WO1997038096A1 - Novel phytase and gene encoding said phytase - Google Patents

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Hideharu Anazawa
Syunichi Kaneko
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Shin Nihon Chemical Co Ltd
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Definitions

  • the present invention relates to a phytic acid for phytic acid which degrades phytic acid as an antinutritional factor contained in feed to improve the nutritional value of the feed and enables efficient use of the phosphoric acid released by the decomposition.
  • the present invention relates to an inexpensive phytase having a small value of Michaelis constant (hereinafter abbreviated as Km), and a gene encoding the phytase.
  • Km Michaelis constant
  • Phosphorus is an essential element for all living things. Plant-derived feed used in livestock production contains phosphorus-containing power, of which 50-70% is present as phytic acid. Phytic acid is abundant in plant seeds and is a major phosphate storage material. However, phytic acid is excreted without being decomposed and absorbed by the digestive system of monogastric animals such as pigs and nits. That is, although phytic acid is a storage material of phosphoric acid, its phosphorus is not used at all. Therefore, phosphoric acid is added to the feed of monogastric animals for the purpose of promoting growth.
  • phytic acid chelates divalent metals such as magnesium, calcium, zinc, and iron, which are important as nutrients, making it difficult for animals to absorb, thereby reducing feed intake. End up with low nutritional value. Therefore, Itic acid is considered a pile nutrient.
  • feed was treated with phytase, which is widely known as an enzyme that hydrolyzes phytate into inositol and inorganic phosphoric acid, to release phosphoric acid from phytic acid.
  • phytase which is widely known as an enzyme that hydrolyzes phytate into inositol and inorganic phosphoric acid, to release phosphoric acid from phytic acid.
  • phytase-producing microorganisms include bacteria such as Bacillus subtilis and Psendomonas, rooster fungi such as Saccharomyces cerevisiae, and Aspergillus' Terius. terreus), filamentous fungi such as "Lus” ficum (Aspergi lus ficcum), and Aspergillus “Amori” (Aspergillus awamori) are known.
  • nucleotide sequence and amino acid sequence are described in Gene, 133, 55-62 (1993).
  • Substrate concentration must be higher than Km value in order to fully utilize the ability of enzyme Yes, given the same maximum reaction rate (Vmax), enzymes with lower K m values do not decrease in reaction rate at lower substrate concentrations as compared to enzymes with higher K m values.
  • an enzyme having a small K m value has the advantage that a sufficient decomposition rate can be maintained even at a low substrate concentration, and the amount of undegraded substrate can be reduced as compared with an enzyme having a large K m value.
  • the present invention relates to a phytase (hereinafter referred to as a novel phytase) having a Michaelis constant of 10 to 30 M using phytic acid as a substrate, a DNA encoding the phytase, and a DNA incorporating the phytase.
  • the present invention relates to a recombinant DNA, a transformant having the recombinant DNA, a method for producing phytase using the transformant, and an animal feed containing the phytase.
  • novel phytase of the present invention include phytases having the following physicochemical properties:
  • 5Substrate specificity phytic acid, p-ditrophenylyl phosphate, D-glucose 6-phosphate, fructose 6-phosphate, D-myo-inositol 1,4,5-triphosphate, glycerol It acts on phosphoric acid and adenosine triphosphate as substrates. 6 Isoelectric focusing; PI 4.7 to 5.4.
  • the present invention also includes a novel phytase having an amino acid sequence in which a secretory signal peptide is bound to the novel phytase described above, such as a novel phytase having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. Can be.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 3 is an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted or added, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 3.
  • Phytase having a homology of 40% or more and having a Km value of 10 to 30 M when phytic acid is used as a substrate can be mentioned.
  • Preferred examples of the enzyme include those having an amino acid sequence of 60% or more homology, and more preferred examples include those having an amino acid sequence of 80% or more homology. Can be given.
  • amino acid substitutions, deletions or additions can be performed according to Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 79, 6409 (1982), Pro atl. , USA, 8i.5662 (1984), Science.224, 1431 (1984) .PCT W085 / 0081 7 (1985), Nature.316.601 (1985), Gene, 34.315 0985), Nucleic Acids Search, 13, 4431 (1985), the current calendar.
  • the method can be carried out according to the method described in, for example, Rotocols 'in' Molecular-Noidology (Current Protocols in Molecular Biology), 8 Mutagenesis of Cloned DNA, John Wiley & Sons, Inc. (1989).
  • the novel phytase can be obtained from a microorganism capable of producing a novel phytase.
  • a microorganism may be any microorganism having the ability to produce a novel phytase, and preferably a microorganism having the ability to produce Aspergillus and producing a novel phytase.
  • FERMBP-54573 Aspergillus niger S K57 strain
  • Aspergillus niger SK92 strain PE RM BP—5) was a mutant derived from Aspergillus niger SK57 strain.
  • the gene encoding the novel phytase according to the present invention may be any gene encoding a novel phytase.
  • SEQ ID NO: 1, 2 or 3 A gene encoding a nucleic acid having the amino acid sequence represented, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or 3 in which one or more amino acids have been substituted, deleted or added. Examples of such a gene include a gene having a sequence and encoding a phytase having a Km value of 10 to 30 M when phytic acid is used as a substrate.
  • the gene may contain an intact mouth in the DNA sequence. Specific examples include SEQ ID NO: 4 and DNAs represented by SEQ ID NO: 5 including introns in the DNA sequence.
  • examples of the novel phytase gene according to the present invention include a DNA having a novel phytase activity and hybridizing with the above-defined DNA under stringent conditions.
  • the DNA that can be hybridized under the stringent conditions is defined as a DNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 or 5, as a probe, by colony hybridisation method, plaque hybridization method. Alternatively, it refers to DNA obtained by using the Southern blot hybridization method or the like. Specifically, using a filter in which DNA derived from colonies or plaques has been immobilized, using 0.7 to OM NaC l After performing hybridization at 65 ° C in the presence of 0.1- to 2-fold concentration of SSC solution (The composition of 1-time concentration SSC solution is 150 sodium chloride, 15 mM Using sodium citrate), and 6
  • DNA that can be identified by washing the filter at 5 ° C can be mentioned.
  • Hybridization is performed by molecular 'cloning: a.
  • DNA having a homology of at least 60% or more preferably a DNA having a homology of 80% or more with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 or 5 as a hybridizable DNA More preferably, DNAs having a homology of 95% or more can be mentioned.
  • the DNA fragment containing the novel phytase gene can be obtained from a microorganism capable of producing a novel phytase.
  • a microorganism capable of producing a novel phytase any microorganism may be used as long as it has the ability to produce a novel phytase.
  • a microorganism belonging to the genus Aspergillus and having the ability to produce a novel phytase is used. More preferably, Aspergillus niger SK57 strain, or a mutant or derivative of these strains can be mentioned. Aspergillus niger SK92 strain can be mentioned as a mutant strain of Aspergillus niger SK57 strain.
  • the chromosome D ⁇ of the microorganism is prepared by the phenol method [Biochim. Biophys. Acta., 72.619 (1963)].
  • the obtained chromosomal DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and the restriction enzyme-cleaved fragment is incorporated into vector DNA to construct a DNA library of the microorganism chromosome.
  • This DNA library is used to transform host microorganisms. From the obtained transformants, a transformant containing a novel phytase gene is selected by a hybridization method. DNA containing the target gene can be obtained from the selected transformant.
  • any phage vector or plasmid vector can be used as long as it can autonomously replicate in Escherichia coli K12 strain. .
  • ZAP Express [Stratagene, Strategies. 5, 58 (1992)].
  • P Bluescript IISK (+) [Nucleic Acids Rese arch. 17. 9494 (1989)]
  • Zap II Gt10.
  • Gtgt11 [DN A Cloning.
  • any microorganism belonging to the genus Escherichia can be used. Specifically, Escherichia col i X Blue Blue MRF '(Stratagene, Strategies.5.81 (1992)), Escherichia col i C600 [Genetics.
  • An example of a probe used in the hybridization method is an oligonucleotide which is obtained by partially determining the amino acid sequence of a novel phytase and synthesizing based on the amino acid sequence information.
  • a phytase gene of a microorganism belonging to a species closely related to a microorganism having the ability to produce a novel phytase has been obtained, the gene may be used as a probe in some cases.
  • the fisperase gene of Aspergillus ficcum there may be mentioned the fisperase gene of Aspergillus ficcum.
  • the Aspergillus ficum phytase gene is prepared according to the method for preparing chromosomal DNA described above, and then a DNA primer is synthesized based on the DNA sequence information of the Aspergillus ficum phytase gene, and polymerase chain reaction is performed. (Polymerase Chain Reaction: PCR) method.
  • DNA primers The synthesis of DNA primers is performed using a commonly used DNA synthesizer, for example, a DNA synthesizer manufactured by Shimadzu Corporation using the thiophosphite method, and a DNA manufactured by Perkin's Elma Inc. using the phosphoramidite method.
  • a synthesizer mode 1 392, Applied Biosystems Co., Ltd. 380 A DNA synthesizer can be used.
  • An example of the DNA primer synthesized in this manner is the DNA shown in SEQ ID NO: 6 or 7.
  • the DNA containing the novel phosphatase gene obtained from the transformant selected by the hybridization method can be used to analyze a DMA containing a commonly used nucleotide sequence, such as the dideoxy method of Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)] to determine the nucleotide sequence of the gene. Wear. Analyze the base sequence using an automatic base sequence analyzer, for example, SQ-5500 DNA Sequencer (Hitachi, Ltd.) or 373A DNA Sequencer (Pakkin Elma) Can also.
  • an automatic base sequence analyzer for example, SQ-5500 DNA Sequencer (Hitachi, Ltd.) or 373A DNA Sequencer (Pakkin Elma) Can also.
  • nucleotide sequence of the novel phytase gene thus determined includes, for example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 or 5.
  • a DNA fragment containing the novel phytase gene is converted into a DNA fragment of an appropriate length containing the novel phytase gene using restriction enzymes or DNA degrading enzymes, and then inserted downstream of the promoter in the expression vector. Then, the expression vector into which the DNA has been inserted is introduced into a host suitable for the expression vector.
  • any host capable of expressing the target gene can be used.
  • filamentous strains belonging to the genus Penicillium yeast strains belonging to the genus Crucibacillus, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Trichosbolon, Schizinomyces, animal cells, insect cells and the like.
  • those which can replicate autonomously in the above-mentioned host or can be integrated into the chromosome and which contain a promoter at a position where the novel phytase gene can be transcribed are used.
  • the novel phytase expression vector When a prokaryote such as a bacterium is used as a host, the novel phytase expression vector must be capable of autonomous replication in a microorganism, and must be composed of a promoter, a ribosome binding sequence, a novel phytase gene, and a transcription termination sequence. Is preferred. Step A gene that controls the mouth motor may be included.
  • expression vectors for example, pKK233-2 (Pharmacia, Inc.), P SE280 (in Bitorojiwen Co.), pGEMEX-1 [Promega (Promega) Co.], pQE-8 (Qiagen (QI AGE N) Ltd.), p K YP Chem., 48.669 (1984)), pLSAl (Agric. Biol. Chem. , 53, 277 (1989)], pGE1 [Pro Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)], pBluescript (STRATAGENE), pTrs30 [Escherichia coli.
  • Escherichia coli containing GHA2 has been deposited as Escherichia coli IGHA2 (FERM BP-400) with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Japanese Patent Laid-Open No. 60-221210].
  • Escherichia coli containing GKA 2 Cp GKA 2 is called Escherichia coli IGKA2 (FERM B-6798), US Patent Application Publication No.
  • JP-A-62-21910 PTerm 2 Japanese Patent Application Laid-Open No. 3-22997, US Pat. , US Pat. No. 5,160,735), pGEX (Pharmacia), pET system (Novagen), pSupex, and the like.
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in a host such as Escherichia coli.
  • i £ 2-bromo-one coater (Pil £), 1 ⁇ promoter one (Pl £) can be mentioned P and promoter, the P R promoter Chief, promoter derived from Escherichia coli or phage, or the like.
  • a promoter (Ptrp 2) in which two Pis are arranged in series, a tac promoter, a T7 promoter, a promoter artificially designed and modified like the Pletl promoter, and the like can also be used.
  • the ribosome-binding sequence it is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 6 to 8 bases).
  • Any novel phytase gene can be used as long as it encodes a novel phytase. Although it can be used, it is preferable to use the DNA sequence of the gene after substituting bases so as to obtain an optimal codon for expression in a host microorganism.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for expression of the present gene, it is desirable to arrange the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • Examples of the host include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Serratia, Coryneocterium, Brevinocacterium, Pseudomonas, Bacillus, and the like, such as Escherichia coli XL. Blue, Escherichia coli XL2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli MCI 000. Escherichia coli MCI 000. Escherichia coli Escherichia col i KY3276.
  • an expression vector for example, P 3SR2 CGene 26, 205-221 ( 1983), pKBY2 CProc Natl Acad Sci USA 82, 834 - « 838 (1985) ], P Sal23 CAgric. Biol. Chem., 5i. 2549-2555 (1987) 3, pSTAl Gen. Genet., 218, 99-104 (1989)), pDJB2 [Gene, 36. 321-331 (198 9)], pLeu4 [Biosci. Biotech. Biochem., 56, 1503-1504 (1992) )) And the like.
  • promoters can be used as long as it can be expressed in the host of the filamentous fungal strain.
  • promoters strongly induced by starch-cellulose such as glucoamylase, ⁇ -amylase of Aspergillus or cellulase of the genus Trichoderma (cellopiohydrase), and phosphoglycerate enzyme, glycolytic enzyme
  • pgk a promoter one promoter such as the glyceraldehyde 3 Hosufuwe one Bok dehydrogenase (g pd).
  • any gene that encodes a novel phytase can be used.
  • the N-type of the novel phytase is used to secrete the novel phytase out of the cells.
  • Examples include a gene encoding a protein having an amino acid sequence in which a peptide having a secretory signal sequence is linked to a terminal amino acid.
  • Examples of the peptide having a secretory signal sequence include glucoamylase of the genus Aspergillus, a secretory signal sequence in ⁇ -amylase, and a peptide having a sequence up to the fourth amino acid sequence of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the like. Can be raised.
  • Aspergillus niger SK57 Aspergillus oryzae
  • Aspergillus oryzae M-2-3 Aspergillus oryzae M-2-3 [Agric. Biol. Chem., 5i, 2549-2555 (1987) )]
  • Aspergilus amori (NRRL3112), Aspergillus nidulans IF04340. Trichoderma reesei Rut—C-30 CAppl. Microbiol. Biotechn. 3 (1984)], Rizopus' Rizopus niveus -37 [Biosci. Biotech.
  • Transformation of filamentous fungi was performed by the method of Gomi et al. CAgric. Biol. Chem., 5i. 2549 (198 7)] and so on.
  • examples of expression vectors include YEp13 (ATCC371I5), YEp24 (ATCC37051), and YCp50 (ATCC37419).
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in a yeast strain host.
  • promoters of glycolytic genes such as hexose kinase, gl1 promoter, gal10 promoter, heat shock protein promoter, MFal promoter, CUP1 promoter and the like can be mentioned.
  • Hosts include Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombej, Kluyveromyces lactis, and Trichosporon-ullans pullusporus. And Schwann iomyces al luvius.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • electroporation Methods. Enzymol., 194.182 (1990)] Natl. Acad. Sci. USA, 84. 1929 (1978)] and the lithium acetate method [ ⁇ Bacteriol., 153. 163 (1983) J].
  • an animal cell is used as a host, as an expression vector, for example, pAGE 107 (Japanese Patent Laid-Open No. 22979; Cytotechnology, 3.133 (1990)), pAS3-3 (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075) ), PCDM8 [Nature, 329.840 (1987)], pc DNA I / Amp (manufactured by Invitrogen), pREP4 (manufactured by Invitrogen) p AGE103 [J. Biochem. Patient, 1307 (1987)], pAGE210 and the like.
  • pAGE 107 Japanese Patent Laid-Open No. 22979; Cytotechnology, 3.133 (1990)
  • pAS3-3 Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075
  • PCDM8 [Nature, 329.840 (1987)]
  • pc DNA I / Amp manufactured by Invitrogen
  • pREP4 manufactured by Invitrogen
  • Any promoter can be used as long as it can be expressed in animal cells.
  • cytomegalovirus (human CMV) IE i. early
  • the promoter of the gene, the early promoter of SV40, the promoter of metallothionein, etc. can be mentioned.
  • the enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • Examples of the host cells include Namalwa cells, human cells, COS cells, monkey cells, CH ⁇ cells, Chinese hamster cells, and HBT5663 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 9 9) and so on.
  • any method can be used as long as ONA can be introduced into animal cells.
  • the calcium phosphate method Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2-227705
  • the ribofection method [: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84. 7413 (1 987) 3 and the like can be used.
  • Acquisition and cultivation of the transformed strain can be carried out according to the method described in JP-A-2-227705 or JP-A-2-257879.
  • an insect cell for example, a baculovirus expression 'Baculovirus expression vector (A Laboratory Manual)', a Les * in-Mole-dried Yura-I. Proteins can be expressed by the method described in Biology Sub34, Bio / Technology, 6, 47 (1988).
  • the recombinant virus is further infected into insect cells to express the protein.
  • the recombinant virus is further infected into insect cells to express the protein.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include pV1392.pVL1333.pBlueBaclII (both from Invitrogen) and the like. .
  • Baculoviruses include, for example, the autographi virus, a virus that infects night moth insects, the 'Californi force, the nucleus, the polyhedrosis' virus (Aut For example, Sf9 and Sf21 which are ovarian cells of Spodoptera f rugiperda (baculovirus expression vectors, alabora) can be used for insect cells that can be used, such as ographa cal i fornica nuclear polyhedrosis virus. Trie's Manual, Doublet's 'Freeman' Freeman and Company, New York, New York (1992), Trichoplus ian_i ovary cells, High 5 (Invitrogen) Manufactured) can be used.
  • the method for co-transfection of the above-described recombinant gene into insect cells and the above-mentioned baculovirus to prepare a recombinant virus includes, for example, the calcium phosphate method.
  • a method for expressing the gene in addition to direct expression, secretory production, fusion protein expression, and the like can be performed according to the method described in Molecular Cloning, Second Edition, and the like.
  • a polypeptide having a sugar or a sugar chain added thereto When expressed by a filamentous fungus, yeast, animal cell, or insect cell, a polypeptide having a sugar or a sugar chain added thereto can be obtained.
  • a microorganism having the ability to produce a novel phytase and a mutant having an improved productivity of a novel phytase from a microorganism having the ability to produce a novel phytase are used. be able to.
  • a mutant strain having an improved productivity of the novel phytase can be obtained by ordinary mutation treatment.
  • a microorganism having the ability to produce a novel phytase, a mutant strain derived from the microorganism, or a transformant having a recombinant DNA incorporating the novel phytase gene is cultured according to a conventional culture method to produce and accumulate the novel phytase.
  • a novel phytase By collecting a novel phytase from the culture, a novel phytase can be produced.
  • the following microorganisms, mutants, and traits used for producing a novel phytase are described below.
  • the conversion break is called a new phytase production organism.
  • the culture medium for culturing the organism includes a carbon source, a nitrogen source, and inorganic salts that can be used by the microorganism.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used as long as the medium can contain the medium and can efficiently culture the transformant.
  • the carbon source may be any one that can be assimilated by each microorganism, such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, acetic acid, propionic acid, etc. Alcohols such as organic acids, ethanol, and propanol are used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, etc., ammonium salts of various inorganic and organic acids, other nitrogen-containing compounds, peptone, meat extract, yeast extract, corn starch. Plyka, casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digests thereof are used.
  • potassium (II) phosphate potassium (II) phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate, etc. are used. .
  • filamentous fungi wheat bran, rice bran, or the like may be used as a carbon source, nitrogen source, inorganic source, etc., and those supplemented with appropriate salts may be used as a medium.
  • the culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature 1 5 to 4 0 e C C., and the culturing time is generally 1 6-9 6 hours.
  • the pH is maintained at 3.0 to 9.0 during culturing, but is preferably maintained at pH 3.0 to 6.5 for culturing filamentous fungi.
  • the pH is adjusted by using an inorganic or organic acid, an alkali solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin-tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • an Indian user may be added to the medium, if necessary.
  • cultivate a microorganism transformed with an expression vector using an iifi promoter such as isopropyl-1- / 3-D-thiogalactopyranoside (IPTG).
  • IPTG isopropyl-1- / 3-D-thiogalactopyranoside
  • IAA indoleacrylic acid
  • the solid component and the filamentous fungus are thoroughly mixed and homogenized, and thinly applied to a large number of aluminum or stainless steel trays. Spread it in the mouth and cultivate it while controlling the temperature, humidity and ventilation. Specifically, static culture is performed in a culture room at a humidity of 100% at 25 to 35 ° C; for 3 to 10 days.
  • the culture medium for culturing the cell may be a commonly used RPM1640 medium, Eag1e MEM medium, or a fetal calf in such medium.
  • a medium or the like to which serum or the like is added is used.
  • the culturing is carried out such 5% C0 2 presence.
  • the culturing temperature is preferably 35 to 37, and the culturing time is usually 3 to 7 days.
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium during the culture.
  • TNM-FH medium Pulsen
  • Sf-90011 SFM medium Gabco BR ExCell 400, ExCell 405 (all manufactured by JRH Biosciences), and the like.
  • the culturing temperature is preferably 25 to 30 C, and the culturing time is usually 1 to 4 days.
  • an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium during the culture.
  • an ordinary enzyme isolation and purification method can be used.
  • the cells in the culture are collected by centrifuging the culture, and the cells are washed with an aqueous buffer or the like. After that, the cells are disrupted using an ultrasonic crusher, French Breath, Menton-Gaurin homogenizer, Dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • a normal enzyme isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Jetylaminoethyl (DEAE) — Sepharose, D 1 A 10N HPA-75
  • the novel phytase When the novel phytase is expressed by forming an insoluble substance in the cells, the cells are similarly collected, crushed, and the novel phytase is obtained by a conventional method from the precipitate fraction obtained by centrifugation. After recovery, the insoluble form of the novel phytase is solubilized with a polypeptide denaturing agent. After diluting the lysate into a solution containing no polypeptide denaturing agent or diluting the concentration of the polypeptide denaturing agent to such an extent that the polypeptide is not denatured, or dialyzing, the novel phytase is formed into a normal three-dimensional structure.
  • a purified sample can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the culture When secreting the novel phytase outside the cells, the culture is treated by a technique such as centrifugation to obtain a soluble fraction.
  • a technique such as centrifugation to obtain a soluble fraction.
  • a novel phytase is extracted with warm water or the like, and then processed by a method such as centrifugation to obtain a soluble fraction. From the soluble fraction, on the cell-free extract A purified enzyme preparation of a novel phytase can be obtained by the same method as the isolation and purification method from sera.
  • the activity of the novel phytase is measured according to the following standard activity measurement method.
  • the Km value of the novel phytase is determined by measuring the activity of the novel phytase when the substrate concentration is changed according to the standard activity measurement method described above, and then obtaining the obtained results using a Lineweave-Burk plot. Can be obtained by
  • novel phytase of the present invention can be used in various processes required for converting phytate into inositol and inorganic phosphoric acid.
  • animal feed for example, soybean processing, liquid feed for pigs and poultry, production of inositol or inositol monophosphate from finphosphate, and the like.
  • animal feeds include the following.
  • the novel phytases of the present invention are mixed with a carrier material such as wheat hull, mixed and dried in a spray tower or fluidized bed.
  • a carrier material such as wheat hull
  • a preservative such as benzoic acid
  • the amount of the novel phytase used in the animal feed is from 100 to 500,000 U, preferably 100 to i000 U, of the novel phytase per kg of the animal feed.
  • FIG. 1 is a diagram showing a restriction enzyme map of a phytase gene derived from Aspergillus niger SK52 strain. In the figure, the arrows indicate the regions encoding the phytase.
  • FIG. 2 is a diagram showing a restriction map of plasmid p ANPHY1.
  • Phytase is a novel phytase gene
  • Amp r represents an Anbishirin resistance gene from p UC 1 1 8. Arrows indicate the direction of gene transcription and translation.
  • FIG. 3 is a diagram of SDS-PAGE electrophoresis when the molecular weight of the novel phytase was measured.
  • FIG. 4 is a diagram of a calibration curve when the molecular weight of the novel phytase was measured.
  • FIG. 5 is a diagram showing the optimal pH of the novel phytase. P showing maximum activity
  • FIG. 6 is a diagram showing the pH stability of the novel phytase.
  • FIG. 7 is a diagram showing the optimum temperature of the novel phytase. The activity at each temperature was shown as a relative activity (%), with the activity value under the temperature condition showing the maximum activity being 100%.
  • FIG. 8 is a diagram showing the temperature stability of the novel phytase. Assuming that the activity value at 4 ° C was 100%, the activity at each temperature was shown as a relative activity (%).
  • FIG. 9 is an electrophoresis diagram showing the isoelectric point of the novel phytase.
  • Example 1 Acquisition of DNA derived from chromosome encoding novel phytase (1) Preparation of bacterial cells of Aspergillus nigaichi SK57 strain
  • malt extract medium 2% malt extract, 2% glucose, 0.1% peptone
  • the SK57 strain was inoculated into the medium, and cultured with shaking at 28 ° (:, 7 days).
  • the culture was filtered through a sterilized glass filter to obtain 0.5 g of cells of the S57 strain.
  • Example 1-1 The cells of the SK57 strain obtained in Example 1-1 were sandwiched between paper towels, compressed and dehydrated. The cells were placed in a mortar cooled to ⁇ 80 ° C., frozen by pouring liquid nitrogen, and then finely crushed with a pestle cooled at ⁇ 80 ° C.
  • the crushed microbial cells were collected in a centrifuge tube, and 0.2 ml of TE buffer [1 OmM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA] was added and suspended. To the suspension was added 0.2 ml of a lysis solution [2% SDS, 0.1 M NaC, 1 OmM EDTA, 5 OmM Tris-HCl (pH 7.0)], and lysed. The lysate was centrifuged at 15,000 rpm (18,500 xg) for 10 minutes at 4, and the supernatant was collected in a new centrifuge tube.
  • a phenol-treated solution a solution of a mixture of phenol, chloroform, and isoamyl alcohol in a ratio of 25: 24: 1
  • a phenol-treated solution a solution of a mixture of phenol, chloroform, and isoamyl alcohol in a ratio of 25: 24: 1
  • a solution treated with black-mouthed form a solution obtained by mixing black-mouthed form and isamyl alcohol in a ratio of 24: 1
  • 4 ° (:, 150,000 rpm The mixture was centrifuged for 10 minutes at 18.50 Xg), and the obtained supernatant was transferred to a new centrifuge tube four times.
  • Aspergillus ficcum NRRL 3 1 3 5 [Acquired from Northern Regional Research Center, United State Department of Agriculture Peoria, Illnois USA (NRRL)] Aspergillus niger SK57 Of phytase was studied.
  • the sense strand primer shown in SEQ ID NO: 6 and the antisense strand primer shown in SEQ ID NO: 7 were manufactured by Applied Biosystems. 380 A ⁇ Synthesized using a DNA synthesizer. PCR was performed using a mixed solution i001 containing the sense strand primer, the antisense strand primer and the genomic DNA of the NRRL315 strain to amplify the phytase structural gene.
  • the PCR consists of a cycle consisting of a reaction process consisting of 92 t for 1 minute, 45 ° C for 2 minutes, and 72 ° C for 3 minutes. Performed 5 cycles.
  • E. coli JM109 purchased from Takara Shuzo was transformed according to a conventional method.
  • the transformed Escherichia coli was transformed into 37 g of an LB medium containing 50 g / m1 sodium ampicillin (Trifluoroton 1%, yeast extract 0.5%, sodium chloride 1%). And cultured all day long.
  • Blasmid was extracted from the cultured cells according to a conventional method, and the brassmid was digested with Ec0RI to recover a 1.7 kb DNA fragment.
  • the 1.7 kb DNA fragment was used as a probe.
  • the membrane was air-dried after the capillary was plotted on a Hybond-N + membrane (manufactured by Amersham) in a 0.4 N sodium hydroxide solution.
  • the membrane was hybridized with ECL direct nucleic acid labeling and detection systems (manufactured by Amersham). Includes 0.5 MNaCl and 5% blocking reagent. ] After immersing in 10 ml for 42 hours, probe solution [Sterile water 7a1 was added to probe 3a1 obtained in Example I-3, and the solution was kept at 95 ° for 5 minutes.
  • the membrane was washed with a primary washing solution (6 M urea, 0.4% SDS, 0.5 XSSC (0.5 OmM sodium chloride and 15 m sodium citrate, 0.5 times composition of SSC solution) Solution)] Washed with 10 Oml at 42 ° C for 20 minutes. After washing, the membrane was washed with a secondary washing solution [0.4% SDS, 0.5 ⁇ SSC] 100 ml at 55 ° C. for 10 minutes, and the washing operation was performed again. After washing, the membrane was washed with 2 XSSC 10 Om 1 at room temperature for 5 minutes, and the washing operation was performed again. The washed membrane was air-dried for 1 minute, and then immersed in 7 ml detection reagent for 1 minute. Quickly wrapped in a saran wrap. This was placed in an X-ray film cassette and exposed for 5 minutes at room temperature using an X-ray film (Fujifilm).
  • a primary washing solution 6 M urea, 0.4% SDS, 0.5 XSSC
  • a DNA fragment strongly hybridizing with the probe was detected at a position of about 4.6 kb.
  • the DNA was cleaved and subjected to 0.8% agarose gel electrophoresis. After electrophoresis, a DNA fragment around 4.6 kb was cut out from the gel, and
  • E. coli vector pUC118 (purchased from Takara Shuzo Co., Ltd.) Add 200 ng of restriction enzyme baI12U [I, react at 37 ° C for 1 hour, cut pUC118 Processing was performed.
  • the above-mentioned DNA fragment of about 4.6 kb was inserted into the cleavage site of the cleavage fragment using a ligase (manufactured by Takara Shuzo) to integrate the chromosomal DNA fragment of Aspergillus' Niger SK57. I got Brasmid.
  • Escherichia coli JMI09 (purchased from Takara Shuzo) was transformed in a conventional manner.
  • the transformed Escherichia coli was cultured overnight at 37 ° C. in an LB medium containing 50 g / m 1 ampicillin sodium. To prepare a replica, the cells were further cultured overnight at 37 on an LB agar medium containing 50 jug / ml of ampicillin sodium (a medium containing 2% agar added to LB medium). The growing colonies were used as a SK57 chromosomal DNA library.
  • colonies from the library were transferred to a membrane filter, and colony hybridization was carried out in accordance with an ECL kit using the probes obtained in Examples 1 to 3 according to a conventional method. Hybridization was performed on thousands of colonies to isolate positive colonies.
  • Plasmid was extracted from the positive colonies obtained in Example 1-6 according to a conventional method.
  • the plasmid was named p ANPHYl.
  • p ANPHY 1 plasmid After digestion of p ANPHY 1 plasmid with various restriction enzymes, agarose gel electrophoresis From this, a restriction enzyme map for an LkI-treated input fragment derived from SK57 chromosomal DNA was prepared (Fig. 1). The imported fragment was 4.6 kb.
  • pANPHY 1 plasmid was digested with various restriction enzymes, separated by agarose gel electrophoresis, and then blotted on a nylon membrane filter. According to the ECL kit, Southern hybridization was carried out using the probe obtained in Example 1-3. The site to which the probe hybridized was located approximately at the center of the insert.
  • the restriction map of p ANPHY 1 and the novel phytase coding region are shown in FIG.
  • the entire nucleotide sequence of the novel phytase gene inserted into PANPHY 1 was determined by the diode oxidase termination method. The sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the intron region in the DNA derived from the chromosome encoding the novel phytase obtained in Example 1 was purified from Asbergillus niger SK57 strain by the following method.
  • RNA extraction Medium is Czapek-D0X, 0.05% magnesium sulfate, 0.001% ferrous sulfate, 0.05% sodium chloride, 0.2% sodium nitrate , 10 glucose, 0.1% corn steep liquor (manufactured by Sanei Saccharification Co., Ltd.) was dissolved in 5 OmM MES buffer, and 10 Om 1 was dispensed into a 500 ml baffled flask and autoclaved. Sterilized (120 ° C, 20 minutes). After sterilization, inoculate one loopful of SK-57 strain from the slant and incubate at 28 ° (: 200 rpm for 5 days with shaking). Collect the cells using a glass filter and a suction bottle. In order to suppress the activity of RNase, it was rapidly frozen with liquid nitrogen and stored at 180 ° C until use. 2 RNA extraction
  • the solution was incubated at 5 (TC for 10 minutes), and then dispensed in lm 1 into an Ebbendorf tube.
  • Chloroform was added to the dispensed solution at a rate of 200 1 and the mixture was shaken. C, the mixture was centrifuged at 15,500 rpm for 15 minutes, and the upper aqueous phase was collected.
  • RNase-free water 5001 of 4 M lithium chloride was added to the aqueous phase, mixed, left at 180 eC for i hours, and then centrifuged at 4 ;, 15,000 rpm for 15 minutes to obtain The obtained precipitate was dissolved in 0.4 ml of sterile water containing no RNase (hereinafter abbreviated as RNase-free water).
  • the precipitate was washed with 75% ethanol, dried appropriately in a vacuum centrifuge, and then dissolved in 0.4 ml of RNase-free water.
  • the precipitate was washed with 75% ethanol and finally dissolved in a total of 0.4 ml of RNase-free water, and used as an RNA sample.
  • phytase cDNA was amplified in the following manner.
  • RTase Buffer 1 Random Primer 11, RNase Inhibitor i 1, and RTase 2 ji 1 included in the T0Y0B0 RT-PCR Kit to the prepared solution, and add PerkinElmer-PJ200 Thermal Cycler.
  • the reaction was carried out at 30 ° C for 10 minutes, at 42 ° C for 20 minutes, at 99t for 5 minutes, and at 4 ° C for 5 minutes.
  • nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 contained one intron (from 44 to 1555).
  • the sequence encodes the amino acid shown in SEQ ID NO: 2 and is obtained from the N-terminal of the amino acid sequence based on the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of the purified novel phytase protein described below. Amino acids up to the second were found to correspond to secretory signal peptides.
  • the host strain (Aspergillus niger SK57, Aspergillus nidulans MD-4 or Aspergillus oryzae M-23) was transformed into DPY medium (2% Dextrin Li down, 1% peptone, 0.5% yeast extract, 0. 5% KH 2 PO " 0. 0 5% M g S 0 7 H z O, p H 5. 5) 3 0 ° with ( : The cells were grown with shaking for 2 to 3 days The grown cells were collected using a 3G1 glass filter and washed with sterile water.
  • the washed cells were filtered and sterilized into a 10 ml solution for preparing a protoplast [5 mg / m 1 Novozyme 2 334, 5 mg / m 1 Cellulase R—10, 0.8 M Na C 10 mM phosphate buffer (pH 6.0)] and shaken gently at 30 ° C for 3 hours. Undegraded mycelium was removed using a 3G3 glass filter, and the obtained filtrate was centrifuged at 700 xg (2,000 rpm) for 5 minutes to obtain a protoplast.
  • the bloat was washed twice with 0.8 M NaC1 and with solution I [0.8 MNaC1, 1 OmM CaC12.5 OmM Tris-HC! (PH 7.5)].
  • the cells were washed once, and suspended in a 4-5 solution I so that the final concentration was 2.5 ⁇ 10 8 cells / m 1.
  • To the suspension was added 15 volumes of solution II [40% (w / v) PEG 400, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5)], and the mixture was used for transformation.
  • a top suspension was prepared.
  • the plasmid p ANPHYl was added to 0.2 ml of the protoplast suspension. l, or pANPHY1101 and p3SR2IuU ⁇ were added, and the mixture was allowed to stand in ice for 30 minutes. Then, 1 ml of Solution II was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 20 minutes. After standing, 10 ml of solution I was added, and the solution was centrifuged at 700 X g for 5 minutes to obtain a precipitate fraction. The precipitate fraction was suspended in 0.2 ml of solution I. ⁇ suspension CD plate medium containing 0.
  • strains with vigorous growth were selected as transformants, and the phytase activity of each transformant was measured.
  • Aspergillus' Niger MH-PA1 strain Aspergillus nidueurans M-PA1, which had high activity, were selected.
  • Strain and Aspergillus oryzae MO—PG3 strain were acquired.
  • Aspergillus niger MH-PA1 strain and Aspergillus nidulans M-PA1 strain were established on January 25, 1996 by the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Institute of Industrial Science and Technology, and Tsukuba East Higashi 1-chome, Ibaraki Prefecture They have been deposited at No. 1-3 (zip code: 2005) as FE RM BP—5 372 and FE RM BP—5 373, respectively.
  • a 500 ml Erlenmeyer flask with 100 g of wheat bran and capped with cotton was sterilized at 120 ° C. for 20 minutes, and then 8 ml of sterilized water was added. After inoculating the medium with the MH-PA1 strain, the flask was shaken to sufficiently mix the mycelium of the MH-PA1 strain with wheat bran, and cultured at 30 ° C for 4 to 5 days.
  • MH-PA1 strain is about the same as SK57 strain shown in Example 6-1. 2. It showed 4 times the production volume.
  • the host Aspergillus nidulans MD-4 strain produced 5 mU of fisidase under the same conditions, while the transformant M-PA1 strain produced 9 OmU, about 1% of the host strain. It was eight times the production volume.
  • a 50 Om1 phytase production medium was filled with a cotton plug, and the Erlenmeyer flask was sterilized with i20 for 20 minutes.
  • the MO-PG3 strain was inoculated into the medium, followed by shaking culture at 28 ° C for 4 to 5 days.
  • the host Aspergillus' oryzae M—23 strain produced 13 mU / ml of phytase, while the transformant M 0—PG3 strain produced 37 mU / m1. The yield was about 29 times that of the host strain.
  • Aspergillus niger SK57 strain in minimal agar medium (2% sucrose, 0.3% sodium nitrate, 0.05% potassium chloride, 0.05% magnesium sulfate, 2% agar , PH 5.5] to form spores.
  • the spores were suspended in 1 Om1 of sterile water.
  • Final 1 0 7 was prepared in sterile water so that spores / m 1, was subjected to mutation treatment using the spore suspension 1 O ml. Mutations were induced by irradiating the spore suspension with ultraviolet and ⁇ -rays to a kill rate of 99%. By this mutation treatment, one phytase high-producing strain was obtained.
  • the production of the new phytase produced by the SK92 strain was about 4.5 times that of the SK57 strain.
  • Transfer SK57 strain which had been previously pure-cultured, to 7,500 kg of wheat bran steamed at 120 ° C for 30 minutes, and use a mixer to mix the mycelium and the bran culture medium sufficiently. Mixed.
  • the mixture was placed in a sterilized 600 mm x 10000 mm aluminum tray in 5 kg / kg pieces at a temperature of 30 ° C and a temperature of 30 ° C in a culture chamber with 100% humidity for 5 days. Then, the SK57 strain was cultured.
  • the culture was transferred to an extraction tank, and 18 tons of warm water was sprayed to collect the phytase extract in a 15 ton tank.
  • the extract was transferred to a vacuum concentration tank (manufactured by Nippon Vacuum Co., Ltd.), concentrated under vacuum 2-3 times, and then 3.5 tons of 95% cold ethanol was added.
  • the impurities insolubilized by this operation were removed by a press filter.
  • the obtained filtrate is filtered using a sterile filter (0.45 mm, manufactured by Nippon Rosy Machine Co., Ltd.). After filtration, 95% cold ethanol was added again for 17.5 tons to insolubilize the novel phytase. The insolubilized phytase was precipitated, and 3 tons of a precipitated fraction containing the novel phytase was obtained.
  • the novel phytase was eluted using acetate buffer E.
  • the eluted fraction was previously subjected to 25 mM Histidine-HC1 buffer [pH 5.8, (Pharmacia) and a new phytase using 10% Polybuffer74-HC1 (pH 4.2, Pharmacia).
  • 25 mM Histidine-HC1 buffer pH 5.8, (Pharmacia)
  • Polybuffer74-HC1 pH 4.2, Pharmacia
  • the novel phytase was purified to a specific activity of 158 U / mg.
  • MH-PA1 strain and M-PA1 strain were cultured, and the liquid fraction (new phytase crude) was obtained from each culture using No. 2 filter paper. Enzyme solution).
  • the eluted fraction was concentrated using an Ultrafilter-1 (Advantec, excluded molecular weight 10,000) and dialyzed.
  • the obtained filtrate fraction was passed through a Toyopearl HW-55F column (2.0 cm x 60 cm) preliminarily equilibrated with 5 OmM acetate buffer E (pH 4.5), The new phytase was eluted with buffer E.
  • the desalted enzyme solution was passed through a Diaion HP A-75 column (5.6 cm ⁇ 3 O cm) previously equilibrated with 5 O mM acetate buffer A (pH 5.5). After washing with acetate buffer A, acetate buffer B containing 0.3 M NaC1 (pH 5.5).
  • the new phytase was eluted using 4.8).
  • the eluted fraction was concentrated using an ultrafilter (Advantech, excluded molecular weight 10,000) and dialyzed.
  • the Toyopearl HW-55 F column (2.10) was obtained by pre-equilibrating the obtained filterase fraction with 5 OmM acetate buffer E (pH 4.5).
  • Example 7-1 to 3 The physicochemical properties of the novel phytase purified and obtained in Example 7-1 to 3 are shown below.
  • Km value The activity was measured according to the standard activity measurement method while changing the substrate concentration within the range of 25 mM from 0.0625. The obtained result was subjected to line-eaver-bark plotting, and the Km value was calculated.
  • the Km values of the novel phytases from Aspergillus niger SK57 strain, Aspergillus niger MH-PA1 strain, Aspergillus nidulans M-PA1 strain and Aspergillus oryzae M ⁇ 1 PG3 strain are 13 respectively. , 30, 20 and 28 M.
  • the Km value of Aspergillus' ficam NRR L3135 strain measured under the same conditions is 197 wM, and the novel phytase of the present invention is the same as the previously known phytase. It was an excellent phytase with an order of magnitude lower Km value.
  • FIG. 3 shows a photograph of SDS-PAGE of a novel phytase derived from Aspergillus nigaichi SK57 strain.
  • the molecular weight of the novel phytase derived from the SK57 strain and the MH-PA1 strain was about 60 kDa in the molecular weight measurement by the SDS-PAGE.
  • the molecular weights of these novel phytases hardly changed even after the removal of sugar chains with end glycosidase H.
  • the molecular weight determined from SEQ ID NOS: 1 and 2 was about 50 kDa, which was almost the same as the value obtained from SDS-PAGE.
  • the novel phytase of the present invention has a maximum pH of 5.0 to 6.5 Showed activity. It was inactive at pH 7.0 or higher.
  • novel phosphatase derived from Aspergillus niga-SK57 strain and ⁇ — ⁇ A1 strain had a residual activity of about 60% or more in the pH range of 45 to 7.5.
  • novel phytases derived from Aspergillus niduulans M-PA1 strain and Aspergillus oryzae M0-PG3 strain had about 70% or more residual activity at pH 8 or less.
  • Optimum temperature The activity at a reaction temperature of 0 to 0 ° C was measured according to the standard activity measurement method.
  • the novel phytase of the present invention showed the maximum activity at 40 to 65 t.
  • Temperature stability 2. Enzyme solution with a protein concentration of 2.1 mg / ml in 100 mM acetic acid / sodium acetate buffer (pH 5.5) for 60 minutes at 0 to 60 ° C. After incubation, the activity was measured according to the standard activity measurement method.
  • a novel phytase derived from Aspergillus niger SK57 strain and Aspergillus niger MH-PA strain 1 shows a relative activity of 70% or more at 30 ° C or lower.
  • the novel phytases from Aspergillus niduulans M-P A1 and Aspergillus ssp. Rize M0-PG3 were stable up to 50 ° C and gradually inactivated above 50 ° C.
  • the novel phytase derived from Aspergillus nidulans MPA1 and Aspergillus oryzae MO—PG3 strain has a sugar chain added thereto.
  • the novel phytase derived from strain SK57 and strain Aspergillus' Niger MH-PA1 is considered to have high temperature stability.
  • Substrate specificity The activity was measured using each substrate prepared at i mM and 1 O mM according to the standard activity measurement method.
  • Table 1 shows the results of the novel phytase derived from Aspergillus niger SK57 strain.
  • the novel phosphatase acted on the substrates shown in Table 1 and had low substrate specificity, but showed almost no activity on substrates other than phytic acid. Similar results were obtained with novel phytases from other strains.
  • Isoelectric focusing AE-3230 electrophoresis apparatus (Atsukasha) using a 3% acrylamide gel (Amph 01 inep H 3.5-10.0, manufactured by Pharmacia) For isoelectric focusing.
  • FIG. 9 shows the results of a novel phytase derived from Aspergillus niger SK57 strain.
  • the isoelectric point (P I) of the phytase was 4.7 to 5.4.
  • the phytic acid is used in the feed to degrade phytic acid as an antinutritional factor contained in the feed, thereby improving the nutritional value of the feed and efficiently utilizing the phosphoric acid released by the decomposition. Can be made possible.
  • Ser Pro Lys lie Asp V l Val lie Ser Glu Ala Ser Thr Ser Asn Asn
  • Glu Trp lie Asn Tyr Asp Tyr Leu Gin Ser Leu Asn Lys Tyr Tyr Gly
  • VVD VDV DVO ODV J ⁇ J ⁇ ⁇ J ⁇ 010 DOO 131 3 ⁇ ⁇ DVO DVV OVO OiD 103 VVD
  • Sequence type Other nucleic acids, synthetic DNA
  • Sequence type Other nucleic acids, synthetic DNA

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Description

明 細 書 新規フィタ一ゼおよび該フィターゼをコ一ドする遺伝子 技術分野
本発明は、 飼料中に含まれる抗栄養因子としてのフィチン酸を分解し、 飼料の 栄養価値を向上させると共に、 該分解により遊離したリ ン酸の効率よい利用を可 能とさせる、 フィチン酸に対するミカエリス定数 （以下、 K mと略す） の値が小 さく安価なフィターゼ、 および該フィタ一ゼをコ一ドする遺伝子に関する。 景技術
リンは、 全ての生物に必須の元素である。 家畜生産に使用されている、 植物由 来の飼料には、 リンが含まれている力、'、 そのうち 5 0〜 7 0 %がフイチン酸とし て存在している。 フィチン酸は、 植物種子に多量に存在しリ ン酸の主要な貯蔵物 質である。 しかし、 フィチン酸は、 豚、 ニヮト リ等の単胃動物の消化器で分解、 吸収されずに排出されてしまう。 即ち、 フィチン酸はリ ン酸の貯蔵物質であるに もかかわらず、 そのリンは全く利用されていない。 従って、 単胃動物の飼料には- 生育促進の目的で、 リ ン酸が添加されている。
飼料へのリン酸の添加は、 排泄物中のリ ンの量をも増加させることになる。 近 年、 家畜生産が著しく増加するに伴い、 家畜の排泄物も増大し、 世界中で環境問 題を起こしている。 特に、 排泄物中に含まれるリ ンは、 湖沼の富栄養化現象を引 き起こす原因に上げられ、 排泄物中のリ ンの量が規制されるようになり、 対処の 必要が生じている。
さらに、 排泄されるリンの問題とともに、 フイチン酸は、 栄養源として重要な マグネシウム、 カルシウム、 亜鉛、 鉄等の 2価の金属類をキレート化し動物に吸 収されにく く してしまい、 飼料を栄養価値の低い物としてしまう。 そのため、 フ イチン酸は、 杭栄養因子と考えられている。
以上のことから、 フイチン酸塩をィノシ卜一ルと無機リ ン酸に加水分解する酵 素として広く知られているフィターゼを用いて飼料を処理し、 フィチン酸より リ ン酸を遊離させ、 該遊離リン酸を、 これまで添加していたリン酸の代わりに利用 し、 排泄物中のリ ンの量を減少させること、 および、 抗栄養因子としてのフイチ ン酸を分解することによる飼料の栄養価値の向上が検討されている 〔米国特許第
3, 297, 548号 ( 1967) 、 J. Nutrition, 皿， 1289-1294 (1971) 〕 。
フィターゼを生産する微生物としては、 枯草菌 (Baci l lus subti l is) および シユードモナス (Psendomonas) 等のバクテリア、 サヅカロマイセス . セレビジ ェ (Saccharomyces cerevisiae) 等の酉 母菌、 およびァスペルギルス ' テリ ウス (Aspergi 1 lus terreus ) 、 Ύスぺノレキ"ルス ' フイカム (Aspergi 1 lus f i ccum) 、 ァスペルギルス ' ァヮモリ (Aspergillus awamori) 等の糸状菌等が知られてい る。
ァスベルギルス · フィカム由来のフィターゼに関して、 精製操作および生化学 的性質については Preparative Biochem. , 18. 443-458 ( 1988) に、 フィ ターゼ 遺伝子およびアミ ノ酸配列については Gene, 127. 87-94 ( 1993) に記載されて いる。
ァスペルギルス · ァヮモリ由来のフィタ一ゼに関しては、 塩基配列およびァミ ノ酸配列が Gene, 133, 55-62 ( 1993) に記載されている。
また、 これまでに知られているフイタ一ゼのミカエリス定数 （Km) の値は、 Wheat Branの 0. 5 7 mM 〔Agr. Biol. Chem.， 26, 794-803 (1962) 3 、 Rice B ranの 0. 1 7 mM (Agr. Biol. Chem., 53, 1475-1483 (1898) 、 maize(Zea m ays)の 1 I 7 M、 Aspergi llus ficcumの 2 5 0 w M (WO 91/05053) 、 Aspergi 1 lus oryz36の 3 3 0 ju M、 Baci 1 lus subt i Hsの 1 5 0 M、 Baci 1 lus nattoの 5 0 0 M、 Escherichia col iの 1 3 0 w Mである。
酵素が持つ能力を充分に発揮するためには、 基質濃度が Km値より高い必要が あり、 最大反応速度 （V max) が同じであれば、 K m値の小さい酵素は、 K m値 の大きい酵素と比較して、 基質濃度が低くなつても反応速度は減少しない。
即ち、 K m値の小さい酵素は、 低い基質濃度でも、 充分な分解速度を保つこと ができ、 K m値の大きな酵素と比較して分解されない基質残量を少なくできる利 点を持つ。
飼料中に含まれる抗栄養因子としてのフィチン酸を分解し、 飼料の栄養価値を 向上させると共に、 該分解により遊離したリン酸の効率よい利用を可能とさせる、 フィチン酸に対する K m値が小さく安価なフィ タ一ゼが求められている。 発明の開示
本願発明は、 フイチン酸を基質としたとき 1 0 ~ 3 0 Mのミカエリス定数を 有するフィ夕一ゼ （以下、 新規フイタ一ゼという） 、 該フィターゼをコ一ドする D N A、 該 D N Aを組み込んだ組換え体 D N A、 該組換え体 D N Aを保有する形 質転換体、 該形質転換体を用いたフィターゼの製造法および該フィターゼを含有 する動物用飼料に関する。
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明の新規フィターゼに含まれる具体例としては、 下記の物理化学的性質を 有するフィターゼ
① K m値； 1 0〜 3 0 w Mである。
②分子量 （ S D S— P A G E法） ： エン ドグリコシダーゼ H処理後の分子量は 約 6 0 k D aである。
③至適 pH； p H 5 . 0 ~ 6 . 5である。
④至適温度： 4 5〜6 5 tで最大活性を示す。
⑤基質特異性： フィチン酸、 p—二トロフヱニルリ ン酸、 D—グルコース 6 一リ ン酸、 フラク トース 6—リ ン酸、 D—ミオ一イ ノシ トール 1 , 4 , 5—三 リン酸、 グリセロールリ ン酸およびアデノシン三リ ン酸を基質として作用する。 ⑥等電点電気泳動； P I 4. 7〜 5. 4である。
あるいは、 配列番号 1または 2に示したアミ ノ酸配列を有する蛋白質等が挙げれ る。
また、 上記記載の新規フィターゼに分泌シグナルべプチドの結合したァミ ノ酸 配列を有する新規フィターゼも本発明に含まれ、 例えば、 配列番号 3で表される ァミノ酸配列を有する新規フィターゼをあげることができる。
さらに、 配列番号 1、 2または 3で表されるアミノ酸配列とは一個以上のァミ ノ酸が置換、 欠失または付加したアミノ酸配列で、 配列番号 1、 2または 3で表 されるアミノ酸配列と 4 0%以上の相同性を有し、 かつフィチン酸を基質とした とき 1 0〜 3 0 Mの Km値を有するフィ タ一ゼをあげることができる。 該フィ 夕一ゼの好ましい例としては、 6 0%以上の相同性のアミ ノ酸配列を有するもの をあげることができ、 更に好ましい例としては、 8 0 %以上の相同性のアミ ノ酸 配列を有するものをあげることができる。
ここで、 アミノ酸の置換、 欠失または付加は、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci. , USA. 79, 6409(1982)、 Pro atl. Ac ad. Sci., USA, 8i.5662 (1984)、 Science. 224, 1431 (1984). PCT W085/0081 7(1985)、 Nature. 316. 601 (1985)、 Gene, 34. 315 0985)、 Nucleic Acids Re search, 13, 4431 (1985)、 カ レン ト ' フ。ロ トコールズ ' イン 'モレキュラー - ノヽィォロジ一 (Current Protocols in Molecular Biology) , 8早 Mutagenesis of Cloned DNA, John Wiley & Sons, Inc. (1989)等に記載の方法に準じて実施す ることができる。
また、 該新規フイターゼは、 新規フイタ一ゼを生成する能力を有する微生物よ り取得することができる。 このような微生物としては、 新規フィターゼを生成す る能力を有する微生物であればいずれでもよいが、 好ましくは、 ァスペルギルス 厲に厲し、 かつ、 新規フィタ一ゼを生成する能力を有する微生物をあげることが できる。 さらに好ましくは、 ァスペルギルス 'ニガ一 (Aspergillus niger) S K 5 7株 （F E RM B P— 5 4 7 3 ) あるいは、 これらの菌株の突然変異株も しくは誘導体をあげることができる。 ァスペルギルス '二ガー S K 5 7株から誘 導された変異株としてァスペルギルス · 二ガー S K 9 2株 （P E RM B P— 5
4 8 1 ) を挙げることができる。
本発明にかかわる新規フィターゼをコードする遺伝子 （以下、 新規フイタ一ゼ 遺伝子と呼ぶ） としては、 新規フイタ一ゼをコードする遺伝子であればいずれで もよく、 例えば、 配列番号 1、 2または 3で表されるアミノ酸配列を有するフィ 夕一ゼをコードする遺伝子、 あるいは、 配列番号 1、 2または 3で表されるアミ ノ酸配列とは一個以上のアミノ酸が置換、 欠失または付加したアミ ノ酸配列を有 し、 かつフィチン酸を基質としたとき 1 0〜3 0 Mの Km値を有するフィター ゼをコ一ドする遺伝子をあげることができる。 遺伝子の DN A配列中にィント口 ンを含んでいてもよい。 具体的には、 配列番号 4や DN A配列中にイントロンを 含む配列番号 5で示される DN A等をあげることができる。
さらに、 本発明にかかわる新規フィターゼ遺伝子として、 新規フイタ一ゼ活性 を有し、 且つ、 上記で定義される DN Aとス卜リ ンジヱン卜な条件下でハイプリ ダイズする DN Aをあげることができる。
該スト リンジヱン卜な条件下でハイブリダイズ可能な D N Aとは、 配列番号 4 または 5に示した塩基配列を含む DN Aをプローブとして、 コロニー .ハイプリ ダイゼ一シヨン法、 プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法あるいはサザンブロッ トハイプリダイゼーション法等を用いることにより得られる D N Aを意味し、 具 体的には、 コロニーあるいはプラーク由来の DN Aを固定化したフィルターを用 いて、 0. 7〜に O MのNa C l存在下、 6 5 °Cでハイブリダィゼ一シヨ ンを 行った後、 0. 1倍〜 2倍濃度の S S C溶液 （ 1倍濃度の S S C溶液の組成は、 1 5 0 塩化ナト リウム、 1 5 mMクェン酸ナト リウムよりなる） を用い、 6
5 °C条件下でフィルタ一を洗浄することにより同定できる D N Aをあげることが できる。 ハイブリ ダィゼーショ ンは、 モレキュラー ' クローニング： ァ . ラボラ 卜 リ一
•マ二ユア レ (Molecular Cloning, A laboratory manual) 第 2版 〔サンフ レツ ク（Sambrook)、 フ リ ッチ（Fri tsch) 、 マニアチス（Maniat is)編集、 コールド ' ス プリ ング 'ハーバ一 · ラボラ トリー ' プレス （Cold Spring Harbor Laboratory Press), i 9 8 9年刊、 以下、 モレキュラー ' クローニング 第 2版と略す〕 等 に記載されている方法に準じて行うことができる。 ハイプリダイズ可能な D N A として具体的には、 配列番号 4または 5に示した塩基配列と少なく とも 6 0 %以 上の相同性を有する DN A、 好ましくは 8 0 %以上の相同性を有する DN A、 更 に好ましくは 9 5 %以上の相同性を有する D N Aをあげることができる。
該新規フィタ一ゼ遺伝子を含む DN A断片は、 新規フィターゼを生成する能力 を有する微生物より取得することができる。 このような微生物としては、 新規フ ィ夕一ゼを生成する能力を有する微生物であればいずれでもよいが、 好ましくは、 ァスペルギルス属に厲し、 かつ、 新規フイタ一ゼを生成する能力を有する微生物 をあげられ、 さらに好ましくは、 ァスペルギルス ♦ニガ一 (Aspergillus nige r) S K 5 7株あるいは、 これらの菌株の突然変異株もしくは誘導株をあげるこ とができる。 ァスペルギルス '二ガー S K 5 7株の突然変異株としてァスペルギ ルス · ニガ一 S K 9 2株をあげることができる。
ァスペルギルス ·ニガ一 S K 5 7株は平成 8年 3月 2 2日付けで、 ァスペルギ ルス ·二ガー S K 9 2株は平成 8年 3月 1 1日付けで工業技術院生命工学工業技 術研究所、 茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 ) にそれぞれ F E RM B P— 5 4 7 3ぉょび £ 1¾1^ B P— 5 4 8 1 として寄託されている。 さらに、 本発明の動物用飼料として、 新規フィターゼを含む動物用飼料をあげ ることができる。
以下に、 新規フィタ一ゼを生成する能力を有する微生物由来のフィターゼ遺伝 子の取得方法を記す。
新規フイターゼを生成する能力を有する微生物から、 通常の DN A単離法、 例 えばフヱノール法 [Biochim. Biophys. Acta. , 72. 619 (1963)) により、 該微 生物の染色体 D Ν Αを調製する。 得られた染色体 D N Aを適当な制限酵素により 切断し該制限酵素切断断片をべクター D N Aに組込むことにより、 該微生物染色 体の DN Aライブラリーを構築する。 この DN Aライブラリーを用いて宿主微生 物を形質転換する。 得られた形質転換体からハイプリダイゼ一ション法により、 新規フィタ一ゼ遺伝子を含む形質転換体の選択を行う。 選択された形質転換体よ り目的とする遺伝子を含む DN Aを得ることができる。
この一連の操作は、 公知の in vitro組換え技法 (モレキュラー . クローニング 第 2版） に準じて行うことができる。
新規フィターゼを生成する能力を有する微生物の染色体 DN Aライブラリーを 構築するベクター DN Aとしては、 大腸菌 K 1 2株において自律複製できるもの であれば、 ファージベクタ一、 プラスミツ ドベクターなどいずれでも使用できる。 具体的には、 ZAP E x p r e s s 〔ストラタジーン社製、 Strategies. 5, 5 8 (1992)] . p B l u e s c r i p t I I S K ( + ) [Nucleic Acids Rese arch. 17. 9494 (1989)〕 、 ス z a p I I (ストラタジーン社製） 、 ス g t 1 0. Λ g t 1 1 〔DN A クロ一ニン グ、 ァ 'プラクティカル . アプローチ （DN A Cloning. A Pract ical Approach) , 丄， 49 (1985)〕 、 L amb d a B l u e M i d (クローンテツク社製） 、 λ E x C e 1 1 (フアルマシア社製） 、 p T 7 T 3 1 8 U (フアルマシア社製） 、 p c D 2 〔Mol. Cell. Biol., 280 (19 83)] および p UC 1 8 CGene. 33. 103 (1985)3 等をあげることができる。 宿主微生物としては、 エツシヱリ ヒア属に属する微生物であればいずれでも使 用することができる。 具体的には、 Escherichia col i Xし卜 Blue MRF' 〔ストラタ ジーン社製、 Strategies. 5. 81 (1992)〕 、 Escherichia col i C600 [Genetics. 39, 440 (1954)3 、 Escherichia col i Y1088 [Science. 222. 778 (1983) ) 、 Escherichia coli Y1090 [Science, 222. 778 (1983)〕 、 Escherichia coli NM5 22 〔上 ol. Biol.. 166, 1 (1983) ) 、 Escherichia coli K802 [J. Mol. Bio I.. 16. 118 (1966) ] および Escherichia col i J 105 [Gene, 38, 275 (198 5) 3 、 Escherichia col i J画 9、 Escherichia col i XU- Blue、 Escherichia col 丄 XL2-Blue、 Escherichia col i DHL Escherichia col i MC 1000等があげられる。 新規フィターゼ遺伝子を含む形質転換体はハイプリダイゼーショ ン法により選 択できる。
ハイブリダイゼ一ション法に使用するプローブとしては、 新規フィタ一ゼのァ ミノ酸配列を部分的に決定し、 該アミノ酸配列の情報を基に合成したオリゴヌク レオチドをプローブとしてあげることができる。 また、 新規フィターゼを生成す る能力を有する微生物に近縁の種に属する微生物の、 フィターゼ遺伝子が取得さ れている場合には、 該遺伝子をプローブとして利用できる場合もある。 このよう なプローブとして利用できる遺伝子として、 ァスペルギルス ' フィカム (Asperg illus f iccum) のフィ夕一ゼ遺伝子をあげることができる。
ァスペルギルス · フィカムのフィターゼ遺伝子は、 前述の染色体 DN Aの調製 法に準じて調製後、 ァスペルギルス · フィカムのフイタ一ゼ遺伝子の DN A配列 の情報を基に DN Aプライマーを合成し、 ポリメラーゼチヱインリアクション (Polymerase Chain Reaction: P C R) 法により増幅し取得することができる。
DN Aプライマーの合成は、 通常用いられる D N A合成機、 例えば、 チォホス フアイ ト法を利用した島津製作所社製の DN A合成機、 フォスフォアミダイ ト法 を利用したパーキン 'エルマ一社製の DN A合成機 m o d e 1 3 9 2、 アプライ ド ·バイオシステムズ社製 3 8 0 A · DN A合成機等を用いて行うことができる。 このようにして合成された DN Aプライマ一として、 例えば、 配列番号 6または 7に示された D N Aをあげることができる。
ハイプリダイゼーショ ン法により選択された形質転換体より得られた新規フィ 夕ーゼ遺伝子を含む DMAを、 通常用いられる塩基配列分析方法、 例えばサンガ 一 (Sanger) らのジデォキシ法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 74, 5463 (197 7)〕 等によって分析することによって、 該遺伝子の塩基配列を決定することがで きる。 塩基配列の分析を、 塩基配列自動分析装置、 例えば S Q— 5 5 0 0 D N Aシークェンサ一 （日立製作所社製） あるいは 3 7 3 A · D N Aシークェンサ一 (パ一キンエルマ一社製） を用いて行うこともできる。
このようにして決定された新規フィターゼ遺伝子の塩基配列として、 例えば配 列番号 4または 5に示された塩基配列をあげることができる。
上記のようにして得られる新規フィターゼ遺伝子を宿主中で発現させるために、 モレキュラー ' クローニング 第 2版や力レン卜 'フ 'ロ トコールズ ·イン 'モレ キユラ一 'バイオロジー サブルメント 1〜 3 4等に記載された方法等を用いる ことができる。
まず、 新規フィタ一ゼ遺伝子を含む D N A断片を、 制限酵素類あるいは D N A 分解酵素類で、 新規フィターゼ遺伝子を含む適当な長さの D N A断片とした後に、 発現べクタ一中プロモーターの下流に挿入し、 次いで上記 D N Aを挿入した発現 ベクターを、 発現ベクターに適合した宿主中に導入する。
宿主としては、 目的とする遺伝子を発現できるものは全て用いることができる。 例えば、 エツシヱリ ヒア属、 セラチア厲、 コリネバクテリウム属、 ブレビバクテ リウム属、 シユードモナス属、 バチルス属、 ミ クロバクテリゥム厲等に属する原 核生物、 ァスペルギルス属、 リゾブス属、 ト リコデル 属、 ノィロスボラ厲、 ム コール属、 ぺニシリウム属等に属する糸状菌株、 クルイべ口ミセス属、 サッカロ マイセス属、 シゾサッカロマイセス属、 ト リコスボロン属、 シヮニォミセス属等 に属する酵母菌株、 動物細胞、 昆虫細胞等をあげることができる。
発現ベクターとしては、 上記宿主において自立複製可能ないしは染色体中への 組込みが可能で、 新規フィターゼ遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有 しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主として用いる場合は、 新規フィターゼ発現べクタ一は 微生物中で自立複製可能であると同時に、 プロモーター、 リボソーム結合配列、 新規フイターゼ遺伝子、 転写終結配列、 より構成されていることが好ましい。 プ 口モーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、 例えば、 pKK233-2 (フアルマシア社） 、 PSE280 (イン ビトロジヱン社） 、 pGEMEX-1 〔プロメガ（Promega)社〕 、 pQE-8 (キアゲン（QI AGE N)社） 、 p K YP 1 0 ( 特開昭 5 8— 1 1 0 6 0 0 ) 、 ρ Κ Υ Ρ 2 0 0 [Agric. Biol. Chem. , 48. 669 (1984)) 、 p L S A l (Agric. Biol. Chem. , 53, 277 (1989)〕 、 p GEし 1 [Pro Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985) ] 、 pB luescript (STRATAGENE社） 、 p T r s 3 0 〔ェシヱ リ ヒア . コ リ JM109/pTrS3 0 (F E RM B P— 5 4 0 7 ) より調製〕 、 p T r s 3 2 [ェシヱ リ ヒア . コ リ JM109/pTrS32 (F E RM B P— 5 4 0 8 ) より調製〕 、 p G H A 2 〔 p G H A 2を含む大腸菌は Escherichia col i IGHA2 (FERM BP- 400)として工業技術院 生命工学工業技術研究所に寄託されている、 特開昭 6 0 - 2 2 1 0 9 1 ] . p G K A 2 Cp GK A 2を含む大腸菌は Escherichia col i IGKA2 (FERM B-6798)とし て工業技術院生命工学工業技術研^所に寄託されている、 特開昭 6 0 - 2 2 1 0 9 1 P T e r m 2 (特開平 3— 2 2 9 7 9、 U S 4 6 8 6 1 9 し U S 4 9 3 9 0 9 4、 U S 5 1 6 0 7 3 5 ) 、 p G EX (Pharmacia社） 、 p ETシステ ム （Novagen社） 、 p S u p e x等を例示することができる 。
プロモーターとしては、 大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいかなる ものでもよい。 例えば、 i£2ブロモ一ター （Pil£) 、 1 ^プロモータ一 （Pl £) 、 Pしプロモーター、 PRプロモータ一等の、 大腸菌やファージ等に由来するプロモー ターをあげることができる。 また Pi££を 2つ直列させたプロモーター ( Ptrp 2 ) 、 tacプロモーター、 T7プロモーター、 Pletlプロモータ一のように人為的 に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
リボソーム結合配列としては、 シャイン一ダルガノ （Shine- Dalgarno) 配列と と開始コ ドンとの間を適当な距離 （例えば 6〜 8塩基） に調節したブラスミツ ドを用いることが好ましい。
新規フィターゼ遺伝子は新規フィタ一ゼをコードする遺伝子であればいずれも 用いることができるが、 該遺伝子の D N A配列を宿主微生物での発現に最適なコ ドンとなるように、 塩基を置換して用いることが好ましい。
本遺伝子の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、 好適には構造遺 伝子直下に転写終結配列を配置することが望ましい。
宿主としては、 ェシヱ リ ヒア属、 セラチア属、 コ リネノくクテリ ゥム属、 ブレビ ノくクテリウム属、 シユードモナス属、 バチルス属等に属する微生物、 例えば、 ェ シエリ ヒア ' コリ (Escherichia col i) XL卜 Blue 、 ェシヱ リ ヒア ' コ リ （Escheri chia col i )XL2- Blue、 ェシヱ リ ヒア ' コ リ (Escherichia col i )DH1 、 ェシェ リ ヒア ■ コ リ (Escherichia col i) MCI 000. ェシエ リ ヒア ' コ リ (Escherichia col i) KY3276. ェシエリ ヒア · コ リ (Escherichia coli) 1485, ェシヱ リ ヒア ' コ リ （Es cherichia col i) JM109、 ェシヱリ ヒア · コ リ (Escherichia col i) HB10 ェシェ リ ヒア ' コリ (Escherichia coli)No.49, ェシエリ ヒア ' コリ (Escherichia col 丄) W3110、 ェシエ リ ヒア ' コリ (Escherichia coli)NY49、 バチルス ' ズブチリス (Baci 1 lus subti 1 is) 、 バチルス ' アミ口リ クエファシェンス（Baci 1 lus amylol ines) 、 フ レヒノヾノ 7"リウム - イマリ才フィ フム (Brevi bac ter i um i mmar iophilum) ATCC14068, ブレビバクテリ ウ厶 · サッカロ リティカム (Brevibacteri um saccharolyticum) ATCC14066 ブレビバクテリ ウ厶 ' フラバ厶（Brevibacteri 届 flavum)ATCC14067、 ブレビバクテリ ウム · ラク トフェルメ ンタ厶（Brevibacte rium lactofermentum) ATCC 13869, コ リネバクテリ ゥ厶 ' グルタミ クム（Corv_neba cterium glutamicum) ATCC 13032 、 コ リネバクテリ ゥム . ァセ トァシ ドフイラ厶 (Corynebacter ium acetoacidophi lum) ATCC 13870 、 ミ クロノくクテリ ゥム . アンモ 二ァフィラム ( icrobacterium amnion iaphi lum) ATCC 15354 等を挙げることができ る。
糸状菌株を宿主として用いる場合には、 発現ベクターとして、 例えば、 P3SR2 CGene. 26, 205-221 (1983) 、 pKBY2 CProc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 834 - 838 (1985)〕 、 PSal23 CAgric. Biol. Chem. , 5i. 2549-2555 (1987) 3 、 pSTAl 4 CMo!. Gen. Genet., 218, 99-104 (1989) ) 、 pDJB2 [Gene, 36. 321-331 (198 9)〕 、 pLeu4 [Biosci. Biotech. Biochem. , 56, 1503 - 1504 (1992) ) 等の発現べ クタ一を例示することができる。
プロモーターとしては、 糸状菌株の宿主中で発現できるものであればいかなる ものでもよい。 例えば、 ァスペルギルス厲のグルコアミラーゼ、 α—アミラーゼ あるいは卜リコデルマ属のセルラ一ゼ （セロピオヒドラ一ゼ） などデンプンゃセ ルロースで強く誘導されるプロモーター、 解糖系酵素のホスホグリセレー卜キナ
—ゼ（pgk)、 グリセルアルデヒド 3—ホスフヱ一卜デヒ ドロゲナーゼ（gpd)のプロ モーター等のプロモータ一をあげることができる。
新規フィターゼ遺伝子としては、 新規フィ夕一ゼをコ一ドする遺伝子であれば いずれも用いることができるが、 好ましくは、 新規フィタ一ゼを菌体外へ分泌さ せるために、 新規フィターゼの N末端アミ ノ酸に分泌シグナル配列を有するぺプ チドの結合したァミノ酸配列を有する蛋白質をコードする遺伝子をあげることが できる。 分泌シグナル配列を有するペプチドとしては、 ァスペルギルス属のグル コアミラーゼ、 α—アミラーゼにおける分泌シグナル配列、 配列番号 2に示され たァミノ酸配列の 1力、ら 2 4番目までの配列を有するぺプチド等をあげることが できる。
宿主としては、 ァスペルギルス · 二ガー（Aspergillus niger) S K 5 7 、 （ァ スぺ レキ レス - 才リセ ') Aspergillus oryzae M - 2 - 3 [Agr ic. Biol. Chem. , 5i, 2549-2555 (1987)] 、 ァスペルギルス · フィカム（Aspergi I lus ficcum) NRRL313
5 、 ァスペルギルス · ァヮモリ （Aspergi 1 lus awamori) NRRL3112 、 ァスペルギ ルス · ニデユランス（Aspergillus nidulans) IF04340 . 卜 リ コデルマ ' リーゼ ィ (Trichoderma reesei) Rut— C一 30 CAppl. Microbiol. Biotechnol. , 20. 46 - 5 3 (1984) ] 、 リゾッパス ' 二べァス（Rhizopus niveus) -37 [Biosci. Biotech.
Biochem., 56. 1503-1504 (1992)〕 等を挙げることができる。
糸状菌株の形質転換は五味らの方法 CAgric. Biol. Chem. , 5i. 2549 (198 7)〕 等に準じて行うことができる。
酵母菌株を宿主として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、 Y E p 1 3 (ATCC371I5) 、 Y Ep 2 4 (ATCC37051) 、 Y C p 5 0 (ATCC37419) 等を 例示することができる。
プロモーターとしては、 酵母菌株の宿主中で発現できるものであればいかなる ものでもよい。 例えば、 へキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、 g l 1プロモーター、 gal 10プロモータ一、 ヒートショ ッ ク蛋白質プロモーター, MFalプロモーター、 CUP 1プロモータ一等のプロモーターをあげることができる。 宿主としては、 サッカロミセス ' セレヒシェ (Saccharomyces cerevisae) 、 シ ソサッカロミセス · ホ'ンぺ (Schizosaccharomyces pombej 、 ク リ ュイべ口ミセス • ラクチス (Kluyveromyces lactis) 、 ト リコスポロン - フ'ルランス (Trichospor on pul lulans) 、 シヮニォミセス · ァ レヒ /ス (Schwann iomyces al luvius)等を 挙げることができる。
組換えベクターの導入方法としては、 酵母に DN Aを導入する方法であればい ずれも用いることができ、 例えば、 エレク トロポレーショ ン法 [Methods. Enzym ol. , 194. 182 (1990)〕 、 スフヱ口プラス ト法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84. 1929 (1978)〕 、 酢酸リチウム法 〔丄 Bacteriol., 153. 163 (1983) J 等を あげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、 発現ベクターとして、 例えば、 p AG E 1 0 7 [特開平 3- 22979 ； Cytotechnology, 3. 133 (1990) ] 、 p A S 3— 3 (特開平 2- 227075) 、 p C DM 8 [Nature, 329. 840 (1987)〕 、 p c DNA I /Amp (イ ンビトロジェン社製） 、 p R E P 4 (イ ンビトロジヱ ン社製） p A G E 1 0 3 [J. Biochem.. 患， 1307 (1987)〕 、 p A G E 2 1 0等が用いら れる。
プロモーターとしては、 動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いる ことができ、 例えば、 サイ トメガロウィルス （ヒ ト C M V) の I E (i薩 ediate early) 遺伝子のプロモータ一、 S V 4 0の初期プロモータ一あるいはメタロチ ォネインのプロモーター等をあげることができる。 また、 ヒ ト C MVの I E遺伝 子のェンハンサ一をプロモータ一と共に用いてもよい。
宿主細胞としては、 ヒ 卜の細胞であるナマルバ （Namalwa) 細胞、 サルの細胞 である CO S細胞、 チャイニーズ 'ハムスターの細胞である C H〇細胞、 HBT 5 6 3 7 (特開昭 6 3 - 2 9 9 ) 等をあげることができる。
動物細胞への DN Aの導入法としては、 動物細胞に ON Aを導入することがで きればいかなる方法も用いることができる。 例えば、 エレク ト口ポーレーシヨ ン 法 CCytotechnology, 3, 133 (1990)〕 、 リ ン酸カルシウム法 （特開平 2— 2 2 7 0 7 5 ) 、 リボフェクシヨ ン法 [： Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 84. 7413 (1 987)3 等を用いることができる。
形質転換株の取得および培養は、 特開平 2— 2 2 7 0 7 5号公報あるいは特開 平 2— 2 5 7 8 9 1号公報に記載されている方法に準じて行なうことができる。 昆虫細胞を宿主として用いる場合には、 例えばバキュロウィルス · ィクスプレ ッシヨ ン 'ベクタース ァ ' ラ ラ ト リ一 ' マニュアル (Baculovi rus Express io n Vectors, A Laboratory Manual ) 、 カ レン 卜 - フ 口 卜コー レス * イ ン · モレ干 ユラ一 . バイオロジー サブルメ ン 卜卜 3 4、 Bio/Technology, 6, 47 (1988)等 に記載された方法によって、 蛋白質を発現することができる。
即ち、 組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入 して昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、 さらに組換えウィルスを昆 虫細胞に感染させ、 蛋白質を発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入べクタ一としては、 例えば、 p Vし 1 3 9 2. p V L 1 3 9 3 . p B l u e B a c lII (ともにイ ンビトロジェ ン社 製） 等をあげることができる。
バキュロウィルスとしては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスである アウ トグラファ ' カ リフォルニ力 · ヌ ク レア一 · ポリへ ドロシス ' ウィルス（Aut ographa cal i fornica nuclear polyhedrosis virus) などを用レヽることができる' 昆虫細胞としては、 Spodoptera f rugiperdaの卵巣細胞である S f 9、 S f 2 1 〔バキュロウィルス · エクスプレッショ ン ·ベクターズ、 ァ ' ラボラ ト リー ' マニュアル、 ダブリユー ' ェイチ ' フリーマン ' アン ド · 力ンパニー （W. Free man and Company) 、 ニューヨーク (New York) 、 (1992) 、 Tr ichoplus ia n_i の卵巣細胞である H i g h 5 (インビトロジヱン社製） 等を用いることができ る。
組換えゥィルスを調製するための、 昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入べク夕 —と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、 例えば、 リ ン酸カルシウム法
(特開平 2-227075) 、 リボフヱクシヨ ン法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84. 7413 (1987)] 等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、 直接発現以外に、 モレキュラー . クローニング 第 2版に記載されている方法等に準じて、 分泌生産、 融合蛋白質発現等をおこな うことができる。
糸状菌、 酵母、 動物細胞または昆虫細胞により発現させた場合には、 糖あるい は糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
新規フイターゼを製造するために、 上記形質転換体に加え、 新規フイターゼを 生成する能力を有する微生物および新規フィターゼを生成する能力を有する微生 物からさらに新規フィターゼの生産性の向上した変異株を用いることができる。 新規フィターゼの生産性の向上した変異株は、 通常の変異処理をすることによ り取得することができる。
新規フィターゼを生成する能力を有する微生物、 該微生物から誘導された変異 株または新規フィターゼ遺伝子を組み込んだ組換え体 D N Aを保有する形質転換 体を通常の培養方法に従って培養し、 新規フイターゼを生成蓄積させ、 該培養物 より新規フィターゼを採取することにより、 新規フィタ一ゼを製造することがで きる。 以下、 新規フイターゼを製造するために用いる上記微生物、 変異株、 形質 転換休を、 新規フィターゼ製造用生物と呼ぶ。
新規フィターゼ製造用生物が大腸菌等の原核生物、 糸状菌ゃ酵母菌等の真核生 物である場合、 該生物を培養する培地は、 微生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、 合成培地のいずれでもよい。
炭素源としては、 それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、 グルコ一 ス、 フラク トース、 スクロース、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいはデン プン加水分解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プ ロパノールなどのアルコール類が用いられる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸ァ ンモニゥム、 りん酸アンモニゥム、 等の各種無機酸や有機酸のアンモニゥ厶塩、 その他含窒素化合物、 並びに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンスチー プリカ一、 カゼイ ン加水分解物、 大豆粕および大豆粕加水分解物、 各種発酵菌体 およびその消化物等が用いられる。
無機物としては、 りん酸第一カリ ウム、 りん酸第二カ リ ウム、 りん酸マグネシ ゥム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナト リ ウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭酸カルシウム等が用いられる。
また、 糸状菌の培養においては、 小麦フスマ、 米糠等を、 炭素源、 窒素源およ び無機物源等とし、 適当な塩類を補強したものを培地として用いることもできる。 培養は、 振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。 培養温 度は 1 5〜4 0 eCがよく、 培養時間は、 通常 1 6〜 9 6時間である。 培養中 p H は、 3 . 0〜 9 . 0に保持するが、 糸状菌の培養においては p H 3 . 0〜 6 . 5 に保持することが好ましい。 p Hの調整は、 無機あるいは有機の酸、 アルカリ溶 液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニアなどを用いて行う。
また培養中必要に応じて、 アンピシリ ンゃテトラサイクリ ン等の抗生物質を培 地に添加してもよい。 プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現べクタ一で形質転換し た微生物を培養するときには、 必要に応じてィンデユーザーを培地に添加しても よい。 例えば、 1 プロモーターを用いた発現べクタ一で形質転換した微生物を 培養するときにはイソプロピル一 /3— D—チォガラク トピラノシド （ I PTG) 等を、 iifiプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する ときにはィンドールァクリル酸 （ I AA) 等を培地に添加してもよい。
糸状菌を小麦フスマ等の固形成分を含む培地で培養する場合には、 糸状菌を植 菌後、 固形成分と糸状菌とを充分混合し均一にし、 アルミまたはステンレス製の 多数の卜レイに薄くひろげて厶口内に置き、 温度、 湿度、 通気を制御しながら培 養する。 具体的には、 湿度 1 00%の培養室で、 2 5〜3 5°C；、 3〜 1 0日間静 置培養する。
新規フィタ一ゼ製造用生物が動物細胞である場合、 該細胞を培養する培地は、 一般に使用されている R PM 1 1 64 0培地、 E a g 1 eの MEM培地またはこ れら培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、 5%C02存在下等の条件下で行う。 培養温度は 3 5〜3 7てがよく、 培養時間は、 通常 3〜7日間である。
また培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリ ン等の抗生物質を培地に添 加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に使 用されている TNM— FH培地 〔ファーミ ンジヱ ン （Pharmingen) 社製〕 、 Sf - 9 00 11 SFM培地 （ギブコ B Rし社製） 、 ExC e l l 4 00 、 ExC e l l 40 5 〔いずれも J RHバイオサイエンシーズ （JRH Biosciences) 社製〕 等をもち いることができる。
培養温度は 2 5 ~ 30 Cがよく、 培養時間は、 通常 1〜 4日間である。
また、 培養中必要に応じて、 ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加しても よい。 新規フィターゼ製造用生物の培養液から、 新規フィターゼを単離精製するには、 通常の酵素の単離、 精製法を用いることができる。
例えば、 新規フィターゼが新規フィターゼ製造用生物の細胞内に溶解状態で蓄 積する場合には、 培養物を遠心分離することにより、 培養物中の細胞を集め、 該 細胞を水系緩衝液等で洗浄した後に、 超音波破 5-機、 フレンチブレス、 マントン ガウリンホモゲナイザー、 ダイノミル等により細胞を破砕し、 無細胞抽出液を得 る。 該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、 通常の酵素の 単離精製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析法、 脱塩法、 有機溶媒による 沈殿法、 ジェチルァミノエチル （ D E A E ) —セファロ一ス、 D 1 A 10N HPA-75
(三菱化成社製） 等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィ一法、 S-Seph arose FF (フアルマシア社製） 等のレジンを用いた陽イオン交換クロマ卜グラフ ィ一法、 ブチルセファロース、 フエ二ルセファロース等のレジンを用いた疎水性 クロマトグラフィ一法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィ二ティグラフィ一法、 クロマトフォーカシング法、 等電点電気泳動等の電気泳勛法等の手法を単独ある いは組み合わせて用い、 精製酵素標品を得ることができる。
また、 該新規フィターゼが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、 同様に 細胞を回収後破砕し、 遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、 通常の 方法により該新規フィターゼを回収後、 該新規フィターゼの不溶体をポリべプチ ド変性剤で可溶化する。 該可溶化液を、 ポリペプチド変性剤を含まないあるいは ポリベプチド変性剤の濃度がポリベプチドが変性しない程度に希薄な溶液に希釈、 あるいは透析し、 該新規フイターゼを正常な立体構造に構成させた後、 上記と同 様の単離精製法により精製標品を得ることができる。
細胞外へ該新規フィターゼを分泌する場合には、 該培養物を遠心分離等の手法 により処理し、 可溶性画分を取得する。 培地成分に固形成分、 例えば小麦フスマ 等、 がある場合には、 温水等で新規フィターゼを抽出した後、 遠心分離等の手法 により処理し、 可溶性画分を取得する。 該可溶性画分から、 上記無細胞抽出液上 清からの単離精製法と同様の手法により、 新規フィターゼの精製酵素標品を得る ことができる。
新規フィターゼの活性は、 下記標準活性測定法に従って測定する。
2. 5 mMフィチン酸ナト リウム （シグマ社製） を含む 0. 2 M酢酸緩衝液 p H 5. 5 (酢酸ナト リウム） 0. 5m 1 を 3 7 Cで 5分間保温した後、 酵素液 0. 5 m 1 を加えて反応を開始する。 3 7°Cで 1 0分間保温した後、 酵素反応停止液 ( 1 0 mMモリブデン酸ァンモニゥム、 5 N硫酸、 アセトンを 1 ： 1 ： 2の比率 で混合した溶液） を 2 m 1添加して反応を停止し、 さらに 1 Mクェン酸 0. l m 1 を加え混合する。 この溶液の 3 8 0 nmにおける吸光度を分光光度計 （日立 U- 2000) により測定する。 フイタ一ゼ活性 1ユニッ ト （unit) を p H 5. 5、 3 7 °C、 1分間に 1 wmo 1の無機リンを遊離する酵素量と定義する。
新規フィターゼの Km値は、 基質濃度を変化させたときの新規フィ タ一ゼの活 性を上記標準活性測定法に従って測定後、 得られた結果をラインウィーバー ·バ ーク （Lineweave-Burk) プロッ トすることにより、 求めることができる。
本発明の新規フィターゼは、 フィチン酸塩をィノシトールと無機リ ン酸に変換 するために必要とされる、 様々な工程に利用することができる。
例えば、 動物飼料、 大豆加工、 ブタおよび家禽の液体飼料、 フィ ンチン酸塩か らイノシトールまたはィノシトール一リ ン酸塩の製造等に利用することができる。 動物飼料としては、 例えば以下のようなものをあげることができる。
本発明の新規フイターゼを小麦もみがらなどのキヤリヤー物質と混ぜて混合し、 噴霧塔または流動床中で乾燥させる。 該乾燥物に、 ソルビトール等の浸透圧を安 定化できる物および安息香酸等の防腐剤を添加した物等を動物飼料としてあげる ことができる。 動物飼料における新規フイタ一ゼの使用量は、 動物飼料 1 k gに 対して新規フイターゼ 1 0〜 5 0 0 0 U、 好ましくは 1 0 0〜 i 0 0 0 Uである。 環面の J¾単な説明 第 1図は、 ァスペルギルス ·二ガー S K 5 2株由来のフィターゼ遺伝子の制限 酵素地図を示す図である。 図中、 矢印はフイタ一ゼをコードしている領域を示し ている。
第 2図は、 プラスミ ド p ANPHY 1の制限酵素地図を示す図である。
Phytaseは新規フィターゼ遺伝子を、 Amprは p UC 1 1 8由来のアンビシリン 耐性遺伝子を示す。 矢印は遺伝子の転写並びに翻訳の方向を示す。
第 3図は、 新規フィタ一ゼの分子量を測定した時の、 S D S— PAG Eによる 電気泳動の図である。
第 4図は、 新規フィターゼの分子量を測定した時の、 検量線の図である。
第 5図は、 新規フィターゼの至適 p Hを表す図である。 最大の活性を示した p
H条件の時の活性値を 1 0 0%として、 各 p Hにおける活性を相対活性 （％) で 示した。
第 6図は、 新規フイターゼの p H安定性を表す図である。
第 7図は、 新規フィターゼの至適温度を表す図である。 最大の活性を示した温 度条件の時の活性値を 1 0 0%として、 各温度における活性を相対活性 （％) で 示した。
第 8図は、 新規フイターゼの温度安定性を表す図である。 4 °Cの時の活性値を 1 0 0%として、 各温度における活性を相対活性 （％) で示した。
第 9図は、 新規フィターゼの等電点を表す電気泳動の図である。 発明を実施するための最良の形態
〔実施例 1〕 新規フイタ一ゼをコードする染色体由来の DN Aの取得 ① ァスペルギルス ·ニガ一 S K 5 7株の菌体の調製
5 0 0 m lバッフル付き三角フラスコに麦芽エキス培地 （ 2%麦芽エキス、 2 %グルコース、 0. 1 %ペプト ン） 1 0 0 m 1 を添加し、 シリコン栓をした後、
1 2 0 、 2 0分間滅菌した。 該培地に S K 5 7株を植菌して、 2 8° (：、 7日間、 振とう培養を行った。
該培養液を滅菌処理したガラスフィルターでろ過することによ り、 0. 5 gの S 5 7株の菌体を取得した。
② 菌体から全 DN Aの単離、 精製
実施例 1ー①で取得した S K 5 7株の菌体をべ一パータオルではさみ圧縮して 脱水した。 該菌体を— 8 0°Cに冷却した乳鉢に入れ、 液体窒素を注ぎ凍結した後、 - 8 0°Cで冷却した乳棒で細かく破砕した。
細かく破砕した該菌体を遠心管に取り、 TE緩衝液 〔 1 OmM T r i s— H C 1 (p H 8. 0) 、 1 mM E DTA〕 を 0. 2 m l加え懸濁した。 該懸濁液 に溶菌溶液 〔 2% S D S、 0. 1 M N a C し 1 O mM E DTA、 5 OmM T r i s— HC 1 (p H 7. 0 ) 〕 を 0. 2m l加え、 溶菌した。 該溶菌液を 4 で、 1 5. 0 0 0 r pm ( 1 8, 5 0 0 x g) で 1 0分間遠心分離し、 得られた上 清を新しい遠心管に回収した。
該上清に 0. 4 m 1のフエノール処理溶液 （フヱノール、 クロ口ホルム、 イソ ァミルアルコールを 2 5 : 2 4 : 1の比率で混合した溶液） を加え、 緩やかに攪 拌した後、 4。 (：、 1 5. 0 0 0 r pm ( 1 8. 5 0 0 x g) で 1 0分間遠心分離し、 得られた上清を新しい遠心管に回収した。 この操作を 3回繰り返し、 上清を新し い遠心管に回収した。
該上清に 1 m 1の冷エタノールを加え、 — 8 0°Cで 1 0分間冷やした後、 4° (：、 1 5. 0 0 0 r pm ( 1 8， 5 0 0 x g) で 1 0分間遠心分離し、 沈殿 （ D N A ) を回収した。
該沈殿を真空乾燥した後、 0. 5 m 1の TE緩衝液を加え、 沈殿物を溶解した。 該溶液に 5 1 の RNa s e A ( 1 0m g/m l ) を加え、 3 7でで 3 0分間 保温した。
該処理溶液に 0. 5 m 1のフヱノール処理溶液を加え、 緩やかに撹拌し、 4° (：、 1 5, 0 0 0 r pm ( 1 8, 5 0 0 x g) で 1 0分間遠心分離し、 得られた上清を
2 I一 新しい遠心管に回収した。 この操作を 2回繰り返し、 上清を新しい遠心管に回収 した。
該上清に 0. 5m lのクロ口ホルム処理溶液 （クロ口ホルム、 ィソァミルアル コールを 2 4 : 1の比率で混合した溶液） を加え、 4° (：、 1 5, 0 0 0 r pm ( 1 8. 5 0 0 X g ) で 1 0分間遠心分離し、 得られた上清を新しい遠心管に回 4又した。
該上清に 5 0 1の N a C 1および 1 m 1の冷エタノールを加え、 一 8 0 °Cで 1 0分間冷やした後、 4で、 1 5 , 0 0 0 r p m ( 1 8 , 5 0 0 X g ) で i 0分間 遠心分離し、 沈殿 （DN A) を回収した。 さらに該沈殿を 0. 5 m 1の 7 0%冷 ェ夕ノ一ルで洗浄した後、 4 ；、 1 5, 0 0 0 r pm ( 1 8, 5 0 0 x g) で 1 0 分間遠心分離し、 沈殿 （DNA) を回収した。 該沈殿を真空乾燥することにより、 精製されたゲノム DN Aを約 5 u g取得した。
③ プローブの調製
ァスペルギルス · フィキューム (Aspergillus f iccum) N R R L 3 1 3 5 [Nor thern Regional Research Center, United State Department of Agriculture P eoria, Illnois U.S.A. (NRRL) より入手〕 の遺伝子をプローブとしてァス ペルギルス · 二ガー S K 5 7のフィターゼをクローニングすることを検討した。
NRRし 3 1 3 5株の全 DN Aは実施例 i—①および②記載の方法に準じて調 製した。
NRRL 3 1 3 5株のフイタ一ゼ構造遺伝子を増幅するために、 配列番号 6に 示したセンス鎖プライマーおよび配列番号 7に示したアンチセンス鎖プライマー をアプライ ド ·バイオシステムズ （Applied Biosystems) 社製 3 8 0 A · D N A 合成機を用いて合成した。 該センス鎖プライマー、 アンチセンス鎖プライマーお よび NRRL 3 1 3 5株のゲノム DNAを含む混合液 i 0 0 1 を用いて P C R を行うことにより、 フイタ一ゼ構造遺伝子を増幅した。 、 P C Rは、 9 2tで 1 分間、 4 5°Cで 2分間、 7 2°Cで 3分間からなる反応工程を 1サイクルとして 2 5サイ クル行った。
p UC 1 1 8を制限酵素 E c o R Iで切断した後、 該切断部位に、 制限酵素且 c 0 R Iで処理した PC R増幅フィターゼ構造遺伝子断片を、 宝酒造社製のライ ゲーションキッ 卜を用いて、 挿入した。
フィターゼ構造遺伝子断片の挿入された、 該プラスミ ドを用い、 大腸菌 J M 1 0 9 (宝酒造社より購入） を常法に従って形質転換した。
該形質転換した大腸菌を 5 0 g /m 1 アンピシリ ンナ ト リウムを含む L B培 地 （トリフ'ト ン 1 %、 酵母エキス 0. 5 %、 塩化ナ ト リ ウム 1 %) を用いて、 3 7で、 一昼夜培養した。
該培養菌体より、 常法に従ってブラスミ ドを抽出し、 該ブラスミ ドを E c 0 R Iで消化して、 1. 7 k bの DN Aフラグメ ン トを回収した。
該 1. 7 k bの DNAフラグメ ン トをプローブとして用いた。
④ サザンハイブリダィゼーシヨ ン
SK 5 7株の染色体 DNA 2 0 gに、 制限酵素 2LL I (宝酒造社製） 1 2 Uを添加し、 3 7eC、 1 2時間反応させ、 該 DNAを切断後、 該 DNAをァガロ ースゲル電気泳動にかけた。 実施例 1ー③で得たプローブを用い、 イージーエル (E Cし） キッ 卜 （アマシャム社製） を用いて、 添付の説明書記載の方法に従つ て以下のように、 サザ一ンハイプリダイゼーションを行った。
ァガロースゲル電気泳動後、 0. 4 N水酸化ナ卜リゥム溶液中で、 Hybond-N+ 膜（アマシャム社製）にキヤビラリ一プロッティングした後、 膜を風乾した。 該膜 を ECL直接核酸標識及び検知システム（direct nucleic acid labelling and dete ction systems) (アマシャム社製）のハイブリダイゼ一ショ ン ·ノくッファー [： 0. 5 M N a C 1および 5 % ブロッキング試薬を含む〕 1 0 m 1中に 4 2 、 1時 間浸した後、 プローブ溶液 〔実施例 Iー③で得たプローブ 3 a 1に滅菌水 7 a 1 を加え 9 5° (：、 5分間保温後、 水中 5分間放置し、 1 0 w 1 のラベリ ング溶液と 1 0 ju 1 グルタルアルデヒド溶液を加え、 3 7°C, 1 0分間保温した溶液〕 3 0 1 をブロッティ ング膜を浸したハイプリダイゼ一ショ ン ·バッファーに添加し、 4 2°C. 一晩振とうした。
該膜を一次洗浄液 〔 6 M 尿素、 0. 4 % S D S、 0. 5 X S S C ( 1 5 Om M 塩化ナ卜リゥムおよび 1 5 m クェン酸ナトリウムよりなる S S C溶液の 0. 5倍濃度の組成よりなる溶液） 〕 1 0 Om l を用いて、 4 2°Cで 2 0分間洗浄し た。 洗浄後、 該膜を二次洗浄液 〔 0. 4 % S D S、 0. 5 X S S C] 1 0 0m 1 を用いて、 5 5°Cで 1 0分間洗浄し、 再度該洗浄操作を行った。 洗浄後、 該膜 を 2 X S S C 1 0 Om 1 を用いて、 室温で 5分間洗浄し、 再度該洗浄操作を行つ 該洗浄膜を 1分間風乾した後、 7 m 1検出試薬に 1分間浸し、 素早くサランラ ップに包んだ。 これを X線フィルムカセッ トに入れ、 X線フィルム （フジフィル ム社製） を用いて室温で 5分間露光した。
約 4. 6 k bの位置にプローブと強くハイプリダイズする DN A断片を検出し た。
⑤ ァスペルギルス · 二ガー S K 5 7株の染色体 DN Aライブラ リ一の作成
S K 5 7染色体 DNA 1 0 u gに制限酵素 X b a I 1 2 Uを添加し、 3 7 °C、
1 2時間反応させ、 該 DN Aを切断後、 0. 8%ァガロースゲル電気泳動にかけ た。 泳動後、 4. 6 k b付近の DNA断片をゲルから切り出し、 ジンクリーン
(GENECLEAN, BI0 101 社製） を用いて、 約 1 0 0 n gの 4. 6 k b付近の DN A断片を取得した。
大腸菌ベクター p U C 1 1 8 (宝酒造社より購入） 2 0 0 n gに、 制限酵素 b a I 1 2 Uを添力 [Iし、 3 7°C、 1時間反応させ、 p U C 1 1 8の切断処理を行 つた。
該切断処理液にアル力リフォスファターゼを 1 U添加し、 3 7°Cで 3 0分間反 応させた後、 2 0 u 1のフヱノール処理溶液を加え、 緩やかに攪拌した後、 4°C、 1 5. 0 0 0 r pm ( 1 8, 5 0 0 x g) で 1 0分間遠心分離し、 上清を新しい遠 心管に回収した。 この操作を 2回繰り返し、 上清を新しい遠心管に回収した。 該上清に 2 1の 3 M酢酸ナ卜リゥム溶液および 5 0 1の冷エタノールを加 え、 — 80 °Cで 1 0分間冷やした後、 4。 (：、 1 5. 0 0 0 r pm ( 1 8, 5 0 0 x g) で 1 0分間遠心分離し、 沈殿 （DNA) を回収した。
該沈殿を真空乾燥した後、 1 0 1の TE緩衝液を加え、 沈殿物を溶解し切断 断片を調製した。
該切断断片の切断部位に上記 4. 6 k b付近の DN A断片を丁 4 リガーゼ （宝 酒造社製） を用いて挿入し、 ァスペルギルス ' 二ガー SK 5 7の染色体 DN A断 片が組み込まれたブラスミ ドを得た。
該プラスミ ドを用い、 大腸菌 J M I 0 9 (宝酒造社より購入） を常法にしたが つて形質転換した。
該形質転換した大腸菌を 5 0 g/m 1ァンピシリ ンナトリゥムを含む LB培 地を用いて、 3 7°C、 一昼夜培養した。 レプリカを作製するために、 さらに、 5 0 ju g/m 1アンピシリンナトリゥムを含む L B寒天培地 （LB培地に寒天を 2 %添加した培地） を用いて、 3 7で、 一昼夜培養した。 生育してきたコロニーを S K 5 7の染色体 DN Aライブラリーとして用いた。
⑥ 染色体 DN Aライブラリ一から目的とする DN Aを持つコロニーの単離 実施例 1ー⑤で作製したライブラリーから新規フィ ターゼ遺伝子を持つコロニ
—を単離するために、 ライブラリ一のコロニーをメ ンブレンフィルターに移し取 り、 E C Lキッ 卜に従い、 実施例 1ー③で得たプローブを用いて、 常法に従って コロニーハイブリダイゼーションを行った。 数千のコロニ一を対象にハイブリダ ィゼーションを行い、 ポジティブコロニーを単離した。
⑦ 制限酵素地図の作成および塩基配列の決定
実施例 1ー⑥で取得したポジティブコロニーより、 常法に従ってプラスミ ドを 抽出した。 該ブラスミ ドを p ANPHY l と命名した。 p ANPHY 1プラスミ ドを種々の制限酵素で消化後、 ァガロースゲル電気泳動を行い、 切断断片の長さ から、 SK 5 7の染色体 DNA由来の Lk I処理揷入断片に関する制限酵素地 図を作成した （第 1図） 。 揷入断片は 4. 6 k bであった。
また、 p ANPHY 1プラスミ ドを各種制限酵素で消化後、 ァガロースゲル電 気泳動によって分離後、 ナイロンメンブレンフィルタ一にブロッティ ングした。 E C Lキッ 卜に従い、 実施例 1—③で取得したプローブを用い、 サザンハイプリ ダイゼーシヨンを行った。 該プローブがハイブリダィズする部位は、 挿入断片の ほぼ中央に位置していた。 p ANPHY 1の制限酵素地図および新規フィターゼ コード領域を第 2図に示した。
P ANPHY 1に挿入された新規フィターゼ遺伝子の全ヌクレオチド配列をダ イデォキシチヱ一ンターミネーショ ン法により決定した。 該配列を配列番号 4に 示した。
〔実施例 〕 新規フィターゼをコードする DN Aのィ ントロンの解析
実施例 1で取得した新規フィターゼをコードする染色体由来の DN Aにおける イントロン領域を、 以下の方法でァスベルギルス ·二ガー S K 5 7株よりフイタ
—ゼの c DN Aを取得することにより解析した。
①ァスペルギルス '二ガー S K 5 7株の培養
培地は C z a p e k- D 0 Xを基本として、 0. 0 5% 硫酸マグネシウム、 0. 0 0 1 % 硫酸第一鉄、 0. 0 5 % 塩化力 リ ウム、 0. 2 % 硝酸ナト リ ウム、 10 グルコース、 0. 1 % コーンスティ一プリカ一 （サンエイ糖化製） を 5 OmM ME S緩衝液に溶解し、 5 0 0 m lのバッフル付フラスコに 1 0 Om 1 ずつ分注し、 ォ一トクレーブ滅菌 （ 1 2 0°C、 2 0分） した。 滅菌後、 S K— 5 7株をスラントから 一白金耳植菌し、 2 8° (：、 2 0 0 r p mで 5日間振とう培 養した後、 菌体をガラスフィルターと吸引ビンを用いて採集し、 RN a s eの活 性を抑えるため液体窒素により急速に凍結させ、 使用するまで一 8 0°Cで保存し た„ ② RNAの抽出
上記①で取得した凍結菌体 1 gを液体窒素'を注ぎながら素早く擦りつぶして粉 末状にし、 5 0°Cに保温した 1 0m lの二ツボンジーンの抽出液 I SOGE Nに 入れ、 30秒間強く振とうした。
該液を 5 (TCで 1 0分間保温した後、 lm 1ずつエツベンドルフチューブに分 注した。
該分注液に 2 0 0 1ずつクロロホルムを添加して振り混ぜ、 4。C、 1 5, 0 0 0 r pmで 1 5分間遠心し、 上層の水相を採取した。
該水相に 4 M 塩化リチウムを 5 0 0 1添加して混ぜ合わせ、 一 8 0eCで i 時間放置した後、 4 ；、 1 5. 0 0 0 r pmで 1 5分間遠心し、 得られた沈殿を RN a s eを含有しない滅菌水 （以下、 RNase- free水と略す） 0. 4 m 1に溶 解した。
該溶液に 0. 4 m 1のイソプロピルアルコールを添加して混ぜ合わせ、 4でで 3 0分間放置した後、 再び 4 (：、 1 5, 0 0 0 r pmで 1 5分間遠心し、 沈殿を 得た。
該沈殿を 7 5%エタノールで洗浄し、 真空遠心機で適度に乾燥させた後、 RN ase-f ree水 0. 4 m Iに溶解した。
該溶解液に 1 m 1のエタノールを添加し、 遠心分離することにより、 再度沈殿 を得た。
該沈殿を 7 5%エタノールで洗浄後、 最終的に全体で 0. 4 m lの RNase- fr ee水に溶解し、 RN Aサンブルとして用いた。
③ RT— PCR法によるフイタ一ゼの c DN Aの増幅
T0Y0B0の RT- PCR Kitを用い、 以下の方法でフィターゼの c DN Aの増幅を行つ た。
(1) 逆転写反応
上記②で調製した RN Aサンプル 1 g相当をエツベンドルフチューブに入れ、 R Nase-free水を添加し、 1 0 w 1 に調製する。
該調製液に T0Y0B0の RT-PCR Kitに付属の 5 xRTase Buffer 1、 Random Pr imer 1 1、 RNase Inhibitor i 1、 RTase 2 ji 1 をカ卩え、 パーキンエルマ -P J 2 0 0 0サーマルサイクラ一を用いて 3 0°Cで 1 0分間、 4 2 °Cで 2 0分 間、 9 9tで 5分間、 4°Cで 5分間反応させた。
(2) PC R
上記（1)で得られた反応のサンプル 2 0 1 に T0Y0B0の RT-PCR Kitに付属の Plu s Buffer 1 0 ^ 1 、 滅菌水 6 8 1、 センスプライマ一 0. 5 1、 アンチ センスプライマー 0. 5 1、 rTaq DNA polymerase i 1 を加えて計 1 0 0 w 1 とし、 9 4 tで 3 0秒間、 6 0 °Cで 3 0秒間、 7 2 tで 9 0秒間の反応工程 を 1サイクルとして 3 5サイクル行い、 c DN Aを増幅した。
反応後、 該反応液にクロ口ホルム/イソァミルアルコール （ 2 4 ： 1 ) を 1 0 0 1加えて振り混ぜ、 1 5 , 0 0_ 0 r p mで 5分間遠心し、 上層を採取して c DN Aサンプルとした。
該 c DN Aサンプルを用いて、 c DN Aを解析した結果、 配列番号 4に示され た塩基配列にはイン卜ロン （ 4 4から 1 5 5 ) が一箇所含まれていることがわか つた。 該配列は、 配列番号 2に示されるアミ ノ酸をコードしており、 後述の精製 された新規フイタ一ゼ蛋白のアミ ノ酸配列 （配列番号 1 ) より、 該アミノ酸配列 の N末から 2 4番目までのァミノ酸は分泌シグナルべプチドに相当することがわ かった。
〔実施例 3〕 新規フィターゼ発現形質転換体の取得
以下の方法により、 ァスペルギルス · 二ガー S K 5 7株、 ァスペルギルス ' 二 デュランス MD— 4株またはァスペルギルス - ォリゼ M_ 2 3株を宿主とした新 規フィターゼ発現組換え体を取得した。
宿主となる菌株 （ァスペルギルス · ニガ一 S K 5 7、 ァスペルギルス · ニデュ ランス MD- 4またはァスペルギルス ' オリゼ M— 2 3 ) を DP Y培地 （ 2% デキスト リ ン、 1 % ペプトン、 0. 5% 酵母エキス、 0. 5% KH2PO" 0. 0 5% M g S 0 7 HzO、 p H 5. 5 ) を用いて 3 0° (：、 2〜 3日間振 とう培養した。 生育した菌体を 3 G 1ガラスフィルターを用いて集菌し、 滅菌水 で洗浄した。
該洗浄菌体を、 フィルター滅菌した 1 0m 1のプロ 卜プラス卜調製用溶液 〔 5 mg/m 1 ノボザィム 2 3 4、 5 mg/m 1 セルラーゼ R— 1 0、 0. 8 M N a C 1 0 mM リン酸緩衝液 （ p H 6. 0 ) 〕 に加え、 3 0 °Cで 3時間静 かに振とうした。 3 G 3ガラスフィルターを用いて未分解の菌糸を除去し、 取得 したろ液を 70 0 x g ( 2. 0 0 0 r pm) で 5分間遠心分離してプロ トプラス トを取得した。
該ブロ トプラストを 0. 8 M N a C 1で 2回、 溶液 I 〔 0. 8 M N a C 1、 1 OmM C aC 1 2. 5 OmM T r i s— HC ! (p H 7. 5 ) 〕 で 1回洗 浄し、 最終濃度が 2. 5 X 1 08個/ m 1 となるように 4ノ 5量の溶液 Iに懸濁 した。 該懸濁液に 1 5量の溶液 I I 〔 4 0% (w/v) P EG 4 0 0 0、 5 0 mM Tr i s—HC l (p H 7. 5 ) 〕 を加え形質転換に用いるプロ 卜プラス 卜懸濁液を調製した。
該ブロ トプラスト懸濁液において、 ァスペルギルス ·二ガー S K 5 7株または ァスペルギルス ·ニデュランス M D— 株由来の場合には、 プロ 卜プラス 卜懸濁 液 0. 2m lにプラスミ ド p ANPHY l を 2 0 l、 あるいは、 p AN PHY 1 1 0 1および p 3 S R 2 I 0 u \を加え氷中で 3 0分間放置後、 1 m 1の 溶液 I Iを加えて室温で 2 0分間放置した。 放置後、 溶液 Iを 1 0 m 1添加し、 該液を 7 0 0 X gで 5分間遠心分離し、 沈殿画分を得た。 該沈殿画分を 0. 2 m 1の溶液 Iに懸濁した。 該該懸濁液を 0. 8 M N a C Iを含む C D平板培地 ( 1% スクロース、 i OmM ァセトアミ ド、 0. 1 % ΚΗ2Ρ〇<、 0. 0 5 % Mg S O 7 Η2Ο、 0. 0 5 % K C 1 ) に塗布し、 0. 5%の寒天を含む 培地を重層し、 3 0°Cで 5〜 1 0日間培養した。 上記プロ 卜ブラス卜懸濁液において、 ァスペルギルス ' オリゼ M— 2 3由来の 場合には、 プロ トプラスト懸濁液 0. 2 m l に p A N P H Y l 1 0 1 および P S a 1 2 3 I 0 μ \ を加え氷中で 3 0分間放置後、 1 m 1 の溶液 I I を加え て室温で 2 0分間放置した。 放置後、 溶液 I を 1 0 m 1添加し、 該液を 7 0 0 X gで 5分間遠心分離し、 沈殿画分を得た。 該沈殿画分を 0. 2 m lの溶液 Iに懸 濁した。 該該懸濁液を 0. 8 M N a C 1 を含む最少平板培地 （ 1 % スクロース、 0. 3 % N a N 03、 0. 1 % K H2 P 04 0. 0 5 % M g S O 7 H2〇、 0. 0 5 °6 K C U p H 5. 5 ) に塗布し、 0. 5 %の寒天を含む該培地を重 層し、 3 0°Cで 5〜 1 0日間培養した。
該培養において、 生育が旺盛な株を形質転換体として選択し、 各形質転換体の フイターゼ活性を測定し、 活性の高かった、 ァスペルギルス '二ガー MH— P A 1株、 ァスベルギルス ·ニデユランス M— P A 1株およびァスペルギルス · ォリ ゼ MO— P G 3株を取得した。 ァスペルギルス ·二ガー MH— P A 1株およびァ スペルギルス ·二デュランス M— P A 1株は、 平成 8年 1月 2 5日付けで工業技 術院生命工学工業技術研究所、 茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号 （郵便番号 3 0 5 ) にそれぞれ F E RM B P— 5 3 7 2および F E RM B P— 5 3 7 3 とし て寄託されている。
〔実施例 4〕 形質転換体によるフィターゼの製造
① ァスペルギルス ·二ガー MH— P A 1株によるフィタ一ゼの製造
1 0 gの小麦フスマを入れ綿栓をした 5 0 0 m 1容三角フラスコを 1 2 0 °Cで 2 0分間滅菌した後、 滅菌水 8 m 1 を加えた。 該培地に MH— P A 1株を植菌し た後、 フラスコを振ることにより MH— P A 1株の菌糸と小麦フスマを充分混合 し、 3 0°Cで 4〜 5日間静置培養した。
約 3 7。Cの温水 1 0 0 m l を培養後のフラスコに加え、 3 7 °Cで 1〜 2時間放 置した。 放置後、 N o . 2のろ紙を用いて固形分と液体を分離し、 新規フィ ター ゼを 5 6 0 U取得した。 MH— P A 1株は実施例 6 —①に示した S K 5 7株の約 2. 4倍の生産量を示した。
② ァスペルギルス ·二デュランス M— P A 1株によるフィターゼの製造
1 0 m I のフィ タ一ゼ生産培地 （ 1 % スクロース、 0. 2 % N a N 03 0. 0 5% Mg S O 7 H20、 0. 0 5% KC U 0. 0 0 1 % F e S O 7 H20、 0. 1 % C. S. L. 、 p H 5. 5 ) を入れシリコン栓をした i 0 0m 1容三角フラスコを 1 2 0でで 2 0分間滅菌した。 該培地に M— P A 1 を植菌し た後、 3 0°Cで 4〜 5日間振とう培養した。
宿主ァスペルギルス ·二デュランス MD— 4株は同条件で 5 mUのフィ夕ーゼ 生産量であたったのに対し形質転換体 M— P A 1株は 9 OmU生産しており、 宿 主菌株の約 1 8倍の生産量であった。
③ ァスペルギルス ' オリゼ MO— P G 3株によるフィ タ一ゼの製造
5 0 Om 1のフィターゼ生産培地を入れ綿栓をした 2 し容三角フラスコを i 2 0でで 2 0分間滅菌した。 該培地に MO— PG 3株を植菌した後、 2 8 °Cで 4〜 5日間振とう培養した。
宿主ァスベルギルス 'ォリゼ M— 2 3株は同条件で 1 3 mU//m lのフイタ一 ゼ生産量であたつたのに対し形質転換体 M 0— P G 3株は 3 7 0 m U /m 1生産 しており、 宿主菌株の約 2 9倍の生産量であった。
〔実施例 5〕 ァスペルギルス · 二ガー S K 5 7株から新規フィターゼ高生産変 異株ァスペルギルス ·二ガー SK 9 2株の取得
ァスペルギルス ·二ガー S K 5 7株を最少寒天培地 〔 2 % シュクロース、 0. 3% 硝酸ナ ト リ ウム、 0. 0 5% 塩化カ リ ウム、 0. 0 5 % 硫酸マグネシゥ ム、 2% 寒天、 p H 5. 5 ] 上で生育させ、 胞子を形成させた。 該胞子を滅菌 水 1 Om 1に懸濁した。 最終 1 07胞子/ m 1 となるように滅菌水で調製し、 該 胞子懸濁液 1 O m l を用いて変異処理を行った。 胞子懸濁液に死滅率 9 9 %とな るように紫外線およびァ線を照射して変異を誘発した。 該変異処理によりフイタ ーゼ高生産株を 1株取得した。 該変異株に該変異処理をさらに 7回繰り返すこと により、 新規フイターゼ高生産株ァスペルギルス ' 二ガー S K 9 2株を取得した c 〔実施例 6〕 ァスペルギルス · ニガ一 S K 5 7株およびァスペルギルス · ニガ - S K 9 2株を用いた新規フィターゼの製造
① S K 5 7株および S K 9 2株による新規フィターゼの製造
1 0 gの小麦フスマを入れ綿栓をした 5 0 0 m l容三角フラスコを 1 2 0°Cで
2 0分間滅菌した後、 滅菌水 8 m 1 を加えた。 該培地に S K 5 7株または S K 9 2株を植菌した後、 フラスコを振ることにより菌糸と小麦フスマを充分混合し、
3 0でで 4〜 5日間静置培養した。
約 3 7 :の温水 1 0 0 m l を培養後のフラスコに加え、 3 7 °Cで i〜 2時間放 置した。 放置後、 N o . 2のろ紙を用いて固形分と液体を分離した。
該製造により、 S K 5 7株で新規フイターゼを 2 3 0 U、 S K 9 2株で 1 0 0 0 Uの新規フィターゼを取得した。
S K 9 2株の生産する新規フイターゼの生産量は、 S K 5 7株の約 4 . 5倍で めつた。
② S K 5 7株による新規フィターゼの製造
1 2 0 °C . 3 0分間空蒸した小麦フスマ 7, 5 0 0 k gに、 予め純粋培養した S K 5 7株を移植し、 菌糸とフスマ培地が均一になるように混合機を用いて充分 混合した。
該混合物を滅菌した 6 0 0 x 1 , 0 0 0 mmのアルミニゥム ト レイに 5 k gず つ 1 , 5 0 0枚に盛り込み、 温度 3 0°C. 湿度 1 0 0%の培養室で 5日間放置し S K 5 7株を培養した。
該培養物を抽出槽に移し 1 8 卜ンの温水を散布してフィターゼ抽出液を 1 5 卜 ンタンクに回収した。 該抽出液を真空濃縮タンク （日本真空株式会社製） に移送 し、 2〜 3倍に真空濃縮した後、 9 5 %冷エタノールを 3. 5 ト ン加えた。 該操 作により不溶化した不純物をプレスろ過機により除去した。
得られたろ液を無菌フィルター （ 0. 4 5 m m, 日本ロスィ機社製） を用いて ろ過した後、 再び 9 5 %冷エタノールを 1 7. 5 卜ン加え、 新規フィタ一ゼを不 溶化させた。 該不溶化フイタ一ゼを沈降させ、 新規フィターゼを含む沈降画分を 3 トン取得した。
該沈降画分に 9 5 %冷エタノールを 8 トン添加し脱水後、 該不溶化フィ ターゼ を沈降させ、 新規フィターゼを含む沈降画分を 3 ト ン取得した。 該脱水 ·沈降操 作を 2〜 3回繰り返した後、 真空乾燥し、 フイタ一ゼ酵素原末し 5億 U取得し た。
〔実施例 7〕 新規フイタ一ゼの精製
① ァスペルギルス ·二ガー S K 5 7株の生産する新規フィターゼの精製 実施例 6—②で取得したフィターゼ酵素原末 1 0 gを酢酸緩衝液 A 〔 5 O mM 酢酸 /5 OmM 酢酸ナ ト リウム （p H 5. 5 ) ] 5 0 m l に溶解した後、 ゥ ルトラフィルター （ザル卜リウス社、 排除分子量 1万） により脱塩した。 得られ た酵素液を予め 5 Om 酢酸緩衝液 Aで平衡化したダイアイオン HP A— 7 5
(三菱化成社） カラム （ 5. 6 cmx 3 0 c m) に通塔した。 酢酸緩衝液 Aで洗 浄後、 0. 3 MN a C 1 を含む酢酸緩衝液 B 〔 5 0 m M酢酸 / 5 0 m M酢酸ナト リウム （p H 4. 8 ) 〕 を用いて新規フィターゼを溶出した。 該溶出画分をウル トラフィルタ一 （ァドバンテツク社、 排除分子量 1万） により 2 0倍に濃縮した 後、 予め酢酸緩衝液 C 〔 5 0 mM酢酸ノ 5 0 mM酢酸ナ ト リ ウム （p H
9 ) 〕 で平衡化した S—セファロ一ス F F ( 2. 5 c m X 3 0 c m、 フアルマシ ァ社製） カラムに通塔した。 酢酸緩衝液 Cで洗浄した後、 酢酸緩衝液 D [ 5 O m M酢酸/ 5 0 mM酢酸ナト リウム （p H 5. 2 ) 〕 により蛋白質を溶出し、 フィ ターゼ画分を得た。 得られた酵素液をウルトラフィルター （アドバンテック社、 排除分子量 1万） により 2 0倍に濃縮した後、 予め酢酸緩衝液 E 〔 5 O mM酢酸 / 5 0 mM酢酸ナト リウム （p H 4. 5 ) 〕 で平衡化したトヨパール HW— 5 5 F (東ソ一社） カラムに通塔した。 酢酸緩衝液 Eを用いて新規フィ ターゼを溶出 した。 該溶出画分を、 予め 2 5 mM Histidine-HC 1緩衝液 〔p H 5. 8、 フ アルマシア社製〕 で平衡化した mono PH R 5 / 2 0カラム （フアルマシア社 製） に通塔し、 1 0% Polybuffer74— HC 1 (p H 4. 2、 フアルマシア社 製） を用いて新規フィ ターゼを溶出した。
以上のステップにより、 新規フィターゼは比活性 1 5 8 U/m gまで精製され た。
② ァスペルギルス ·二ガー MH— P A 1株およびァスペルギルス · ニデュラン ス M— P A 1株の生産する新規フィタ一ゼの精製
実施例 6—①に記載の方法に準じて、 MH— PA 1株および M— PA 1株を培 養し、 各々の培養液より N o. 2のろ紙を用いて液体画分 （新規フィターゼ粗酵 素液） を取得した。
該粗酵素液各々について、 5 0mM 酢酸緩衝液 A (p H 5. 5 ) を加え、 ゥ ルトラフィルター （アドバンテック社、 排除分子量 1万） を用いて脱塩した。 該脱塩した酵素液をあらかじめ 5 OmM 酢酸緩衝液 （p H 5. 5 ) で平衡化 したダイヤイオン HP A- 7 5カラム （ 5. 6 c mx 3 0 c m) に通塔した。 酢 酸緩衝液 Aで洗浄後、 0. 3 M N a C 1 を含む酢酸緩衝液 B (p H 4. 8 ) を 用いて新規フィターゼを溶出した。
該溶出画分をウルトラフィルタ一 （アドバンテッ ク社、 排除分子量 1万） を用 いて濃縮した後、 透析を行った。 得られたフィ夕一ゼ画分をあらかじめ 5 OmM 酢酸緩衝液 E (p H 4. 5 ) で平衡化したトヨパール HW— 5 5 Fカラム （ 2. 0 cmx 6 0 cm) に通塔し、 酢酸緩衝液 Eで新規フィターゼを溶出した。
以上のステップにより、 ァスペルギルス ·二ガー MH— P A 1株およびァスぺ ルギルス .二デュランス M— P A 1株の生産する新規フィターゼを精製した。
③ ァスペルギルス 'ォリゼ M〇一 PG 3株の生産する新規フィターゼの精製 実施例 4ー③の培養で得られた培養液から遠心分離により菌体を除去し、 得ら れた培養上清を粗酵素液として用いた。
粗酵素液に 5 OmM 酢酸緩衝液 A ( p M 5. 5 ) を加え、 ウルトラフィルタ 一 （アドバンテック社、 排除分子量 1万） を用いて脱塩した。
該脱塩した酵素液をあらかじめ 5 O mM 酢酸緩衝液 A (p H 5. 5 ) で平衡 化したダイヤイオン HP A— 7 5カラム （ 5. 6 cm x 3 O c m) に通塔し た。 酢酸緩衝液 Aで洗浄した後、 0. 3 M Na C 1 を含む酢酸緩衝液 B (p H
4. 8 ) を用いて新規フイタ一ゼを溶出した。
該溶出画分をウルトラフィルター （ァドバンテツク社、 排除分子量 1万） を用 いて濃縮した後、 透析を行った。 得られたフイタ一ゼ画分をあらかじめ 5 OmM 酢酸緩衝液 E (p H 4. 5 ) で平衡化したトョパール HW— 5 5 Fカラム （ 2.
0 cmx 6 0 cm) に通塔し、 酢酸緩衝液 Eにてフィターゼを溶出した。
以上のステップにより、 ァスベルギルス '才リゼ MO— P G 3株の生産する新 規フィターゼを精製した。
〔実施例 8〕 新規フィターゼの物理化学的性質
実施例 7—①〜③で精製取得した新規フィターゼの物理化学的性質を以下に示 す。
① Km値： 0. 0 0 6 2 5〜に 2 5 m Mの範囲で基質濃度を変化させ、 標準 活性測定法に従い活性を測定した。 得られた結果をラインゥイーバ一 ·バークプ ロッ トし、 Km値を算出した。
ァスペルギルス ·二ガー S K 5 7株、 ァスペルギルス · 二ガー MH— P A 1株、 ァスペルギルス ·二デュランス M— P A 1株およびァスペルギルス ·ォリゼ M〇 一 P G 3株由来の新規フィターゼの Km値は、 それぞれ 1 3、 3 0、 2 0および 2 8 Mであった。
同条件で測定したァスペルギルス ' フィカム NRR L 3 1 3 5株由来のフィ夕 —ゼの Km値は 1 9 7 w Mであり、 本発明の新規フィターゼはこれまで知られて いるフィターゼょりも一桁低い Km値を有する優れたフィターゼであった。
② 分子量 （S D S— P AG E法） ：実施例 7—①、 ②または③で精製取得した 新規フィターゼの試料 4 0 m 1 に 1 Om lのサンプルバッファー （ 4 % 2—メ ルカブトエタノール、 8 0 % グリセリ ン、 4 % S D S、 4 0 mM 卜 リス一塩 酸緩衝液 p H 6. 8 ) を加え 2分間煮沸した。 1 2. 5 % アクリルアミ ドゲル を用いて A E— 6 2 0 0型電気泳動装置 （ァ卜一社） により泳動した。 蛋白の染 色にはクマシブリ リアン卜ブル一 G 2 5 0を用いた。 また、 ェンドグリコシダ一 ゼ Hによる糖鎖の除去処理を行つた試料も同様に泳動した。
ァスペルギルス ·ニガ一 S K 5 7株由来の新規フィターゼの S D S— P AGE の写真を第 3図に示した。 該 S D S— PAG Eによる分子量測定で、 S K 5 7株 および MH— P A 1株由来の新規フィターゼの分子量は約 6 0 k D aであった。 これら新規フィターゼは、 ェンドグリコシダーゼ Hによる糖鎖の除去処理を行つ ても分子量はほとんど変化しなかった。 配列番号 1、 2から求められる分子量は 約 5 0 k D aであり、 S D S— PAG Eから得られた値とほぼ一致していた。 また、 ァスペルギルス ·ニデユランス M— P A 1株およびァスペルギルス ·ォ リゼ M0— P G 3株由来の新規フィターゼの S D S- P A G Eによる分子量測定 結果を第 4図に示した。 該測定による両菌株由来の新規フィタ一ゼの分子量は約 9 0〜 1 0 0 k D aであった。 エンドグリコシダーゼ H処理したこれら新規フィ ターゼの分子量は、 S K 5 7株、 MH P A 1株由来の新規フィターゼの分子量 と同じ、 約 6 0 k D aとなったことより、 M— P A 1株および MO— PG 3株由 来の新規フィタ一ゼには糖鎖が付加していることがわかった。
③ 至適 p H :下記に示す 0. 2 M 緩衝液を用いて各 p Hにおける活性を、 標 準活性測定法に準じて測定した。
P H 2 ~ 4 グリシン/塩酸緩衝液
p H 4〜 5. 5 酢酸/酢酸ナト リゥム緩衝液
p H 5. 5〜 7 M E S緩衝液 （G o o d B u f f e r ) P H 7〜 8 MOP S緩衝液 （G o o d B u f f e r )
P H 8 ~ 9 T r i s /塩酸緩衝液
結果を第 5図に示した。 本発明の新規フィターゼは P H 5. 0〜6. 5で最大 活性を示した。 また、 P H 7. 0以上では不活性であった。
④ p H安定性： 2. 1 mg/m 1の新規フィクーゼ溶液を、 下記に示す 1 0 0 mM緩衝液で 3 7て 60分間保温した後、 標準活性測定法に準じて、 活性を測 定した。
p H 2〜 4 グリシン /塩酸緩衝液
p H 4〜 5. 5 酢酸/酢酸ナ卜 リゥム緩衝液
P H 5. 5〜 7 ME S緩衝液 （G o o d B u f f e r )
p H 7〜 8 MOP S緩衝液 （G o o d B u f f e r ) p H 8 ~ 9 T r i sZ塩酸緩衝液
結果を第 6図に示した
ァスペルギルス ·ニガ -S K 5 7株および ΜΗ— Ρ A 1株由来の新規フイタ一 ゼは、 p H 4 5 ~ 7. 5の範囲において、 約 6 0 %以上の残存活性を有してい た。
ァスペルギルス . ニデユランス M— P A 1株およびァスペルギルス · ォリゼ M 0-PG 3株由来の新規フィターゼは、 p H 8以下において、 約 7 0%以上の残 存活性を有していた。
⑤ 至適温度：反応温度 0〜了 o°cにおける活性を、 標準活性測定法に準じて測 定した。
結果を第 7図に示した。 本発明の新規フイタ一ゼは 4 0〜6 5tで最大活性を 示した。
⑥ 温度安定性： 2. 1 mg/m 1の蛋白質濃度の酵素溶液を 1 0 0 mM酢酸/ 酢酸ナ卜 リゥム緩衝液 （p H 5. 5 ) 中、 0〜 6 0°Cで 6 0分間保温した後、 標 準活性測定法に準じて、 活性を測定した。
結果を第 8図に示した。
ァスペルギルス ·二ガー S K 5 7株およびァスペルギルス ·ニガ一 MH— P A 1株由来の新規フィターゼは、 3 0°C以下において 7 0%以上の相対活性を示し た。
ァスペルギルス ·ニデユランス M— P A 1およびァスペルギルス · 才リゼ M0 一 PG 3株由来の新規フィターゼは、 5 0°Cまで安定であり、 それ以上では徐々 に失活した。 上記実施例 8—①に示したように、 ァスペルギルス · 二デュランス M-P A 1およびァスペルギルス ·ォリゼ MO— PG 3株由来の新規フィタ一ゼ には糖鎖が付加してしているため、 ァスペルギルス 'ニガ一 S K 5 7株およびァ スペルギルス ' 二ガー MH— PA 1株由来の新規フィターゼょり温度安定性が高 いと考えられる。
⑦ 基質特異性： i mMおよび 1 O mMに調製した各基質を用い、 標準活性測定 法に準じて、 活性を測定した。
ァスペルギルス ·二ガー S K 5 7株由来の新規フィターゼの結果を第 1表に示 した。 第 1表に記載の基質に対し、 新規フイタ一ゼは作用し基質特異性は低いが、 フィチン酸以外の基質に対してはほとんど活性を示さなかった。 他の菌株由来の 新規フィターゼについても同様の結果を得た。
第 i 表
相対活性
基 質
( 1 0 0%)
フィチン酸 1 1 0 0
p—二トロフェニル 1 1. 9
フォスフエ一卜 1 0 1 0
D—グルコース 1 0. 4 5
6—フォスフェート 1 0 4 · 2
フラク トース 1 0. 1 5
6—フォスフェート 1 0 0. 9 3
D—ミオーィ ノシ トール 1,4,5 1 0. 7 1
— 卜 リス一フォスフェート 1 0 5. 8
1 0. 1 1
グリセロリ ン酸
1 0 0. 9 6
1 1. 6
ATP
1 0 1. 2 ⑧ 等電点電気泳動； 3 %アク リルアミ ドゲル （ Am p h 0 1 i n e p H 3. 5- 1 0. 0 フアルマシア社製） を用い、 A E— 3 2 3 0型電気泳動装置 （ァ 卜一社） により等電点電気泳動を行った。
ァスペルギルス · ニガ一 SK 5 7株由来の新規フィタ一ゼの結果を第 9図に示 した。 該フイターゼの等電点 （P I ) は 4. 7〜 5. 4であった。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 フィチン酸に対する Km値が小く安価なフイタ一ゼ、 該フィ ターゼをコードする DNA、 該 DN Aを組み込んだ組換え体 DN A、 該組換え体 DN Aを保有する微生物および該微生物を用いたフィターゼの製造法を提供する ことができる。 そして、 このフィチン酸を飼料に用いて、 飼料中に含まれる抗栄 養因子としてのフィチン酸を分解し、 飼料の栄養価値を向上させると共に、 該分 解により遊離したリ ン酸の効率よい利用を可能とさせることができる。
配列表
配列番号： 1
配列の長さ ： 443
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
ハイボセティカル： Yes
配列
Ser Arg Asn Gin Ser Thr Cys Asp Thr Val Asp u!n Gly Tyr Gin Cys
1 5 10 15
Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp Gly Gin Tyr Ala Pro Phe Phe Ser
20 25 30
Leu Ala Asn Lys Ser Ala lie Ser Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys His
35 40 45
Val Thr Phe Ala Gin Val Leu Ser Arg His Gly Ala Arg Tyr Pro Thr
50 55 60
Asp Ser Lys Gly Lys Lys Tyr Ser Ala Leu lie Glu Glu lie Gin Gin 65 70 75 80
Asn Ala Thr Thr Phe Glu Gly Lys Tyr Ala Phe Leu Lys Thr Tyr Asn
85 90 95
T r Ser Leu Gly Ala Asp Asp Leu Thr Pro Phe Gly Glu Gin Glu Leu
100 105 110
Val Asn Ser Gly Val Lys Phe Tyr Gin Arg T r Glu Ser Leu Thr Arg
115 120 125
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355 360 365
Asp Gly Phe Ser Ser Ala Trp Thr Val Pro Phe Ala Ser Arg Met Tyr
370 375 380
Val Glu Met Met Gin Cys Gin Ser Glu Gin Glu Pro Leu Val Arg Val
385 390 395 400
Leu Val Asn Asp Arg Val Val Pro Leu His Gly Cys Pro V l Asp Ala
405 410 415
Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Ser Phe Val Lys Gly Leu Ser Phe Ala
420 425 430
Arg Ser Gly Giy Asp Trp Gly Glu Cys Phe Ala
435 440 配列番号：
配列の長さ ： 443
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
ハイポセティカル： Yes
配列
Ser Xaa Xaa Gin Ser Thr Cys Asp ihr Val Asp Gin Gly Tyr Gin Cys
1 5 10 15
Phe Ser Glu Thr Ser His Leu Trp Gly Gin Tyr Ala Pro Phe Phe Ser
20 25 30 leu Ala Asn Lys Ser Ala lie Ser Pro Asp Val Pro Ala Gly Cys His
35 40 45 e -
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195 200 205
Thr Leu Asp Pro Gly Thr Cys Thr Val Phe Glu Asp Ser Glu Leu Ala
210 215 220
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Gin Arg Leu Glu Asn Asp Leu Ser Giy V l Ser Leu Thr Asp Thr Glu
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Ser Glu Ala Ser Thr Ser Asn Asn Thr Leu Asp Pro Gly Thr Cys Thr
180 185 190
GTT TTC GAA GAT AGC GAA TTG GCC GAT GAC ATC GAA GCC AAT TTC ACC 624
Val Phe Glu Asp Ser Glu Leu Ala Asp Asp lie Glu Ala Asn Phe Thr
195 200 205
GCC ACG TTC GTC CCC TCC ATT CGT CAA CGT CTG GAG AAC GAC TTG TCT 672
Ala Thr Phe Val Pro Ser lie Arg Gin Arg Leu Glu Asn Asp Leu Ser
210 215 220
GGC GTG TCT CTC ACG GAC ACA GAA GTG ACC TAC CTC ATG GAC ATG TGC 720
Gly Val Ser し en Thr Asp Thr Glu Val Thr Tyr Leu Met Asp Met Cys
225 230 235 240
TCC TTC GAC ACC ATC TCC ACC AGC ACC GTC GAC ACC AAG CTG TCC CCC 768
Ser Phe Asp Thr lie Ser Thr Ser Thr Val Asp Thr Lys Leu Ser Pro
245 250 255
TTC TGT GAC CTG TTC ACC CAT GAA GAA TGG ATC AAC TAC GAC TAC CTC 816
Phe Cys sp Leu Phe Thr His Glu Glu Trp lie Asn Tyr Asp Tyr Leu
260 265 270
CAG TCC CTG AAC AAA TAC TAC GGC CAT GGC GCA GGT AAC CCG CTC GGC 864
Gin Ser Leu Asn Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly Asn Pro Leu Gly
275 280 285
CCG ACC CAG GGC GTC GGC TAC GCT AAC GAG CTC ATC GCC CGT CTC ACC 912
Pro Thr Gin Gly Val Gly Tyr Ala Asn Glu Leu He Ala Arg Leu Thr 一 ο ς
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435 440 配列番号 ： 5
配列の長さ ： 1515
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類 ： Genomic DNA
ハイポセティカル ： YES
アンチセンス ： YES
ゲノム内での位置
単位 ：ゲノム ％ _
配 列
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443 配列番号 ： 6
配列の長さ ： 32
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類 ：他の核酸、 合成 DNA
配 列
GGGAATTCAT GGGCGTCTCT GCTGTTCTAC TT 32 配列番号 ： 7
配列の長さ ： 32
配列の型 ：核酸
鎖の数 ：一本鎖
トポロジー ：直鎖状
配列の種類 ：他の核酸、 合成 DNA
配 列
GGGAATTCCT AAGCAAAACA CTCCGCCCAA TC 32

Claims

1. フイチン酸を基質としたときのミカエリス定数が 1 0〜 3 0 w Mであるフ ィターゼ。
2. フイタ一ゼが、 下記の物理化学的性質を有するフイタ一ゼである、 請求項 1記載のフィタ一ゼ。
①分子量 （ S D S— PAG E法） ；ェンドグリコシダ一ゼ H処理後の分子量は 約 6 0 k D aである。
②至適 pH； p H 5. 0〜 6. 5である。
③至適温度； 4 5〜6 5 °Cで最大活性を示す。
④基質特異性： フィチン酸、 p—二トロフヱニルリ ン酸、 D—グルコース 6 -リ ン酸、 フラク ト一ス 6—リ ン酸、 D—ミオ一イ ノシ 卜ール 1. 4 , 5—三 リン酸、 グリセロールリ ン酸およびアデノシン三リ ン酸を基質として作用する。
⑤等電点電気泳動： P.I 4. 7〜 5. 4である。
3. フイタ一ゼが、 配列番号 1、 2および 3で表されるアミ ノ酸配列を有する 蛋白質から選ばれる蛋白質、 または、 配列番号 1、 2および 3で表されるァミ ノ 酸配列を有する蛋白質から選ばれる蛋白質のァミノ酸配列とは一個以上のァミ ノ 酸が置換、 欠失または付加したアミ ノ酸配列を有しかつフィチン酸を基質とした ときのミカエリス定数が 1 0〜 3 0 Mであるフィターゼ活性を有する蛋白質で ある、 請求項 1または 2記載のフィターゼ。
. フ 夕ーゼが、 ァスペルギルス厲に属する微生物由来のフィターゼである、 請求項 1または 2記載のフィターゼ。
5. ァスペルギルス属に属する微生物が、 ァスペルギルス ·二ガー S K 5 7 (F E RM B P— 5 4 7 3 ) およびァスペルギルス · 二ガー S K 9 2 ( F E R
M B P— 5 4 8 1 ) から選ばれる微生物である、 請求項 4記載のフィターゼ。
6. フイタ一ゼが、 糖鎖を有するフイタ一ゼである、 請求項 1、 2または 3記 載のフイ タ一ゼ。
7. フイチン酸を基質としたときのミカエリス定数が 1 0〜 3 0 Mであるフ ィターゼをコードする遺伝子。
8. フィターゼが、 下記の物理化学的性質を有するフィターゼである、 請求項 7記載の遺伝子。
①分子量 （ S D S— P AG E法） ；ェンドグリコシダ一ゼ H処理後の分子量は 約 6 0 k D aである。
②至適 ρΗ : ρ Η 5 · 0〜 6. 5である。
③至適温度： 4 5〜 6 5 Cで最大活性を示す。
④基質特異性； フィチン酸、 p—二トロフヱニルリ ン酸、 D—グルコース 6 一リ ン酸、 フラク 卜一ス 6—リ ン酸、 D—ミオ一イノシ卜一ル 1 , 4 , 5—三 リ ン酸、 グリセロールリ ン酸およびアデノシン三リ ン酸を基質として作用する。
⑤等電点電気泳動： p I 4. 7〜 5. 4である。
9. 遺伝子が、 配列番号 1、 2および 3で表されるアミ ノ酸配列を有する蛋白 質から選ばれる蛋白質、 または、 配列番号 1、 2および 3で表されるアミ ノ酸配 列を有する蛋白質から選ばれる蛋白質のアミ ノ酸配列とは一個以上のアミ ノ酸が 置換、 欠失または付加したァミノ酸配列を有しかつフィチン酸を基質としたとき のミカエリス定数が 1 0〜 3 O w Mであるフィターゼ活性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子である、 請求項 7または 8記載の遺伝子。
1 0. 遺伝子が、 配列番号 4および 5で表される DNAから選ばれる遺伝子で ある、 請求項 7または 8記載の遺伝子。
1 1. 遺伝子が、 ァスペルギルス属に属する微生物由来の遺伝子である、 請求 項 7または 8記載の遺伝子。
1 2. ァスペルギルス属に厲する微生物が、 ァスペルギルス ' 二ガー S K 5 7 (F E RM B P— 5 4 7 3 ) およびァスペルギルス · ニガ一 S K 9 2 ( F E R
M B P- 5 4 8 1 ) から選ばれる微生物である、 請求項 1 i記載の遺伝子。
1 3. フイチン酸を基質としたときのミカエリス定数が 1 0〜 3 0 Mである フィターゼをコ一ドする遺伝子を含む DN A断片をべクタ一に組み込んで得られ る組換え体 DN A。
1 . フイタ一ゼが、 下記の物理化学的性質を有するフイタ一ゼである、 請求 項 1 3記載の組換え体 DNA。
①分子量 （ S D S— P A G E法） ： エン ドグリコシダーゼ H処理後の分子量は 約 6 0 k D aである。
②至適 pH； p H 5 · 0 ~ 6. 5である。
③至適温度； 4 5 ~ 6 5 °Cで最大活性を示す。
④基質特異性； フィチン酸、 p—二トロフヱニルリ ン酸、 D—グルコース 6 一リ ン酸、 フラク トース 6—リ ン酸、 D—ミオーイ ノシ トール し 4 , 5—三 リ ン酸、 グリセロールリ ン酸およびアデノシン三リ ン酸を基質として作用する。
⑤等電点電気泳動； P I 4. 7〜 5. 4である。
1 5. 遺伝子が、 配列番号 1、 2および 3で表されるアミ ノ酸配列を有する蛋 白質から選ばれる蛋白質、 または、 配列番号 1、 2および 3で表されるアミ ノ酸 配列を有する蛋白質から選ばれる蛋白質のァミノ酸配列とは一個以上のァミ ノ酸 が置換、 欠失または付加したアミ ノ酸配列を有しかつフィチン酸を基質としたと きのミカエリス定数が 1 0〜 3 0 u Mであるフィタ一ゼ活性を有する蛋白質をコ ードする遺伝子である、 請求項 1 3または 1 4記載の組換え体 DN A。
1 6. 遺伝子が、 配列番号 4および 5で表される DNAから選ばれる遺伝子で ある、 請求項 1 3または 1 4記載の組換え体 DNA。
1 7. 遺伝子が、 ァスペルギルス属に属する微生物由来の遺伝子である、 請求 項 1 3または 1 4記載の組換え体 DNA。
1 8. ァスペルギルス厲に厲する微生物が、 ァスペルギルス ' 二ガー S K 5 7 (F E RM B P— 5 4 7 3 ) およびァスペルギルス ' ニガ一 S K 9 2 ( F E R
M B P- 5 4 8 1 ) から選ばれる微生物である、 請求項 1 7記載の組換え体 D N A。
1 9 . 組換え体 D N A力、'、 p A N P H Y 1である、 請求項 1 3または 1 4記載 の組換え体 D N Α。
2 0 . フイチン酸を基質としたときのミカエリス定数が 1 0〜 3 0 Μである フィタ一ゼをコードする遺伝子を含む D N Α断片をベクターに組み込んで得られ る組換え体 D N Aを保有する形質転換体。
2 1 . フィターゼが、 下記の物理化学的性質を有するフイタ一ゼである、 請求 項 2 0記載の形質転換体。
①分子量 （ S D S— P A G E法） ；エン ドグリコシダーゼ H処理後の分子量は 約 6 0 k D aである。
②至適 pH : p H 5 . 0〜 6 . 5である。
③至適温度： 4 5 ~ 6 5 °Cで最大活性を示す。
④基質特異性； フィチン酸、 p—ニトロフヱニルリ ン酸、 D—グルコース 6 一リ ン酸、 フラク トース 6—リ ン酸、 D—ミオーイ ノシ トール 1 , 4， 5—三 リン酸、 グリセ口一ルリン酸およびアデノシン三リ ン酸を基質として作用する。
⑤等電点電気泳動： p I 4 . 7〜 5 . 4である。
2 2 . 遺伝子が、 配列番号 1、 2および 3で表されるアミ ノ酸配列を有する蛋 白質から選ばれる蛋白質、 または、 配列番号 1、 2および 3で表されるアミ ノ酸 配列を有する蛋白質から選ばれる蛋白質のァミノ酸配列とは一個以上のァミ ノ酸 が置換、 欠失または付加したアミノ酸配列を有しかつフィチン酸を基質としたと きのミカエリス定数が 1 0 ~ 3 0 w Mであるフィターゼ活性を有する蛋白質をコ —ドする遺伝子である、 請求項 2 0または 2 1記載の形質転換体。
2 3 . 遺伝子が、 配列番号 4および 5で表される D N Aから選ばれる遺伝子で ある、 請求項 2 0または 2 1記載の形質転換体。
2 4 . 遺伝子が、 ァスペルギルス属に属する微生物由来の遺伝子である、 請求 項 2 0または 2 1記載の形質転換体。
2 5 . ァスペルギルス属に属する微生物が、 ァスペルギルス · ニガ一 S K 5 7 (F E RM B P— 5 4 7 3 ) およびァスペルギルス · 二ガー S K 9 2 ( F E R M B P- 5 4 8 1 ) から選ばれる微生物である、 請求項 2 4記載の形質転換体。 2 6. 組換え体 DN A力、'、 p A N Pト! Y 1である、 請求項 2 0または 2 1記載 の形質転換体。
2 7. 形質転換体が、 エツシヱリ ヒア属、 セラチア厲、 コリネバクテリゥ厶属、 ブレビバクテリ ウム厲、 シユードモナス厲、 バチルス厲、 ァスペルギルス属、 リ ゾブス厲、 卜 リコデルマ厲、 ノィロスボラ厲、 ムコール属、 ぺニシリウム属、 ク ルイべ口ミセス厲、 サッカロマイセス属およびシゾサッカロマイセス属に属する 微生物から選ばれる微生物である、 請求項 2 0または 2 1記載の形質転換体。 2 8. 形質転換体が、 ァスペルギルス - 二ガー MH— P A I (F E RM B P — 5 3 7 2 ) 、 ァスペルギルス · 二デュランス M— P A 1 (F E RM B P— 5
3 7 3 ) およびァスペルギルス ·ォリゼ MO— PG 3から選ばれる微生物である、 請求項 2 0または 2 1記載の形質転換体。
2 9 , フイチン酸を基質としたときのミカエリス定数が 1 0〜 3 0 Mである フィターゼを生成蓄積する能力を有する微生物を培地中で培養し、 該フィターゼ を生成蓄積させ、 該培養物より該フィターゼを採取することを特徴とするフィタ ーゼの製造法。
3 0. フィターゼが、 下記の物理化学的性質を有するフィターゼである、 請求 項 1 9記載の製造法。
①分子量 （ S D S— P A G E法） ： ェンドグリコシダ一ゼ H処理後の分子量は 約 6 0 k D aである。
②至適 pH： p H 5. 0 ~ 6. 5である。
③至適温度； 4 5 ~ 6 5 °Cで最大活性を示す。
④基質特異性： フィチン酸、 p—ニトロフヱニルリ ン酸、 D—グルコース 6 —リン酸、 フラク 卜一ス 6—リ ン酸、 D—ミオ一イノシトール 1. 4 , 5—三 リ ン酸、 グリセ口一ルリ ン酸およびアデノシン三リ ン酸を基質として作用する。 ⑤等電点電気泳動： P I 4. 7〜 5. 4である。
3 1. 微生物が、 ァスペルギルス · ニガ一 S K 5 7 (F E RM B P- 5 4 7 3 ) およびァスペルギルス ' ニガ一 S K 9 2 (F E RM B P— 5 4 8 1 ) から 選ばれる微生物である、 請求項 2 9または 3 0記載の製造法。
3 2. 微生物が、 フィチン酸を基質としたときのミカエリス定数が 1 0〜 3 0 w Mであるフイタ一ゼをコ一ドする遺伝子を含む DN A断片をベクターに組み込 んで得られる組換え体 DN Aを保有する形質転換体である、 請求項 2 9または 3 0記載の製造法。
3 3. 遺伝子が、 配列番号 1、 2および 3で表されるアミ ノ酸配列を有する蛋 白質から選ばれる蛋白質、 または、 配列番号 1、 2および 3で表されるアミノ酸 配列を有する蛋白質から選ばれる蛋白質のァミ ノ酸配列とは一個以上のァミノ酸 が置換、 欠失または付加したアミノ酸配列を有しかつフィチン酸を基質としたと きのミカエリス定数が 1 0〜 3 0 Mであるフィ夕ーゼ活性を有する蛋白質をコ ードする遺伝子である、 請求項 3 2記載の製造法。
3 4. 遺伝子が、 配列番号 4および 5で表される DN Aから選ばれる遺伝子で ある、 請求項 3 2記載の製造法。
3 5. 遺伝子が、 ァスペルギルス属に属する微生物由来の遺伝子である、 請求 項 3 2記載の製造法。
3 6. ァスペルギルス属に属する微生物が、 ァスペルギルス · 二ガー S K 5 7 (F E RM B P— 5 4 7 3 ) およびァスペルギルス · 二ガー S K 9 2 (F E R M BP- 5 4 8 1 ) から選ばれる微生物である、 請求項 3 5記載の製造法。 3 7. 組換え体 D N Aが、 p A N P H Y 1である、 請求項 3 2記載の製造法。 3 8. 形質転換体が、 エツシヱリ ヒア属、 セラチア属、 コリネバクテリゥム属、 ブレビバクテリウム属、 シユードモナス属、 バチルス属、 ァスペルギルス厲、 リ ゾプス属、 卜 リコデルマ厲、 ノィロスボラ厲、 ムコール属、 ベニシリ ウ厶属、 ク ルイべ口ミセス属、 サッカロマイセス厲およびシゾサッカロマイセス属に属する 微生物から選ばれる微生物である、 請求項 3 2記載の製造法。
3 9. 形質転換体が、 ァスペルギルス ' ニガ一 MH— P A 1 (F E RM B P 一 5 3 7 2 ) 、 ァスペルギルス ' 二デュランス M— P A i (F E RM B P— 5
3 7 3 ) およびァスペルギルス · ォリゼ MO— PG 3から選ばれる微生物である. 請求項 3 2記載の製造法。
4 0. フィチン酸を基質としたときのミカエリス定数が 1 0〜 3 0 ju Mである フィターゼを含むことを特徴とする動物用飼料。
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