JPH04148698A - 固相化プライマーと鋳型ｒｎａとのハイブリダイズ物を用いる逆転写酵素の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、被検液中の逆転写酵素の決定方法および体液
中の逆転写酵素中和抗体測定による被検者のレトロウィ
ルス感染の確認法に関する。

［従来の技術］ 従来、逆転写酵素の活性測定としては、天然型ＲＮＡ又
はアデニンリボポリヌクレオチド（以下、ポリＡと略す
ことがある）とオリゴデオキシチミンヌクレオチド（以
下、オリゴｄＴと略すことがある）とを用い、基質とし
てトリチウム化デオキシチミジン５”−トリホスフェー
ト（以下、（３Ｈ）ｄＴＴＰと略称することがある）を
用い、反応液中の逆転写酵素活性を利用してオリゴｄＴ
を伸長させ、これをフィルターで濾過し、フィルター中
の放射活性を測定する方法が報告されている（　Ｄａｖ
ｉｄ　　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ　　Ｎａｔｕｒｅ、　２２
６．１２０９−１２１１、　（１９７０）　；　　Ｈｏ
ｗａｒｄ　Ｍ、　Ｔｅｍ１ｎ　＆　ＳａｔｏｓｈｉＭｉ
ｚｕｔａｎｉ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２２６．１２１１−
１２１３．（１９７０））。

そして更に、上述の逆転写酵素活性の測定方法を利用し
たレトロウィルスの一種であるエイズウィルスの感染を
診断する方法が報告されている〔特開昭６３−２５２２
５３号公報〕。

従来、一般にバイオ医薬的研究及び組換えＤＮＡテクノ
ロジーに用いられる多くの操作は、通常同位体水素（”
Ｈ）、リン（ＩＩ２Ｐ）、炭素（”Ｃ）、ヨウ素（１２
％工）等で放射標識されたポリヌクレオチドの使用に大
きく依存している。　そして、このような放射性化合物
は、たとえ核酸又は他の科学的註又は臨床上興昧ある分
子が極めて微量で存在していても、それらを検出し、監
視し、局在化し、又は単離することが可能であるので、
有用な指示プローブとして使用されている。

しかしながら、放射性物質の使用には厳しい制約があり
重大な欠点が伴っている。　すなわち、まず第一に、放
射性物質を取り扱う人は、潜在的に高レベルの放射線に
曝されがねない危険があるので、放射性同位体の製造、
使用、後処理の間、倉入すな安全策を請じ維持しなけれ
ばならないという問題点があった。

第二に、放射性ヌクレオチドは高価なものであり、一般
の使用においては経費が高くなるという問題がある。　
第三に、必要な感度を得るには、高い比放射能の放射性
物質を用いなければならないが、比放射能の高い放射性
物質はそれに対応して半減期が短く、貯蔵寿命が限られ
ており使用に制約が加えられるという問題があった。

そこで、放射性物質に替えて非放射性の標識物質を用い
る方法が検討されているが、例えば、鳥型ミエローマ由
来の逆転写酵素を用い、鋳型として天然型ｍＲＮＡ、ブ
ライマーとしてオリゴｄＴ及び基質としてビオチン化デ
オキシウリジン５′−トリホスフェート（以下、ビオチ
ン化ｄＵＴＰと略すことがある）を用いて反応せしめた
ところ、ビオチン化ｄＵＴＰは何ら基質として利用され
ず、オリゴｄＴの伸長は見られず、逆転写酵素の活性測
定に利用し得ないことが報告されており［Ｐｅｎｎ１ｎ
ａ　Ｒ，Ｌａｎｇｅｒ、　Ａｌｅｘ　Ａ、　Ｗａｌｄｒ
ｏｐ　＆Ｄａｖｉｄ　Ｃ，Ｗａｒｄ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｕｓＡ。

７８、６６３３−６６３７．　（１９８１）　］　、ビ
オチン化ヌクレオチドは逆転写合成酵素の活性測定には
適用できないとされていた。

本発明者らは先に、放射性同位体を用いない逆転写酵素
活性の測定系を得べく、鋭意研究を行なった結果、特定
の鋳型ＤＮＡおよびブライマーを用いれば逆転写酵素の
存在下においてビオチン化ｄＵＴＰは基質として利用さ
れ、逆転写酵素活性が容易に測定しうろことを見出した
。

［発明が解決しようとする課題］ しかし、上記の方法にもまだいくつか問題があり、その
改善が求められていた。すなわち、上記方法では操作手
順に煩雑な点があり、また、反応開始後、測定が可能と
なるまでに若干の時間がかかるという問題があり、操作
手順が簡便で、短時間で測定可能な方法の確立が求めら
れていた。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、上記問題点に鑑み更に研究を行なった結
果、固相化ブライマーを使用すれば上記の問題点を解消
することができ、簡便かつ迅速に逆転写酵素活性が測定
しうろことを見出し本発明を完成した。

即ち本発明は、少なくとも、水性媒体中で、人為的に調
製されたアデニンリボポリヌクレオチド鋳型ＲＮＡと該
アデニンリボポリヌクレオチド鋳型ＲＮＡに相補的な固
相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチドとをハイ
ブリダイズせしめたハイブリダイズ物と、ビオチン化デ
オキシウリジントリホスフェートとを被検液の存在下反
応せしめ、該反応の反応生成物と未反応のビオチン化デ
オキシウリジントリホスフェートを分離した後、反応生
成物もしくは未反応のビオチン化デオキシウリジントリ
ホスフェートの量を測定することを特徴とする被検液中
の逆転写酵素の決定方法である。

また本発明は、少なくとも、水性媒体中で、人為的に調
製されたアデニンリボポリヌクレオチド鋳型ＲＮＡと該
アデニンリボポリヌクレオチド鋳型ＲＮＡに相補的な固
相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチドとをハイ
ブリダイズせしめたハイブリダイズ物と、ビオチン化デ
オキシウリジントリホスフェートとを被検体液および逆
転写酵素の存在下反応せしめ、該反応の反応生成物と未
反応のビオチン化デオキシウリジントリホスフェートを
分離した後、反応生成物もしくは未反応のビオチン化デ
オキシウリジントリホスフェートの量を測定し、この量
から被検体液中の逆転写酵素中和抗体価を求めることを
特徴とする被検者のレトロウィルスの感染確認法である
。

本発明において、鋳型として用いられるＲＮＡは、人為
的に調製されたアデニンリボポリヌクレオチドである（
以下、このようなＲＮＡをポリＡと略称することがある
）。

ポリＡは、例えば、遺伝子操作技術若しくは化学合成技
術を用いて合成することにより人為的に調製され、特に
好ましい態様としては１００〜５００塩基からなるポリ
Ａを挙げることができ、通常有利に利用できるものとし
ては、平均鎖長２５５塩基程度のポリＡが例示される。

固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチド（以下
、固相化オリゴｄＴと略すことがある）はプライマーと
して作用するもので、好ましい態様としては、１１塩基
以上のデオキシチミジンのオリゴマーであり、長いもの
ほど好ましいが、通常有利に利用できるものとして例示
されるものは、平均鎖長１５塩基ないし２１塩基程度の
固相化オリゴｄＴである。

この固相化オリゴｄＴは、オリゴデオキシチミンヌクレ
オチド（オリゴｄＴ）を同相に固定化したものである。

同相としては、特に限定はされないが、ガラス粒子、セ
ルロース、ポリスチレン等の天然または合成高分子の担
体等が用いられる。

このうち合成高分子担体の例としては、例えば、スチレ
ンや置換基としてスルホン酸基、カルボキシル基、アミ
ノ基を有するスチレン（以下、スチレン誘導体モノマー
という〉の単一重合物もしくは共重合物であるポリスチ
レンや、スチレンまたはスチレン誘導体モノマーとメチ
ルスチレン、エチルスチレン、クロルスチレン、エチレ
ン、プロピレン、アクリル酸、アクリル酸メチルエステ
ル、アクリル酸エチルエステル、メタクリル酸、メタク
リル酸メチルエステル、メタクリル酸エチルエステル、
アクリロニトリル、アクリルアミド、マレイン酸、フマ
ル酸、ブタジェン、クロルプレン、イソプレン、塩化ビ
ニル、塩化ビニリデン、酢酸ビニル、ビニルトルエン、
ジビニルベンゼンなどとの共重合体、ポリビニルトルエ
ン、ポリエステル、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸
、ポリアクリロニトリル、ポリビニルピロリドン、ポリ
酢酸ビニルアクリレート、塩化ビニル−アクリレートな
どとの共重合体などが挙げられる。また、この合成高分
子担体は、その表面を非イオン界面活性剤で前処理した
ものであっても良い。

特に好ましいものとしては、スチレン、クロルスチレン
、アクリル酸、ビニルトルエン、メタクリル酸メチルエ
ステルの重合または共重合体が例示される。

これらの固相にオリゴｄＴを固定化する方法としては、
吸着法および化学結合法のいずれをも利用することがで
きるが、より高い感度を得られる点で化学結合法が好ま
しい。

特に、オリゴｄＴの５゛末端側で固相に化学結合せしめ
る方法が好ましく、例えば、アミノ基を有するポリスチ
レンやポリペプチド等のアミノ基を有するかこれを導入
した固相のアミノ基にオリゴｄＴの５”末端に存在する
リン＃！歿基を縮合剤等の存在下活性化し、アミン基と
リン酸基を縮合する方法、例えば１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等の
縮合剤の存在下、好ましくは１−メチルイミダゾールを
添加して縮合せしめれば良い。

また、他の方法として、例えば、カルボキシル基を有す
るスチレン等のカルボキシル基を有しまたはこれを導入
した固相のカルボキシル基に対し、オリゴｄＴの５゛末
端のリン酸残基に上記縮合剤により予めアミノ基を結合
導入せしめ、次いで、カルボキシル基とアミノ基を脱水
縮合せしめる方法が挙げられる。

さらに、スルホン酸基や水酸基、ジメチルアミノ基等の
官能基を有するかまたはこれを導入した固相とオリゴｄ
ＴまたはオリゴｄＴの５°末端を適当な官能基となし、
適当なスペーサーを用いて両者を結合しても良い。

形状としても特に限定されず、ボールや粒子状、繊維状
の表面や、プレート、容器等の壁面に固相化したもので
あっても良い。

固相化オリゴｄＴの単位面積当たりの固相への結合量は
、好ましくは　１．２ｐｍｏｌ／Ｃｍ２以上であればよ
く、通常は、５．０　ｐｍｏｌ／Ｃｍ２の結合量までに
は最高の吸光度を与え、それ以上の結合量においても測
定可能であるが、結合量が多すぎると感度の面および経
済性の面から好ましくなく、好ましくは１．２〜５．０
ｐｍｏｌ／ｃｍ２の範囲が例示される。

基質として用いられるビオチン化デオキシヌクレオシド
トリホスフェート（以下、ビオチン化ｄＵＴＰあるいは
標識基質と略称することがある）は、例えば、ビオチン
基とウラシルデオキシヌクレオシド基がアリールアミン
等の適当なスペーサーを介して結合した化合物があげら
れ、具体的な化合物例としては、例えば、５−　（Ｎ−
（Ｎ−ビオチニル−ε−アミノカプロイル）−３−アミ
ノアリール〕−デオキシウリジントリフオスフェート（
ピオチン化−１１−ｄＵＴＰ）、５−　（Ｎ−〔Ｎ−（
ビオチニル−ε−アミノカプロイル）−γ−アミノブチ
リル〕−３−アミノアリール〕−デオキシウリジントリ
フオスフェート（ビオチン化−１６−ｄＵＴＰ）等のよ
うにビオチニル基が適当なスペーサーを介してｄＵＴＰ
と結合された化合物である。ビオチン化−１１−ｄＵＴ
Ｐ及びピオチン化−１６−ｄＵＴＰは、市販されている
化合物であり、また、それ以外の化合物も特開昭５７−
２０９２９７号公報等の公知文献に記載の方法に準じて
容易に調製される。

ビオチン量測定のために用いられる試薬およびその組成
物としては、一般にビオチン量を測定するために用いら
れるものを採用することができ、例えばＦＩＴＣ（フル
オレラセンイソチオシアネート）蛍光検出用組成物、パ
ーオキシダーゼ検出用組成物、酸性ホスファターゼ検出
用組成物、アルカリホスファターゼ検出用組成物、β−
ガラクトシダーゼ検出用組成物等が挙げられる。

ＦＩＴＣ蛍光検出用組成物としては、例えば、兎ＩｇＧ
ビオチン抗体およびＦＩＴＣ結合山羊抗兎ＩｇＧ抗体か
らなる組成物並びにＦＩＴＣ結合アビジン等が挙げられ
、また、パーオキシダーゼ検出用組成物としては、例え
ばストレプトアビジン−ビオチン化西洋わさびパーオキ
シダーゼ複合体、リン酸Ｉｌｉ新液等の適当な緩衝液お
よびオルトフェニレンジアミンおよび過酸化水素からな
る組成物が挙げられる。　更に、酸性ホスファターゼ検
出用組成物としては、例えばストレプトアビジン−ビオ
チン化酸性ホスファターゼ複合体、リン酸緩衝液等の適
当なｍ新液、パラニトロフェニルホスフェート等の発色
基質あるいは４−メチルウンベリフェリルホスフェート
等の蛍光基質からなる組成物等が、アルカリホスファタ
ーゼ検出用組成物としては、例えばストレプトアビジン
−ビオチン化アルカリホスファターゼ複合体、トリス塩
酸緩衝液等の適当なｙｉ衝新液よびパラニトロフェニル
ホスフェート等の発色基質あるいは４−メチルウンベリ
フェリルホスフェート等の蛍光基質からなる組成物、ス
トレプトアビジン化アルカリホスファターゼ、トリス−
塩酸緩衝液等の適当な！！衝新液よびパラニトロフェニ
ルホスフェート等の発色基質あるいは４−メチルウンベ
リフェリルホスフェート等の蛍光基質からなる組成物が
、また、β−ガラクトシダーゼ検出用組成物としては、
例えば、ストレプトアビジン−β−ガラクトシダーゼ結
合体、リン酸緩衝液等の適当な緩衝液および２−ニトロ
フェニル−β−ガラクトシド等の発色基質あるいは４−
メチルウンベリフェリル−β−ガラクトシド等の蛍光基
質からなる組成物等が挙げられる。

これらの組成物は、既に市販されているものを利用して
もよく、また、公知文献を参考にして、種々調製し、ビ
オチン量測定用試薬組成物としても良い。

本発明の被検液中の逆転写酵素を決定する方法を実施す
るには、まず、ポリＡと固相化オリゴｄＴとをハイブリ
ダイズせしめ、次いで充分洗浄せしめて調製したハイブ
リダイズ物を用い、該ハイブリダイズ物とビオチン化ｄ
ＵＴＰとを被検液の存在下反応させ、未反応のビオチン
化ｄＵＴＰを除去した後、ビオチン化ｄＵＴＰ量を測定
すればよい。

ポリＡ（平均鎖長：２５５塩基）と固相化オリゴｄＴ（
平均鎖長：　２１．５塩基）の量的関係は、固相化オリ
ゴｄＴを１（モル比）としたときに、ポリＡを３〜０．
０７の比とすることが好ましく、適宜、固相化オリゴｄ
Ｔの単位表面積当たりの結合量において好ましいポリＡ
の量とすれば良い。

ハイブリダイズは、ｐＨ４〜９、好ましくは５〜８に調
整した各種緩衝液や生理食塩水等の水性媒体中で行なわ
れるが、これに塩等を添加しても良く、又ハイブリダイ
ズを阻害′せしぬない限りホルムアミド等の有機溶媒を
添加しても良い。さらに、ハイブリダイズせしめやすい
という点で、水性媒体中の各種電解質の温度は高いほう
が好ましい。

また、ハイブリダイズに要する処理時間は、通常は１〜
２４時間、十分にハイブリダイズせしめるためには１０
時間以上が好ましく、より好ましくは１５〜２４時間程
度であり、ハイブリダイズ温度は、通常、凍結しない温
度以上であり、約５０℃以下程度、好ましくは４〜４２
℃程度とされる。

ハイブリダイズ生成物の洗浄には、各種緩衝液、生理食
塩水等の水性媒体が用いられ、その電解質濃度はその後
の逆転写酵素測定液の濃度と同じか又はそれ以上である
ことが好ましい。本発明においては固相化ブライマーを
使用していることからハイブリダイズ物の洗浄は濾過、
遠心分離、デカンテーション等により容易に実施するこ
とが出来、洗浄回数は、通常、十分量で３〜５回程度と
され、十分に洗浄される量と回数で行なわれれば良い。

反応は、被検液、上記ポリＡ−固相化オリゴｄＴハイブ
リダイズ物および標識基質としてのビオチン化ｄｔＪＴ
Ｐを、ｐＨ６，５〜８に調整したトリス−塩酸緩衝液、
リン酸緩新液等ノｖＩｉ衛液中、３７°Ｃ付近で０．５
〜２４時間インキュベートし、系中に存在する逆転写酵
素の作用により、前記ビオチン化ｄＵＴＰをポリＡ−固
相化オリゴｄＴハイブリダイズ物のブライマ一部に結合
せしめる。

被検液としては、逆転写酵素の存在、非存在または逆転
写酵素の酵素活性を測定しようとする検液であれば良く
、例えば、レトロウィルス感染細胞の培養液を挙げるこ
とができる。

更に、ポリＡ−固相化オリゴｄＴハイブリダイズ物と結
合したビオチン化ｄＵＴＰ　（以下、反応生成物という
ことがある）と未反応のビオチン化ｄＵＴＰとの分離は
、固相化オリゴｄＴを用いているので、濾過、遠心分離
、デカンテーション等により容易に実施することができ
る。

基質として利用されたビオチン化デオキシウリジンの量
、すなわち反応ピオチン化ｄＵＴＰ量は、伸長工程を経
てブライマーに結合したビオチン化デオキシウリジンの
ビオチン量をビオチンの測定用試薬を用いて測定すれば
良く、例えば、ビオチン含量の測定用試薬として、スト
レプトアビジン化アルカリホスファターゼ、トリス−塩
酸緩衝液、パラニトロフェニルホスフェートからなる組
成物を用いた場合には、次の様にして実施される。

すなわち、０．１５〜０．５ＭのＮａＣ１を含むｐＨ７
，５〜９．５に調整したトリス塩酸緩衝液に０．０５〜
１０　、ｕｇ／ｍＨ！度のストレプトアビジン化アルカ
リフォスファターゼを含有させて得た溶液に、ビオチン
化ｄＵＴＰの反応した固相担体を１０〜６０分程度浸漬
させる。十分量の上述ｌ１ｍ液で少なくとも３回以上同
相担体を洗浄し、次に例えば１　ｍＭ　Ｍｇ　Ｃ１２を
含む５０ｍＭジエタノ−ルアミンー塩酸緩ｌｔｉ澄（ｐ
Ｈ９，５〜１０）に１ｍｇ／ｍｌのパラニトロフェニル
ホスフェートを溶解させて得た溶液に、固相担体を　０
．１〜２時間浸漬させて発色せしめる。発色量の定量は
、波長４０５ｎｍの吸光度を測定すれば良い。

かくして測定されたビオチン化ｄＵＴＰの結合量は、系
中の逆転写酵素量、すなわち被検液中の逆転写酵素量を
反映するものであるので、これから逆転写酵素量等を決
定することができる。

さらに、より検出感度を上げるために標識基質の他に、
基質としてデオキシチミジントリホスフェート（以下、
ｄＴＴＰと略すこともある）を加えることができる。こ
のような目的のために使用されるｄＴＴＰＯ量は、通常
、標識基質であるビオチン化ｄＵＴＰ量に比して、モル
比で２〜２０倍、好ましくは３〜４倍である。

本願方法による逆転写酵素量の決定は、通常０．０００
０５〜１ユニット程度の逆転写酵素が決定しうる感度の
良いものである。

また、本発明の体液中の逆転写酵素中和抗体検出による
被検者のレトロウィルス感染の確認法を行なうに際して
は、被検体液および逆転写酵素存在下、基質として少な
くともビオチン化ｄＵＴＰを用い、これをポリ人および
固相化オリゴｄＴのハイブリダイズ物と反応させる。こ
の工程は、予め酵素活性を測定した逆転写酵素含有溶液
を通常０．００１〜１ユニツト、好ましくは０．００１
〜０．０１ユニツトに調製し、これと被検体液とを混合
し、約４°Ｃで通常０．１〜２時間、好ましくは　１０
〜６０分間ブレインキュベートした後、更に基質として
のビオチン化ｄＵＴＰを通常０．５〜１００μＭ、好ま
しくは１〜５μＭ含有する、ｐＨ６，５〜８に調整した
トリス−塩１２ｍ５液等の１１面溶液が存在するポリＡ
および固相化オリゴｄＴのハイブリダイズ物へ加え、約
３７°Ｃで０．５〜２４時間程度インキュベートする。

逆転写酵素としては、ヒト免疫不全ウィルス１型（Ｈ工
■）、ヒト免疫不全ウィルス２型、アカゲザル免疫不全
ウィルス、マウス乳腺腫ウィルス、ヒトＴ細胞白血病ウ
ィルス丁型、ラウス株トリ肉腫ウィルス、ラウス関連ウ
ィルス２型、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）などのレトロ
ウィルス等のウィルス粒子を非イオン性界面活性剤、例
えば、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（
トリトンＸ−１００，ＮＰ−４０）で溶解処理して得た
ものを使用することができる。

また、被検体液としては、逆転写酵素に対する抗体をも
つ人体に含有されまたは産生される任意の体液であれば
よく、好ましくは血清である。

血清は、３０〜５０％飽和硫安で沈澱させたもの、ある
いはＤＥＡＥ、ＱＡＥ−セファデックス等陽イオン交換
樹脂を通過させたものが通常用いられる。

反応および未反応ビオチン化ｄＵＴＰの分離およびそれ
らの量を測定する方法も、前述の逆転写酵素の決定方法
に準じれば良い。

かくして測定系中の反応または未反応ピオチン化ｄＵＴ
Ｐ量が求められるのであるが、系中の逆転写酵素は被検
体液由来の抗体により失活され、この結果、反応ピオチ
ン化ｄＵＴＰ量が減少する。　従って、陽性体液コント
ロールおよび陰性体液コントロールを指標とすることに
より体液中の逆転写酵素中和抗体価を測定することがで
き、この抗体価はその被検体液を持つ被検者のレトロウ
ィルス感染の有無のＮ、認の指標となる。

本発明においても、ポリＡ（平均鎖長：２５５塩基）と
固相化オリゴｄＴ（平均鎖長：　２１．５塩基）の量的
関係は、固相化オリゴｄＴを１（モル比）としたときに
、ポリＡを３〜０．０７の比とすることが好ましく、適
宜、固相化オリゴｄＴの単位表面積出たりの結合量にお
いて好ましいポリＡの量とすれば良い。

また、より検出感度を上げるために標識基質のほか更に
基質としてｄＴＴＰを加えることができる。　このよう
な目的のために使用されるｄＴＴＰの量は、通常標識基
質であるピオチン化ｄＵＴＰ量に比しモル比で２倍〜２
０倍、好ましくは３〜４倍である。

本発明方法を有利に実施するためには、例えば ■人為的に調製されたアデニンリボポリヌクレオチド鋳
型ＲＮＡと鋳型ＲＮＡに相補的な固相化オリゴデオキシ
チミンヌクレオチドのハイブリダイズ物 ■ピオチン化デオキシウリジントリホスフェート、およ
び ■ピオチン量測定用試薬、 を含有してなる逆転写酵素測定用キットを利用すること
ができる。

これらキットは、溶液状態のものであっても良いが、使
用時に脱イオン水、生理食塩水、各種緩衝液等で溶解す
るような凍結乾燥試薬とすることもできる。

［発明の効果］ 本発明方法により、例えばＨＩＶの保持者のリンパ球培
養土清中の逆転写酵素活性を放射性標識を使わずに検出
することが可能となった。また、ＡＩＤＳ発症と密接に
関連のある抗進転写酵素中和抗体量も放射性物質を使用
せず測定できるようになったので、ＨＩＶキャリヤーの
発症の可能性等を容易に監視することができる。

特に本発明方法では、固相化オリゴｄＴとポリＡ−固相
化オリゴｄＴハイブリダイズ物を使用するので、反応時
間が短くてすみ、また、反応生成物と未反応物の分離が
極めて容易であるので、測定時間の短縮、多数のサンプ
ル数を処理すること等が可能となり、機械化に好都合で
ある。

また、オリゴｄＴを１（モル比）としてポリＡを０．０
７〜３の比とした場合には感度良く、さらにポリＡｔｔ
Ｏ，５〜２．６とした場合には更に好ましく測定するこ
とが可能となった。

［実施例］ 以下、実施例を挙げ、本発明をさらに詳細に説明するが
、本発明は何らこれに限定されるものではない。

実施例　１ 予め調製した鋳型ポリＡと固相化オリ ゴｄＴ１２−＋ｓのハイブリダイズ物による逆転写酵素
反応と液相系逆転写酵素 反応との反応速度の比較： （１）オリゴｄ　Ｔ　、、、！ｌのアミノ化プレートへ
の固定 １００ｍＭ　　１−−Ｃチル−３−（３−ジメチルアミ
ノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＣＤＩと略す；ペ
プチド研究所説）と１００ｍＭ　　１−メチル−イミダ
ゾール−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０、ＩＭＤと略す；ＳＩ
ＧＭＡ社製）を含む水溶液に“、オリゴｄＴ＋２−＋ｓ
（平均鎖長：１５塩基、平均分子量：４，９５０ダルト
ン；ファルマシア社製）を２００　ｎ　ｇ　７５０μｌ
となるように溶解し、その５０μｍずつをアミノプレー
ト（底面積０．３２ｃｍ”；住人ベークライト社製）の
ウェルに分注（反応液が接触するウェルの表面積は０．
６３ｃｍ’）　し、室温で２４時間反応させた。反応後
、この溶液を捨て、０．１５Ｍ　ＮａＣ１を含む０．１
Ｍ　　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５；以下、ＴＢＳ
と呼ぶ）の２００μｍでウェルを洗浄し、同じく２回、
緩衝液２００μｍでウェルを洗浄し、同じく２回ＴＢＳ
２００μｍで洗浄し、これを固相化プライマー（オリゴ
ｄＴ＋２−ｔｏ固定プレート）とした。

（２）鋳型ポリＡと固相化プライマーのハイブリダイゼ
ーション ０．５ＭＮａＣ１を含む０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（
ｐＨ７，５；以下高塩濃度ＴＢＳと呼ぶ）にて１００　
ｎ　ｇ　／　５０μｌとなるように調製したポリＡ（平
均鎖長：２５５塩基、平均分子量：８６，７００ダルト
ン；ファルマシア社製）５０μｍを上記（１）で調製し
たオリゴｄＴ＋２−＋ｅ固定プレートに添加し、４°Ｃ
で１８時間ハイブリダイズせしめた後、高塩濃度ＴＢＳ
にて５回洗浄した。

（３）逆転写酵素反応 逆転写酵素によるＤＮＡ鎖伸長反応を行なわせるのに、
２箔製度の反応緩ｆｆ１ｌｉ液（１００ｍＭ　　トリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ７，８）、２４ｍＭジチオスレイト
ール、２．４ｍＭ還元型グルタチオン、２０　ｍ　Ｍ　
ｋ（ｇ　Ｃ１２，３２０ｍＭ　ＫＣＩ、２ｍＭ　ｘチレ
ングリコール四酢酸、０．４％　トリトンＸ−１００，
４％エチレンゲルコールからなる緩衝液）の５０μｍに
　０．４ｎｍｏｌのビオチン化−１１−ｄＵＴＰ　（エ
ンゾ社製）を添加し、これを上記（２）に記載の如くし
て得られた固相化ブライマーとポリＡがハイブリダイズ
したウェルに分取した。次にリン酸！！衛生理食塩水（
ｐＨ７，４、以下、ＰＢＳと呼ぶ）にて１５ｍＵ１５０
μｌに調製した逆転写酵素（ラウス関連ウィルス２型（
ＲＡＶ−２）由来、宝酒造製）を５０μｍウェルに加え
、混合した後、３７°Ｃで１．２．３および２４時間作
用せしめた。

（４）酵素反応生成物（ビオチン化ＤＮＡ）の定量 上記（３）に記載の如くして得られたそれぞれの反応液
に１０μｍの５Ｍ　ＮａＣ１を添加し、５分間放Ｍ後、
０．５ＭＮａＣ１と０．０５Ｍ　ＭｇＣ１゜を含む０．
１Ｍ　　トリス−塩酸ｍｆｉ液（ｐＨ９，５、以下、洗
浄液と呼ぶ〉の２００μｍにてウェルを洗浄し、同じく
２回から４回洗浄液２００μｌで洗浄した。

次いで、洗浄液に溶解した３％牛血清アルブミンの１０
０μｌをウェルに分取し、３７°Ｃで１時間インキュベ
ートした。３％牛血清アルブミン液を捨てた後、洗浄液
で１０００倍に希釈したアルカリホスファターゼ標識ス
トレプトアビジン（最終濃度０．０８８μｇ／　ｍ　１
、ＢＲＬ社製）の５０μｍをウェルに分取し、室温で１
時間インキュベートした。

２００μｍの洗浄液にて同様にウェルを３回から５回洗
浄して余分なアルカリホスファターゼ標識ストレプトア
ビジンを除去した後、ウェルに残っているアルカリホス
ファターゼの酵素活性を測定することにより、ビオチン
化ＤＮＡの定量とした。

アルカリホスファターゼの酵素活性の測定は、パラニト
ロフェニルホスフェートを１ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃ１２を
含む５０ｍＭ　　ジェタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ９，５）にて１ｍ　ｇ　／　ｍ　１になるよう溶解し
、その５０μｌを各ウェルに加え、３７゛Ｃで３０分イ
ンキュベートし、次いで、０．５規定ＮａＯＨの５０μ
ｍをその反応液へ添加することにより酵素反応を終了さ
せ、アルカリホスファターゼ活性により呈色した吸収波
長４０５ｎｍの吸光度をプレートリーダー（Ｊ−２００
０型、インターメッド社製）にて測定することによって
行なった。

１５ｍＵの逆転写酵素を使用して１時間、２時間、３時
間、及び２４時間反応せしめた時に得られた吸光度を第
１表に示す。

第　　　１　　　表 反応時間 （ｈ） 吸　　光　　度　傘 １．０　２　５ １．９３８ ２．２　３　３ ２．７　１　２ 上記結果が示すように、伸長鎖反応には時間依存性があ
った。そして、この測定法においては、吸光度０．１以
上にて信頼できる測定値が得られることが知られている
ので、本発明方法によれば、反応開始後１時間で既に定
量を行なうことができることが理解される。これに対し
、以下に示す参考例１の比較方法（液相系での反応）で
は反応開始後２時間においてやつと測定できた。

この様に固相化プライマーを使用して逆転写酵素反応さ
せる本発明方法は、液相系での反応の時よりも短い時間
で逆転写酵素の活性を測定することが出来、より優れた
ものであることが明らかである。

参考例１ 液相系に於ける逆転写酵素反応生成物の経時変化 実施例１（３）に記載した２信認度の逆転写酵素反応１
衝液５０μｍに、１μｇのオリゴｄＴ＋２−＋ｓ、０．
１μｇのポリＡ、０．４ｎｍｏｌのビオチン化−１１−
ｄＵＴＰを添加し、そこへ　１５ｍＵのＲＡＶ−２由来
逆転写酵素を加えて全量を１００μｍとし、３７°Ｃで
１．２．３および２４時間の各時間作用せしめた。

この反応液に１０倍量のＩＮ塩酸と０．１Ｍピロリン酸
ナトリウム塩を含む溶液を添加し、撹拌混合した後、１
０分間氷冷した。

この溶液を、ナイロン膜１００Ｃ璽２（日本ボール社製
：商品名バイオダイン）を装着した９６穴マニホールド
（ＢＲＬ社製）で吸引、濾過し、伸長操作をせしめたビ
オチン化ＤＮＡ鎖をナイロン膜へと吸着せしめた。

ここで得られたビオチン化ＤＮＡを吸着したナイロン膜
に、緩衝液１　（０，１Ｍ　　トリス−塩酸Ｉ！衝新液
ｐＨ７，５）　、０．１５ＭＮａＣ１とからなる緩衝液
）に３％ＢＳＡを添加し、６５°Ｃで１時間インキュベ
ートした。

該溶液からビオチン化ＤＮＡを吸着したナイロン膜を取
りだし、次に緩衝液１で１０００倍に希釈したアルカリ
ホスファターゼＩ識ストレプトアビジン溶液中に、ナイ
ロン膜１００ｃｍ’当り該溶液７ｍｌの割合で１０分間
装いた。続いて、ナイロン膜を緩衝液　１１００ｍｌに
１５分間曝し、同じく佳２回ビオチン化ＤＮＡｇを吸着
したナイロン膜を緩衝液　１　１００ｍ１に１５分間曝
し洗浄した。

更にピオチン化ＤＮＡ鎖を吸着したナイロン膜を取りだ
し、緩衝液２　（０，１Ｍ　　トリス−ｍＭｆｉｆｆｉ
液（ｐＨ９，５）　、０．１ＭＮａＣ１及び５０　ｍ　
Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２からなる緩衝液）１００ｍｌで１
０分間洗浄した。

発色は、０・３３　ｍ　ｇ　／　ｍ　１のニトロブルー
テトラゾリウム（ＮＥＴ）と０．１７ｍｇ／ｍｌの５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドール−リン酸塩（ＢＣ
ＩＰ）を含む緩衝液２（ナイロン膜１００ｃｍ”当り７
．５ｍｌの割合で使用する）中に３０分分間−た。ナイ
ロン膜上に出現した発色スポットを、デンシトメーター
（Ｃ８−９３０、島原製作所製）を用い、波長５５０ｎ
ｍで測定した。

液相系に於ける逆転写酵素反応の１．２．３および２４
時間に於ける反応生成物の面積強度を第２表に示す。

第 表 反 応 時 間 面 積 強 度 ２．３ ７．３ ９．２ この測定条件においては、面積強度が７×１０３以上で
信頼できる測定が可能である。

従って、液相系の逆転写酵素反応では、反応開始後１時
間ではまだ定量性のある十分な面積強度は得られず、開
始後２時間から定量可能な面積強度が得られた。

実施例２ 予め調製した各量鋳型ポリＡと固相化 ｄＴ＋ｏ−２□のハイブリダイズ物における逆転写酵素
反応 実施例１（１）の手法により、オリゴ ｄ　Ｔ　ｌ−２４（平均鎖長：　２１．５塩基、平均分
子量ニア、０９５ダルトン；ファルマシア社製）を固定
した固相化ブライマーに、実施例１（２）の手法に準じ
て１０μｇ、１μｇ、１１００ｎ、Ｌｏｎｇおよびｌｎ
ｇのポリＡをハイブリダイズせしめ、洗浄してハイブリ
ダイズ物を調製した。このハイブリダイズ物に、実施例
１（３）記載のピオチン化−１１−ｄＵＴＰ含有２倍濃
度箔製転写酵素緩衝液に更に０．９６ｎｍｏ１のｄＴＴ
Ｐ　（ベーリンガーマンハイム社製）を添加した混合液
を　５０μｍ添加し、更に０．１ｍＴＪのＲＡＶ−２由
来逆転写酵素を３７°Ｃで１８時間作用せしめた。その
後、実施例１（４）に記載の手法で固相に伸長したビオ
チン化ＤＮＡを測定した。

参考例２ 予めハイブリダイゼーションさせず、逆転写酵素反応開
始時にポリＡを添加した場合の逆転写酵素反応 実施例１（３）に記載した２倍の濃度の反応緩衝液の５
０μｌに、０．２４ｎｍｏｌのピオチン化−１１−ｄＵ
ＴＰおよび０．９６ｎｍｏ１のｄＴＴＰと、１０μｇ、
１μｇ、１１００ｎ、１０ｎｇおよびｌｎｇの各員のポ
リＡとを添加し、これを実施例２で調製したオリゴｄ　
Ｔｌｏ−２ａ固定化プレートの各ウェルに分取した。次
に、同様にＰＢＳにて０゜１ｍＵ１５０μｌに調製した
ＲＡＶ−２逆転写酵素５０μｌを該ウェルに加え、混合
した後、３７°Ｃで１８時間インキュベートして逆転写
酵素を作用せしめた。その後、実施例１（４）に記載の
手法で、固相に伸長したビオチン化ＤＮＡを測定した。

固相化プライマーと各員のポリＡを予めハイブリダイズ
物させた場合（実施例２）と逆転写酵素反応開始時に各
量ポリＡを添加した場合（参考例２）とについて、０．
１ｍＵのＲＡＶ−２由来逆転写酵素を３７°Ｃで１８時
間作用せしめた時に得られた吸光度を第３表に示した。

第　　　３　　　表 （ｎｇ） 実施例２ 参考例２ １　　　　　　０．００９０　　　　０．０２００１０
　　　　　０．０３８０　　　　０．１３６０１００　
　　　　０．２９２０　　　　０．１７３５１．０００
　　　　　０．２ｇ７０　　　０．１５５０１０　００
０　　　　　０．２６５５　　　０．２３２５以上の結
果から、１１００ｎ以上のポリＡを用いる場合には予め
固定オリゴｄ　Ｔｌ９−１４とハイブリダイズさせてお
いた実施例２の方が予めハイブリダイズせしめずに測定
を行なった参考例２より高い感度が得られた。

実施例３ 実施例２により得た固相化オリゴｄＴ ９−２４に実施例１（２）の手法に準じて１１００ｎの
ポリＡをハイブリダイズせしめて洗浄し調製したハイブ
リダイズ物を用い、実施例２に従って、３７°Ｃ１１８
時間逆転写酵素反応を行なった。

この時、ＲＡＶ−２由来逆転写酵素の存在ｉ１をＯ＝　
０．０１．０．０２．０．０４．０．０８、ｏ、１６．
０．３１、　０．６３．１．２５．２．５および５ｍＵ
　（以上、溶液量は各々５０μｌ）として各々実施し、
その後、実施例１（４）に従って吸光度を測定した。

この結果は後記第４表に示す。

参考例３ 実施例１（３）に記載の２箔製度の反応緩衝液５０μｍ
に、０．２４ｎｍｏｌのピオチン化−１１−ｄＵＴＰ、
０．９６ｎｍｏｌのｄＴＴＰ及び１．ＯＯＯｎｇのポリ
Ａとを添加し、これを実施例２にて調製した固相化オリ
ボｄ　Ｔ　ｔ。−２４の各ウェルに分取した。これにＰ
ＢＳにて　５０μｌ溶液量としたＲＡＶ−２由来逆転写
酵素を０，０．０１．０．０２．０．０４．０．０８．
０．１６．０．３１．０．６３．１．２５．２．５およ
び５ｍＵ加え、各添加量で逆転写酵素反応を行なった。

そして実施例１（４）に従って吸光度を測定した。

実施例３および参考例３の測定結果を第４表に示すが、
同表が示すとおり、実施例３では、逆転写酵素が０．０
４ｍＵ位から測定し得るのに対し、参考例３では０．０
８ｍＵにおいても測定しにくいという結果であった。

（以下余白） 第 表 Ｑ　　　　　　　　　Ｑ　　　　　　　　　００．０１
　　　　　０．０１５　　　　０．０１３０．０２　　
　　　０．０２１　　　　０．０２３０．０４　　　　
　０．０ｇ２　　　　０．０２７０．０８　　　　　０
．１５９　　　　０．０６５０．１６　　　　　０．３
５１　　　　０．１２２０．３１　　　　　０．７５２
　　　　０．３０１０．６３　　　　　１゜１６７　　
　　０．６３８１．２５　　　　　２．２３９　　　　
１．８０１２．５　　　　　　２．４７６　　　　２．
１２７５　　　　　　　２．７７７　　　　２．６２５
ネ　λ＝４０５ｎｍ 実施例４ 逆転写酵素反応に至適な固相化オリゴ ｄ　Ｔｌ９−２４量とそれにハイブリダイズするポリＡ
の量 逆転写酵素反応にとって最も効率の良Ｖ）プライマーと
鋳型の実質量比を決定する為に、以下の実験を行なった
。

（１）アミノプレートに結合する実質オリゴｄ　Ｔ１９
−２４量の決定 ■オリゴｄ　Ｔ　１９−２ａの標識 １０μｇのオリゴｄＴＩｏ−２ａを２０μｍの水に溶解
し、これに１０倍の濃度のカイネーション緩衝液　（５
００ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７−，６）、１００
ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１００ｍＭ　　２−メルカプトエタ
ノール）を２μｌ、１０μＣｉ／μｌの［γ−３２Ｐ］
ＡＴＰを１μｌ、２０ユニツト／μｌ　　Ｔ、ポリヌク
レオチドキナーゼを１μｍ添加し、３７℃で３０分イン
キュベートすることにより、オリゴｄ　Ｔ　１Ｇ−２ａ
の５°末端を［γ−３２Ｐ］標識した。３０分後、反応
生成物のうち２ｎｇをペーパ゛−クロマトグラフ法によ
り展開しく展開液は３５０ｔｐＭギ酸アンモニウム）、
濾紙を乾燥後５等分して原点に放射活性があること、即
ちオリゴｄＴが［γ−３２ｐ　］　標識されていること
を確認した。展開し、５等分した濾紙を原点から１．２
．３．４．５と番号をつけ、測定したそれぞれの放射活
性を第５表に示した。

第 表 展開画分番号 放　　射　　活 性 １（原点’）　　　　　　４５８７ 放射活性の９１％は原点、即ちオリゴｄＴ１ト２４の局
在する両分にあり、オリゴｄＴ、。

２４は［γ−３２Ｐ〕標識されたことが確認された。

また第５表から、 ラベル率：　９１％ 比活性：　２．３Ｘ１０’　ｃｐｍ／μｇと計算された
。

残った反応液に更に３０μｌの水を加えて全量を５０μ
ｌとし、これに等量のフェノール（予め１ｍＭＥＤＴＡ
を含む１０ｍＭ　　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）
で飽和させたもの）を加えて撹拌した後、水層を回収し
た。　これに５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムならびに１５
０μｌの冷エタノールを加え、−８０°Ｃで１５分間冷
却した。遠心分ｗｉ後、上清を除き、残ったベレットを
冷７５％エタノールで２回洗浄した。

■オリゴｄ　Ｔ　１９−２ａのアミノ化プレートへの固
定と結合したオリゴｄ　ＴｌＣｌ−２４の定量残ったベ
レット（標識オリゴｄＴ）を真空乾燥し、水で０．１μ
ｇ／μｌになる様に溶解し、これを２　、　ＯＯＯｎ　
ｇ　／　５０　ｕ　ｌ、２００ｎｇ１５０μｌ、２０ｎ
ｇ１５０μｌおよび２　ｎ　ｇ　／　５０μｌとなるよ
うに実施例１（１）記載のＣＤＩとＩＭＤを含む水溶液
で希釈し、その５０μｍをひとつのウェルずつに分断し
たアミノブレートに分注し、室温で２４時間反応させた
。反応後、実施例１（１）の記載通りに洗浄し、ウェル
に残った放射活性を測定した。各標識オリゴｄＴ量を使
用したときにアミノブレートのウェルに残った放射活性
と標識オリゴｄＴの比活性（２，３ｘｌＯ’ｃｐｍ／μ
ｇ）ならびに平均分子量（７，０９５ダルトン）から計
算されるアミノブレートへ結合したオリゴ ｄＴ＋ｏ−２ａ実質量（重量ならびにモル数）を第６表
に示し、またオリゴｄ　Ｔ１９−２４反応液が接触する
ウェルの表面積（０，６３ｃｍ２）から計算される単位
面積当りのオリゴ ｄＴ＋ｏ−２４の結合量を第６表に示す。

（以下余白） 第 表 ２　　　　　　　　＋、６３７　　　　　０．７１　　
　　　０．１００２０　　　　　　１３．００３　　　
　　５．６７　　　　　０．７９９２００　　　　　２
６．５５５　　　　１１．５８　　　　　１．６３３２
、ＯＱＯ４７，７９８２０Ｊ　　　　　　　２．９３３
以上の結果がら、アミノブレートの１ウエルに結合した
オリゴｄＴ、。−２４量は、添加したオリゴｄＴ、。−
２４量に比例して増加し、オリゴｄ　Ｔｌｏ−ｚａミラ
、０００　ｎ　ｇ添加した場合に、２０　ｎ　ｇ　／　
１ウ工ル結合した。

アミノブレートの１ウエルは、底面積 ０．３２ｃｍ２の円柱型であって、オリゴｄ　ＴＩＧＩ
−２４の結合反応の総液量が５０μｍであることから、
オリゴｄＴ’＋ｏ−２ａが結合し得るウェル上の表面積
は０．６３ｃｍ２となり、オリゴｄＴ、。−２４（平均
鎖長：　２１．５塩基）の平均分子量が７．０９５ダル
トンであるがら、ウェル単位表面積当りの結合オリゴｄ
Ｔ量は、４．６５５ｐｍｏ　ｌ／ａｍ２程度までであっ
た。

（２）固相オリゴｄＴにハイブリダイズするポリＡの定
量 ■ポリＡの［γ−３２Ｐ］標識 ５０量ｇのポリＡを１００μｌの水に溶解し、これに実
施例４（１）■に記述した１０倍の濃度のカイネーショ
ン緩衝液を　１０μｌ、１０μＣｉ／μｌの［γ−”Ｐ
ＥＡＴＰを１μｍ、２０ユニツト／μｌのＴ、ポリヌク
レオチドキナーゼを２μｌ添加し、３７℃で３０分イン
キュベートすることにより、ポリＡを［γ−３２Ｐ］標
識した。３０分律、反応生成物の２５量ｇを実施例４（
１）■と同様にペーパークロマトグラフ法により展開し
、展開した濾紙を乾燥後、原点から１ｃｍずつ６等分し
て原点に放射活性があること、即ちポリＡが［γ−３２
Ｐ］標識されていることを確認した。展開し、６等分し
た濾紙を原点から１．２．３．４．５．６と番号をつけ
、測定したそれぞれの放射活性を第７表に示した。

第 表 展開画分番号 （原点） 放 射　　活　　性 （ｃ　ｐｍ） 放射活性の８５．８％は原点、即ちオリゴｄＴ、。−２
４の局在する画分にあり、オリゴｄＴｌＧ−２ａは［γ
−３２Ｐ］標識されたことが確認された。また、第７表
から、 ラベル率：　　８５．８％ 比活性：　１．１４Ｘ１０’ｃｐｍ／μｇと計算された
。

残った反応液を実施例４（１）■にボした方法に従い、
除蛋白、エタノール沈澱した。

■［γ−３２Ｐ］標識ポリＡと固相化オリゴｄＴのハイ
ブリダイゼーション 実施例４（２）■により除蛋白、エタノール沈澱して得
たベレット（１！識ポリＡ）を真空乾燥し、水で１ａｇ
／μｍになるように溶解し、これを１０μｇ７５０μｌ
、１ａｇ１５０μｍ、１００　ｎ　ｇ　／　５０　ｐ　
１、Ｌｏｎｇ１５０μｌおよび１　ｎ　ｇ　／　５０　
μｍとなるように高塩濃度ＴＢＳにて希釈した。実施例
４（１）■で判明した各員のオリゴｄＴ、。

２４が結合したプレートのウェルへ各濃度に希釈した標
識ポリＡを５０μｌ添加し、４℃で１８時間ハイブリダ
イズせしめた後、実施例１（２）の手法に準じてウェル
を５回洗浄し、ウェルに残った放射活性を測定した。各
員のオリゴｄＴ＋ｏ−２ａ固定プレートに各員の標識ポ
リＡを用いてハイブリダイズさせたときのウェルに残っ
た放射活性と標識ポリＡの比活性（１，１４ｘ　１０’
ｃ　ｐｍ／μｇ）ならびに平均分子量（８６，７００ダ
ルトン）から計算される各量固相化オリゴｄ　Ｔｌｙ−
２ａと実際にハイブリダイズした標識ポリ重量（重量な
らびにモル数）を第８表に示し、また、ポリＡ液が接触
する各オリゴｄ　Ｔ　、、２．固定プレートのウェルの
表面積（０，６３ｃｍ２）から計算される単位面積当り
のポリＡのハイブリダイズ量を第９表に示す。

（以下余白） （３）逆転写酵素によるＤＮＡ鎖伸長反応に於ける鋳型
と固相化プライマーの至適量の検討 実施例４（２）■で判明した各社のポリＡと各固相化オ
リゴｄＴ＋ｏ−２４のハイブリダイズ物について、０．
１ｍＵのＲＡＶ−２由来逆転写酵素を用い、実施例２の
手法により逆転写酵素を作用せしめた。実施例１（４）
の手法により伸長したビオチン化ＤＮＡを測定し、逆転
写酵素反応に対して最も感度よく測定できる至適な固定
化オリゴｄＴ、。−２４とポリＡのハイブリダイズ量を
調べた。

各ポリＡと固相化オリゴｄＴ、。−２４量の組み合わせ
のハイブリダイズ物のモル比と、その各モル比で、０．
１ｍＵのＲＡＶ−２由来逆転写酵素を３７°Ｃで１８時
間作用せしめた時に得られた吸光度を第９表に示した。

以上の結果から、信頼し得る最低の吸光度（約０．１程
度）を得る為の固相化オリゴｄＴ１９−２４とポリＡの
至適量は、固相化オリゴｄ　Ｔ　ＩＧ−２−（平均鎖長
：　２１．５塩基、平均分子量７，０９５ダルトン）の
量は５．６ｎｇ（１，２ｐｍｏ　１／ａｍ”）から２０
ｎｇ　（５ｐｍｏｌ／ｃｍ”）程度、好ましくは１１．
５ｎｇ　（２，６ｐｍｏｌ／ｃｍ’）程度であった。

また、この範囲の量の固相化オリゴ ｄＴ、。−２４で０．１程度の吸光度を得る為の固相化
オリゴｄ　Ｔ　１．−２４とハイブリダイズさせるポリ
Ａ（平均鎖長：２５５塩基、平均分子量８６，７００ダ
ルトン）の量は１９ｎｇ（０，３ｐｍｏ　１７ａｍ２）
から５６７ｎｇ（１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２）で、好ましく
は８２ｎｇ　（１，５ｐｍｏｌ／ｃｍ２）であった。

これらの事から、逆転写酵素反応に最も好ましい固相化
オリゴｄ　Ｔ　＋ｏ−２ａ　：ポリＡのハイブリダイズ
量は、１８ｎｇ／ｃｍ”：　１３０ｎ　ｇ　／　Ｃｍ　
２であり、モル比としてはおよそ１：　　０．６であっ
た。

実施例５ ポリＡならびにポリｄＡを鋳型とした 時の逆転写酵素反応 実施例１（１）の手順に準じて調製したオリゴｄＴ、。

−２４固定プレートに、実施例１（２）の手法に準じて
１１００ｎのポリＡ、あるいはポリｄＡをハイブリダイ
ズせしめ、洗浄してハイブリダイズ物を調製した。この
ハイブリダイズ物を用い、実施例２に記載の手法により
１ｍＵ１５０．ｕｌのＲＡＶ−２由来逆転写酵素を３７
°Ｃで１８時間作用せしめ、実施例１（４）の手法によ
り伸長したピオチン化ＤＮＡを測定した。鋳型にポリＡ
およびポリｄＡを使用して逆転写酵素を作用せしめた時
に得られた吸光度を第１０表に示す。

第 表 鋳 型 吸 光 度 ＊ ポリ　Ａ １．５３ ポリｄＡ　　　　　Ｏ，０１２ この様に、ポリｄＡでは逆転写酵素は作用せず、鋳型を
ポリＡにすることで逆転写酵素を特異的に測定すること
が出来た。

実施例　６ 逆転写酵素活性阻止抗体の定量 Ｍｏ１ｔ−４細胞（大日本製薬■より請人）をヒト免疫
不全ウィルス（Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉ
ｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ　；　ＨＩ　Ｖ　）に感染させ、
この細胞を１０％牛脂児血清を添加したＲＰＭＩ−１６
４０培地（ギブコ社製）中、炭酸ガス濃度５％、３７°
Ｃで２週間前後培養した。培養上清を３０，０００ｒｐ
ｍで１時間遠心してウィルス粒子ベレット（１０６個）
を取得し、これを０．５％　トリトンＸ−１００，０，
８ｍＭ　ＮａＣ１，０，５ｍＭ　フェニルメチルスルフ
ォニルフロライド、２０％グリセリン及び５０ｍＭ　ト
リス−塩酸（ｐＨ７゜８）とからなる緩ｉ！ｉ液に懸濁
し、酵素液とした。

一方、ＨＩＶ感染者から得た血清を５０ｍＭエチレンジ
アミン−酢酸緩衝液（ｐＨ７，０）にて２０倍に希釈し
、その１ｍｌをＱＡＥ−セファデックスＡ　−５０カラ
ム（ゲルペット１ｍ１）へ通し、その素通り画分４ｍｌ
を、部分精製した坑道転写酵素抗体として使用した。

最初に、２５μｌの上述した酵素液と２５μｍの抗体原
液、１／１０及び１／１００希釈液あるいはＰＢＳをそ
れぞれ混合し、４°Ｃで３０分間インキュベートした。

実施例１（１）の手順に準じて調製したオリゴｄＴ、、
−□４固定プレートに、実施例１（２）の手法に準じて
１１００ｎ／のポリＡをハイブリダイズせしめ、洗浄し
調製したハイブリダイズ物を用い、実施例２で記述した
手法に従ってこの混合液中に残存している逆転写酵素活
性を測定した。その結果、第１１表に示すような吸光度
が得られ、血清中に存在する坑道転写酵素抗体が定量さ
れた。

第　　　１１　　　表 抗体希釈倍率　　　　吸光度＊ ×１ ×　　　１０ ×　１００ （抗体なし） ０．０　２　１ ０．１８０ ０．５　６　８ １．１７４ ＊ ＾＝４０５ｎｍ 実施例７ オリゴｄＴ鎖長の違いによる逆転写酵 素反応 鎖長がそれぞれ、８．１０．１２．１５．１２〜１８．
１９〜２４．２５〜３ｏおよび２７２のオリゴｄＴ（す
べてファルマシア社製）の２００ｎｇずつを実施例１（
１）に記載した方法でアミノプレートに固定し、実施例
１（２）の記載に準じて１００ｎＨのポリＡを使用して
各固相化オリゴｄＴとハイブリダイズせしめ、洗浄して
それぞれハイブリダイズ物を調製した。各ハイブリダイ
ズ物について、実施例２の条件で０．１ｍＵの逆転写酵
素を作用せしめ、実施例１（４）に記載の方法に準じて
伸長したビオチン化ＤＮＡを測定した。オリゴｄＴの長
さと吸光度の程度の関係を第１２表に示した。オリゴｄ
Ｔ鎖の長さに応じて吸光度は上昇した。鎖の長さは１０
以下においては好ましくはなく、１２以上において好ま
しい結果であり、従って通常、鎖の長さは１１以上で用
いられることが確認された。

第 表 オリゴｄＴ 吸光度本 １２〜１８ １９〜２４ ２５〜３０ ０．０　２　９ ０．０．６２ ０．１１８ ０．１４６ ０．１５２ ０．２　９　１ ０．５０１ ０．６　２　１ 実施例８ ｄＴＴＰ添加量によるビオチン化ＤＮ Ａの検出感度の変化 実施例１（１）の記載に準じて固定したオリゴｄＴ、。

−２４固定プレートに、実施例１（２）の手法によりｔ
ｏｏｎｇのポリＡを使用してハイブリダイズせしめ、こ
れに実施例１（３）で記載した２倍浪度の反応緩衝液４
６μｌを分取した。一方、ビオチン化−１１−ｄＵＴＰ
とｄＴＴＰをその混合モル比でそれぞれ１：０．１：３
．１；４．１：５゜７．１：９．１　：　１２．３．１
：１９、１：２４．１：２９．１：３９．１：４９およ
び１：９９となるように混合し、これらの混合液をビオ
チン化−１１−ｄＵＴＰとｄＴＴＰを併せて最終濃度が
０．３ｍＭになる様に調製した。これらの０．３ｍＭ　
ビオチン化−１１−ｄＵＴＰとｄＴＴＰの混合液をそれ
ぞれ４μｍずつ、前述のポリＡがハイブリダイズしたオ
リゴｄＴ’＋ｏ−２ａ固定プレートに加え、反応緩衝液
と混合した。更にＰＢＳで　１ｍＵ１５０μｍとなる様
に調製したＲＡＶ−２由来逆転写酵素の５０μｌを各ウ
ェルに加え、混合した後に３７℃で１８詩間インキュベ
ートし、実施例１（４）の記述に準じてビオチン化ＤＮ
Ａを定量した。ピオチン化−１１−ｄＵＴＰとｄＴＴＰ
の各混合モル比に於ける吸光度を第１３表に示した。

ビオチン化ｄＵＴＰ：　ｄＴＴＰ　　　吸　光　度１混
合モル比 この結果から明らかなように、ビオチン化−１１−ｄＵ
ＴＰとｄＴＴＰの混合モル比が１：４の時に最も良い感
度が得られた。

以 上 出 願 人 東洋醸造株式会社

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも、水性媒体中で、人為的に調製された
   アデニンリボポリヌクレオチド鋳型ＲＮＡと該アデニン
   リボポリヌクレオチド鋳型ＲＮＡに相補的な固相化され
   たオリゴデオキシチミンヌクレオチドとをハイブリダイ
   ズせしめたハイブリダイズ物と、 ビオチン化デオキシウリジントリホスフェートとを被検
   液の存在下反応せしめ、該反応の反応生成物と未反応の
   ビオチン化デオキシウリジントリホスフェートを分離し
   た後、反応生成物もしくは未反応のビオチン化デオキシ
   ウリジントリホスフェートの量を測定することを特徴と
   する被検液中の逆転写酵素の決定方法。
2. （２）固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチド
   が、オリゴデオキシチミンヌクレオチドの５′末端と固
   相とが化学結合している固相化されたオリゴデオキシチ
   ミンヌクレオチドである請求項第１項記載の決定方法。
3. （３）固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチド
   が、１１塩基以上のヌクレオチド残基からなる請求項第
   １項記載の決定方法。
4. （４）固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチド
   が、１．２ｐｍｏｌ／ｃｍ＾２〜５．０ｐｍｏｌ／ｃｍ
   ＾２であり、アデニンリボポリヌクレオチド鋳型ＲＮＡ
   が、固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチドを
   １としてモル比で３〜０．０７の比でハイブリダイズせ
   しめたものである請求項第１項記載の決定方法。
5. （５）反応に際し、さらにデオキシチミジントリホスフ
   ェートを含有せしめることを特徴とする請求項第１項記
   載の決定方法。
6. （６）少なくとも、水性媒体中で、人為的に調製された
   アデニンリボポリヌクレオチド鋳型ＲＮＡと該アデニン
   リボポリヌクレオチド鋳型ＲＮＡに相補的な固相化され
   たオリゴデオキシチミンヌクレオチドとをハイブリダイ
   ズせしめたハイブリダイズ物と、 ビオチン化デオキシウリジントリホスフェートとを被検
   体液および逆転写酵素の存在下反応せしめ、該反応の反
   応生成物と未反応のビオチン化デオキシウリジントリホ
   スフェートを分離した後、反応生成物もしくは未反応の
   ビオチン化デオキシウリジントリホスフェートの量を測
   定し、この量から被検体液中の逆転写酵素中和抗体価を
   求めることを特徴とする被検者のレトロウイルスの感染
   確認法。
7. （７）固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチド
   が、オリゴデオキシチミンヌクレオチドの５′末端と固
   相とが化学結合している固相化されたオリゴデオキシチ
   ミンヌクレオチドである請求項第６項記載の感染確認法
   。
8. （８）固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチド
   が、１１塩基以上のヌクレオチド残基からなる請求項第
   ６項記載の感染確認法。
9. （９）固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチド
   が、１．２ｐｍｏｌ／ｃｍ＾２〜５．０ｐｍｏｌ／ｃｍ
   ＾２であり、アデニンリボポリヌクレオチド鋳型ＲＮＡ
   が、固相化されたオリゴデオキシチミンヌクレオチドを
   １としてモル比で３〜０．０７の比で混合してハイブリ
   ダイズせしめた請求項第６項記載の感染確認法。
10. （１０）反応に際し、さらにデオキシチミジントリホス
    フェートを含有せしめることを特徴とする請求項第６項
    記載の感染確認法。