代わりに生理食塩
水で注射して処置群と対照群のマウス数は各々10匹にし
た。
腫瘍移植30日経過後マウスを致死させ腫瘍の重量を測定
した。G 009に対するトリパン ブルー効果に対する上
の実験結果は表７の通りであり、このような実験結果は
大食細胞不活性化因子であるトリパン ブルーを処理す
ることに依り本発明の抽出成分であるG 009が抗癌効果
と関連のある大食細胞を活性化させていることを知るこ
とが出来、又G 009がＴ−淋巴球の抗癌活性と共に大食
細胞の機能を活性化してやることに依り抗癌効果を現す
ものと見られる。
した。G 009に対するトリパン ブルー効果に対する上
の実験結果は表７の通りであり、このような実験結果は
大食細胞不活性化因子であるトリパン ブルーを処理す
ることに依り本発明の抽出成分であるG 009が抗癌効果
と関連のある大食細胞を活性化させていることを知るこ
とが出来、又G 009がＴ−淋巴球の抗癌活性と共に大食
細胞の機能を活性化してやることに依り抗癌効果を現す
ものと見られる。
実施例５
新生マウスの胸腺切除後G 009投与と抗胸腺グロブリン
効果 ２日令ICRマウスの胸腺切除はスジョジン（Sjodin）の
方法で施行し、胸腺切除の６週後マウス鼠蹊部に肉腫−
180の１×107細胞懸濁液を0.1mlずつ移植した。移植24
時間後隔日間隔で10回20mg/kgの投与量でG 009を筋肉注
射した。胸腺切除されたマウスの感染防止のため実験期
間中テトラサイクリン−HCI（Tetracycline−HCl）を含
んだ給水をした。
効果 ２日令ICRマウスの胸腺切除はスジョジン（Sjodin）の
方法で施行し、胸腺切除の６週後マウス鼠蹊部に肉腫−
180の１×107細胞懸濁液を0.1mlずつ移植した。移植24
時間後隔日間隔で10回20mg/kgの投与量でG 009を筋肉注
射した。胸腺切除されたマウスの感染防止のため実験期
間中テトラサイクリン−HCI（Tetracycline−HCl）を含
んだ給水をした。
抗胸腺血清の分離はTadakuma方法を使用したところ２−
３週令のマウスから胸腺を切除して胸腺細胞を分離した
後、燐酸塩緩衝溶液に稀釈して細胞懸濁液に作った後１
×109細胞/mlの胸腺細胞を３週間隔で３家兎に静脈注射
して免疫化させた。最終注射後１週間経過後抗胸腺血清
を取って56℃で30分間不活性化させた。
３週令のマウスから胸腺を切除して胸腺細胞を分離した
後、燐酸塩緩衝溶液に稀釈して細胞懸濁液に作った後１
×109細胞/mlの胸腺細胞を３週間隔で３家兎に静脈注射
して免疫化させた。最終注射後１週間経過後抗胸腺血清
を取って56℃で30分間不活性化させた。
この不活性化された抗胸腺血清から1gG（免疫グロブリ
ン Ｇ）分劃をアンモニウム スルフェートで沈殿させ
て分離した後１×107細胞/mlの肉腫−180を接種して１
日経ったマウスに10日間0.1mlの投与量で腹腔注射し、G
009は肉腫−180移植１日後隔日間隔で20mg/kgの投与量
で５回筋肉注射した。
ン Ｇ）分劃をアンモニウム スルフェートで沈殿させ
て分離した後１×107細胞/mlの肉腫−180を接種して１
日経ったマウスに10日間0.1mlの投与量で腹腔注射し、G
009は肉腫−180移植１日後隔日間隔で20mg/kgの投与量
で５回筋肉注射した。
上の実験結果は表８に表れた如くG 009の抗癌効果はＴ
−細胞の機能と関連して胸腺切除されたマウスが対照群
より抗癌効果が顕著に低く、抗胸腺グロブリン処理群で
も正常の家兎グロブリンのシュド（pseudo）−処理群で
ある対照群より抗癌効果が減少するのを見ることが出来
る。それ故このような実験結果はG 009がＴ−細胞の機
能を活性化させることに依り抗癌効果を表すと看做され
る。
−細胞の機能と関連して胸腺切除されたマウスが対照群
より抗癌効果が顕著に低く、抗胸腺グロブリン処理群で
も正常の家兎グロブリンのシュド（pseudo）−処理群で
ある対照群より抗癌効果が減少するのを見ることが出来
る。それ故このような実験結果はG 009がＴ−細胞の機
能を活性化させることに依り抗癌効果を表すと看做され
る。
実験例６
G 009が補体系に及ぼす影響
補体はギニア ピグ（Guinea pig）血清と人間の新鮮な
血清を使用し、赤血球は緬羊赤血球を使用し抗体は抗緬
羊溶血素（Anti sheep−hemolysin）を使用した。
血清を使用し、赤血球は緬羊赤血球を使用し抗体は抗緬
羊溶血素（Anti sheep−hemolysin）を使用した。
補体系活性実験は下記の如く行った。
試験管に150μｌのゼラチンベロナール緩衝液（GVB2+）
と試料50μｌを加えた後、これに50μｌの補体（100uni
ts/ml）を添加し、37℃で30分間反応させた後、GVB2+を
加えて補体濃度を1units/mlに調整した。これらの混合
物を溶血素（Hemolysin;2MHU/mlに感作した緬羊赤血球
細胞（５×108細胞/ml）2mlずつを添加しGVB2+溶液で調
整された補体混合物を1.0,1.2,1.6unitを各々加えた後G
VB2+溶液で総量が5mlになるように調整した。
と試料50μｌを加えた後、これに50μｌの補体（100uni
ts/ml）を添加し、37℃で30分間反応させた後、GVB2+を
加えて補体濃度を1units/mlに調整した。これらの混合
物を溶血素（Hemolysin;2MHU/mlに感作した緬羊赤血球
細胞（５×108細胞/ml）2mlずつを添加しGVB2+溶液で調
整された補体混合物を1.0,1.2,1.6unitを各々加えた後G
VB2+溶液で総量が5mlになるように調整した。
37℃で60分間反応させた後2500rpmで５分間遠心分離し
た上澄液の吸光度を541nmで測定した。
た上澄液の吸光度を541nmで測定した。
活性度は対照群とG 009の補体消費量（％）であり、表
９に表れた如くG 009の濃度に比例して補体消費量が増
加し、このような結果はG 009が免疫系の重要防御機能
中の一つである補体系に機能を活性化させてやることに
依り免疫増強作用を表すものと考えることが出来る。
９に表れた如くG 009の濃度に比例して補体消費量が増
加し、このような結果はG 009が免疫系の重要防御機能
中の一つである補体系に機能を活性化させてやることに
依り免疫増強作用を表すものと考えることが出来る。
実験例７
免疫に関連した臓器重量に対するG 009の効果
G 009を10mgの投与量でマウスに静脈注射した後５日後
肺、肝、脾臓を摘出して、これらの重量を測定し、リゾ
チーム（Lysozyme）は燐酸塩緩衝溶液（pH6.2）で溶解
したストレプトコッカス リソデイクス（Streptococcu
s lysodeicus）を基質にして反応させた後、その活性は
660nmの吸光度を測定した。
肺、肝、脾臓を摘出して、これらの重量を測定し、リゾ
チーム（Lysozyme）は燐酸塩緩衝溶液（pH6.2）で溶解
したストレプトコッカス リソデイクス（Streptococcu
s lysodeicus）を基質にして反応させた後、その活性は
660nmの吸光度を測定した。
表10に表した通りG 009の処理群において脾臓の重量と
リゾチームの活性度が増加した理由はG 009が大食細胞
を活性化させてリゾチームの活性値が増加したためであ
り、免疫機能に関連した脾臓の重量が増加したものと見
られる。
リゾチームの活性度が増加した理由はG 009が大食細胞
を活性化させてリゾチームの活性値が増加したためであ
り、免疫機能に関連した脾臓の重量が増加したものと見
られる。
実験例８
マウスの溶血班形成細胞数にG 009が及ぼす影響
１）実験動物として20−25gの雄性マウスの１群を５匹
として、試料を20g/kgの濃度で連続して腹腔注射した。
として、試料を20g/kgの濃度で連続して腹腔注射した。
最後の投与７日後、緬羊赤血球を１×106細胞/ml濃度で
腹腔注射して免疫させた後、緬羊赤血球投与４日後脾臓
を摘出した。ブレンダー（blender）で氷冷の平衡塩溶
液と共に粉砕して脾臓細胞を遊離させた。
腹腔注射して免疫させた後、緬羊赤血球投与４日後脾臓
を摘出した。ブレンダー（blender）で氷冷の平衡塩溶
液と共に粉砕して脾臓細胞を遊離させた。
これを2000rpmで５分間遠心分離して、上澄液を除去
し、赤血球を除去するため0.83％塩化アンモニウム溶液
に浮遊させて37℃で３分間放置した。
し、赤血球を除去するため0.83％塩化アンモニウム溶液
に浮遊させて37℃で３分間放置した。
再び遠心分離して氷冷の平衡塩溶液に浮遊させた後、赤
血球除去脾臓細胞数を血球計で測定した。
血球除去脾臓細胞数を血球計で測定した。
２）アルセベル溶液［葡萄糖20.5g,塩化ナトリウム4.2
g,クエン酸ナトリウム8.0gをILの蒸留水に溶解した後、
ミリポア濾過器（0.45μｍ）で濾過して使用］に懸濁し
た緬羊赤血球を平衡塩溶液で2000rpmで５分間４回反復
して洗浄し、最終濃度が10％になるよう平衡塩溶液に浮
遊させた。
g,クエン酸ナトリウム8.0gをILの蒸留水に溶解した後、
ミリポア濾過器（0.45μｍ）で濾過して使用］に懸濁し
た緬羊赤血球を平衡塩溶液で2000rpmで５分間４回反復
して洗浄し、最終濃度が10％になるよう平衡塩溶液に浮
遊させた。
３）平板皿に1.5％アガー（Noble agar,Difco.）10mlを
注いで基底層平板を作った。再び0.7％アガー2mlに１）
の脾臓細胞100μｌと２）の緬羊赤血球100μｌを混合し
た後、平板皿に注ぎ均一に広がるようにした。
注いで基底層平板を作った。再び0.7％アガー2mlに１）
の脾臓細胞100μｌと２）の緬羊赤血球100μｌを混合し
た後、平板皿に注ぎ均一に広がるようにした。
これを37℃で60分間感作化させた後、補体として吸収さ
れたギニアピグ血清を平衡塩溶液で10倍稀釈して2.5ml
ずつ加えて37℃で30分間培養し後、形成された溶血班形
成細胞数及び脾臓細胞全体中の溶血班形成細胞は、（PF
C/脾臓）を計算して表示した。
れたギニアピグ血清を平衡塩溶液で10倍稀釈して2.5ml
ずつ加えて37℃で30分間培養し後、形成された溶血班形
成細胞数及び脾臓細胞全体中の溶血班形成細胞は、（PF
C/脾臓）を計算して表示した。
表11に表れた結果から見てG 009が全体脾臓細胞数及び
溶血班形形成細胞数の顕著なる増加原因を招来するので
免疫増強作用に関連していることを知ることが出来る。
溶血班形形成細胞数の顕著なる増加原因を招来するので
免疫増強作用に関連していることを知ることが出来る。
実施例９
免疫刺戟作用
毎グループ当10匹にして生後６週たった20−25gの雄性I
CR系マウスを使用した。G 009を生理食塩水に溶解し各
濃度別溶液0.2mlをマウスに腹腔内投与する。投与24時
間後1mlのペリカン ドローイング インク17 ブラッ
ク（Perican Drawing Ink 17 Black,Gunther−Wagner C
o.,Ltd.製造）と３％（V/V）のゼラチンを含有する生理
食塩水2mlを混合して製造した炭素懸濁液0.2mlをマウス
の尾に静脈注射した後1,5,10及び15分にヘパリンで被覆
されたヘマトクリト毛細管を利用して眼目窩で血液0.02
mlを採採取して直ちに0.1％（V/V）の炭酸ナトリウム水
溶液1.6mlに稀釈及び溶血させる。
CR系マウスを使用した。G 009を生理食塩水に溶解し各
濃度別溶液0.2mlをマウスに腹腔内投与する。投与24時
間後1mlのペリカン ドローイング インク17 ブラッ
ク（Perican Drawing Ink 17 Black,Gunther−Wagner C
o.,Ltd.製造）と３％（V/V）のゼラチンを含有する生理
食塩水2mlを混合して製造した炭素懸濁液0.2mlをマウス
の尾に静脈注射した後1,5,10及び15分にヘパリンで被覆
されたヘマトクリト毛細管を利用して眼目窩で血液0.02
mlを採採取して直ちに0.1％（V/V）の炭酸ナトリウム水
溶液1.6mlに稀釈及び溶血させる。
この溶液を675nmで比色し、食作用指数（Ｋ値）をハル
ペルン等（Halpern et al）の等式により測定する。
ペルン等（Halpern et al）の等式により測定する。
対照群はマウスに生理食塩水0.2mlを投与する。
上記式で
Co＝to時間での血液中の炭素粉末含量であり
Ｃ＝ｔ時間で血液中の炭素粉末含量である。
上の試験に対する結果を表12に表しG 009の濃度に比例
して免疫食作用指数（Ｋ）が高く表れており、このよう
な結果から見てG 009が免疫反応に関与して免疫増強作
用を表すものと見られる。
して免疫食作用指数（Ｋ）が高く表れており、このよう
な結果から見てG 009が免疫反応に関与して免疫増強作
用を表すものと見られる。
実験例10
G 009に対する急性毒性試験はマウス、ラット家兎に対
し行い、G 009投与後14日目に測定した。
し行い、G 009投与後14日目に測定した。
表13に表れた如く投与経路や種（species）によっても
致死は無かったのでG 009は毒性が極めて低い安全な物
質である。
致死は無かったのでG 009は毒性が極めて低い安全な物
質である。
実験例11
菌種間の特性比較
本発明者等は全国各地域で採取したガノデルマ ルシダ
ム（Ganoderma lucidum）菌株の抗癌効果を検索した結
果、抗癌効果が優秀であると判断される４種と標準菌種
（農村振興庁 農業技術庁研究所 菌茸課保有）の系統
間分類及び生理遺伝的差異を糾明するため次の如き実験
を行った。
ム（Ganoderma lucidum）菌株の抗癌効果を検索した結
果、抗癌効果が優秀であると判断される４種と標準菌種
（農村振興庁 農業技術庁研究所 菌茸課保有）の系統
間分類及び生理遺伝的差異を糾明するため次の如き実験
を行った。
実験材料及び方法
使用菌株、培地及び培養
本実験に使用した菌株は国内に自生する霊芝（Ganoder
−lucidun）の内抗癌効果が優秀であると判断される４
菌株を使用し、収集源は表14の通りである。
−lucidun）の内抗癌効果が優秀であると判断される４
菌株を使用し、収集源は表14の通りである。
試料の抽出
液内培養した培養物を遠心分離して得られた菌糸体を燐
酸塩緩衝塩液（phosphate buffered saline:pH7.5）で
３回洗浄した後、菌体を氷冷して30秒間超音波処理し
た。
酸塩緩衝塩液（phosphate buffered saline:pH7.5）で
３回洗浄した後、菌体を氷冷して30秒間超音波処理し
た。
これを1200xgで遠心分離した後、上澄液を電気泳動試料
に使用した。
に使用した。
蛋白質定量
試料中の蛋白質は牛血清アルブミン（bovin serum albu
min:BSA）を標準物質に使用してBCA蛋白分析試薬（prot
ein assayreagent Pierce Co.）を使用して定量した。
min:BSA）を標準物質に使用してBCA蛋白分析試薬（prot
ein assayreagent Pierce Co.）を使用して定量した。
電気泳動
電気泳動は不連続緩衝系（discontinuous buffer syste
m）を利用した。分離ゲル（separating gel）は240mMト
リス−HCl緩衝液（pH8.48）に10％T,10％Ｃ濃度にし、
スタック ゲル（stacking gel）はTris緩衝溶液（39.5
mM Tris,0.064N H3 PO4に3.125％T,20％Ｃ濃度でゲルを
調剤した。
m）を利用した。分離ゲル（separating gel）は240mMト
リス−HCl緩衝液（pH8.48）に10％T,10％Ｃ濃度にし、
スタック ゲル（stacking gel）はTris緩衝溶液（39.5
mM Tris,0.064N H3 PO4に3.125％T,20％Ｃ濃度でゲルを
調剤した。
Gelを固めるためにTEMEDとammonium persulfateを使用
した。ランニング緩衝（running buffer）で陽極には40
mMトリス グリシン緩衝液（pH8.8）を、陰極には60mM
トリス−HCl緩衝液（pH7.47）を使用し、試料は70μｇ
ずつをゲルに装填（loading）して４℃で100Vで２時間
展開した。
した。ランニング緩衝（running buffer）で陽極には40
mMトリス グリシン緩衝液（pH8.8）を、陰極には60mM
トリス−HCl緩衝液（pH7.47）を使用し、試料は70μｇ
ずつをゲルに装填（loading）して４℃で100Vで２時間
展開した。
ゲルの染色
（１）エステラーゼ（E.C.3,1,1,1）
展開したゲルを0.2M燐酸塩緩衝液（pH6.5）に30分間浸
漬させた。沈漬される間、新しい緩衝液で３回交換して
やった。沈漬の終わったゲルの酸度を調整した後、発色
液（α−naphthylacetate20mg,ethylene glycolmonomet
hyl ether 2ml,fast blue RR salt20mg,0.2M phosphate
buffer 120ml）を加えて暗い場所で35℃で30分間徐々
に振ってやりながら発色させた。
漬させた。沈漬される間、新しい緩衝液で３回交換して
やった。沈漬の終わったゲルの酸度を調整した後、発色
液（α−naphthylacetate20mg,ethylene glycolmonomet
hyl ether 2ml,fast blue RR salt20mg,0.2M phosphate
buffer 120ml）を加えて暗い場所で35℃で30分間徐々
に振ってやりながら発色させた。
（２）アシド ホスファターゼ（E.C.3,1,3,2）
ゲルを0.1M醋酸塩緩衝液（pH5.2）に浸漬してゲル内の
酸度を調整した後、発色液（10％MgCl,溶液6ml,fast ga
rnet GBC salt 70mg,α−naphthylphosph 80mg,β−nap
hthylphosphate 40mg,0.1M acetate buffer 100ml）を
加え37℃で30分間発色させた。
酸度を調整した後、発色液（10％MgCl,溶液6ml,fast ga
rnet GBC salt 70mg,α−naphthylphosph 80mg,β−nap
hthylphosphate 40mg,0.1M acetate buffer 100ml）を
加え37℃で30分間発色させた。
（３）ロイシン アミノ ペプチダーゼ（E.C.3,4,11,
1） ゲルに発色液［Ｌ−leucyl−β−naphthylamide HCl 20
mg,fast balck K salt 20mg,distilled water 50mg,0.2
M Tris malate buffer（pH5.4）120ml］を加えて暗い場
所で30分間発色させた。
1） ゲルに発色液［Ｌ−leucyl−β−naphthylamide HCl 20
mg,fast balck K salt 20mg,distilled water 50mg,0.2
M Tris malate buffer（pH5.4）120ml］を加えて暗い場
所で30分間発色させた。
（４）ペルオキシダーゼ（E.C.1,11,1,7）
ゲルを水洗した後、発色液（Benzidine lg,acetic acid
9ml,mixed solution of 1 part of benzidine solutio
n mixed with 40ml of distilled water,1 part of 0.0
3％ H2O2 and 4 parts of distilled water）を加えて
暗い場所で発色させた。
9ml,mixed solution of 1 part of benzidine solutio
n mixed with 40ml of distilled water,1 part of 0.0
3％ H2O2 and 4 parts of distilled water）を加えて
暗い場所で発色させた。
このような実験結果を説明すれば下記の通りである。
エステラーゼの同位酵素パターン（pattern）
霊芝のエステラーゼ バンド（esterase band）は第１
図におけると同じく総計17個が表れたが、５と15番目の
バントは全ての菌株で殆ど共通的に見えた。標準菌株で
あるFr07004とFr07008及びIY005菌株のエステラーゼパ
ターンは極めて類似していたが、IY 009とIY 010の菌株
のエステラーゼ パターンは他の菌株と大きな差異のあ
ることを知ることが出来た。
図におけると同じく総計17個が表れたが、５と15番目の
バントは全ての菌株で殆ど共通的に見えた。標準菌株で
あるFr07004とFr07008及びIY005菌株のエステラーゼパ
ターンは極めて類似していたが、IY 009とIY 010の菌株
のエステラーゼ パターンは他の菌株と大きな差異のあ
ることを知ることが出来た。
アシド ホスファターゼの同位酵素パターン
第５図に表れたように標準菌株Fr07004,Fr07008及びIY0
05菌株のアシド ホスファターゼのパターン間には極め
て類似した様相を表したが、IY 009とIY 010の場合は他
の菌株とは相違したバンドのパターンを見せた。
05菌株のアシド ホスファターゼのパターン間には極め
て類似した様相を表したが、IY 009とIY 010の場合は他
の菌株とは相違したバンドのパターンを見せた。
ロイシン アミノ ペプチダーゼの同位酵素パターン
霊芝では全部３個のロイシン アミノ ペプチダーゼ
バンドが現れ、このうち標準菌株であるFr07004,Fr0700
8及びIY005は大大部分同様な様相を表したが、IY 009は
これらとは全然異なる様相を表した（第５図）。
バンドが現れ、このうち標準菌株であるFr07004,Fr0700
8及びIY005は大大部分同様な様相を表したが、IY 009は
これらとは全然異なる様相を表した（第５図）。
ペルオキシダーゼの同位酵素パターン
霊芝菌株では２個のペルオキシダーゼ バンドが表れた
が標準菌株であるFr07004,Fr07008及びIY005の間には類
縁関係が多かった（第５図）。
が標準菌株であるFr07004,Fr07008及びIY005の間には類
縁関係が多かった（第５図）。
菌種間の類縁関係
表14に表れているように、霊芝の標準菌株であるFr0700
8とIY005の間には93.8％,Fr07004とIY 005の間には82.4
％の高い類縁関係を見せているが、Fr07004とIY 010及
びFr07004とIY 009の間には各々30.4％と31.8％の比較
的低い類縁関係を見せた。
8とIY005の間には93.8％,Fr07004とIY 005の間には82.4
％の高い類縁関係を見せているが、Fr07004とIY 010及
びFr07004とIY 009の間には各々30.4％と31.8％の比較
的低い類縁関係を見せた。
以上のような結果から同一種内の同位酵素パターンの差
異は地理的環境の差異に伴う遺伝的変異に依り生化学的
変化を誘発することに依り表れることを知ることが出
来、このような差異が菌株毎に抗癌活性が異なる蛋白多
糖体を生成することと関連のあるものと見られる。
異は地理的環境の差異に伴う遺伝的変異に依り生化学的
変化を誘発することに依り表れることを知ることが出
来、このような差異が菌株毎に抗癌活性が異なる蛋白多
糖体を生成することと関連のあるものと見られる。
図面の簡単な説明
第１図は本発明蛋白質多糖類G 009の糖類分析クロマ
トグラム、 第２図は本発明蛋白多糖類G 009のアミノ酸クロマト
グラム、 第３図は本発明蛋白多糖類G 009のI.R分析、 第４図は本発明菌株IY 009菌糸体の顕微鏡写真であ
り、 第５図は本発明菌株IY 009の特異性比較図である。
トグラム、 第２図は本発明蛋白多糖類G 009のアミノ酸クロマト
グラム、 第３図は本発明蛋白多糖類G 009のI.R分析、 第４図は本発明菌株IY 009菌糸体の顕微鏡写真であ
り、 第５図は本発明菌株IY 009の特異性比較図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
(Ｃ１２Ｐ 21/00
Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (1)
- 【請求項１】抗腫瘍免疫増強効果を有する蛋白多糖体G
009を産生するガノデルマ ルシダムIY009菌株。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1990/19877 | 1990-12-04 | ||
| KR1019900019877A KR920008374B1 (ko) | 1990-12-04 | 1990-12-04 | 항종양 면역증강효과가 있는 단백다당체(G 009)를 생성하는 가노데르마루시덤(Ganoderma lucidum) IY 009 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO1992010562A1 JPWO1992010562A1 (ja) | 1993-11-04 |
| JPH084494B2 true JPH084494B2 (ja) | 1996-01-24 |
| JPH084494B1 JPH084494B1 (ja) | 1996-01-24 |
Family
ID=19307028
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4-500088A Expired - Lifetime JPH084494B2 (ja) | 1990-12-04 | 1991-12-04 | 抗腫瘍免疫増強効果のある蛋白多糖体（Ｇ００９）を生成するガノデルマルシダム（Ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍ）ＩＹ００９ |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0563383A4 (ja) |
| JP (1) | JPH084494B2 (ja) |
| KR (1) | KR920008374B1 (ja) |
| AU (2) | AU8951591A (ja) |
| CA (1) | CA2097821C (ja) |
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