JPS6289699A - フイブロネクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 フィブロくクチン（ＦＨｓ　）はＩａｍの付着性および
拡散、細胞の移動、細胞の形態制御、分化および腫瘍遺
伝子の形質転換のような背椎動物の各種接触方法に鍵と
なる役割を有する一種の高分子量グリコ−タン白を構成
する。すべてのこれらの生物学的活性はＦＮと細胞およ
びＦＮと細胞外物質の相互作用を意味する。コラー２ン
、ヘパリン、フィブリン、ａ泡表面、細菌およびＤＮＡ
に対する結合活性はＦＭＪ分子のそれぞれ異る領域にあ
る（総説に対してはヤマダ、１９８６参照）ＯＦＮは機
能的にも、構造的にももつとも多面的既知タン白の１つ
である。ＦＮ分子は通例相似するが、同一ではない分子
量＝２５０，０００のポリペゾチＶの二量体である。細
胞ＦＮは噴維芽細胞および他の訓胞タイプの細胞外マト
リックスの細繊維成分に見出される。血漿ＦＮは血漿に
高濃度で（５００μ９／ｍｌ）含まれる可溶性分子で、
恐らくはオゾソニン作用、創傷の癒合および止血（ヤマ
ダ、１９８５　；　Ｈｙｎｅｓ＆Ｙａｍａｄａ、　１９
８２　）に含まれるものであろう。部分的−文構造デー
タは２個のＦＮ形間および異る種からのＦＮのうちの双
方に高保持アミノ酸配列を示した：牛の血漿（Ｐｅｔｅ
−ｒｓ　ｅｎら、１９８！ｌ）、牛の細胞質（Ｋｏｒｎ
ｂｌｉｈｔｔら、１９８３）、ヒトの血ｑ　（Ｐａｎｄ
ｅ　＆　５ｈｉｖｅｌｙ　１９８２；　Ｇａｒｃｉａ−
Ｐａｒｄｏら、１９８５）、ヒトの細胞質（Ｋｏｒｎｂ
ｌｉｈｔｔら、１９８５．１９８４ａ；　Ｏｌｄｂｅｒ
ｇら、１９８５）、ラットの血漿（５ｃｂｙａｒｚｂａ
ｕｅｒら、１９８５）。これらのデータは基本的ＦＮ−
リペデチドは５つの異るタイプの内部反復を含むことを
確証するのに役立った〔牛血漿ＦＮに最初に示されるよ
うに相同タイプＩＸ　ＩＦおよび■、それぞれ約４０．
６０および９０個のアミノ酸の長さく　Ｓｋｏｒｓｔｅ
ｎｇａａｒｄら、１９８２　；　Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、
１９８３））。この基本的フィブロネクチン構造の変化
は細胞質および血漿フィブロネクチン間の差異および画
形のｚリペデチド鎖間の差異をも説明する。フィブロネ
クチンの多様形は第二の（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　）
スプライシングｔ−経た通常の前駆体に１個の遺伝子を
転写することにより生ずるように思われる（　Ｖｉｂｅ
−Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９８４）。

今日までこのタイプの変化が起こる少なくとも２つの領
域が記載されている。あるヒトのセルラインでは（繊維
芽細胞、Ｈｓ　５７８Ｔ　）　ＦＮｍＲＮＡは正確に相
同タイプ■の１つをコード化する２７０ニユ一クレオチ
ド部分（ＨＤ）　Ｋより区別することができる。このＥ
Ｄ部分は血漿ＦＨの起源である肝細胞ｍＲＮＡに存在し
ないようである（　Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔら、１９８５
．１９８４　ｂ　）ｏ　　Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｅｒら
（１９８５）はｇｎ領域タタン白３′カルざキシ末端側
部に位置する区域（ＩＩ［Ｃ８）で異るラット肝臓の第
二のスプライシングにより生ずる３つの異るＦ　Ｎ　ｍ
ＲＮＡを報告した。異る配列は既知内部相同のいずれに
も稿さず、最後の２つのタイゾ■相同反復間に、末端Ｃ
０ＯＨの近くに挿入される。さらに悔涙ら（１９８５）
はヒト肝臓Ｆ　Ｎ　ｍＲＮＡの等し１４［［ＣＳ区域に
、この区域に対し全体ｆ、５のモチーフに導く別の変化
を報告し念。ＦＮｄｅリペゾチド間に認められる差異は
シレーｍＲＮＡの少なくとも２つの特殊領域における第
二のスプライシングに基づ＜　（Ｔａｍｋｕｎら、１９
８４　；　’ｖｉｂｅ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９８４
；悔涙ら、１９８５）内部−次起動の変化の結果である
（　Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔら、１９８４　ａ　、　　ｌ
　９３４　ｂ　；　５ｃｂｙａｒｚｂａｕｅｒら、１９
８５）。

成人ヒトＦＮポリペプチドの完全なアミノ酸配列は下記
複数のｃＤＮＡクローンのニュークレオチド配列から決
定されるようになった。ポリペプチドの長さは内部に別
のスプライシングが起こることにより２１４６〜２３２
５アミノ酸に変化する。

本発明はフィブロネクチン分子の任意の所望部分、特に
その他のものとは別のフィブロネクチンの各結合活性を
有するポリペプチドを供することができる。第２図では
ＦＮアミノ酸配列の各部分の結合部位が示される。これ
らのいくつかのものｈａ知であるが、ヒトコラーテン結
合部位の配列は新しい（図のライン８〜１３）。タイプ
■相同をきむライン９および１０は特別の意ｆｉｔ−有
し、コラーゲン結合能の大部分又はすべてを含むと信じ
られる。

本発明は第２図に示す２７７〜５７７のアミノ酸配列を
実質的に有し、又はコラーゲン結合能を有するその任意
の連続部分、特に６７９〜４４５の配列を有する新規ポ
リペプチドを供する。実際にこのようなポリペプチドは
フィブロネクチン分子自体の付加的残基を含む、コラー
ゲン結合ポリペプチドの所望の末端使用に影響しないさ
らに別のアミノ酸残基に結合することができる＠同様に
フィブロネクチン分子の他の配列は他の分子に結合する
これらの能力に対し利用できる０＠２図に示すように２
１〜２４１のポリペプチド配列はフィブリン、ヘパリン
および５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕＳに対
する結合に連結する。示されるように他の配列はＤＮＡ
　、細胞および別のヘパリンおよびフィブリン結合部位
に対する結合に連結する。

新規ポリペプチドはぼりペプチドをコーｖし、代謝産物
からｔｉｅ　＋７ペゾチドを分離する内在ＤＮＡを含む
細胞を培養することにより製造できる。適当なりＮＡ配
列はＥ、　ｃｏｌｉ又は他の微生物、例えばＳａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母
のコンぎテント株をクローンすることができる。後者は
培養され、次に所望のポリペプチドは培養生成物から単
離される。°第６図はフィブロネクチンおよび関連アミ
ノ酸残基の完全なりＮＡ配列を示し、これからフィブロ
ネクチン分子の任意の所望部分の発現をクローニングす
るための所要のｃＮＤＡ配列は容易に決定できる。

コラーテン結合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は
１１４７配位〜１３５１配位にあり、フィシリン結合ポ
リペプチドをコードする配列は７５〜７５８配位にある
。

しかし、さらに詳細に本発明によれば、ｐＦ’Ｈ５４，
１）ＦＨｌ　３４、ｐＦ’Ｈ１６およびｐＦＨ６とじて
記載するクローンおよび同様のクローンはＥ、　ｃｏｌ
ｉ沿よび他の適当な微生物に発現することにより相当す
るポリペゾチｒの製造に使用できる。ｐＦＨ１３４匂よ
びｐＦＨ１６はフィブロネクチン分子のコラーテン結合
部分に対するＩ）ＮＡ配列を含み、フィブロネクチンの
コラーーン結合活性を有し、他の結合親和性を有しない
ポリペプチドを生成するために使用できる。Ｉ）ＦＨ６
はポリペプチド結合フィブリンおよびヘパリンの発現に
対しコンビテン）　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ｔ−形質変換する
ために使用することができる。

クローンｐＦａ５４、ｐＦＨ１３４およびｐＦＨ１６を
得る方法は下記する。引用方法の反復により本質的に同
一か又は僅かに異る実用性を有する同様のクローンが得
られるであろう。これに関連して適当な起源、すなわち
所望のタン白又はポリペプチドをもともと発現できる細
胞からの全細胞質ＲＮＡ　’ｉ使用する有用なｃＤＮＡ
の単離は現在利用できる技ｒｒｔ−使用し、特に水切Ｉ
ｆｍ書における場合のように所望タン白又はポリペプチ
ドの実際のアミノ酸配列および相当するＤＮＡ配列はい
ずれも既知である場合、当業者には日常的試験に属する
事柄であることが認められるであろう。下記試験部分は
有効であることがわかった適当な技術を記載するが、他
の既知技術も同様に適用できることは予期されるであろ
う。試験者が入手しうる多数の材料から形質変換に対し
ＲＮＡ　、ベクターおよびコンぎテント微生物の適当な
起源の同様の選択は当業者の通常技術内にある。

フィブロネクチンの所望のアミノ酸配列が形質変換微生
物により発現される場合、微生物自体のポリペプチド特
性と連合できることは認められるであろう。これはポリ
ペプチドの意図的使用に対し重要ではないが、ある場合
例えばぼりペプチドが治療に使用される場合、付加的ア
ミノ酸残基の存在は許容しえない。その場合ポリペプチ
ドは例えばデｑテアーゼにより付加的処理して望ましく
ない付和的アミノ酸残基を含まない所望のぼりペプチド
を分離しなければならない。

上記のように、本発明はコラーゲンおよび／又はフィブ
リンに結合しうるポリペプチドを発現することができる
ように適当な微生物を形質変換する手段を供することに
特別の関心がある。コラー２ンに結合できるポリペプチ
ドは例えば貴重なポリペプチドの親和精製を助けるため
に使用できる。

コラーゲン結合ポリペデチｒは別の関心のある？リペプ
チドに結合する形で発現される場合、又はこのような＆
　ＩＪペプチドに単離後結合する場合、結合ポリペプチ
ドは結合ゼラチン（すなわちコラーゲン）カラム上で親
和クロマト“グラフィにより、ｆｉｌｆ製し、次にｆ＃
製後後所望ポリペプチドは例えＩｌ！酵素加水分解によ
りコラーゲン結合ポリペプチドから分離できる。

フィブリンに結合できるポリペプチドは天然フィブリン
、例えば血餅に対する治療剤を目標とする治療に使用で
きる。例えば、ポリペプチドに結合するフィシリン分解
酵素は改良された血餅溶解性をπ１これはその目標に対
する改良粘着性を百するからである。

図面において、第１図はヒ）　Ｆ　Ｎ　ｍＲＮＡ０前１
ノ囚尾部から７３９２ニユークレオチドをカバーする７
つのｃ　ＤＮＡクローンの制限酵素マツプを示す。

ヒトＦ　Ｎ　ｍＲＮＡは７９００ニユークレオチｒの長
さであると見積もられる（　Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔら、
１９８５）。

クローンは成熟タン白質（下図は結合部位を示す）に対
する完全なコード領域および５′非コード領域をカバー
する。点線は相当するｃＤＮＡクローンて存在しない部
分を示すが、これは最初のストランドｃＤＮＡ反応で合
成されなければならない。そしてこれはフレノウ酵素の
不足の結果として失なわれ、二次ｃＤＮＡストランドを
完結させる。マツプの数字は塩基対にある。

第２図はヒ）ＦＮ！ｌ？リペゾチドの完全なアミノ酸配
列を示す。残基１および２５２５は成熟タン白のＮＨ２
および末ｉ　Ｃ０ＯＨである。配列は第１図描写のｃＤ
ＮＡクローンのニュークレオチド配列（第５図参照）か
ら推定される。線列は内部相同を示す。ギヤングは相同
ｔ−最高化するために導入された。１タイプの相同内の
同一残基は枠組みされる。

細胞認識テトラペゾチドＲＧＤＳ　（Ｐｉｅｒｓｃｈｂ
ａｃｈｅｒ　＆Ｒｕ０８１ａｈｔｉｌ　１９８４　）は
強調される。位置１７（Ｓｅｒ　）　、２１　（Ｃｙｓ
　）および４２　（Ｖａｌ　）はＧａｒｃｉａ−Ｐａｒ
ｄｏら（１９８３）によりそれぞれＣｙｓ　。

８ｅｒおよびＡｌａとして報告される。この図に示され
るＦＮポリペプチドは分子量＝２５５，９０５を有する
２５２５残基を有する。炭水化物側鎖を有し、９％のタ
ン白マスであると評価される（珈−１１９８３）マスが
添加される場合このＦＮＮポリペブチの分子量は約２７
９，０００に増加するであろう。この数字はＳＤＳ　−
ＰＡＧＥにより評価されるＦＮモノマーの分子量（２り
　０−２５０．Ｄ　００　）よりかなり高いと思われる
。ずれはその範囲の適当なタン白標準物の不足と共に高
分子汲タン白の範囲におけるＳＤＳ　ｒルの貧弱な分解
により説明できるであろう。

記号は欠の通りであるニー、遊離ＳＨ基；人炭水化物側
鎖部位；Δ、キモトリプシンの開裂部位；＾、プラスミ
ンの開裂部位。複数のフイゾロネクチンボリペデチドは
ライン２６および５０の別のスプライス領域のすべての
可能な順列により生成させることができる（下記説明）
。

第５図は第１図のｃＤＮＡクローンの配列から推定した
第２図のヒ）ＦＮｔ？リペデチ１の完全なニュークレオ
チド配列全示す。

、第４図はＦＮ−次構造の変化を示す。Ａは成熟タン白
の完全な構造である。黒ぬり枠はタイプ■相同であり、
斜線枠はタイプ■相同であり、白枠はタイプ■相同であ
る。ＢおよびＣはＥＤ頌域ＩＢ）およびｌｌ［ｃｓ領領
域Ｃ）で認められる複数Ｆ　Ｎ　ｍＡの翻訳により生じ
うる異るＦＮポリペプチドを図示する。相当するコード
化ｍＲＮＡ種を表わすｃＤＮＡクローンの名称は各ポリ
ペプチドの右側に示される。△に接触を示す。λｒ１＋
２はラットの肝″５Ｊ、　ＣＤＮＡライブラリから（Ｓ
ｃｈｗａｒｚ　ｂａｕｅｒら、１９８５）。

ｐＦＨＬ　１および８はヒト肝＠　ｃＤＮＡライブラリ
から、およびｐＦＨ１はＨｓ　５７８　Ｔセルラインｃ
ＤＮＡライブラリから（Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔら、１９
８５）単離された。すべての変化はコラーゲンおよびフ
ィブリンに結合する区域を含むことは注目される。

第５図は第１図よりさらに詳細にコラ−ｒン結合領域の
位置および内部相同（■、■および■）を示すフィブロ
ネクチンタン白の部分を示す。下記細菌発現試験におい
て使用されるＣＤＮＡ系列の位置および大きさく塩基対
における）が下記される。ｃＤＮＡ　ｐＸＦＮ　１〜８
に関連する制限酵素部位のみが示される。ｐＦＨ１５４
およびｐＦＨ１６の側部Ｈｉｎｄ　ｌ［およびＢａｎ　
Ｈ１部位はベクターのポリリンカーに存在する。

第１図はヒ）　Ｆ　Ｎ　ｍＲＮＡの成熟タン白に対する
５′非コード領域および完全コータ領域をカバーする異
るｃＤＮＡクローンの°制限マツプを示す。クローンｐ
ＦＨＩ　ＸｐＦＨｍおよびｐＦＨ１５４の単離は上記し
た（　Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔら、１９８３．１９８４　
ａ）、そして後者のニュークレオチド配列および推定ア
ミノ酸配列は以前公刊された（　Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔ
ら、１９８４ｂ）。クローンｐＦＨ５４、ｐＦＨ１５４
、ｐＦＨ１６おｊびｐＦＨ（５は新規である。図の５′
の了全カバーするこれら４つのｃＤＮＡクローンの単離
はオリゴニュークレオチドゾライマーの合成を含んだ。

プライマーの配列（すなわち、 ５−ＧＣＴＣ）ＡＡＣＣＡＴＴＴＧＣＴＧＡＧＣ）はク
ローンｐＦＨ１５４の５′の端末に近い領域のｍＲＮＡ
配列を相補するものであった。オリゴニュークレオチド
はＨｓ５７８　Ｔ細胞からの全ＲＮＡの最初の逆転写に
使用しく　Ｈａｃｋｅｔｔら、１９７７）およびｃ　Ｄ
ＮＡライブラリは下記のように調製した。クローンｐＦ
Ｈ５４、ｐＦＨ１５４、ｐＦＨ６およびｐＦＨ１６はさ
らに分析するため選択された。これらのクローンの完全
なニュークレオチド配列は測定され、７３９２　ｂｐか
ら成り、そのうちの６９７２　’ｂｐはコード領域に、
７２０　ｂｐは３′非翻訳領域およびぼり（Ａ）尾部に
和尚する。配列は第３図に示すＦＮの完全ＤＮＡ配列に
含まれる。

、　第１図のクローンのニュークレオチド配列から推定
されるヒトフィブロネクチンのアミノ酸配列は第２図に
示される。第２図の線列は内部相同を最高化する。完全
なＦＮ鎖は６つの異るタイプの内部相同（タイプ■、■
およびｍ）ｔ−有する区域および分子内に同族対応を有
しない区域を供する。

後者１ＮＨ２端末およびＣ０ＯＨ端末部分および内部連
管ストランにである。ＭＢ２−からＣ００Ｈ−末端に、
ＦＮは１つの２０残基の長さのＭＢ２−末１部分（第２
図ライン１）、５ユニツトのタイプＩ相同又はフィンカ
ー（ライン２〜６）、１つの連結ストラン１（ライン７
）、１つのフィンガー（ライン８）、２ユニツトのタイ
プ■相同（ライン９および１０）、５つのフィンが−（
ライン１１．１２および１３）、１ユニツトのタイプ■
相同（ライン１４）、１つの連結ストランド（ライン１
５）、１４ユニツトのタイプ■相同（ライン１６〜２９
、ＥＤポリペプチドをきむ）、１つの連結ストランド（
ｒｘ　ｃ’　Ｓ。

ライン３０）、１ユニツトのタイプ■相同（ライン５１
）、１連皓ストランド（ライン５２）、３フインガー（
ライン５５．５４および３５）およびＣ００Ｈ−末端部
分（ライン５６）により形成される。

ＦＮの一次構造に順序のレベルおよび任童の他のタン白
に以前に見られない複雑さを反映する。

１６ユニツトのタイプ■相同の配列における対称性は特
に興味がある。２ユニツトのタイプｍ（第２図、ライン
１４および６１）は並列方法で残りの１４を有する中心
ブロックから連結ストランド（ライン１５および５０）
により分離される。タイ−１ｍユニット内の相同度は非
常に高い。５つの残基はすべてのユニット、すなわちＴ
ｒｐ（第２図、上部の残４５９９を有する枠部分）、Ｌ
ｅｕ（上部の残基６４０を有する枠部分）およびＴｙｒ
　（上部の残基６４６を有する枠部分）に保持される。

保持残基は非相同の谷により分離されたＴｒｐおよびＴ
ｙｒの周囲の２個のピークに分配される。タイプ■配列
の順序および保持の度合いはＦＮの中心領域の二次構造
の特別の拘束を反映しなければならない。この領域にジ
サルファイド橋により安定化されない。それはタイ７°
ｒＩＩ配列に含まれる（第２図の位置１２０１および２
０７５）僅か２個のＣＹ８残基が還元形で存在すること
が示されたからである（　Ｖｉｂｅ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ
ら、１９８２；Ｓｍ１ｔｈら、１９８２）。

＾くつかの結合活性はＦＮ分子の異る領域に制癌てられ
た（第１図および＠２図参照）。しかし、細胞結合能力
の場合においてのみ、実際の結合部位が今までに確認さ
れた。実際にＰｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒおよびＲｕｏ
ｌｓａｈｔｉ　（１９８４）はテトラペプチドＡｒｇ−
Ｇｌｙ−Ａｓｐ−８ｅｒ　（ＲＧＤＳ）はＦ’Ｎの細胞
付着活性の原因となることを実証した。このテトラペプ
チドは１つのタイプ■ユニット内の１４９５〜１４９６
位置で第１４９配列に唯一度だけ存在する。第２図はこ
の区域のタイプ■配列の最適線列は、テトラペプチドが
特別の要素であると考えられる場合にのみ得られ、タイ
プ■ユニットの残りの相当する領域に４つのギャップを
与えることも示す。細胞結合部位と同様にタイプ■配列
内の他の結合部位又は生物学的活性は非保持ストレッチ
に存することは確かなようである。他のテトラペプチド
は細胞付Ｎ活性を示すフイブリノーゲンのα鎖ｔｔ６他
のタン白（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ　＆　Ｒｕｏｌ
ｓａｈｔｉ　。

１９８４）にも見出された。

ＦＮ遺伝子発現の重要な特徴は通常のｍＲＮＡ前躯体の
分化ゾロセツシングによる僅かに異るぼりペデチーの生
成である（　Ｖｉｂｅ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、１９８４
）。

第４図ＡはＦＮ分子に沿って今まで認められた可変性の
２つの領域の局限化を図で示す（Ｓｃｈｗａｒｚ−ｂａ
ｕｅｒら、ｌ　９８５　；　Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔら、
１９８４ａ１９８４ｂ）。第４図ＢおよびＣはＥＤ（第
２図、ライン２６）および１ｉｃＳ（第２図、ライン５
０）領域でそれぞれ生成する異るｍＲＮＡの翻訳により
生じうる式リペゾチドのタイプを示す。この図はヒトお
よびラット双方のフィブロネクチンに対しなされ九観察
を組み合せる。少なくとも１０の異るＦＮボリペゾチド
はＨＤおよびｌｌＩｃ５部分間のすべての順列が可能で
あると仮定する場合１個の遺伝子から生成することがで
きる。これは生体内に見出された細胞質および血漿ＦＮ
の二次元のデル電気泳動分析で認められたＦＮポリペデ
チド不均質性と一致する。同種又は異種二量体ＦＮ分子
はＦＮボリペゾチドゾールから形成することができる。

この複合状態の生物学的意義は尚明らかではない。しか
しＦＤおよび■Ｃ８の変動領域はｎ」胞−ヘパリンおよ
びヘパリン−フィブリン結合部位間に介在することは注
目されることである。分子のこれらの生物学的活性部位
間の距離はＦＮ機能に対し臨界的である。例えば、血漿
ＦＮは形態および線列を形質変換噴維芽細胞セルライン
に復帰するのく細胞質フィブロネクチンより活性の低い
１〜２オーダーの大きさである（　Ｙａｍａｄａ　＆Ｋ
ｅｎｎｅｄｙ、　１９７９　）　ｏさらにｌｌｉｉＤ部
分を有するｍＲＮＡは繊維芽細胞に存在する（ＪＢＩ胞
質ＦＮの１起源）が、肝細胞には存在しない（血［ＦＮ
の１起＃）　（Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔら、１９８４ｂ）
ｏ　ＥＤの機能は細胞結合テトラペプチドおよびヘパリ
ン結合部位間の距離全増加させることで、細胞質Ｆ’Ｎ
分子の結合活性を増強することになる。

試　　　験 ＲＮＡ調製 ヒトセルライア　Ｈｓ　５７８　Ｔ　（Ｈａｃｋｅｔｔ
ら、１９７７）を１０％牛脂児血清を含むＤｕｌｂｅｃ
ｃｏ修正Ｅａｇｌｅ培地で培養した。総ＲＮＡ　ｆ：グ
アニジンーＨＣ１法により集密的細胞単層から抽出した
（　Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、１９７９）。２〜４１Ｒ９間
の総ＲＮＡを４Ｘ１０８Ｍ胞から抽出した。

ＲＮＡの他の起源は好ましい場合、例えば喰維芽細砲又
は肝細胞を使用できる。

第１図に描写したすべてのｃＤＮＡクローンは鋳型とし
てＨｓ　５７８Ｔ細胞ＲＮＡを使用して得た。オリゴニ
ュークレオチドデローデによるクローンｐＦＨ１の単離
はＫｏｒｎｂｌｉｈｔｔら（１９８！ｌ）により記載さ
れた。クローンｐＦＨ１１１およびｐＦＨ１５４のｒ　
ｍＲＮＡ歩行（ｗａｌｋｉｎｇ　）　Ｊ　（オリゴニュ
ークレオチドゾライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ　）　］に
よる単雛はＫｏｒｎｂｌｉｈｔｔら（１９８４ａ）によ
り記載された。この最後の手順は新規クローンｐＦＨ５
４、ｐＦＨ１５４、ｐＦＨ１６およびｐＦＨ６の単離に
使用された。ｐＦＨｌ　５４の５′末端に近接するｍＲ
ＮＡ領域に相補的なオリゴニュークレオチドゾライマー
はＧａｉ　ｔら（１９８０）の方法により合成された。

オリテニュークレオチドはａｓ５７８Ｔ！胞からの総Ｒ
ＮＡのプライム逆転写に使用された（　Ｈａｃｋｅｔｔ
ら、１９７７）、プラント末４　ｄｓ　ｃＤＮＡは調製
され、上記のように’Ｂ、　ｃｏｌｉ　Ｍ　ＣＩ　Ｑ　
（５ｌ　（Ｋｏｒｎ−ｂｌｉｈｔｔ　ラ、１９Ｅｌ）の
デフ　ｘ　ミＦ　ｐＡＴ　１５５／　ｐ’ｖｕ　ｎ　／
　８　（Ａｎｓｏｎら、１９８４）にクローンされた。

コロニーは一端でフィリングすることによりラベルされ
た、プライマー配列を欠（ｐＦＨ１５４の５′末端から
の制限断片をプローブとして使用してスクリーニングし
た。この方法で、クローンｐＦＨ５４およびｐＦＨ１５
４が得られた。第２工程ではクローンｐＦＨ１６および
６がクローンｐＦＨ１５４の５′末端に対する末端ラベ
ルゾローデによりスクリーニングすることにより得られ
た。

フィブロネクチンｃＮＤＡの制限断片はＤＮＡポリメラ
ーゼＩのフレノウ断片を満たし、そしてＳａｍＩカット
／ホスファターゼ処理ｐｇｘＬ２又は５ベクターにプラ
ント末端を連結した。形質変換はカナマイシン耐性を特
定し、０１８５７対立遺伝子を有するシラスミドｐｃ　
１８５７　（Ｒｅｍａｕｔら翫１９８３１含むＥ、　ｃ
ｏｌｉ株Ｌ　Ｋ　Ｉ［（Ｚａｂｅａｎら、１９８２）を
使用して行なった。コロニーはｗｈａｔｍａｎ　５４１
個紙に移しく　Ｇｅｒｇｅｎら、１９８５）、り末端ラ
ベル（Ｍａｘａｍら、１９７７）又はニック翻訳プロー
ブ（Ｒｉｇｂｙら、１９７７）のいずれかによりスクリ
ーンされた。

配列の決定 クローンからのインサートはアがロースデル電気泳動で
分離され、電気溶離により回収された（　Ｇｉｒｗｉｔ
ｚら、１９８０）ベクターＤＮＡから適当な制限酵素で
消化することにより除去された。大部分の配列はＭａ：
ｃａｍおよびＧ１１ｂｅｒｔ　（１９８０）の化学的分
解処理により行なわれた。いくつかの領域は連鎖ターミ
ネータ法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７）により配列され
た。この目的に対し、関連断片は単離され、ＡｌｕＩ又
はＨａｅ　ｌ［のいずれかにより消化され、そのサーキ
ュラ−化を阻止するために子牛暢ホスファターゼにより
予め処理されたＳｍａ　Ｉ消化Ｍ１３ｍｐ９ベクターに
連結された（　Ｍｅｓｓｉｎｇｇｏ　Ｖｉｅｉｒａ、　
１９８２　）。連結混合物はコンビテン）　Ｅ、　ｃｏ
ｌｉ　Ｊ　Ｍ　１０１　ｔ−形質変換するために使用さ
れ、再結合物はβ−がラクトシダーゼ遺伝子のインサー
ト不活性化により透明ゾラークとして選択された（　Ｍ
ｅｓｓｉｎｇら、１９８１）。１個のストランｐ　ＤＮ
Ａは標準手順により製造され（Ｗｉｎｔｅｒ＆Ｆｉｅｌ
ｄｓ　、　１９８０　）、インサートハ「万能的」１７
−ニュークレオチドのゾライマーを使用して配列された
Ｃ　Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈら、１９８１）。

再結合シラスミｒを有する細菌は５０℃で２Ｔ時間生長
させ、ＣｒＯ／β−がラクトシダーゼ融合タン白の発現
は２時間４２℃に変えることにより誘導した。細菌は１
２００！ｑのペレットにし、５０ミリモルトリスＨＣｔ
　Ｘｐ）ｌ　７．４．１７０ミリモルｋｃｔにより洗滌
した。細胞はりゾチーム（２，５１ｎ９７　ｍｌ　）　
ｔｌ−含む同じ緩衝液に再懸濁し、２分間氷上で音波処
理した。分解物は４℃で５０分、　４５，０００ｙで遠
心分離した。ペレットは１０ミリモルトリスＨＣ１中の
７モル尿素、ｐＨ７，４，１ミリモルＢＤＴＡ中に再懸
濁し、３０分室温でインキュベートした。

可溶化抽出物は４℃で５０ミリモルトリスＨＣｔｐＨ７
，４に対し広く透析し、次に４℃で５０分、４５，００
０ｇで遠心分離した。

ゼラチン−セファロースはＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌｓ（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｏ、　ＵＳＡ　）から
得るか、又はゼラチン（豚皮タイプ■、Ｓｉｇｍａ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ　）をＣＮＢ　ｒ−活性化セファロー
スＣＬ　、　４　Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＩＵｐｐ
ｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ　）に結合させることにより
製造した。ゼラチン−セファロース上の細菌抽出物のり
ｃｙマドグラフィ１４　Ｒｕｏｓｌａｈｔｉら（１９８
２）による記載のように行なった。ゼラチン−セファロ
ースマトリックスの効力は精製ヒト血漿フイブロネクチ
ｙ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）に使用して
立証された。

５ＤＳ−ポリアクリルアミドデル電気泳動を７．５％（
Ｗ／Ｖ　）アクリルアミドスラブデル（１９）上でトリ
ス／グリシン緩衝液中の０．１％（Ｗ／Ｖ　）ＳＤＳで
行なった。デルはメタノール／水／酢酸（４二５：１、
容量で）中の０．１％クローンーブルーで染色した。イ
ムノプロッティングはＴｂｗｂｉｎら（１９７９）によ
る記載のように行なった。電気泳動によりニトロセルロ
ースに移動したポリペゾチドはウサゼ抗（ヒト血漿フィ
ブロネクチン）血清（１：５００、ホスフェート緩衝塩
水、１０％新生子牛血清および０．０５％ツイーン２０
中で）によりゾローブされた。結合免疫グロブリンはア
ルカリ性ホスファターゼ抱合山羊抗−（ウサギＩｇＧ　
）　（１：　Ｉ　Ｄ　ＯＯ；　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ　）　ｆ使用して可視化した。

タン自分析 タン白は標準として牛血清アルブミンを使用してＢｒａ
ｄｆｏｒｄ法（１９７３）により評価した。

性表示 ヒトフィブロネクチンｃＤＮＡクローンのｐＦＨｉ３４
およびｐＦＨ１６はタン白のタン自分解開裂により確認
されたフィブロネクチンのコラーゲン結合領域のすべて
又は一部を包含する（第１図および第５図参照）。従っ
てこれらのｃ　ＤＮＡはＥ、　ｃｏｌｉの機能的コラー
ゲン結合部位の発現を研究するため出発点として選択さ
れた。クローニングに対し使用されるｐＥＸベクターは
外因性遺伝子配列をλ孜プロモーターの調整下にｃｒｏ
−Ｌａｃｚバイブリド遺伝子の６′末端ですべての５つ
の読み枠のボ＋Ｊ　ＩＪンカーにインサートすることが
できる（　５ｔａｎｌｅｙら、１９８４）。１）ＦＨ１
３４およびｐＦＨ１６の１．７４ｂおよび１．０１ｃｂ
インサートの５′末端はＣＤＮＡおよびｐＥＸ　２のＳ
ｍａ　ｒ部位にクローン化されるプラント末端の読み枠
を確定するために配列された（　Ｍａｘｍａら、１９８
０）。再結合プラスミドは温度感受性λＰｒリプレッサ
ー、０１８５７ｆｔコード化するシラスミドにより予め
形質変換されたＥ。

ｃｏｌｉ株に導入された。これはｃｒｏ　／β−がラク
トシダーゼタン白の温度訪導性発現を考慮する。発現構
造体によるフィブロネクチン融合タン白の生産を試験す
るためにバイブリド形成陽性のクローンを５０℃で２Ｔ
時間生長させ、次にさらに２時間４２℃に変えた。総細
菌分解物をＳＤＳポリアクリルアミドデル電気泳動によ
り分析した。シ１ｏのｐＸＦＨ１５４構造体およびレフ
ｐＸＦＨ１６構造体はｃＤＮＡインテートの長さＣ〜１
８５ＫＤおよび〜１６５ＫＤ、それぞれ）と一致する大
きさの高分子量ポリペデチげの生産を示した。ｐＸＦＩ
（１５４および］）ＸＦＨ１６のフィブロネクチン配列
の正しい配向は制限酵素分析により確証された。

ｐＸＦＨ１５４およびｐＸＦＨ１６により生産された融
合タン白はこのベクターシステムに対し既報文と一致す
る約２０％の全細菌タン白を証明した（　５ｔａｎｌｅ
ｙら、１９８４）。両融合タン白、特にｐＸＦＨ１ろ４
ボリペゾチドはめくらかのタン自分解全示し、これμ野
生タイプのｃｒｏ　／β−がラクトシダーゼ（１１６Ｋ
Ｄ）の大きさに部分開裂されるらしい。誘導期間（０〜
１２０分）に合成されたタン白の分析はタン自分解が融
合タン白の合成に付随して起ったことを示した。

ｐＸＦＨ１Ｚ、　４　オよびｐＸＦＨ１６のフィブロネ
クチン抗原決定基の発現はウサギポリクローナル抗−（
ヒト血漿フィブロネクチン）血清を使用してイムノプロ
ッティングにより研究された。抗血清はｐＸＦＨ１３４
により合成された１　８５　ＫＤポリペプチドと反応す
るが、ｐＸＦＨ１６融合タン白又鉱ｃｒ。

／β−がラクトシダーゼボリペデチＰとは反応しない。

これは抗血清によＶ認識されるエピトープはタイプ■相
同ユニットおよび隣接するタイプ■リピートの外側にあ
ることを示す（第５図）０この観察は既報（Ｒｕｏｓｌ
ａｈｔｉら、１９７９）のヒトフィブロネクチンのコラ
ーゲン結合領域の弱い抗原性と一致し、十中へ九はこの
領域における非常に高レベルのアミノ酸保持を反映する
ものであろう（第２図）。

ゼラチン−セファロース親和クロマトグラフィＥ、　ｃ
ｏｌｉのβ−がラクトシダーゼ融合の過生産は不溶性混
合体として細胞にタン白の沈Ｓｔ生ずる（　Ｗｉｌｌｉ
ａｍｓら、１９　Ｂ　２　；　Ｃｂｅｎｇ　１９８３　
；８ｔａｎｌｅｙ　１９８５　）　ｏ　　ｐＸＦＨ１５
４プラスミドを発現する細菌が音波処理により分解され
、遠心分離される場合、フィブロネクチン融合タン白は
不溶性ペレットにもっばら見出された。このフラクショ
ンは細菌分解物の全タン白の約５０％を表わした。この
材料の可溶化は７Ｍ尿素による処理およびその後透析を
要し、６０％のタン白が溶液中に残った。融合タン日中
に非常に強化されたこのフラクションＨ５０ミリモルト
リスＨＣ’ｔＸｐＨ７，４中で平方化された５Ｍのゼラ
チン−セファロースカラムに直接適用された。カラムは
通過流のＥ２８０が＜　０．０１になるまで５０ミリモ
ルトリスＨＣ１。

ｐｉ１７．４中の０．５モルＮａＣ６により洗滌した。

ｃｒｏ／β−がラクトシダーゼフイデロネクチンハイプ
リドタン白は同じ緩衝液中の４モル尿素により１つの対
称ピークとしてカラムから溶離された。これらの条件下
でフィブロネクチンはぜラチンーセファロースから特定
的に溶離される（　Ｒｕｏｓｌａｈｔｉら、１９８２）
。ｐＥＸ　２のみを使用する対照試験では、野生タイプ
のｃｒｏ　／β−がラクトシダーゼタン白の結合は全く
認められなかった。

機能的コラーゲン結合部位は従ってｐＸＦＨ１５４融合
タン白中で再、購成された。しかし、特定的にカラムか
ら溶離される融合タン白はカラムに適用された融合タン
白のく５％を表わした。こうして細浦細胞中の融合タン
白の不溶化によりかなりの活性が失なわれることは意外
なことではない。その後これらを再溶解するために烈し
い処理が必要である。

ｐＸＦＨ１６Ｋより生産されるフィブロネクチン融合タ
ン白もゼラチン結合に対し試験がなされ、ｐＸＦＨ１５
４と同様の活性を示した。これはコラーゲン結合領域が
タン白レベルの規定領域内に存在し、２つのタイプ■お
よび隣接するタイプＩ相同ユニットに強く関係すること
を示した（第５図参照）。さらに結合部位を局限するた
めに一連の重複表現構造物をｐＦＨ１６から製造しく第
５図）、ゼラチン結合活性を系統的に分析した。結果は
表１に要約し、タイプ■相同ユニットの一貫した関連性
を示す（ｐＸＦＮ　２　、ｓおよび６）。

表　　　１ ｐＸＦ！（１５４＋ ｐＸＦＨ１６＋ ｐＸＦＮ　ｌ　　　　− ｐＸＦＮ２　　　＋ ｐＸＦＮ　５＋ ｐＸＦＮ　　４　　　　　　　　　　　　　　　　−ｐ
ＸＦＮ　　５　　　　　　　　　　　　　　　　−ｐＸ
ＦＮ　　６　　　　　　　　　　　　　　　　　＋ｐＸ
ＦＮ　７　　　　　　　　　　　　　　　　−ｐＸＦＮ
　Ｆ３　　　　　　　　　　　　　　　−ｐＥＸ２ベク
ターのみ　　　　　　　−１）ＸＦ’Ｈ５４の結合活性
は２つのタイプ「相同ユニットから成る構造物によりほ
とんど完全に説明される（　ｐＸＦＮ　３　）。ｐｘＦ
Ｎ５オヨヒｐＸＦＮ６（双方共活性）とｐＸＦＮ　５お
よびｐＸＦＮ　８　（双方共不活（４）を比奴すること
により、結合に対し臨界的のアミノ酸結合はｐＸｌ［ｉ
”Ｎ　５のフィブロネクチン断片の半分のＣ−末端にあ
り、さらに詳ｒｉ’ｊｆＪにはＨｉｎｆｌ（第６図の配
ｕ１１４７）からＲｓａ（部位（第５図の配ｕ１５５１
）にあると推定できる。この６６アミノ酸配列はフィブ
ロネクチンのほとんど全体の第２のタイ７°ＩＩ相同ユ
ニツトプラス隣接タイプＩ相同ユニツトの少数のアミノ
酸を表わす（第２図参照）。

引用文献 Ａｎｉｏｎ　ｒ　Ｄ、＋Ｃｈｏｏ　＋に、Ｈ，、Ｒ６６
１ｉ１＋Ｄ、Ｊ　、Ｇ、＋Ｇｉａｎｎｅｌｌｉ　、Ｆ、
＋Ｃｏｕｌｄｌ　Ｋ、＋　）Ｉｕ（１ｄ１６８ｔｏｎｌ
　Ｊ　、Ａ、！Ｌｎ（Ｉ　　Ｂｒｏｗｎｉｅｓ　＋Ｇ、
Ｇ。

（１９８４）　ｇｕａｏ　Ｊ、３．１０５３−１０６４
゜Ｂｒａａｒｏｒｄ　ｕ、（ｘｃ＋７ｓ）＋Ａｎａｔ、
Ｂｉｏｃｈａｍ、＋７２＋２４ｓ−２ｓ４゜Ｃｈｉｒｇ
ｗｉｎ　ｌ　Ｊ　、Ｍ、　＋ＰｒＺｙｂｙｌａ＋　Ａ、
　Ｅ−＋ＭａＣＤＯｎａｌｄ＋　Ｒ，Ｊ　、　ａｎ（Ｉ
Ｒｕｔｔｅｒ、Ｗ、Ｊ、（１９７９）　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ　１８１５２９４−５２９９゜Ｃｊｈ６ｎｌ
ｆ　Ｙ、（１９８３）　ｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ
ｐｈｙ　９　＋　Ｒｅｓ　、Ｃｏｍｍｕｎ、１１１１．
１０４−１１１゜ Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ、ｌＪ、Ｌ、　＋Ｇａ１ｔ＋Ｍ、Ｊ
、　＋ＧＯ６１６ｔ＋Ｐ、＋ＨＯｎｇ＋Ｇ、Ｆ、、　５
ｉｎｑｈ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｔｉｔｍａｓ、　Ｒ，Ｃ，
（１９８１）Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、９，１６
９１−１７０６゜Ｇａ１ｔ、　Ｍ、Ｊ、　ｅｔ　ａｌ−
（１９８０）　、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８
−、１０８１−１０９６゜ Ｇａｒｃｉａ−Ｐａｒｄｏ、　Ａ、、　Ｐｅａｒｌｓｔ
ｓｉｎ、　Ｅ、　ａｎｄ　Ｆｒａｎｇｉｏｎｅ。

Ｂ、　（１９８３）　、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２
５８．１２６７０−１２６７４゜Ｇｅｒｇｅｎ　Ｊ、Ｐ
、、　５ｔｅｒｎ　Ｒ，Ｈ，、ａｎｄ　Ｗｅｒｓｉｎｋ
　Ｐ、Ｃ，（１９７９）。

Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　　フ、２１１５−
２１３６゜Ｇｉｒｗｉｔｚ、　Ｓ、Ｃ，、Ｂａｃｃｈｅ
ｔｔｉ、　Ｓ、、　Ｒａｉｎｂｏｗ、　Ａ、Ｊ、　ａｎ
ｄＧｒａｈａｍ、　Ｆ、Ｌ＊　（１９８０）　Ａｎａｌ
、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１０６．４９２−４９６゜ Ｈａｃｋｅｔｔ、　Ａ、Ｊ、、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｈ，Ｓ
、、　５ｐｒｉｎｑｅｒ、　ＥＥＬ、、　Ｏｗｅｎｓ。

ＲｏＢ、、　Ｎｅ１ｓｏｎ−Ｒａｅｓ、　Ｗ、Ａ、、　
Ｒｌｇｑｓ、　Ｊ、Ｌ、　ａｎｄＧａｒｄｎａｒ、　Ｍ
、Ｂ、　（１９７７）　、Ｊ、ＮａｔｌａＣａｎｃｅｒ
工ｎｓｔ、　５８゜１７９５−１８００゜ Ｈｙｎａｓ、　Ｒ，Ｏ，ａｎｄ　Ｙａｒ＋ｚａｄａ、　
Ｋ、Ｍ、　　（１９８２）　、ＪａＣｅｌｌ、Ｂｉｏｌ
。

９５、　３６９−３７７゜ Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔ、　Ａ、Ｒ，、Ｖｉｂｅ−Ｐｅｄ
ｅｒｓｅｎ、　Ｔ１．、　ａｎｄ　Ｂａｒａｌｌｅ。

Ｆ、Ｅ、　　（１９８３）　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔ７ＳＡ　８０゜３２１Ｂ−３２
２２゜ Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔ、　Ａ、Ｒ，、Ｖｉｂｅ−Ｐａｉ
ｅｒｓｅｎ、　Ｋ、　ａｎｄ　Ｂａｒａｌｌｅ。

Ｆ、Ｅ、　（１９８４ａ）　、ＥＭＢＯＪ、　２．２２
１−２２６゜Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔ、　Ａ、Ｒ，、Ｖｉ
ｂｅ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、　Ｌ　ａｎｄ　Ｂａｒａｌｌ
ｅ。

Ｆ、Ｅ、　　　（１９８４ｂ）　　、ｒゴｕｃ１．Ａｃ
１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　　二１２．　５８５３−５８６８
゜Ｍａｘａｍ、　Ａ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、
　Ｗ、　　（１９７７）　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ。

Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７４，５６０−５６９゜Ｍａｘａ
ｍ、　Ａ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒし、　ｗ、　　
（１９８０）　Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ、　６５゜４９９
−５８０゜ Ｍｅｓｓｉｎｑ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ
、　　（１９８２）　、Ｇｅｎｅ　１９．２６９−２７
３゜Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、、　Ｃｒｅａ、　Ｒ，ａｎ
ｄ　５ｅｅｂｕｒｑ、　Ｐ、Ｈ，（１９８１）Ｎｕｃｌ
、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、９，３０９−３２１゜０１ｄｂ
ｅｒｇ、　Ａｓ、　Ｌｉｎｎｅｙ、　Ｅ、　ａｎｄ　Ｒ
ｕｏｓｌａｈｔｉ、　Ｅ、　　（１９８３）Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｍ、２５８，１０１９３−１０１９６゜Ｐａ
ｎｄｅ、　Ｈａ　ａｎｄ　５ｈｉｖｅｌｙ、　Ｊ、Ｅ、
　　（１９８２）　、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２１旦、　２５Ｂ−２６５゜Ｐｅｔ
ｅｒｓｅｎ、Ｔ、、Ｔｈφｑｅｒｓｅｎ、Ｈ，Ｃ，、Ｓ
ｋｏｒｓｔｅｎｇａａｒｄ、に、。

Ｖｉｂｅ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、に、、５ａｈｌ、Ｐ、、
５ｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎ。

Ｌ、　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、　Ｓ、　　（１９
８３）　１’ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０，１３７−１４１゜Ｐｉｅｒｓｃ
ｈｂａｃｈｅ′Ｉ；、　Ｍ、Ｄ、　ａｎｄ　Ｒｕｏｓｌ
ａｈｔｉ、　Ｅ、　　（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ　３０
９，３０−３３゜ Ｒａｍａｕｔ　Ｅ、、　Ｔｓａｏ　Ｈ，ａｎｄ　Ｆｉｅ
ｒｓ　Ｗ、　　（１９８３）　、Ｇｅｎｅ、　２２゜１
０３−１１３゜ Ｒｌｑｂｙ　Ｐ、Ｗ、Ｊ、、　Ｄｉｅｃｋｍａｍａ　Ｈ
，Ｒｈｏｄｅｓ　Ｃ，、ａｎｄ　Ｂｅｒｇ　Ｐ。

（１９７７）、Ｊ、Ｍｏ１．　　Ｂｉｏｌ、　　ユｉ３
．　２３フ−２５１゜Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、　Ｅ、、　
Ｈａｙｍａｎ、　Ｅ、Ｇ、、　Ｋ１ｎｎ５ｅｌａ　Ｐ、
、　５ｈｉｖｅｌｙＪ、Ｅ、、　ａｒｉｄ　Ｅｎｑｖａ
ｌｌ　Ｅ、、　　（１９７９）、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ。

２５４．６０５４−６０５９゜ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、　Ｅ−ｔ　Ｈａｙｍａｎ　ＥａＧ
−ｔ　Ｐｉｅｒｓｂａｃｈｅｒ　Ｍ−＃　ａｎｄＥｎｇ
ｖａｌｌ　Ｅ、　　（１９８２）、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎ
ｚｙｍｏｌ＊　８２．８０３−８３１゜８ａｎｇｅｒ、
　Ｆ、、　ｒＪｉｃｋｌｅｎ、　ｓ、　ａｎｄ　Ｃｏｕ
ｌｓｏｎ、　Ａ、Ｒ，（１９７７）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７４．　５４６３−５
４６７゜Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｅｒ、　ＪｓＥ＊、　Ｔ
ａｍｋｕｎ、　Ｊ、Ｗ＊、　ＴＡｍｉｓｃｈｋａ、工、
Ｒ０ａｎｄ　Ｈｙｎｅｓ、　Ｒ，Ｏ，（１９８３）　、
Ｃｅ１ｌ　３５．４２１−４３１゜！９ｋｏｒｓｔｅｎ
ｑａａｒｄ、　　Ｋ、、Ｔｈ（ｌｌｑｅｒｓｅｎ、　　
Ｈ，Ｃ，、Ｖｉｂｅ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ。

Ｋ、、　Ｐｅｔｅｒｓｅｎ、　Ｔ、Ｅ、　ａｎｄ　Ｍａ
ｑｎｕｓｓｏｎ、、　Ｓ、、　（１９８２）］？ｕｒ、
Ｊ、Ｒ１ｏｃｈｅｍ、　　１２８．　６０５−６２３゜
Ｓｍ１ｔｈ、　Ｄ、Ｇ、、　Ｍｏ５ｈｅｒ、　Ｄ、Ｆ、
、　Ｊｏｈｎｓｏｎ、　Ｒ，Ｂ、　ａｎｄ　Ｆｕｒｃｈ
ｔ。

Ｌ、Ｔ、　　（１９８２）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ
、　２５７．５８３１−５８３８゜５ｔａｎｌｅｙ　Ｋ
、に、　（１９８３）、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、　１１．４０７７−４０９２゜ ５ｔａｎｌｅｙ　Ｋ、に、　ａｎｄ　Ｔｈｕｚｉｏ、　
Ｐ、　（１９８４）　、ＥＭｎＯＪ、　３゜１４２９−
１４３４゜ Ｔａｒｎｋｕｎ、Ｊ−に−＃　Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｅ
ｒ、　Ｊ、Ｅ−ａｎｄ　Ｈｙｎｅｓ、　Ｒ−０−（１９
８４）　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ
、ＵＳＡ　８１．５１４０−５１４４゜Ｔｏｗｂｉｎ　
Ｈ，、５ｔａｅｈｌｉｎ　Ｔ、　ａｎｄ　Ｇｏｒｄｏｎ
　、：ｒ、　（１９７９）。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ
、Ａ、、　７３、４３５０−４３５４゜Ｕｒｔｉｅｚａ
ｗａ、　Ｋ、、　Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔｔ、　Ａ、Ｒ，ａ
ｎｄ　Ｂａｒａｌｌｅ、　Ｆ、Ｅ。

（１９８５）　、ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ　ｔｏ　ＦＥＢＳ
　Ｌｅｔｔ。

Ｖｉｂｅ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、　　Ｋ、、５ａｈｌ、Ｐ
、、　　５ｋｏｒｓｔｅｎｑａａｒｄ、　　Ｋ、　　ａ
ｎｄＰｅｔｅｒｓｅｎ、　Ｔ、Ｅ、　　（１９８２）　
、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１４２．２７−３０゜Ｖｉｂ
ｅ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、　Ｋ、、　Ｋｏｒｎｂｌｉｈｔ
ｔ、　Ａ、Ｒ，ａｎｄ　Ｂａｒａｌｌｅ。

Ｆ、Ｅ、　（１９８４）　、ＥＭＢＯＪ、　２．２５１
１−２５１６゜Ｗｉｌｌｉａｍｓ　Ｄ、Ｃ，、Ｖａｎｉ
″Ｆｒａｎｋ　Ｒ，Ｍ、、　Ｍｕｔｈ　Ｗ、Ｌ、　ａｎ
ｄＢｕｒｎｅｔｔ　Ｊ、Ｐ、　（１９８２）、　５ｃｉ
ｅｎｃｅ　２１５．６８７−６８９゜Ｗｉｎｔｅｒ、　
Ｇ、　ａｎｄ　Ｆｉｅｌｄｓ、　　Ｓ、　　（１９ＲＯ
）　、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｓ。

８．１９６５−１９７４゜ Ｙａｍａｄａ、　Ｋ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｋｅｎｎｅｄｙ、
　Ｄ、Ｗ、　　（１９７９）　、Ｊ、Ｃｅ１ｌ、Ｂｉｏ
ｌ。

８０．４９２−４９８゜ Ｙａｍａｄａ、　ＬＭ、　　（１９８３）　、Ａｎｎ、
Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５２．７３１−７９９゜Ｚ
ａｂｅａｕ　Ｍ、　ａｎｄ　５ｔａｎｌｅｙ　Ｋ、に、
　　（１９８２）　ＥＭＢＯＪ、、　１．１２１７−１
２２４゜

【図面の簡単な説明】

第１図は７つの０ＤＮｋクローンを含むヒ）ＦＮｍＲＮ
Ａの制限酵素マツプを示す。 第２図はヒ）ＦＮＮポリペブチの完全なアミノ酸配列を
示す。 第６亀図〜第３ｈ図は第２図に示したヒ）ＦＮポリベデ
チｒの完全なニュークレオチド配列を示す。 第４図はＦＮ−次構造の変化を示す。 第５図はコラーゲン結合領域および内部相同の位置を示
すフィブロネクチンタン白の部分を示す。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）コラーゲンおよび／又はフイブリンに対し特異的
   親和性を有し、かつフイブロネクチンのコラーゲン結合
   部分および／又はフイブリン結合部分のアミノ酸残基と
   実質的に同じ順序のアミノ酸残基を含有する、ポリペプ
   チド配列。
2. （２）少なくとも第２図に示すアミノ配列の２７７〜５
   ７７のコラーゲン結合部分を含む、特許請求の範囲第１
   項記載のポリペプチド。
3. （３）少なくとも第２図に示すコラーゲン結合アミノ酸
   配列３７９〜４４５を含む、特許請求の範囲第１項記載
   のポリペプチド。
4. （４）少なくとも第２図に示すアミノ酸配列２１〜２４
   １のフイブリン結合部分を含む、特許請求の範囲第１項
   記載のポリペプチド。
5. （５）フイブロネクチンに存在しないポリペプチドに結
   合した、特許請求の範囲第１項から第４項のいずれか１
   項に記載のポリペプチド。
6. （６）物質の精製方法において、その物質とフイブロネ
   クチンのコラーゲン結合部分との抱合体を固定化コラー
   ゲンと接触させ、この抱合体をこのコラーゲンに結合さ
   せ、次に抱合体を溶離することを特徴とする、上記方法
   。
7. （７）溶離抱合体を次に開裂してコラーゲン結合部分を
   除去し、次にこの物質を単離する、特許請求の範囲第６
   項記載の方法。
8. （８）治療剤と結合したフイブリン結合アミノ酸配列を
   含む、特許請求の範囲第１項又は第４項に記載のポリペ
   プチド。
9. （９）コラーゲンおよび／又はフイブリンに対し特異的
   親和性を有するフイブロネクチンのポリペプチド配列を
   コードするｃＤＮＡ配列。
10. （１０）第３ｂ図の１１４７〜１３５１に示す構造を有
    する、特許請求の範囲第９項記載のｃＤＮＡ配列。
11. （１１）第３ａ図の７３〜７３８に示す構造を有する、
    特許請求の範囲第９項記載のｃＤＮＡ配列。
12. （１２）特許請求の範囲第９項から第１１項のいずれか
    １項に規定したｃＤＮＡ配列を含むプラスミド又は他の
    ベクター。
13. （１３）特許請求の範囲第１２項に特許請求したベクタ
    ーを包含することにより修飾した微生物。
14. （１４）特許請求の範囲第１２項に特許請求したベクタ
    ーを包含することにより修飾した￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
    ｉａ　ｃｏｌｉ￥。