WO1996010089A1

WO1996010089A1 - Modification of peptide and protein

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Inventors: Yoshiyuki Takahara; Naoyuki Yamada; Masao Motoki
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Description

明細書

ぺプチド及び蛋白質の修飾

帝業卜の禾 ilffl ！？

この発明は、生理活性ペプチド又は生理活性蛋白質の修飾法及びその修飾物質に関するものである。従来の技術

生理活性ペプチド又は生理活性蛋白質が数多く知られている。以下これらをまとめて生理活性ペプチドと称することもある。

これらの生理活性ペプチドとしては、例えば、インターロイキン（ I L ) 一 1、一 2、 — 3、 — 4、一 5、一 6、一 7、一 8、一 9、一 1 0、一 1 1、一 1 2、 — 1 3、一 1 4、一 1 5、 G— C S F、 GM— C S F、 M— C S F、エリスロボェチン（Erythropoietin) 、ステムセルファクター（幹細胞因子、 Stem eel 1 factor) 、 m p 1 — リガンド（mp卜 1 igand) 、 α —、 β ―、 r一インターフエロン、ソマトス夕チン、ノソプレツシン（Vasopressin) 、インシュリン U insu 1 in) 、成長ホルモン（Growth hormone) 、サブスタンス P (Substance P ) 、 A D F (ATL derived factor, ヒトチォレドキシン）等、人体中で生理的に働いているペプチド及びこれらを改変したペプチド、ボンべシンの様に動物由来のもの、ァスパラギナーゼ（Asparaginase) の様な微生物由来のもの、リシンの様な植物由来のものなどが挙げられる。また、抗体もこれらの生理活性ペプチドに含まれる。

これらの抗体としてはヒ卜のモノクローナル抗体ばかりでなく、動物のモノクローナル抗体も含まれる。これらのうちのいくつかのものは医薬又は診断薬としてすでに利用されており、また、いくつかのものは医薬又は診断薬としての利用が検討されている。

例えば、 I L— 2は抗癌剤として、エリスロポエチン、 G— C S Fは造血剤として、インシュリンや成長ホルモンは先天的、後天的にこれらが欠損あるいは不足している患者の治療に臨床応用されている。更に、 I L一 6は血小板増強剤として臨床開発中である。

このように生理活性ペプチドは医薬として重要であるが、更に生理活性べプチドに新たな機能を附与したり、生理活性ペプチドの持つ医薬としての欠点を補う目的で、生理活性ペプチドを高分子物質などで修飾することが試みられている。例えば、先天性免疫疾患であるアデノシンデァミナ一ゼ欠損症は正常なアデノシンデアミナーゼ（A D A ) の欠損によるもので、 A D Aの体内滞留時間を延長するために A D Aをポリエチレングリコール（ P E G ) で修飾したものが医薬として用いられている。

一方、生理活性ペプチドの多くは対応する受容体、或はリガンドに特異的に結合することがその生理機能を発揮する為に必須であるが、この特異的結合を利用して特定の生理活性ペプチドをターゲティング分子として利用することも考えられている。

例えば I L一 6分子にジフテリアトキシンを結合し、 I L一 6受容体を持つ癌細胞へ特異的に当該トキシンを送り込み、癌細胞を殺す試みがなされている。癌特異的抗原を認識するモノクローナル抗体に制癌剤を結合させ、制癌剤を癌細胞に特異的に送り込むことも同様に有効な方法として開発されている。

更に、ドラッグデリバリーシステム（D D S ) に生理活性ペプチドを利用する試みは遺伝子治療の領域でも重要である。とりわけ、遺伝子の生体内（in vivo) 投与による遗伝子治療は大きな期待を持たれており、 George Y. Wuらは、化学的方法によりオルソムコイド（orosonucoid) 等の生理活性ペプチドにポリリジン（プラス荷電を持つ）を結合させ、この複合体で D N Aプラスミド（マイナス荷電）を包み、オルソムコィドに対する受容体を持つ肝細胞に D N Aを送り込む遺伝子療法を開発した (J. Biol. Chem. , 263, 14621, 1988) 。

これら生理活性ペプチドの臨床上の問題点を以下に述べる

1、副作用：本来、生体内で生理的に働いている、これら生理活性ペプチドを人体に投与しても副作用が無いと思われるが、実際に臨床投与すると、ほとんどの生理活性べプチドは何等かの副作用を示す。これはこれら生理活性ペプチドは本来局所で生産され、放出され、局所で作用して、その場で大部分が分解されているのに対して、臨床投与された生理活性べプチドは一時的に高い血中濃度で全身に分布する訳であるから、一般的に非生理的反応や臨床上望ましくない反応が生じる。

2、早い代謝速度：生理活性ペプチドの多くにとって、生体内で長時間存在することは生体に不都合で有るため、血中で分解されたり、いくつかの臓器に捕獲されて分解され、早い速度で血中より消失する。これは生理活性ペプチドの薬効を出すうえでの障害となる。

3、抗原性：人体内の生理活性ペプチドは抗原性が低いが、組換え体で作られる生理活性べプチドは糖鎖が付かない物や、天然と違つた糖鎖が付いた物が臨床に用いられる。これらは場合によっては抗原性を持ち長期間あるいは頻回投与すると抗体ができて、投与した生理活性ペプチドを中和し、薬効がでなくなったり、最悪の場合は人体に有害なアレルギー反応を起こす場合も考えられる。

このような生理活性べプチドが有する以上の問題点を解决するために、

1、臓器あるいは組織に対し特異的な親和性を持つ分子、例えば、骨髄細胞に多く分布する c一 k i t分子に対して特異的に結合するステムセルファクタ一（幹細胞因子（ S C F) ) を I L一 6分子と結合させた分子、 I L一 6Z S C Fは骨 ifiに港縮され、 I L一 6の作用として巨核球を血小板への分化を促進し、血小板を增加させることができる。 I L一 6は視床下部に作用し中枢神経を介して発熱を起こすが、 I L一 6の骨饉への濂縮は発熱という副作用を低減させることであろう。

同様に、 I L一 2を腫瘍特異的サイトトキシック Τ セル（Cytotoxic T Ce II ( C T L ) ) に作用させるために、 I L一 2分子に腫瘍抗原分子、腫瘍そのもの、或は腫瘍細胞の破砕画分に結合した形で投与することが考えられる。腫瘍抗原を認識する CT Lは当該腫瘍抗原に結合し、更にそれに結合した I L一 2で効果的に活性化され、腫瘍細胞を攻 gすることができるであろう。

ウィルス性肝炎に用いられているインターフロン（ 0 [ —、 /8—、 r - IFN) はァシァログリコプロテイン（ asialoglycoprotein) 等の肝ァシァログリコプロテインレセプ夕一（asialoglycoproten receptor) に対するリガンドを結合させて肝臓にターゲッ卜し、 I F Nの副作用を軽減させることが期待できる。

また、造血系の前駆細胞に作用しこれを分化増殖させるまたは造血系癌に作用して免疫系または抗癌剤の作用を増強する目的で用いられる TNF、 G— C S F、 GM_ C S F、 I L一 1 1、 S C F、 m 1 - 1 i g a n d , L I F、 I L - 3 等もそれぞれ対応する作用細胞またはその隣接する支持細胞に結合能を持つ分子 (ターゲッティング分子）との結合体を用いることにより、それぞれの副作用を軽減させることが期待できる。造血系以外の癌の治療に用いられる TN F、 I F についても同様である。

2、投与された I L一 6は速やかに血液中より消失するが、 I L— 6を例えば、ヒ卜血清アルブミン（human serum albumin ( H S A ) ) 、ポリリジンや、 P E G のような生体の細網内皮系（reticuloendothelial system, RES) に捕捉されにくい高分子物質と結合させると、 I L一 6の血中半減期を延長できるであろう。また、 A D F (ATL derived factor, ヒ卜チォレドキシン； M sui. et al.. (1 992)Biophys. Biochem. Res. Com.186 (3), 1220-1226. ) または S O D (superoxide dismutase) は発生期の酸素を還元する生体内分子で抗炎症剤として臨床応用が試みられているが、 A D Fまたは S 0 Dの血中濃度を長時間維持できれば、より高ぃ抗炎症作用を期待できる。 I L— 6と同様に A D Fまたは S ODに H S Aや P E Gを結合させることにより AD F又は S ODの抗炎症効果の増強ができる。

I L— 2、 I FN、 G - C S F、 GM - C S F、 I L一 1 1、 S C F、 m p 1 一 l i g a n d、 L I F、 I L一 3、 TN F等についてもも同様に効果を高めることが期待できる。

3、先天的にある酵素が欠損している為に起きる遺伝病が多くの種類知られている。例えば、プリンヌクレオサイドホスホリラーゼ（ P N P ) が欠損すると神経障害を起こして死亡するが、牛の P N Pをポリエチレングリコール（Polyethy lene glycol (P E G) ) に結合したものを投与することである程度救うことができる。

P E Gを結合させることは牛 P N Pの抗原性を低減させ、この臨床応用を可能にした。これは P N Pの抗原となる部位が P E Gでマスクされる為と解釈されている。 P N Pに H S Aを結合させることにより同様に抗原性を減少させることが期待できる。

抗血栓症に用いるへビ毒ぺプチド等に対しても H S Aや P E Gを結合することにより同様の抗原性軽減効果が期待できる。

このように、生理活性ペプチドの問題点を補う為の修飾の場合も、生理活性べプチドを標的分子として利用する場合も、生理活性ペプチドと他の生理活性ぺプチド、糖鎖、 P E G等を互いの機能を失うことなく結合させ修飾することは重要である。一般にこのような修飾を行うための結合は化学的な方法で行なわれる。化学反応の場合は生成する化学結合の位置や結合数を制御することが難しく、結合対象の両者の活性を保持した状態で結合体を得ることが難しい。また、一定の構造を持った結合物を一定に生産するという医薬品では極めて重要なことが製造上制御しにくい。特に、高分子同士の結合の場合は、複数の形の結合物が同時に生成することになり、単一物に精製することが極めて難しくなる。日月の示、本発明は、少なくともグルタミン残基を有する生理活性べプチド又は生理活性蛋白質とァミノ供与体を有する物質とを、微生物由来のトランスグルタミナーゼの存在下に反応せしめて、該グルタミン残基の r -位酸アミドにおいて該ァミノ供与体のアミノ基と酸アミド結合を形成せしめることを特徴とする生理活性べプチド又は生理活性蛋白質の修飾方法に関する。

また本発明は、少なくともグルタミン残基を有する生理活性ペプチド又は生理活性蛋白質とァミノ供与体を有する物質とを、微生物由来のトランスグル夕ミナーゼの存在下に反応せしめて、該グルタミン残基の位醸アミドにおいて該アミノ供与体のアミノ基と酸アミド結合を形成せしめることを特徴とする生理活性べプチド又は生理活性蛋白質の修飾方法で製造しうるペプチド又は蛋白質の修飾体に関する。

本発明者らは、前記の問題点を解決するために研究を重ねた結果、生理活性べプチド又は生理活性蛋白質とァミノ供与体（ァミノ基）を有する物質とを、トランスグル夕ミナーゼを用いることにより、穏和な条件でかつ選択的に結合させることができることを見出した。

トランスグルタミナ一ゼ（ E C 2 · 3. 2. 1 3 ) (系統名： protein-glutam ine: r-glutamyltransferase) はペプチドまたは蛋白質中のグルタミン残基とアミノ基を有する物質のアミノ基を特異的に結合させることのできる公知の酵素である。トランスグル夕ミナーゼについては、既に種々の文献で報告されているが、その一例として次のものを挙げることができる。

( ) J. E. Folk et al, Adv. Protein Chem.31, 1-133, 1977

(D)J. E. Folk et al, Adv. Enzymol, 38, 109-191, 1973

(;»)H. Bo n et al, Mol. Cel IBioc em.20, 67-75, 1978

(二) orand et al, Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, vol.2,

Proteins, ed G. D. Fasman, pp.669-685, C 1 eve 1 and： C C.3rd ed.

(ホ) Guinea pig and rabbi t liver transglutaminase:!. Abe et a 1 ,

Biochemistry, 16, 5495-5501(1977)

(Mhuman red blood cells tranglutaminase:S. C. Brenner et a I , B i och i m.

Biophys. Acta.522, 74-83, 1978

(卜) Rat coagulating gland transglutaminase: J. Wi Ison et a I Fed. Proc. , 38,

1809(Abstr. ), (1979)

また、トランスグルタミナ一ゼはその由来により、種々のものが知られている。例えば、微生物由来のトランスグル夕ミナ一ゼ（Bacterial Transglutaminase, 以下単に B T Gと記す。 H. Ando et al, Agric. Biol. Chem. , 53( 10), 2613-2617 ( 198 9), K. fashizu et al, Biosci. Biotech. Biochem.， 58 ( 1 ), 82- 87 ( 1994)などで報告されている。）、肝トランスグル夕ミナーゼ（ liver transglutaminase) 、血漿因子 XIII (aplasnia factor XI I la) 、血小板一胎盤因子 XI 1 la (Platelet and plac ental factor XI I la) 、ヘアーホリックトランスグル夕ミナーゼ（ Hair-follic le transglutaminase) 、上皮卜ランスグレタミナーゼ ( Epidemal transglutam inase) 、プロスティ卜卜ランスグル夕ミナーゼ（ Prostate transglutaminase) などの動物由来のトランスグル夕ミナーゼ (Mammalian Transglutaminase) などが知られている。本発明で用いられるトランスグル夕ミナーゼとしては、いずれの由来のものも使用することができるが、 B T Gを用いるのが好ましい。

トランスグル夕ミナーゼによる結合の場合は反応が特異的な位置に限られる為に副成物の種類も少なく、制御もしゃすい利点がある。また、酵素反応であるために、化学反応に対して以下の優位点がある。 i ) 結合対象物の機能を失わせずに特定の位置での結合物を作成できる可能性が高い。

ii) 結合反応条件が生理的条件であるために、結合対象物を変性させない。 iii) 品質を一定に保てる為、高品質の医薬品が製造できる。

一方、蛋白質と蛋白質を結合させる方法は遗伝子同士を結合させる組換え D N Aの技術を用いる方法がある。組換え DNA法に対して、トランスグルタミナ一ゼを用いる方法は以下の利点が有る。

i ) 組換え DNA法に比して、 DN Aから直接合成できない物質、例えば、糖鎖、糖蛋白、糖脂質、 P E G等も結合させることができる。

ii) 組換え DNA法では一方の蛋白質の N末端或は C末端にもう一方の蛋白質を結合させた融合蛋白質しか作れない。

iii) 組換え DNA法では N末端或は C末端にもう一方の蛋白質が結合した融合蛋白質しか得られないので、活性中心が蛋白質の末端に存在してると、この融合蛋白質は活性を失う可能性が高い。

一方、トランスグルタミナーゼを用いると、グルタミンの酸アミド基に限定してアミノ基を有する物質を結合させることができ、組換え DN A法とは異なる結合体が得られる。 B T Gでの結合の制御により、両者の活性を保持した結合体が得られる。

本発明の生理活性ペプチド又は生理活性蛋白質とァミノ供与体を有する物質との結合は、使用するトランスグルタミナーゼの酵素反応条件下で反応させることができる。

たとえば、 B T Gを使用する場合には、温度 4〜 5 5°C、好ましくは 30〜 5 0 で、 p Hが 5〜8、好ましくは ρ Η 6〜 7· 5で反応させることができる。トランスグルタミナーゼ活性測定法。

本発明でいうトランスグルタミナーゼの活性単位は次のように測定される。すなわち、温度 37°C、 p H 6. 0のトリス緩衝液中動物由来酵素の場合は 5 m

Mの C a ²'存在下で、微生物由来酵素の場合は非存在下でベンジルォキシカルボ二ルー Lーグルタミングリシン及びヒドロキシルアミンを基質とする反応系で、トランスグルタミナーゼを作用せしめ、生成したヒドロキサム酸をトリフロロ酢酸存在下で鉄錯体を形成させた後、 5 2 5 n mにおける吸光度を測定し、ヒドロキサム酸量を検量線により求め、 1 分間に 1 "モルのヒドロキサム酸を生成せしめた酵素をトランスグル夕ミナーゼの活性単位、 1 ユニット（ 1 U ) とする。本発明の生理活性べプチドを修飾するァミノ供与体を有する物質としては、分子中にアミノ基を有するものであれば特に制限はないが、アミノ基を有するぺプチド又は蛋白質が好ましい。好ましい物質としては、前記で挙げた生理活性ぺプチド又は蛋白質 ' 抗体 ' 特に、モノクローナル抗体 · 抗原 ' ポリアミノ酸、ポリエチレングリコールのアルキルアミン誘導体、特にポリリジン又はポリエチレングリコールのアルキルアミン誘導体が好ましい。これらの分子量は 3, 000〜200, 0 00、好ましくは 3， 000〜100, 000のものが挙げられる。さらに、これらの分子量は 5, 000〜200, 000、好ましくは 10, 000〜 100, 000のものが挙げられる。

また、本発明の生理活性ペプチドとしては、アミノ酸配列中にグルタミンを有するものであれば、特に制限はないが、前記した生理活性ペプチド又は蛋白質が好ましく、より好ましくはインターロイキン一 2、インターロイキン一 6、インタ一フヱロン、 A D F (ATL derived factor, ヒトチォレドキシン）などを挙げることができる。

本発明の方法によって得られる生理活性ペプチド又は蛋白質の修飾体の例を以下に示す。

1 ) I L一 2は免疫担当細胞に作用して免疫力を増強して癌細胞を殺す可能性があるが、全身に投与すると副作用が激しいので、作用部位すなわち T細胞や N K/L A K細胞へ集積させるか、癌細胞周辺へ集積することが重要とされている。

I L— 2 Z抗 C D 8抗体 [C D 8陽性 T細胞へ集積]

I L一 2 /抗 C D 4抗体 [C D 4陽性 T細胞へ集積]

I L一 2ノ抗 N K/L A K細胞抗体 [N KZL A K細胞へ集積]

I L一 2ノ肝細胞特異的抗原に対する抗体（例えば、抗スルファチド抗体、抗アルブミン受容体抗体） [肝臓に集積して肝癌周囲の免疫力増加]

I L一 2 /重合 H S A [重合 H S Aは肝纖のアルブミン受容体抗体に結合するため肝癌に集積]

I L - 2 抗5 r b B 2抗体又は E r b B 2 リガンド [E r b B 2を有する癌へ集積]

I L一 2 Z大腸癌特異的癌抗原に対する抗体 [大腸癌へ集積]

I L一 2 /メラノ一マ特異的癌抗原に対する抗体 [メラノーマへ集積]

I L— 2 ポリリジン [血中半減期延長]

I L - 2 / P E G (ポリエチレングリコール） [血中半減期延長]

I L— 2ZH S A (human serum albumin) [血中半減期延長]

I L一 2ダイマー [血中半減期延長]

I L一 2ノレンチナン [相乗的抗癌作用増強]

I L - 2 / I L - 9 [相乗的 T細胞活性化]

I L - 2 / I L - 12 [相乗的 T細胞活性化]

I L一 2Zトキシン（例えば、テ夕ナストキシン（tetanus toxin) 、シユードモナストキシン（Pscudononas toxin) ) [ I L— 2受容体を有する癌細胞除去]

2 ) I L一 6は血小板の前駆細胞に作用して血小板数を增強させる鋤きがあるが、肝臓に作用して急性期蛋白質を放出させたり、中枢神経系に作用して発熱を引き起こしたりする為、血小板増強剤として用いる為には骨 «Iへ集積させることが重要とされている。 I L一 6はある濃度以上の血中濃度になると副作用が生じるが、血中半減期を延長できれば一時的に高濃度となる投与を避けることができると考えられるので、血中半減期を延長して徐放効果を与えると副作用軽減効果が生じる。

I L一 6 /骨 ¾細胞又は骨随細胞の支持細胞（ストローマ細胞等）に対する抗体 [骨への集積]

I L一 6 Z骨 ¾細胞に多く発現している受容体に対するリガンド（例えば、 S C F、 I L— 11、 m p 1 - 1 i g a n d、 G— C S F、 GM— C S F又は I L— 3 ) [骨髄への集積及び I L一 6と S C F、又は、 mp 1 — 1 i g a n dの血小板増加作用又は造血幹細胞増加作用に対する相乗作用]

I L一 6 Z骨 18細胞特異的細胞外マトリックスに対するリガンド又は特異的に親和力のある分子 [骨髄への集積]

I L一 6Zポリリジン [血中半減期の延長]

I L - 6 / P E G [血中半減期の延長] I L一 6/H S A [血中半減期の延長]

I L一 6ダイマー [血中半減期の延長]

I L一 6 Zトキシン（例えば、テタナストキシン（tetanus toxin), シユードモナストキシン（Pscudonionas toxin) ) [ I L一 6受容体を有する癌細胞、例えば、骨髄腫の除去]

3 ) さらに、 I L一 6は慢性関節リウマチ、キャッスルマン病等の自己免疫疾患に関与し、 I L一 6と I L一 6受容体異常発現による白血病癌細胞の異常増殖、ある種の癌細胞の悪液質の原因、細菌感染時のショック誘発等、場合によっては病気の原因又は增悪因子となっている。それゆえに抗 I L一 6抗体又は抗 I L一 6受容体の抗体による I L一 6作用の消去は上述の疾患の治療薬となる。

抗 I L _ 6抗体を慢性関節リウマチ治療に用いる場合を考えると、抗 I L一 6 抗体はマウスモノクローナル抗体であるが、このままか、或はこの可変部（vari able region) を用いてヒト抗体の定常部（constant region) と融合させたキメラ抗体や、 L鎖可変部（light chain variable region) と H鎖可変部（heavy c hain variable region) の融合蛋白よりなる 1本鎖抗体などが用いられ、これを関節腔に投与することになる。いずれにしろヒトにとってこの抗体に対する抗体が作られ、抗 I L一 6抗体の作用が打ち消されしまう危険性がある。また、一本鎖抗体の様に人工的抗体は血中又は関節腔中半減期が短い可能性がある。

よって、抗 I L一 6抗体の抗原性低減や血中又は関節腔中半減期の延長等が効となる。

1つの特異性を持った抗体を、もう 1つの特異性を持った抗体とを結合させた二官能性抗体（B F A Bi functional antibody) は新たな医薬の可能性を持っているが、例えば、抗 I L一 6抗体に抗 I L— 1抗体を結合させた B F Aは慢性関節リウマチの增悪因子である I L一 1 と I L一 6を同時に抑えることにより相乗的効果を奏するでろう。これらの例を以下に挙げる。

抗 I L一 6抗体 ZH S A [血中又は関節腔中半減期延長、抗原性減少] 抗 I L一 6抗体/ポリリジン [血中又は関節腔中半減期延長、抗原性減少] 抗 I L - 6抗体/コラーゲン [血中又は関節腔中半減期延長、抗原性減少] 抗 I L一 6抗体 Z抗 I L一 1抗体 [慢性関節リゥマチ治療効果の増強] 4 ) ポリリジンはプラス電荷を持つポリマーで、水溶液中でマイナス電荷を持つ D N A分子を包含し、これを保護する。ポリリジンに夕ーゲッティング分子を結合させ、結合物と D N A分子を混合することにより、 D N Aを夕一ゲッティング分子で包んだ複合体を形成する。この複合体はィンビボ投与でターゲッティング分子に対応する組織に遺伝子を特異的に導入し、蛋白質を発現することができる。 D N Aを包含する分子はかならずしもポリリジンに限定されたものではなく、 D N Aと何等かの親和性を持つ物質で、生体に害の無い循環器系のどこかでトラップされにくい物質であればよい。

5 ) I NF- , - β , - γ は抗ウィルス作用があり、ウィルス性肝炎の治療に用いられている。しかし、大量投与、長期投与による副作用が激しいので、作用部位、即ち肝臓にターゲットすることにより、 I NF の副作用を軽減することができる。この場合、肝臓の実質細胞表面に存在するァシァログリコプロテインレセプ夕一に対するリガンドを結合させることにより、肝臓へのターゲッティングが可能となる。一方、血中において一時的に高濃度となることを抑えるため、血中半減期を延長して徐放効果を与えると副作用軽減効果が生じる。

I NF I ァシァ口ォロソムコィド [肝艨へ集積]

I NF I ァシァロフヱツイン [肝臓へ集積]

I NF I ガラクトース修飾アルブミン [肝臓へ集積]

I NF I ガラクトース修飾ポリリジン [肝臓へ集積]

I NF I 分枝型ガラクトース合成リガンド [肝臓へ集積]

I NF I PEG [血中半減期の延長]

I NF / ポリリジン [血中半減期の延長]

I NF I HSA [血中半減期の延長]

I NF ダイマー [血中半減期の延長]

6 ) ADF (ATL der i ved f ac tor) は発生期の酸素を還元することから抗炎症剤として臨床応用が試みられているが、血中滞留性が低い。そこで血中半減期を延長することにより抗炎症効果の增強が可能である。また、 ADF は肝組織障害における肝細胞ミトコンドリア機能不全の治療応用に期待されているので、肝艨へ夕ーゲットすることによりその効果の増強が生じる。 ADF I PEG [血中半減期の延長]

ADF / ポリリジン [血中半減期の延長]

ADF I HSA [血中半減期の延長]

ADF ダイマー [血中半減期の延長]

ADF I ァシァ口ォロソムコィド [肝臓へ集積]

ADF I ァシァ口フェツイン [肝臓へ集積]

ADF I ガラクトース修飾アルブミン [肝臟へ集積]

ADF / ガラクト一ス修飾ポリリジン [肝朦へ集積]

ADF I 分枝型ガラクトース合成リガンド [肝縢へ集積]

本発明によれば、微生物由来のトランスグルタミナーゼ（BT G) を用いることにより、グルタミンを有する生理活性ペプチド又は蛋白質のグルタミン残基の部分で、特異的にかつ穏和な条件で当該べプチド又は蛋白質を修飾することができる。生理活性ペプチド又は蛋白質の特性を消失することなく、当該ペプチド又は蛋白質の性質を改善することができる。本発明によれば、グルタミンを有する生理活性ペプチド又は蛋白質とアミノ基を有するペプチド又は蛋白質を特異的にかつ穏和な条件で融合することができるので、両方の性質を生かした有用な蛋白質を得ることができる。例えば、抗体、特にモノクローナル抗体を用いて修飾することにより、当該生理活性ペプチド又は蛋白質を必要な組織、臓器、細胞などに特異的に集積することができる。

KliSのな説 B月

図 1は、 I L一 6及び I L— 2の BTG処理物の S D S— P A GEパターンを示す。

図 2は、精製ポリリジン結合 I L一 6のクロマトグラフィーのパターンを示す。図 3は、ポリリジン結合 r h I L一 6の S D S— P A G Eパターンを示す。図 4は、 P E G結合 r h I L— 6の S D S— P A G Eパターンを示す。

図 5は、モノクローナル抗体結合 r h I L— 6のウエスタンブロット法の結果を示す。

図 6は、ポリエチレングリコール（P E G) 結合 1" 1 1 し— 2の 303—？八 G Eパターンを示す。

図 7は、ポリエチレングリコール（P E G) 結合 r h I L— 6の S D S— P A G Eパターンを示す。

図 8は、ポリエチレングリコール（P E G) 結合 r I N F— a— 2 bの S D S 一 P A G Eノ、。ターンを示す。

図 9は、ポリエチレングリコール（P E G) 結合 r A D Fの S D S— P A G E パターンを示す。日月を ^するための

以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

実施例 1

B TGの基質となる各種生理活性蛋白質の検索。

対象生理活性蛋白質として、リコンビナントヒト（ r h ) I L— 2、 r h I L _ 6及び H S Aを用いた。

r h I L - 2 ： l m g/m l 70 mM 齚酸ナトリウム、 p H 5. 0、

250 mM N a C 1

r h I L - 6 ： 1. 75 m g /m 1 1 0 mM クェン酸ナトリウム、

p H 6. 0

H S A ： PASTEUR MERIEUX製（発売元：富士レビォ）、 2 0 0 m g Z m 1 方法

1 ) 各蛋白質 0. 5〜 2 m gを含む l m lの溶液に等量の 50 M モノダンシルカダべリン (Monodansy lcadaverine) 溶液 ( p H 7. 5、 50 m M T r i s— HC 1 ) を加えた。 0. I N— N a OHを必要最小量添加して各溶液の P Hを 7. 2〜7. 4 となるように調製した。

2) 調製した各反応液 2 50 ^ 1 に対して精製 BTG溶液（ 1 O u n i t / m 1 ) を 1 0〃 1添加して、 3 7 で 2時間静置培養した後、 1 M硫酸アンモニゥム 20 1 を添加して反応を終了させた。コントロールとして酵素液を添加する前に硫安溶液を添加したものを用意した。 3) 各反応溶液の 200〃 1 を N u n c社の 96穴マイクロウェルプレートにサンプリングし、ミリポア社製の蛍光プレートリーダー（Cytof or) に力、け光強度を測定した。フィル夕一はェキサイテーション（Exc ation) が 360Z 4 0 n m、ェミッション（Emission) が 530 / 25 n mとし、感度は 6を選択した。

結果

結果を表 1 に示す。表 1

実施例 2

BTGによる r h I L— 2、 r h I L— 6の架棰重合化反応。

試薬 r h I L— 2、 r h I L— 6溶液は実施例 1 と同じものを使用した。方法

1 ) r h I L— 2又は r h I L— 6溶液 1 00〃 1 に対して実施例 1で用いた酵素液を 1 0 " 1添加し、 37てで 90分間放置した。コントロールには酵素液の代りに、同量の蒸留水を添加した。反応終了後に、直ちに 1 00 " 1 の S D S— P A G E用試料調製液を加えて S D S — P A G Eの試料を調製した。

2 ) 試料の S D S — P A G Eはファストシステム（Phastsystem) を用いて行なった。ゲルは P h a s t G e l lO— 15を用い、染色は銀染色をファストシルバースティンキット（Phast Si lver Stain Kit) を用いて行なった。サンプリングされた試料量は 1 1 である。

結果の S D S _ P A G Eパターンを図 1 に示す。図 1 中の 1 は、マーカーを示し、 2は r h I L — 6を、 3は B T G処理した r h I L _ 6を、 4は r h I L —

2を、 5は B T G処理した r h I L — 2をそれぞれ示す。

B T G処理した 3及び 5にはより高分子量のスポットが示されており、 r h I

L 一 2及び I L 一 6が B T G処理により架橋重合化されることが示された。実施例 3

ポリリジン結合 r h I L— 6の作成。

1 0 m gのポリリジン臭酸塩（分子量 7, 900、 45, 700、 83, 800 Sigma社製）を l m l の 5 0 mM T r i s — H C 1 ( p H 7. 5 ) に溶解する。これに 5 0〃 1 の B T G溶液（ 1 4 U /m l 5 0 mM T r i s — H C l 、 p H 7. 5 ) を添加して、室温で 3 0分培養する。これに 2 m l の r h I L _ 6溶液（ 2 m g Z m l 1 0 mMクェン酸ナトリウム、 p H 6. 0 ) を加え搜はん後、 3 7 で 2. 5時間（分子量 7, 900の場合）又は 2 0時間（分子量 45， 700又は 83， 800の場合）放置する。反応液を逆相 H P L Cで精製する。

溶出条件は図 2に示した条件と同様である。ポリリジン結合 I L 一 6画分を集め逆相 H P L Cで濃縮する。条件は図 2 と同じ、但し、 B 0 %→ B 1 0 0 %、 5分とした。ポリリジン結合 r h I L — 6画分を集めてゲル濾過で脱溶媒する。条件は、

カラム S e p h a d e x G - 2 5 ( l x l O c m)

パッファー 2 0 mM T r i s — H C 1 、 0. 5 M N a C K P H 8. 5 流速 2 m 1 / m i n、

である。

精製したポリリジン結合 r h I L— 6の純度を逆相 H P L Cで分析した結果を 994 図 2に示す。図 2のように、ほぼ単一に精製された。

図 2の 1は、 r h I L— 6 ( Reten t i on t i me 14.12分）を、

図 2の 2は分子量 7, 900のポリリジンが結合した r h I L— 6 (Retention time 12.38分）を、

図 2の 3は分子量 45， 700のポリリジンが結合した r h I L— 6 (Retention time 12.16分）を、

図 2の 4は分子量 83, 800のポリリジンが結合した r h I L— 6 (Retention time 11.46分）を示している。

当該 H P L Cの条件は、カラム： Vydac Protein C4 214TP54 (4.6 x 250mm)。

溶媒： Aは 0.1%トリフルォロ醉酸（T F A) 、

Bは 0.1% T F A— 80%ァセトニトリル。溶出プログラムは B 4 0%から 20分で B 1 00%。流速： 1 mlノ分であった。

ポリリジン結合 r h i L— 6 (分子量 7, 900の場合）の S D S— P A G Eを図 3に示す。図 3に示されるように、ポリリジン結合 r h I L— 6はほぼ単一のバンドを示した。

図 3中、 1はマーカーを示し、 2は r h I L— 6を示し、 3はポリリジン結合 r h I L - 6 (分子量 7, 900の場合）を示す。実施例 4

ポリエチレングリコール（P E G) 結合 r h i L— 6の作成。

1 0 m gのポリオキシエチレンビス（ 6—ァミノへキシル）（分子量 3, 350 Sigma社製）を l m lの 50mM T r i s— H C 1 ( H 7. 5 ) に溶解する。これに 50 1 の B TG溶液（ 1 4 UZm l 50 mM T r i s— H C 1 , p H 7. 5) を添加して、室温で 30分放置する。これに 2 m 1の r h I L— 6溶液（ 2m g/m l 1 0 mM クェン酸ナトリウム、 p H 6. 0 ) を加え搜はん後、 37°Cで 2. 5時間放置する。反応液を逆相 H P L Cで精製する。精製条件は実施例 3 (図 2 ) と同じである。 P E G結合 r h I L— 6画分を集めて逆相 H P L Cで濃縮する。条件は実施例 3と同じであるが、但し、溶出プログラムを B 0 %→B 1 00%を 5分とした。 P E G結合 r h I L— 6画分を集めてゲル濾過で脱塩する。

条件は、

カラム S e p h a d e x G- 2 5 ( l x i O c m) ,

ノ、、ッファー 20 mM T r i s— H C l、 0. 5 M N a C し H 8. 5 流速 2 m 1 / m i n、

である。

精製物を S D S— P A G Eで解析した（図 4 ) 。 P E G結合 r h I L— 6は分子量約 24， 000の位置にほぼ単一のバンドを示した。未修飾体に対して P E Gが 1 分子結合したと予想される。

図 4中、 1は r h I L— 6を示し、 2は精製 P E G結合 r h I L— 6を示す。 P E G結合 r h I L— 6はほぼ単一のバンドを示した。実施例 5

i ) ポリリジン結合 r h I L— 6及び P E G結合 r h I L— 6の i n v i t r o活性。

方法

I L— 6依存性マウスハイブリドーマ MH 60 B S F 2をサブクローニングした MH 60. 32株を用いた。

96穴プレートを用いて各ゥエルに以下の溶液を加える。

a ) 培地にて段階的に稀釈した検体溶液 1 00 w 1 ( l O Om gZm l より 3 倍づっ稀釈）

b ) 培地にて 3回洗浄し 1 00 1 の培地に懸濁した 5 x 1 0³個の MH 60。

37で、 50 % C 0₂下で 60時間培養後、細胞数を以下の MT Tアツセィ法で測定し、各ゥヱルに MTT溶液（ 3— [4， 5—ジメチルチアゾールー 2—ィル (dimethylthiazol - 2 -yl) ] - 2, 5—ジフエニルテトラゾリゥムブロマイド (diphenyl tetrazol iun bromide) 1 m g /m 1 P B S溶液） 50 yti l を力！]えて約 6時間放置後、上清 1 50 1 を除き、 MTT溶解液（20%S D S 0.

04 N HC 1溶液） 1 00 1 を加えて一晩放置する。マイクロプレートリーダ一で吸光度（ 570— 620mm) を測定した。本実験で使用した培地は P R PM I 1640 (G1BC0社）、 1 0%V C S (非動化）である。単位は平野ら（Proc. N. A. S. , 82, 5490( 1985)) の方法に従って算出した。

結果

表 2に示すように、 ΜΗ 60の増殖活性において、ポリリジン結合 r h I L— 6 (実施例 3で作成した 3種のポリリジン結合 r h I L _ 6 ) 及び P E G結合 r h I L— 6は r h I L一 6とほぼ同等の活性を示した。

ポリリジン結合 r h I L— 6及び P E G結合 r h I L - 6

の in vitro活性（M H 60增殖）

表 2

i i) ポリリジン結合 r h I L— 6及び P E G結合 r h I L— 6の i n v i v o活性

方法 6週令前後で体重 2 5 gの健康な I C R系雌マウスを用い、試料 0. 1 m l 皮下注射する。試料はクェン酸バッファー（クェン酸ナトリウム p H 7. 0) で稀釈した。対象はクェン酸バッファ一とする。試験動物は 1群 5匹であり、投与は 1 日 2回（朝 · 夕）、 5日目の朝まで合計 9回投与する。最後の投与から 4〜8 時間目に各試験動物の心臓から採血し、抗凝固剤と混合して採血後 3時間以内にその血小板数を電気抵抗変化検出法により測定した。

fe -^.

表 3に示すように、 r h I L— 6に対してポリリジン結合 r h I L— 6 (実施例 3で作成した 3種のポリリジン結合 r h I L - 6 ) 及び P E G結合 r h I L - 6は、 i n V i V 0 において有意に血小板数を亢進させた。ポリリジン結合 r h I L一 6及び P E G結合 r h I L一 6

の in vivo活性（血小板数亢進）

表 3 蛋白質血小板数（ + S D )

( X 1 0⁴ 1 )

クェン酸バッファー 1 1 1. 2 + 8. 9 r h I L - 6 1 24. 6 + 1 9. 1 ポリリジン（分子量 7, 900) 1 35. 3 + 7. 8

結合 r h I L— 6

ポリリジン（分子量 45, 700) 1 4 3. 2 + 8. 1

結合 r h I L— 6

ポリリジン（分子量 83， 800) 1 38. 5 + 1 0. 2

結合 r h I L— 6

P E G結合 r h I L— 6 1 4 5. 4 + 9. 8 実施例 6

I L— 6とモノクローナル抗体の結合。

マウスモノクローナル抗体ラット巨核球ノ血小板抗体 50 g 5 0 1、 50 mM T r i s—H C l p H 7. 5に B TG 1 U / 1 00 50m M T r i s— H C l p H 7. 5を加え、室温で 30分放置した後、 r h I L 一 6 5 0 s / 2 5 u 1 OmM クェン酸ナトリウム p H 7. 0を加え、 20°Cで 4時間反応させた。反応液を予め 1 0 mM酢酸ナトリウム緩衝液 p H 7. 0で平衝化したマウスモノクローナル抗 h I L— 6抗体カラムに供し、続いて 0. I N H C 1、 2 M N a C l で溶出させた。これを、 0. 3M T r i s— H C 1. p H 8. 5で 3倍に稀釈した後、予め、 1 O mM酢酸ナトリウム緩衝液 p H 7. 0で平衝化した P r 0 t e i n G カラム（フアルマシア製）に供し、統いて 0. 1 Mグリシン一 H C 1緩衝液 P H 2. 7で溶出させた。この溶出画分を S D S— P A G Eにかけ、抗 r h I L— 6抗体でウェスタンブロッティングを行なった。

結果を図 4に示す。抗 r h I L— 6抗体カラムと P r o t e i n G カラムともに吸着した物質が高分子領域に検出されたことは、モノクローナル抗体は r h I L - 6と結合したことを示している。

図 4中、 1はマーカーを示し、 2は反応液を、 3は抗 r h I L— 6抗体カラムの溶出液を、 4は抗 r h I L— 6抗体カラム吸着画分を、 5は Protein G カラム吸着画分をそれぞれ示す。なお、 3は抗体カラムのキャパシティーを越えて r h I L一 6結合物がオーバ一フローしていることを示している。実施例 7

ポリエチレングリコール（PEG) 結合 rhIL- 2 の作製。

0.25 M の NaCl を含む 50 mM 酢酸緩衝液（pH 5.0) に溶解した rhlい 2 溶液 (2.5 mL) を、 200 mM トリス - 塩酸緩衝液（PH 7.5) で予め平衡化した「Sepha dex G-25J カラムにアプライし、上記トリス緩衝液で溶出した。溶出液を 280 n m の吸光度でモニターし、 rh - 2 の溶出画分を得た（3 raL)。この溶出画分の蛋白質濃度を 280 nm におけるモル吸光係数を 1.2 104 M- lcra- 1 として換算し、さらに上記トリス緩衝液で希釈してすることにより 5 u M の蛋白質溶液を調製した。この希釈溶液（2.5 mL) に 75 mg のポリォキシェチレンビス（6- ァミノへキシル）（分子量 3,350, Sigma 社製）を添加し、 37 °Cでプレインキュペートした。この反応液に 250 〃 L の B T G 溶液（220 U/mL 200 πιΜ トリス - 塩酸緩衝液（ΡΗ 7.5) ) を添加し、 37 *C で 2 時間ィンキュベ一トした。

反応液を「YMC C8 APJ カラム（山村化学社製）を用いた逆相 HPLC により精製し、未反応の rhIL- 2 画分を除去した。精製物の純度は Phast System (Pharmacia 社製）を用いた SDS- PAGE (Momogenious 20 ゲル使用）により分析した。その結果、 PEG による修飾体（PEG- rhlL-2 ) は未修飾体に対し PEG 力； 1 分子結合したと予想される程度上昇した位置にのみ蛋白質由来のバンドを確認した（図 6 )。図 6中、 1 は分子量マーカ一を示し、 2 は rhlい 2 を示し、 3 は PEG 結合 rhlい 2 を示す。実施例 8

ポリエチレングリコール（PEG) 結合 rhlい 2 (PEG-rhIL-2) の 1L- 2 活性。

IL-2 依存性マウス細胞「CTLL- 2」を rat - 2 (Collaborative 社製）約 50 units/mL を含む 10¾ FCS (ゥシ胎児血清）含有 RPMI 1640 培地で培養した。本細胞を 10% FCS 含有 RPM1 1640 培地で洗浄した後、本培地に 4 x 104 cells/m L となるように浮遊させた。この 100 L を組織培養用 96 穴プレートの各穴に分注し、さらに 10% FCS 含有 RPM1 1640 培地で希釈した PEG- rhlい 2 及び未柊飾 rhIL- 2 検体液を各穴 100 L 加えて培養した。培養開始 20 時間後に NEN 社製「raethyl- 3H」 Thymidine (740 GBq/mmol) を 10% FCS 含有 RPMI 1640 培地で 100倍希釈し、 370 Bq/50 L を各穴に加え、さらに 4 時間培養した。培養後、細胞を Packard 社製「Matrix 96 Direct Beta counterj で取り込まれた放射活性を測定した。その結果、 PEG-rhlい 2 の rhlい 2 に対する比活性は 97% となり rh IL-2 の PEG 修飾体は IL- 2 活性を保持していることが示された。実施例 9 ポリエチレングリコール（PEG) 結合 rhIL- 6 の作製。

10 nM クェン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.0) に溶解した rhlい 6 溶液（1.75 π g/mL) を、 200 πιΜ トリス - 塩酸緩衝液（ρΗ 7.5) で希釈することにより 5〃の蛋白質溶液を調製した。この希釈溶液（2.5 nL)に 75mgのポリオキシエチレンビス

(6- ァミノへキシル）（分子量 3， 350, Sigma 社製）を添加し、 37 でプレインキュベートした。この反応液に 250 u i の B T G 溶液（220 U/mL 200 πΜ トリス - 塩酸緩衝液（PH 7.5) ) を添加し、 37 で 2 時間インキュベートした。反応液を「YMC C8 APJ カラム（山村化学社製）を用いた逆相 HPLC により精製し，未反応の rhIL- 6 画分を除去した。精製物の純度は Phast System (Pharmacia 社製）を用いた SDS-PAGE ( omogenious 20 ゲル使用）により分析した。その結果、 PEG による修飾体（PEG-rhlL- 6 ) は未修飾体に対し PEG が 1 分子結合したと予想される程度上昇した位置にのみ蛋白質由来のバンドを確認した（図 7 )。図 7中、 1 は分子量マ一カーを示し、 2 は rhIL-6 を示し、 3 は PEG 結合 rhIL- 6 を示す。実施例 1 0

ポリエチレングリコール（PEG) 結合 rINF-a-2b の調製。

rlNF- a -2b の凍結乾燥体（山ノ内社製）を 200 πιΜ 卜リス - 塩酸緩衝液（pH 7.5) に溶解させることにより 5 M の蛋白質溶液を調製した。この調製液（2. 5 mL) に 22.5 mg のポリオキシエチレンビス（6- ァミノへキシル）（分子量 3, 350， Sigma 社製）を添加し、 37 てでプレインキュペートした。この反応液に 250 〃 L の B T G 溶液（220 U/oL 200 mM トリス - 塩酸緩衝液（pH 7.5) ) を添加し、 37 V で 2 時間インキュベートした。

反応液を Phast System (Pharmacia 社製）を用いた SDS- PAGE (Momogenious 20 ゲル使用）により分析した。その結果、 PEG による修飾体（PEG-rINF- a - 2b) は未修飾体に対し PEG が 1 分子結合したと予想される程度の分子量が上昇した位置にのみ蛋白質由来のバンドを確認した（図 8 )。図 8中、 1 は分子量マーカーを示し、 2 は rINF- a - 2b を示し、 3は PEG修飾反応液を示す。 3の 43.0 KDa付近のスポットは反応液中の B T Gであり、 67.0 KDa以上のスポットは原料 rINF- α - 2b中の人血清アルブミン（H S A ) である。

実施例 1 1

ポリエチレングリコール（PEG) 結合 rADF の調製。

rADF の凍結乾燥体を 200 mM トリス - 塩酸緩衝液（pH 7.5) に溶解させることにより 5 M の蛋白質溶液を調製した。この調製液（2.5 mL) に 22.5 nig のポリオキシエチレンビス（6- ァミノへキシル）（分子量 3, 350, Sigma 社製）を添加し、 37 °Cでプレインキュペートした。この反応液に 250 〃 L の B T G 溶液（220 U/raL 200 mM トリス - 塩酸緩衝液（pH 7.5) ) を添加し、 37 °C で

2 時間インキュベートした。

反応液を Phast System (Pharmacia 社製）を用いた SDS- PAGE (Momogen i ous 20 ゲル使用）により分析した。その結果、 PEG による修飾体（PEG- rADF) は未修飾体に対し PEG 力 ί 1 分子結合したと予想される程度分の子量が上昇した位置にのみ蛋白質由来のバンドを確認した（図 9 )。図 9中、 1 は分子悬マーカーを示し、 2は rADF を示し、 3は PEG 修飾反応液を示す。 3の 43.0 KDa付近のスポットは反応液中の B T Gである。

Claims

請求の範囲

. 少なくともグルタミン残基を有する生理活性ペプチド又は生理活性蛋白質とァミノ供与体を有する物質とを、微生物由来のトランスグルタミナーゼの存在下に反応せしめて、該グルタミン残基の位酸アミドにおいて該ァミノ供与体のァミノ基と酸アミド結合を形成せしめることを特徴とする生理活性ペプチド又は生理活性蛋白質の修飾方法。

. ァミノ供与体を有する物質がポリリジン、モノクローナル抗体又はポリェチレングリコールのアルキルアミン誘導体のいずれかである特許請求の範囲第 1 項に記載のぺプチド又は蛋白質修飾方法。

. グルタミン残基を有する生理活性蛋白質がインターロイキン 2若しくは 6、ィンターフェロン又は A D F (ATL der i ved fac tor, ヒトチォレドキシン）のいずれかである特許請求の範囲第 1 項又は第 2項に記載のペプチド又は蛋白質修飾方法。

. 特許請求の範囲第 1項に記載の方法で製造しうるペプチド又は蛋白質の修飾体。

. ァミノ供与体を有する物質がポリリジン、モノクローナル抗体又はポリェチレングリコールのアルキルアミン誘導体のいずれかである特許請求の範囲第 4 項に記載のペプチド又は蛋白質修飾体。

. グルタミン残基を有する生理活性蛋白質がインターロイキン 2若しくは 6、ィンターフェロン又は A D F (ATL der i ved f ac tor, ヒトチォレドキシン）のいずれかである特許請求の範囲第 4項又は第 5項に記載のペプチド又は蛋白質修飾体。