WO1993020228A1

WO1993020228A1 - Nouvelle proteine physiologiquement active et promoteur de la croissance des cellules souches hemopoietiques

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Publication number: WO1993020228A1
Application number: PCT/JP1993/000404
Authority: WO
Inventors: Tatsutoshi Nakahata; Genji Kawano; Tetsuo Sudo; Katsuaki Kojima
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1992-03-31
Filing date: 1993-03-31
Publication date: 1993-10-14
Anticipated expiration: 1994-09-30
Also published as: US5668104A; EP0590156A4; CA2110283A1; EP0590156A1

Description

明細書，新規生理活性タンパク質および造血幹細胞増加剤技術分野

本発明は、未分化の造血幹細胞の増殖活性を有する新規生理活性タンパク質及び該タンパク質を有効成分として含有する造血幹細胞増加剤に関するものである。

背景技術

最近、未分化の造血幹細胞から成熟血球に至る分化の過程には、数多くの造血因子が種々のレベルで相互に関与し、複雑な造血系ネットワークを形成している事が分かってきた。又、これら造血因子の殆どのものは遺伝子クローニングされ、現在、いくつかの造血因子については遺伝子組換え技術により大量生産され、臨床応用が進められている。一方、未分化の造血幹細胞は自己複製能 (増殖）を有する事を特徴としているが、骨髄において未分化の造血幹細胞に働く増殖因子については十分に解明されていない。

骨髄における造血幹細胞の増殖や成熟細胞への分化には骨髄ストローマ細胞が中心的な働きを果たしている事が知られており、ストローマ細胞が分泌する何らかの液性因子或いは細胞間相互作用等が未分化の造血幹細胞の増殖に関与していると考えられている。

例えば、 C 5 7 Β 1 / 6新生児マウスの頭蓋冠から樹立された骨髄スト口一マ細胞 M C 3 T 3 - G 2 /P A - 6 (P A— 6 ) 細胞がマウスの多能性造血幹細胞の増殖を支持することが知られている [K o d a m a H.

e t a 1 ： J . C e l l . P h y s i o l , , 1 1 2_, 8 9 ( 1 9 8 2 ) ] o

近年、造血幹細胞表面の c— k i t 夕ンパク質に対するリガンドが幹細胞の増殖に関与する因子として注目され、その実体解明の研究が精力的に行われた結果、 3つのグループが、その遺伝子クローニングに成功し、 S C F [ s t e m c e l l f a c t o r ; K. Μ. Z s e b ο e t a l : C e l l , 6 3 , 1 9 5 - 2 0 1 ( 1 9 9 0 ) ] 、 MG F [m a s t c e l l g r o w t h f a c t o r ; D. E. W i l l i a m s e t a 1 : C e 1 1 , 6 3 , 1 6 7 - 1 7 4 ( 1 9 9 0 ) 、及び K L [ c— k i t l i g a n d ; H u a n g e t a 1 ： C e 1 1 , 6 3 , 2 2 5 - 2 3 3 ( 1 9 9 0 ) ] として報告された。

現在、遺伝子組換え技術により大量生産された c— k i t リガンドを使い、その作用の解析が進められているが、これまでの研究ではこの因子はある程度分化した造血幹細胞の増殖を支持する事が分かりつつある [H a y a s h i e t . a 1. : I n t . J . H e m a t o 1 o g y , S u p p l e . N o . 1， p 1 9 8 ( 1 9 9 1 ) ] 。従って、このタンパク質の他に骨髄において、もつと未分化の造血幹細胞に働く因子が存在すると者えられている。 - 未分化の造血幹細胞の増殖を支持する造血因子は、骨髄抑制に対する治療剤、例えば癌化学療法や骨髄移植等における骨髄抑制の回復、或いは再生不良性貧血や骨髄異形成症候群等の骨髄機能不全に対する治療剤として、さらに末梢血幹細胞及び骨髄幹細胞の i n i t r o 増殖剤として骨髄移植治療に用いられる等有用な医薬品となる。

本発明は、未分化の造血幹細胞の増殖活性を有する新規タンパク質を提供すると共に、これを有効成分として、骨髄抑制に対する治療、或いは骨髄機能不全に対する治療、或いは末梢血幹細胞及び骨髄幹細胞の i n V i t r o増殖に利用する造血幹細胞増加剤を提供することを目的とする。

骨髄ストローマ細胞が線維芽細胞 Z前脂肪細胞、内皮細胞、マクロファージから構成され、インターロイキン 1、インターロイキン 6、インターロイキン 7、インタ一ロイキン 8、インターロイキン 1 1、 c一 k i t リガンド、 L I F l e u k e m i a i n h i b i t o r y f a c t o r ) 、 GM - C S F、 G— C S F、 M - C S F等の造血因子を産生していることが知られているので、本発明者等はヒト線維芽細胞の培養液に未分化の造血幹細胞に対する増殖因子が存在すると考えた。

大量の 5—フルォロウラシル（5 F U) を投与したマウスの骨髄から得られた造血細胞は前脾コロニー形成細胞（p r e C F U— S ) と呼ばれ、自己複製能の高い未分化の造血幹細胞である事が知られている。

本発明者等は 5— F U耐性のマウス骨髄細胞に対する増殖活性を指標にして、線維芽細胞の培養液から新規の生理活性タンパク質の分離を目的として鋭意研究を重ねた。その結果、未分化の造血幹細胞の増殖活性を有する新規生理活性タンパク質を分離し、本発明を完成するに至った o 発明の開示

本発明は、未分化の造血幹細胞の増殖を支持する活性を有し、分子量が 1 8， 0 0 0 ± 2 , 0 0 0である配列表の配列番号 1に示した N末端アミノ酸配列を有する新規生理活性タンパク質に関する。また、本発明の生理活性タンパク質は表 1のアミノ酸組成を有する。さ'らに、本発明の生理活性タンパク質は、配列表の配列番号 5に示したァミノ酸配列の、 1番目から 1 6 2番目までのァミノ酸配列からなるタンパク質、 1番目から 1 6 3番目までのアミノ酸配列からなるタンパク質、 1番目から 1 6 4番目までのアミノ酸配列からなるタンパク質、 1番目から 1 6 5番目までのアミノ酸配列からなるタンパク質、 1番目から 1 6 6番目までのァミノ酸配列からなるタンパク質、 1番目から 1 6 7番目までのアミノ酸配列からなるタンパク質、 1番目から 1 6 8番目までのアミノ酸配列からなるタンパク質、または 1番目から 1 8 8 番目までのアミノ酸配列からなるタンパク質である。図面の簡単な説明

第 1図は、サーモリシンによるフィプロネクチンの限定分解断片と各モノクローナル抗体認識ドメイン模式図を示すものであり、第 2図は、発現ベクター p S R a F N 1 4の作製方法を示すものである。発明を実施するための最良の形態

本発明の生理活性タンパク質（以下、 F D F — 3 と略す）は、その N末端アミノ酸配列及びァミノ酸組成から、新規の造血因子に属するものである。また、本発明の生理活性タンパク質のァミノ酸配列は、フィブロネクチンの一部分であることが示唆された。フイブロネクチンには、エリスロポエチンによる赤血球系の細胞の増殖を増強すること（We i ns t eon, R. , e t a 1, Bl ood, 73, 111 (1 989) ) が知られており、この増強は Arg- Gly-Asp- Se r (R G D S ) のテトラペプチドにより阻害されることから、フイブロネクチン中の R G D S配列が存在する部分がこの増強をになうことが示された。しかし、本発明の生理活性タンパク質中には R G D S配列は存在しないので、この知見とは異なる新規の造血因子に属するものであ。

さらに、本発明者等は該生理活性タンパク質がマウス骨髄細胞を使用した評価系において、造血幹細胞の増殖を支持することを確認し、該生理活性タンパク質を有効成分とする新規造血幹細胞増加剤を完成した。

本発明の新規生理活性夕ンパク質を得るための原料としては、通常はヒト線維芽細胞の培養液を用いる。すなわち、ヒト線維芽細胞を牛血清を含む培地で培養し、一定の細胞数に到達後、無血清培地に交換し、該タンパク質を産生させる。得られた培養液をシリカクロマト、へパリンァフィ二ティーク口マト、陰イオン交換ク口マト、金属キレートク口マト、及びゲル濾過ク口マト、ハイドロキシアパタイトクロマト等を用いて精製し、純品を得ることができる。もしくは、フイブロネクチンをサーモリン、トリプシンなどのプロテアーゼで分解し、上記に示した方法で本発明のァミノ酸配列を含む断片を得ることができる。

また、本発明の生理活性物質（F D F— 3 ) は、組換え D N A技術により安定かつ大量に取得することができる。すなわち、ヒト線維芽細胞 m R N Aより調製した c D N Aライプラリーより、 F D F— 3のアミノ酸に基づいて合成したォリゴヌクレオチドをプローブとして用いてヒト F D F— 3のポリペプチドをコードする塩基配列を含む c D N Aを得ることができる。また本発明の F D F— 3はフイブロネクチンの断片であるので、 F D F— 3のポリぺブチドにあたる部分のフィブロネクチンの 5 ' 末端および 3 '末端塩基配列より 2種類のプライマーを D N Aシンセサイザ一にて合成し、各プライマーをヒ 1 ト細胞 m R N Aより調製した c D N Aと共に Tafl D N A ポリメラーゼなどの D N Aポリメラーゼ存在下で D N A の変性、次いでプライマーのアニーリング、そしてブライマ一の伸長反応を、例えば Perkin-Elmer Cetus社の D N Aサーマルサイクラ一を用いることにより、 F D F — 3の c D N Aを得ることができる。こうして得られた c D N Aを、種々の発現ベクターに組み込んで、該組換え発現ベクターで形質転換された形質転換体を培養し、培養物から組換え型ヒト F D F— 3を採取することができ

F D F— 3を発現するために用いられるベクターとして、プロモーターの下流に F D F — 3ポリペプチドの一部または全部のアミノ酸配列をコ一ドする D N A断片を有する。プロモーターとしては種々のプロモーターが報告されているが、本発明においては S V 4 0のプロモーターなどの、動物細胞で発現可能なプロモーターが望ましい。このプロモーターの下流には分泌タンパク質の遺伝子中に含まれるシグナル様配列を有し、さらにその下流に F D F— 3遺伝子の D N A断片を転写方向に従って挿入する。この場合、シグナル配列に用いた遺伝子の構造遺伝子部分が含まれても良い。分泌タンパク質のシグナル配列としてインターロイキン一 6などのサイトカインのものが利用できる。さらに上記 F D F — 3遺伝子の下流にポリ A付加シグナルが存在することが必要である。ポリ A付加シグナルとして、例えば S V 4 0 D N Α、 β 一グロビン遺伝子、またはメクロチォネイン遺伝子のポリ A付加シグナルが利用できる。

上記べク夕一を用いて動物細胞、例えば C 0 S— 1細胞ゃ CHO細胞を形質転換することができる。発現べクターの動物細胞への導入は、リン酸カルシウム共沈法、 D E AEデキストラン法、電気パルス法、マイクロインジェクション法などを用いることかできる。

形質転換された動物細胞は、前述したように培養し、培養物を各種ク口マトグラフィ一により精製することができる。

上記の方法で得られた本発明の生理活性タンパク質の物理化学的性質及び生物学的性質の詳細を以下に記載する

(1) 分子量： 1 8, 0 0 0 ± 2， 0 0 0 [S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ L a e mm Γ i

U. K. ： N a t u r e, 22 7, 6 8 0 - 6 8 5 · C 1 9 7 0 ) ]

(2) N末端アミノ酸配列（2 0残基）：

配列表の配列番号 1に示す。

(3) 部分アミノ酸配列（1 0残基）：

配列表の配列番号 2に示す。 -

(4) 全ァミノ酸配列

配列表の配列番号 5に示す。

(5) アミノ酸組成：

表 1に示す。 ( 6 ) 生物活性：，

5— F U処理マウスの骨髄細胞に対し、 I L— 3との併用、 G— C S Fとの併用もしくはステムセルフアクターとの併用により、または I L 一 3と G— C S Fとの併用により増殖活性を示す。またヒトさい帯血単球に対し、 GM— C S Fとの併用により増殖活性を示す。

本発明の生理活性タンパク質（F D F— 3) は、未分化の造血幹細胞に対する増殖活性を示し、骨髄抑制（例えば抗癌剤使用後や骨髄移植等）に対する治療に有効な造血幹細胞増加剤として、骨髄機能不全（例えば再生不良性貧血や骨髄異形成症候群等）に対する治療に有効な造血幹細胞増加剤として、または末梢血幹細胞および骨髄幹細胞の i n V i t r oにおける増殖に有効な造血幹細胞増加剤として有用である。

すなわち、本発明の F D F— 3は、特に I L— 3と共に働き、未分化な血液細胞であるブラストコロニーの形成を刺激することから、造血幹細胞増加剤として有用であり、また、 F D F— 3は S C F、 G— C S F、 GM— C S F、 I L一 3 と相乗的に働き、 5—フルォロウラシル（5— F U) で処理されたマウスなどの哺乳類の骨髄細胞のコロニー形成を著しく刺激することから、化学療法薬（5— F U) を投与されたことによりおこる骨髄形成不全や骨髄抑制の治療に、骨髄回復の増強剤として利用できる。この効果は化学療法薬投与後の骨髄回復だけに限定されるものでなく、放射線療法後の骨髄回復薬としても有効である。

さらに、本発明の F D F— 3は巨核球コロニー（C-F U -M e g) の形成を刺激することから、巨核球から放出される血小板の産生を増加させると考えられるため、血小板増加剤としても有用である。また、 F D F— 3は S C F、 G— C S F、 GM— S C F、 I L— 3と相乗的に働き、好中球（C F U— G) などの白血球を増加させることから、哺乳動物における白血球減少症の治療剤としても有効である。

本発明の生理活性夕ンパク質を前記の本発明の用途に用いる場合、そのままもしくは自体公知の薬理学的に許容される担体、賦形剤等と混合した医薬組成物として、経口的または非経口的に投与することができる。

経口投与のための剤形としては、具体的には錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などが挙げられる。かかる剤形は自体公知の方法によつて製造され、製剤分野において通常用いられる担体もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、澱粉、ショ糖、ステアリン酸マグネシゥムなどが挙げられる。

非経口投与のための剤形としては、例えば、軟膏剤、注射剤、湿布剤、塗布剤、吸入剤、坐剤、経皮吸収剤などが挙げられる。注射剤は自体公知の方法、例えば、本発明のタンパク質を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化すること.によつて調製される。注射用の水溶液としては生理食塩水、ブドウ糖溶液が挙げられ、油性液としてはゴマ油、大豆油などが挙げられ、それぞれ溶解補助剤を併用しても良い。腸内投与に用いられる坐剤は自体公知の方法、例えば本発明のタンパク質を通常の坐剤用基剤に混合し、成型することによって調製される。

本発明のタンパク質の有効投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度によつても異なるが、通常成人一人当たり、 0. 0 1〜： L O O m gを、好ましくは 0. l〜 1 0 m g を一回または数回に分けて投与することができる。

実施例

以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例 1

ヒト線維芽細胞の培養：

3 0 L培養槽を用い、ヒト線維芽細胞を 1 0 %F B S -ME M培地— 0. 3 %ビーズ（C y t o d e x— 1 : フアルマシァ社製）で、 3 7 °C、 5日間、攪拌培養を行つた。増殖がコンフルェントに到達した後、 M E M培地に切り替え、ポリ i ZC l O u gZm l を添加し、インダクシヨンをかけ、タンパク質産生を誘導した。 3 7°C、 4日間培養を継続し、 2 0 Lの培養液を回収した。

硫安を 6 0 %飽和になるように添加し、得られた沈殿を 2 ひ mMトリス塩酸緩衝液（p H 8. 0) に溶解した後、同じ緩衝液に対し透析し、脱塩した。

この液を 2 O mMトリス塩酸緩衝液（p H 8. 0) で平衡化したへパリンセファロースカラム（担体 0. 5 L : フアルマシア社製）に吸着させ、次いで平衡化に使用した緩衝液で洗浄した。非吸着画分と洗浄液を合わせ、 2 0 mMトリス塩酸緩衝液（P H 8. 0 ) で平衡化した D E AEセル口ファインカラム（担体 0. 5 L ：生化学社製）に吸着させ、平衡化の緩衝液で洗浄した。次ぎに、 OMから 1Mへの N a C lの直線濃度勾配で夕ンパク質を溶出させた。

得られた活性画分 2 5 0 m 1を 0. 5 MN a C l含有 2 0 mMトリス塩酸緩衝液（p H 8. 0 ) で平衡化した Z nキレートセファロースカラム（担体 3 0 m l ：ファルマシア社製）に吸着させ、平衡化の緩衝液で洗淨した。 1 MN H₄ C 1含有 2 0 mMトリス塩酸緩衝液（ p H 8. 0) で不純夕ンパク質を除去した後、 0〜 5 0 mMイミダゾール（ 0. 5 MN a C 1含有 2 0 mMトリス塩酸緩衝液、 p H 8. 0) で溶出させた。得られた活性画分 2 O m lを 0. 5 MN a C 1含有 2 0 mMトリス塩酸緩衝液（ p H 8. 0 ) で平衡化したセファアクリル S 1 0 0 HRカラム（担体 1 L ：フアルマシア社製）でゲル濾過した。活性画分 2 0 m lを、 0. 5 MN a C 1含有に吸着させ、平衡化の緩衝液で洗浄後、 0〜5 0 mMイミダゾール 0. 5 MN a C 1含有 2 0 mMトリス塩酸緩衝液、 P H 8. 0) で溶出させた。

活性ピークについて、非還元下で S D S— P A G Eをおこなったところ、分子量 1 8 , 0 0 0 ± 2， 0 0 0の単一バンドを示した。

実施例 2

N末端アミノ酸配列およびァミノ酸組成：

実施例 1で得られた精製夕ンパク質をアミノ酸シ一ケンサー (A p p l i e d B i o s y s t e m s 4 7 7 A P r o t e i n S e q u e n c e r ) にかけた結果、 N末端 2 0個のアミノ酸配列は配列表の配列番号 1 の通りであった。更に、この精製タンパク質をリジルェンドぺプチダーゼで分解後、逆相高速液体クロマトグラフィー（V y d a c C ₈ ) でペプチドを分画し、得られたフラグメントのアミノ酸配列を上記のァミノ酸シ一ケンサ一で分析した。このフラグメントのアミノ酸配列は配列表の配列番号 2の通りであつた。

この精製タンパク質 A u gZS S u l に 0. 4 %チォグリコール酸を含む濃塩酸 2 5 u 1 を添加し、真空封管下 1 1 0°Cで 2 2時間加水分解後、塩酸を減圧乾固し、ついでこれを蒸留水に溶解後、アミノ酸分析計（日立 8 3 5型アミノ酸分析計）で分析を行った。結果を表 1に示す。表 1

実施例 3

抗ヒトフィプロネクチンモノク口一ナル抗体を用いた F D F - 3の解析：

実施例 2の N末端ァミノ酸配列、部分ァミノ酸配列およびアミノ酸組成より、 F D F— 3がフイブロネクチンの C末端断片であることが明らかにされたので、抗ヒトフイブロネクチンモノクローナル抗体を用いて、 FD F ー 3の解析を行った。ヒトフイブロネクチンはサ一モリシンやトリプシンによる限定分解によりいくつかの断片に分解されることが知られており [S e k i g u c h i : K . e t . a 1. ： J . B i o l . C h e m . ， 2 6 0 5 1 0 5 ( 1 9 8 5 ) ] 、抗フイブロネクチンノクローナル抗体 F N 8 — 1 2はサ—モリシンにより限定分解される分子量 2. 2万の断片を認識し、 F N 1 — 1 は同様にして限定分解されて得られる分子量約 6 0 0 0のジスルフィド結合した二量体を認識する。第 1図に、サーモリシンによるフイブロネクチンの限定分解断片と各モノクローナル抗体認識ドメイン模式図を示す。 [ I c h i h a r a — T a n a k a , K. ， e t . a 1 . J . B i o 1 . C h e m. 2 6 5 , 4 0 1 ( 1 9 9 0 ) 、 K a t a y a m a , M . , e t . a 1 . C l i n . C h e m.

3 7 , 4 6 6 ( 1 9 9 1 ) ] o

実施例 1で得られた F D F — 3およびヒトフィブロネクチン（ィヮキ硝子）還元下で S D S —ポリアクリルァミド電気泳動（ 4 — 2 0 %) にかけた。その後、二ト口セルロースメンブレンにウェスタンブロットし、メンプレンをスキムミルクでブロッキングした後、 F N 8 — 1 2または F N 1 — 1 (いずれもタカラ酒造より購入した）を加え 1時間反応させた。洗浄後、ホースラディシュぺルォキシダーゼで標識した抗マウス I g抗体を加え、 1 時間反応させ、洗浄後、 E C L システム（アマシャムより購入）にてモノクローナル抗体に反応する蛋白質を検出した。その結果、 F N 8 — 1 2は F D F — 3を認識するが F N 1 — 1では認識されないことが判明した。以上のことから、 F D F — 3は C末端にジスルフィド結合を持たないことが示唆された。実施例 4 .

マウス骨髄細胞を用いる造血幹細胞に対する増殖活性の測定：

B D F！雌性マウスに 1 5 O m gZK gの 5—フルォロウラシルを静注し、 48時間後に大腿骨から骨髄細胞を採取した。

培養は I s c 0 V e らの方法を改変したメチルセル口ース法にて行った。 5 X 1 0⁴ 個の骨髄細胞を以下の組成の無血清培地に加え、 1 m l とした。

α—メディウム、 0. 9 %メチルセルロース、 l % c r y s t a l 1 i z e d d e i o n i z e d b o v i n e s e r um a l b um i n、 S O O u g/m l F e— s a t e r a t e d h um a n t r a n s f e r r i n、 1 6 0 u gZm l s o y b e a n 1 e c t h i n (S i gm a社製）、 9 6 u g/'m l コレステロール（ナカライ）、 1 0 - 4 M 2 - M e r c a p t o e t h a n o 及び試料或いは各種造血因子を加えたものを各々培地として、 3 5mmL u x c u 1 t u r e d i s hに分注した。各造血因子は以下の濃度で添加した： r m u I L— 3 (コスモバイオ）： 2 0 0 uZm l、 r h u G- C S F (コスモバイオ）： 2 0 u Zm 1。

培養は、 3 7で、 5 % C 0₂ 、湿度 1 0 0 %の培養器内で培養した。

-培養 12日間後のコロニーを倒立顕微鏡下にて観察し、各コロニー数を算定した。結果を表 2 に示す。 . 表 2 5 FU処理マウス骨髄細胞に対する FDF— 3の造血幹細胞増殖活性

FDF-3 900 n g/ml

I L-3 100 u/ml

G-C S F o 0 n g / m 1 実施例 5

実施例 4の G— C S Fの代わりに、マウス · ステムセルファクター（m S C F ) を用いて、実施例 4 と同様の測定をした。結果を表 3 に示す。表— 3 5 F U処理マウス骨雠細胞に対する F D F一 3の造血幹細胞増殖活性

FDF-3:200ng/ml

SCF :100ng/ral

9 実施例 6 .

ヒトさい帯血単球を用いた血液細胞の増殖活性の測定：ヒト臍帯血より単球を分離し、実施例 4に記載した培地を用いて、試料または各種造血因子を加えて、 3 7 C、 5 % C 0 . 5 % N ₂、湿度 1 0 0 %の培養器内で培養した。培養 1 4 日目および 2 1 日目のコロニーを倒立顕微鏡下にて観察し、各コロニー数を算定した。結果を表 4に示す。培養に加えた試料および造血因子の濃度は F D F - 3 ： 1 β g /m 1 _Λ ヒトフイブロネクチン（イワキ）： 1 0 ;t/ g Zm l 、ヒト G M— C S F (コスモバイォ） i S O n g Zm l である。

表— 4 ヒトさい帯血単球に対する F D F— 3の造血作用

F D F- 3 ： 1 g/m 1 フィブロネクチン： 1 0 # g/m 1 h GM- C S F ： 50 n g/m 1

実施例 7

組換え型 F D F— 3の作製：

( 1 ) ヒト正常線維芽細胞 mR N Aの単離

ヒト正常線維芽細胞より塩化リチゥム Z尿素法 [ A u f f r a y e t . a 1. , E u r . J . B i o c h e m. 1 0 7, 3 0 3 ( 1 9 8 0 ) ] にて RNAを調製した。得られた RN Aを I mM E D T Aを含む 1 0 mM トリス塩酸バッファー（P H 7. 5) (以下 T Eと略する。）に溶解し、 7 0 C、 5分間加熱処理した後、 1 M L i C 1 を含む T Eを同量加えた。 0. 5 M L i C

1 を含む T Eで平衡化したオリゴ d Tセルロースカラムに RN A溶液を添加し、同バッファ一にて洗浄後、 0. 0 1 % S D Sを含む 2 mME D T A溶液（ p H 7. 5 ) で吸着したポリ（A) RNAを溶出した。

(2) F D F— 3 c D N Aのクローニング

実施例 2および 3から、 F D F— 3はフィブロネクチンの断片であることがわかったので、 F D F— 3の N末端ァミノ酸配列に相同なフイブロネクチンの塩基配列

[K o r n b l i h t t , A. e t . a 1. N u c l e i c A c i d s R e s . 1 2， 5 8 5 3 ( 1 9 8 4)

] に基づいてセンスプライマーを、フイブロネクチンの C末端の塩基配列に基づいてァンチセンスプライマーを ' D N Aシンセサイザ一にて合成した。プライマーの塩基配列を以下に示す。

センスプライマー： 5 ' A A C C A A C C T A C G G A T G A C T C 3 ' (配列表の配列番号 3 ) .

アンチセンスプライマ一： 5 ' T T A G T C T C G G G A AT C T T C T C 3 ' (配列表の配列番号 4) 上記（ 1) で得られた 1 gのポリ（A) RN Aを用いて G u b l e r らの方法 [G u b l e r , V. , e t . a 1. G e n e . 2 5 , 2 3 6 ( 1 9 8 7 ) ] に準じて c D N Aを合成した。合成された c D N Aの 1 /2 0量と上記 2種類のプライマーをそれぞれ 2 0 p m o 1 を 0. 5 m 1 のミクロ遠心管に取り、 2 0 mMトリス塩酸バッファー（p H 8. 3 ) ， 1. 5 mM M g C 1 ₂ , 2 5 mM K C 1 , 1 0 0 g / 1 ゼラチン， 5 0 M 各 d N T P, 4単位 T a q D N Aポリメラーゼとなるように各試薬を加え、全量を 1 0 0 1 とする。 D N Aの変牲条件を 9 4 〇で 1分、プライマーのァニ一リング条件を 5 8 Cで 2分、プライマーの伸長条件を 7 2 C で 3分の各条件'で P e r k i n— E l m e r C e t u s社の D N Aサーマルサイクラ一を用い、 3 5サイクル反応させた。これを 1 %ァガロースゲルにて電気泳動し、約 5 7 0 b pの D N A断片を常法（M o l e c u l a r C l o n i n g. C o l d S r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y. N e Y o r k, 1 9 8 2 ) に従って調製した。

(3 ) F D F— 3発現ベクターの調製

第 2図に、発現べクター p S Rひ F N 1 4の作製方法を示す。発現ベクター p c D L— S Rな 2 9 6 [T a k e b e， Y. , e t . a l . M o l . C e l l .. B i o 1. _8 , 4 4 6 ( 1 9 8 8 ) ] を制限酵素 E c o R I および K p n Iで消化し、アルカリホスファタ一ゼにて脱燐酸化しておく。一方、マウス I L一 6 c D N Aをクロ —ン化したベクター p H P l B 5 [V a n S n i c k,

J . , e t . a 1. E u r . J . I mm u n o l . 1—8, 1 9 3 ( 1 9 8 8 ) ] を D r a Iで消化し、 T 4 D N A リガーゼにて K p n I リンカ一を連結した。さらに、これを E c o R I および K p_n Iで消化後、 1 %ァガロースゲルにて電気泳動し、マウス I L— 6 c D N Aを含む約 8 3 0 b pの DN A断片を常法に従い調製した。この D N A断片を、先に調製した p c D L— S R α 2 9 6に Τ 4 D N Αリガーゼを用いて連結した。これを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミド DNAを常法（M o l e c u l a r C l o n i n g.

C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y . N e Y o r k, 1 9 8 2) により調製し、マウス I L一 6発現ベクター p S R a m l L— 6を得た。

p S R am I L - 6を制限酵素 A c c I I Iで消化し、 D NAポリメラーゼ I (K l e n o w断片）にて平滑末端とした後、アルカリフォスファタ一ゼで脱リン酸化しておく。一方、（2) で得られた F D F— 3 c D NA断片を常法に従って、 T 4 D N Aポリメラーゼで平滑末端とし、さらに T 4 D N Aキナーゼでリン酸化する。この D N A断片を上記で得られた Aに T 4 D N Aリガーゼで連結した。これを用いて大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミド DNAを常法によりプラスミド D N Aを調製した。次にこのプラスミド D NAを制限酵素 E c 0 R Iで消化することにより目的の D N A断片が組み込まれていることを確認し（該ベクターを p S R a F N 1 4と呼ぶ）、 G e n e s i s 2 0 0 0 D A a n a l y s i s s y s t e m (ァュポン社) を用いて、ダイデォキシ法 [P r o b e r e t . a 1. S c i e n c e. 2 3 8， 3 3 6 (1 9 8 7) ] で F D F— 3 c D N Aの塩基配列を決定した（配列表の配列番号 5の 1番目から 5 6 7番目までの塩基配列）。

(4) 動物細胞での F D F— 3の発現。

上記（3) で得られた p S R a F N 1 4はマウス I L — 6と F D F— 3のキメラ蛋白質を発現するべクターである。 N末端の 7つのアミノ酸（P h e P r o ' T h r S e r G i n V a 1 A r g) がマウス I L— 6由来であり、それに続いて F D F— 3の配列となる。 1 O ju gの p S R a F N 1 4を 5 O mMトリス塩酸バッファー（p H 7. 5) ， 4 0 0 μ gZm 1の D E A Eデキストラン（フアルマシア社）および 1 0 0 / Mのクロ口キン（シグマ社）を含む 4m lの RPM I 1 64 0培地に加えておく。一方、直径 1 0 cmのディシュに 1 0 %ゥシ胎児血清（ギブコ社）を含む R P M I 1 640培地で、 5 0 %コンフルェントになるまで培養した C 0 S ー 1細胞（AT C C CRL— 1 6 5 0 ) を P B Sで 1 回洗浄した後、上記で得た 4 m 1 の D N A混合液を加え、 5 % C 0 ₂、 3 7 Cの条件下で培養した。 4時間後、細胞を P B Sで洗浄した後、 2 0 m l の R P M I 1 6 4 0 培地にて 5 %、 3 7 Cの条件で 4 日間培養した。培養上清を集め、これに 8 0 %飽和となるように硫酸アンモニゥムを徐々に加え溶解した後、 4 Cに一夜置いた。 6 5 0 0回転で 2 0分間遠心することにより沈殿を集め、 2 0 mM トリス塩酸バッファー（ p H 8. 0 ) で溶解し、同バッファ一にて十分透析し、硫安濃縮液とした。

1 0 β I の硫安濃縮液を還元下で S D S —ポリアクリルァミド電気泳動（ 4 一 2 0 %) にかけた。その後、二トロセルロースメンブレンにウェスタンプロットし、メンブレンをスキムミルクでブロッキングした後、 F N 8 - 1 2 (夕カラ酒造より購入した）を加え 1時間反応させた。洗浄後、ホースラディシュペルォキシダーゼで標識した抗マウス I g抗体を加え、 1時間反応させ、洗浄後、 E C L システム（アマシャムより購入）にてモノクローナル抗体に反応する蛋白質を検出した。その結果、は F D F — 3の発現が確認された。

( 5 ) 組換え型 F D F— 3の生物活性

上記（ 4 ) に示した様に、 p S R a F N 1 4を C O S 一 1細胞に導入し、 4 日間培養して得られた培養上清の F D F - 3の生物活性を実施例 4に示した方法で測定した。 C O S — 1細胞中にはサル I L 一 6が存在しているので、この活性を中和するために抗ヒト I L 一 6抗体を加えて活性を測定した。その結果、表 5に示す様に組換え型 F D F — 3に天然型と同様に生物活性が認められた。

実施例 8

C末端ァミノ酸配列が異なる F D F— 3の c D N Aのクローニング：

実施例 7 (2) のアンチセンサープライマーの代わりに、以下に示す 7種の配列のものを用い、実施例 7 (2) および（3) と同様の方法により、アンチセンサーブライマ一に対応する C末端アミノ酸が異なる 7種類の F D F - 3 c D NAの塩基配列を決定した。

ァンチセンサーブライマ一：

a ： 5 ' T T AAT TAA C AT TA G T G T T

T G T T C T 3 ' (配列表の配列番号 6 ) b ： 5 ' TT AAA C ATTA G T G T T T G T

T C T C T G 3 ' (配列表の配列番号 7) c ： 5 ' T TAAT TA G T G T T T G T T C T

C T G A T G 3 ' (配列表の配列番号 8 ) d ： 5 ' T TAA G T G T T T G T T C T C T G

A T G G T A 3 ' (配列表の配列番号 9) e ： 5 ' TT A G TT T G T T C T C T G AT G

G T A T C T 3 ' (配列表の配列番号 1 0) f ： 5 ' T T AT G TT C T C T G AT G G T A

T C T C T G 3 ' (配列表の配列番号 1 1 ) g ： 5 ' T T A T C T C T G AT G G T AT C T C T G A G A 3 ' (配列表の配列番号 1 2) 決定した塩基配列はそれぞれ、配列表の配列番号 5に示した塩基配列の、 1番目から 4 8 6番目までの塩基配列、 1番目から 4 8 9番目までの塩基配列、 1番目から 4 9 2番目までの塩基配列、 1番目から 4 9 5番目までの塩基配列、 1番目から 4 9 8番目までの塩基配列、 1 番目から 5 0 1番目までの塩基配列、および 1番目から 5 0 4番目までの塩基配列である。産業上の利用可能性

本発明の生理活性夕ンパク質はマウス骨髄細胞を用いた評価系において造血幹細胞の増殖を支持することから、本発明の生理活性タンパク質を有効成分とする幹細胞増加剤として、骨髄抑制（例えば抗癌剤使用後や骨髄移植後等）に対する治療、或いは骨髄機能不全（例えば再生不良性貧血等）に対する治療、或いは末梢血幹細胞及び骨髄幹細胞の i n V i t r o増加剤として骨髄移植治療の用途に利用することができる。また本発明の生理活性タンパク質は、巨核球コロニーを刺激することから血小板増加剤として、さらに好中球を増加させることから白血球減少症治療剤として利用することができる。

配列表配列番号： 1

配列の長さ： 20

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：タンパク質

フラグメント型： N末端フラグメント

配列

Asn Gin Pro Thr Asp Asp Ser Cys Phe Asp Pro Tyr Thr Va 1 Ser His

1 5 10 15

Tyr Ala Val Gly

20

配列番号： 2

配列の長さ： 10

配列の型：アミノ酸

トポロジー：直鎖状

配列の種類：タンパク質

フラグメント型：中間部フラグメント

配列

Thr Tyr His Val Gly Glu Gin Trp Gin Lys

1 5 10 S列番号： 3

配列の長さ： 20

se列の型：核酸

鎖の数：一本鏆

トポロジー：直鎖状

S2列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

AACCAACCTA CGGATGACTC 20

配列番号： 4

配列の長さ： 20

E列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TTAGTCTCGG GAATCTTCTC 20

配列番号： 5

配列の長さ： 5 6 7

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖伏

配列の種類： c D N A o m R N A

配列

AAC CAA CCT ACG GAT GAC TCG TGC TTT GAC CCC TAC ACA GTT TCC CAT 48 Asn Gin Pro Thr Asp Asp Ser Cys Phe Asp Pro Tyr Thr Val Ser His

1 5 10 15

TAT GCC GTT GGA GAT GAG TGG GAA CGA ATG TCT GAA TCA GGC TTT AAA

Tyr Ala Val Gly Asp Glu Trp Glu Arg Met Ser Glu Ser Gly Phe Lys

20 25 30

CTG TTG TGC CAG TGC TTA GGC TTT GGA ACT GGT CAT TTC AGA TGT GAT 144 Leu Leu Cys Gin Cys Leu Gly Phe Gly Ser Gly His Phe Arg Cys Asp

35 40 45

TCA TCT AGA TGG TGC CAT GAC AAT GGT GTG AAC TAC AAG ATT GGA GAG 192 Ser Ser Arg Trp Cys His Asp Asn Gly Val Asn Tyr Lys lie Gly Glu

9 50 55 60 6

AAG TGG GAC CGT CAG GGA GAA AAT GGC CAG ATG ATG AGC TGC ACA TGT 240 Lys Trp Asp Arg Gin Gly Glu Asn Gly Gin Met Met Ser Cys Thr Cys

65 70 75 80

CTT GGG AAC GGA AAA GGA GAA TTC AAG TGT GAC CCT CAT GAG GCA ACG 288 Leu Gly Asn Gly Lys Gly Glu Phe し ys Cys Asp Pro His Glu Ala Thr

85 90 95

TGT TAC GAT GAT GGG AAG ACA TAC CAC GTA GGA GAA CAG TGG CAG AAG 336 Cys Tyr Asp Asp Gly Lys Thr Tyr His Val Gly Glu Gin Trp Gin Lys

100 105 110 GAA TAT CTC GGT GCC ATT TGC TCC TGC ACA TGC TTT GGA GGC CAG CGG 384 Glu Tyr Leu Gly Ala lie Cys Ser Cys Thr Cys Phe Gly Gly Gin Arg

115 120 125

GGC TGG CGC TGT GAC AAC TGC CGC AGA CCT GGG GGT GAA CCC AGT CCC 432 Gly Trp Arg Cys Asp Asn Cys Arg Arg Pro Gly Gly Glu Pro Ser Pro

130 135 140

GAA GGC ACT ACT GGC CAG TCC TAC AAC CAG TAT TCT CAG AGA TAC CAT 480 Glu Gly Thr Thr Gly Gin Ser Tyr Asn Gin Tyr Ser Gin Arg Tyr His

145 150 155 160

CAG AGA ACA AAC ACT AAT GTT AAT TGC CCA ATT GAG TGC TTC ATG CCT 528 Gin Arg Thr Asn Thr Asn Val Asn Cys Pro He Glu Cys Phe Met Pro

165 170 175

TTA GAT GTA CAG GCT GAC AGA GAA GAT TCC CGA GAG TAA 567 Leu Asp Val Gin Ala Asp Arg Glu Asp Ser Arg Glu ***

180 185

配列番号： 6 ' 配列の長さ： 24

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TTAATTAACA TTAGTGTTTG TTCT 24

配列番号： Ί

配列の長さ： 24

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TTAAACATTA GTGTTTGTTC TCTG 24

配列番号： 8

配列の長さ： 24

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖伏

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TTAATTAGTG TTTGTTCTCT GATG 24 配列番号： 9 ' 配列の長さ： 24

E列の型：核酸

鎮の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TTAAGTGTTT GTTCTCTGAT GGTA 24

配列番号： 10

配列の長さ： 24

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

S2列の種類：他の核酸合成 D N A

配列

TTAGTTTGTT CTCTGATGGT ATCT 2

E列番号： 11

列の長さ： 24

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TTATGTTCTC TGATGGTATC TCTG 24 配列番号： 12 '

配列の長さ： 24

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

TTATCTCTGA TGGTATCTCT GAGA 24

Claims

請求の範囲 _

1. 未分化造血幹細胞に対する増殖活性を有し、分子量が 1 8, 000 ± 2, 00 0の下記 Ν末端アミノ酸配列を有する新規生理活性タンパク質。

Asn Gin Pro Thr Asp Asp Ser Cy s Phe Asp Pro Ty r

1 5 10

Thr Va 1 Ser His Tyr Ala Va 1 Gly

15 20

2. 下記部分アミノ酸配列を有する請求の範囲第 1項記載の新規生理活性タンパク質。

Thr Tyr His Val Gly Glu Gin Trp Gin Lys

1 5 10

3. 表 1のアミノ酸組成を有する請求の範囲第 1項または第 2項記載の新規生理活性夕ンパク質。

4. 配列表の配列番号 5に示したアミノ酸配列の、' 1番目から 162番目までのアミノ酸配列からなる新規生理活性タンパク質。

5. 配列表の配列番号 5に示したアミノ酸配列の、 1番目から 16 3番目までのアミノ酸配列からなる新規生理活性タンパク質。

6. 配列表の配列番号 5に示したアミノ酸配列の、 1番目から 1 64番目までのアミノ酸配列からなる新規生理活性タンパク質。

7. 配列表の配列番号 5に示したアミノ酸配列の、 1番目から 1 65番目までのアミノ酸配列からなる新規生理活性タンパク質。 -

8. 配列表の配列番号 5に示したアミノ酸配列の、 1番目から 1 6 6番目までのアミノ酸配列からなる新規生理活性タンパク質。

9. 配列表の配列番号 5に示したアミノ酸配列の、 1番目から 1 6 7番目までのアミノ酸配列からなる新規生理活性夕ンパク質。

1 0. 配列表の配列番号 5に示したアミノ酸配列の、 1 番目から 1 6 8番目までのアミノ酸配列からなる新規生理活性タンパク質。

1 1. 配列表の配列番号 5に示したアミノ酸配列の、 1 番目から 1 8 8番目までのアミノ酸配列からなる新規生理活性タンパク質。

1 2. 請求の範囲第 1〜 1 1項記載の生理活性タンパク質をコードする D N A。

1 3. 請求の範囲第 1〜 1 1項記載の生理活性タンパク質のいずれか'をコードする D N Aを、宿主細胞中で発現可能なプロモーターの下流に連結してなる発現べクター。

1 4. 請求の範囲第 1 3項記載の発現ベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。

1 5. 請求の範囲第 1 4項記載の形質転換体を培養することを特徴とする請求の範囲第 1〜 1 1項記載の生理活性夕ンパク質の製造方法。

1 6. 請求の範囲第 1〜 1 1項記載の新規生理活性タンパク質のいずれかを有効成分として含有する造血幹細胞増加剤。 .

1 7 . 請求の範囲第 1〜 1 1項記載の新規生理活性タンパク質のいずれかを有効成分として含有する血小板増加剤。

1 8 . 請求の範囲第 1〜 1 1項記載の新規生理活性タンパク質のいずれかを有効成分として含有する白血球減少症治療剤。

1 9 . 有効成分としてさらにインターロイキン 3、顆粒球コロニー剌激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、またはステムセルフアクターを含有する請求項 1 6記載の造血幹細胞増加剤。

2 0 · 有効成分としてさらにインターロイキン 3、顆粒球コロニー剌激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、またはステムセルフアクターを含有する請求項 1 7記載の血小板増加剤。

2 1. 有効成分としてさらにインタ一ロイキン 3、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、またはステムセルフアクターを含有する請求項 1 8記載の白血球減少症治療剤。