WO1992012244A1

WO1992012244A1 - Genes codant pour le cochon d'inde et des recepteurs du facteur d'activation plaquettaire humain

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Publication number: WO1992012244A1
Application number: PCT/JP1991/001779
Authority: WO
Inventors: Zen-Ichiro Honda; Takao Shimizu; Motonao Nakamura
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1990-12-27
Filing date: 1991-12-27
Publication date: 1992-07-23
Anticipated expiration: 1993-06-27
Also published as: EP0517926A1; EP0517926A4

Description

明細書モルモット血小板活性化因子受容体およびヒト血小板活性化因子受容体をコ - ドする追伝子技術分野

この発明は血小板活性化因子受容体をコ - ドする遣伝子、特に、モルモット血小板活性化因子受容体およびヒト血小板活性化因子受容体をコ一ドする遣伝子に関する。背景技術

血小板活性化因子（ P 1 a t e 1 e t - a e t i V a t i π g f a c t o r. 以下 P A F と略記する）は、新しいタイプの脂質メディエーターであり、最初ゥサギ好塩基球由来の血小板凝集因子（ジャーナル * ォブ · ェクスペリメンタル · メディスン 136 巻 1356 頁（ 1972) ) 、および腎髄質に存在する降圧物質（ジャーナル ♦ 才ブ ♦ クリニカル ♦ インべスティゲーシヨン 39巻

266頁（ 1960 ) ) として認識された。この P A Fは、現在ではアレルギー、炎症などの病態に関するケミカルメディエーターとして非' に重要視されている。代表的な生理活性として血小板、好中球、単球などの活性化、好酸球の遊走性、血管透過性促進、降圧、気管支収縮、胃や小腸の虚血性壊死などが挙げられる。いずれの作用も P A Fを特異的に認識する受容体が細胞あるいは組織に存在し、そこに P A Fが結台することにより '1き起こされると考えられる。しかし、 P A F は極めて疎水性が強く、容易に脂質二重層に侵入するため受容体結合実験は難しく、受容体の精製も非常に困難である。また、現在 P A F受容体は情報伝達の際、 G T P結合タンパク質と共役することがわかっているが、受容体遺伝子のク口一二ングは報告されていない。したがって、 P A F受容体を高発現する形質転換細胞を作り、有用なァゴニスト，アンタゴニストの開発や P A F定量法の確立を行なうことも不可能であった o

上述のように、 P A F受容体の結合実験や精製は非常に困難であるため、有効なァゴニスト，アン夕ゴニストの開発は遅れている。したがって、今後これらの開発、およびアレルギー、炎症などのメカニズムの解明においては、 P A F受容体を発現する逍伝子を決定し、 · P A F受容体を高発現する形質転換細胞を形成することが必要不可欠である。発明の開示

この発明、モルモット P A F受容体をコ一ドする遣伝子を提供することを目的とする。

また、この発明は、ヒト P A F受容体をコードする遺伝子を提供することをも目的とする。

本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究を重ねた結果、モルモット P A F受容体およびヒト P A F受容休のァミノ酸配列を初めて決定し、これをコードする追伝子（ c D N A ) を調製した。

モルモット P A F受容体は、笫 1図に示すァミノ酸配列を有する。この発明による遺伝子（ c D N A) は、このモルモット P A F受容体をコードするものであり、第 2図に示す塩基配列を有する。

第 2図に示す配列から明らかなように、この c D N Aは、塩基番号 1から塩基番号 1029の合計 1029塩基対からなる。塩基番号 1から 3は翻訳開始遺伝暗号に相当し、塩基番号 1027 から 1029までは翻訳停止遺伝暗号に相当する。なお、第 2図に示す塩基配列において、塩基番号 1027から 1029の N N Nは、 T G A， T A Aまたは T A Gのいずれでもよい。また、翻訳開始暗号および翻訳停止暗号は任意の塩基対と結合することができる。この塩基対の種類および数は重要ではなく、バクテリァ等が有する核外遺伝子と連結するための適当な塩基対であればよい。例えば、翻訳開始暗号は第 3図に示す塩基配列を有する塩基対と、翻訳停止暗号は第 4図に示す塩基配列を有する塩基対と、それぞれ結合することができる。

また、ヒト P A F受容体は、第 5図に示すアミノ酸配列を有する。この発明による他の追伝子（ c D N A) は、このヒト P A F受容体をコードするものであり、第 6図に示す塩基配列を有する。

笫 6図に示す配列から明らかなように、この c D N Aは、塩基番 '' j' 1から塩基番 j- 1029の合計 1029塩基対からなる。塩基 S号 1から 3は翻訳始逍伝暗号に相当し、塩基番号 1027 から 1029までは翻訳停止逍伝暗号に相当する。なお、第 6図に示す塩基配列において、塩基番号 1027ないし 1029の N N N は、 T G A, T A Aまたは T A Gのいずれでもよい。また、翻訳開始暗号および翻訳停止暗号は、それぞれ任意の塩基対と結合することができる。この塩基対の種類および数は重要ではなく、パクテリァ等の核外遺伝子と連結するための適当な塩基対であればよい。例えば、翻訳開始暗号は第 7図に示す塩基配列を有する塩基対と、翻訳停止暗号は第 8図に示す塩基配列を有する塩基対と、それぞれ結合することができる。

この発明によるモルモット P A F受容体をコードする逍伝子（ c DNA) は、モルモット肺 mRNA由来の c D NAラィブラリ一から、例えばァフリカッメガエル卵母細胞を用いた遺伝子発現系を利用し、受容体遺伝子の発現を電気生理学的に検知する方法で得ることができる。すなわちライブラリ一内の c D N Aを踌型にしてイン * ビトロで R N Aを合成し、これを卵母細胞にマイクロインジクトして細胞内で翻訳させる。もし、マイクロインジェクトした RNAの中に目的とする P A F受容体をコードするものが存在すれば、それを翻訳した卵母細胞は P A F受容体を発現し、 P A Fに触れることにより、 P A F受容休と G T P結合タンパク質の共役—ホスホリパーゼ Cの活性化— I P 3 の上昇" *C a ^{2 +}の上昇という情報伝達の後、最終的に C 1 ^_ チヤンネルが開口する。

このチャネルの開口は、電気生理学的手法（ボルテージ * クランプ（voltage c lamp ) 法）により、膜電流の変化という形で検知できる。仮に、ファージライブラリー内の

6x 10⁴ 個の c DNAを鋅型にして P A F受容体追伝子の存 ^を示唆する上記レスポンスが得られたとすると、これを順次分割して上記検定を繰り返すことにより最終的に 1つの目的とするクローンを得ることができる。

こうして得られた c D N Aは、次に、適当なベクタ一（プラスミド、ファージ等）に挿入し、これを宿主となるバクテリァ中に導入して大量に生産させることができる。

なお、この発明によるモルモット P A F受容体をコ一ドする遺伝子を得るための c D N Aライブラリ一はモルモット由来で P A F受容体結合活性のある臓器に由来するものであれば、いずれのものでもよい。例えば、モルモット白血球 c D NAライブラリーやモルモット腎臓 c DNAライブラリーを fflいることができる。

このようにして、モルモット P A F受容体を作るために必要な全ての遺伝情報を持つこの発明の c D N Aが得られる。

また、この発明によるヒト P A. F受容体をコ一ドする追伝子（ c D NA) は、ヒト白血球 mRNA由来の c D NAライブラリーから、たとえばプローブハイブリダィゼーション法を利用して得ることができる。この方法によれば、すでに塩基配列がわかつている上記モルモット P A F受容体追伝子をプローブとして用い、 c D NAライブラリーからプローブと相補的な塩基配列を持つ D N Aを得ることができる。

こうして得られた c D N Aは、適当なベクター（プラスミド、ファージ等）に揷入し、これを宿主となるバクテリア中で大量に生産させることができる。

なお、この ¾明によるヒト P A F受容休をコ― ドする遗伝子を' るための c D N Aライブラリーはヒト由来で P A F受容体結合活性のある臓器に由来するものであれば、いずれのものでもよい。例えば、ヒト肺 c D N Aライブラリーゃヒト腎臓 c D N Aライブラリ一を用いることができる。

このようにして、ヒト P A F受容体を形成するために必要な全ての遺伝情報を有するこの発明の c D N Aが得られる。図面の簡単な説明

第 1図は、モルモット P A F受容体のァミノ酸配列を示す図、

第 2図は、この発明によるモルモット P A F受容体をコードする遺伝子の塩基配列を示す図、

第 3図は、この発明によるモルモット P A F受容体をコードする遺伝子の翻訳開始暗号が結合し得る塩基対の塩基配列を示す図、

第 4図は、この発明によるモルモット P A F受容体をコードする遣伝子の翻訳停止暗号が結合し得る塩基対の塩基配列を示す図、

第 5図は、ヒト P A F受容体のアミノ酸配列を示す図、第 6図は、この発明によるヒト P A F受容体をコードする逍伝子の塩基配列を示す図、

第 7図は、この発明によるヒト P A F受容体をコードする追伝子の翻訳開始暗号が結合し得る塩基対の塩基配列を示す図、

第 8図は、この発明によるヒト P A F受容休をコードする追伝子の翻訳停止暗号が結合し得る塩基対の塩基配列を示す図、第 9図は、アフリカッメガエル卵母細胞にモルモット P A F受容体遺伝子を含む 6 X 10⁴ 個のファージ群由来の R N A をマイクロインジェクトし、その発現をボルテージ ♦ クランプ法により測定した結果を示す図、

第 10図は、アフリカッメガエル卵母細胞に、単一化したモルモット P A F受容体遺伝子を鋅型として合成した R N Aをマイクロインジェク卜し、その発現をボルテージ ♦ クランプ法により測定した結果を示す図。

第 11図は、 C 0 S細胞内発現用プラスミド p E U K P A F の構築の過程を示す図。

第 12図は、プラスミド p E U K P A Fを導入した C O S 7 細胞における P A F受容体結合活性のデータを示す図。

第 13図は、水をマイクロインジェク卜したアフリカッメガエル卵母細胞をボルテ -ジ ♦ クランプ法で測定した結果を示す図。

笫 14図は、クローン化したヒト P A F受容体追伝子を鋅型にして合成した： R N Aを、アフリカッメガエル卵母細胞にマイク口インジェクトし、その発現をボルテージ · クランプ法により測定した結粜を示す図。

^ 15図は、 C 0 S細胞内発現用プラスミド p E U K h P A Fの構築の過程を示す図。

笫 16図は、プラスミド p E U K h P A Fを導入した C 0 S 7細胞における P A F受容体結合活性を示すグラフ。発明を荬施するための^良の形態以下、この発明を実施例により説明する。もっとも、この発明は下記実施例に限定されるものではないことは明かである。なお、下記実施例において、各操作は、特に明示がない限り、マ二.ァテイス（Maniai is) ら、モレキュラー ♦ クローニング · ラボラトリーマニュアル第 2版（ 1989) コールド * スプリング · ハーバ一記載の方法により行なった。また、制限酵素は市販のものを用い、その具体的使用法は市販品の指示書に従った。

実施例 1

この実施例においては、第 2図に示す塩基配列を有する遺伝子に、塩基番号 1の側に第 3図に示す配列を有する塩基対、塩基番号 1029の側に第 4図に示す配列を有する塩基対がそれぞれ結合した塩基配列を有する D N Aの製造法、およびこれを用いた形質転換体の作製を説明する。

( 1 ) モルモット肺 m R N Aの調製

ハートレー系モルモット、メス（約 350 g ) 2匹から肺 (約 5g) を取出し、ただちに凍結して、 mR N Aの分解を防いだ。この肺を液体窒素で冷却しながら、ハンマーで粉砕し、 3001 1 の 0 ^/10：緩街液（ 6M グァニジンチオシァネ一ト， 5m Mクェン酸ナトリウム， 17m Mサルコシルナトリゥム， 0.7 % /3—メノレカプトエタノール）を加えながらホモジナイズした。得られたホモジネートは、室温において 3, 000 x gで 5分問遠心し、上清を別のチューブへ移した。このホモジネートの上淸 25 m 1 を、 0. 1 M E D T Aを含む 5.7 M 塩化セシウムのクッション（ 8m l ) の上に重層し、日立 S R P 28ローターを用いて、 15 にぉぃて26, 000 >< 2で65時間遠心した。遠心後、褐色および茶褐色のタンパク質層、および D N A層をァスピレーターで除去した。チューブの底に沈澱した R N Aを T E S緩衝液（ lOOmM Tr i s - H C 1 ,

5m M E D T A, 1 % S D S , pH7. 5 ) 1m l に溶解し、フエノールークロロホルム（ 1 ： 1 ) で抽出した。 R N Aを含む水層に、 3M酢酸ナトリウム 0. 1 m 1 、冷却したェタノール 2m 1 を加え、 R N Aを沈澱させた。遠心分離により回収した R N Aは、 80%エタノールで洗浄後、真空乾燥させ、滅菌蒸留水に溶解した。

次に、得られた R N A水溶液を、以下の手順でオリゴ

( d T ) セルロースカラムに通し、ポリ（A) を有する m R N Aを分離した。すなわち、滅菌蒸留水に溶解した R N Aに、 2倍容の平衡化緩衝液（0. 5 M N a C 1 , 20mM Tris- H C 1 , lm M E D T A, 0. 1 % S D S , pH7. 6 ) を加え、 6 5 で 5分間熱処理を施した後、予め平衡化緩衝液で平衡化したオリゴ（ d T) セルロースカラムにかけ、 10倍容の平衡化緩衝液で洗^した。洗净後、溶出緩衝液（20mM Tris - H C 1 , 1 m M E D T A, pH7. 6 ) で m R N Aを溶出して、エタノール沈澱により回収し、 80%エタノールで洗浄後、真空乾燥-し、滅 W蒸溜水に溶解した。

次に、 m R N Aを以下の乎順で 5〜30%ショ糖密度勾配遠心分離によりサイズ分刚した。まず、 5〜30%のショ糖密度勾配をもつ溶液（10 m M Tr i s - H C 1 1 m M E D T A, 0. 1 % S D S , pH7. 5 ) に、 65 Cで 5分問熱処理した R N Aを約 150〃 g重層し、日立 R P S 40Tローターを用いて、 15。Cにおいて、 2 000x gで， 18時間遠心した。遠心後、 0.4 m lずつの画分に分画し、それぞれの画分からエタノール沈澱により、 RNAを回収した。各画分の一部を 1%ァガロースゲルで電気泳動して、 18S r RNAを含む画分を同定し、それより大きい分子量の R N Aを含む画分を用いて以下のじ D NA合成を行なった。

(2) c D N Aライブラリーの作製

調製した mRNAからの c DNA合成は、フアルマシア社から市販されている c D NA合成システムを甩い、製品に添付されているプロトコールに従って行なった。すなわち、逆転写酵素により m R N Aに相補的な c D N Aを合成した後、リボヌクレア一ゼ Hで、 R N A鎩にニックとギヤップを入れ、これを T4 DNAポリメラーゼを用いて修復合成することにより、 RNA鎖を c D NA鎖に置換した。最後に、大腸菌 D NAポリメラ一ゼ Iのクレノーフラグメントにより、 c D N A鎖の両端を平滑化した。続いて、ストラテジーン社から市販されている； I Z A P Hライブラリーシステムを用いて、 c D N Aライブラリ一を作製した。方法は、すべて製品に添付されているプロトコールに従って行なった。すなわち、まず、合成 c D N Aの両端に / R Iアダプタ一（ク / I s i t eを持たないもの）を付加し、これと予め / Vク R Iで切断処理が施されている； Ι ΖΑ Ρ Πアームとを連結した。その後、インビトロパッケージングを行ない、大腸菌 X L I 一 B 1 u e株

(製品に付属）に感染させることにより、 c D NAライブラリーを作製した。

( 3 ) P A F受容体をコードする c D N Aクローンの選抜 c D N Aライブラリーからの P A F受容体遺伝子のスクリ一二ングには、サブスタンス K受容体遺伝子（ネィチヤ一、第 329巻、 836頁（ 1987) ) や、セロトニン 1 c受容体遺伝子（サイエンス、第 241巻、 558頁（1988) ) のクローニングと同様の方法、すなわちアフリカッメガエル卵母細胞の逍伝子発現系を利用する方法を採用した。

まず、ライブラリーを 6x 10⁴ 個ずつのファージ群に分け、そこから常法通り、すなわちポリエチレングリコール沈澱、フエノールークロロホルム（ 1 ： 1 ) 処理、数回のエタノール沈澱を行なうことによりファージ D N Aを調製した。このファージ D N A (約は、 T 7プロモーターの下流に位置する / I サイトを切断後、イン · ビ卜口での R N A合成のための鋅型とした。 R N A合成は、 0. 5mM Cap 一アナ口グ 7—メチルー G p p p G, 0. 5m A T P , 0. 5m M U T P， 0. 5m M C T P , 0. 05m M G T Pの存在下、 40m M Tr i s - H C 1 pH 7. 9) , 100^ g / m 1 B S A , 10m M D T T , 6m M g C 1 ₉ , 2m スペルミジン， 1 gノ 1 ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビタ一を含む反応液巾で、 10ュニットの T 7 R N Aポリメラーゼを 37 Cで 60分問反応させることにより行った。反応後、フエノール— クロ口ホルム（ 1 ： 1 ) 処理、エタノール沈澱により ί 成 R N Aを回収し、 ^終的に 1 g / 1 の濃度になるよう滅菌蒸留水に溶解した。次に、合成 R N Aのマイクロインジェクション用卵母細胞を調製した。まず、氷中で麻酔したアフリカッメガエル（浜松実験動物供給所より購入）の腹をハサミで約 5mm切り、ピンセットで卵母細胞の塊を 1〜 2g取り出した。この塊を直ちに、 3m l の M B S (88m M N a C 1 , 1 m M C 1 , 2.4mM N a H C 03 , 15mM Tris - H C 1 _f 0.3 mM C a (N 0₃ ) ₂ · 4 Η ₀ 0, 0.41m M C a C " • 4 H ₂ 0, 0.82mM M g S 0₄ · 7 H ₂ 0, \ μ s / m l ペニシリンナトリウム塩、ストレブ卜マイシン硫酸塩， ρΠ.6 ) を入れたミニシャーレの中に入れ、 3回 M B Sで洗浄した後、 0.2 % (w/v)コラゲナーゼ · タイプ II (シグマ社製）を含む M B S中において室温で 1.5 時間処理した。処理後、卵母細胞の塊を新しい M B Sで 4〜 5回洗浄し、実体顕微鏡下でピンセットを使って卵母細胞表面の濾胞細胞膜を取り除いた。こうして膜を除いた卵母細胞に、合成 RN Aを 50η 1ずつマイクロインジェク卜し、その後、 20。Cの M B S中で 3日問培養することにより注入 R N A由来のタンパクを合成させた。

卵母細胞内で合成させたタンパク質中に P A F受容体が含まれるか否かは、リガンド依存性の C a ^{ώ +}感受性 C 1 _ チヤンネルの開口を指標として判断した。これは、ボルテージ ' クランプ法を用いて膜^位の変化を測定することで検定できた。

実体顕微鏡下に 0.5 m 1 の漕をセッ卜し、リンゲル液

( H5mM N a C 1 , 2m M K C 1 、 5m M H E P E 3

S , 1.8m C a C 1 ₂ , lm g Zm l B S A , pH7. 2 ) で漕内を灌流しながら漕内に卵母細胞を置き、ボルテージ · クランプした。この場合、コマンド電位は、リンゲル液内でのじ 1 " のリバーサルポテンシャル以下（通常 -50 -100 m V) に設定した。ボルテージ · クランプを維持した状態で、 1(Γ'Μの P A Fを含むリンゲル液を流したが、 P A F受容体が発現している卵母細胞に閲しては、その受容体に P A Fカ結合することにより、 G T P結合蛋白質の活性化—ホスホリパーゼ Cの活性化—細胞内 C a ^{2 +}の上昇→ C 1 " チャンネルの開口という一連の反応が進み、シグナルとして外向きの CI amp 電流が得られた。このシグナルは、 6X 10⁴ 個のファジ群を 5種類スクリーニングした時点で、その中の 1群から得られた。その時のレスポンスを第 9図に示す。図に示す様に、 G T P結合蛋白質に連関する受容体に特有とされる典型的な二相性のタイ厶コースを持つ膜電流が観察された。以下、レスポンスを見ながら 6x 10⁴ 個のファージ群を顺次分割して、 7回のサイクルの後にシングルクローンを得ることができた。第 10図は、シングルクローンを铸型として合成した R N Aをマイクロインジヱクトした際に得られたレスボンスを示す。

得られたファージクローン力、ら、 f 1ヘルファージ R 408 (ストラテジーン社製）を使ったプラスミドレスキュ一法により、インサートを含むプラスミド（ Z p 74) を回収した。この際の詳細な方法は、すべてストラテジーン社のプ口卜コールに従った。 Z p 74の c D N Aィンサー卜の長さは、約 3 K b pであった。

(4 ) c D NAインサートの全塩基配列の決定

c D NAインサー卜の全塩基配列をキロシークェンス用ディレーシヨンキット（宝酒造（株）より購入）、およびシ一クエネース D NAシークユンスキッ卜（東洋紡（株）より購入）を用いて決定した。決定した全塩基配列を第 2図、第 3 図および笫 4図に示す。ここで、第 3図に示す配列は第 2図に示す配列の塩基番号 1の塩基に結合しており、第 4図に示す配列は第 2図に示す配列の塩基番号 1029の塩基に結合している。クローン Z p 74は、 3017塩基対を揷入 D N Aとして含み、翻訳開始遺伝暗号 A T Gから翻訳停止遺伝暗号 T A Gまでの 1029塩基対を、連続した最も大きなオープンリーディングフレームとして有していた。第 2図に示す D N A塩基配列から誘導されるアミノ酸配列を第 1図に示した。

( 5 ) モルモッ卜 P A F受容体遣伝子の C O S細胞内発現を @的とした発現用プラスミド p E U K P A Fの構築

クロ一ニングしたモルモット P A F受容体遺伝子を培養細胞 C 0 Sに導入し、発現の有無を調べるために第 11図に示す発現ブラスミドを構築した。

C 0 S細胞内発現用ベクター p E U K— C 1 (クロンテツク社製）は、東泎紡（株）より購入した。このベクターは、導人逍伝子の転写開始のための S V40後期プロモーターと、 S V 40後期ポリアデニレーションシグナルを持ち、その ί¾に 5個のクロ一ニングサイトを持っている。

まず、 5〃 gの Ζ ρ 74を 5ュニッ卜の H I と X" Iで消化し、得られた反応物を 1%ァガロースゲル電気泳動にて分離した。そして、このァガロースゲル中の R A F受容体遺伝子を含む約 3K b pの D N A断片を、 Gene clean (バイオテック社製）を用いて添付のプロトコールに従って回収し、エタノール沈澱後、滅菌蒸留水に溶解した。

次に、 5 gの発現用べクタ一 P E U K— C 1 も 5ュニッ卜の / H I と X" I で消化した後、同様の方法で、約 4.8 K b pの D N A断片を回収し、滅菌蒸留水に溶解した。

上述の 2種類の回収 D N A断片、すなわち約 200n gの

P A F受容体追伝子を含む D N A断片と約 50n gのベクター D N A断片を混合した後、結合反応を行なった。この反応は、夕カラ ♦ ライゲ一ションキットを用い、添付のプロトコールに従って行なった。この反応液を用いて常法により、大腸菌 X L 1 - B 1 u eを形質転換し、アンピシリン耐性

(A m p " ) のコロニーを得、このコロニーよりプラスミド D N Aを回収した。回収したプラスミドが目的とするものであることは、 H I と i'ho I で消化した後、ァガ口一スゲル電気泳動にて確認した。このようにして、 C O S細胞内発現 fflプラスミド p E U K P A Fを構築することができた。

( 6 ) モルモット P A F受容体追伝子の C 0 S 7細胞内での発現

上記 ( 5 ) で構築した C 0 S細胞内発現ブラスミド p E U K P A Fを C O S細胞の一種である C O S 7細胞に^人し、 P A F受容体迫伝子の発現の有無を調べた。 ¾験は、以ドの 3つのステップで逃めた。 ( a ) プラスミド p E U K P A Fの C 0 S 7細胞への導入 C O S 7細胞は、 20%ゥシ胎児血清（ベーリンガー · マンハイム社製）， 0.6 g / 1 L一グルタミン， 1. 5 g / 1 炭酸水素ナトリウム， 100ユニット Zm l ペニシリン， 50 // g / m 1 ストレプ卜マイシンを補足した D M E M培地 (日水製薬（株）社製）で、 37 C， 5% C 0₂ の条件下で培養した。プラスミド導入の際に、細胞数は、 10' 個/ m 1 のオーダーに調製した。導入方法は、フアルマシア社製セルフェク卜 · トランスフエクションキットを用い、添付のプロ卜コールに従った。プラスミドを導入した細胞は、さらに 3日間培養を続け、導入遺伝子の発現を待った。

( b ) 形質転換細胞からの膜画分の調製

培養後、培養容器の底面に付着した形質転換細胞は、培溶液を十分懸濁し、 4 において 800 x gで 10分間遠心することにより回収した。沈澱した細胞は、氷冷した H E P E S緩街液（25mM H E P E S , lOmM M g C 1 , 0.25M スクロース， ρΗ7.4 ) に懸濁し、氷上で懸濁液をホモジヱナィズすることで完全に破砕した。

P A F受容体結合実験に供する膜画分は、この破砕液を 4°Cにおいて 800 X gで】0分間遠心後、上清をさらに 4°Cにおいて 40， 000 X gで 20分間遠心分離し、得られた沈澱物を H E P E S緩街液に懸濁したものを用いた。

c ) C 0 S 7細胞で発現した P A F受容体の確認形赏転換細胞に P A F受容体が発現していることは、調製した膜画分における P A F受容体結合活性の有無を測定することで確認した。この実験は、トリチウムラベルされた P A Fアンタゴニス卜 W E B 2086 (N E N社製）を用いて行なつた。まず、の反応緩衝液（25mM H E P E S , 10 m M M g C 1 ₂ , 0. 1 % B S A, pH7.4 ) に ΙΟΟη Μ, 50n M, 25n M, 12, 5 π Mあるいは 6. 25 n Mの [ ³H] W E B 2086を加え、これに（ b ) で調製した 1 の膜画分を入れて 25 で 90分間反応させた。反応後、該反応液を直ちにグラスフィルター（ワットマン社製、 G F Z C ) に通して膜画分をグラスフィルターに吸着させ、さらにグラスフィノレ夕一を反応緩衝液で十分洗浄することで未吸着の [ JH] W E B 2086を除いた。その後、このグラスフィルタ一を 80。Cで 30 分間乾燥し、液体シンチレーションを加えて力ゥン卜を測定した。なお、 [ ³H] W E B 2086の膜への非特異的吸着も知るために、各ポイントで反応系に 10 P A Fを存在させた場合の結合カウントも測定した。第 12図は、その結果を示したものである。第 12図において、〇は特異的な結合、豢は非特異的な結合を表している。これにより、形質転換細胞膜上に P A F受容体が発現していることが確認できた。

実施例 2

この実施例においては、第 6図に示す塩基配列を有する遺伝子において、塩基 S 1 の塩基に笫 7図に示す配列を有する塩 S対が、また塩 S番 ^ 1029の塩基に第 8図に示す配列を有する塩基対がそれぞれ結合した塩基配列を有する D N Aの製造法、およびこれを用いた形質転換体の作製を説明する。

1 ) ヒ卜白血球 m R N Aの調製予め _80。Cに凍結保存しておいたヒト白血球を、 30m 1 の G T C緩衝液（ 6Mグァニジンチオシァネート， 5mMクェン酸ナトリウム， 17mMサルコシルナトリウム， 0.7 % 3— メルカプトエタノール）を加えながら素早くホモジナイズした。

得られたホモジネートを、室温において 3, OOOx gで 5分間遠心し、上清を別のチユーブへ移した。このホモジネ一卜の上清 25m l を、 0. 1 M E D T Aを含む 5.7M塩化セシゥムのクッション（ 8m l ) の上に重層し、日立 S R P 28ローターを用いて、 15。Cにおいて 26, OOOx gで 65時間遠心した。遠心後、褐色および茶褐色のタンパク質層、および D NA層をァスピレーターで除去した。チューブの底に沈殿した R N Aを T E S緩衝液（ lOOmM Tris- H C 1 , 5mM E D T A, 1 % S D S , pH7.5 ) 1m l に溶解し、フエノール -クロロホルム（ 1 ： 1 ) で抽出した。

R N Aを含む水層に、 3M酢酸ナトリウム 0. lm 1、冷却したエタノール 2m 1 を加え、 R N Aを沈殺させた。遠心分離により回収した R N Aは、 80%エタノールで洗浄後、真空乾燥させ、滅菌蒸留水に溶解した。次に、得られた R NA水溶液を、以下の手順でォリゴ（ d T ) セルロースカラムに逝し、ポリ（A) を有する m R N Aを分離した。すなわち、滅菌蒸留水に溶解した R N Aに、 2倍容の平衡化緩衝液

(0.5 N a C 1 , 20m M Tris— H C 1 , 1 m M E D T A , 0. 1 % S D S , pH7.6 ) を加え、 65。Cで 5分間熱処理を施した後、あらかじめ平衡化緩衝液で平衡化したオリゴ ( d T ) セルロースカラムにかけ、 10倍容の平衡化緩衝液で洗浄した。洗净後、溶出緩衝液 (20m M Tr i s— H C 1 ,

Im E D T A , pH7. 6 ) を用いて m R N Aを溶出し、ェタノ一ル沈澱により回収した。回収した m R N Aは 80%エタノールで洗浄した後、真空乾燥し、滅菌蒸溜水に溶解した。この m R N A 3〃 gを用いて以下の c D N A合成を行った。

( 2 ) c D N Aライブラリーの作製

調製した m R N Aからの c D N A合成は、フアルマシア社から市販されている c D N A合成システムを用い、製品に添付されているプロトコールに従って行なった。逆転写酵素により、 m R N Aに相補的な c D N Aを合成した後、リボヌクレアーゼ Hで、 R N A鎖にニックとギャップを入れ、これを T 4 D N Aポリメラーゼを用いて修復合成する二とにより、 R N A鎖を c D N A鎖に置換した。最後に、大腸菌 D N Aポリメラーゼ I のクレノーフラグメントにより、 c D N A鎖の両端を平滑化した。続いて、ストラテジーン社から市販されているス Z A P Πライブラリ一システムを用いて、 c D N A ライブラリーを作製した。方法は、すべて製品に添付されているプロトコールに従って行なった。すなわち、まず、合成 c D N Aの両端に / V R I アダプター、Wot I サイ卜を持たないもの）を付加し、これと予め / R I で切断処理が施されている； I Z A P 1！アームとを連結した。その後、インビ卜口パッケ一ジングを行ない、大腸菌 X L I — B 1 u e株

(製品に付厲）に感染させることにより、 c D N Aライブラリ一を作製した。 ( 3 ) ヒ卜 P A F受容体をコードする c D N Aクローンの選抜

上記（2 ) において調製した c D N Aライブラリーのうち、約 30万個のファージ群を大腸菌 X L 1 — B 1 u e株に吸収させて寒天ブレー卜にまき、 37でで 12時間培養した。その寒天上に二トロセルロースフィルターを置き、 3分間放置してファ一ジをフィルターに吸着させた後、フィルターを寒天から剥して変性液（ 0. 2N N a 0 H, 1, 5 M N a C 1 ) 中で

5分間変性処理を行なつた。ペーパータオル上で十分変性液を除いた後、中和液（1. 5 M Tr i s- H C 1 , 1. 5 M, N a C 1 , ρΗ7. 5 ) 中で 5分間中和反応をし、続いて 2x S S C

( I Xは 0. 15M塩化ナトリウムを含む 15mMクェン酸ナ卜リウム塩酸緩衝液， pH7, 0) ) 中で 5分間洗浄した。このフィルターを乾燥後、 80 Cで 2時間加熱した。室温に戻した後、

5 Xデンハルツ液（ 1 Xは 0. 02%フイコール， 0. 02%ポリビ二ルビ口リドン， 0. 02%ゥシ血清アルブミン）， N E T液

( 5M N a C 1 , 2M Tr i s- H C 1 , 0. 5 Μ Ε D Τ A , ρΗ8. 0 ) , 0. 1 ?6 ドデシル硫酸ナトリウム、および 1 m 1 当り ΙΟΟίί gの変性サケ精子 D N Aの溶液中において 55°Cで 16 時問反応させた。

プローブの ³² P標識は、モルモッ卜 P A F受容体追伝子の

S S I 消化断片（約 800 b p ) を鍩型として、マルチブラィマ一キッ卜（アマシャム社製）を用いて行なった。この ^j2P 標識したプローブを上記反応液に加えてさらに 24時問ハイブリダィゼーシヨン反応を行なった。その後、フイノレターを . 0. 1 % ドデシル硫酸ナトリウムを含む 300 m 1 の 2x S S C により室温で 2回、 5分間ずつ洗い、さらに 0. 1 % ドデシル硫酸ナトリウムを含む 300m 1 の 2x S S Cにより 55。Cで 2 回、 20分間.ずつ洗った。その後、フィルターを乾燥させ、 -70°Cでィンテンシファイスクリーンを用いて 2日間ォー卜ラジオグラフィ一を行なつた。

ヒト P A F受容体をコ— ドする遺伝子の c D N Aが揷入されているファージ D N Aには³² Pで標識した D N Aプローブが接合する。従って二トロセル口一スフィルターに吸着されたファージ D N Aのプラークに相当する部分は X線フイルムに黒点を生じる。この黒点を生じたプラークのファージを寒天プレートから単離し、約 1.7K b pの長さの、 c D N Aが揷入されているクローンを得た。

得られたファ一ジクローン力、ら、 f 1ヘルパーファージ R 408 (ストラテジーン社製）を使ったプラスミドレスキュ一法により、インサートを含むプラスミド（ p h P A F ) を回収した。この際の詳細な方法は、すべてストラテジーン社のプロ卜コールに従った。

(4 ) c D N Aインサートの全塩基配列の決定

c D N Aィンサー卜の全塩基配列をキロシークユンス用ディレーシヨンキット（宝酒造（株）より購入）、およびシークヱネ一ス D N Aシークヱンスキッ卜（朿洋紡（株）より購入）を川いて決定した。決定した全塩基配列を笫 6図、 ^ 7 図および第 8図として示す。ここで第 7図に示す配列は第 6 図に示す配列の塩基番号 1 の塩基に結合しており、 8図に示す配列は第 6図に示す配列の塩基番号 1029の塩基に結合している。クローン p h P A Fは、 1780塩基対を揷入 D N Aとして含み、翻訳開始遺伝暗号 A T Gから翻訳停止遺伝暗号 T A Gまでの 1029塩基対を、連続した最も大きなオープンリ一ディングフレームとして持っていた。第 6図に示す D NA塩基配列から誘導されるァミノ酸配列を第 5図に示した。

(5) ヒト P A F受容体遺伝子のアフリカッメガエル卵母細胞内での発現

上記（3) においてクローン化した D N Aが確かにヒト P A F受容体をコードすることを、アフリカッメガエル卵母細胞の遺伝子発現系を利用して確かめた。実験は、以下の 3つのステップで進めた。

(a ) クローン化 D N Aを铸型としたイン · ビトロでの R N Aの台成

5 gのプラスミド P h P A Fを制限酵素 ^/ Iで消化し、フエノール -クロ口ホルム（ 1 ： 1 ) 抽出、エタノール沈澱後、 50 1の滅菌蒸留水に溶解した。 RNA合成は、この D N A溶液と 50 1の反応緩衝液（ ImM Cap —アナログ 7 一メチル一 G p p p G, ImM AT P, ImM C T P , ImM U T P , 0. ImM G T P, 80 m M Tr i s - H C 1 pH 7.9 ) , 200 g / m 1 B S A , 20m M D TT, 12 mM M g C 1つ， 4 m , スペルミジン， 2 g / 1 ヒト胎盤リボヌクレアーゼインヒビター）を混合し、 10ュニッ卜の T 7 RNAポリメラーゼを加え、 37°Cで 60分問反応させることにより行なった。反応後、 5ュニッ卜の D N A分解酵素を加え、 37°Cで 15分間インキュベートすることにより鍀型 D N Aを分解した。得られた反応液から、フエノール -クロ口ホルム抽出、エタノール沈澱により R N Aを回収し、回収した R N Aは l〃 g /〃 1 の濃度になるよう滅菌蒸留水に溶解した。

( b ) 合成 R N Aマイクロインジヱクション用卵母細胞の調製

実験に用いたアフリカッメガエルのメス（約 100g ) は、浜松実験動物供給所より購入した。氷中で麻酔したアフリカッメガエルの腹をハサミで約 5 m m切り、ビンセッ卜で卵母細胞の塊を 1〜 2g取り出した。この塊を直ちに、 3m 1 の B S (88m M N a C l , lm M K C 1 , 2.4m M

N a H C 03 , 15m M Tr i s - H C 1 , 0.3m M C a ( N 03 ) ₂ · 4 H ₂ 0, 0.41m M C a C 1 ₂ · 4 H ₂ 0 , 0.82m M M g S 0₄ · 7 H ₂ 0, 10/i g / m 1 ぺニシリンナトリウム塩，ストレプトマイシン硫酸塩， pH7.6 ) を入れたミニシャーレの中に入れ、 M B Sで 3回洗 '净後、 0.2 % (w/v)コラゲナーゼ♦ タイプ 11 いングマ社製）を含む M B S中において室温で 1.5時間処理した。処理後、卵母細胞の塊を新しい M B Sで 4〜 5回洗淨し、実体顕微鏡下でピンセッ卜を使つて卵母細胞表面の濾泡細胞膜を取り除いた。こうして調製した卵母細胞を、直ちにマイクロインジェクシヨン用として使用した。、

( c ) 合成 R N Aの卵母細胞内での発現

上記 ( b ) において調製した卵母細胞に、上記 { a ) で合成した R N Aを 50 n 1ずつマイクロインジェク卜し、その後、 20°Cの M B S中で 3日間培養することにより注入 R N A由来のタンパクを合成させた。

卵母細胞内で発現させたタンパクがヒト P A F受容体であるか否かは、リガンド依存性の C a ^2τ感受性 C 1 " チャンネルの開口を指標として判断した。これは、ボルテージ · クランプ（Voltage Clamp ) 法を用いて膜電位の変化を測定することで検定できた。

実体顋微鏡下に 0.5m 1 の漕をセットし、リンゲル液

( 115mM N a C 1 , 2m M K C 1、 5 m M HE P E S , 1.8mM C a C 1 2 . I m g Zm l B S A, pH7. 2 ) で漕内を灌流しながら漕内に卵母細胞を置き、ボルテ -ジ · クランプした。この際のコマンド電位は、リンゲル液内での C 1 — のリバーサルポテンシャル（通常 -50〜 - 100 m V ) 以下に設定した。ボルテージ * クランプを維持した状態で、 1 0一⁷ Mの P A Fを含むリンゲル液を流すことにより、 P A F受容体が発現している卵母細胞に関しては、その受容体に P A Fが結合することにより、 G T P結合蛋白質の活性化— ホスホリバ一ゼ Cの活性化—細胞内 C a ^{2 +}の上昇— C 1 " チャンネルの開口という一迚の反応が進み、シグナルとして外向きのクランプ電流が得られた。第 13図は水をマイクロインジェク卜した場台、および第 14図は、上記（ a ) で合成した R N Aをマイクロインジェク卜した場合にそれぞれ得られるレスポンスを示したものである。この結果から、クローン化した c D N Aはヒ卜 P A F受容体をコードするものであることが確かめられた。

( 6 ) ヒト P A F受容体遺伝子の C 0 S細胞内発現を目的とした発現用プラスミド p E U K h P A Fの構築

クローニングしたヒ卜 P A F受容体遺伝子を培養細胞 C O Sに導入し、発現の有無を調べるために第 15図に示す発現プラスミドを構築した。

C O S細胞内発現用ベクター p E U K— C 1 (クロンテツク社製）は、東洋紡（株）より購入した。このベクターは、導入遺伝子の転写開始のための S V 40後期プロモーターと、 S V 40後期ポリアデニレーションシグナルを持ち、その間に 5個のクローニングサイトを持っている。

まず、 5〃 gの p h P A Fを 5ユニットの ^ H I および ΙΑο I で消化し、得られた反応生成物を 1%ァガロースゲル電気泳動にて分離した。そして、このァガロースゲル中のヒト P A F受容体遺伝子を含む約 1.7K b pの D N A断片を、 Gene clean (バイオテック社製）を用いて添付のプロトコ一ルに従って回収し、エタノール沈澱後、滅菌蒸留水に溶解した。

次に、 gの発現用ベクター p E U K— C 1 も 5ュニッ卜の H I および J' I で消化した後、同様のす j法で、約 4.8K b pの D N A断片を回収し、滅菌蒸留水に溶解した, 上述の 2種類の回収 D N A断片、すなわち約 200n gのヒ卜 P A F受容体逍伝子を含む D N A断片と約 50n gのべクタ — D N A断片を混合後、結合反応を行なった。この反応は、夕カラ · ライゲーションキットを用い、添付のプロ卜コールに従って行なった。この反応液を用いて常法により、大腸菌 X L 1 - B 1 u eを形質転換し、アンピシリン耐性

C A m p ^R ) のコロニーを得、このコロニーよりプラスミド D N Aを回収した。回収したプラスミドが S的のものであることは、 /^ H I および -Uo I による消化反応後、ァガロースゲル電気泳動にて確認した。このようにして、 C O S細胞内発現用プラスミド p E U K h P A Fを構築することができた。

( 7 ) ヒ卜 P A F受容体遺伝子の C 0 S 7細胞内での発現上記（6) で構築した C 0 S細胞内発現ブラスミド p E U K h P A Fを C O S細胞の一種である C 0 S 7細胞に導入し、 P A F受容体追伝子の発現の有無を調べた。実験は、以下の 3つのステツプで進めた。

( a ) プラスミド p E U K h P A Fの C 0 S 7細胞への導人

C O S 7細胞は、 20%ゥシ胎児血清（ベ一リンガー · マンハイム社製）， 0, 6 g Z 1 L—グルタミン， 1. 5 g Z 1 炭酸水素ナトリウム， 100ユニット/ m 1 ペニシリン， 50 g /m I ストレプトマイシンを補足した D M E M培地（日水製薬（株）社製）において、 37。C、 5% C 0₇ の条件下で培養した。プラスミド導入の際、細胞数は、 10⁷ 個/ m 1 のオーダーに調製した。導入方法は、フアルマシア社製セルフェクト · 卜ランスフエクシヨンキッ卜を用い、添付のプロ卜コールに従った。プラスミドを導入した細胞は、さらに 3曰問培粱を^け、導入遺伝子の発現を待った。 ( b ) 形質転換細胞からの膜画分の調製

培養後、培養容器の底面に付着した形質転換細胞は、培溶液を十分懸濁し、 4。Cにおいて 800 x gで 10分間遠心することにより回収した。沈澱した細胞は、氷冷した H E P E S緩衝液（25mM H E P E S , lOmM M g C 1 ₂ , 0. 25M スクロース， ρΗ7.4 ) に懸濁し、氷上で懸濁液をホモジヱナィズすることで完全に破砕した。

P A F受容体結合実験に供する膜画分は、この破砕液を 4。Cにおいて 800 x gで 10分間遠心後、上清をさらに 4°Cにおいて 40, 00 D X gで 20分間遠心分離し、得られた沈澱物を H E P E S緩衝液に懸濁したものを用いた。

( c ) C 0 S 7細胞で発現したヒト P A F受容体の確認形質転換細胞でヒト P A F受容体が発現していることは、調製した膜画分に P A F受容体結合活性が存在することで確認した。この実験は、トリチウムラベルされた P A Fアン夕ゴニスト W E B 2086 (N E N社製）を用いて行なった。まず、

100 i 1 の反応緩衝液（25m M H E P E S , 10m M g C 1 , 0. 1 % B S A , pH7.4 ) に 200 η M、 100η , 50 n M, 25 n , 12. 5 n M, 6. 25n Mあるいは 3. 125m Mの

[ ³H] W E B 2086を加え、これに上記（ 7 ) , ( b ) で調製した 100 1 の膜画分を入れて 25°Cで 90分 [1 反応させた。反応後、反応液を、ちにグラスフイノレター（ヮッ卜マン社製、 G F / C ) に通して膜画分をグラスフィルタ一に吸着させ、さらにグラスフィルタ一を反応緩衝液で十分洗^することで未吸着の [ ³H] W E B 2086を除いた。その後、グラスフィルターを、 80。Cで 30分間乾燥し、液体シンチレーシヨンを加えてカウントを測定した。なお、 [ ^J H ] W E B 2086の膜への非特異的吸着も知るために、各ポイン卜で反応系に 1 0 ^ M P A Fを存在させた場合の結合カウン卜も測定した, 第 1 6図は、その結果を示したものである。第 1 6図において、 Oは特異的な結合、暴は非特異的な結合を表している。これにより、形質転換細胞膜上に P A F受容体が発現していることが確認できた。産業上の利用可能性

この遣伝子を用いて作成された形質転換細胞は、今後ますます有用性が増加するァゴニス卜、アンタゴニストのスクリ一二ングに応用することが可能である。また、この遺伝子は，現在困難とされている P A Fの定量にも応用することができ

Claims

請求の範囲

1. 下記ァミノ酸配列を有するモルモッ卜血小板活性化因子受容体をコードする遺伝子。

Met Glu Leu As n S e r S e r Ser A r g Va 1 Asp

Se r Glu Phe Ar g Ty r Th r Leu Ph e Pro 11 e

Va 1 Ty r Ser l ie lie Phe Va 1 Leu G 1 l ie

lie Ala Asn Gl y Tr Va 1 Leu Tr p Va 1 Phe

Ala A r g L e u T y r Pro Ser L y s L y s L e u Asn

Glu l ie Ly s l ie Phe Met Va 1 Asn Leu Th r

V a 1 Ala Asp Leu Leu Phe Leu I 1 e Th r Leu

Pro Leu T r p 11 e Va 1 Ty r Ty r Ser Asn Gin

Gl y Asn Trp Phe Leu Pro Ly s Phe Leu Cy s

Asn Leu Ala Gly C y s Leu Phe Phe l ie Asn

Th r Ty r Cy s Ser Va 1 Ala Phe Leu Gly Va 1

l ie Th r Ty r Asn A r g Phe Gin A 1 a Va 1 L y s

Ty r Pro 11 e Ly s Th r Ala Gin Ala Th r Th r

A r g L y s A r g G 1 y lie Ala Leu Ser Leu Va 1

l ie Trp Va 1 A 1 a l ie Va 1 A 1 a Ala Ala Ser

Ty r Phe Leu Va 1 Met Asp Ser Thr Asn Va 1

Va 1 Ser A s n L y s A 1 a Gly Ser Gly A s n l ie

Thr Arg Cy s Phe Glu His Ty r G 1 u Ly s Gly

Ser L y s Pro V a 1 Leu l ie l ie Hi s l ie C y s

l ie Va 1 Leu Gl Phe Phe l ie Va 1 Phe Leu

Leu l ie Leu Phe C y s Asn Leu V a 1 l ie l ie

Hi s Thr Leu L e u Arg Gin Pro V a 1 L y s Gin Gin Ar g As n Al a G i u Va 1 Ar g Arg Ar g Ala

Leu Trp Met Va 1 Cy s Thr Va 1 Leu Ala Va 1

Phe Va 1 lie Cy s Phe Va 1 Pro His His Met

Va 1 Gin Leu Pro Trp Thr Leu Ala Gl u Leu

Gl y Me t Trp Pro Se r Se r As n His Gin Al a

I！ e As n As Ala His Gin Va 1 Thr Leu Cy s

Leu Leu S e r Thr As n Cy s Va 1 Leu Asp Pro

Va 1 l ie Ty r C" P e Leu Thr Ly s Ly s Phe

A r g Ly s His Leu S e r G 1 u Ly s L e u As n lie

Met Arg Se r Se r Gin Ly s Cy s Se r Ar g Va 1

Thr Thr Asp Thr Gl y Thr Gl u Me t Ala 11 e

Pro lie As n His Thr Pro Va 1 Asn Pro lie

L j s A s n

2. 下記塩基配列を有する、請求の範囲第 1項記載のモルモッ卜血小板活性化因子受容体をコ - ドする遺伝子。

ATG GAG TTA AAC AGC TCT TCC CGG GTG GAT TCT GAG TTT CGA TAC ACA CTC TTC CCA ATT GTT TAC AGC ATT ATC TTT GTG CTG GGG ATC ATC GCC AAT GGC TAT GTG CTA TGG GTC TTT GCC CGC CTA TAC CCT TCC AAG AAA CTA AAT GAG ATA AAG ATC TTC ATG GTG AAC CTC ACG GTG GCT GAC CTC CTC TTC CTG ATC ACC TTG CCT CTG TGG ATC GTC TAC TAT TCC AAC CAG GGC AAC TGG TTT CTA CCC AAA TTC CTT TGT AAC CTG GCT GGC TGC CTC TTC TTC ATC AAC c J c_ c.

E-

6— -< -<

-< c -> <^

-<

t— 6— c

- o O E- - -<

-< E— <

£— 6— -< £— - -<

£-«

CO

E—

-< c -

-< -< £—

e-> c-* ^-

E— E- ^ e— · -

·*< E— ^ - E— - c - - -< - > -< t-« -<

^ 6—

9 v

ここで、 NM は、 TGA , TAA または TAGを表わす。

3. 下記ァミノ酸配列を有するヒ卜血小板活性化因子受容体をコードする遣伝子。

Met Gl u Pro His Asp Ser Se r His Met Asp

Ser Gl u Phe Arg Ty r Th r Leu Phe Pro lie

Va 1 Tyr Ser l ie 11 e Phe Va 1 Leu Gl y Val

lie A I a As n G 1 y T r Va I Leu Trp Va 1 Phe

Ala Ar g Leu T r Pro Cy s Ly s Ly s Phe As n

G 1 u lie Ly s I 1 e Phe Me t Va 1 As n Leu Th r

Met Ala Asp Met Leu Phe Leu lie Thr Leu

Pro Leu Trp 11 e Val Tyr Tyr Gin Asn Gin

G 1 y Asn Trp lie Leu Pro Ly s Phe Leu Cys

Asn Val Ala Gl y Cys Leu Phe Phe lie Asn

Thr Tyr C s Ser Va 1 Ala Phe Leu Gl Va 1

11 e Thr T r Asn Arg Phe Gin A I a Val Thr

Ar g Pro l ie Ly s Thr Ala Gin Ala As n Thr

Arg L s Arg G 1 I 1 e Ser Leu Ser Leu Val

11 ε Trp Va 1 Ala l ie Va 1 Gl y Ala Ala Ser

Tyr Phe Leu lie Leu As Ser Thr Asn Thr

Va 1 Pro As Ser Ala Gl γ Ser G 1 Asn Va l

Thr Arg Cys Phe Gl u Hi s Tyr G 1 u L s G 1

Ser Va I Pro Val Leu 〖 1 e lie His I 1 e Phe

I 1 e Va 1 Phe Ser Phe Phe Leu Va 1 Phe Leu

lie l ie Leu Phe C y s Asn L e u Val l ie I 1 e

Arg Thr Leu Leu Me t Gin Pro Va 1 Gin Gin Gin A r g A s n A 1 C 1 u Va 1 L y s A r g A r g Ala

Leu Tr p Met Va 1 Cy s Th〖 Va 1 Leu Ala Va 1

Phe lie l ie Cy s Phe Va 1 Pro His His Va 1

Va 1 Gin Leu Pro Trp Th r Leu Al a G 1 u Leu

Gl y Phe Gin Asp Se r Ly s Phe His Gin Ala

l ie As n Asp Ala His G 1 n Va 1 Thr Leu C y s

Leu L e u S e r Thr A s n C y s V a 1 Leu Asp Pro

Va 1 lie Ty r Cy s Phe Leu Thr Ly s Ly s Phe

Ar g Ly s His Leu Th r G 1 u Ly s Phe Ty r Se r

Me t A r g S e r S e r A r g L y s C y s S e r A r g Ala

Thr Thr Asp Thr Va 1 Thr Gl u Va 1 Va 1 Va 1

Pro Phe Asn Gin lie Pro Gl y Asn Se r Leu

L y s Asn

4. 下記塩基配列を有する、請求の範囲第 3項記載のヒト血小板活性化因子受容体をコ - ドする遺伝子。

ATG GAG CCA CAT GAC TCC TCC CAC ATG GAC

TCT GAG TTC CGA TAC ACT CTC TTC CCG ATT

GTT TAC AGC ATC ATC TTT GTG CTC GGG GTC

ATT GCT AAT GGC TAC GTG CTG TGG GTC TTT

GCC CGC CTG TAC CCT TGC AAG AAA TTC AAT

GAG ATA AAG ATC TTC ATG GTG AAC CTC ACC

ATG GCG GAC ATG CTC TTC TTG ATC ACC CTG

CCA CTT TGG ATT GTC TAC TAC CAA AAC CAG

GGC AAC TGG ATA CTC CCC AAA TTC CTG TGC

AAC GTG GCT GGC TGC CTT TTC TTC ATC AAC KNN IVV YYV

313 301 1VV 333 丄;)；） 3XV 3V3 3VV 311 V33

0 01D VY9 IOV 310 93V 1V0 03V 33V

030 00D 331 331 VYV 990 09V 19V 303 01V

30V 3V1 311 3VV VV9 3DV 313 DV3 9VV 033

Oil OVV OVV 3DV 3 0 « 101 3Ϋ1 OXV 110

1D0 DV9 Vll 319 101 3VY 33V 09V X 0

091 313 D3V 319 9V3 J.V3 V39 IV9 IVV 11V

3D9 OVD 3V3 311 VVV 30V 3Y9 9V3 Oil 309

013 9V9 X 00 X X 0 33V 391 333 913 9V3 919

9X9 D¥3 0V3 003 0 3 «L 331 31V D1V 0X1

910 039 J> 0 93V 091 919 9IV 001 913

939 993 393 9VY 319 VV9 139 m 393 9Y0

3V3 9Y0 919 333 9V0 01V 0 ^ } 3DV 130

31V 01V 010 013 3VY 391 3 0 0 31Y 31V

0 0 0 X 319 913 J X 0 39V 311 919 OXV

311 31V 3V3 D1V 31V 3X3 319 VDO 919 09V

099 9VV 0Ϋ0 3Y1 I¥3 3V0 J* X 30 il> 303 X3Y

019 3VV 309 V31 0D9 130 19V OVO 333 019

VDV OVV D3V 301 3V0 0X0 01V 313 311 DV1

331 V30 139 V09 910 IIV 339 910 301 3iV

0 0 0 X 00 X 0 131 31V 399 103 9YV 090

03V OVV 300 DV3 13D XDV OVV D1V ODD 393

13V Vlfl V30 9V3 31X 393 Π1 X3V 31V

019 090 3 3 il« 33D 919 3 X J «丄 3YI 03Y

LLlO/l6dC/JDd WLZMZd ここで、 NNN は、 TGA , TAA または TAGを表わす。

5. 請求の範囲第 3項記載のヒト血小板活性化因子受容体をコードする遺伝子を含み、微生物細胞内で自己増殖可能な組換え体 D N Ao

6. 前記ヒ卜血小板活性化因子受容体をコードする逍伝子が下記塩基配列で表わされる請求の範囲第 5項記載の組換え体 D N A。

ATG GAG CCA CAT GAC TCC TCC CAC ATG GAC TCT GAG TTC CGA TAC ACT CTC TTC CCG ATT GTT TAC AGC ATC ATC TTT GTG CTC GGG CTC ATT GCT AAT GGC TAC GTG CTG TGG GTC TTT GCC CGC CTG TAC CCT TGC AAG AAA TTC AAT GAG ATA AAG ATC TTC ATG GTG AAC CTC ACC ATG GCG GAC ATG CTC TTC TTG ATC ACC CTG CCA CTT TGG ATT GTC TAC TAC CAA AAC CAG GGC AAC TGG ATA CTC CCC AAA TTC CTG TGC AAC GTG GCT GGC TGC CTT TTC TTC ATC AAC ACC TAC TGC TCT GTG GCC TTC CTG GGC GTC ATC ACT TAT AAC CGC TTC CAG GCA GTA ACT CGG CCC ATC AAG ACT GCT CAG GCC AAC ACC CGC AAG CGT GGC ATC TCT TTG TCC TTG GTC ATC TGG GTG GCC ATT GTG GGA GCT GCA TCC TAC TTC CTC ATC CTG GAC TCC ACC AAC ACA GTG CCC GAC AGT GCT GGC TCA GGC AAC GTC ACT CGC TGC TTT GAG CAT TAC GAG AAC GGC AGC GTG CCA GTC CTC ATC ATC CAC ATC TTC

ATC GTG TTC AGC TTC TTC CTG GTC TTC CTC ATC ATC CTC TTC TGC AAC CTG GTC ATC ATC CGT ACC TTG CTC ATG CAG CCG GTG CAG CAG CAG CGC AAC GCT GAA GTC AAG CGC CGG GCG CTG TGG ATG GTG TGC ACG GTC TTG GCG GTG TTC ATC ATC TGC TTC GTG CCC CAC CAC GTG GTG CAG CTG CCC TGG ACC CTT GCT GAG CTG GGC TTC CAG GAC AGC AAA TTC CAC CAG GCC ATT AAT GAT GCA CAT CAG GTC ACC CTC TGC CTC CTT AGC ACC AAC TGT GTC TTA GAC CCT GTT ATC TAC TGT TTC CTC ACC AAG AAG TTC CGC AAG CAC CTC ACC GAA AAG TTC TAC AGC ATG CGC AGT AGC CGG AAA TGC TCC CGG GCC ACC ACG GAT ACG GTC ACT GAA GTG GTT GTG CCA TTC AAC CAG ATC CCT GGC AAT TCC CTC AAA AAT 隱

で、 NNN は、 TGA , TAA または TAGを表わす。

7. 請求の範囲第 6項記載の D N Aを保持する形 Sf転換細胞。