WO1996040934A1 - Process for producing l-lysine - Google Patents

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Masakazu Sugimoto
Masako Izui
Atsushi Hayakawa
Eiichi Nakano
Masaki Kobayashi
Yasuhiko Yoshihara
Tsuyoshi Nakamatsu
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    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Definitions

  • L-lysine biosynthesis genes include dihydroxypicolinate reductase gene (JP-A-7-75578) and diaminopimelate dehydrogenase gene (Ish ino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987). ), Cloned genes involved in L-lysine biosynthesis, phosphoenolpyruvate ruboxylase gene (JP-A-60-87788), and dihydrodipicolinate synthase gene (Japanese Patent Publication No. 6-55149).
  • diaminopimelic acid decarboxylase gene JP-A-60-62994
  • An object of the present invention is to provide aspartokinase (hereinafter also referred to as “AK”), which is an important enzyme of L-lysine biosynthesis in coryneform bacterium cells. ), Dihydropicolinate reductase (hereinafter also referred to as "DDPR”.
  • DDPR Dihydropicolinate reductase
  • the gene encoding the DDPR protein is also referred to as "dapB").
  • the gist of the present invention is to provide a mutant lysC (hereinafter simply referred to as “mutant AK”) encoding a mutant AK in which the synergistic inhibition by lysine and threonine has been released in coryneform bacteria.
  • Mutated lysC By enhancing dapB in combination with lysC, growth can be improved and L-lysine production rate can be increased, as compared with the case where lysC is enhanced alone.
  • dapA, lysA By gradually increasing ddh, the L-lysine production rate can be increased stepwise.
  • chromosomal DNA is prepared by the method of Saito and Miura (H. Saito and K. Miura Biochem. Biophys. Acta, 72, 619, (1963)), etc. It can be performed by amplifying lysC by the polymerase chain reaction method (PCR: polymerase chain react ion; see White, TJ et al; Trends Genet. 5, 185 (1989)).
  • SEQ ID NO: 10 shows the base sequence of the DNA fragment containing dapB and the amino acid sequence deduced from this sequence. In addition, only the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 11. In the present invention, in addition to the DNA fragment encoding this amino acid sequence, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11, that is, the DDPR activity is not substantially affected. Unless otherwise specified, a DNA fragment encoding an amino acid sequence having a mutation due to substitution, deletion or insertion of one or more amino acids can be used in the same manner.
  • lysA forms an operon with argS (arginyl-tRNA synthase gene), and lysA is present downstream of argS.
  • Expression of lysA is regulated by a promoter upstream of argS (see Journal of Bacteriology Nov., 7356-7362 (1993)).
  • the nucleotide sequences of these genes are known in Corynebacterium glutamicum (see Molecular Microbiology 4 (11), 1819-1830 (1990), Molecular and General Genetics 212, 112-119 (1988)) and are based on this.
  • DM primer examples include SEQ ID NO: 16 in the sequence listing (corresponding to base numbers 11 to 33 in the nucleotide sequence described in Molecular Microbiology 4 (11), 1819-1830 (1990)). Each having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 (corresponding to nucleotide numbers 1370 to 1392 in the nucleotide sequence described in Molecular and General Genetics 212, 112-119 (1988)). DNA.
  • the synthesis of DNA, the PCR reaction, and the preparation of the resulting lysA-containing plasmid can be performed in the same manner as in the case of lysC described above.
  • the DDH gene is known in Corynebacterium glutamicum (Ishino, S. et al., Nucleic Acids Res., 15, 3917 (1987)), and PCR primers can be prepared based on this. .
  • a specific example of such a DM primer is a 20-mer DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 or 22 in the sequence listing. DNA synthesis, PCR reaction, preparation of a plasmid containing the obtained ddh, and the like can be performed in the same manner as in the case of lysC described above.
  • the coryneform bacterium carrying the mutant AK may be a mutant that has produced a mutant aspartokinase by mutation, or may have been transformed by introducing a mutant lysC. .
  • mutants having the ability to produce L-lysine derived from these strains can also be used as hosts.
  • Such artificial mutants include the following. S— (2-aminoethyl) one cysteine (hereinafter abbreviated as “AEC”) Resistant mutants (for example, Brevipacterium lactofermentum AJ11082 (NRR LB-11470), Japanese Patent Publication No. 56-1914, Japanese Patent Publication No. 56-1915, Japanese Patent Publication No. 57-14157, Japanese Patent Publication No. 57-14158 No. 57-30474, No. 58-10075, No.
  • AEC (2-aminoethyl) one cysteine
  • transposons derived from coryneform bacteria are described in WO02 / 02627 International Publication Pamphlet, W093 / 18151 International Publication Pamphlet, European Patent Publication 0445385, JP-A-6-46867, Vertes, AA et al., Mol. icrobiol., 11, 739-746 (1994), Bonainy, C., et al., Mol. Microbiol., 14, 571-581 (1994), Vertes, AA et al., Mol. Gen. Genet., 245. , 397-405 (1994), Jagar, W. et al., FEMS Microbiology Letters, 126, 1-6 (1995), JP-A-7-107976, JP-A-7-327680, and the like.
  • the coryneform bacterium further enhanced with lysA is, for example, a group containing the mutant lysC, dapB, dapA and lysA and capable of autonomous growth in coryneform bacterium cells. It is obtained by introducing the recombinant DNA into a host coryneform bacterium.
  • sugars such as glucose, fructose, sucrose, molasses and starch hydrolysates, and organic acids such as fumaric acid, cunic acid, and succinic acid can be used.
  • FIG. 5 is a diagram showing a process of constructing a plasmid pLYSAB having lysA and Brevi. -Ori.
  • FIG. 9 is a diagram showing a process of constructing a plasmid pAB having dapA, dapB and Brevi. -Ori.
  • FIG. 14 is a diagram showing a process of constructing a plasmid pCABDL having mutant lys dapA, dapB, ddh, lysA and Brevi. -Ori. DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS
  • Example 1 Brevipacterium lactofamentum wild-type lvsC gene
  • the lysC of Corynebacterium glutamicum is a protein known to have two identical ⁇ and / 3 subunits encoded in the same DNA strand in the same reading frame (Kalinowski, J et al; Molecular Microbiology (1991) 5 (5), 1197-1204), judging from homology, this gene also shows that two subunits, ⁇ and / 3, are encoded in the same DNA strand in the same reading frame. Conceivable.
  • PCR-Script (manufactured by Invitrogen) was used as a vector for cloning the amplified 201 bp gene fragment, and was connected to the amplified dapB fragment.
  • a plasmid in which the dapB fragment 201 bp amplified from the Brevibacterium lactofermentum chromosome was connected to pCR-Script was produced.
  • the plasmid having dapB derived from ATCC13869 thus obtained was named pCRDA PB.
  • the transformed AJ13107 strain obtained by introducing pCRDAPB into the E. coli JM109 strain has been used since May 26, 1995, Accession number FERM BP-5114, 1-3-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan, and is deposited internationally under the Budapest Treaty.
  • plasmid in which the dapA fragment 141 bp amplified from the brevibacterium lactofermentum chromosome was connected to pCR1000 was prepared.
  • the plasmid having dapA derived from ATCC13869 obtained in this manner was named pCRDAPA.
  • Chromosome DM was prepared from ATCC13869 strain according to a conventional method. A DNA fragment containing argS, lysA and the operon containing them was amplified by PCR from the chromosomal MA.
  • This plasmid was digested with Kpnl, and the resulting Brevi.-ori DNA fragment was ligated to p299LYSA also digested with Kpnl to prepare a plasmid capable of autonomous replication in coryneform bacteria and containing lysA.
  • the prepared plasmid was named pLYSAB.
  • Figure 5 shows the process of pLYSAB construction.
  • pUC18DDH was cut with Xbal and Kpnl, and the resulting ddh fragment was ligated to pPK4 cut with pnpnl and Xbal.
  • pPK4D a plasmid capable of autonomous replication in coryneform bacteria and containing ddh was produced, and this plasmid was named pPK4D.
  • Figure 6 shows the process of pPK4D construction.
  • This fragment was ligated with pCRDAPA cut with EcoRI.
  • the resulting plasmid was named pCRCAB.
  • This plasmid is capable of autonomous propagation in E. coli and coryneform bacteria, imparts kanamycin resistance to the host, and has both mutant lysC and dapA.
  • Figure 7 shows the process for preparing pCRCAB.
  • Example 7 Preparation of Plasmid Having Mutant lv'sC and dapB Plasmid P399AK9 Having Mutant lysC and Plasmid p399DPR Having dapB Mutant ly S C, to prepare a plasmid containing dapB.
  • Brevi.-ori was introduced into the obtained P399AKDPR.
  • Plasmid pHK4 containing Brevi.-ori was cut with the restriction enzyme Kpnl (Takara Shuzo Co., Ltd.), and the cut surface was blunt-ended. Blunting was performed using a DNA Blunting kit (Takara Shuzo) according to the designated method. After blunting, a phosphorylated BamHI linker (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was connected, and a modification was made so that the DM fragment of the Brevi. -Ori portion was cut out from pHK4 by cutting only with BaraHI.
  • This plasmid was digested with BamHI, and the resulting Brevi.-oriDNA fragment was ligated to P399AKDDPR, which was also digested with BamHI, to obtain a plasmid capable of autonomous growth in coryneform bacteria and containing mutant lysC and dapB. It was made and named pCB.
  • Figure 8 shows the process of pCB construction.
  • Example 8 Preparation of Plasmid Having Both dapA and dapB Plasmid having dapA pCRDAPA was cut with Kpnl and EcoRI, a DNA fragment containing dapA was extracted, and vector plasmid pHSG399 was cut with Kpnl and EcoRI. Connected. The obtained plasmid was designated as P399DPS.
  • the plasmid pCRMPB having dapB was digested with SacI I and EcoRI, a 2.0 kb DNA fragment containing the region encoding DDPR was extracted, and connected to P399DPS digested with SacI I and EcoRI. A plasmid with both dapB and dapB was prepared. The obtained plasmid was designated as P399AB.
  • AJ1 1082 strain has AEC resistance properties.
  • the method of introducing the plasmid was based on the electric pulse method (Sugimoto et al., JP-A-2-20771). Transformants were selected based on the drug resistance marker of each plasmid. When a plasmid containing the chloramphenicol-resistant gene was introduced, complete medium containing 5 ⁇ g / ml chloramphenicol was used, and when a plasmid containing the kanamycin-resistant gene was introduced, 25 Transformants were selected on a complete medium containing g / ml kanamycin.
  • Example 14 Production of L-lysine Each transformant obtained in Example 13 was cultured in an L-lysine-producing medium, and its monolysine-producing ability was evaluated. The composition of the L-lysine production medium is as shown below.
  • VVI 303 VM 33V 309 VOO IVI 110 310 330 WO OVO VV3 300 300 0X3 0 ⁇ OO S68 u ⁇ 0 aqj ufo n- [3 STJ] naq EJV gjy B ⁇ y BTV
  • Glu Phe Cys lie Asn Asn Gly lie Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Gly
  • Trp Glu Ser Gin Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gin Tyr Gly

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Description

明細書
Lーリジンの製造法 技術分野 本発明は、 ァミノ酸などの発酵生産に用いられているコリネ型細菌に遺伝子操 作の手法を用いて改変を加え、 該微生物を培養することによる Lーリジンの製法 に関する。 背景技術 飼料添加物として用いられている Lーリジンは通常、 コリネ型細菌の Lーリジ ン生産変異株を使って発酵法により生産されている。 現在知られている種々の L 一リジン生産菌はコリネ型細菌の野生株の人工変異により作られている。
一方、 コリネ型細菌において、 菌体内で自律増殖可能でかつ、 薬剤耐性マーカ 一遺伝子を有するベクタ一プラスミ ド （米国特許第 4514502号参照） 、 遺伝子の菌 体への導入方法 （特開平 2-207791号等） が開示されており、 これらの技術を用い た Lースレオニンまたは L—イソ口イシン生産菌育成の可能性が開示されている (米国特許第 4452890号、 及び米国特許第 4442208号参照） 。 また、 L -リジン生 産菌育成に関しても、 ベクタ一プラスミ ドに L一リジン生合成に関与する遺伝子 を組み込み、 菌体内で増幅させる技術 （特開昭 56-160997号などがある） が知られ ている。
Lーリジン生合成遺伝子としては、 例えば、 ジヒ ドロジピコリン酸レダクター ゼ遺伝子 （特開平 7- 75578) ゃジァミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 （Ish ino, S. et al. , Nucleic Acids Res. , 15, 3917 ( 1987)) のように、 L一リジン 生合成に関与する遺伝子をクローニングした例や、 ホスホェノールピルビン酸力 ルボキシラーゼ遺伝子 （特開昭 60-87788) 、 ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺 伝子 （特公平 6- 55149) 、 ジァミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子 （特開昭 60-62994) のように、 遺伝子の増幅が L一リジン生産性に影響を与える例が知ら れている。
また、 L—リジン生合成に関与する酵素のうち、 野生型ではフィードバック阻 害を受ける酵素について、 フィ一ドバック阻害が解除された変異を有する酵素遺 伝子を導入して Lーリジン生産性を向上させた例も知られている。 このような遺 伝子として具体的には、 ァスパルトキナーゼ遺伝子 （W094/25605国際公開パンフ レツ 卜） 等が知られている。
上記のように、 L一リジン生合成遺伝子の増幅、 あるいは変異遺伝子の導入に よって、 一定の成果が得られている。 例えば、 リジン及びスレオニンによる協奏 阻害が解除された変異型ァスパルトキナーゼ遺伝子を保持するコリネ型細菌は、 L一リジンを著量 （約 2 5 g / L ) 生産する。 但し、 該細菌は、 変異型ァスパル トキナーゼ遺伝子を保持しない細菌と比較して生育速度が低下する。 また、 変異 型ァスパルトキナ一ゼ遺伝子に加え、 さらにジヒ ドロジピコリン酸シンターゼ遺 伝子を導入することによって Lーリジン生産性が向上するとの報告 （Applied an d Environmental Microbiology 57(6)， 1746-1752 (1991)) もある。 但し、 概細 菌は、 生育速度が一層低下する。
一方、 ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子については、 これを導入した コリネ型細菌のジヒドロジピコリン酸レダク夕ーゼ活性が上昇したことは示され ているが、 L一リジン生産性への影響については報告されていない （特開平 7-75 578) 。
また、 コリネ型細菌においては、 L—リジン生合成遺伝子を複数個組み合わせ、 生育を抑制せずに Lーリジン収率の大幅な改善に成功した例は知られていないの が現状である。 また、 L一リジン生合成遺伝子の増強により生育の改善が図られ た例も報告されていない。 発明の開示 本発明の課題は、 コリネ型細菌の細胞中の L -リジン生合成の重要な酵素であ るァスパル卜キナーゼ （以下 「A K」 ともいう。 A K蛋白をコードする遺伝子を 以下 「lysC」 ともいう。 ） 、 ジヒ ドロジピコリン酸レダクターゼ （以下 「D D P R」 ともいう。 D D P R蛋白をコードする遺伝子を以下 「dapB」 ともいう。 ） 、 ジヒ ドロジピコリン酸シンターゼ （以下 「DDP S」 と略す。 DDP S蛋白をコ ―ドする遺伝子を以下 「dapA」 ともいう。 ） 、 ジァミノピメ リン酸デカルボキシ ラーゼ （以下 「DD C」 ともいう。 DD C蛋白をコ一ドする遺伝子を以下 「lysA」 ともいう。 ） 、 及びジァミノピメリン酸デヒドロゲナ一ゼ （以下、 「DDH」 と もいう。 DDH蛋白をコードする遺伝子を以下 「ddh」 ともいう。 ） の各々をコー ドする DNA配列を遺伝子材料に用い、 コリネ型細菌の Lーリジン生産能及び生 育速度を改善しょうというものである。
微生物を用いた物質の発酵生産を行なう場合、 投入した原料に対する目的物質 の収率と並んで、 生産速度は極めて重要な因子であり、 設備当りの生産速度を上 げることにより目的物質を大幅に安価に製造することが出来る。 そのため、 発酵 収率と生産速度を両立させることは工業的に極めて重要である。 本発明は、 コリ ネ型細菌を用いた Lーリジンの発酵生産を行なうに当たり、 以上の様な問題点の 解決方法を提示するものである。
本発明の要旨は、 コリネ型細菌において、 リジン及びスレオニンによる協奏阻 害が解除された変異型 AK (以下、 単に 「変異型 AK」 ともいう。 ） をコードす る変異型 lysC (以下、 単に 「変異型 lysC」 ともいう。 ） に dapBを組み合せて増強 する事により、 lysCを単独で増強した場合と比べ、 生育が改善され、 L—リジン 生産速度を向上させることができること、 更に dapA、 lysA、 ddhを順次増強するこ とにより、 段階的に Lーリジン生産速度を向上できることにある。
すなわち本発明は、 Lーリジン及び L一スレオニンによるフィードバック阻害 が実質的に解除されたァスパルトキナ一ゼをコ一ドする DN A配列、 及びジヒド ロジピコリン酸レダクターゼをコードする DN A配列を含み、 コリネ型細菌細胞 中で自律増殖可能な組換え DNAである。 また、 上記各 DNA配列に加えてジヒ ドロジピコリン酸シンターゼをコ一ドする DN A配列をさらに含む組換え DN A を提供する。 さらに、 上記 3種の DNA配列に加えてジアミノピメリン酸デカル ボキシラーゼをコ一ドする DN.A配列をさらに含む組換え DNAを提供する。 ま た更に、 上記 4種の DNA配列に加えてジアミノピメリン酸デヒ ドロゲナーゼを コ一ドする DN A配列をさらに含む組換え DN Aを提供する。
また、 本発明は、 L一リジン及び Lースレオニンによるフィードバック阻害が 実質的に解除されたァスバルトキナーゼを保持し、 さらにジヒドロジピコリン酸 レダクターゼをコ一ドする D N Aが増強されたコリネ型細菌を提供する。 さらに、 このコリネ型細菌において、 さらにジヒ ドロジピコリン酸シンターゼをコ一ドす る D N Aが増強されたコリネ型細菌を提供する。 さらにまた、 このコリネ型細菌 において、 前記の 3種の D N Aに加えてジァミノピメリン酸デカルボキシラーゼ をコードする D N Aが増強されたコリネ型細菌を提供する。 また、 前記コリネ型 細菌において、 前記の 4種の D N Aに加えて、 ジアミノピメリン酸デヒ ドロゲナ 一ゼをコ一ドする D N Aが増強されたコリネ型細菌を提供する。
さらに本発明は、 上記のいずれかのコリネ型細菌を好適な培地で培養し、 該培 養物中に L—リジンを生産蓄積せしめ、 該培養物から Lーリジンを採取すること を特徴とする Lーリジンの製造法を提供するものである。
尚、 本発明においてコリネ型細菌とは、 バージーズ 'マニュアル 'ォブ 'デ夕 一ミ不ィティフ *ノ、クテリオロシー (Bergey' s Manual of Determinative Bacte riology) 第 8版 599頁 （1974) に定義されている一群の微生物であり、 好気性， グ ラム陽性， 非抗酸性， 胞子形成能を有しない桿菌であり、 コリネパクテリゥム属 細菌、 及び従来ブレビパクテリゥム属に分類されていたが現在コリネバクテリゥ ム属細菌として統合されたブレビバクテリゥム属細菌、 さらにコリネバクテリゥ ム属細菌と非常に近縁なブレビバクテリゥム属細菌を含む。
以下、 本発明を詳細に説明する。
< 1〉本発明に用いられる L一リ ジン生合成遺伝子の取得
本発明に用いる Lーリジン生合成遺伝子は、 D N A供与体である細菌から染色 体 D N Aを調製し、 プラスミ ドベクター等を用いて染色体 D N Aライブラリーを 作製し、 このライブラリ一から所望の遺伝子を保持する株を選択し、 選択された 株からその遺伝子が挿入された組換え D N Aを回収することによって得られる。 本発明に用いる Lーリジン生合成遺伝子の D N A供与体としては、 所望の Lーリ ジン生合成遺伝子がコリネ型細菌細胞中で機能する酵素タンパク質を発現するも のであれば、 特に制限されないが、 コリネ型細菌が好ましい。
コリネ型細菌由来の lysC、 dapA及び dapB遺伝子は、 いずれも配列が知られてい るので、 ポリメラーゼチヱインリアクション法 （ P C R ： polymerase chain rea ction； White, T. J. et al ； Trends Genet. 5, 185( 1989)参照） によって増幅する ことにより取得することができる。
以下に、 本発明に用いる各 Lーリジン生合成遺伝子を取得する方法を例示する。
(： 1 ) 変異型 lysCの取得
変異型 lysCを含む D N A断片は、 A K活性に対する Lーリジン及び L—スレオ ニンによる相乗的なフィ一ドバック阻害が実質的に解除された変異株から調製す ることができる （WO94/25605国際公開パンフレツ ト） 。 このような変異株は、 例 えば、 コリネ型細菌野生株に、 通常の変異処理法、 紫外線照射または N -メチル - Ν' 一二トロー Ν—二トロソグァ二ジン （N T G ) 等の変異剤処理を施し、 変 異処理した細胞群の中から取得することができる。 A Κ活性の測定は、 Miyajima, R et al ;The Journal of Biochemistry(1968), 63(2), 139- 148に記載される方法を 用いることができる。 このような変異株として、 ブレビパクテリゥム ·ラク トフ アーメンタム （Brevibacterium lactofermentum) 野生株 ATCC13869株 （現在の名 禾尔 {ま、 コリネノくクテリゥム ·ク' レタミカム（Corynebacterium glutamicura) (こ変更 されている） より変異処理により誘導された L—リジン生産菌 AJ3445 (FERM P-1 944) が最も好ましいものとして挙げられる。
また、 変異型 lysCは、 野生型 lysCを含むプラスミ ド D N Aをインビトロ変異処 理することによつても得られる。 さらに、 A Kの L—リジン及び L—スレオニン による相乗的なフィードバック阻害を解除する変異が具体的に知られている （W0 94/25605国際公開パンフレッ ト） ので、 この情報に基づいて部位特異的変異法等 により、 野生型 lysCから調製することもできる。
コリネ型細菌から lysCを単離するには、 例えば、 斎藤、 三浦の方法 （H. Saito and K. Miura Biochem. Biophys. Acta, 72, 619, (1963)) 等により染色体 D N Aを調 製し、 ポリメラーゼチェインリアクション法 ( P C R ： polymerase chain react ion； White, T. J. et al ； Trends Genet. 5， 185( 1989)参照) により、 lysCを増幅 することによって行うことができる。
D N Aプライマーとしては、 例えば、 コリネバクテリゥム，グルタミカムにお いて既知となっている配列 (Molecular Microbiology( 1991), 5(5), 1197-1204, M ol. Gen. Genet. ( 1990)224, 317- 324参照) を基にして、 lysCをコート"する約 1643bp の領域を増幅すべく、 配列表配列番号 1及び配列番号 2に示す塩基配列を有する 23mer及び 21merの一本鎮 D N Aが挙げられる。 D N Aの合成は Applied Biosyste ms社製 D N A合成機 model 380Bを使用し、 ホスホアミダイ ト法を用いて （Tetra hedron Letters(1981), 22, 1859参照) 常法に従って合成できる。 PCR反応は、 宝酒 造 （株） 製 DNAサ一マルサイクラ一 PJ2000型を用い、 TaqDMポリメラ一ゼを用い、 供給者により 指定された方法に従って行うことができる。
P C R法により増幅された lysCは、 E. coli及び 又はコリネ型細菌の細胞内に おいて自律複製可能なベクタ一 D N Aに接続して組換え D N Aを調製し、 これを E. coli細胞に導入しておくと、 後の操作がしゃすくなる。 E. coli細胞内におい て自律複製可能なベクターとしては、 プラスミ ドベクタ一が好ましく、 宿主の細 胞内で自立複製可能なものが好ましく、 例えば pUC19、 pUC18、 pBR322、 pHSG299、 pHSG399、 pHSG398、 RSF1010等が挙げられる。
また、 これらのベクタ一にコリネ型細菌中でプラスミ ドを自律複製可能にする 能力をもつ D N A断片を挿入すると、 E. coli及びコリネ型細菌の両方で自律複製 可能ないわゆるシャトルべクターとして使用することができる。
このようなシャ トルベクタ一としては、 以下のものが挙げられる。 尚、 それぞ れのベクターを保持する微生物及び国際寄託機関の寄託番号をかっこ内に示した。 pHC4 x- i'Jh7 'JAJ 12617(FERM BP- 3532)
PAJ655 x- in7 >JAJ 11882(FERM BP- 136)
コリネハ"クテリウ ク"ルタミカム SR820KATCC39135)
PAJ1844 ェシエリヒ了'コリ AJ11883(FERM BP- 137)
コリネハ"クテリウム "ルタミカム SR8202(ATCC39136)
PAJ611 ェシエリヒア · ]リ AJ11884(FERM BP- 138)
PAJ3148 コリネハ"ク ίリウム ·Γルタミカム SR8203(ATCC39137)
PAJ440 ハ"チルス ·ス' 'フ'、チリス AJ1190KFERM BP- 140) これらのベクターは、 寄託微生物から次のようにして得られる。 対数増殖期に 集められた細胞をリゾチーム及び S D Sを用いて溶菌し、 3 0 0 0 0 X gで遠心 分離して溶解物から得た上澄液にポリェチレングリコールを添加し、 セシウムク 口ライ ド—ェチジゥムブ口マイ ド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
E. coliにプラスミ ドを導入して形質転換するには D. M. Morrisonの方法 （Meth ods in Enzyraology, 68, 326, 1979) あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処 理して D N Aの透過性を増す方法 (Mandel, M. and Higa, A. , J. Mol.， Biol. , 53， 15 9( 1970) ) 等により行うことができる。
上記のようにして A K野生株から lysCを単離すれば野生型 lysCが得られ、 A K 変異株から lysCを単離すれば変異型 lysCが得られる。
野生型 lysCを含む D N A断片の塩基配列の一例を、 配列表配列番号 3に示す。 この塩基配列より推定される野生型 A Kタンパク質のひサブュニッ 卜のアミノ酸 配列を D N A配列と同時に配列表の配列番号 4に、 ァミノ酸配列のみを配列番号 5に示す。 また、 D N A塩基配列より推定される野生型 A Kタンパク質の /9サブ ュニッ 卜のアミノ酸配列を D N Aと同時に配列表の配列番号 6に、 アミノ酸配列 のみを配列番号 7に示す。 尚、 各サブュニッ トとも、 開始コドンに G T Gが用い られており、 対応するアミノ酸をメチォニンと表記しているが、 これは、 メチォ ニン、 ゾくリン、 またはフオルミルメチォニンを表すものである。
本発明に用いる変異型 lysCとしては、 Lーリジン及び Lースレオニンによる相 乗的なフィードバック阻害が解除された A Kをコードするものであれば特に制限 されないが、 野生型 A Kのアミノ酸配列において、 ひサブュニッ トでは N末端か ら 2 7 9番目のァラニン残基がァラニン以外かつ酸性ァミノ酸以外のァミノ酸残 基に、 βサブュニッ トでは 3 0番目のァラニン残基がァラニン以外かつ酸性アミ ノ酸以外のアミノ酸残基に変化する変異が挙げられる。 ここで、 野生型 Α Κのァ ミノ酸配列としては、 具体的には αサブュニッ トでは配列表配列番号 5に示すァ ミノ酸配列が、 βサブュニッ トでは配列表配列番号 7に示すァミノ酸配列が挙げ られる。
また、 上記のァラニン以外かつ酸性ァミノ酸以外のァミノ酸残基として好まし いものは、 スレオニン残基、 アルギニン残基、 システィン残基、 フヱニルァラ二 ン残基、 プロリン残基、 セリン残基、 チロシン残基及びパリン残基が挙げられる c 尚、 置換されるアミノ酸残基に対応するコドンは、 そのァミノ酸残基をコード するものであれば種類は特に問わない。 また、 菌種ゃ菌株の違いにより保持する 野生型 A Kのァミノ酸配列がわずかに相異するものがあると予想される。 このよ うな酵素の活性に関与しない 1又は 2以上の位置での 1又は 2以上のァミノ酸残 基の置換、 欠失あるいは挿入等による変異を有する A Kも本発明に使用すること ができる。 さらに、 A K活性、 及び L —リジン及び L —スレオニンによる相乗的 なフィードバック阻害の解除に実質的に影響のない限り、 他の 1又は 2以上のァ ミノ酸の置換、 欠失あるいは挿入等による変異を有する A Kも使用できる。
ブレビパクテリゥム ·ラク トフアーメンタム野生型株である AJ 12036株 （FERM BP- 734) に変異型 lysCプラスミ ド p399AK9Bを導入した株 AJ 12691は、 1 9 9 2年 4 月 1 0日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 3 0 5 日本 国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号） に受託番号 FERM P- 12918として寄託され、
1 9 9 5年 2月 1 0日にブダぺスト条約に基づく国際寄託に移管され、 FERM BP - 4999の受託番号で寄託されている。
( 2 ) dapBの取得
dapBを含む D N A断片は、 コリネ型細菌染色体から PCRにより調製することがで きる。 D N A供与菌としては特に制限されないが、 ブレビパクテリゥム · ラク ト ファーメンタム ATCC13869株が挙げられる。
D D P Rをコードする D N A配列は、 ブレビパクテリゥム ·ラク トフアーメン タムにおいて既知であり (Journal of Bacteriology 175(9), 2743-2749 ( 1993)) 、 これを基にして PCR用 DMプライマーを調製することができる。 このような DNAブラ イマ一として具体的には、 配列表の配列番号 8及び 9に記載の塩基配列を有する 各々 23merの D N Aが挙げられる。 D N Aの合成、 PCR反応、 得られた dapBを含む プラスミ ドの調製等は、 前記の lysCの場合と同様にして行うことができる。
dapBを含む D N A断片の塩基配列及びこの配列から予想されるアミノ酸配列を 配列番号 1 0に示す。 また、 アミノ酸配列のみを配列番号 1 1に示す。 本発明に は、 このアミノ酸配列をコードする D N A断片の他、 配列番号 1 1に示すアミノ 酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、 すなわち D D P R活性に実質的に影響が ない限り、 1又は 2以上のアミノ酸の置換、 欠失あるいは挿入等による変異を有 するアミノ酸配列をコ一ドする D N A断片も同様に使用できる。
E. coliJM109株に後記実施例で得られた dapBを含むプラスミ ド pCRMPBを導入し て得られた形質転換株 AJ13107株は、 1 9 9 5年 5月 2 6日より通商産業省工業技 術院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 3 0 5 日本国茨城県つくば市東一丁目 1 番 3号） に受託番号 FERM BP- 5114の受託番号で、 ブダペスト条約に基づき国際寄 託されている。
( 3 ) dapAの取得
dapAを含む D N A断片は、 コリネ型細菌染色体から PCRにより調製することがで きる。 D N A供与菌としては特に制限されないが、 ブレビバクテリウム · ラク ト ファーメンタム ATCC13869株が挙げられる。
D D P Sをコ一ドする D N A配列は、 コリネバクテリゥム ·グル夕ミカムにお いて既知であり (Nucleic Acids Research 18(21), 6421 (1990)、 EMBL accessi on No. X53993参照） 、 これを基にして PCR用 DNAプライマ一を調製することができ る。 このような DNAプライマーとして具体的には、 配列表の配列番号 1 2及び 1 3 に記載の塩基配列を有する各々 23merの D N Aが挙げられる。 D N Aの合成、 PCR 反応、 得られた dapAを含むプラスミ ドの調製等は、 前記の lysCの場合と同様にし て行うことができる。
dapAを含む D N A断片の塩基配列及びこの配列から予想されるアミノ酸配列の 一例を配列番号 1 4に示す。 また、 アミノ酸配列のみを配列番号 1 5に示す。 本 発明には、 このアミノ酸配列をコードする D N A断片の他、 配列番号 1 5に示す ァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列、 すなわち D D P S活性に実質的に 影響がない限り、 1又は 2以上のアミノ酸の置換、 欠失、 挿入等による変異を有 するアミノ酸配列をコードする D N A断片も同様に使用できる。
E. coliJM109株に後記実施例で得られた dapAを含むプラスミ ド pCRMPAを導入し て得られた形質転換株 AJ 13106株は、 1 9 9 5年 5月 2 6日より通商産業省工業技 術院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 3 0 5 日本国茨城県つくば市東一丁目 1 番 3号） に受託番号 FERM BP- 5113の受託番号で、 ブダペスト条約に基づき国際寄 託されている。
( 4 ) lysAの取得
lysAを含む D N A断片は、 コリネ型細菌染色体から PCRにより調製することがで きる。 D N A供与菌としては特に制限されないが、 ブレビパクテリゥム ·ラク ト ファーメンタム ATCC13869株が挙げられる。
コリネ型細菌においては、 lysAは argS (アルギニル一 tRNAシンターゼ遺伝子） とともにオペロンを形成しており、 argSの下流に lysAが存在している。 lysAの発 現は、 argSの上流にあるプロモーターによって調節を受ける （Journal of Bacte riology Nov. , 7356-7362 ( 1993)参照） 。 これらの遺伝子の塩基配列は、 コリネ パクテリゥム ·グルタミカムにおいて既知であり （Molecular Microbiology 4(1 1)， 1819- 1830 ( 1990)、 Molecular and General Genetics 212, 112-119 ( 1988) 参照） 、 これを基にして PCR用 DMプライマーを調製することができる。 このよう な DMプライマーとして具体的には、 配列表の配列番号 1 6 (Molecular Microbi ology 4(11)， 1819- 1830 (1990)に記載されている塩基配列において塩基番号 1 1 - 3 3に相当する） 及び配列番号 1 7 (Molecular and General Genetics 212, 112-119 ( 1988)に記載の塩基配列において塩基番号 1 3 7 0 ~ 1 3 9 2に相当す る） に示す塩基配列を有する各々 23merの D N Aが挙げられる。 D N Aの合成、 P CR反応、 得られた lysAを含むプラスミ ドの調製等は、 前記の lysCの場合と同様に して行うことができる。
後記実施例では、 lysAを増強するために、 プロモーター、 argS及び lysAを含む D N A断片を用いたが、 argSは本発明に必須ではなく、 lysAがプロモーターの直 下に連結された D N A断片を用いてもよい。
argS及び 1 ysAを含む D N A断片の塩基配列及びこの配列がコ一ドすると予想さ れるアミノ酸配列の一例を配列番号 1 8に示す。 また、 argSがコ一ドするアミノ 酸配列の一例を配列番号 1 9に、 lysAがコードするアミノ酸配列の一例を配列番 号 2 0に示す。 本発明には、 このアミノ酸配列をコードする D N A断片の他、 配 列番号 2 0に示すアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列、 すなわち D D C 活性に実質的に影響がない限り、 1又は 2以上のアミノ酸の置換、 欠失あるいは 挿入等による変異を有するァミノ酸配列をコードする D N A断片も同様に使用で きる。
( 5 ) ddhの取得
ddhを含む DN A断片は、 コリネ型細菌染色体から PCRにより調製することがで きる。 DNA供与菌としては特に制限されないが、 ブレビバクテリウム ·ラク ト ファーメンタム ATCC13869株が挙げられる。
DDH遺伝子は、 コリネバクテリゥム グルタミカムにおいて既知であり （Ishin o， S. et al. , Nucleic Acids Res. , 15, 3917 (1987)) 、 これを基にして PCR用 プライマーを調製することができる。 このような DMプライマーとして具体的には、 配列表の配列番号 21及び 22に記載の塩基配列を有する各々 20merの D N Aが挙 げられる。 DNAの合成、 PCR反応、 得られた ddhを含むプラスミ ドの調製等は、 前記の lysCの場合と同様にして行うことができる。
ddhを含む DNA断片の塩基配列及びこの配列から予想されるアミノ酸配列を配 列番号 23に示す。 また、 アミノ酸配列のみを配列番号 24に示す。 本発明には、 このァミノ酸配列をコードする DN A断片の他、 配列番号 24に示すァミノ酸配 列と実質的に同一のァミノ酸配列、 すなわち DDH活性に実質的に影響がない限 り、 1又は 2以上のアミノ酸の置換、 欠失あるいは挿入等による変異を有するァ ミノ酸配列をコードする DNA断片も同様に使用できる。 く 2〉本発明の組換え DN A及びコリネ型細菌
本発明のコリネ型細菌は、 L—リジン及び L—スレオニンによるフィードバッ ク阻害が実質的に解除されたァスバルトキナーゼ （変異型 AK) を保持し、 さら にジヒドロジピコリン酸レダクタ一ゼをコードする DNA (dapB) が増強された ものである。 本発明のコリネ型細菌として好ましい態様は、 さらに、 ジヒ ドロジ ピコリン酸シンターゼをコードする DNA (dapA) が増強されたコリネ型細菌で ある。 本発明のコリネ型細菌としてさらに好ましい態様は、 さらに、 ジアミノビ メリン酸デカルボキシラーゼをコ一ドする DNA (lysA) が増強されたコリネ型 細菌である。 本発明のコリネ型細菌としてより好ましい態様は、 さらに、 ジアミ ノピメリン酸デヒ ドロゲナーゼをコ一ドする DNA (ddh) が増強されたコリネ型 細菌である。
ここで D N Aを 「増強」 とは、 遺伝子のコピー数を高くする、 プロモーターを 強力なものを使用する、 比活性の高い酵素をコードする遺伝子を使用する、 ある いはこれらを組み合わせるなどして、 その D N Aによりコードされる酵素の細胞 中の活性を高くすることをいう。
変異型 A Kを保持するコリネ型細菌としては、 突然変異によって変異型ァスパ ル卜キナーゼを産生するようになったものでもよく、 また、 変異型 lysCを導入す ることによって形質転換されたものでもよい。
上記 D N Aを導入するコリネ型細菌の例としては、 例えば次のような L一リジ ン生産性野生株が挙げられる。
コリネバクテリゥム ·ァセトァシドフィルム ATCC13870
コリネバクテリゥム ·ァセトグルタミクム ATCC15806
コリネバクテリウム ·カルナェ ATCC15991
コリネバクテリウム · グルタミクム ATCC13032
(ブレビバクテリゥム ·ディバリカタム） ATCC14020
(ブレビバクテリゥム · ラク トフアーメンタム） ATCC13869
(コリネバクテリゥム · リ リゥム） ATCC15990
(ブレビバクテリゥム · フラバム） ATCC14067
コリネバクテリゥム メラセコーラ ATCC17965
ブレビパクテリゥム サッカロリティクム ATCC14066
ブレビパクテリゥム ィンマリオフィルム ATCC14068
ブレビパクテリゥム ロゼゥム ATCC13825
ブレビパクテリゥム チォゲニタリス ATCC19240
ミクロノくクテリゥム アンモニアフィラム ATCC15354
コリネバクテリゥム サ一モアミノゲネス AJ12340CFERM BP- 1539) また、 上記菌株以外にも、 これらの菌株から誘導された L一リジン生産能を有 する変異株等も、 宿主として利用できる。 この様な人工変異株としては次の様な ものがある。 S— （2—アミノエチル） 一システィン （以下、 「AEC」 と略記する） 耐性変異株 （例えば、 ブレビパクテリゥム · ラク トファーメンタム AJ11082 (NRR L B-11470) 、 特公昭 56-1914号、 特公昭 56-1915号、 特公昭 57- 14157号、 特公昭 5 7 - 14158号、 特公昭 57-30474号、 特公昭 58- 10075号、 特公昭 59-4993号、 特公昭 61 -35840号、 特公昭 62- 24074号、 特公昭 62-36673号、 特公平 5- 11958号、 特公平 7-1 12437号、 特公平 7- 112438号参照） 、 その成長に L—ホモセリン等のアミノ酸を必 要とする変異株 （特公昭 48-28078号、 特公昭 56-6499号） 、 AECに耐性を示し、 更 に L—ロイシン、 L—ホモセリ ン、 L—プロリン、 Lーセリン、 L一アルギニン、 Lーァラニン、 Lーバリン等のアミノ酸を要求する変異株 （米国特許第 3708395号 及び第 3825472号） 、 D L— α—アミノー e—力プロラクタム、 α—アミノーラウ リルラクタム、 ァスパラギン酸一アナログ、 スルファ剤、 キノィ ド、 Ν—ラウ口 ィルロイシンに耐性を示す L一リジン生産変異株、 ォキザ口酢酸脱炭酸酵素 （デ カルボキシラ一ゼ） または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示す Lーリジン生産変異株 (特開昭 50- 53588号、 特開昭 50-31093号、 特開昭 52-102498号、 特開昭 53- 9394号、 特開昭 53- 86089号、 特開昭 55-9783号、 特開昭 55- 9759号、 特開昭 56- 32995号、 特 開昭 56- 39778号、 特公昭 53- 43591号、 特公昭 53-1833号） 、 イノシトールまたは酢 酸を要求する L一リジン生産変異株 （特開昭 55-9784号、 特開昭 56-8692号） 、 フ ルォ口ピルビン酸または 34°C以上の温度に対して感受性を示す Lーリジン生産変 異株 （特開昭 55- 9783号、 特開昭 53-86090号） 、 エチレングリコールに耐性を示し, L —リジンを生産するブレビバクテリゥム属またはコリネバクテリゥム属の生産 変異株 （米国特許第 4411997号） 。 上記のような宿主において L一リジン生合成遺伝子を増強するには、 具体的な 例としては、 これらの遺伝子をプラスミ ドベクター、 トランスポゾン、 ファージ ベクター等を用いて宿主に導入する。 その際、 低コピー型のベクターを用いても ある程度の増強は期待できるが、 マルチコピー型のベクターを用いることが好ま しい。 そのようなベクターとして、 上記 pAJ655、 pAJ1844 pAJ611> pAJ3148及び PAJ440等のプラスミ ドベクターが挙げられる。 また、 コリネ型細菌由来のトラン スポゾンは、 WO02/02627国際公開パンフレツ ト、 W093/18151国際公開パンフレツ ト、 欧州特許公開 0445385号、 特開平 6-46867号、 Vertes, A. A. et al. , Mol. icrobiol. , 11, 739 - 746 ( 1994)、 Bonainy, C.， et al. , Mol. Microbiol. , 14, 571-581 ( 1994)、 Vertes, A. A. et al.， Mol. Gen. Genet. , 245, 397-405 ( 19 94)、 Jagar, W. et al. , FEMS Microbiology Letters, 126, 1-6 ( 1995)、 特開平 7- 107976号、 特開平 7- 327680号等に記載されている。
尚、 本発明において、 変異型 lysCは必ずしも増強されている必要はなく、 前記 したように染色体 D N A上の lysCに変異を有するもの、 あるいは変異型 lysCが染 色体 D N Aに組み込まれたものでもよいが、 プラスミ ドベクターを用いて導入さ れても差し支えない。 一方、 dapA、 dapB、 lysA及び ddhは、 効率よく L —リジンを 生産させるためには増強されていることが好ましい。
lysC、 dapA、 dapB、 lysA及び ddhの各遺伝子の導入は、 それぞれ別個のベクター を用いて宿主に順次導入してもよく、 単一のベクターを用いて 2種類、 3種類 4 種類、 又は 5種類の遺伝子を共に導入してもよい。 別個のベクタ一を用いる場合 には、 遺伝子の導入の順序は問わないが、 宿主での安定な分配保持機構を有し、 互いに共存可能なべク夕一を用いることが好ましい。
変異型 A Kを保持し、 さらに dapBが増強されたコリネ型細菌は、 例えば、 変異 型 lys 及び dapBを含み、 コリネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組換え D N Aを 宿主コリネ型細菌に導入することによって、 得られる。
また、 変異型 lysC及び dapBに加え、 さらに、 dapAが増強されたコリネ型細菌は、 例えば、 変異型 lysC：、 dapB及び dapAを含み、 コリネ型細菌細胞中で自律増殖可能 な組換え D N Aを宿主コリネ型細菌に導入することによって、 得られる。
さらに、 変異型 lysC：、 dapB及び dapAに加え、 さらに、 lysAが増強されたコリネ 型細菌は、 例えば、 変異型 lysC、 dapB、 dapA及び lysAを含み、 コリネ型細菌細胞 中で自律増殖可能な組換え D N Aを宿主コリネ型細菌に導入することによって、 得られる。
さらにまた、 変異型 lysC：、 dapB、 dapA及び lysAに加え、 さらに、 ddhが増強され たコリネ型細菌は、 例えば、 変異型 lysC、 dapB、 dapA、 lysA及び ddhを含み、 コリ ネ型細菌細胞中で自律増殖可能な組換え D N Aを宿主コリネ型細菌に導入するこ とによって、 得られる。
上記のような組換え D N Aは、 例えば、 プラスミ ドベクタ一、 トランスポゾン、 ファージベクター等のベクターに、 Lーリジン生合成遺伝子の各々を挿入するこ とによって得られる。
宿主への組換え D N Aの導入の方法は、 プラスミ ドの場合、 電気パルス法 （杉 本ら、 特開平 2-207791号公報） によって行うことができる。 トランスポゾンを用 いた遺伝子の増幅は、 プラスミ ドにトランスポゾンを搭載させて細胞内に導入し、 トランスポゾンの転位を誘導することにより行なうことができる。
< 3 > L—リジンの製造法
上記のようにして L一リジン生合成遺伝子が増強されたコリネ型細菌を好適な 培地で培養し、 該培養物中に L一リジンを生産蓄積せしめ、 該培養物から Lーリ ジンを採取することにより、 Lーリジンを効率よく製造することができる。
使用する培地としては、 炭素源、 窒素源、 無機イオン及び必要に応じその他の 有機成分を含有する通常の培地が挙げられる。
炭素源としては、 グルコース、 フラク トース、 シュクロース、 糖蜜やでんぷん の加水分解物などの糖類、 フマール酸、 クェン酸、 コハク酸等の有機酸類を用い ることができる。
窒素源としては、 硫酸アンモニゥム、 塩化アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム 等の無機アンモニゥム塩、 大豆加水分解物などの有機窒素、 アンモニアガス、 ァ ンモニァ水等を用いることができる。
有機微量栄養源としては、 ビタミン B l、 L一ホモセリンなどの要求物質また は酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。 これらの他に、 必要に応じて リン酸カリウム、 硫酸マグネシウム、 鉄イオン、 マンガンイオン等が少量添加さ れる。
培養は好気的条件下で 30〜90時間実施するのがよく、 培養温度は 2 5て〜 3 7 °Cに、 培養中 p Hは 5〜 8に制御することが好ましい。 尚、 p H調整には無機あ るいは有機の酸性あるいはアル力リ性物質、 更にアンモニアガス等を使用するこ とができる。 培養物からの L一リジンの採取は通常のイオン交換樹脂法、 沈澱法 その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。 図面の簡単な説明 図 1は、 変異型 lysCを有するプラスミ ド P399AK9B及び p399AKYB構築の過程を示 す図である。
図 2は、 dapB及び Brevi. -oriを有するプラスミ ド pDPRBの構築の過程を示す図で ある。
図 3は、 dapA及び Brevi. -oriを有するプラスミ ド pDPSBの構築の過程を示す図で ある。
図 4は、 lysAを有するプラスミ ド P299LYSAの構築の過程を示す図である。
図 5は、 lysA及び Brevi. -oriを有するプラスミ ド pLYSABの構築の過程を示す図 である。
図 6は、 ddh及び Brevi. ori-を有するプラスミ ド pPK4Dの構築の過程を示す図で ある。
図 7は、 lysC、 dapB及び Brevi. -oriを有するプラスミ ド pCRCABの構築の過程を 示す図である。
図 8は、 変異型 lys (：、 dapB及び Brevi. -oriを有するプラスミ ド pCBの構築の過程 を示す図である。
図 9は、 dapA、 dapB及び Brevi. -oriを有するプラスミ ド pABの構築の過程を示す 図である。
図 1 0は、 ddh及び lysAを有するプラスミ ド p399DLの構築の過程を示す図である c 図 1 1は、 ddh、 lysA及び Brevi. -oriを有するプラスミ ド pDLの構築の過程を示 す図である。
図 1 2は、 変異型 lysC、 dapA、 dapB及び Brevi. -oriを有するプラスミ ド pCABの 構築の過程を示す図である。
図 1 3は、 変異型 lysC；、 dapA、 dapB、 lysA及び Brevi. -oriを有するプラスミ ド pCABLの構築の過程を示す図である。
図 1 4は、 変異型 lys dapA、 dapB、 ddh, lysA及び Brevi. -oriを有するプラス ミ ド pCABDLの構築の過程を示す図である。 好適な実施例の説明 以下に、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。 実施例 1 ブレビパクテリゥム ·ラク トフアーメンタム野生型 lvsC遺伝子
及び変異型 lysC遺伝子の取得
< 1〉野生型及び変異型 lysCの取得、 及びそれらを含有するプラスミ ドの作製 ブレビバクテリウム ·ラク トファーメンタ厶 ATCC13869株、 及び ATCC13869株よ り変異処理により得られた Lーリジン生産性変異株 AJ3445 (FERM P-1944) を染色 体 D N Aの供与体として用いた。 AJ3445株は、 変異により lysCがリジン及びスレ ォニンによる協奏阻害が実質的に解除されている (Journal of Biochemistry 68, 701 -710 ( 1970)) 。
染色体 DMより PCR法 (polymerase chain reaction； White, T. J. et al ； Trend s Genet. 5, 185(1989)参照） により lysCを含む D N A断片を増幅した。 増幅に用 いた MAプライマーはコリネバクテリゥム ·グルタミカムにおいて既知となってい る配列 (Molecular Microbiology( 1991 )5(5), 1197- 1204, Mol. Gen. Genet. ( 1990) 224, 317- 324参照） を基にして lysCをコードする約 1643bpの領域を増幅すべく、 配 列番号 1及び配列番号 2に示す塩基配列を有する 23mer及び 21merの一本鎮 D N A を合成した。 D N Aの合成は Applied Biosystems社製 D N A合成機 model 380Bを 使用し、 ホスホアミダイ ト法を用いて (Tetrahedron Letters( 1981), 22， 1859参照) 常法に従って合成した。
PCR反応は、 宝酒造 （株） 製 D N Aサーマルサイクラ一 PJ2000型を用い、 TaqD NAポリメラーゼを用い、 供給者により指定された方法に従って遺伝子増幅を行な つた。 増幅された 1643kbの遺伝子断片をァガロースゲル電気泳動により確認した 後、 ゲルより切り出した該断片を常法により精製し、 制限酵素 Nrul (宝酒造 （株） 製） 及び EcoRI (宝酒造 （株） 製） にて切断した。
遺伝子断片のクローン化用ベクターには PHSG399 (Takeshi ta, S et al ;Gene( l 987), 61, 63- 74参照） を用いた。 pHSG399を制限酵素 Smal (宝酒造 （株） 製） 及び 制限酵素 EcoRIにて切断し、 増幅された lysC断片と接続した。 D N Aの接続は D N Aライゲ一シヨンキッ ト （宝酒造 （株） 製） を用い、 指定された方法にて行なつ た。 この様にして PHSG399にブレビバクテリゥム · ラク トファーメンタム染色体よ り増幅された lysC断片が接続されたプラスミ ドを作製した。 野生株である ATCC13 869株由来の lysCを有するプラスミ ドを p399AKY、 L一リジン生産菌である AJ3463 由来の sCを有するプラスミ ドを p399AK9と命名した。
P399AKYおよび P399AK9に、 それぞれコリネバクテリゥム属細菌中でプラスミ ド を自律複製可能にする能力をもつ D N A断片 （以下 「Brevi. -ori」 と記す） を導 入し、 コリネパクテリゥム属細菌中で自律複製可能な lysCを搭載したプラスミ ド を作製した。 Brevi. - oriは、 これを含み、 ェシエリヒア ' コリと、 コリネバクテ リゥム属細菌の双方の菌体中で自律複製可能なブラスミ ドべク夕一 pffl から調製 した。 pM4は、 pHC4を Kpnl (宝酒造 （株） 製） 及び BamHI (宝酒造 （株） 製） で切 断し、 Brevi. -ori断片を抽出し、 同じく Kpnl及び BamHIにて切断した pHSG298に接 続することによって構築される （特開平 5- 7491号公報参照） 。 pHK4は、 宿主に力 ナマイシン耐性を付与する。 尚、 pHK4を保持するェシヱリヒア · コリ HB101は、 ェ シエリヒア · コリ AJ 13136と命名され、 1 9 9 5年 8月 1日に、 通商産業省工業 技術院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 3 0 5 日本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号） に受託番号 FERM BP- 5186として寄託されている。
pHK4を、 制限酵素 Kpnl及び BamHIにて切断し、 切断面を平滑末端化した。 平滑末 端化は DNA Blunting kit (宝酒造 （株） 製） を用い、 指定された方法にて行なつ た。 平滑末端化後、 リン酸化済み BamHIリンカー （宝酒造 （株） 製） を接続し、 p HK4より Brevi. -ori部分の MA断片を BamHIのみによる切断によって切り出される様 改変した。 このプラスミ ドを BamHIにより切断し、 生じた Brevi. -ori D N A断片 を同じく BamHIにて切断した p399AKY、 p399AK9に接続し、 コリネバクテリウム属細 菌中で自律複製可能でかつ lysC遺伝子を含むプラスミ ドを作製した。
P399AKY由来の野生型 lysC遺伝子を含むプラスミ ドを p399AKYBと命名し、 p399A K9由来の変異型 lysC遺伝子を含むプラスミ ドを p399AK9Bと命名した。 p399AK9B、 P399AKYB構築の過程を図 1に示す。 ブレビバクテリウム · ラク トフアーメンタム 野生株である AJ12036株 （FERM BP-734) に変異型 lysCプラスミ ド p399AK9Bを導入 した株 AJ12691は、 1 9 9 2年 4月 1 0日に通商産業省工業技術院生命工学工業技 術研究所 （郵便番号 3 0 5 日本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号） に受託番号 FERM P- 12918として寄託され、 1 9 9 5年 2月 1 0日にブダぺスト条約に基づく 国際寄託に移管され、 FERM BP- 4999の受託番号で寄託されている。 く 2〉ブレビバクテリゥム . ラク トファーメンタムの野生型 lysC及び変異型 lysC の塩基配列の決定
野生型 lysCを含むプラスミ ド P399AKY及び変異型 lysCを含むブラ スミ ド p399AK 9を各々の形質転換体から調製し、 野生型及び変異型 lysCの塩基配列の決定を行な つた。 塩基配列の決定はサンガーらの方法 （F. Sanger et al ： Proc. Natl. Acad. S ci. 74, 5463( 1977)などがある） によった。
P399AKYにコードされている野生型 lysCの塩基配列を配列表の配列番号 3に示す。 一方、 P399AK9にコードされている変異型 lysCの塩基配列は野生型 lysCと比べ、 配 列番号 3において 1 0 5 1番目の Gが Aに変化しているという 1塩基の変異のみ を有していた。 コリネバクテリゥム 'グルタミカムの lysCは、 同一の D N A鎖に α、 /3の 2本のサブュニッ 卜が同一のリーディングフレームでコードされている ことが知られている力 (Kalinowski, J et al ;Molecular Microbiology(1991)5(5), 1197- 1204参照） 、 相同性から判断して本遺伝子も同一の D N A鎖に α、 /3の 2本 のサブュニッ 卜が同一のリーディングフレームでコードされていると考えられる。
D N Α塩基配列より推定される野生型 Α Κタンパク質の αサブュニッ トのァミ ノ酸配列を D N Α配列と同時に配列表の配列番号 4に、 ァミノ酸配列のみを配列 番号 5に示す。 また、 D N A塩基配列より推定される野生型 A Kタンパク質の 3 サブュニッ 卜のアミノ酸配列を D N Aと同時に配列表の配列番号 6に、 アミノ酸 配列のみを配列番号 7に示す。 尚、 各サブュニッ 卜とも、 開始コドンに G T G力 用いられており、 対応するアミノ酸をメチォニンと表記しているカ 、 これは、 メ チォニン、 パ'リン、 またはフオルミルメチォニンを表すものである。
一方、 変異型 lysC配列上の変異は、 野生型 A Kタンパク質のアミノ酸配列 （配 列番号 5、 7 ) において、 αサブユニッ トでは 2 7 9番目のァラニン残基がスレ ォニン残基に、 3サブュニッ トでは 3 0番目のァラニン残基がスレオニン残基に というアミノ酸残基置換を起こしていることを意味する。 実施例 2 ブレビバクテリウム ·ラク トフアーメンタム dapBの取得
< 1 >dapBの取得及びそれを含有するプラスミ ドの作製
ブレビバクテリゥム · ラク トファ一メンタム野生株 ATCC13869株を染色体 D N A の供与体として用いた。 ATCC13869株より常法に従い、 染色体 DNAを調製した。 染 色体 MAより PCRにより dapBを含む D N A断片を増幅した。 増幅に用いた DNAプライ マーはブレビバクテリゥム · ラク トファーメンタムにおいて既知となっている配 列 (Journal of Bacteriology 175(9), 2743-2749 (1993)参照) を基にして D D P Rをコードする約 2. Okbの領域を増幅すべく、 配列表の配列番号 8及び 9に記載 の塩基配列を有する各々 23merの D N A断片を合成した。 D N Aの合成及び PCR反 応は、 実施例 1と同様にして行った。 増幅された 2 0 0 1 b pの遺伝子断片のク ローン化用ベクターには pCR- Script ( Invitrogen社製） を用い、 増幅した dapB断 片と接続した。 この様にして pCR- Scriptにブレビバクテリウム ·ラク トファーメ ンタム染色体より増幅された dapB断片 2 0 0 1 b pの接続されたプラスミ ドを作 製した。 この様にして取得した ATCC13869由来の dapBを有するプラスミ ドを pCRDA PBと命名した。 E. coliJM109株に pCRDAPBを導入して得られた形質転換株 AJ13107 株は、 1 9 9 5年 5月 2 6日より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 (郵便番号 3 0 5 日本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号） に受託番号 FERM BP -5114の受託番号で、 ブダぺス卜条約に基づき国際寄託されている。
更に、 pCRDAPBを EcoRVと Sphlで切断する事により、 DDPRの構造遺伝子を含む 1 1 0 1 b pの断片を抽出した。 この断片を、 pHSG399を HincI Iおよび Sphlにて切断 したものと連結したプラスミ ドを作成した。 この作成したプラスミ ドを P399DPRと
¾卩^ έした。
作製した P399DPRに Brevi. -oriを導入し、 コリネ型細菌中で自律複製可能な dap Bを搭載したプラスミ ドを作製した。 pHK4を制限酵素 Kpnl (宝酒造 （株） 製） にて 切断し、 切断面を平滑末端化した。 平滑末端化は DM Blunting kit (宝酒造 （株） 製） を用い、 指定された方法にて行なった。 平滑末端化後、 リン酸化済み BamHIリ ンカー （宝酒造 （株） 製） を接続し、 pHK4より Brevi. -ori部分の DM断片を BamHI のみによる切断によって切り出される様改変した。 このプラスミ ドを BamHIにより 切断し、 生じた Brevi. - oriDNA断片を同じく BamHlにて切断した p399DPRに接続し、 コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつ dapBを含むプラスミ ドを作製した。 作製し たプラスミ ドを pDPRBと命名した。 pDPRB構築の過程を図 2に示す。 く 2〉ブレビバクテリウム · ラク トフアーメン夕ム dapBの塩基配列の決定
P399DPRを保持する AJ 13107株からプラスミ ド DNAを調製し、 実施例 1と同様にし て塩基配列の決定を行なつた。 決定した塩基配列及びこの配列から予想されるァ ミノ酸配列を配列番号 1 0に示す。 また、 ァミノ酸配列のみを配列番号 1 1に示 す。 実施例 3 ブレビパクテリゥム 'ラク トフアーメン夕ム dapAの取得
< 1 > dapAの取得及びそれを含有するプラスミ ドの作製
ブレビパクテリゥム 'ラク トファーメンタム野生株 ATCC13869株を染色体 D N A の供与体として用いた。 ATCC13869株より常法に従い、 染色体 DNAを調製した。 染 色体 DNAより PCRにより dapAを含む D N A断片を増幅した。 増幅に用いた MAプライ マーはコリネパ'クテリゥム ·グル夕ミカムにおいて既知となっている配列 （Nucl eic Acids Research 18(21), 6421 ( 1990)、 EMBL accession No. X53993参照） を 基にして D D P Sをコードする約 1. 5kbの領域を増幅すベく、 配列表の配列番号 1 2及び 1 3に記載の塩基配列を有する各々 23merの D N Aを合成した。 D N Aの合 成及び PCR反応は、 実施例 1と同様にして行った。 増幅された 1 4 1 1 b pの遺伝 子断片のクローン化用のベクターには pCRlOOO ( Invitrogen社製； Bio/Technolog y 9， 657-663 ( 1991)参照） を用い、 増幅した dapA断片と接続した。 DNAの接続は DNAライゲ一シヨンキッ ト （宝酒造 （株） 製） を用い、 指定された方法にて行なつ た。 この様にして pCRlOOOにブレビバクテリゥム ·ラク トファーメンタム染色体よ り増幅された dapA断片 1 4 1 1 b pの接続されたプラスミ ドを作製した。 この様 にして取得した ATCC13869由来の dapAを有するプラスミ ドを pCRDAPAと命名した。
E. coliJM109株に pCRMPAを導入して得られた形質転換株 AJ13106株は、 1 9 9 5年 5月 2 6日より通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 3 0 5 日本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号） に受託番号 FERM BP- 5113の受託番 号で、 ブダペスト条約に基づき国際寄託されている。
作製した pCRDAPAに Brevi. - oriを導入し、 コリネ型細菌中で自律複製可能な dap Aを搭載したプラスミ ドを作製した。 pHK4を制限酵素 Kpnl及び BamHI (宝酒造 （株） 製） にて切断し、 切断面を平滑末端化した。 平滑末端化は DM Blunting kit (宝 酒造 （株） 製） を用い、 指定された方法にて行なった。 平滑末端化後、 リン酸化 済み Smalリンカー （宝酒造 （株） 製） を接続し、 pHK4より Brevi. - ori部分の DNA断 片を Smalのみによる切断によって切り出される様改変した。 このプラスミ ドを Sm alにより切断し、 生じた Brevi. -oriDNA断片を同じく Smalにて切断した pCRMPAに 接続し、 コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつ dapAを含むプラスミ ドを作製した。 このプラスミ ドを pDPSBと命名した。 pDPSB (Kmr ) の構築過程を図 3に示す。
< 2 >ブレビバクテリゥム . ラク 卜ファーメンタム dapAの塩基配列の決定
pCRDAPAを保持する AJ 13106株からプラスミ ド DNAを調製し、 実施例 1と同様にし て塩基配列の決定を行なつた。 決定した塩基配列及びこの配列から予想されるァ ミノ酸配列を配列番号 1 4に示す。 また、 ァミノ酸配列のみを配列番号 1 5に示 す。 実施例 4 ブレビバクテリウム 'ラク トフアーメンタム lysAの取得
< 1 > lysAの取得及びそれを含有するプラスミ ドの作製
ブレビバクテリウム · ラク トファ一メンタム野生株 ATCC13869株を染色体 D N A の供与体として用いた。 ATCC13869株より常法に従い、 染色体 DMを調製した。 染 色体 MAより PCRにより、 argS、 lysA及びこれらを含むオペロンのプロモーターを 含む D N A断片を増幅した。 増幅に用いた MAプライマーとしては、 コリネバクテ リゥム ·グル夕ミカムにおいて既知となっている配列 （Molecular Microbiology 4(11), 1819-1830 ( 1990)、 Molecular and General Genetics 212, 112-119 (1 988)参照） を基にしてアルギニル— tRNAシンターゼ及び D D Cをコードする約 3. 6kbの領域を増幅すべく、 配列表の配列番号 1 6及び 1 7に記載の塩基配列を有す る各々 23merの合成 D N Aを用いた。 D N Aの合成及び PCR反応は、 実施例 1と同 様にして行った。 増幅された 3 5 7 9 b pの遺伝子断片のクローン化用のベクタ —には PHSG399を用いた。 pHSG399を制限酵素 Smal (宝酒造（株）製） にて切断し、 増幅された lysAを含む D N A断片と接続した。 この様にして取得した ATCC13869由 来の lysAを有するプラスミ ドを P399LYSAと命名した。
更に、 P399LYSAを Kpnl (宝酒造 (株)製） と BamHI (宝酒造 (株)製） で切断するこ とにより、 lysAを含む D N A断片を抽出した。 この D N A断片を、 pHSG299を Kpn Iと BamHIで切断したものと連結した。 得られたプラスミ ドを p299LYSAと命名した。 P299LYSA構築の過程を図 4に示す。
得られた P299LYSAに Brevi. -oriを導入し、 コリネ型細菌中で自律複製可能な ly sAを搭載したプラスミ ドを作製した。 pHK4を制限酵素 Kpnl及び BamHIで切断し、 切 断面を平滑末端化した。 平滑末端化は DM Blunting kit (宝酒造 （株） 製） を用 い、 指定された方法にて行なった。 平滑末端化後、 リン酸化済み Kpnlリンカー (宝酒造 （株） 製） を接続し、 pHK4より Brevi. -ori部分の DM断片を Kpnlのみによ る切断によって切り出される様改変した。 このプラスミ ドを Kpnlにより切断し、 生じた Brevi. - oriDNA断片を同じく Kpnlにて切断した p299LYSAに接続し、 コリネ型 細菌中で自律複製可能でかつ lysAを含むプラスミ ドを作製した。 作製したプラス ミ ドを pLYSABと命名した。 pLYSAB構築の過程を図 5に示す。
< 2〉ブレビバクテリゥム ·ラク トファーメンタム lysAの塩基配列の決定
P299LYSAのプラスミ ド DNAを調製し、 実施例 1と同様にして塩基配列の決定を行 なつた。 決定した塩基配列及びこの配列がコードすると予想されるァミノ酸配列 を配列番号 1 8に示す。 また、 この塩基配列のうち、 argSがコードするアミノ酸 配列及び lysAがコードするァミノ酸配列を、 各々配列番号 1 9及び 2 0に示す。 実施例 5 ブレビバクテリウム ·ラク トフアーメンタム ddhの取得 ddh遺伝子は、 コリネノくクテリウム グノレ夕ミカム (Corynebacterium glutami cum; の ddh遺伝子の既知のヌクレオチド配列 （Ishino, S. et al. , Nucleic Aci ds Res.， 15, 3917 ( 1987)) をもとに作成した 2種のオリゴヌクレオチドプライ マー （配列番号 21、 22) を用いた P C R法により、 ブレビパクテリゥム ラク ト フアーメンタム ATCC13869 の染色体 D N Aから ddh遺伝子を増幅することによつ て得た。 得られた増幅 D N A断片を EcoT22Iと Avalで切断し、 末端を平滑化した後、 PMW119の Sraal部位に挿入し、 プラスミ ド pDDHを得た。
次に、 pDDHを Sailと EcoRIにて切断し、 平滑末端化した後、 得られた断片を Sma Iで切断した PUC18と連結した。 こうして得られたプラスミ ドを pUC18DDHと命名し た。
PUC18DDHに Brevi. -oriを導入し、 コリネ型細菌中で自律複製可能な ddhを搭載し たプラスミ ドを作製した。 pHK4を制限酵素 Kpnl及び BamHIで切断し、 切断面を平滑 末端化した。 平滑末端化は DNA Blunting kit (宝酒造 （株） 製） を用い、 指定さ れた方法にて行なった。 平滑末端化後、 リン酸化済み Pstlリンカ一（宝酒造 （株） 製） を接続し、 PHSG299の Pstl部位に挿入した。 このようにして作製したプラスミ ドを pPK4と命名した。 次に、 pUC18DDHを Xbalと Kpnlで切断し、 生じた ddh断片を Κ pnlと Xbalで切断した pPK4に接続した。 このようにして、 コリネ型細菌中で自律複 製可能で、 かつ、 ddhを含むプラスミ ドを作製し、 このプラスミ ドを pPK4Dと命名 した。 pPK4D構築の過程を図 6に示す。 実施例 6 変異型 lvsC及び dapAを併せ持つプラスミ ドの作製 dapAを有するプラスミ ド pCRDAPAと変異型 lysC及び Brevi. -oriを有するプラスミ ド P399AK9Bより、 変異型 lysC、 dapAおよびコリネ型細菌の複製起点を有するブラ スミ ドを作製した。 P399AK9Bを Sailにて完全分解した後、 平滑末端化し、 EcoRIリ ンカーを接続する事により Sa 11部位を EcoR I部位に改変したプラスミ ドを作製した c 得られたプラスミ ドを P399AK9BSEと命名した。 p399AK9BSEを EcoRIにて部分分解す ることよって変異型 lysCと Brevi.—oriを一つのフラグメントとして切り出した。 このフラグメン卜を pCRDAPAを EcoRIにて切断したものと連結した。 得られたプラ スミ ドを pCRCABと命名した。 このプラスミ ドは E. coliとコリネ型細菌中で自律増 殖可能で、 かつ宿主にカナマイシン耐性を付与し、 変異型 lysCと dapAを併せ保持 しているプラスミ ドである。 pCRCABの作製過程を図 7に示す。 実施例 7 変異型 lv'sC及び dapBを併せ持つプラスミ ドの作製 変異型 lysCを有するプラスミ ド P399AK9と dapBを有するプラスミ ド p399DPRより、 変異型 lySC、 dapBを含むプラスミ ドを作製した。 P399DPRを EcoRVと Sphlで切断す ることにより、 DDPRの構造遺伝子を含む 1 1 0 1 b pの断片を抽出した。 この断 片を、 P399AK9を Sailで切断した後平滑末端化し、 更に Sphlにて切断したものと結 合し、 変異型 lysCと dapBを併せ持つプラスミ ドを作製した。 このプラスミ ドを p3 99AKDDPRと命名した。
次に、 得られた P399AKDPRに Brevi. - oriを導入した。 Brevi. - oriを含むプラスミ ド pHK4を制限酵素 Kpnl (宝酒造 （株） 製） にて切断し、 切断面を平滑末端化した。 平滑末端化は DNA Blunting kit (宝酒造 （株） 製） を用い、 指定された方法にて 行なった。 平滑末端化後、 リン酸化済み BamHIリンカー （宝酒造 （株） 製） を接続 し、 pHK4より Brevi. -ori部分の DM断片を BaraHIのみによる切断によって切り出さ れる様改変した。 このプラスミ ドを BamHIにより切断し、 生じた Brevi. - oriDNA断 片を同じく BamHIにて切断した P399AKDDPRに接続し、 コリネ型細菌中で自律増殖可 能でかつ変異型 lysCおよび dapBを含むプラスミ ドを作製し、 pCBと命名した。 pCB の構築の過程を図 8に示す。 実施例 8 dapA及び dapBを併せ持つプラスミ ドの作製 dapAを有するプラスミ ド pCRDAPAを Kpnlおよび EcoRIにて切断し、 dapAを含む D N A断片を抽出し、 ベクタープラスミ ド pHSG399を Kpnlおよび EcoRIにて切断した ものと接続した。 得られたプラスミ ドを P399DPSと命名した。
一方、 dapBを有するプラスミ ド pCRMPBを SacI Iおよび EcoRIにて切断し、 D D P Rをコードする領域を含む 2 . 0 k bの D N A断片を抽出し、 SacI Iおよび EcoRI にて切断した P399DPSと接続し、 dapAと dapBを併せ持つプラスミ ドを作製した。 得 られたプラスミ ドを P399ABと命名した。
次に、 P399ABに Brevi. - oriを導入した。 Brevi. - oriを含む pHK4を制限酵素 BamH 1 (宝酒造 （株） 製） にて切断し、 切断面を平滑末端化した。 平滑末端化は DM B hinting kit (宝酒造 （株） 製） を用い、 指定された方法にて行なった。 平滑末端 化後、 リン酸化済み Kpnlリンカー （宝酒造 （株） 製） を接続し、 pHK4より Brevi. -ori部分の DNA断片を Kpnlのみによる切断によって切り出される様改変した。 この プラスミ ドを Kpnlにより切断し、 生じた Brevi. -oriDM断片を同じく Kpnlにて切断 した P399ABに接続し、 コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつ dapAおよび dapBを含 むプラスミ ドを作製し、 pABと命名した。 pABの構築の過程を図 9に示す。 実施例 9 ddh及び lvsAを併せ持つプラスミ ドの作製 ddhを有するプラスミ ド pUC18DDHを EcoRIおよび Xbalにて切断し、 ddhを含む D N A断片を抽出した。 この ddh断片を、 lysAを有するプラスミ ド p399LYSAを BamHIお よび Xbalにて切断した後、 切断面を平滑末端化したものと連結した。 得られたプ ラスミ ドを P399DLと命名した。 p399DL構築の過程を図 1 0に示す。
次に、 P399DLに Brevi. - oriを導入した。 pHK4を Xbalおよび BamHIにて切断し、 切 断面を平滑末端化した。 平滑末端化後、 リン酸化済み Xbalリンカーを接続し、 pH K4より Brevi. -ori部分の DNA断片を Xbalのみによる切断によって切り出される様改 変した。 このプラスミ ドを Xbalにて切断し、 生じた Brevi. - oriDNA断片を同じく X balで切断した p399DLに接続し、 コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつ ddhおよび lysAを含むプラスミ ドを作製し、 pDLと命名した。 pDLの構築の過程を図 1 1に示 す。 実施例 1 0 変異型 lysC、 dapA及び dapBを併せ持つプラスミ ドの作製
P399DPSを EcoRI、 Sphlにて分解し、 平滑末端化した後、 dapA遺伝子断片を抽出 した。 この断片を、 P399AK9を Sai lにて切断し平滑末端化したものとライゲーショ ンし、 変異型 lysCと dapAが共存したプラスミ ド p399CAを構築した。
dapBを有するプラスミ ド pCRDAPBを EcoRIにて切断、 平滑末端化した後、 Saclに て切断し、 dapBを含む 2. 0kbの D N A断片を抽出した。 dapA及び変異型 lysCを有す るプラスミ ド P399CAを Spelにて切断、 平滑末端化した後、 Saclにて切断し、 抽出 した dapB断片と接続し、 変異型 lysC、 dapA及び dapBを含むプラスミ ドを得た。 こ のプラスミ ドを P399CABと命名した。
次に、 P399CABに Brevi. - oriを導入した。 Brevi. -oriを有するプラスミ ド pHK4を 制限酵素 BamHI (宝酒造 （株） 製） にて切断し、 切断面を平滑末端化した。 平滑末 端化は DNA Blunting kit (宝酒造 （株） 製） を用い、 指定された方法にて行なつ た。 平滑末端化後、 リン酸化済み Kpnlリンカー （宝酒造 （株） 製） を接続し、 pH K4より Brevi. -ori部分の MA断片を Kpnlのみによる切断によって切り出される様改 変した。 このプラスミ ドを Kpnlにより切断し、 生じた Brevi. - oriDNA断片を同じく Kpnlにて切断した P399CABに接続し、 コリネ型細菌中で自律増殖可能でかつ変異型 lysC；、 dapAおよび dapBを併せ持つプラスミ ドを作製し、 pCABと命名した。 pCABの 構築の過程を図 1 2に示す。 実施例 1 1 変異型 lvs (：、 dapA, dapB及び lvsAを併せ持つプラスミ ドの作製 lysAを有するプラスミ ド p299LYSAを Kpnl及び BamHIにて切断し、 平滑末端化した 後、 lysA遺伝子断片を抽出した。 この断片を、 pCABを Hpal (宝酒造 （株） 製） に て切断し平滑末端化したものとライゲーションし、 コリネ型細菌中で自律増殖可 能でかつ変異型 lysC、dapA、 dapB、 及び lysAを併せ持つプラスミ ドを作製し、 pCA BLと命名した。 pCABL構築の過程を図 1 3に示す。 尚、 pCABL中で、 lysA遺伝子断 片は dapB遺伝子を含む D N A断片内の Hpal部位に挿入されているが、 この Hpal部 位は、 dapB遺伝子のプロモーターよりも上流 （配列番号 1 0中塩基番号 6 1 1〜 6 1 6 ) に位置しており、 dapB遺伝子は分断されていない。 実施例 1 2 変異型 lvs (：、 dapA、 dapB、 ddh及び lysAを併せ持つプラスミ ドの作製
PHSG299を Xbal及び Kpnlにて切断し、 ddh及び lysAを有するプラスミ ド p399DLを Xbal及び Kpnlで切断したものと連結した。 作製されたプラスミ ドを p299DLと命名 した。 この p299DLを Xbal及び Kpnlで切断し、 平滑末端化した。 平滑末端化後、 dd h及び lysAを含む DNA断片を抽出した。 この DNA断片を、 変異型 lysC：、 dapAおよび d apBを併せ持つプラスミ ド pCABを Hpalにて切断し平滑末端化したものと連結し、 コ リネ型細菌中で自律増殖可能でかつ変異型 lysC、 dapA、 dapB、 lysA及び ddhを併せ 持つプラスミ ドを作製し、 pCABDLと命名した。 pCABDL構築の過程を図 1 4に示す。 実施例 1 3 L—リジン生合成遺伝子を含むプラスミ ドの
ブレビパクテリゥム · ラク トファ一メンタム L —リジン生産菌への導入 上記のようにして作製された L 一リジン生合成遺伝子を有するプラスミ ド p399 AK9B (Cmr ) 、 pDPSB ( Km" ) 、 pDPRB (Cm" ) 、 pLYSAB (Cmr 、 pPK4D (Cm' ) 、 pC RCAB (Kmr) 、 pAB (Cmr) 、 pCB (Cmr) 、 pDL (CnT) 、 pCAB (CnT) 、 pCABL (Cmr) 、 pCABDL (Cmr) をブレビバクテリゥム ·ラク トファーメンタム L—リジン生産菌で ある A J 1 1 082 (NRRL B - 1 1470 ) に導入した。 A J 1 1082 株は、 AE C耐性の性質を有する。 プラスミ ドの導入の方法は、 電気パルス法 (杉本ら、 特開平 2- 207791号公報） によった。 形質転換体の選択は各々のプラス ミ ドが持つ薬剤耐性マーカ一によった。 クロラムフ 二コール耐性遺伝子を有す るプラスミ ドを導入した場合は 5 ^g/mlのクロラムフヱニコールを含む完全培地 にて、 また、 カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミ ドを導入した場合には 2 5 g/mlのカナマイシンを含む完全培地にて形質転換体の選択を行なった。 実施例 14 L一リジンの製造 実施例 13で取得した各形質転換体を L一リジン生産培地にて培養し、 そのし 一リジン生産能を評価した。 L—リジン生産培地の組成は以下に示す通りである。
〔L一リジン生産培地〕
炭酸カルシウム以外の下記成分 （1 L中） を溶解し、 KOHで pH8. 0に調 製し、 1 1 5°Cで 15分殺菌した後、 別に乾熱殺菌した炭酸カルシウムを 50 g 加える。
グルコース 100 g
(NH4) 2S 0 55 g
KH2P 04 1 g
Mg S 0 7H20 1 g
ピオチン 500 β
チアミ ン 2000 ULg
F e S 0 7 H20 0.01
Figure imgf000030_0001
ニコチンァミ ド 5 mg
蛋白質加水分解物 （豆濃） 30 ml
炭酸カルシウム 50 g 上記組成の培地に各種形質転換体及び親株を植菌し、 31.5°Cにて往復振盪培養 を行ったo o。 培養 4 0時間、 Ί 2時間後の L一リジン生成量、 及び 72時間後の生 育 （0D562 )•aを表に示す。 表中、 lysC'は変異型 lysCを表す。 生育は 1 0 1倍希釈 した後、 560nmにて 0 Dを測定することにより定量した。 表 1 培養時間 40、 72時間後の L一リジン蓄積
L -リシ"ン生産量 (g/L) 生育 菌株 Zプラスミ ド 導入遺伝子 40時間後 72時間後 （OD562 /101)
AJ11082 22.0 29.8 0.450
AJ11082/p399AK9B lysC* 16.8 34.5 0.398
AJ11082/pDPSB dapA 18.7 33.8 0.410
AJ11082/pDRB dapB 19.9 29.9 0.445
AJ11082/pLYSAB lysA 19.8 32.5 0.356 ddh 19.0 33.4 0.330 lysC*, dapA 19.7 36.5 0.360 dapA, dapB 19.0 34.8 0.390
Figure imgf000031_0001
lysC*, dapB 23.3 35.0 0.440 ddh, lysA 23.3 31.6 0.440
AJ11082 pCAB lysC*, dapA, dapB 23.0 45.0 0.425
AJ11082 pCABL lysC*, dapA, dapB, lysA 26.2 46.5 0.379
AJ11082 pCABDL lysC*, dapA, dapB, lysA, ddh 26.5 47.0 0.409
以上に示すように、 変異型 lys dapA、 又は dapBの単独の増強では、 培養 72 時間後には L一リジン生産量は親株よりも多いか同等であるが、 40時間後では 親株よりも生産量が少なく、 すなわち短期間培養における L一リジン生産速度は 低下した。 同様に、 変異型 lysC及び dapA、 又は dapA及び dapBを組み合わせて増強 した場合には、 培養 72時間後には L一リジン生産量は親株よりも多いが、 4 0 時間後では親株よりも生産量が少なく、 L-リジン生産速度は低下した。
同様に、 lysAもしくは ddhを単独で増強した場合には、 培養 40時間後には L - リジン生産量は親株よりも多いが、 生育が低下したために長期間培養では親株よ りも生産量が少ぃ結果となった。
これらに対し、 変異型 lysCとともに dapBを増強した株では、 生育が改善され、 短期間培養における L—リジン生産速度を回復させることができた上、 長期間培 養での L—リジン蓄積量も向上した。 さらに、 変異型 lysC、 dapA及び dapBの 3者 が同時に増強された株では、 L一リジン生産性が一層向上された。 また、 さらに lysA、 ddhを順次増強することによって、 段階的に L—リジンの生産速度及び蓄積 量はともに向上した。 尚、 lysA及び ddhのみを組み合わせて増強した場合にも、 親 株に比べて L 一リジン生産速度が向上した。 産業上の利用分野 本発明により、 コリネ型細菌の L一リジン生産能を向上させることができ、 生 育速度も改善される。
コリネ型 Lーリジン生産菌において、 変異型 lysCとともに dapBを増強すること により、 L一リジン生産速度を向上させることができ、 生産性も向上させること ができる。 これらの遺伝子に加え、 dapA、 lysA、 ddhを順次増強することによって, Lーリジン生産速度及び生産性を一層向上させることができる。
配列表
( 1 )一般情報
(i) 出願人： 味の素株式会社
(ii) 発明の名称：
(iii) 配列数：
(iv) 連絡先：
(A)宛名
(B)番地
(C)市
(D)州
(E)国
(F) ZIP：
(V) コンビュ 夕読取り可能形式
(A)媒体：
(B)コンピュータ
(C)操作システム
(D)ソフ トウェア
(vi) 現行出願データ
(A)出願番号
(B)出願日
(C)分類
(viii)代理人 Z事務所情報
(A)名前：
(B)登録番号：
(C)整理番号：
(ix)通信情報
(A)電話番号：
(B)ファクシミ リ番号
(2) 配列番号 1の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 23 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎮
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 D N A (iv) アンチセンス： NO
(xi ) 配列： SEQ ID N0: 1
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTT 23
(2) 配列番号 2の配列の情報：
(i) 配列の性質:
(A) 配列の長さ： 21 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： 他の核酸 合成 D N A
(iv) アンチセンス： YES
(xi) 配列： SEQ ID NO : 2 :
ACGGAATTCA ATCTTACGGC C 21
(2) 配列番号 3の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 1643 base pairs
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： ニ本鎮
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： Genomic DNA
(vi ) 起源：
(A)生物名 ： フ"レビハ"クテリゥム 'ラクトフア-メンタム
(Brevibacterium lactofermentum;
(B)株名 ： ATCC 13869
(xi ) 配列： SEQ ID N0 : 3 :
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 psir base
GCAA CCGGCCG TAAGTTGAA CTTTGA CCTGGA AGAGCCAT TTCGCTGCG TTTCTTT TCCGCCA ACACTGTTGCTCCCGTT ACA TTATGACACATCGCA ¾TGGCA GGTCGTAT CCGTTTG CAACCGGCGCCA GTGCGCAG
CG GGAAGAG AAGCGTCGT TTATAT AAAGTTTACCGCGGC ACCGGACGCTTAA AGGAGGTT
Figure imgf000035_0001
ATCCGTGATTGA TTAG ATGACGGCTGGCAGGATGC ATGAGCACAGCTGC CTCTGTT CGGC
CGAGAA CGTGTCA ACGTCAT CGAATTGATATG AGATC TTGTGT TCCCCTCCGCATCCCTG
CTCGTGGTCATGAA GT CAGATGG CTGGCTCACCCA GGTGTTACGGTCA GGAAGCTCTCTG TTCAGGTTCAATG GATG ACA CC AGGGCCCAAGTG CTTTACGACCGGTC CAAAGTCTGGCC CATT GACACT TCACGCCC TCGTGA¾G CGATGGATGAAAGCCGCC GGACGCCGAT CTGAG
GAATA GATCA AATGACT GGTTTGCAAGCT CTGTGGAACCG ACTCTCAGA CGGCCCACC T GTCTGG¾A TTCGATAA GCCACGAGG TTTTCCGTCGGG GCTGCCAATG GTTC
TGTAT AT CCGGAAG AAGCGCCT TACCGGTGTAAACAGCCGAAAAC GCCCGGC C ACGTAGTAA TATG CGC ¾CTCGT CTTAGTCCCGGC ACTTTGATCGTCTA GGAGGATATTT
TCAAGAGCTGCG CAGTTG CATTCACTTT TGGTT2GAA TACGCTCGATGT GCCACTTCGC
O
-3 o
AATGCAGGAAAA GCTACTTAGC TGGAACTT TTTTCAGA AGCTCGC GAAGAATGCGCGGGC
¾A ¾¾GAA TTTACTCGGA CGTTGACG¾¾ATACG CTGCCCATCGTTG ¾CGCG CCCT
Figure imgf000035_0002
GGTTT TTGTCGTGTGGCGA CACCACTGCA ¾TGTTGG CAGCTGCTT GAACGCT GCGTGAT
GATTGG TT AACTGA TTGTCTGTTCAGGCTTTAATAAAG AAACCCGC T¾CACACi GGACCG
AAA GGACGTGTTGA CGTCAACC GTGAGCATCAC GCATCCG GGTC¾GTGCT CGAGAGGGC
CGCAGATCTTT CACTT¾G TGCTCA GGAAG CTCAGGCCTAGGCTGCCA CGAGCGCCA CCC
CTCCTGATGAGCG TATTTTACATGCTG CTGiiCAC GCTCTCGTCG CGCTAT TGAGTCCCTT
GAACTTTGAGCTAG AACTCGC GCAGTGAATTTC CAGCTCG AA CCCGCCGTGAATGGTATG
ACAAGAAAACAGGTGA TGTCSGTTG CAATGGAG CTGGT CiTCGCTCCGGA CACCACGGAT-
GGCGGTTTGAGAG TGACCTGCTCGGACG ATTAGAAAG TCGCTGAATG CCCCG GACTTGCC AA ¾CTGTTAGATAATCA GCACG CGAGGTG AAAAGGTG CCCGGTCCGC2 ACAGAAATAT- (C) 鎖の数： ニ本鎮
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： Genomic DNA
(vi ) 起源：
(A)生物名 ： フ"レビハ"クテリ1 Η·ラクトフア-メンタム
(Brevibacterium lactofermentum;
(B)株名 ： ATCC 13869
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号： CDS
(B) 存在位置: 217. . 1482
(xi) 配列： SEQ ID NO :4：
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAG GTG GCC CTG GTC GTA CAG 234
Met Ala Leu Val Val Gin
1 5
AAA TAT GGC GGT TCC TCG CTT GAG AGT GCG GAA CGC ATT AGA AAC GTC 282 Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala Glu Arg l ie Arg Asn Val
10 15 20
GCT GAA CGG ATC GTT GCC ACC AAG AAG GCT GGA AAT GAT GTC GTG GTT 330 Ala Glu Arg l ie Val Ala Thr Lys Lys Ala Gly Asn Asp Val Val Val
25 30 35
GTC TGC TCC GCA ATG GGA GAC ACC ACG GAT GAA CTT CTA GAA CTT GCA 378 Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp Glu Leu Leu Glu Leu Ala
40 45 50
GCG GCA GTG AAT CCC GTT CCG CCA GCT CGT GAA ATG GAT ATG CTC CTG 426 Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg Glu Met Asp Met Leu Leu
55 60 65 70 ACT GCT GGT GAG CGT ATT TCT AAC GCT CTC GTC GCC ATG GCT ATT GAG 474 Thr Ala Gly Glu Arg l ie Ser Asn Ala Leu Val Ala Met Ala lie Glu
75 80 85
TCC CTT GGC GCA GAA GCT CAA TCT TTC ACT GGC TCT CAG GCT GGT GTG 522 Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gin Ser Phe Thr Gly Ser Gin Ala Gly Val
90 95 100
CTC ACC ACC GAG CGC CAC GGA AAC GCA CGC ATT GTT GAC GTC ACA CCG 570 Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg lie Val Asp Val Thr Pro
105 110 115
GGT CGT GTG CGT GAA GCA CTC GAT GAG GGC AAG ATC TGC ATT GTT GCT 618 Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly Lys l ie Cys He Val Ala
120 125 130
GGT TTT CAG GGT GTT AAT AAA GAA ACC CGC GAT GTC ACC ACG TTG GGT 666 Gly Phe Gin Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg Asp Val Thr Thr Leu Gly
135 140 145 150
CGT GGT GGT TCT GAC ACC ACT GCA GTT GCG TTG GCA GCT GCT TTG AAC 714 Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala Leu Ala Ala Ala Leu Asn
155 160 165
GCT GAT GTG TGT GAG ATT TAC TCG GAC GTT GAC GGT GTG TAT ACC GCT 762 Ala Asp Val Cys Glu l ie Tyr Ser Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Ala
170 175 180
GAC CCG CGC ATC GTT CCT AAT GCA CAG AAG CTG GAA AAG CTC AGC TTC 810 Asp Pro Arg He Val Pro Asn Ala Gin Lys Leu Glu Lys Leu Ser Phe
185 190 195
GAA GAA ATG CTG GAA CTT GCT GCT GTT GGC TCC AAG ATT TTG GTG CTG 858 Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly Ser Lys l ie Leu Val Leu
200 205 210
CGC AGT GTT GAA TAC GCT CGT GCA TTC AAT GTG CCA CTT CGC GTA CGC 906 Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn Val Pro Leu Arg Val Arg
215 220 225 230 TCG TCT TAT AGT AAT GAT CCC GGC ACT TTG ATT GCC GGC TCT ATG GAG 954 Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu He Ala Gly Ser Met Glu
235 240 245
GAT ATT CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG 1002 Asp l ie Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys
250 255 260
TCC GAA GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG 1050 Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly He Ser Asp Lys Pro Gly Glu
265 270 275
GCT GCC AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC 1098 Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu l ie Asn l ie Asp
280 、 285 290
ATG GTT CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC 1146 Met Val Leu Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp He
295 300 305 310
ACG TTC ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG 1194 Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu l ie Leu
315 320 325
AAG AAG CTT CAG GTT CAG GGC AAC TGG ACC AAT GTG CTT TAC GAC GAC 1242 Lys Lys Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp
330 335 340
CAG GTC GGC AAA GTC TCC CTC GTG GGT GCT GGC ATG AAG TCT CAC CCA 1290 Gin Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro
345 350 355
GGT GTT ACC GCA GAG TTC ATG GAA GCT CTG CGC GAT GTC AAC GTG AAC 1338 Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn
360 365 370
ATC GAA TTG ATT TCC ACC TCT GAG ATC CGC ATT TCC GTG CTG ATC CGT 1386 l ie Glu Leu lie Ser Thr Ser Glu l ie Arg lie Ser Val Leu l ie Arg
375 380 385 390 S6 06 58
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Figure imgf000039_0002
腦 OVO Oil 0V3 0V3 IVO Oil V30 103 VOO 130 IDO IVO 010 XVO IVO WO
- - lISI0/96df/lDd ^£60^96 OW Gly Ser Gin Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100 105 110
He Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115 120 125
Lys l ie Cys He Val Ala Gly Phe Gin Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130 135 140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala 145 150 155 160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu He Tyr Ser Asp Val
165 170 175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg l ie Val Pro Asn Ala Gin Lys
180 185 190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195 200 205
Ser Lys l ie Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210 215 220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu 225 230 235 240 l ie Ala Gly Ser Met Glu Asp l ie Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245 250 255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly l ie
260 265 270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275 280 285
Ala Glu l ie Asn l ie Asp Met Val Leu Gin Asn Val Ser Ser Val Glu
290 295 300
Asp Gly Thr Thr Asp l ie Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg 305 310 315 320
Arg Ala Met Glu l ie Leu Lys Lys Leu Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr
325 330 335 Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340 345 350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355 360 365
Arg Asp Val Asn Val Asn l ie Glu Leu l ie Ser Thr Ser Glu He Arg
370 375 380
l ie Ser Val Leu l ie Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385 390 395 400
Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405 410 415
Ala Gly Thr Gly Arg
420
(2) 配列番号 6の配列の情報：
(i ) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 1643 base pairs
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 二本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： Genomic DNA
(vi ) 起源：
(A)生物名 ： フ"レビハ"クテリウム 'ラクトフア-メンタム
(Brevibacterium lactofermentum)
(B)株名 ： ATCC 13869
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号： CDS
(B) 存在位置: 964. - 1482
(xi) 配列： SEQ ID N0:6 :
TCGCGAAGTA GCACCTGTCA CTTTTGTCTC AAATATTAAA TCGAATATCA ATATACGGTC 60 TGTTTATTGG AACGCATCCC AGTGGCTGAG ACGCATCCGC TAAAGCCCCA GGAACCCTGT 120 GCAGAAAGAA AACACTCCTC TGGCTAGGTA GACACAGTTT ATAAAGGTAG AGTTGAGCGG 180 GTAACTGTCA GCACGTAGAT CGAAAGGTGC ACAAAGGTGG CCCTGGTCGT ACAGAAATAT 240 GGCGGTTCCT CGCTTGAGAG TGCGGAACGC ATTAGAAACG TCGCTGAACG GATCGTTGCC 300 ACCAAGAAGG CTGGAAATGA TGTCGTGGTT GTCTGCTCCG CAATGGGAGA CACCACGGAT 360 GAACTTCTAG AACTTGCAGC GGCAGTGAAT CCCGTTCCGC CAGCTCGTGA AATGGATATG 420 CTCCTGACTG CTGGTGAGCG TATTTCTAAC GCTCTCGTCG CCATGGCTAT TGAGTCCCTT 480 GGCGCAGAAG CTCAATCTTT CACTGGCTCT CAGGCTGGTG TGCTCACCAC CGAGCGCCAC 540 GGAAACGCAC GCATTGTTGA CGTCACACCG GGTCGTGTGC GTGAAGCACT CGATGAGGGC 600 AAGATCTGCA TTGTTGCTGG TTTTCAGGGT GTTAATAAAG AAACCCGCGA TGTCACCACG 660 TTGGGTCGTG GTGGTTCTGA CACCACTGCA GTTGCGTTGG CAGCTGCTTT GAACGCTGAT 720 GTGTGTGAGA TTTACTCGGA CGTTGACGGT GTGTATACCG CTGACCCGCG CATCGTTCCT 780 AATGCACAGA AGCTGGAAAA GCTCAGCTTC GAAGAAATGC TGGAACTTGC TGCTGTTGGC 840 TCCAAGATTT TGGTGCTGCG CAGTGTTGAA TACGCTCGTG CATTCAATGT GCCACTTCGC 900 GTACGCTCGT CTTATAGTAA TGATCCCGGC ACTTTGATTG CCGGCTCTAT GGAGGATATT 960 CCT GTG GAA GAA GCA GTC CTT ACC GGT GTC GCA ACC GAC AAG TCC GAA 1008
Met Glu Glu Ala Val Leu Thr Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu
1 5 10 15
GCC AAA GTA ACC GTT CTG GGT ATT TCC GAT AAG CCA GGC GAG GCT GCC 1056 Ala Lys Val Thr Val Leu Gly l ie Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala
20 25 30
AAG GTT TTC CGT GCG TTG GCT GAT GCA GAA ATC AAC ATT GAC ATG GTT 1104 Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu l ie Asn l ie Asp Met Val
35 40 45
CTG CAG AAC GTC TCC TCT GTG GAA GAC GGC ACC ACC GAC ATC ACG TTC 1152 Leu Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp l ie Thr Phe
50 55 60
ACC TGC CCT CGC GCT GAC GGA CGC CGT GCG ATG GAG ATC TTG AAG AAG 1200 Thr Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu He Leu Lys Lys
65 70 75 ：丄： ON αΐ 53S ： ( Ο
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GSI os i dsy ηχο gjy 9Π naq 〗ΒΛ J9S S-iV 3ΐΙ "TO ュ s d\[ Π9Ί 2681 IVO WO 103 OIV 013010331 IIV 303 OiV 0V013133V 331 IIV Oil
5ZI 021 511
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- -
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1 5 10 15
Lys Val Thr Val Leu Gly l ie Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys
20 25 30
Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp Ala Glu l ie Asn l ie Asp Met Val Leu
35 40 45
Gin Asn Val Ser Ser Val Glu Asp Gly Thr Thr Asp l ie Thr Phe Thr
50 55 60
Cys Pro Arg Ala Asp Gly Arg Arg Ala Met Glu He Leu Lys Lys Leu 65 70 75 80
Gin Val Gin Gly Asn Trp Thr Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gin Val Gly
85 90 95
Lys Val Ser Leu Val Gly Ala Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr
100 105 110
Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu Arg Asp Val Asn Val Asn l ie Glu Leu
115 120 125
l ie Ser Thr Ser Glu l ie Arg l ie Ser Val Leu l ie Arg Glu Asp Asp
130 135 140
Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala Leu His Glu Gin Phe Gin Leu Gly Gly 145 150 155 160
Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr Ala Gly Thr Gly Arg
165 170
(2) 配列番号 8の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 23 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 DNA (iv) アンチセンス： NO
(xi ) 配列： SEQ ID N0:8 :
GGATCCCCAA TCGATACCTG GAA 23
(2) 配列番号 9の配列の情報：
(i ) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 23 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
(iv) アンチセンス： YES
(xi) 配列： SEQ ID NO: 9 :
CGGTTCATCG CCAAGTTTTT CTT 23
(2) 配列番号 10の配列の情報：
(i ) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 2001 base pairs
(B) 配列の型： 核酸
( 鎖の数： 二本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： Genomic DNA
(vi ) 起源：
(A)生物名 ： フ"レビハ、'クテリゥム 'ラクトフ了-メンタム
(Brevibacterium lactofermentum;
(B)株名 ： ATCC 13869
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号： CDS
(B) 存在位置： 730. . 1473
(xi) 配列： SEQ ID NO: 10: o
> o
Figure imgf000046_0001
Oo OO — 1 oo oo CO
OO OO
OO
AAC AACGGCGGC GCAGTGGA TTGCTATCG CGGGGACCG iCTTG CGCTCT G ATCC
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TATCAATGCAAAAC CTGATCAGC CTTGTATTCAA TCGATACAACGAC GGATCCCCTG G Π31 Αΐ9 naq αλχ STH ηχ naq ΪΒΛ
Figure imgf000047_0001
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5S3 OSZ 532
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OZZ 512 012
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SOZ 002 S6T 06Ϊ
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Figure imgf000047_0002
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581 081 511
ΪΒΛ eiv STH ΪΒΛ OJJ an A\ dsy Τ^Λ s HTV ^1 V J^S ^TO "TO 6ΖΪ 319 V30 3V3 110 VOO OIV VOO IVO VIO 30V V30 300 103 331 130 0V3
OAt S91 091
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0^1 S8I 081
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- -
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(2) 配列番号 11の配列の情報：
(i ) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 248 amino acids
(B) 配列の型： アミノ酸
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： 夕ンパク質
(xi ) 配列： SEQ ID NO: 1 1：
Met Gly l ie Lys Val Gly Val Leu Gly Ala Lys Gly Arg Val Gly Gin
1 5 10 15
Thr l ie Val Ala Ala Val Asn Glu Ser Asp Asp Leu Glu Leu Val Ala
20 25 30
Glu l ie Gly Val Asp Asp Asp Leu Ser Leu Leu Val Asp Asn Gly Ala
35 40 45
Glu Val Val Val Asp Phe Thr Thr Pro Asn Ala Val Met Gly Asn Leu
50 55 60
Glu Phe Cys l ie Asn Asn Gly l ie Ser Ala Val Val Gly Thr Thr Gly
65 70 75 80
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ΪΒΛ BIV J3S an HTV 3Md usy 0Jd BIV 3Π ns AIO ΪΒΛ usy dsy
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USlO/96df/lDd 60W96OAV GTCGACGGAT CGCAAATGGC AAC 23
(2) 配列番号 13の配列の情報：
(i ) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 23 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
(iv) アンチセンス： YES
(xi ) 配列： SEQ ID NO: 13 :
GGATCCTTGA GCACCTTGCG CAG 23
(2) 配列番号 14の配列の情報：
(i ) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 1411 base pairs
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 二本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： Genomic DNA
(vi ) 起源：
(A)生物名 ： フ、'レビハ"クテリウム 'ラクトフ了-メンタム
(Brevibacterium lactofermentum)
(B)株名 ： ATCC 13869
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号： CDS
(B) 存在位置： 311. . 1213
(xi ) 配列： SEQ ID NO: 14 :
CTCTCGATAT CGAGAGAGAA GCAGCGCCAC GGTTTTTCGG TGATTTTGAG ATTGAAACTT 60 TGGCAGACGG ATCGCAAATG GCAACAAGCC CGTATGTCAT GGACTTTTAA CGCAAAGCTC 120 m ςει οει
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STH ηΐ0 ΐ^Λ ^ΐθ ^ΜΙ sAq BIV α¾ n9q Αχ J¾ J3S 13« 6^8 3V3 OVO VIO VOO 33V OVV 133 VOV VII 109 VOV 30V OIV I0I3VV0II3
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- 6 -
HSlO/96df/XDd W60t 96 OA ATT TGT CTC TAT GAC ATT CCT GGT CGG TCA GGT ATT CCA ATT GAG TCT 781 l ie Cys Leu Tyr Asp l ie Pro Gly Arg Ser Gly l ie Pro l ie Glu Ser
145 150 155
GAT ACC ATG AGA CGC CTG AGT GAA TTA CCT ACG ATT TTG GCG GTC AAG 829 Asp Thr Met Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr l ie Leu Ala Val Lys
160 165 170
GAC GCC AAG GGT GAC CTC GTT GCA GCC ACG TCA TTG ATC AAA GAA ACG 877 Asp Ala Lys Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu l ie Lys Glu Thr
175 180 185
GGA CTT GCC TGG TAT TCA GGC GAT GAC CCA CTA AAC CTT GTT TGG CTT 925 Gly Leu Ala Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu
190 195 200 205
GCT TTG GGC GGA TCA GGT TTC ATT TCC GTA ATT GGA CAT GCA GCC CCC 973 Ala Leu Gly Gly Ser Gly Phe l ie Ser Val l ie Gly His Ala Ala Pro
210 215 220
ACA GCA TTA CGT GAG TTG TAC ACA AGC TTC GAG GAA GGC GAC CTC GTC 1021 Thr Ala Leu Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val
225 230 235
CGT GCG CGG GAA ATC AAC GCC AAA CTA TCA CCC CTG GTA GCT GCC CAA 1069 Arg Ala Arg Glu He Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gin
240 245 250
GGT CGC TTG GGT GGA GTC AGC TTG GCA AAA GCT GCT CTG CGT CTG CAG 1117 Gly Arg Leu Gly Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gin
255 260 265
GGC ATC AAC GTA GGA GAT CCT CGA CTT CCA ATT ATG GCT CCA AAT GAG 1165 Gly l ie Asn Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro He Met Ala Pro Asn Glu
270 275 280 285
CAG GAA CTT GAG GCT CTC CGA GAA GAC ATG AAA AAA GCT GGA GTT CTA 1213 Gin Glu Leu Glu Ala Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val Leu
290 295 300 TAAATATGAA TGATTCCCGA AATCGCGGCC GGAAGGTTAC CCGCAAGGCG GCCCACCAGA 1273
AGCTGGTCAG GAAAACCATC TGGATACCCC TGTCTTTCAG GCACCAGATG CTTCCTCTAA 1333
CCAGAGCGCT GTAAAAGCTG AGACCGCCGG AAACGACAAT CGGGATGCTG CGCAAGGTGC 1393
TCAAGGATCC CAACATTC 1411
(2) 配列番号 15の配列の情報：
(i ) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 301 amino acids
(B) 配列の型： アミノ酸
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 夕ンパク質
(xi ) 配列： SEQ ID NO: 15 :
Met Ser Thr Gly Leu Thr Ala Lys Thr Gly Val Glu His Phe Gly Thr
1 5 10 15
Val Gly Val Ala Met Val Thr Pro Phe Thr Glu Ser Gly Asp He Asp
20 25 30
l ie Ala Ala Gly Arg Glu Val Ala Ala Tyr Leu Val Asp Lys Gly Leu
35 40 45
Asp Ser Leu Val Leu Ala Gly Thr Thr Gly Glu Ser Pro Thr Thr Thr
50 55 60
Ala Ala Glu Lys Leu Glu Leu Leu Lys Ala Val Arg Glu Glu Val Gly
65 70 75 80
Asp Arg Ala Asn Val l ie Ala Gly Val Gly Thr Asn Asn Thr Arg Thr
85 90 95
Ser Val Glu Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Asp Gly Leu
100 105 110
Leu Val Val Thr Pro Tyr Tyr Ser Lys Pro Ser Gin Glu Gly Leu Leu
115 120 125
Ala His Phe Gly Ala l ie Ala Ala Ala Thr Glu Val Pro He Cys Leu
130 135 140 Tyr Asp l ie Pro Gly Arg Ser Gly l ie Pro l ie Glu Ser Asp Thr Met 145 150 155 160
Arg Arg Leu Ser Glu Leu Pro Thr l ie Leu Ala Val Lys Asp Ala Lys
165 170 175
Gly Asp Leu Val Ala Ala Thr Ser Leu l ie Lys Glu Thr Gly Leu Ala
180 185 190
Trp Tyr Ser Gly Asp Asp Pro Leu Asn Leu Val Trp Leu Ala Leu Gly
195 200 205
Gly Ser Gly Phe l ie Ser Val l ie Gly His Ala Ala Pro Thr Ala Leu
210 215 220
Arg Glu Leu Tyr Thr Ser Phe Glu Glu Gly Asp Leu Val Arg Ala Arg 225 230 235 240
Glu l ie Asn Ala Lys Leu Ser Pro Leu Val Ala Ala Gin Gly Arg Leu
245 250 255
Gly Gly Val Ser Leu Ala Lys Ala Ala Leu Arg Leu Gin Gly l ie Asn
260 265 270
Val Gly Asp Pro Arg Leu Pro l ie Met Ala Pro Asn Glu Gin Glu Leu
275 280 285
Glu Ala Leu Arg Glu Asp Met Lys Lys Ala Gly Val Leu
290 295 300
(2) 配列番号 16の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 23 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
(iv) アンチセンス： NO
(xi) 配列： SEQ ID NO: 16 : GTGGAGCCGA CCATTCCGCG AGG 23
(2) 配列番号 17の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 23 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
(iv) アンチセンス： YES
(xi ) 配列： SEQ ID NO: 17 :
CCAAAACCGC CCTCCACGGC GAA 23
(2) 配列番号 18の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 3579 base pairs
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 二本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： Genomic DNA
(vi) 起源：
(A)生物名 ： フ"レ!: "ハ"クテリウム 'ラクトフ了-メン夕ム
(Brevibacterium lactofermentum)
(B)株名 ： ATCC 13869
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号： CDS
(B) 存在位置： 533. . 2182
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号： CDS
(B) 存在位置： 2188. . 3522 > - ~
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ATTCTTTGGTGTT GCGCTGCGCTC TTCCCAGC GCAAT A TCTACCTGAG GTGGGCATGAGG CG TATGCTGCACATTGAATCACG CGC GAGAATAGTG CGGGATATC AT C AACAGGCCTTG AGCCCACGTT TTGGCAGC ΏΤΑGTGCCT GCTTTCGCCG8 ATGG
AACAAGG CTCGCC CCACCA AAGTATG TATGGAT TGCC AAGCCTGGCCA TCTG ：
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"91 ηΐθ uio jqi BTV BIV OJJ nio na BIV na Βχγ ηχο OJJ STH sAq i02T 丄丄 3 9V0 0V3 33V VOO 333 133 9V0 Oil 130 Oil 930 WO 133 IVO OVV
S02 002 961
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ΠΠ OVO WO V33 00V VOO OVO 009 OVV 000 030 V33 110 IID 331 Oil 130
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5 l 0^1 961 οει
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021 9Π
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616 131 Li Oil OVO 313 OVV 910 OVO 0X1 3V3 331 XIO 3V0丄 V3 331 OVV
Oil SOt 001
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- S9 -
IlSlO/96df/IDd 60fr/96OAV CTG TTC GAG TCC GGT GCG GTG GAC AAG GCC GTG CAG GTG CTG AAG GAC 1351 Leu Phe Glu Ser Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gin Val Leu Lys Asp
260 265 270
AAC GGC AAC CTG TAC GAA AAC GAG GGC GCT TGG TGG CTG CGT TCC ACC 1399 Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser Thr
275 280 285
GAA TTC GGC GAT GAC AAA GAC CGC GTG GTG ATC AAG TCT GAC GGC GAC 1447 Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val Val l ie Lys Ser Asp Gly Asp
290 295 300 305
GCA GCC TAC ATC GCT GGC GAT ATC GCG TAC GTG GCT GAT AAG TTC TCC 1495 Ala Ala Tyr l ie Ala Gly Asp l ie Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe Ser
310 315 320
CGC GGA CAC AAC CTA AAC ATC TAC ATG TTG GGT GCT GAC CAC CAT GGT 1543 Arg Gly His Asn Leu Asn l ie Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His Gly
325 330 335
TAC ATC GCG CGC CTG AAG GCA GCG GCG GCG GCA CTT GGC TAC AAG CCA 1591 Tyr l ie Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lys Pro
340 345 350
GAA GGC GTT GAA GTC CTG ATT GGC CAG ATG GTG AAC CTG CTT CGC GAC 1639 Glu Gly Val Glu Val Leu l ie Gly Gin Met Val Asn Leu Leu Arg Asp
355 360 365
GGC AAG GCA GTG CGT ATG TCC AAG CGT GCA GGC ACC GTG GTC ACC CTA 1687 Gly Lys Ala Val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr Leu
370 375 380 385
GAT GAC CTC GTT GAA GCA ATC GGC ATC GAT GCG GCG CGT TAC TCC CTG 1735 Asp Asp Leu V l Glu Ala l ie Gly He Asp Ala Ala Arg Tyr Ser Leu
390 395 400
ATC CGT TCC TCC GTG GAT TCT TCC CTG GAT ATC GAT CTC GGC CTC TGG 1783 l ie Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp l ie Asp Leu Gly Leu Trp
405 410 415 52 OZ St 01
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92S 0Z9 515
BIV BIV na BIV naq gjy HIV JMI S TH 3 Π OJJ BJV Jqi dsy rnj) dsy
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08 SZ 0
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- A9 -
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591 091 951
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- 85 - llSlO/96Jf/13d 60tV96 OAV m ςεε οεε
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5 2
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08Z S22 022
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8682 UO OVO 301 OVO 013 300 110 013 OVV 013 OVV WO VOO OVV OVV 330
003 561 061
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0612 333 VVV V33 V30 WO Oil VOO 331 100 331 V30 013 331 Oil VOO Oil
- 65 -
HSlO/96df/I3d tZ60t/96 O W CTC TAC GGC TCC GAA TAC GAC GCC CGC GTA GTA TCC CGC TTC GCC GAA 3270 Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu
350 355 360
GGA GAC CCA GTA AGC ACC CGC ATC GTG GGC TCC CAC TGC GAA TCC GGC 3318 Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg l ie Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly
365 370 375
GAT ATC CTG ATC AAC GAT GAA ATC TAC CCA TCT GAC ATC ACC AGC GGC 3366 Asp He Leu l ie Asn Asp Glu l ie Tyr Pro Ser Asp l ie Thr Ser Gly
380 385 390
GAC TTC CTT GCA CTC GCA GCC ACC GGC GCA TAC TGC TAC GCC ATG AGC 3414 Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser
395 400 405
TCC CGC TAC AAC GCC TTC ACA CGG CCC GCC GTC GTG TCC GTC CGC GCT 3462 Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala
410 415 420 425
GGC AGC TCC CGC CTC ATG CTG CGC CGC GAA ACG CTC GAC GAC ATC CTC 3510 Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp l ie Leu
430 435 440
TCA CTA GAG GCA TAACGCTTTT CGACGCCTGA CCCCGCCCTT CACCTTCGCC 3562 Ser Leu Glu Ala
445
GTGGAGGGCG GTTTTGG 3579
(2) 配列番号 19の配列の情報：
(i ) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 550 amino acids
(B) 配列の型： アミノ酸
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： タンパク質
(xi ) 配列： SEQ ID NO: 19 : Met Thr Pro Ala Asp Leu Ala Thr Leu l ie Lys Glu Thr Ala Val Glu
1 5 10 15
Val Leu Thr Ser Arg Glu Leu Asp Thr Ser Val Leu Pro Glu Gin Val
20 25 30
Val Val Glu Arg Pro Arg Asn Pro Glu His Gly Asp Tyr Ala Thr Asn
35 40 45
He Ala Leu Gin Val Ala Lys Lys Val Gly Gin Asn Pro Arg Asp Leu
50 55 60
Ala Thr Trp Leu Ala Glu Ala Leu Ala Ala Asp Asp Ala l ie Asp Ser 65 70 75 80
Ala Glu l ie Ala Gly Pro Gly Phe Leu Asn l ie Arg Leu Ala Ala Ala
85 90 95
Ala Gin Gly Glu l ie Val Ala Lys l ie Leu Ala Gin Gly Glu Thr Phe
100 105 110
Gly Asn Ser Asp His Leu Ser His Leu Asp Val Asn Leu Glu Phe Val
115 120 125
Ser Ala Asn Pro Thr Gly Pro He His Leu Gly Gly Thr Arg Trp Ala
130 135 140
Ala Val Gly Asp Ser Leu Gly Arg Val Leu Glu Ala Ser Gly Ala Lys 145 150 155 160
Val Thr Arg Glu Tyr Tyr Phe Asn Asp His Gly Arg Gin l ie Asp Arg
165 170 175
Phe Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Lys Gly Glu Pro Thr Pro Glu
180 185 190
Asp Gly Tyr Gly Gly Glu Tyr l ie Lys Glu lie Ala Glu Ala l ie Val
195 200 205
Glu Lys His Pro Glu Ala Leu Ala Leu Glu Pro Ala Ala Thr Gin Glu
210 215 220
Leu Phe Arg Ala Glu Gly Val Glu Met Met Phe Glu His l ie Lys Ser 225 230 235 240 Ser Leu His Glu Phe Gly Thr Asp Phe Asp Val Tyr Tyr His Glu Asn
245 250 255
Ser Leu Phe Glu Ser Gly Ala Val Asp Lys Ala Val Gin Val Leu Lys
260 265 270
Asp Asn Gly Asn Leu Tyr Glu Asn Glu Gly Ala Trp Trp Leu Arg Ser
275 280 285
Thr Glu Phe Gly Asp Asp Lys Asp Arg Val Val l ie Lys Ser Asp Gly
290 295 300
Asp Ala Ala Tyr l ie Ala Gly Asp l ie Ala Tyr Val Ala Asp Lys Phe 305 310 315 320
Ser Arg Gly His Asn Leu Asn l ie Tyr Met Leu Gly Ala Asp His His
325 330 335
Gly Tyr He Ala Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Tyr Lys
340 345 350
Pro Glu Gly Val Glu Val Leu l ie Gly Gin Met Val Asn Leu Leu Arg
355 360 365
Asp Gly Lys Ala Val Arg Met Ser Lys Arg Ala Gly Thr Val Val Thr
370 375 380
Leu Asp Asp Leu Val Glu Ala l ie Gly l ie Asp Ala Ala Arg Tyr Ser 385 390 395 400
Leu l ie Arg Ser Ser Val Asp Ser Ser Leu Asp l ie Asp Leu Gly Leu
405 410 415
Trp Glu Ser Gin Ser Ser Asp Asn Pro Val Tyr Tyr Val Gin Tyr Gly
420 425 430
His Ala Arg Leu Cys Ser l ie Ala Arg Lys Ala Glu Thr Leu Gly Val
435 440 445
Thr Glu Glu Gly Ala Asp Leu Ser Leu Leu Thr His Asp Arg Glu Gly
450 455 460
Asp Leu l ie Arg Thr Leu Gly Glu Phe Pro Ala Val Val Lys Ala Ala 465 470 475 480 Ala Asp Leu Arg Glu Pro His Arg l ie Ala Arg Tyr Ala Glu Glu Leu
485 490 495
Ala Gly Thr Phe His Arg Phe Tyr Asp Ser Cys His He Leu Pro Lys
500 505 510
Val Asp Glu Asp Thr Ala Pro lie His Thr Ala Arg Leu Ala Leu Ala
515 520 525
Ala Ala Thr Arg Gin Thr Leu Ala Asn Ala Leu His Leu Val Gly Val
530 535 540
Ser Ala Pro Glu Lys Met
545 550
(2) 配列番号 20の配列の情報：
(i ) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 445 amino acids
(B) 配列の型： アミノ酸
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： 夕ンパク質
(xi ) 配列： SEQ ID NO:20:
Met Ala Thr Val Glu Asn Phe Asn Glu Leu Pro Ala His Val Trp Pro
1 5 10 15
Arg Asn Ala Val Arg Gin Glu Asp Gly Val Val Thr Val Ala Gly Val
20 25 30
Pro Leu Pro Asp Leu Ala Glu Glu Tyr Gly Thr Pro Leu Phe Val Val
35 40 45
Asp Glu Asp Asp Phe Arg Ser Arg Cys Arg Asp Met Ala Thr Ala Phe
50 55 60
Gly Gly Pro Gly Asn Val His Tyr Ala Ser Lys Ala Phe Leu Thr Lys 65 70 75 80
Thr l ie Ala Arg Trp Val Asp Glu Glu Gly Leu Ala Leu Asp l ie Ala
85 90 95 Ser l ie Asn Glu Leu Gly l ie Ala Leu Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ser
100 105 110
Arg l ie Thr Ala His Gly Asn Asn Lys Gly Val Glu Phe Leu Arg Ala
115 120 125
Leu Val Gin Asn Gly Val Gly His Val Val Leu Asp Ser Ala Gin Glu
130 135 140
Leu Glu Leu Leu Asp Tyr Val Ala Ala Gly Glu Gly Lys l ie Gin Asp 145 150 155 160
Val Leu He Arg Val Lys Pro Gly l ie Glu Ala His Thr His Glu Phe
165 170 175 l ie Ala Thr Ser His Glu Asp Gin Lys Phe Gly Phe Ser Leu Ala Ser
180 185 190
Gly Ser Ala Phe Glu Ala Ala Lys Ala Ala Asn Asn Ala Glu Asn Leu
195 200 205
Asn Leu Val Gly Leu His Cys His Val Gly Ser Gin Val Phe Asp Ala
210 215 220
Glu Gly Phe Lys Leu Ala Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Tyr Ser Gin 225 230 235 240 l ie His Ser Glu Leu Gly Val Ala Leu Pro Glu Leu Asp Leu Gly Gly
245 250 255
Gly Tyr Gly l ie Ala Tyr Thr Ala Ala Glu Glu Pro Leu Asn Val Ala
260 265 270
Glu Val Ala Ser Asp Leu Leu Thr Ala Val Gly Lys Met Ala Ala Glu
275 280 285
Leu Gly l ie Asp Ala Pro Thr Val Leu Val Glu Pro Gly Arg Ala l ie
290 295 300
Ala Gly Pro Ser Thr Val Thr l ie Tyr Glu Val Gly Thr Thr Lys Asp 305 310 315 320
Val His Val Asp Asp Asp Lys Thr Arg Arg Tyr lie Ala Val Asp Gly
325 330 335 Gly Met Ser Asp Asn l ie Arg Pro Ala Leu Tyr Gly Ser Glu Tyr Asp
340 345 350
Ala Arg Val Val Ser Arg Phe Ala Glu Gly Asp Pro Val Ser Thr Arg
355 360 365
He Val Gly Ser His Cys Glu Ser Gly Asp l ie Leu l ie Asn Asp Glu
370 375 380
He Tyr Pro Ser Asp He Thr Ser Gly Asp Phe Leu Ala Leu Ala Ala
385 390 395 400
Thr Gly Ala Tyr Cys Tyr Ala Met Ser Ser Arg Tyr Asn Ala Phe Thr
405 410 415
Arg Pro Ala Val Val Ser Val Arg Ala Gly Ser Ser Arg Leu Met Leu
420 425 430
Arg Arg Glu Thr Leu Asp Asp l ie Leu Ser Leu Glu Ala
435 440 445
(2) 配列番号 21の配列の情報：
(i ) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 20 bases
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii) 配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
(iv) アンチセンス： NO
(xi ) 配列： SEQ ID N0:21 :
CATCTAAGTA TGCATCTCGG 20
(2) 配列番号 22の配列の情報：
(i) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 20 bases
(B) 配列の型： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： 他の核酸 合成 DNA
(iv) アンチセンス： YES
(xi ) 配列： SEQ ID N0:22 :
TGCCCCTCGA GCT A A ATT AG 20
(2) 配列番号 23の配列の情報：
(i ) 配列の性質：
(A) 配列の長さ： 1034 base pairs
(B) 配列の型： 核酸
(C) 鎖の数： 二本鎖
(D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類: Genomic DNA
(vi ) 起源：
(A)生物名 ： フ"レビハ"クテリウ ラクトフア-メンタム
(Brevibacterium lactofermentum)
(B)株名 ： ATCC 13869
(ix) 配列の特徴：
(A) 特徴を表す記号： CDS
(B) 存在位置： 61. . 1020
(xi) 配列： SEQ ID NO: 23 :
ATGCATCTCG GTAAGCTCGA CCAGGACAGT GCCACCACAA TTTTGGAGGA TTACAAGAAC 60
ATG ACC AAC ATC CGC GTA GCT ATC GTG GGC TAC GGA AAC CTG GGA CGC 108
Met Thr Asn l ie Arg Val Ala l ie Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg
1 5 10 15
AGC GTC GAA AAG CTT ATT GCC AAG CAG CCC GAC ATG GAC CTT GTA GGA 156
Ser Val Glu Lys Leu He Ala Lys Gin Pro Asp Met Asp Leu Val Gly
20 25 30 ATC TTC TCG CGC CGG GCC ACC CTC GAC ACA AAG ACG CCA GTC TTT GAT 204 He Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp
35 40 45
GTC GCC GAC GTG GAC AAG CAC GCC GAC GAC GTG GAC GTG CTG TTC CTG 252 Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu
50 55 60
TGC ATG GGC TCC GCC ACC GAC ATC CCT GAG CAG GCA CCA AAG TTC GCG 300 Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp l ie Pro Glu Gin Ala Pro Lys Phe Ala
65 70 75 80
CAG TTC GCC TGC ACC GTA GAC ACC TAC GAC AAC CAC CGC GAC ATC CCA 348 Gin Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp l ie Pro
85 90 95
CGC CAC CGC CAG GTC ATG AAC GAA GCC GCC ACC GCA GCC GGC AAC GTT 396 Arg His Arg Gin Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val
100 105 110
GCA CTG GTC TCT ACC GGC TGG GAT CCA GGA ATG TTC TCC ATC AAC CGC 444 Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser l ie Asn Arg
115 120 125
GTC TAC GCA GCG GCA GTC TTA GCC GAC CAC CAG CAG CAC ACC TTC TGG 492 Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gin Gin His Thr Phe Trp
130 135 140
GGC CCA GGT TTG TCA CAG GGC CAC TCC GAT GCT TTG CGA CGC ATC CCT 540 Gly Pro Gly Leu Ser Gin Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg l ie Pro
145 150 155 160
GGC GTT CAA AAG GCA GTC CAG TAC ACC CTC CCA TCC GAA GAC GCC CTG 588 Gly Val Gin Lys Ala Val Gin Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu
165 170 175
GAA AAG GCC CGC CGC GGC GAA GCC GGC GAC CTT ACC GGA AAG CAA ACC 636 Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gin Thr
180 185 190 spioe OUTIDB QZ '■ ^^G9½3i (V)
■ ^ (υ
Figure imgf000070_0001
^Οΐ 0V03 I00VIIIVVI
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008 . Z OQZ
OJd en ΐΒΛ ηΐ0 η3Ί ΐΒΛ ュ 4丄 ^Md ^TV Αχο JSS UIQ AJQ UIO UIQ sAq ZLQ VOO 130 110 WO 313319 ODV 311130 VOO 30V WD 303 0V3 OVO OVV
08Z
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0i2 59Z 092
dsy ojj usy SJV dsy nsq sAq naq 9|i jiA丄 i^e^ ュ LJ丄 usy aqj
U2 IVO VD3 OVV VOO OVO 013 OVV 31331V OVI WO 010 33V OVO 3VV OIL
9S2 0S2 5^2
^ΐθ JMI dsy ΑΐΟ ^MI ail ΐ^Λ STH ^1 ^IQ STH OJJ 9« Αΐθ
828 300 130 3DV OVO 300 33V 30V I1V 019 OVO 300 100 OVO VOO OIV 300
On 962 OSZ
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08丄 30V OVO OVO 331 OVO Oil 33V VOO WO 3V9 3IV Oil OVV 019 WO 310
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Z L VV3 3VI 300 110 Oil 3VI IVO 133 OIV 33V 303 OIV OVO 3VV WO 3XV
S02 96ΐ
3-iV ηΐθ SJH dsy BIV ^iV dsy BIV I¾A ΐ^Λ ^Md SAQ UIO S^V sAq STH 89 333 OVO 3VD IVO 330 930 3V0 330119 310 311 301 WO 303 OVV 3V3
- 89 -
HSlO/96df/lDd ^€60^96 OW (D) トポロジー： 直鎖状
(ii ) 配列の種類： タンパク質
(xi ) 配列： SEQ ID NO: 24:
Met Thr Asn l ie Arg Val Ala l ie Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg
1 5 10 15
Ser Val Glu Lys Leu l ie Ala Lys Gin Pro Asp Met Asp Leu Val Gly
20 25 30
He Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp
35 40 45
Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu
50 55 60
Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp l ie Pro Glu Gin Ala Pro Lys Phe Ala 65 TO 75 80
Gin Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp He Pro
85 90 95
Arg His Arg Gin Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val
100 105 110
Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser l ie Asn Arg
115 120 125
Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gin Gin His Thr Phe Trp
130 135 140
Gly Pro Gly Leu Ser Gin Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg l ie Pro 145 150 155 160
Gly Val Gin Lys Ala Val Gin Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu
165 170 175
Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gin Thr
180 185 190
His Lys Arg Gin Cys Phe Val Val Ala Asp Ala Ala Asp His Glu Arg
195 200 205
Figure imgf000072_0001
Ι^Α dsy 3JV EIV 3U dl dsy dsy ns usy n^g OJJ jas ngq naq ュ A丄
008 Z 06Z
0Jd BTV ΪΒΛ nto na JBA ュ iU 3Md ^TV ^io J3S utg u\ \ sAq
582 082
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992 092 S 3
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582 922
-iqi S H ηΐΟ -I3S dsy 3Md JMI ^TV "10 dsy s\\ sqd usy ΐ^Λ ηΐΟ ΐ^Λ
QZZ 513 OIZ ηΐ9 -ΐΑχ Αΐ9 3Md 丄 dsy OJJ Jqi §JV 3Π dsy usy 9Π
- OA - lISlO/96dr/lDd £60IV96OAV

Claims

請求の範囲
1. Lーリジン及び Lースレオニンによるフィードバック阻害が実質的に解 除されたァスバルトキナーゼをコードする DN A配列、 及びジヒ ドロジピコリン 酸レダクターゼをコ一ドする DN A配列を含み、 コリネ型細菌細胞中で自律増殖 可能な組換え DNA。
2. ジヒ ドロジピコリン酸シンターゼをコ一ドする DNA配列をさらに含む 請求項 1記載の組換え D N A。
3. ジァミノピメリン酸デカルボキシラーゼをコ一ドする DN A配列をさら に含む請求項 2記載の組換え D N A。
4. ジァミノピメ リン酸デヒ ドロゲナーゼをコ一ドする DN A配列をさらに 含む請求項 3記載の組換え D N A。
5. 前記 Lーリジン及び Lースレオニンによるフィードバック阻害が実質的 に解除されたァスパルトキナーゼが、 コリネ型細菌由来のァスパルトキナ一ゼで あり、 αサブュニッ トでは Ν末端から 279番目のァラニン残基がァラニン以外 かつ酸性ァミノ酸以外のァミノ酸残基に、 /3サブュニツ 卜では 30番目のァラニ ン残基がァラニン以外かつ酸性ァミノ酸以外のァミノ酸残基に変化した変異型ァ スパルトキナ一ゼである請求項 1〜 4のいずれか一項に記載の組換え DNA。
6. ジヒ ドロジピコリン酸レダクターゼをコ一ドする D N A配列が、 配列表 配列番号 15に示すァミノ酸配列又はこれと実質的に同一のァミノ酸配列をコ一 ドする請求項 1〜 4のいずれか一項に記載の組換え DNA。
7. ジヒ ドロジピコリン酸シンターゼをコ一ドする DN A配列が、 配列表配 列番号 1 1に示すァミノ酸配列又はこれと実質的に同一のァミノ酸配列をコード する請求項 2記載の組換え D N A。
8. ジアミノビメ リン酸デカルボキシラーゼをコ一ドする DN A配列が、 配 列表配列番号 19に示すアミノ酸配列又はこれと実質的に同一のアミノ酸配列を コードする請求項 3記載の組換え DNA。
9. ジァミノピメ リン酸デヒ ドロゲナーゼをコ一ドする DN A配列が、 配列 表配列番号 24に示すァミノ酸配列又はこれと実質的に同一のァミノ酸配列をコ ードする請求項 4記載の組換え DNA。
10. L—リジン及び Lースレオニンによるフィ一ドバック阻害が実質的に 解除されたァスパルトキナ一ゼを保持し、 さらにジヒドロジピコリン酸レダクタ ーゼをコ一ドする DN A配列が増強されたコリネ型細菌。
1 1. 請求項 1記載の組換え DN Aが導入されたことにより形質転換された 請求項 1 0記載のコリネ型細菌。
12. さらに、 ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードする DN A配列が 増強された請求項 10記載のコリネ型細菌。
13. 請求項 2記載の組換え DNAが導入されたことにより形質転換された 請求項 12記載のコリネ型細菌。
14. さらに、 ジアミノピメ リン酸デカルボキシラーゼをコードする DN A 配列が増強された請求項 12記載のコリネ型細菌。
15. 請求項 3記載の組換え DN Aが導入されたことにより形質転換された 請求項 14記載のコリネ型細菌。
1 6. さらに、 ジアミノピメ リン酸デヒ ドロゲナーゼをコードする DN A配 列が増強された請求項 14記載のコリネ型細菌。
17. 請求項 4記載の組換え DN Aが導入されたことにより形質転換された 請求項 16記載のコリネ型細菌。
18. 請求項 10〜 17のいずれか一項に記載のコリネ型細菌を好適な培地 で培養し、 該培養物中に L一リジンを生産蓄積せしめ、 該培養物から L一リジン を採取することを特徴とする L—リジンの製造法。
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