WO1997029784A1 - Diagnostic agent for angiopathic diseases - Google Patents

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WO1997029784A1
WO1997029784A1 PCT/JP1997/000435 JP9700435W WO9729784A1 WO 1997029784 A1 WO1997029784 A1 WO 1997029784A1 JP 9700435 W JP9700435 W JP 9700435W WO 9729784 A1 WO9729784 A1 WO 9729784A1
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smooth muscle
muscle myosin
monoclonal antibody
solution
antibody
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Tsutomu Iwasaki
Ryozo Nagai
Hirohisa Katoh
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Yamasa Corp
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Yamasa Corp
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Definitions

  • the present invention relates to a diagnostic agent and a kit for a diagnostic agent useful for the diagnosis of dissociative aortic aneurysm (also referred to as aortic dissection) and vasculopathy such as vasculitis by an image diagnostic method.
  • aortic dissection also referred to as aortic dissection
  • vasculopathy such as vasculitis
  • Dissecting aortic aneurysms occur when a part of the intima of the aorta is torn and blood flows into the media through the cleft to cause dissection of the blood vessel wall, causing necrosis of vascular smooth muscle cells, and is severe. It is a disease with chest pain and is a very serious disease with a high fatality rate. Factors that cause these diseases include degeneration and weakening of the media due to arteriosclerosis, cystic medial necrosis of the aorta due to degenerative diseases, and hypertension.
  • vasculitis is caused by collagen diseases, etc., and the lesions often spread to the blood vessels of the whole body, accompanied by the death of vascular smooth muscle cells, disseminated intravascular coagulation (DIC), thrombosis, embolism, etc. Cause severe fatal complications.
  • DIC disseminated intravascular coagulation
  • vascular disorders involving necrosis of vascular smooth muscle cells such as dissociated aortic aneurysms and vasculitis, are serious, and a quick and accurate diagnosis requires prevention and effective treatment of complications. Is necessary for
  • vasculopathy diseases there is no test method specific to these vasculopathy diseases.
  • vascular disorders are diagnosed based on abnormal values of morphological diagnosis using diagnostic imaging tests and various general blood biochemical tests derived from the underlying disease.
  • diagnostic imaging tests There was no choice but to make a presumptive diagnosis, and the diagnosis was extremely difficult.
  • MRI magnetic resonance imaging
  • aortic angiography aortic angiography
  • DSA and aortic angiography are highly invasive and are dangerous tests during the acute phase of the disease.
  • echography, CT, and MRI are low-risk tests even in the acute phase, but these diagnostic imaging tests are generally morphological diagnosis and can distinguish old and old lesions from new acute lesions. Is impossible. In other words, it is not possible to specifically diagnose a lesion site in the acute phase where vascular smooth muscle cell damage has occurred.
  • vasculitis is more difficult than conventional dissecting aortic aneurysms, because vasculitis itself is a disease that does not involve specific morphological changes.
  • the present invention provides a tracer that specifically binds to vascular smooth muscle cells damaged in the acute phase of dissociative aortic aneurysm or vasculitis and enables specific diagnostic imaging of the accurate disease site.
  • the purpose is to develop a formulation. Disclosure of the invention
  • the present inventors have found that smooth muscle myosin, which is a major protein of blood vessels, is capable of dissociating aortic aneurysms, vasculitis and other vascular disorders,
  • the present invention has been found to be useful for diagnostic imaging of the present invention.
  • the present invention provides a diagnostic agent for a vascular disorder comprising a monoclonal antibody against human smooth muscle myosin labeled with a radioisotope or an active fragment thereof.
  • the present invention provides a method for diagnosing a vascular disorder comprising a monoclonal antibody against human smooth muscle myosin or an active fragment thereof, a force-coupled compound comprising a bifunctional chelating agent, and a radioisotope solution. It provides medicinal kits.
  • the present invention also provides a method for diagnosing vasculopathy using the above-mentioned diagnostic agent or kit.
  • Figure 1 shows the standard curve.
  • Figure 2 shows the results of examining cross-reactivity.
  • Figure 3 also of a is shows the results of 1 2 5 I counts per tissue 1 g.
  • Figure 4 shows the results of imaging by autoradiography.
  • Figure 5 shows the distribution of anti-smooth muscle myosin antibody in the rat.
  • Figure 6 shows the results of autoradiographic imaging.o Best mode for carrying out the invention
  • the diagnostic agent of the present invention comprises a monoclonal antibody against human smooth muscle myosin labeled with a radioisotope or an active fragment thereof specifically bound to a disease site of a vascular disorder, thereby forming a disease site. It is used for accurate image diagnosis. Therefore, it is necessary to include at least a radioactively labeled monoclonal antibody against human smooth muscle myosin or an active fragment thereof.
  • the monoclonal antibody used in the present invention is not particularly limited as long as it specifically binds to human smooth muscle myosin, particularly human smooth muscle myosin heavy chain, but has low cross-reactivity with other myosins. It is preferred to use
  • Such a monoclonal antibody can be prepared by appropriately using a known method as shown in Examples described later (for example, “Immunobiochemical Research Method (Seizoku Chemistry Laboratory Course 5)”, Japanese Chemistry, pp. 1-88 (1996), Biochemistry, 27, 3807-3811 (1988), Eur. J. Biochem .. 179, 79-85 (1989), J. Mol. Biol., 198, 143-157 (1987), J. Biol. Chem., 264, 9734-9737 (1989), J. Biol. Chem., 264, 18272-18275 (1989), J. Biol. Cem .. 266 , 3768-3773 (1991), Circulation, 88, 1804-1810 (1993), etc.) o
  • the monoclonal antibody to be used may be the monoclonal antibody itself, or an active fragment may be used.
  • Such an active fragment is not particularly limited as long as it is various fragments such as F (ab ′) 2, Fab ′, and Fab and has the characteristics of the monoclonal antibody of the present invention. By using such an active fragment, it is also possible to shorten the half-life in blood and increase clearance in vivo.
  • the monoclonal antibody and the active fragment thus prepared can be used as a diagnostic agent of the present invention by labeling with a radioisotope.
  • Such a labeling method can be selected from various known methods according to each nuclide and used.
  • a radioisotope such as a chloramine T method or a lactoperoxidase method can be used for antibody or activity.
  • a method of directly labeling the fragment, or a method of covalently bonding a bifunctional chelating agent to an antibody or an active fragment and labeling the force coupling compound with the above-mentioned nuclide, and the like can be mentioned.
  • Examples of the bifunctional chelating agent used herein include: 11-amino-6,17-dihydroquinone 17,10,28,21-tetraoxo27- (N-acetylhydrid oximino) -16, Examples include 11, 17, 22 -tetraazahepanol eicosane (desphenyloxamine), 8-hydroxyquinoline, ethylenediaminetetraacetic acid, diethylenetriaminepenacetic acid (DTPA), and dimerinocyclohexyltetraacetic acid.
  • a commonly used method such as a carbodiimide method, an acid anhydride method, or a daltaraldehyde method may be employed.
  • the diagnostic kit of the present invention comprises preparing a monoclonal antibody or an active fragment thereof against human smooth muscle myosin labeled with a radioisotope, and converting the labeled monoclonal antibody or an active fragment thereof into a vascular disorder.
  • a monoclonal antibody against human smooth muscle myosin labeled with at least a radioisotope or an active fragment thereof which is used to accurately diagnose the disease site by specifically binding to the disease site. Must be able to be prepared.
  • a monoclonal antibody against human smooth muscle myosin or an active fragment thereof and a bifunctional chelate are used.
  • a kit containing a force coupling compound comprising a toning agent and a radioisotope solution.
  • the diagnostic reagent and kit of the present invention include, in addition to the above reagents, a chromatography column for purifying nuclides, a carrier such as a sodium chloride solution and a glucose solution for preparing a dosage form, and other stabilizing agents. Can be combined.
  • the diagnostic agent of the present invention is administered to a human body by intravenous injection. Therefore, the drug of the present invention is used in a form suitable for injection administration by using the above-mentioned carriers and the like.
  • the dose of the drug of the present invention is controlled by the power depending on the type of radioisotope used for labeling, usually 100 ⁇ Ci to 30 mCi, preferably 500 / Ci to 3 mCi.
  • a vascular disorder such as the heart of a patient occurs 1 to 48 hours after administration of the drug of the present invention by autoradiography, a scintillation scanner, a scintillation camera, or the like. This can be done by scanning a site that is believed to be affected, detecting the radioactivity derived from the agent of the present invention, and drawing the image.
  • Human uterine smooth muscle myosin, human aortic smooth muscle myosin, human small intestinal smooth muscle myosin, human platelet myosin and human skeletal muscle myosin were provided by Saga Medical University and Dr. Matsumura.
  • Human cardiac myosin was purified by the method of Yazaki (Cir Res., 36: 208, 1975). After confirming the purity of each type of myosin by SDS-PAGE, the protein was quantified by the Lowry method (J. Biol. Chem., 193: 265-275.1951) using pepsin albumin as a standard substance to determine the concentration.
  • HAT medium 0.1 ⁇ m was added, and every 3-4 days thereafter, half of the medium was replaced with fresh HAT medium.
  • Hypri-Dorma 1 H6 and Ha Ibri-Doma 4E12 was established by the SMHMW 1H6 and SMHMW 1H6 in the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry (address: 1-3-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan). SMHMW4 E12 was deposited internationally on October 13, 1994 under the Bush Treaty, and as a deposit number on October 13, 1999, FERMBP—4 829 And FERMBP — 4830.
  • mice were administered intraperitoneally to mice to which pristane had been previously administered. About 2 weeks later, 5 m_g of ascites was collected per mouse.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • each monoclonal antibody was determined by Western plotting. Human uterine smooth muscle myosin (1 mg / m 2) was treated with the same amount of reduced solution and heat-treated at 100 ° C for 5 minutes. SDS-PAGE was performed using a 10% separation gel and a 5% condensed gel on a mini-gel electrophoresis device (manufactured by Marisol) at 10 mV for about 3 hours. The protein was transferred to the nitrocellulose membrane by applying a current of 37 V for about 18 hours using a plotting device for minigel (manufactured by Marisol). This nitrocellulose membrane was cut into strips along the electrophoresis line of the sample, and a part was stained for proteins using amide black. The remainder was blocked with 3% gelatin and reacted with the culture supernatant of each hybridoma for 1 hour at room temperature.
  • the coloring solution HRP coloring reagent (manufactured by BioRad) 30 mg, methanol 10 m, TBS 50 m, 30% hydrogen peroxide 30% ⁇ ⁇ ) and washed with distilled water.
  • An anti-smooth muscle myosin monoclonal antibody (4E12) was diluted with PBS to 10 g / m £, and divided into 96 ⁇ L plates (H type: Sumitomo Belite) by 50 ⁇ ⁇ each. It was poured and left still at 4 ° C. After washing with PBS containing 0.05% Tween 20 three times, 0.5% skim milk was dispensed at 300 ° C and left at room temperature for 1 hour. The skim milk solution was removed to obtain an immobilized antibody reagent.
  • Human aortic smooth muscle myosin was adjusted to 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.563, 0.781, 0.391 ng / m ⁇ was diluted with 1% BSA-containing PBS.
  • Tween 20 was dissolved in PBS to a concentration of 0.05% (w / v).
  • TMBZ 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMBZ) in 0.3M citrate buffer (pH 3.8), 0.3mM, hydrogen peroxide in water 0.05% (w / w) ).
  • 1 MgZrni anti-smooth muscle myosin monoclonal antibody (9 D 7) A solution 20 and Na '25 I 3. 7MBq were combined and mixed in exactly 30 seconds vortexed further added 0.3% chlorambucil Mi emissions T solution 5 . To this mixed solution, 10% of 0.5% sodium pyrosulfite solution, 5% of 1% potassium iodide solution, and 5% of 1% BSA solution were sequentially added and mixed. The reaction solution was applied to a PD 10 column (manufactured by Pharmacia) equilibrated with 1% BSA solution, eluted with 1% BSA solution, and fractionated in lm. As a result of measuring each fraction with an auto gamma counter, two peaks were observed. The fraction of the first peak was collected and used as a 125 I anti-smooth muscle myosin monoclonal antibody.
  • the count at the damaged portion of the aorta was higher at 4 hours and 48 hours than at the normal portion, and was more significant at 48 hours.
  • a hybridoma that produces a monoclonal antibody specifically reactive with human intestinal smooth muscle myosin in the same manner as in Example 2 (1), using human intestinal smooth muscle myosin instead of human uterine smooth muscle myosin. 8 was established.
  • This hybridoma 8B8 was registered as IMH8B8 at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry (address: 1-3-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan). It was deposited internationally on March 5, 1996 under the strike treaty, and was assigned FERMBP—544444 as a deposit number on March 5, 1996.
  • this monoclonal antibody (8B8) was labeled in the same manner as in Example 4, and an image diagnosis of an aortic injury site in a model experiment using a rat was attempted according to the method described in Example 5. As a result, accumulation of 1 2 5 I match the injury site of the aorta is confirmed, in the imaging, to obtain a clearer image of the contrast than the results when using a monoclonal antibody (9 D 7) did it.
  • Example 7 (Fab conversion of monoclonal antibody)
  • the anti-smooth muscle myosin monoclonal antibody IMH8B8 was adjusted to 2 mgZm with PBS, and EDTA was added to a final concentration of 2 mM.
  • EDTA was added to a final concentration of 2 mM.
  • a macropapine manufactured by Sigma
  • a papain solution 1% by weight of the antibody amount was added to the antibody solution, mixed, and then subjected to an enzyme treatment at 37 ° C for 15 minutes. Enzyme reaction was stopped by adding chloride with a final concentration of 5 mM. 3 M NaC1, 1.5 M glycine buffer in the same volume as the enzyme-treated antibody solution
  • Example 8 (Imaging using 125 I anti-smooth muscle myosin monoclonal Fab antibody) IMH8B8-Fab prepared in Example 7 was labeled with 125 I by the method of Example 4. Using a male rat with a body weight of 300 g, under pentobarbital anesthesia, a force is applied from the femoral artery, and a 0.014 inch spring coil guide wire is inserted into the abdominal aorta. After laparotomy, the abdominal aorta was compressed with forceps, and the guide wire was manipulated to damage the vascular media.
  • the diagnostic agent and the kit for a diagnostic agent of the present invention are useful for vascular disorders such as dissociative aortic aneurysms and vasculitis, particularly in the diagnostic imaging of the acute phase of the disease. Has made it possible for the first time to identify diseased sites.

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Description

明細書 血管障害性疾患用診断薬 技術分野
本発明は、 解離性大動脈瘤 （大動脈解離とも称されている） 、 血管炎等の血管 障害性疾患の画像診断法による診断に有用な診断薬および診断薬用キッ トに関す るものである。 背景技術
解離性大動脈瘤は、 大動脈の内膜の一部が裂け、 その裂孔から中膜に血液が流 入して血管壁の解離を生じ、 血管平滑筋細胞の壊死をひきおこして発症するもの で、 激しい胸痛を伴う疾患であり、 非常に重篤な疾患で致命率が高い。 これらの 疾患の発症要因としては、 動脈硬化による中膜の変性や脆弱化、 変性疾患による 大動脈の囊胞状中膜壊死に加え、 高血圧なども指摘されている。
一方、 血管炎は膠原病などが原因で生ずるか、 その病変はしばしば全身の血管 におよび、 血管平滑筋細胞の壤死を伴って、 D I C (播種性血管内凝固） 、 血栓 症、 塞栓症などの重篤な致命的合併症を引き起こす。
このように、 解離性大動脈瘤や血管炎等の如き血管平滑筋細胞の壊死を伴う血 管障害性疾患は重篤なものが多く、 迅速で正確な診断が合併症の予防や効果的な 治療に必要である。
従来、 これらの血管障害性疾患に特有な検査法はないため、 画像診断検査によ る形態学的診断や原疾患から派生する様々な一般血液生化学検査の異常値から血 管障害性疾患を推測診断するしかなく、 その診断は極めて困難であつた。
力、かる診断法のうち、 たとえば、 解離性大動脈瘤の診断法としては、 他の心疾 患と同様に、 エコー検査、 C T (X線コンピュータートモグラフィー） 、 D S A (デジタル ·サブトラクシヨン -アンギオグラフィ一） 、 MR I (マグネチック • レゾナンス■イメージング） 、 大動脈造影などが用いられている。 このうち、 D S Aや大動脈造影は侵襲が多いため疾患の急性期には危険を伴う検査であり、 一方、 エコー検査、 C T及び MR Iは急性期でも危険の少ない検査であるが、 こ れらの画像診断は総じて形態学的診断であり、 古 、陳旧性病変と新しい急性期の 病変の鑑別は不可能である。 つまり、 血管平滑筋細胞の障害が生じている急性期 の病変部位を特定診断することはできない。
また、 血管炎の診断法については、 血管炎自体が特異的な形態変化を伴わない 疾患であるため、 解離性大動脈瘤以上に従来の画像診断法による診断は困難であ る。
したがって、 本発明は、 解離性大動脈瘤や血管炎の急性期において障害された 血管平滑筋細胞に特異的に結合して、 その正確な疾患部位の特異的画像診断を可 能にするためのトレーサー製剤の開発を目的とするものである。 発明の開示
本発明者らは、 上記目的を達成すべく研究を重ねた結果、 血管の主要なタンパ ク質である平滑筋ミオシンが、 解離性大動脈瘤、 血管炎等の血管障害性疾患、 特 に急性期の画像診断に有用であることを見いだし、 本願発明を完成した。
すなわち、 本発明は、 放射性同位元素で標識されたヒ ト平滑筋ミオシンに対す るモノクローナル抗体またはその活性フラグメントを含有する血管障害性疾患の 診断薬を提供するものである。 また、 本発明は、 ヒト平滑筋ミオシンに対するモ ノクローナル抗体またはその活性フラグメント及び二官能性キレ一ト化剤からな る力ップリング化合物と放^"性同位元素溶液とを含有する血管障害性疾患診断薬 用キッ トを提供するものである。
また、 本発明は、 上記診断薬またはキッ 卜を使用する血管障害性疾患の画像診 断法を提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 標準曲線を示したものである。 図 2は、 交叉反応性を検討した結果を 示したものである。 図 3は、 組織 1 gあたりの1 2 5 Iカウントの結果を示したも のである。 図 4は、 オートラジオグラフィ一によるイメージングの結果を示した ものである。 図 5は、 抗平滑筋ミオシン抗体のラッ ト体内分布を示したものであ る。 図 6は、 ォ一トラジオグラフィーによるイメージングの結果を示したもので ある o 発明を実施するための最良の形態
本発明の診断薬は、 放射性同位元素により標識されたヒ 卜平滑筋ミオシンに対 するモノクローナル抗体またはその活性フラグメン卜を血管障害性疾患の疾患部 位に特異的に結合させることにより、 疾患部位を正確に画像診断するために使用 するものである。 よって、 少なくとも放射性同位元素で標識されたヒト平滑筋ミ ォシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメントを含んでいる必 要がある。
本発明に使用するモノクローナル抗体としては、 ヒト平滑筋ミオシン、 特にヒ ト平滑筋ミオシン重鎖に対して特異的に結合するものであれば特に限定されない が、 他のミオシンに交差反応性が小さいものを使用するのが好ましい。
このようなモノクローナル抗体は、 後述の実施例に示すように公知の方法を適 宜用いることにより調製することができる （例えば、 「免疫生化学研究法 （続生 化学実験講座 5) 」 、 日本生化学編、 1〜8 8頁 （ 1 9 8 6年） 、 Biochemistry, 27, 3807-3811(1988), Eur. J. Biochem..179, 79-85(1989), J.Mol.Biol., 198, 143 - 157(1987)、 J. Biol.Chem.， 264, 9734-9737(1989)、 J. Biol.Chem. , 264, 18272 -18275(1989)、 J. Biol. C em..266, 3768-3773(1991), Circulation, 88, 1804-1810 (1993)等参照) o
使用するモノクローナル抗体は、 モノクローナル抗体そのものでもよいが、 活 性フラグメン トを使用することもできる。 かかる活性フラグメン トとして は、 F (a b' ) 2、 F a b' 、 F a bなどの各種フラグメントで、 本発明のモ ノクローナル抗体の特徴を有するものであれば特に制限されない。 このような活 性フラグメントを使用することで、 血中の半減期を短縮し、 生体内クリアランス を高めることも可能である。
これらの活性フラグメン卜の調製には、 精製モノクロ一ナル抗体に対して パパイン、 ペプシン、 トリプシン処理などの公知の方法を適用することがで きる （ 「免疫生化学研究法 （続生化学実験講座 5) 」 、 日本生化学編、 8 9頁 ( 1 9 8 6年） 参照） 。
このようにして調製されたモノクロ一ナル抗体および活性フラグメン トは、 放 射性同位元素で標識することにより、 本発明の診断薬として使用することができ ここで、 放射性同位元素の核種としては、 ヨウ素一 1 2 5、 ヨウ素一 1 2 3、 ヨウ素一 1 3 1、 インジウム一 1 1 1、 インジウム— 1 1 3 m、 テクネチウム一 9 9 m. ガリウム一 6 7、 鉛一 2 0 3、 ルテニウム— 9 7、 水銀— 1 9 7、 タリ ゥ厶— 2 0 1、 ビスマス一 2 1 2などが挙げられる。
かかる標識化法としては、 種々の公知の方法の中から、 それぞれの核種に応じ て選択して用いることができ、 例えば、 クロラミ ン T法、 ラク トペルォキシダ一 ゼ法など放射性同位元素を抗体または活性フラグメントに直接標識する方法、 あ るいは、 抗体または活性フラグメン卜に二官能基性キレー卜剤を共有結合させ、 この力ップリング化合物を上記核種で標識する方法などが挙げられる。
ここで使用される二官能基性キレート剤としては、 1 一アミノー 6， 1 7—ジ ヒドロキン一 7 , 1 0， 2 8 , 2 1 —テトラオキソー 2 7— （N—ァセチルヒド 口キシィミノ） 一 6， 1 1 , 1 7 , 2 2—テトラァザヘプ夕エイコサン （デスフ エリオキサミン） 、 8—ヒドロキシキノリン、 エチレンジアミンテトラ酢酸、 ジ エチレントリアミンペン夕酢酸 （D T P A) 、 ジ了ミノシクロへキシルテ卜ラ酢 酸などが例示され、 これらと抗体または活性フラグメントとの結合法は、 カルボ ジイ ミ ド法、 酸無水物法、 ダルタルアルデヒド法など通常使用している方法を採 用すればよい。
本発明の診断用キッ トは、 放射性同位元素により標識されたヒト平滑筋ミオシ ンに対するモノクロ一ナル抗体またはその活性フラグメントを調製し、 この標識 されたモノクローナル抗体またはその活性フラグメントを血管障害性疾患の疾患 部位に特異的に結合させることで疾患部位を正確に画像診断するのに使用するた めものであり、 少なくとも放射性同位元素で標識されたヒト平滑筋ミオシンに対 するモノクロ一ナル抗体またはその活性フラグメントを調製できるように構成さ れていなければならない。 その具体的な態様の 1つとしては、 ヒト平滑筋ミオシ ンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメント及び二官能性キレー ト化剤からなる力ップリング化合物と放射性同位元素溶液とを含有するキッ 卜を 挙げることができる。
本発明診断薬およびキッ 卜には、 上記試薬の他、 核種を精製するためのクロマ トグラフィー用カラム、 投与形態に調製するための塩化ナトリゥム溶液やグルコ —ス溶液などの担体、 その他安定化剤などを組合わせることもできる。
また、 本発明診断薬は、 静脈内注射により人体に投与するものである。 従って、 本発明薬剤は、 上述のような担体などを使用することによって、 注射投与に適し た形態で用いられる。 本発明薬剤の投与量は、 標識に使用する放射性同位元素 の各種にもよる力、 通常 1 0 0〃C i〜30mC i、 好ましくは 500 / C i〜 3mC iの範囲で投与される。
本発明薬剤を使用した画像診断の方法は、 本発明薬剤投与後 1〜4 8時間後に、 オートラジオグラフィー、 シンチレーシヨンスキャナー、 シンチレ一ジョンカメ ラなどにより、 患者の心臓部などの血管障害が発生していると思われる部位を走 査して、 本発明薬剤由来の放射能を検出しそれを画像描写することにより行うこ とができる。 実施例
以下、 本発明を実施例をあげて具体的に説明するが、 本発明はこれらによって 何等限定されるものではなし、。
実施例 1 (各種ミオシンの調製）
ヒ ト子宮平滑筋ミオシン、 ヒ ト大動脈平滑筋ミオシン、 ヒ ト小腸平滑筋ミオシ ン、 ヒ ト血小板ミオシン及びヒト骨格筋ミオシンは佐賀医科大学、 松村先生より 分与された。 ヒト心筋ミオシンは矢崎の方法 （Cir Res., 36:208, 1975) により 精製した。 各種ミオシンとも SDS— PAGEにより純度を確認後、 ローリー法 (J.Biol.Chem., 193:265-275.1951) によりゥシ血清アルブミンを標準物質とし てタンパク定量を行 、濃度を求めた。
実施例 2 (モノクローナル抗体の作製）
1) モノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマの作製
ヒト子宮平滑筋ミオシン 25〜50 gをフロインド完全アジュバントと共に、 6〜 8週令の BALBZcマウスに、 2〜4週間おきに 4〜 7回腹腔内に投与し、 最後にヒト子宮平滑筋ミオシン 1 0 gを静脈内投与した。
最終免疫から 3日後にマウスの脾臓を摘出し、 この脾臓細胞とマウス骨髄 腫細胞 P 3 X 63 Ag 8 U. 1 (P 3 U 1 ) (ATCC CRL— 1 5 9 7) を 1 0 : 1で混合後、 遠心分離して得たぺレッ トに、 50 %ポリエチレング'リコー ル含有 RPM I 1 6 4 0溶液 1 m を徐々に加えて細胞融合を行った。 さらに RPM I 1 64 0培地を加えて 1 0 m とし、 遠心分離して得たぺレッ トを 1 0 %ゥシ胎児血清 （FCS) 含有 RPM I 1 6 4 0培地に P 3 U 1 として 3 x 1 04 個 1 m£となるように懸濁させ、 96ウェルマイク口プレー トに各 ゥエル 0. l m ずつ分注した。
1日後、 HAT培地を 0. l m 添加し、 その後 3〜4日おきに培地の半分量 を新しい H A T培地で交換した。
融合後？〜 1 0日目に培養上清をサンプリングし、 あらかじめヒト子宮平滑筋 ミオシンでコートし、 3 %ゼラチンでブロッキングしてある 9 6ゥエルポリ塩化 ビニル （PVC) プレートに 50〃£添加し室温で 1時間反応させた。 PBSで 3回洗浄後、 ピオチン化ゥマ抗マウス I gG (ベクター社製） を 1 %ゥシ血清ァ ルブミン （BSA) 含有 PBSで 1 / 500に希釈した溶液を、 50〃 ずつ分 注し室温で 1時間静置した。 PBSで 3回洗浄後、 ペルォキシダーゼ一アビジン D (ベクター社製） を 1 %BS A含有 PBSで 1 /2000に希釈した溶液を、 50 £ずつ分注し室温で 1 5分間静置した。 PBSで 3回洗浄後、 基質溶液
( 4ーァミノアンチピリン， 0. 25mgZm 、 フエノール， 0. 25mgZ m , 0. 4 M過酸化水素） 200 を加え室温で発色させた。 マイクロプレ 一トフォ トメ一夕一を用いて 550 nmにおける吸光度を測定し、 ヒ ト子宮平滑 筋ミオシンに特異的に反応するモノクロ一ナル抗体産生ハイブリ ド-マを選択し た。
このようにして選択した各ハイブリ ド -マは限界希釈法によりクローニングを 行いヒ ト子宮平滑筋ミオシンに対する抗体産生ハイプリ ド—マ 5株 ( 1 H6, 4 E 1 2, 9 A 1 2, 9D 7, 1 0 G 2 ) を樹立した。 特異抗体陽性ゥヱル数、 増 殖ゥ Xル数及び全ゥヱル数を表 1に示す。 この中で、 ハイプリ ドーマ 1 H 6とハ イブリ ドーマ 4 E 1 2は、 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （あて 名 ； 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 ) ) に SMHMW 1 H 6および SMHMW4 E 1 2としてブ夕ぺスト条約に基づき 1 9 9 4年 1 0月 1 3日に国際寄託され、 1 9 9 4年 1 0月 1 3日付けで受託番号とし て FERMBP— 4 8 29および FERMBP— 4 8 30が付与されている。
表 1 特異抗体陽性ゥェル数/増殖ゥェル数 z全ゥェル数
1 1 6 5 3 94 0
2 ) モノクロ -ナル抗体の調製及び精製
次に、 樹立した各ハイプリ ドーマを培養し、 あらかじめプリスタンを投与して あるマウスの腹腔内に 1匹当り 3 X 1 06個を投与した。 約 2週間後マウス 1匹 当り 5 m _gの腹水を採取した。
3 M塩化ナトリゥム含有 1. 5 Mダリシン塩酸緩衝液及び等量の同グリシン塩 酸緩衝液と混合した腹水を P H 8. 9にて平衡化したプロティン Aセファロース CL- 4 B (フアルマシア社製） カラムに流した。 充分量の同グリシン塩酸緩衝 液で洗浄後、 0. 1 Mクェン酸緩衝液 （pH6. 0) にて抗体を溶出した。 溶出 液を P B Sにて透析後、 SDS -ポリアクリアミ ドゲル電気泳動 （SDS - PAGE) にて純度を確認し、 精製モノクローナル抗体とした。
実施例 3 (モノクローナル抗体の性質）
1 ) アイソ夕イブ
ヒト子宮平滑筋ミオシンをコー卜し、 3%ゼラチンでブロッキング処理してあ る 9 6ゥエル PVCプレートに各ハイプリ ドーマの培養上清を添加し、 Mon o Ab— I D E I Aキッ ト （ザィメッ ド社製） を用いて抗体のアイソタイプの検 索を行った。 結果を表 2に示す。
表 2 ハイブリ ドーマ 1H6 4E12 9A12 9D7 10G2 アイソタイプ IgGl/ IgGl/ κ IgGl/ κ IgGl/ κ 2) ウエスタンブロッテイ ングによる特異性の解析
各モノクローナル抗体の特異性をウエスタンプロッティングにより解折した。 ヒト子宮平滑筋ミオシン 1 mg/m を同量の還元処理液を加えて 1 0 0°Cで 5分間加熱処理した。 SDS— PAGEは、 1 0%分離ゲル、 5 %濃縮ゲルを用 い、 ミニゲル電気泳動装置 （マリソル社製） で 1 0mV、 約 3時間、 を行った。 プロッティ ングはミニゲル用プロッティ ング装置 （マリ ソル社製） を用い、 3 7 Vで約 1 8時間通電してニトロセルロース膜にタンパク質を転写させた。 この二 トロセルロース膜を試料の泳動ラインに沿って短冊状に切断し、 一部はアミ ドブ ラックを用いてタンパク質を染色した。 残りは 3 %ゼラチンでプロッキング後、 各ハイプリ ドーマの培養上清と室温で 1時間反応させた。
0. 0 5 %ツイーン 2 0含有 2 0 mM卜 リス、 5 0 0 mMN a C し ρ Η 7. 5緩衝液 （T— TBS) で 1 0分ずつ 2回洗浄後、 ピオチン化ゥマ抗マウス I gG (ベクタ一社製） の 1 / 5 0 0希釈液と室温で 1時間反応させた。 T — TBSで 1 0分ずつ 2回洗浄後、 ペルォキシダーゼ—アビジン D (ベクタ一社 製） の 1 Z 2 0 0 0希釈液と室温で 1 5分間反応させた。 T— TBSで 1 0分ず つ 2回洗浄後、 発色液 （HRP発色試薬 （バイオラッ ド社製） 3 0mg、 メ夕ノ —ル 1 0m 、 TBS 5 0m 、 3 0 %過酸化水素水 3 0 ζ ^含有） にて発色後、 蒸留水で洗浄した。
アミ ドブラックによるタンパク染色の結果、 20 0 Κ (子宮平滑筋ミオシン重 鎖） 、 1 4 0Κ (子宮平滑筋ミオシン重鎖のフラグメント） 、 70 Κ (子宮平滑 筋ミオシン重鎖のフラグメント） 、 20Κ (子宮平滑筋ミオシン軽鎖） 、 1 7K
(子宮平滑筋ミオシン柽鎖） 5本のバンドがみられた。 いずれの抗体もヒト子宮 平滑筋ミォシン重鎖に反応し、 軽鎖には反応しないことが確認された。
3 ) サンドィッチ法を利用した交叉反応性の解析
①ビォチン化抗体の調製
上記各モノクロ—ナル抗体を 0. 1 IV [炭酸水素ナトリゥム溶液に透析後、 セン トリフロー （アミコン製） により 2mgZm^まで濃縮した。 ピオチン （ロング アーム） NHS試薬 （ベクタ一社製） を 1 OmgZm になるようにジメチルフ オル厶アミ ドに溶解し、 その 20〃 と上記抗体溶液 Ι ΙΏ を混合し、 室温で 2 時間反応させた。 エタノールァミン 5 を加え反応を止めた後、 P B Sに 2回 透析し、 ピオチン化抗体を得た。 このピオチン化抗体を 1 %BS A含有 P BSで に希釈し、 ピオチン化抗体溶液を得た。
②固相化抗体の調製
抗平滑筋ミオシンモノクロ一ナル抗体 （4 E 1 2) を PBSで 1 0 g/m£ に希釈し、 9 6ゥエルプレ一ト （Hタイプ：住友べ一クライト社製） に 5 0〃 ^ ずつ分注し、 4 °Cでー晚静置した。 0. 0 5%Twe e n 20含有 PBSで 3回 洗浄後、 0. 5%スキムミルクを 30 0〃 ずつ分注し、 室温で 1時間静置した。 スキムミルク溶液を除去し、 固相化抗体試薬を得た。
③その他の試薬の調製およびキッ トの調製
•平滑筋ミオシン標準液；
ヒ ト大動脈平滑筋ミオシンを 2 5、 1 2. 5、 6. 2 5、 3. 1 2 5、 1. 5 6 3、 0. 7 8 1、 0. 3 9 1 n g/m ^となるように 1 % B S A含 有 PBSで希釈して調製した。
•洗浄液；
Twe e n 20を PBSに 0. 0 5% (w/v) になるように溶解させて調製 した。
•酵素標識アビジン溶液；
ペルォキシダーゼ標識ァビジン D ( A - 2 0 0 4 ： べクター社製） を 1 % 83 含有 83で 1 5 0 0 0に希釈して調製した。
•基質溶液；
0. 2Mクェン酸緩衝液 （pH3. 8) に 3， 3' , 5, 5' ーテトラメチル ベンチジン二塩酸塩 （TMBZ) が 0. 3mM、 過酸化水素水が 0. 0 0 5 % (w/w) になるように溶解させて調製した。
•酵素反応停止液；
1 N硫酸を用いる。
④標準曲線
固相化抗体試薬の各ゥヱルに 1 %83八含有？83を 1 0 0 £ずつ分注後、 平滑筋ミオシン標準液を 5 0 ずつ分注し 拌後、 室温で 4時間静置した。 洗 浄液で 3回洗浄後、 ビォチン化抗体 （ 1 H 6 ) 溶液を 50 ずつ分注し、 室温 で 30分間静置した。 洗浄液で 3回洗浄後、 酵素標識アビジン溶液を 50 ^ず つ分注し、 室温で 1 5分間静置した。 洗浄液で 3回洗浄後、 基質溶液を 1 00 〃 ずつ分注し、 室温で 1 0分間静置して発色させた。 酵素反応停止液を 1 00 ずつ加えて反応を停止させ、 マイクロプレー 卜フォ トメ一夕一を用いて 450 nmにおける吸光度を则定した。 得られた標準曲線を図 1に示す。
⑤交叉反応性
上記④の操作法に準じ、 各種ミオシンとの交叉反応性を検討した。 その結果、 図 2に示すように、 子宮平滑筋ミオシンおよび大動脈平滑筋ミオシンとは同等に 反応するが、 骨格筋ミオシン、 心筋ミオシンおよび血小板ミオシン （非筋型ミオ シン） とはほとんど反応しないことが確認された。
実施例 4 (モノクローナル抗体の標識化）
1 mgZrniの抗平滑筋ミオシンモノクローナル抗体 （ 9 D 7 )溶液 20 と Na'25 I 3. 7MBqを混合し、 さらに 0. 3 %クロラ ミ ン T溶液 5 を加えて正確に 30秒間ボルテックスで混合した。 この混合液に 0. 5%ピロ亜 硫酸ナトリウム溶液 1 0〃 、 1 %ヨウ化カリウム溶液 5 ^、 1 %BSA溶液 5〃 を順次加え混合した。 反応液を 1 %BSA溶液で平衡化してある PD 1 0 カラム （フアルマシア社製） にかけ、 1 %BSA溶液で溶出し、 lm ずつ分取 した。 各フラクションをオートガンマカウンターで測定した結果、 2つのピーク がみられたため、 最初のピークのフラクションを集めて125 I抗平滑筋ミオシン モノクローナル抗体とした。
実施例 5 (125 I抗平滑筋ミオシンモノクローナル抗体による画像診断）
体重 300 gの雄のラッ トを用いて、 ペントバルビタール麻酔下に大腿動脈よ り力二ユレ一シヨンを行い、 0. 014インチのスプリ ングコイルガイ ドワイヤ ― (spring coil guide wire) を腹部大動脈にまで挿入するとともに、 開腹して 腹部大動脈を鉗子により圧迫し、 ガイドワイヤーを操作することにより血管中膜 にまで損傷を加えた。 直ちに、 125 I標識抗平滑筋モノクローナル抗体 1. 23 MB qを大腿静脈より静注し、 創部を縫合した。
4時間後及び 48時間後に屠殺して、 各臓器を摘出し、 組織 1 g当たりの 1 2 5 Iのカウン卜を比較するとともに、 ォー卜ラジオグラフィ一によるイメージ ングを行った。
その結果、 図 3に示すように大動脈の損傷部のカウン卜は正常部に比べて 4時 間後、 4 8時間後ともに高値で、 4 8時間後においてはより顕著であった。
また、 図 4に示すように、 ォ一トラジオグラフィーでは、 損傷部に一致して 1 2 5 Iの集積が認められた。
実施例 6
ヒ卜子宮平滑筋ミオシンの代わりにヒト小腸平滑筋ミオシンを用い、 実施例 2 の 1 ) と同様の方法でヒト小腸平滑筋ミオシンに特異的に反応するモノクローナ ル抗体を産生するハイブリ ドーマ 8 B 8を樹立した。 このハイブリ ドーマ 8 B 8 は通産省工業技術院生命工学工業技術研究所 （あて名 ： 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 ) ) に I MH 8 B 8としてブ夕ぺスト条約に基 づき 1 9 9 6年 3月 5日に国際寄託され、 1 9 9 6年 3月 5日付けで受託番号と して F E R M B P— 5 4 4 4が付与されている。
このハイプリ ドーマから産生されるモノクローナル抗体を実施例 2の 2 ) と同 様の方法で精製後、 モノクローナル抗体の諸性質を実施例 3に記載の方法と同様 の方法を用いて調べた。 その結果を以下に示す。
I g G b /
②反応特異性 平滑筋重鎖と反応し、 軽鎖とは反応しない
③交叉反応性 小腸平滑筋ミオシン、 子宮平滑筋ミオシンおよび大動脈平滑 筋ミオシンとは反応するか、 骨格筋ミオシン、 心筋ミオシン 及び血小板ミオシン （非筋型ミオシン） とは反応しない ④種特異性 ： ヒ ト平滑筋ミオシンのみならずラッ ト平滑筋ミオシンにも反 応ずる
次に、 このモノクローナル抗体 （8 B 8 ) を実施例 4と同様の方法で標識化し、 実施例 5に記載の方法に従ってラッ トを用いたモデル実験における大動脈損傷部 位の画像診断を試みた。 その結果、 大動脈の損傷部位に一致して1 2 5 Iの集積が 確認され、 イメージングにおいては、 モノクローナル抗体 （ 9 D 7 ) を用いた時 の結果よりもよりコントラストのはっきりした画像を得ることができた。 実施例 7 (モノクローナル抗体の F a b化）
抗平滑筋ミオシンモノクロ一ナル抗体 IMH8 B 8を PBSで 2mgZm に 調製後、 EDTAを終濃度が 2mMになるように添加した。 マ一キュリーパパイ ン （シグマ製） を 5mMシスティン、 2mM E D T A含有 P B Sで 1 m g/ m に調製後、 37てで 30分間プレインキュベーションした。 抗体量の 1 %重 量のパパイン溶液を抗体溶液に加え混合後、 37°Cで 15分間、 酵素処理した。 ョ一ドアセトアミ ドを終濃度が 5 mMになるように添加し酵素反応を止めた。 酵 素処理した抗体溶液と同量の 3 M N a C 1 , 1. 5 Mグリ シンバッファー
(pH 8. 9) と混合し、 同バッファ一で平衡化してあるプロテイン Aセファロ ース カラム （フアルマシア製） にかけ抗体溶液中の F cを吸着させた。 溶出液 を限外濾過により濃縮し、 PBSに透析後、 Fabの純度を SDS - PAGEに て確 Ϊ忍した。
実施例 8 (125 I抗平滑筋ミオシンモノクローナル Fab抗体による画像診断） 実施例 7で作製した I MH 8 B 8— F a bを、 実施例 4の方法により125 I標 識した。 体重 300 gの雄のラッ トを用いて、 ペントバルビタール麻酔下に大腿 動脈より力二ユ レ一シヨ ンを行い、 0. 0 1 4インチの spring coil guide wireを腹部大動脈にまで挿入するとともに、 開腹して腹部大動脈を鉗子により圧 迫し、 guide wireを操作することにより血管中膜にまで損傷を加えた。 直ちに 125 I標識 IMH8 B 8 - F a b抗体 1. 23 MB qを大腿静脈より静注し、 創 部を縫合した。 1時間後及び 6時間後に屠殺して、 各臓器を摘出し、 組織 1 g当 たりの" 5 Iのカウン卜を比較するとともに、 オートラジオグラフィ一によるィ メ一ジングを fi1つた。
その結果、 実施例 6の1251標識 IMH8B8 - I gG抗体を用いた場合に比 ベ、 血中の半減期が著しく改善され、 静注後 6時間で、 血中のカウン トが大動脈 の損傷部のカウントを下回ることが示された （図 5)。 また、 ォートラジオグ ラフィ一では実施例 6と同様に損傷部に一致して125 Iの集積が認められた （図 6) 産業上の利用可能性 放射性同位元素により標識されたヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル 抗体またはその活性フラグメントを血管障害性疾患の疾患部位に特異的に結合、 集積することにより、 その正確な疾患部位の特異的な画像診断を行えることは、 本願発明者らによつて初めて見いだされたことである。
従って、 本願発明の診断薬および診断薬用キッ トは、 解離性大動脈瘤、 血管炎 等の血管障害性疾患、 特に該疾患の急性期の画像診断に有用なものであり、 これ らを使用することにより、 疾患部位の特定が初めて可能となつた。

Claims

請 求 の 範 囲 放射性同位元素で標識されたヒト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗 体またはその活性フラグメントを含有する血管障害性疾患用診断薬。
血管障害性疾患が解離性大動脈瘤または血管炎である請求項 1記載の診断 薬。
ヒ ト平滑筋ミオシンに対するモノクローナル抗体またはその活性フラグメン ト及ぴ二官能性キレート化剤とからなるカツプリング化合物と放射性同位元 素溶液とを含有する血管障害性疾患診断薬用キッ ト。
血管障害性疾患が解離性大動脈瘤または血管炎である請求項 3記載のキッ 請求項 1または 2記載の診断薬または請求項 3または 4記載のキッ 卜を使用 することを特徴とする血管障害性疾患の画像診断法。
血管障害性疾患における疾患部位を特定するためのものである請求項 5記載 の診断法。
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