WO1995006242A1

WO1995006242A1 - Bod sensor and bod measuring method

Info

Publication number: WO1995006242A1
Application number: PCT/JP1994/001418
Authority: WO
Inventors: Isao Karube; Kiyoko Yano
Original assignee: Akebono Brake Industry Co Ltd; Akebono Research and Development Centre Ltd
Current assignee: Akebono Brake Industry Co Ltd; Akebono Research and Development Centre Ltd
Priority date: 1993-08-26
Filing date: 1994-08-26
Publication date: 1995-03-02
Anticipated expiration: 1996-02-26
Also published as: EP0667521A1; CA2147861A1; EP0667521A4

Description

明細書

B 0 Dセンサ及び B 0 Dの測定方法技 ifo分野本発明は、 B O Dセンサに関し、詳しくは、酸素電極を用いない B O Dセンサに関する。背景技術河川や産業排水の水質管理に重要な項目として、 B O D (生物化学的酸素要求量）があり、国際的な有機性水質汚濁の指標とされている。有機化合物に起因する水質汚濁は、好気性微生物による酸化反応で減少、消去され、その有機物質濃度に対応して溶存酸素が消費される。この消費された酸素量を計測することで、水質汚濁が明らかになる。すなわち B O Dは、有機化合物濃度を、酸素量により間接的に表したものである。

日本工業規格 J I Sで B O Dの測定法が規定されているが、この方法は煩雑な操作を必要とし、さらに測定に 5日間を要するなどの問題点があつた。そこで迅速、簡単、かつオンライン計測可能な B O D測定法が要望され、既に B O Dセンザが開発されており、工場排水などの測定に利用されている。

従来使用されている B 0 Dセンサは、微生物膜と酸素電極で構成されており、溶液中の溶存酸素の減少量により B 0 Dを測定するものである。このようなセンサとして、例えば、酸素電極の隔膜とそれを覆う透析膜の間に有機物を資化し酸素を消費する微生物を封入せしめた微生物電極（特開昭 5 4— 4 7 6 9 9号公報）が知られている。

しかしながら、上記のような溶存酸素の減少量により B 0 Dを測定するセンサでは、溶存酸素の低 t、廃液では正確な値を測定することは難しいという問題がある。また、酸素電極の構造は、電極内に電解液等を内蔵するために、ある程度の大きさが必要であった。

本発明は、上記観点からなされたものであり、酸素電極を用いずに直接に有機化合物濃度を測定することができ、溶存酸素量が低くても測定が可能な B 0 Dセンサを提供することを課題とする。発明の開示本発明者は、上記課題を解決するために、 B O Dセンサを以下の構成とした。すなわち本発明は、金属又は炭素からなる電極並びにこの電極に当接された微生物菌体を含有する薄膜からなる作用電極（微生物電極）と、対極とを有する B O Dセンサである。また本発明は、有機物を含有する溶液に、金属又は炭素からなる電極並びにこの電極に当接された微生物菌体を含有する薄膜からなる作用電極（微生物電極）と、対極とを有するセンサを浸潰し、微生物電極と対極との間に電位差を負荷したときに流れる電流を計測することにより、この溶液の B 0 D を測定する方法を提供する。

また本発明は、上記構成に加えてさらに参照電極を有する B O Dセンサ、及び有機物を含有する溶液に、この B O Dセンサを浸潰し、作用電極と参照電極との間に電位差を負荷したときに流れる電流を計測することにより、この溶液の B 0 Dを測定する方法を提供する

以下、本発明を詳細に説明する。

< 1 >本発明の B O Dセンサ

本発明の B O Dセンサは、金属又は炭素からなる電極（以下、単に「金属電極」ともいう）並びにこの金属電極に当接された微生物菌体を含む薄膜（以下、単に「微生物膜」ともいう）からなる作用電極と、対極とを有する。本発明の他の態様の B 0 Dセンサは、金属電極並びにこの金属電極に当接された微生物菌体を含む薄膜（以下、単に「微生物膜」ともいう）からなる作用電極と、対極と、さらに参照電極とを有する。

微生物を有機化合物を含む試料溶液に存在させると、微生物は有機化合物をェネルギー獲得のために代謝する。その過程において、呼吸鎖の電子伝達系に電子の移動が起こる。この際、代謝される有機物濃度と移動する電子の量には相関がある。したがって、この移動する電子の量を測定することによって微生物のまわりに存在する有機物濃度がわかり、 B O Dを測定することができる。この電子の移動量を直接計測することは困難であるので、本発明においては、上記構成を有する B 0 Dセンサを有機化合物含有溶液に浸漬し、センサの作用電極と対極もしくは参照電極との間に、電子が移動しやすいように一定の電位差を負荷し、両電極間に流れる電流を計測する。以下に、本発明の B O Dセンサの構成を説明する c 微生物膜は、微生物菌体を金属電極表面又はその近傍に存在させるためのものであり、薄膜状のものであれば、特に形態は問わない。例えば、微生物菌体を、アルギン酸ゲル膜、ァガロースゲル膜、光架橋性ポリビニルアルコール膜あるいはポリアクリルアミド膜等の三次元架橋構造体中に封入したものが挙げられる。金属電極と透析膜等の微生物菌体を透過させない膜との間に微生物を膜状に封入してもよい。また、高分子膜に微生物菌体を固定してもよい。さらには、作用電極を構成する金属膜表面に、グルタルアルデヒド等を用いて微生物を膜状に固定化したものでもよい。薄膜中の微生物は生存していることが望ましい。

上記微生物としては、有機物を代謝することにより電子伝達系に電子の移動が起こるものであればよく、特に制限されない。前核微生物及び真核微生物のいずれも使用できるが、真核生物細胞內では呼吸鎖の電子伝達がミトコンドリア内で行われるため、作用電極に移動する電子の量が比較的少ないので、 B O D測定感度の点では前核微生物が好ましい。前核微生物としては、例えば、大腸菌、バチルス属、ァシネトパクター属、グルコノバクター属あるいはシユードモナス属に属する細菌、放線菌などの前核微生物が、真核微生物としてはトリコスポロン属に属する酵母等が挙げられる。

金属又は炭素からなる電極は、 B 0 D測定試料中の有機物が微生物により代謝されて生じる電子を受け取る。作用電極の素材としては、安定であり、かつ、導電性が大きく、微生物に実質的に無害なものであればよく、例えば、白金、金、銀等の金属、又はグラフアイト、カーボン等の炭素素材が挙げられる。また、その形状としては、特に制限はないが、棒状、筒状、シート状が挙げられる。

本発明の B O Dセンサを構成する作用電極は、上記金属電極に微生物膜を当接させたものである。金属電極と微生物膜との距離が離れすぎると、微生物膜で生じた電子が金属電極に移動することができない。この意味で、「当接」とは必ずしも完全に接している必要はなく、溶液中で電子が移動可能な程度に近接していればよい。

上記作用電極の具体的構造としては、金属電極表面上に官能基を介して微生物を固定したもの、微生物を含むゲル膜を金属電極に接着したもの、金属電極端に透析膜を被せ、金属電極と透析膜の間に微生物を入れたものなどが挙げられる。また、微生物懸濁液をァセチルセルロース等の薄膜上で吸引濾過し、この薄膜上に微生物を膜状に集菌し、ァセチルセルロース膜の外側から透析膜で覆うようにして金属電極に被せてもよい。また、金属電極の形状及び微生物膜の形状は、これらの接触面積が大きくなるようにするとよい。

本発明の B O Dセンサは、上記作用電極と対極とを有し、必要に応じてさらに参照電極を有する。対極の素材としては、白金、銀、金、カーボン等が挙げられる。 B O Dセンサを測定試料液に浸漬し、作用電極と対極との間に電位差を負荷したときに、電極反応が進行するにつれて、電極表面での反応種の濃度は減少し、また生成物の濃度が増加するなどして電極電位が設定した電位からずれてしまうことがある。そこで、 A g ZA g C 1電極等の参照電極を試料液に浸潰し、参照電極を電位設定の基準として作用電極の電位を設定することが好ましい（3極法） c 本発明の B 0 Dセンサは、作用電極と対極及び必要に応じて参照電極とを別体としてもよいし、また一体構造としてもよい。

< 2 > B O Dの測定法

本発明の B O Dの測定法は、有機物を含有する溶液（測定試料液）に上記 B O Dセンサを浸漬し、作用電極と対極もしくは参照電極との間に電位差を負荷したときに両電極間に流れる電流を計測することにより、この溶液の B 0 Dを測定する方法である。

具体的には、例えば、上記 B O Dセンサを測定試料液に浸漬し、作用電極と対極との間に電位差を負荷し、両電極間に流れる電流を計測する。また、 3極法においては、作用電極と参照電極との間に電位差を負荷し、両電極間に流れる電流を計測する。電位差の負荷及び電流の測定は、ポテンシォスタツト等を用いるとよい。

また、試料液にメディエータを添加しておくと、より高感度な測定が可能となるので好ましい。あるいは、微生物膜中又は微生物膜と金属電極との間にメディエータを含ませてもよい。

メデイエ一夕は、微生物により有機物が代謝されて生じる電子が、金属電極に移行するのを促進するものである。メディエータとしては、微生物から金属電極に電子が移行するのを促進するものであればよく、具体的には 1ーメトキシ— 5 一メチルフエナジニゥムメチルスルフォネート（1一 M— PMS)、 2, 6—ジクロ口インドフエノール（D C I P)、 9ージメチルァミノベンゾー α—フエナゾキソニゥムクロライド、メチレンブルー、インジゴトリスルホン酸、フヱノサフラニン、チォニン、ニューメチレンブルー、 2, 6—ジクロ口フエノール、ィンドフエノール、ァズレ Β、 Ν, Ν, Ν' 、 Ν，ーテトラメチルー ρ—フエニレンジアミンジヒドロクロリド、レゾルフイン、サフラニン、ソディウムアントラキノン /3—スルフォネート、インジゴカーミン等の色素、リボフラビン、 Lーァスコルビン酸、フラビンアデニンジヌクレオチド、フラビンモノヌクレオチド、ニコチンアデニンジヌクレオチド、ノレミクロム、ュビキノン、ハイドロキノン、 2， 6—ジクロ口べンゾキノン、 2—メチルベンゾキノン、 2, 5—ジヒドロキシベンゾキノン、 2—ヒドロキシー 1, 4一ナフトキノン、グルタチオン、パーォキシダーゼ、チトクロム C、フヱレドキシン等の生体酸化還元物質又はその誘導体、その他 F e— EDTA、 Mn— EDTA、 Zn— EDTA、メソスルフエート、 2, 3, 5, 6—テトラメチルー p—フエ二レンジァミン、フェリシアン化カリウム等が挙げられる。これらのメディエー夕の濃度は、 40 nM以上程度が好ましい。

上記の化合物の中では、 1一 M— PMS、 DC I P、フェリシアン化カリウム及び 9ージメチルァミノべンゾー α—フエナゾキソニゥムクロライドが好ましい _c

BODの測定は、有機物を含有しない緩衝液を用いて対極若しくは参照電極と作用電極との間を流れる電流を測定し、続いて測定試料あるいは前記緩衝液で希釈した測定試料液を用いて同様に電流を測定し、これらの電流の差を、標準試料を用いたときの電流の差と比較することにより行う。

センサを流れる電流は、微生物の種類、金属電極と微生物膜との接触面積、メディエー夕の種類及び濃度、対極と金属電極との間に負荷する電位差、 BOD濃度等に依存するので、これらは予備実験を行つて適宜設定するとよい。本発明の B ODセンサを有機物含有溶液に浸漬すると、センサの微生物膜中の微生物により、有機物が代謝される。その結果、電子が電子伝達系に移動する。対極と金属電極との間に電位差を負荷すると、電子が微生物膜から金属電極に移行する。その結果、電子が発生しないときと比べて得られる電流が異なる。この電流を計測することにより、有機物濃度、すなわち BODを測定することができる。

この際、試料溶液中又は微生物膜にメディエータを添加しておくと、微生物から電子が金属電極に移行するのを促進するので、測定感度が向上する。図面の簡単な説明図 1は、本発明の BODセンサを構成する作用電極の一実施例を示す断面図であ。

図 2は、本発明の BODセンサを用いた BOD測定系の一例を示す正面図である。

図 3は、負荷電圧と電流値との関係を示すグラフ図である。

図 4は、緩衝液濃度と電流値との関係を示すグラフ図である。

図 5は、メデイエ一夕（DC I P) 濃度と電流値との関係を示すグラフ図である。

図 6は、メディエー夕（1一 M— PMS)濃度と電流値との関係を示すグラフ図である。

図 7は、メデイエ一夕の種類を変えたときの B 0 Dと電流値との関係を示すグラフ図である。

図 8は、 BOD測定検量線の一例を示すグラフ図である。

図 9は、溶存気体が B 0 D測定に与える影響を示すダラフ図である。

図 10は、メデイエ一夕として 8mMフェリシアン化力リゥムを使用したときの BODと電流値との関係を示すグラフ図である。

図 11は、メディエー夕として 40 nM 9—ジメチルアミノベンゾ一な一フエナゾキソニゥムクロライドを使用したときの B 0 Dと電流値との関係を示すグラフ図である。図 12は、メデイエ一夕として 80 nM 1— M— PMSを使用したときの BO Dと電流値との関係を示すグラフ図である。

図 13は、電極素材を変えたときの BODと電流値との関係を示すグラフ図であ。

図 14は、微生物膜の微生物として大腸菌を用いたとき BODと電流値との関係を示すグラフ図である。

図 15は、微生物膜の微生物としてバチルス ·ステアロザーモフィルスを用いたとき BODと電流値との関係を示すグラフ図である。

図 16は、微生物膜の微生物としてァシネトパクター ·カルコァセティカスを用いたとき BODと電流値との関係を示すグラフ図である。

図 17は、微生物膜の微生物としてトリコスポロン ·クタネゥムを用いたとき BODと電流値との関係を示すグラフ図である。

図 18は、微生物膜の微生物としてグルコノパクター ·サブォキシダンスを用いたとき BODと電流値との関係を示すグラフ図である。

図 19は、微生物膜の微生物としてシユードモナス ·エルギノーサを用いたとき BODと電流値との関係を示すグラフ図である。

図 20は、低溶存酸素が BOD測定に与える影響を示すグラフ図である。

図 21は、ァガロースを用いて微生物菌体を金属電極に固定した B0Dセンサによる BODの測定を示す図である。

図 22は、光架橋性ポリビニルアルコール（P V A— S b Q： polyvinyl alco hoi stilbazole quaternized) を用いて微生物菌体を金属電極に固定した B 0 D センサによる BODの測定を示す図である。

図 23は、グルタルアルデヒドを用いて微生物菌体を金属電極に固定した B0 Dセンサによる B 0 Dの測定を示す図である。発明を実施するための最良の形態以下に、本発明の実施例を説明する。実施例 1 BODセンサはじめに、 BODセンサを構成する作用電極の一例、及びこの作用電極を有する BODセンサを用いた測定系を、図 1、 2に基づいて説明する。

活性汚泥からスクリーニングされたバチルス属に属する微生物（L— GL 3と命名した）を、 0. 3%K₂HP0₄、 0. 1 %ΚΗ₂Ρθ4 0. 0 3 %Mg S 0 ₄ · 7Η₂0、 0. 5%硫酸アンモニゥム、 0. 0 0 1 %L—グルタミン酸、 0. 1 %酵母エキスを含む培地 80m 1 (pH7. 0) に植菌し、 3 0てで 4 8時間、振盪培養した。培養液を遠心して菌体と培地とを分雜し、菌体を緩衝液（0. 0 5Mリン酸 pH7. 0) で洗維し、同緩衝液に懸濁させた。

上記で得られた菌懸濁液を多孔性ァセチルセルロース膜 1 a (孔径 0. 4 5〃 m) で濾過し、膜面に菌体 1 bを付着させた。この膜 1を微生物膜とし、テフ口ンチューブ 8を被覆することにより側面を絶縁した直径 3 mmの円柱状の白金電極 2の一方の端部に、膜の菌体 1 bが付着している面が接するように被せ、その上から透析膜 1 cで覆い、 0—リング 3で固定した（図 1) 。電極の他方の端部には、リード線 4を銀ペーストで接着することにより結線した。リード線は、クリップ等を用いて金属電極に固定してもよい。上記リード線と金属電極との接続部位は、熱収縮チューブを被覆することにより絶縁した。金属電極の側面及びリ一ド線との接続部位の絶縁は、以下の実施例においても上記と同様にして行った。

上記のように構成された作用電極 2 0を用いて、以下のような測定系（3極法） (図 2) により BOD測定法の検討を行った。上記作用電極と参照電極 5 (Ag/A gCl電極）と対極（白金電極） 7とをポテンシォスタツト 6に接続し、緩衝液を入れた試料槽 9に浸漬し、 BODセンサとした。参照電極と作用電極との間に定電圧を負荷し、流れる電流を計測した。次に、 BOD標準液又は L一グルタミン酸溶液を添加し、同様に電流値を測定した。 BODの測定中は、マグネチックスターラ 1 0を用いて試料液を攪拌した。測定値は、レコーダ 1 2で記録した。実施例 2 至適電位の検討上記測定系における至適負荷電位の検討を行った。試料液 30を 40 nM DC I P、 40 nM 1— M— PMSを含む 0. 01 Mリン酸緩衝液（ p H 7. 0) とし、これを 5m 1入れた試料槽中に BODセンサを挿入し、負荷電位を +200 mV〜； I Vに設定し、一定濃度の有機物（15 Omg/ 1 L—グルタミン酸） 4 0 β 1を添加し、電流値の増加を測定した。結果を図 3に示す。

この結果から、 + 200mV〜80 OmVの間でほぼ等しい応答値を示し、上記条件下においてはこの範囲で測定するのが好ましいことがわかった。実施例 3 緩衝液の至適濃度の検討緩衝液濃度の検討を行った。リン酸緩衝液（pH 7. 0) の濃度を 10mM〜 20 OmMの間で変化させ、負荷電位を +400 mVに固定した以外は実施例 2 と同様にして電流値の増加を測定した。結果を図 4に示す。

この結果から、 10mM〜20 OmMのリン酸緩衝液（pH7. 0) では等しい応答値を示し、少なくともこの範囲で測定できることがわかった。実施例 4 至適メディエータ濃度の検討 (1) メディエー夕に DC I P及び 1一 M— PMSを用い、 1一 M— PMSが濃度 4

0 nMのときの至適 DC I P濃度の検討を行った。リン酸緩衝液（pH 7. 0) の濃度を 0. 01Mとし、負荷電位を +40 OmVに固定し、 DC I P濃度を 1 0〜80 nMの間で変化させた以外は実施例 2と同様にして電流値の増加を測定した。結果を図 5に示す。 DC I P濃度 10 nM以上で良い応答値が得られた。実施例 5 至適メディエータ濃度の検討 2) メディエー夕に DC I P及び 1一 M—PMSを用い、 DC I P濃度が 40 nM のときの至適 1一 M— PMS濃度の検討を行った。 DC I P濃度を 40 nMとし、

1一 M— PMS濃度を 0〜80 nMの間で変化させた以外は実施例 4と同様にして電流値の増加を計測した。結果を図 6に示す。この結果から 10 nM以上で良い応答値が得られることがわかる。実施例 6 メディエー夕が電流値に与える影響の検討

0. 01Mリン酸緩衝液（pH7. 0) 5m 1中に、メディエータとして 1一 M— PMSのみ 40 nM、 D C I Pのみ 40 nM、あるいは 1一 M— PMS及び DC I Pを各々 40 nMとなるように添加し、これらの緩衝液またはメディエータを添加していない緩衝液に BODセンサを挿入し、さらに、 BOD標準液（グルコース及び Lーグルタミン酸をそれぞれ 15 Omg/ 1含む混合溶液（BOD

22 Omg/1 ) ：以下、単に「BOD標準液」という）を加え、電流を測定した。結果を図 7に示す。

高濃度の BOD標準溶液添加では、メディエータなしでも小さいながら電流値の増加が得られた。しかし、メディエータを添加した方が、大きい電流値の増加が得られた。従って、本センサは、メディエータなしでも BOD測定が可能であるが、メディエータを添加した方がより効果があることが示された。実施例 7 BOD測定用検量線の作成

40 nM DC I P、 40 nM 1 - M— PMSを含む 0. 01Mリン酸緩衝液 (pH7. 0) を 5m 1入れた試料槽中に、 BODセンサを挿入し、 + 400m Vの電位を負荷し、 BOD標準液を添加し、電流値の増加を測定した。結果を図 8に示す。

この結果から明らかなように、少なくとも 150 Omg/m 1程度までは、電流値は BOD濃度に比例して増加し、本発明の方法により、 BODを正確に測定できることがわかる。実施例 8 滾存酸素の影響の検討本発明の方法に溶存酸素が与える影響を調べた。 0. 011^1リン酸緩衝液（ H7. 0) 5m 1中に、窒素、酸素、空気をそれぞれ 30分間通気し、 DC I P 及び 1一 M— PMSを各々終濃度が 40 nMとなるように添加し、 BODセンサを挿入し、 +40 OmVの電位を負荷し、 BOD標準液を 40 μ 1添加し、電流値の増加を測定した。同様に気体を通気せずに測定を行った。結果を図 9に示す。各種気体の通気の有無に関わらず、電流値は一定であり、本発明の BODセンサは、溶存酸素の影響を受けずに BODを測定できた。本発明の BODセンサは、従来のセンサのように、溶存酸素の減少量により BODを測定するものではなく、有機物が代謝されることにより生じる電子を計測することにより B 0 Dを測定するものであることを支持するものである。実施例 9 他のメディエー夕の検討

0. 01Mリン酸緩衝液（pH7. 0) 5m l中に、 1一 M— PMSのみ（8 O nM) 、フヱリシアン化カリウム（8mM) あるいは 9ージメチルァミノベンゾー α—フヱナゾキソニゥムクロライド（40 nM) を添加し、 BODセンサを挿入し、さらに、 BOD標準液を加え、電流を測定した。結果を図 10〜12に示す。実施例 10 電極素材についての検討白金電極と同じく、径 3mmの金、銀、カーボン電極を用いて BODセンサを作製し、実施例 6と同様に BODの測定を行った。但し、参照電極を使用せず、作用電極と対極との間に電位差を負荷し、両電極間に流れる電流を測定した。結果を図 13に示す。この結果から明らかなように、白金、金、銀、カーボン電極とも同様の結果が得られ、安定な金属あるいはカーボンの様な導電性の物質であれば測定可能であることがわかつた。実施例 11 微生物膜に用いる微生物の種類の検討

( 1 ) ェシヱリヒア ·コリ（Escherichia coli：大腸菌）

ェシヱリヒア ' コリ J Ml 09を 37てで 12時間振盪培養し、二トロセル口 —ス膜に固定化して、これを P t電極に装着した。得られた作用電極と対極と参照電極から構成される BODセンサを、メデイエ一夕（1一 M— PMS、 DC I P各 4 O nM) を含む緩衝液中に挿入し、 BOD標準液を添加し、上記と同様にして電流値の増加を測定した。結果を図 14に示す。 (2)ノチノレス · ステアロザーモフィルス（Bacillus stearothermophilus) バチルス ·ステアロザーモフィルス I AMI 1602を 45てで振盪培養して同様の実験を行った。結果を図 15に示す。

( 3 ) ァシネ卜ノく'クタ一 ·カルコ了セティカス (Acini tobacter calcoaceticus) ァシネトパクター ·カルコァセティカス I F012552を 30 で培養して同様の実験を行った。メデイエ一夕にはフリシアン化カリウム（8mM) を使用した。結果を図 16に示す。

(4) トリコスポロン ·クタネゥム（Trichosporon cutaneum)

トリコスポロン ·クタネゥム I F010466を 30てで培養して同様の実験を行った。メディエー夕には 1一 M— PMS (80 nM) を使用した。結果を図 17に示す。

(5) ダルコノバクタ一 'サブォキシダンス（Gluconobacter suboxydans) ダルコノバクタ一 ·サブォキシダンス I F03172を 30てで培養して同様の実験を行った。メディエー夕にはフヱリシアン化カリウム（l OmM) を使用した。結果を図 18に示す。

6 ) シユードモナス ·エノレ干ノーサ (Pseudomanas aeruginosaリ

シユードモナス ·エルギノーサ I FO 10466を 30 で培養して同様の実験を行った。メディエー夕にはフェリシアン化カリウム（8mM) を使用した。結果を図 19に示す。

以上の結果から、異なる種類の微生物を用いても、本発明の方法により BOD を測定できることが明らかである。実施例 12 溶存酸素の低い溶液中での B 0D測定

0. 01Mリン酸緩衝液に窒素ガスを 30分間通気させた後に、 5m l緩衝液中に最終濃度 40 nMになるように DC I P及び 1— M— PM Sを添加した。これに実施例 1と同様の B0Dセンサを挿入し、 +40 OmVの電位差をかけ、 B OD標準液を添加した。測定中、緩衝液中の溶存酸素のない状態又は低い状態を保っために液面に窒素ガスを吹き付けながら、電流値の増加を測定した。

窒素ガスを吹き付けたものと、通常通り測定したものとではほぼ同様の結果を得た（図 20) 。よって、本発明の BODセンサを用いることにより溶存酸素の低いあるいはない溶液でも B 0 Dの測定が可能であることが示された。実施例 13 B 0 Dセンサの他の実施例実施例 1と同様にして培養して得られた L— GL 3株の菌体を、直径 3mmの円柱状の白金電極の金属面に、ァガロース、光架橋性ポリビニルアルコール（P V A - S b Q： polyvinyl alcohol stilbazole quatemized) 又 {まグノレタノレアノレデヒドを用いて固定化し、作用電極を作製した。これらの作用電極と、対極及び参照電極からなる B 0 Dセンサを用いて、 B 0 Dの測定を行つた。

(1) ァガロース

ァガロースを適当な濃度（例えば 2%) となるように加熱溶解し、約 60てに保持しながら、これに L一 GL 3菌体をリン酸緩衝液に懸濁させた懸濁液を混合した。こうして得られた菌体を懸濁させたァガロース溶液を、直径 3mmの円柱状の白金電極の一方の端面に均一に付着させ、冷却し、作用電極とした。

この作用電極、対極及び参照電極を用いて、図 1と同様の測定系により BOD の測定を行った。試料には前記 B0D標準液を、メディエー夕には 10 O nM 1 一 M—PMSを用いた。結果を図 21に示す。

(2) P VA- S bQ

リン酸緩衝液に懸濁した L一 G L 3懸濁液に、 P V A— S b Q溶液を適量混合し、これを直径 3 mmの円柱状の白金電極の金属面に均一に付着させ、 37てで 3時間喑所でインキュベートした。この後、蛍光灯を照射し、？八ー313(3を架橋させた。

この作用電極を用いて、（1) と同様にして BODの測定を行った。但し、メディエー夕には 1 _mMフヱリシァン化カリゥムを用いた。結果を図 22に示す。

(3) グルタルアルデヒド

リン酸緩衝液に懸濁した L— GL 3懸濁液にゥシ血清アルブミン（BSA) を適量溶解させ、直径 3 mmの円柱状の白金電極の金属面に均一に付着させた。これを、約 25 %濃度のダルタルアルデヒド水溶液の蒸気に 20分曝した後、リン酸緩衝液で 3回リンスした。この作用電極を用いて、（1) と同様にして BODの測定を行った。但し、メディエー夕には 80 nM 1一 M— PMSを用いた。結果を図 23に示す。

以上の結果から、金属電極に菌体を固定化する方法にかかわらず、本発明の B 0 Dセンサを用いて B 0 Dを測定することができることが明らかである。

産業上の利用性

本発明の BODセンサを用いると、溶存酸素濃度に影響されることなく、 BO Dを測定することができる。

Claims

請求の範囲

1. 金属又は炭素からなる電極並びにこの電極に当接された微生物菌体を含有する薄膜からなる微生物電極と、対極とを有する BODセンサ。

2. さらに参照電極を有する請求項 1記載の B 0 Dセンサ。

3. 前記微生物が前核生物であることを特徴とする請求項 1又は 2記載の B ODセンサ。

4. 有機物を含有する溶液に、金属又は炭素からなる電極並びにこの電極に当接された微生物菌体を含む薄膜からなる作用電極と対極とを浸潰し、作用電極と対極との間に電位差を負荷したときに両電極間に流れる電流を計測することにより、この溶液の BODを測定する方法。

5. 請求項 4において、前記溶液にさらに参照電極を浸潰し、作用電極と参照電極との間に電位差を負荷したときに両電極間に流れる電流を計測することにより、この溶液の BODを測定する方法。

6. 前記微生物が前核生物であることを特徴とする請求項 4又は 5に記載の BODを測定する方法。

7. 前記有機物を含有する溶液及び/又は微生物膜にメディエータを添加することを特徴とする請求項 4〜 6のいずれか一項に記載の B 0 Dを測定する方法。

8. 前記メディエー夕が、 1 -メトキシ一 5—メチルフヱナジニゥムメチルスルフォネート、 2, 6—ジクロ口インドフエノール及びフェリシアン化力リウム、からなる群から選ばれることを特徴とする請求項 6記載の BODを測定する方法。

9. 前記メディエー夕が、 10 nm以上の濃度範囲で添加されることを特徴とする請求項 7記載の B 0 Dを測定する方法。