WO1997032995A1 - Verfahren und test-kit für den nicht-radioaktiven und enzymatischen nachweis von reverser transkriptase - Google Patents
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Definitions
- virus-specific antibodies and / or virus components e.g. anti-HIV antibody tests, HIV-p24 antigen tests, HIV-PCR detection test (Holodniy M. et al. J. Infect. Dis. 163, 862-866, 1991; Henrard DR et al. AIDS Res. Hum Retrovir. 8, 47-52, 1992).
- virus-specific antibodies and / or virus components e.g. anti-HIV antibody tests, HIV-p24 antigen tests, HIV-PCR detection test (Holodniy M. et al. J. Infect. Dis. 163, 862-866, 1991; Henrard DR et al. AIDS Res. Hum Retrovir. 8, 47-52, 1992).
- This analysis is based only on a non-functional or structure-specific molecular interaction between antibody and antigen or PCR primer and proviral DNA and therefore does not allow conclusions to be drawn about a whole and functional intact virus.
- Reverse transcriptase is the key enzyme of all retroviruses. Since it causes the reverse transcription (translation) of the viral RNA into complementary DNA (cDNA) and its subsequent integration into the genome of the host cell.
- the enzyme is specifically retroviruses and its enzyme activity is an indication of the existence of virus particles and their functional integrity, since the enzyme as a free molecule is very unstable and quickly becomes inactive.
- the present and patent pending method describes the routine direct and enzymatic detection of retroviruses using reverse transcriptase.
- the method to be patented and the corresponding test kit are based on the use for the reverse transcription reaction of a primer and templates immobilized on magnetic particles in the form of a particle primer / template complex (PPT complex) and the labeling of those on the PPT -Complex newly synthesized cDNA with biotinylated-deoxy nucleotide triphosphates in the form of a PPT-cDNA complex and its detection with streptavidin-linked marker enzymes and impressive substrates in the form of a PPT-cDNA conjugate complex (see Fig. 2).
- PPT complex particle primer / template complex
- Magnetic particles and ligand complexes immobilized on them have the advantage that they can be separated from solid phase solutions in the presence of a magnetic field and can be redispersed in solution in the absence of magnetic fields or with shaking (see Fig. 1).
- This simple, very fast, efficient and reproducible physical process can be used in immobilization of molecules on magnetic particles in biological tests to process these molecules and to separate (immobilize) or disperse (solubilize) as required.
- This alternating magnetic handling (Fig. 1) is particularly advantageous in enzymatic or biochemical reactions where reaction starting materials (substrates) from products have to be separated in part.
- the magnetic handling of particle-ligand complexes in solution is realized by the successive introduction and removal of magnets in the vicinity of the reaction vessel or the solution, whereby the successive separation and dispersion of the complexes or change of solutions, washing reaction stop etc. is realized can be (Fig. 1).
- a so-called microtiter-magnet separator (Fig. 3) consisting of an optically transparent Haiter plate with 24 rod magnets is used for the magnetic handling, which are inserted into the external space between the microtiter wells and thus separate the particle-ligand complexes in solution on the side walls of the wells (Fig. l).
- Primer can be a homo- or hetero-oligo-deoxynucleotide triphosphate (e.g. oligo-dT, oligo-dG), while as a template (matrix RNA molecule), a homo- or hetero-polymeric RNA, e.g. poly-rA ( poly-adenosine triphosphate) can be used.
- particles, primer and template form the so-called particle primer / tempiate complex / reagent (PPT reagent).
- PPT reagent in the presence of reverse transcriptase and biotin-labeled and unlabeled deoxy-nucleotide triphosphates dNTP's the corresponding cDNA is synthesized complementarily to the template RNA, which is also immobilized on the magnetic particles by means of the template primer and forms the so-called PPT : cDNA complex.
- biotinylated PPT-cDNA complex is incubated with streptavidin-conjugated marker enzymes (e.g. peroxidase, alkaline phosphatase), the so-called PPT-cDNA conjugate complex being formed.
- streptavidin-conjugated marker enzymes e.g. peroxidase, alkaline phosphatase
- the excess of unbound streptavidin conjugate is washed away and the marker enzyme immobilized on the particles is incubated with the appropriate substrates (e.g. ortho-phenylenediamine, AEBTS, TMB) and the reaction is determined photometrically by means of extinction / absorption or luminometrically.
- the newly synthesized cDNA is labeled using the built-in biotin dNTP 's .
- Labeling with biotin has the advantage that its detection with streptavindine / avidin and a conjugated marker enzyme is very sensitive due to the very strong binding of biotin /
- One unit is the enzyme activity which causes the incorporation of 1.0 nmol [ ⁇ ] -TMP into acid-precipitable products in 10 min at 37 ° C with poly (A) / (dT).
- the described method and the associated test kit have the following advantages over the existing detection methods and products: a) non-radioactive method / test kit or use of non-radioactive and aqueous reagents only, avoidance of organic solvents (TCA, toluene etc.) ), therefore feasible in any laboratory, without special approval and environmentally friendly, since radioactive and organic waste is avoided b) lOx improved sensitivity and increased linear measuring range (0.7-7.0 mU) compared to other non-radioactive methods, because the biotin / streptavidin , which is characterized by a very high binding constant, is used as the marking system.
- the potential applications of the method and test kits relate to the following areas: a) Research & development laboratories in industry, at universities and major research institutions involved in the development of antiviral agents. Therapeutics. Virus diagnostics, vaccines, experiment models etc. work. In all work, the direct detection of retroviruses is absolutely necessary. b) medical diagnosis and monitoring of retrovirus-related diseases e.g. AIDS, leukemia, autoimmune diseases, cancer. The same application also applies to retrovirus-related diseases in animals. Accordingly, potential users are: Schlen u. Hospitals, blood banks, clinical laboratories and laboratory communities. c) the entire transplantation and transfusion medicine or the donor banks of blood, organs, bone marrow, semen etc.
- HIV reverse transcriptase was used as the model enzyme to develop and optimize the method.
- the following experimental steps were carried out for each test batch. (well) carried out: 1) 50 ⁇ l of the particle primer / template reagent (oiigodT / poly rA-magnetic particles) were specified and diluted with 150 ⁇ l of particle washing buffer.
- reaction was started with 30 ⁇ l reaction mix and 60 min. incubated at 37 ° C. and shaken in a reaction mixture of 10 ⁇ M dTTP + biotin-dUTP, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0. 80mM KC1, 10mM MgCl 2 , 2mM DTT, 1mM EDTA, 0.2% NP40, 0.2% Triton X-100.
- Fig. 4 and Tab. 1 show a linear increase in absorbance or enzymatic activity in a range of 0.1-7.0 mU reverse transcriptase within 15 min after addition of the substrate. With longer substrate incubation of 60 min. the sensitivity can be reduced even further to approx. 0.05 mU.
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Abstract
Das beschriebene Verfahren ermöglicht den routinemäßigen, nicht-radioaktiven und enzymatischen Nachweis von Reverser Transkriptase. Dies wird realisiert durch die Verwendung von magnetischen Partikeln und daran immobilisierten Reverse Transkriptions-Primern und -Templates in Form eines sogenannten Partikel-Primer/Template-Komplexes (PPT-Komplex) kombiniert mit einer Biotin-Markierung der neu synthetisierten cDNA in einem PPT-cDNA-Komplex und einer anschließenden Detektion mittels Streptavidin-Konjugat in einem PPT-cDNA-Konjugat-Komplex nach Substratzugabe. Verfahren und Test-Kit sind gekennzeichnet durch die magnetische Handhabung der o.g. Partikel-Ligand-Komplexe mittels eines Mikrotiter-Magnet-Separators, der die sukzessive Separation und Dispersion der Partikel-Ligand-Komplexe aus/in Lösung und somit Waschvorgänge, Austausch von Lösungen, Reaktions-Start/Stop sowie eine photometrische/fluorimetrische oder luminometrische Quantifizierung ermöglicht. Durch die Kombination zwischen magnetischer Handhabung der Partikel-Ligand-Komplexe und deren Markierung mittels Biotin/Streptavidin wird eine mindestens zehnfach verbesserte Sensitivität von erstmalig 0.05 mU/Test und eine Erweiterung des Linear-Meßbereichs von 0.05-10.0 mU erreicht sowie die Durchführung kinetischer Untersuchungen möglich. Durch die magnetische Handhabung sowie die starke Bindung des Biotin/Streptavidin Systems ist das Verfahren sehr schnell (3 Stunden), einfach und reproduzierbar. Weiterhin ist es auf Grund des eigenen Magnet-Separators im Mikrotiterformat durchführbar und ermöglicht somit das gleichzeitige Verarbeiten vieler Proben in kurzer Zeit. Das Verfahren ist unter Anwendung entsprechend optimierter Reaktionsbedingungen universell auf alle Spezies von Retroviren bzw. Reverse Transkriptasen anwendbar und eignet sich zum direkten Nachweis von Retroviren bei Virus-bedingten Krankheiten, in der Transfusion- und Transplantationsmedizin, in der virologischen Forschung und Entwicklung sowie bei der biologischen Qualitätskontrolle biopharmazeutischer und biotechnoilogischer Produkte.
Description
2 . Beschreibung
Verfahren und Test-Kit für den nicht-radioaktiven, enzymatischen Nachweis von Reverser Transkriptase
Virus-Diagnostik
2. 1 Stand der Technik Der routinemäßige Nachweis von Retroviren erfolgt gegenwärtig über den Nachweis von Virus-spezifischen Antikörpern und/oder von Virus-Komponenten (Antigene, RNA, provirale DNA), z.B. anti-HIV-Antikörper Tests, HIV-p24-Antigen-Tests, HIV-PCR Detektions Test (Holodniy M. et al. J. Infect. Dis. 163, 862-866, 1991 ; Henrard DR et al. AIDS Res. Hum. Retrovir. 8, 47-52, 1992). Diese Analytik stützt sich lediglich auf eine nicht funktionelle bzw. Struktur spezifische molekulare Interaktion zwischen Antikörper und Antigen oder PCR primer und proviraler DNA und erlaubt deshalb nicht den Rückschluß auf ein ganzes und funktionelles intaktes Virus. Außerdem erfaßt diese Analytik nicht alle Stadien einer viralen Infektion. z.B. die Phase, in der die Infektion stattgefunden hat, jedoch noch keine Antikörper gebildet sind. Diese Faktoren bewirken somit gelegentlich falsch positive oder negative Ergebnisse. Deshalb ist der direkte und auch funktionelle Nachweis für Retroviren in biologischen Proben dringlichst notwendig. Diese Notwendigkeit ist auch gegeben durch die medizinische und sozial-politische Bedeutung von Retroviren, vor allem durch AIDS und durch eine zu beobachtende ansteigende Tendenz und zunehmende Rolle von Retroviren bei tierischen und menschlichen Erkrankungen (Leukämie, Autoimmunerkrankunge, Krebs etc.). Weiterhin birgt die Übertragbarkeit von Retroviren durch Infektion ernste Probleme für die Transfusions- und Transplantationsmedizin bzw. erfordert Qualitätsuntersuchungen auf Virus- Kontamination bei Lymph-, Speichel-, Sperma- oder Blutproben von Spendern und bei zu verpflanzenden Organen, Haut, Knochenmark etc. Die gleiche Problematik der Virus- Kontaminantion bzw. Infektion gilt auch für die Verwendung von Bio-Pharmazeutika und anderen biotechnologischen oder gen-technoiogischen Präparaten biologischen Ursprungs zu Therapiezwecken bei Mensch und Tier sowie in der medizinischen Grundlagen-Forschung. Voraussetzung für die Lösung der oben erwähnten Problemstellungen ist der direkte und funktionelle Nachweis von Retroviren mittels möglichst einfacher, verläßlicher und empfindlicher Methoden. Der direkte und biologisch funktionelle Nachweis von Retroviren i.st bislang nur in Einzelfällen und mit sehr hohem Arbeits- und Zeitaufwand über Infektion von Zellen und nur in in gereinigten Virus-Präparaten oder in Zellkultur-Überständen möglich. Quantitative, einfache und verläßliche Routine-Methoden gibt es bislang dafür nicht. Ein Grund dafür ist die komplexe Zusammensetzung biologischer Proben (Blut, Organextrakte etc.), die Proteine. Enzyme, Vitamine, Lipide. Zucker und verschiedene Inhibitoren enthalten. Diese erschweren oder machen den direkten und funktionellen Nachweis von Retroviren unmöglich.
Die Reverse Transkriptase ist das Schlüsselenzym aller Retroviren. da es die Reverse Transkription (Übersetzung) der Virus-RNA in komplementäre DNA (cDNA) bewirkt und deren nachträgliche Integration in das Genom der Wirtszelle ermöglicht. Das Enzym ist spezifisch Retroviren und seine Enzymaktivität ist ein Hinweis auf die Existenz von Virus-Partikeln und deren funktionelle Integrität, da das Enzym als freies Molekül sehr instabil ist und schnell inaktiv wird.
Obwohl bislang eine Vielzahl von Tests für den Nachweis von Reverser Transkriptase entwickelt wurden konnte sich diese Technologie als Routine -Verfahren in der virologischen und klinischen Diagnostik auf Grund folgender Defizite nicht durchsetzen: a) Verwendung radioaktiver Komponenten (Tritium-, Phosphor- markierte Substrate) und organischer gesundheits- bzw. umweltschädlicher Lösungsmittel (Trichloressig- säure, Toluol)
b) unzureichende Sensitivität der nicht-radioaktiven Verfahren im Vergleich zur ELISA (enzyme-linked-immunosorbent assay)- und PCR (polymerase chain reaction) -
Technologie bedingt durch die Verwendung zur Markierung und Detektion der Reaktions- Produkte (cDNA) von Antigen/Antikörper Systemen (z.B. Digoxigenin/anti-Digoxigenin. Fluoreszein/anti-Fluoreszein) mit relativ niedriεen Bindunεskonstanten (Ebeiie. J. et al., J. Virol. Meth. 20, 347-356, 1992, K. Suzuki et. al. J. Virol Meth.41. 21 -28, 1993). c) erschwerte routinemäßige Handhabung und Durchführung kinetischer Messung durch unzulängliche Separationsverfahren der Reaktions-Edukte von den Produkten bedingt durch die Doppeimarkierung der neusynthetisierten cDNA (Membranadsorbtion. Filtration bzw. capturing an solider Phase), (Eberle, J. et al., J. Virol. Meth. 20. 347- 356, 1992, K. Suzuki et. al. J. Virol Meth.4 l , 21 -28. 1993) d) ineffiziente Immobilisierung von primern an Festphasen (Plastik-), (T. Urabe et al. J.
Virol. Meth. 40. 154- 154, 1992)
Das vorliegende und zur Patentierung angemeldete Verfahren beschreibt den routinemäßigen direkten und enzymatischen Nachweis von Retroviren mittels Reverser Transkriptase.
2.2 Lösung des Problems
Das zu patentierende Verfahren und der entsprechende Test-Kit stützen sich auf die Verwendung zur Reversen Transkriptions Reaktion eines an magnetischen Partikeln immobili¬ sierten primers und templates in Form eines Partikel-Primer/Template-Komplexes (PPT- Komplexes) und die Markierung der am PPT-Komplex neusynthetisierten cDNS mit Biotinyiiierten-deoxy-Nukleotid-triphosphaten in Form eines PPT-cDNA -Komplexes sowie dessen Detektion mit Streptavidin gekoppelten Marker-Enzymen und einsprechenden Substraten in Form eines PPT-cDNA-Konjugat-Komplexes (siehe Abb. 2).
Magnetische Partikel und daran immobilisierte Ligand-Komplexe bieten den Vorteil, daß sie in Gegenwart eines Magnetfeldes aus Lösungen in fester Phase separiert und in Abwesenheit von Magnetfeldern bzw. unter Schütteln wieder in Lösung dispergiert werden können (siehe Abb. 1 ). Dieses einfache, sehr schnelle, effiziente und reproduzierbare physikalische Verfahren kann bei Immobilisierung von Molekülen an magnetische Partikel in biologischen Tests benutzt werden um diese Moleküle zu prozessieren und nach Bedarf sukzessive zu separieren (immobilisieren) oder zu dispersieren (solubilisieren). Diese abwechselnde magnetische Handhabung (Abb. 1 ) i.st besonders vorteilhaft bei enzymatischen oder biochemischen Reaktionen wo Reaktions-Edukte (Substrate) von Produkten zum Teil getrennt werden müssen. Die magnetische Handhabung von Partikel- Ligand-Komplexen in Lösung wird realisiert durch das sukzessive Einbringen und Entfernen von Magneten in die nahe Umgebung des Reaktionsgefäßese bzw. der Lösung wodurch die sukzessive Separation und Dispersion der Komplexe bzw. Wechsel von Lösungen, waschen Reaktionsstop etc. realisiert werden kann (Abb. 1 ). Bei Mikrotiterplatten wird für die magnetische Handhabung ein sogenannter Mikrotiter-Magnet-Separator (Abb.3) bestehend aus einer optisch durchsichtigen Haiter-Platte mit 24 Stab-Magneten eingesetzt, die in den externen Zwischenraum der Mikrot/ ^r-wells eingeführt werden und somit die in Lösungbefindlichen Partikel-Ligand- Komplexe an den Seitenwänden der wells separieren (Abb. l ). Dadurch wird ein problemloser Austausch von Lösungen, Waschen sowie photometrische Messungen in Gegenwart und ohne Verlust der magnetischen Partikel-Ligand-Komplexe möglich und realisiert. In dem zu patentierenden Verfahren bzw. Test-Kit werden magnetische Partikel mit immobilisiertem primer und template verwendet, die für die Reaktion der Reversen Transkriptase notwendig sind. Primer kann ein homo- oder hetero- oligo-deoxynukleotid- triphosphat sein (z.B. oligo-dT, oligo-dG) sein, während als template (Matrix-RNS-Molekül), eine homo- oder hetero-polymere RNS z.B. poly-rA (poly-adenosin-triphosphat) verwendet werden kann. Zusammen bilden Partikel, primer und template das sogenannte Partikel- primer/tempiate-KompIex/Reagenz (PPT-Reagenz). In Gegenwart von Reverser Transkriptase und Biotin-markierten sowie unmarkierten deoxy-Nukleotid-Triphosphaten dNTP's
wird komplementär zu der template-RNS die entsprechende cDNS synthetisiert, die mittels dem template primer gleichfalls an den magnetischen Partikeln immobilisert ist und den sogenannten PPT:cDNA-KompIex bildet.
Der Überschuß an nichteingebauten Nukleotiden wird weggewaschen und anschließend der biotinyllierte PPT-cDNA-Komplex mit Streptavidin konjugierten Marker-Enzymen (z.B. Peroxidase, Alkalische Phosphatase) inkubiert, wobei sich der sogenannte PPT-cDNA- Konjugat-Komplex bildet. Der Überschuß an nichtgebundenem Streptavidin Konjugat wird weggewaschen und das an die Partikel immobilisierte Markerenzym mit dem entsprechenden Substraten (z.B. ortho-Phenylendiamin, AEBTS, TMB) inkubiert und die Reaktion photometrisch mittels Extinktion/Absorbtion oder luminometrisch quantitativ bestimmt.
Die neu synthetisierte cDNS ist mittels der eingebauten Biotin-dNTP's markiert. Die
Markierung mit Biotin bietet den Vorteil, daß dessen Detektion mit Streptavindin/Avidin und einem konjugierten Markerenzym sehr empfindlich ist auf Grund der sehr starken Bindung Biotin/
Streptavidin (10',5M) im Vergleich zu einer vergleichsweise schwachen Antigen /Antikörper
Bindung ( I O 7- 10 " M).
Durch die sehr effiziente und einfache magnetische Handhabung der Partikel-Ligand-Komplexe in Kombination mit der extrem starken Bindung des Biotin/Straptavidin Systems wird erstmalig eine wesentlich bessere Sensiti vität des Verfahrens realisiert (0,1 mU* Reverse Transkriptase/Test) was eine mindestens zehnfache Steigerung im Vergleich zu anderen existierenden Verfahren und Produkten bedeutet. Bei längerer Inkubation kann die Sensitivität sogar auf 0.05 mü gesteigert werden, wodurch bei einer spezifischen Aktivität von ca. 5000 Units/mg eine Nachweisgrenze von ca. lOpg Reverse Transkriptase pro Test erreicht wird. Außerdem kann durch die starke Bindung des Biotin/Straptavidin Systems wesentlich weniger markiertes Substrat (z.B. Biotin-dUTP) eingesetzt werden, wodurch der lineare Meßbereich über zwei Zehnetpotenzen ansteigt (ca. 0.5- 10.0 mU/Test).
Die verbesserte Sensitivität, der erweiterte Linearitäts-Bereich sowie die einfache, schnelle und effiziente Handhabung machen das neue Verfahren und den Test-Kit sehr interessant für den Bereich der klinischen Routine- Virus-Diagnostik sowohl für Krankheiten als auch für die Qualitätskontrolle von Bio-Pharmazeutika.
* Definition der Reverse Transkriptase-Einheit: Eine Einheit ist die Enzymaktivität, die in 10 min bei 37°C mit Poly(A)/(dT) , , den Einbau von 1.0 nmol [Η]-TMP in säurefällbare Produkte bewirkt.
2.3 Vorteile des Verfahrens/Test-Kits
Das beschriebene Verfahren und der dazugehörige Test-Kit haben gegenüber den bisher existierenden Nachweismethoden und Produkten folgende Vorteile: a) nicht-radioaktives Verfahren/Test-Kit bzw. Verwendung ausschließlich nicht¬ radioaktiver und wässeriger Reagentien, Vermeidung organischer Lösungsmittel (TCA, Toluol etc.), folglich durchführbar in jedem Labor, ohne spezielle Genehmigung und umweltfreundlich, da radioaktiver und organischer Abfall vermieden wird b) lOx verbesserte Empfindlichkeit und erhöhter linearer Meßbereich (0.7-7.0 mU) im Vergleich zu anderen nicht-radioaktiven Verfahren, da das Biotin/Streptavidin, weiches durch eine sehr hohe Bindungskonstante gekennzeichnet ist, als Markierungssystem verwendet wird. c) Kinetische- und Inhibitionsstudien sind erstmals im nichtradioaktivem Bereich möglich, da die Reverse Transkriptions-Reaktion durch Absaugen des Reaktions-Mix gestoppt werden kann, d) einfache und zeitsparende Handhabung (max. 3 Stunden) durch Anwendung der magnetischen Separation und Dispersion Partikel gebundener Reaktion-Edukte/Produkte e) wiederholte Substrat-Zugabe und Extinktionsmessung wird erstmals durch die magnetische Immobilisierung des PPT-cDNA-Konjugat-Komplexes bei einem Reverse Trans¬ kriptase Assay möglich f) hohe Test-Kapazität und routinemäßig anwendbar, da im Mikrotiterformat durchführbar
g) das Verfahren ist unter Anwendung entsprechend spezifischer Reaktionsbcdmgungen universell auf alle Spezies von Retroviren bzw. Reverse Transkriptasen anwendbar und kann entsprechend adaptiert und optimiert werden. h) der Nachweis von Retroviren erfolgt nicht nur strukturell, w ie bei Antigen. Antikörper oder PCR/DNA Tests sondern auch biochemisch funktionell anhand der Reverse Transkriptase
2.4. Anwendungsgebiete
Die potentiellen Anwendungen des Verfahrens und Test-Kits beziehen sich auf folgende Bereiche: a) Forschung & Entwicklungs-Labors in der Industrie, an Universitäten und Groß- forschungseinπchtungen, die an der Entwicklung von antiviralen Wirkstoffen. Therapeutika. Virus-Diagnostika, Impfstoffen, Experimentier-Modellen etc. arbeiten. Bei sämtlichen Arbeiten ist der direkte Nachweis von Retroviren absolut notwendig. b) die medizinische Diagnostik und Verlaufskontrolle bei Retrovirus bedingten Krankheiten z.B. AIDS, Leukämie, Autoimmunerkrankungen, Krebs. Dieselbe Anwendung gilt auch für Retrovirus bedingte Krankheiten bei Tieren. Dementsprechend sind potentielle Anwender: Kliniken u. Krankenhäuser, Blutbanken sowie klinische Labors und Laborgemeinschaften. c) die gesamte Transplantations- und Transfusions-Medizin bzw. die Spender- Banken von Blut, Organen, Knochenmark, Samen etc. Der Nachweis von Kontamination mit Retroviren in den oben genannten Spender-Materialien ist äußerst wichtig um einer Weiterverbreitung und Infektion durch Transplantation oder Spende vorzubeugen. d) die biologische Qualitätskontrolle und Zulassung von Bio-Pharmazeutika (z.B. Blutderivate, Gerinnungs-Präparate), bio/gen-technologischer Kosmetika. Lebensmittel und Labor-Reagentien (z.B. Zellkuluren, Immunglobuline. therapheutische Enzyme, Insulin, fötale Seren etc.), die auf Kontamination mit Retroviren untersucht werden müssen um gegebenenfalls deren Übertragung zu verhindern.
3. Beispiel
Zur Entwicklung und Optimierung des Verfahrens wurde als Modell-Enzym HIV Reverse Transkriptase verwendet. Folgende experimentellen Schritte wurden pro testansatz . (well) durchgeführt: 1 ) 50 μl des Partikel-Primer/Template Reagenz (oiigodT/poly rA-magnetische Partikel) wurden vorgegeben und mit 150 μl Partikel-Waschpuffcr verdünnt.
2) die Partikel wurden in Gegenwart des Mikrotiter-Magnet-Separators 5 Minuten an der Seitenwand des wells gesammelt, die Lösung mit einem 8 Kanal-Wascher abgesaugt und anschließend mit 3 x 200μl Partikel Waschpuffer gewaschen.
3) Nach Absaugen des Partikel Waschpuffers wurde 20μl HIV-Reverse Transkriptase in Lysispuffer bestehend aus lOmM Tris-HCl, pH7.5, 5mM DTT, 0.5% NP40. 0.5% Triton X- 100. 2.5 mM EDTA in verschiedenen Konzentrationen vorgegeben und mit den Partikel- template/primer-Reagenz gemischt. Alternativ können bei Inhibitionsstudien lOμl Enzym und lOμl Inhibitor in o.g. Lysispuffer vorgegeben werden.
4) Die Reaktion wurde mit 30 μl Reaktionsmix gestartet und 60 min. bei 37°C inkubiert und geschüttelt in einem Reaktionsgemisch von lOμM dTTP+Biotin-dUTP, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0. 80 mM KC1, 10 mM MgCl2, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 0.2% NP40, 0.2% Triton X- 100.
5) Die Reaktion wurde durch Separation der mag. Partikel und Absaugen des Reaktionsmix gestoppt und die Partikel mit dem immobilisierten Reaktionsprodukt (cDNA) in 5 x 200 μl Waschpuffer gewaschen bestehend aus salinem Phosphatpuffer (PBS) mit 0.1 % Tween.
6) Anschließend wurden die Partikel mit 150μi Streptavidin-Pci oxidase in Konjugat-Puftei 30 min bei 37°C inkubiert und geschüttelt.
7) der Überschuß von nicht gebundener Streptavidm-Peroxidase wurde anschließend wie 230 beschrieben abgesaugt und die Partikel mit 5 x 200 μl Waschpuffer gewaschen
8) anschließend wurden 200μl AEBTS Substrat in Substratpuffer zugegeben und die Extinktion der grünen Farbentwickiung bei 405nm und einer Referenzwellenlange von 492nm kinetisch gemessen
235
Die Werte aus Abb. 4 und Tab 1. zeigen einen linearen Anstieg der Extinktion bzw enzymatischen Aktivität m einem Bereich von 0.1-7.0 mU Reverse Transkriptase innerhalb von 15 min nach Substratzugabe. Bei längerer Substrat-Inkubtion von 60 min. kann die Sensitivität sogar weiter bis auf ca. 0,05 mU gesenkt werden.
240
Claims
1. Verfahien und Test-Kit zum nicht-radioaktiven, enzymatischen Nachweis von Reverser Transkriptase dadurch gekennzeichnet, daß hierfür ein magnetisch sukzessiv separierbarer und dispergierbarer Partikel-Primer/Template-Komplex (PPT-Komplex) verwendet wird in Kombination mit einer Biotin-Markierung der neu synthetisierten cDNA in einem magnetisierbaren PPT-cDNA-Komplex und anschließender Detektion mittels Streptavidin/Avidin konjugierten Markerenzymen (Peroxidase, Alkalische Phosphatase) und in einem magnetisierbaren PPT-cDNA-Konjugat-Komplex nach Zugabe entsprechender Substrate
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der daraus resultierende Test-Kit für Reverse Ti anskπptase folgende Zusammensetzung hat: a PPT-Reagenz - magnetischer Partikel-Primer/Template-Reagenz, dei ohgo-dT mit poiy (rA) bzw RNA oder ohgo-dG mit poly(rC) bzw RNA. oder olιgo(dC) mit poly(ιG) bzw RNA in Lager-Puffer, bestehend aus PBS, Triton X-100, EDTA, RNAse-Inhibitoren und RT-Cryoprotect-Reagenz b PPT-Waschpuffer, der Tπs/HCl, pH 8.0, NaCl, EDTA enthalt c Virus-Lysis-Pufffer, der Tπs/HCl, pH 7 5, EDTA, Triton X-100. NP-40, DTT enthalt d. Nukleotid-Mix, der dTTP mit Biotm-dUTP oder dCTP mit Biotin-dCTP oder dATP+dCTP+dGTP+dTTP mit Biotin-dUTP oder mit Biotin-dCTP enthalt. e. RT-Reaktionspuffer, der Tπs/HCl pH 8.0; KCI, MgCI2 enthalt f RT-Waschpuffer, der PBS mit Tween enthalt g Konjugat-Puffer, der Waschpuffer mit RT-Blocking-Reagenz enthalt h Streptavidin-Reagenz, das unkonjugiertes Streptavidin oder Avidin enthalt i Konjugat-Reagenz, das Streptavidin- oder Avidin - konjugiert mit Markerenzymen z B. Peroxidase, Alkalische Phosphatase oder aber Biotin- konjugiert mit Maikerenzymen enthalt j. Substrat, das den Konjugat-Markerenzymen entsprechende Substrate z B. 2,2'-Azιno- bιs(3-ethylbenz-thιazohne-6-Sulfon-Saure)Dιammonιum Salz enthält k. Substrat-Puffer, das den o.g. Konjugat-Markerenzym-Substraten entsprechende Puffer z.B Na-HPO4, NaBo2 und Citronensäure pH 4.5, enthält.
1. Referenz-Enzym, das HIV-Reverse-Transkriptase als Marker enthalt
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der sogenannte Partikel- Primer/Template-Komplex (PPT-Komplex) aus magnetischen Partikeln (z B. Dynal, IGI, BioMag, Advanced Biotechnologies, Novagen) und daran immobilisierten Reaktions-primer und Reaktions-templates zusammengesetzt ist
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktions-primer (Initiator) ein homo- oder heteromer von ohgo-deoxy-nukleotidtπphosphaten sein kann z.B olιdo(dT), ohgo-(dG), daß direkt an die magnetischen Partikel gebunden ist
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktions-template (Matrix) ein homo- oder heteromer von poiy-nukleotidtnphosphaten z.B. poly-(ιA), poly-(rC) oder eine naturliche RNA sein kann, die direkt oder indirekt an den magnetischen Partikeln bzw. in dem PPT-Komplex immobilisiert ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das PPT-Reagenz in einem PPT-Lagerungs Puffer (PPT-storage buffer) tiefgekühlt gelagert wird der PBS, EDTA, Triton X-100 und RT-Cryoprotect-Reagenz enthalt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das PPT- Reagenz in Mikrotiterplatten oder andere Reagenzgefäße vorgegeben wird (z.B 50 μl) und mit Partikel- Waschpuffer. PPT- Waschpuffer (z.B. 150 μl) verdünnt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das PPT-Reagenz abwechselnd mittels eines externen Magnetfeldes an der Wand der Mikrotiter-wells gesammelt (separiert) und anschließend solubiiisiert (dispergiert) werden um den Partikel-Waschpuffer oder andere Losungen abzusaugen, zu wechseln und physikalische Messungne durchzuführen (z.B. Photometπe, Fluoπmetrie, Luminometπe), (siehe Abb. 1)
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß zur Separation und Dispersion des PPT-Reagenz ein Permanent-Magnet bzw. ein sogenannter Mikroplatten- Magnet-Separator verwendet wird, der aus einer optisch transparenten Halter-Platte mit 24 Magnet-Stiften entsprechend der Konstruktion aus (Abb.3) besteht, wobei ein Magnet-Stift in die externen Zwischenräume der Mikrotiterwells eindringt und das Magnetfeld für die vier umgebenden wells liefert.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das PPT-Reagenz mit PPT- Waschpuffer gewaschen wird (z.B. mit 3 x 250 μl)
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das PPT- Reagenz nach dem letzten Waschvorgang mit den zu testenden Proben (Reverse Transkπptase± Inhibitoren) in Virus-Lysis-Puffer (z.B. 20μl) unter Schütteln resuspendiert/dispei giert und voi- inkubiert wird
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Reverse Transkriptions Reaktion durch Zugabe des Reaktions-Mix (z.B. 30μl), bestehend aus Tns- Puffer pH7.8-8.3, KC1, MgCl2 sowie unmarkierte und markierte deoxy-Nukleotidtπphosphate, dNTP^s (z.B. dATP, dTTP, dCTP, dGTP+Biotin-dUTP gestartet und bei 37°C - 43°C für verschiedene Zeiten (z.B. 60-180 mm) inkubiert wird. Dabei wird markierte cDNA neusynthetisiert, die mit dem PPT-Reagenz den sogenannten PPT-cDNA-Komplex bildet, der mittels Magnetfeldern sukzessive sepanert und dispergiert werden kann.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß alternativ zur Biotin-Markierung, dNTPvs mit Markierungen von Br-, Digoxigenin- oder Fluoreszenz- Markern (z.B. FITC-) eingesetzt werden können.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Reverse Transkriptions Reaktion durch magnetische Separation des PPT-cDNA Komplexes und Absaugen des Reaktions-Mix gestoppt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Überschuß an nicht eingebauten Nukleotiden und der PPT-cDNA-Komplex mit sogenanntem RT- Waschpuffer gewaschen wird, bestehend aus salinem Phophatpuffer und Tween (z.B. 3 x 250 μl).
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der PPT-cDNA Komplex anschließend mit Konjugat bzw. Streptavidin- odei Avidin-konjugiciten Maiker- enzymen (z.B. Alkalische Phosphatase, Peroxidase) in sogenanntem Konjugat-Puffer inkubiert wird, der sahnen Phophatpuffer, Tween und RT-Blocking-Reagenz enthalt, wobei der sogenannte PPT-cDNA-Konjugat-Komplex entsteht, der gleichfalls magnetisch sepaπeit und dispergiert werden kann.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der PPT-cDNA Komplex alternativ mit unkonjugiertem Streptavidin- oder Avidin in Konjugat-Puffer inkubiert, dann in RT-Waschpuffer gewaschen und anschließend mit Biotin-konjugierten Markerenzymen (z.B. Alkalische Phosphatase, Peroxidase) inkubiert werden kann.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Überschuß an nicht gebundenem Konjugat und der PPT-cDNA-Konjugat Komplex mit RT-Waschpuffer gewaschen wird.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der PPT-cDNA- Konjugat Komplex mit entsprechenden Substraten der Konjugat-Enzyme (z B Alkalische Phosphatase, Peroxidase) in entsprechendem Substratpuffer (z.B. perborat/citrat-Puffei) inkubiert werden (z.B. 200μl) und quantitativ photometrisch, fluoπmetπsch oder luminometπsch gemessen werden.
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