ES2810198T3 - Método para mejorar el valor nutricional del pienso para animales - Google Patents
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Abstract
Método para aumentar la ganancia de peso y/o mejorar la tasa de conversión alimenticia en animales de granja, el método comprende el paso de aplicar al animal un pienso con una cantidad eficaz de una o más enzimas proteolíticas en combinación con al menos una fitasa en donde: a. la fitasa se administra en cantidades tales que la actividad específica en el pienso final está entre 1000 FYT/kg de pienso y 4000 FYT/kg de pienso y b. la proteasa es una serina proteasa estable frente al ácido administrada en una dosis de entre 10 000 unidades/kg de pienso y 30 000 unidades/kg de pienso.
Description
DESCRIPCIÓN
Método para mejorar el valor nutricional del pienso para animales
Referencia a un listado de secuencias
[0001] Esta solicitud contiene un listado de secuencias en formato legible por ordenador, que se incorpora en el presente documento como referencia.
Campo de la invención
[0002] La presente invención se refiere a un método para mejorar el valor nutricional del pienso para animales. Más específicamente, la invención se refiere a un método para mejorar la tasa de conversión alimenticia (TCA) del pienso para animales, método que comprende tratar la fuente de pienso para animales con una dosis alta de al menos una fitasa en combinación con una enzima proteolítica.
[0003] La invención además se refiere al uso de composiciones de aditivos para piensos que comprenden al menos una fitasa superdosificada junto con una o varias enzimas proteolíticas, es decir, proteasa.
Antecedentes de la invención
[0004] Se describe la combinación de la proteasa Avizyme 1505 y la fitasa Phyzyme, junto con una xilanasa y una alfa-amilasa (A J Cowieson et al., Carbohydrases, proteases, and phytases have an additive beneficial effect in Nutritionally Marginal Diets for Broiler Chicks, Poultry Science, vol 84, páginas 1860-1867) como resultado de una mejora en el aumento de peso corporal (APC) y la tasa de conversión alimenticia (TCA) sobre un control negativo.
[0005] US2012/321747 describe la producción de proteasas de especies de Nocardiopsis para uso alimentario.
[0006] EP0756457 describe la combinación de proteasa y fitasa para mejorar la solubilidad de las proteínas en los vegetales.
[0007] WO2012/110777 describe la combinación de un DFM con una fitasa y una proteasa.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0008] La presente invención se refiere a un método para aumentar la ganancia de peso y/o mejorar la tasa de conversión alimenticia en animales de granja, el método comprende el paso de aplicar al animal un pienso con una cantidad eficaz de una o más enzimas proteolíticas en combinación con al menos una fitasa en donde: a. la fitasa se administra en cantidades tales que la actividad específica en el pienso final está entre 1000 FYT/kg de pienso y 4000 FYT/kg de pienso y
b. la proteasa es una serina proteasa estable frente al ácido administrada en una dosis de entre 10 000 unidades/kg de pienso y 30000 unidades/kg de pienso.
[0009] La invención también se refiere al uso de una o más enzimas proteolíticas en combinación con al menos una fitasa en el pienso para animales con el fin de aumentar la ganancia de peso y/o mejorar la tasa de conversión alimenticia en animales de granja, donde:
a. la fitasa se administra en cantidades tales que la actividad específica en el pienso final está entre 1000 FYT/kg de pienso y 4000 FYT/kg de pienso y
b. la proteasa es una serina proteasa estable frente al ácido administrada en una dosis de entre 10 000 unidades/kg de pienso y 30000 unidades/kg de pienso.
Visión general del listado de secuencias
[0010]
SEQ ID N.°: 1 es la secuencia de aminoácidos madura de la fitasa AppA de E. coli.
SEQ ID N.°: 2 es la secuencia de aminoácidos madura de la fitasa AppA2 de E. coli.
SEQ ID N.°: 3 es la secuencia de aminoácidos madura de la fitasa obtenida de E. coli.
SEQ ID N.°: 4 es la secuencia de aminoácidos madura de la fitasa obtenida de E. coli.
SEQ ID N.°: 5 es la secuencia de aminoácidos madura de la fitasa obtenida de E. coli.
SEQ ID N.°: 6 es la secuencia de aminoácidos madura de una fitasa descrita como la SEQ ID N.°: 1 de WO2008/017066.
La SEQ ID N.°: 7 es la secuencia de aminoácidos madura de una fitasa descrita como la SEQ ID N.°: 3 de WO2014/164442.
SEQ ID N.°: 8 es la secuencia de aminoácidos madura de una fitasa descrita como la SEQ ID N.°: 6 de WO2014/164442.
SEQ ID N.°: 9 es la secuencia de aminoácidos madura de una fitasa descrita como la SEQ ID N.°: 8 de WO2014/164442.
SEQ ID N.°: 10 es la secuencia de aminoácidos madura de una fitasa de Citrobacter braakii ATCC 51113.
SEQ ID N.°: 11 es la secuencia de aminoácidos madura de la fitasa obtenida de Citrobacter gillenii.
SEQ ID N.°: 12 es la secuencia de aminoácidos madura de la fitasa obtenida de Citrobacter amalonaticus.
SEQ ID N.°: 13 es la secuencia de aminoácidos madura de una fitasa de Citrobacter braakii YH-15.
SEQ ID N.°: 14 es la secuencia de aminoácidos madura de una fitasa de Citrobacter freundii P3-42.
SEQ ID N.°: 15 es la secuencia de aminoácidos madura de una fitasa de Buttiauxella sp P1-29.
SEQ ID N.°: 16 es la secuencia de aminoácidos madura de una fitasa de Buttiauxella sp P1-29.
SEQ ID N.°: 17 es la secuencia de aminoácidos madura de una fitasa descrita como la SEQ ID N.°: 1 de WO2008/097619.
SEQ ID N.°: 18 es la secuencia de aminoácidos madura de una fitasa de Buttiauxella gaviniae DSM18930.
SEQ ID N.°: 19 es la secuencia de aminoácidos madura de una fitasa de Buttiauxella agrestis DSM18931.
SEQ ID N.°: 20 es la secuencia de aminoácidos madura de una fitasa de Buttiauxella agrestis DSM18932.
SEQ ID N.°: 21 es la secuencia de aminoácidos madura de una fitasa de Peniophora lycii CBS n.° 686.96.
SEQ ID N.°: 22 es la secuencia de aminoácidos madura de una variante de fitasa de Peniophora lycii CBS n.° 686.96.
SEQ ID N.°: 23 es la secuencia de aminoácidos madura de una fitasa de Hafnia alvei.
SEQ ID N.°: 24 es la secuencia de aminoácidos madura de una fitasa de Hafnia sp. LU11047.
SEQ ID N.°: 25 es la secuencia de aminoácidos madura de una fitasa de fusión descrita como la SEQ ID N.°: 18 de WO2011/048046.
SEQ ID N.°: 26 es la secuencia de aminoácidos madura de una variante de fitasa de fusión descrita como la SEQ ID N.°: 24 de WO2012/143862.
SEQ ID N.°: 27 es la secuencia de aminoácidos de una proteasa de Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235.
SEQ ID N.°: 28 es la secuencia de aminoácidos madura de una proteasa de Bacillus clausii.
SEQ ID N.°: 29 es la secuencia de aminoácidos de una proteasa de Nocardiopsis sp. DSM 16424.
SEQ ID N.°: 30 es la secuencia de aminoácidos de una proteasa de Nocardiopsis alba DSM 15647. SEQ ID N.°: 31 es la secuencia de aminoácidos de una proteasa de Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235.
SEQ ID N.°: 32 es la secuencia de aminoácidos madura de una proteasa de Nocardiopsis sp. NRRL 18262. SEQ ID N.°: 33 es la secuencia de aminoácidos de una proteasa de Nocardiopsis prasina DSM 15648. SEQ ID N.°: 34 es la secuencia de aminoácidos de una proteasa de Nocardiopsis prasina DSM 15649. SEQ ID N.°: 35 es la secuencia de aminoácidos de una proteasa de Nocardiopsis prasina DSM 15649. SEQ ID N.°: 36 es la secuencia de aminoácidos de una proteasa de Nocardiopsis prasina DSM 14010. SEQ ID N.°: 37 es la secuencia de aminoácidos de una proteasa de Nocardiopsis alkaliphila DSM 44657. SEQ ID N.°: 38 es la secuencia de aminoácidos de una proteasa de Nocardiopsis lucentensis DSM 44048. SEQ ID N.°: 39 es la secuencia de aminoácidos madura de una proteasa de Kribella solani.
SEQ ID N.°: 40 es la secuencia de aminoácidos madura de una proteasa de Kribella aluminosa.
SEQ ID N.°: 41 es la secuencia de aminoácidos madura de una proteasa de Saccharomonospora viridis.
SEQ ID N.°: 42 es la secuencia de aminoácidos madura de una proteasa de Saccharothrix australiensis.
SEQ ID N.°: 43 es la secuencia de aminoácidos madura de una proteasa de Saccharopolyspora erythraea.
SEQ ID N.°: 44 es la secuencia de aminoácidos madura de una proteasa de Bacillus sp.
SEQ ID N.°: 45 es la secuencia de aminoácidos madura de una proteasa de Saccharopolyspora erythraea.
SEQ ID N.°: 46 es la secuencia de aminoácidos madura de una proteasa de Meripilus giganteus.
SEQ ID N.°: 47 es la secuencia de aminoácidos madura de una proteasa de Dactylosporangium variesporum. SEQ ID N.°: 48 es la secuencia de aminoácidos madura de una variante de proteasa de Bacillus amyloliquefaciens.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
[0011] Sorprendentemente, se ha encontrado que la adición de al menos una fitasa tal como se define de ahora en adelante en el pienso para animales, da como resultado una mejora significativa del aumento de peso y/o la TCA si la fitasa se complementa en dosis altas y se combina con una enzima proteolítica.
[0012] Así, en un aspecto, la invención se refiere a un método para aumentar la ganancia de peso y/o mejorar la tasa de conversión alimenticia en animales de granja, el método comprende el paso de aplicar al animal un pienso con una cantidad eficaz de una o más enzimas proteolíticas en combinación con al menos una fitasa en donde:
a. la fitasa se administra en cantidades tales que la actividad específica en el pienso final está entre 1000 FYT/kg de pienso y 4000 FYT/kg de pienso y
b. la proteasa es una serina proteasa estable frente al ácido administrada en una dosis de entre 10 000 unidades/kg de pienso y 30000 unidades/kg de pienso.
[0013] La tasa de conversión alimenticia (TCA) es indicativa de la eficacia con la que se utiliza un pienso. Cuanto más baja es la TCA, mejor se utiliza el pienso. La TCA puede determinarse sobre la base de un ensayo en animales que comprende un primer tratamiento en el que la fitasa y la proteasa para su uso según la invención se añaden al pienso para animales en una concentración deseada (por ejemplo, 6 o 30 mg de proteína enzimática por kg de pienso), y un segundo tratamiento (control) sin adición de enzimas al pienso para animales. En realizaciones particulares, la TCA mejora (es decir, se reduce) en comparación con el control en al menos un 1.0 %, preferiblemente al menos un 1.5 %, un 1.6 %, un 1.7 %, un 1.8 %, un 1.9 %, un 2.0 %, un 2.1 %, un 2.2 %, un 2.3 %, un 2.4 % o al menos un 2.5 %. En realizaciones particulares adicionales, la TCA mejora (es decir, se reduce) en comparación con el control en al menos un 2.6 %, un 2.7 %, un 2.8 %, un 2.9 % o al menos un 3.0 %. En otras realizaciones particulares adicionales, la TCA mejora (es decir, se reduce) en comparación con el control en al menos un 3.1 %, un 3.2 %, un 3.3 %, un 3.4 %, un 3.5 %, un 3.6 %, un 3.7 %, un 3.8 %, un 4.0 %, un 4.5 %, un 5.0 %, un 5.5 %, un 6.0 %, un 6.5 %, un 7.0 % o al menos un 8.0 %. En otras realizaciones particulares, la TCA mejora (es decir, se reduce) en comparación con el control entre un 1.0 % y un 15.0 %, preferiblemente entre un 1.5 % y un 12.0 %, un 2.0 % y un 11.0 %, un 2.5 % y un 11.0 %, un 3.0 % y un 10.5 %, un 4.0 % y un 10.5 % o entre un 5.0 % y un 10.0 %.
[0014] En otra realización, la TCA mejora (es decir, se reduce) en comparación con el uso de la fitasa sola en la misma dosis en al menos un 1.0 %, preferiblemente al menos un 1.5 %, un 2.0 %, un 2.5 %, un 3.0 %, un 3.5 %, un 4.0%, un 4.5 %, un 5.0 %, un 5.5 %, un 6.0 %, un 6.5 %, un 7.0 % o al menos un 8.0 %. En otras realizaciones particulares, la TCA mejora (es decir, se reduce) en comparación con el uso de la fitasa sola en la misma dosis entre un 1.0 % y un 15.0 %, preferiblemente entre un 1.5 % y un 12.0 %, un 2.0 % y un 11.0 %, un 2.25 % y un 11.0 %, un 2.5 % y un 10.5 %, un 2.75 % y un 10.5 % o entre un 3.0 % y un 10.0 %.
[0015] Un aumento de peso mejorado significa un aumento de peso diario, semanal, quincenal o mensual mejorado (en g o kg durante el periodo de tiempo relevante), en relación con un control sin fitasa y proteasa adicionales.
Fitasas
[0016] Las fitasas (mioinositol hexakisfosfato fosfohidrolasas; EC 3.1.3.8) son enzimas que hidrolizan el fitato (mioinositol hexakisfosfato) a mioinositol y fosfato inorgánico y se sabe que son aditivos para pienso valiosos.
[0017] Se ha identificado una variedad de fitasas que difieren en el pH óptimo, la especificidad del sustrato y la especificidad de la hidrólisis en plantas y hongos. Las fitasas ácidas del salvado de trigo y Aspergilli han sido ampliamente estudiadas y la estereoespecificidad de la hidrólisis ha sido bien establecida. Según la especificidad de la hidrólisis inicial, la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada y la Unión Internacional de Bioquímica (IUPAC-IUB, 1975) reconocen dos clases de fitasas ácidas, la 6-fitasa, que se encuentra por ejemplo en plantas, y la 3-fitasa, que se encuentra en hongos. La 6-fitasa hidroliza el éster de fosfato en la posición L-6 (o D-4) del ácido fítico, y la 3-fitasa hidroliza el éster de fosfato en la posición D-3.
[0018] El sitio ENZYME en internet (http://www.expasy.ch/enzyme/) es un repositorio de información relativa a la nomenclatura de enzimas. Se basa principalmente en las recomendaciones del Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUB-MB) y describe cada tipo de enzima caracterizada para la cual se ha proporcionado un número de EC (Comisión de Enzimas) (Bairoch A. The ENZYME database, 2000, Nucleic Acids Res 28: 304-305). Ver también el manual Nomenclatura de enzimas de NC-IUBMB, 1992).
[0019] Según el sitio ENZYME, se conocen dos tipos diferentes de fitasas: la llamada 3-fitasa (mioinositol hexafosfato 3-fosfohidrolasa, EC 3.1.3.8) y la llamada 6-fitasa (mioinositol hexafosfato 6- fosfohidrolasa, EC 3.1.3.26). Para los propósitos de la presente invención, ambos tipos están incluidos en la definición de fitasa.
[0020] Ejemplos de fitasas de ascomicetos son los derivados de una cepa de Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus awamori PHYA (SWISSPROT P34753, Gene 133: 55-62 (1993)), Aspergillus niger (ficuum) PHYA (SWISSPROT P34752, EP 420358, Gene 127: 87-94 (1993)), Aspergillus awamori PHYB (SWISSPROT P34755, Gene 133: 55-62 (1993)), Aspergillus niger PHYB (SWISSpRo T P34754, Biochem. Biophys Res. Commun. 195: 53-57 (1993)); o una cepa de Emericella, por ejemplo Emericella nidulans PHYB (SWISSPROT O00093, Biochim Biophys Acta 1353: 217-223 (1997)); o una cepa de Thermomyces (Humicola), por ejemplo la fitasa de Thermomyces lanuginosus descrita en WO 97/35017. Otros ejemplos de fitasas de ascomicetos se describen en EP 684313 (por ejemplo, derivadas de cepas de Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus y Myceliophthora thermophila); JP 11000164 (una fitasa derivada de una cepa de Penicillium); EE. UU. 6139902 (una fitasa derivada de una cepa de Aspergillus) y WO 98/13480 (fitasa de Monascus anka).
[0021] Ejemplos de fitasas de basidiomicetos son las fitasas derivadas de Paxillus involutus, Trametes pubescens, Agrocybe pediades y Peniophora lycii (ver WO 98/28409).
[0022] En el presente contexto, una fitasa preferida según la invención se clasifica como perteneciente al grupo EC 3.1.3.26. Los números EC se refieren a Nomenclatura de enzimas 1992 de NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, California, incluyendo los suplementos 1-5 publicados en Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6; y Eur. J. Biochem.
1999, 264, 610-650; respectivamente. La nomenclatura se suplementa y actualiza regularmente; ver, p. ej., la World Wide Web en http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.
Ejemplos de fitasas para su uso según las presentes invenciones son:
[0023] Fitasas derivadas de cepas de E. coli, de cepas de Buttiauxella, fitasas de ascomicetos tal como se describe en EP 684313 (por ejemplo, derivadas de cepas de Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus y Myceliophthora thermophila); JP 11000164 (una fitasa derivada de una cepa de Penicillium); EE. UU. 6139902 (una fitasa derivada de una cepa de Aspergillus), WO 98/13480 (fitasa de Monascus anka), WO 2008/116878 y WO 2010/034835 (fitasa de Hafnia).
[0024] Una fitasa preferida para su uso según la invención se deriva de la familia Enterobacteriaceae y más preferiblemente es una especie de Escherichia, Citrobacter, Buttiauxella o Hafnia
[0025] Los ejemplos preferidos de la especie de Escherichia son Escherichia coli tales como los descritos en WO 2000/71728, WO 2001/90333, WO 2002/095003, WO 2002/095003, WO 2006/028684, WO 2006/028684, WO 1999/08539 y WO 2003/037102 o variantes de los mismos, tales como la SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 3, SEQ ID N.°: 4, SEQ ID N.°: 5, SEQ ID N.°: 6, SEQ ID N.°: 7, SEQ ID N.°: 8 y SEQ ID N.°: 9. Los ejemplos preferidos de Citrobacter son Citrobacter amalonaticus, C. farmer, C. freundii, C. gillenii, C. intermedius, C. koseri y C. rodentium, tales como los descritos en WO 2004/085638, WO 2006/037327, WO 2006/037328, WO 2006/038062, WO 2006/038128 y WO 2007/112739 o variantes de los mismos, tales como la SEQ ID N.°: 10, SEQ ID N.°: 11, SEQ ID N.°: 12, SEQ ID N.°: 13 y SEQ ID N.°: 14. Los ejemplos preferidos de Hafnia son Hafnia alvei y H. paralvei, tales como los descritos en WO 2008/116878, WO 2010/034835, WO 2011/048046, WO 2012/143861 y WO 2012/143862 o variantes de los mismos, tales como la SEQ ID N.°: 23, SEQ ID N.°: 24, SEQ ID N.°: 25 y SEQ ID N.°: 26. Los ejemplos preferidos de Buttiauxella son Buttiauxella agrestis, B. brennerae, B. ferragutiae, B. gaviniae, B. izardii, B. noackiae y B. warmboldiae, tales como los descritos en WO 2006/043178, WO 2008/092901, WO 2008/097619, WO 2008/097620, WO 2009/129489 o variantes de los mismos, tales como la SEQ ID N.°: 15, SEQ ID N.°: 16, SEQ ID N.°: 17, SEQ ID N.°: 18, SEQ ID N.°: 19 y SEQ ID N.°: 20.
[0026] En otra realización preferida, la fitasa para su uso según la invención se deriva de la familia Peniophoraceae y más preferiblemente es una especie de Peniophora, tales como las descritas en WO 1998/028408, WO 1998/028409 y WO 2003/066847 o variantes de las mismas, tales como la SEQ ID N.°: 21 y SEQ ID N.°: 22.
[0027] Ejemplos de especies de Peniophora son: Peniophora aurantiaca, P. cinerea, P. decorticans, P. duplex, P. ericsonii, P. incamate, P. lycii, P. meridionalis, P. nuda, P. piceae, P. pini, P . pithya, P. polygonia, P. proxima, P. pseudo-pini, P. rufa, P. versicolor y la especie clasificada simplemente como Peniophora sp. Una especie preferida es Peniophora lycii. Una cepa preferida es Peniophora lycii CBS 686.96.
[0028] En una realización preferida, la secuencia de aminoácidos de la fitasa tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 3, SEQ ID N.°: 4, SEQ ID N.°: 5, SEQ ID N.°: 6, SEQ ID N.°: 7, SEQ ID N.°: 8, SEQ ID N.°: 9, SEQ ID N.°: 10, SEQ ID N.°: 11, SEQ ID N.°: 12, SEQ ID N.°: 13, SEQ ID N.°: 14, SEQ ID N.°: 15, SEQ ID N.°: 16, SEQ ID N.°: 17, SEQ ID N.°: 18, SEQ ID N.°: 19, SEQ ID N.°: 20, SEQ ID N.°: 21, SEQ ID N.°: 22, SEQ ID N.°: 23, SEQ ID N.°: 24, SEQ ID N.°: 25 o la SEQ ID N.°: 26. En una realización más preferida, la secuencia de aminoácidos de la fitasa tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 3, SEQ ID N.°: 4, SEQ ID N.°: 6, SEQ ID N.°: 6, SEQ ID N.°: 7, SEQ ID N.°: 8, SEQ ID N.°: 9, SEQ ID N.°: 10, SEQ ID N.°: 11, SEQ ID N.°: 12, SEQ ID N.°: 13, SEQ ID N.°: 14, SEQ ID N.°: 15, SEQ ID N.°: 16, SEQ ID N.°: 17, SEQ ID N.°: 18, SEQ ID N.°: 19, SEQ ID N.°: 20, SEQ ID N.°: 21, SEQ ID N.°: 22, SEQ ID N.°: 23, SEQ ID N.°: 24, SEQ ID N.°: 25 o la SEQ ID N.°: 26. En una realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos de la fitasa tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 3, SEQ ID N.°: 4, SEQ ID N.°: 5, SEQ ID N.°: 6, SEQ ID N.°: 7, SEQ ID N.°: 8, SEQ ID N.°: 9, SEQ ID N.°: 10, SEQ ID N.°: 11, SEQ ID N.°: 12, SEQ ID N.°: 13, SEQ ID N.°: 14, SEQ ID N.°: 15, SEQ ID N.°: 16, SEQ ID N.°: 17, SEQ ID N.°: 18, SEQ ID N.°: 19, SEQ ID N.°: 20, SEQ ID N.°: 21, SEQ ID N.°: 22, SEQ ID N.°: 23, SEQ ID N.°: 24, SEQ ID N.°: 25 o la SEQ ID N.°: 26. En una realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos de la fitasa tiene al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 1, SEQ ID N.°: 2, SEQ ID N.°: 3, SEQ ID N.°: 4, SEQ ID N.°: 5, SEQ ID N.°: 6, SEQ ID N.°: 7, SEQ ID N.°: 8, SEQ ID N.°: 9, SEQ ID N.°: 10, SEQ ID N.°: 11, SEQ ID N.°: 12, SEQ ID N.°: 13, SEQ ID N.°: 14, SEQ ID N.°: 15, SEQ ID N.°: 16, SEQ ID N.°: 17, SEQ ID N.°: 18, SEQ ID N.°: 19, SEQ ID N.°: 20, SEQ ID N.°: 21, SEQ ID N.°: 22, SEQ ID N.°: 23, SEQ ID N.°: 24, SEQ ID N.°: 25 o la SEQ ID N.°: 26.
[0029] Para los fines de la presente invención, las fitasas preferidas son las fitasas contenidas en los siguientes productos comerciales: Ronozyme®HiPhos, Ronozyme®NP y Ronozyme® P (DSM Nutritional Products AG), NatuphosTM (BASF), Finase® y Quantum® Blue (AB Enzimas), OptiPhos® (Huvepharma), Phyzyme® XP (Verenium/DuPont) y Axtra® PHY (DuPont).
[0030] Para el propósito de la presente invención, la actividad fitasa se determina liberando fosfato inorgánico de la solución de Na-fitato, en donde una unidad de actividad fitasa es la cantidad de enzima que libera 1 pmol de fosfato inorgánico por minuto a partir de una solución de Na-fitato 0.0051 M en Na-acetato 0.25 M, pH 5.5 y a 37 °C (Engelen, A. J., et al., 1994, "Simple and rapid determination of phytase activity", J. AOAC Int. 77: 760-764) Ejemplos de nombres de unidades de actividad son: FYT, FTU y U. La actividad fitasa se puede determinar usando el ensayo tal como se describe en el ejemplo 1 ("Determinación de la actividad de fitasa"). En un aspecto, los polipéptidos de la presente invención tienen al menos un 20 %, p. ej., al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos el 100 % de la actividad de fitasa de la SEQ ID N.°: 10.
[0031] La actividad específica se mide en muestras altamente purificadas (un gel de poliacrilamida con SDS debe mostrar la presencia de un solo componente). La concentración de proteína enzimática puede determinarse mediante análisis de aminoácidos y la actividad de la fitasa en unidades de FYT. La actividad específica es una característica de la variante de fitasa específica en cuestión, y se calcula como la actividad de fitasa medida en unidades FYT por mg de proteína enzimática fitasa.
[0032] Para determinar los mg de proteína fitasa por kg de pienso o aditivo para pienso, la enzima se purifica a partir de la composición del pienso o el aditivo para pienso, y la actividad específica de la enzima purificada se determina usando un ensayo relevante. La actividad de fitasa de la composición de pienso o del aditivo de pienso también se determina usando el mismo ensayo, y sobre la base de estas dos determinaciones, se calcula la dosificación en mg de proteína fitasa por kg de pienso.
[0033] Según la invención, la fitasa debería aplicarse, por supuesto, en una cantidad eficaz, es decir, en una cantidad adecuada para mejorar el valor nutricional del pienso si se usa en combinación con una enzima proteolítica [obteniendo el efecto deseado, p. ej., mejora de la TCA]. Actualmente se contempla que la fitasa se administre en cantidades tales que la actividad específica en el pienso final esté entre 1000 FYT/kg de pienso y 4000 FYT/kg de pienso. En realizaciones particulares, la actividad específica es al menos 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 o al menos 3000 FYT/kg de pienso. En otra realización particular, la actividad específica está entre 1200 y 3900 FYT/kg de pienso, preferiblemente entre 1400 y 3800 FYT/kg de pienso, entre 1600 y 3700 FYT/kg de pienso, entre 1800 y 3600 FYT/kg de pienso, entre 1900 y 3500 FYT/kg de pienso, entre 2000 y 3500 FYT/kg de pienso, entre 2200 y 3500 FYT/kg de pienso, entre 2400 y 3500 FYT/kg de pienso, entre 2500 y 3500 FYT/kg de pienso, entre 2600 y 3400 FYT/kg de pienso, entre 2700 y 3300 FYT/kg de pienso y entre 2800 y 3200 FYT/kg de pienso.
[0034] En una realización preferida, la fitasa se aplica a una dosis de entre 2 y 4 veces la dosis comercial estándar para esa fitasa.
Proteasas
[0035] Las enzimas proteolíticas o proteasas, o peptidasas, catabolizan los enlaces peptídicos en las proteínas y las descomponen en fragmentos de cadenas de aminoácidos o péptidos.
[0036] Las proteasas se clasifican en función de su mecanismo catalítico en los siguientes grupos: serina proteasas (S), cisteína proteasas (C), proteasas aspárticas (A), metaloproteasas (M) y proteasas desconocidas o aún no clasificadas (U) , ver Handbook of Proteolytic Enzymes, A. J. Barrett, N. D. Rawlings, J. F. Woessner (eds), Academic Press (1998)), en particular la parte de introducción general.
[0037] Las proteasas para el uso según la invención son serina proteasas estables frente a los ácidos. En una realización preferida adicional, las serina proteasas estables frente a los ácidos son serina proteasas S1. La estabilidad ácida se puede determinar usando el ensayo cinético de Suc-AAPF-pNA como se describe en el ejemplo 2 de WO 01/58276 y una proteasa se considera estable frente al ácido si hay > 50 % de actividad residual a pH 3 en comparación con la actividad de las muestras que se mantuvieron en condiciones estables (5 °C y el pH óptimo para esa proteasa).
[0038] En una realización particular, la proteasa para su uso según la invención es una proteasa microbiana. El término microbiano indica que la proteasa se deriva o se origina a partir de un microorganismo, o es un análogo, un fragmento, una variante, un mutante o una proteasa sintética derivada de un microorganismo. Puede producirse o expresarse en la cepa microbiana de tipo salvaje original, en otra cepa microbiana o en una planta; es decir, el término cubre la expresión de proteasas de tipo salvaje y origen natural, así como la expresión en cualquier huésped de proteasas recombinantes, genéticamente modificadas o sintéticas.
[0039] Ejemplos de microorganismos son las bacterias, p. ej., bacterias del filo Actinobacteria, p. ej., de la clase Actinobacteria, p. ej., del orden Streptosporangiales, p. ej., de la familia Nocardiopsaceae p. ej., del género Nocardiopsis, p. ej., Nocardiopsis sp. NRRL 18262, y Nocardiopsis alba; p. ej., de la especie Bacillus o mutantes o variantes de las mismas que exhiben actividad de proteasa.
[0040] Las proteasas preferidas según la invención son las serina proteasas estables frente a los ácidos obtenidas u obtenibles a partir de la clase Actinobacteria, como las que se derivan de Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235 (A1918L1), Nocardiopsis prasina DSM 15649 (NN018335L1), Nocardiopsis prasina (anteriormente alba) DSM 14010 (NN18140L1), Nocardiopsis sp. DSM 16424 (NN018704L2), Nocardiopsis alkaliphila DSM 44657 (NN019340L2) y Nocardiopsis lucentensis DSM 44048 (NN019002L2), así como proteasas homólogas. Otras proteasas preferidas son las descritas en WO 2001/058276, WO 2004/111220, WO 2004/111221, WO 2004/072221, WO 2005/123911, WO 2013/026796, WO 2013/098185, WO 2013/110766, WO 2013/189972, WO 2014/096259, WO 2014/122161 y WO 2014/037438.
[0041] El término serina proteasa se refiere a serina peptidasas y sus clanes tal como se definen en el manual antes mencionado. En la versión de 1998 de este manual, las serina peptidasas y sus clanes se abordan en los capítulos 1-175. Las serina proteasas pueden definirse como peptidasas en las que el mecanismo catalítico depende del grupo hidroxilo de un residuo de serina que actúa como el nucleófilo que ataca el enlace peptídico. Ejemplos de serina proteasas para su uso según la invención son las proteasas del clan SA, p. ej., familia S2 (estreptogrisina), p. ej., subfamilia S2A (proteasa alfa-lítica), tal como se define en el manual antes mencionado.
[0042] La actividad de proteasa se puede medir usando cualquier ensayo en el que se emplee un sustrato que incluya enlaces peptídicos relevantes para la especificidad de la proteasa en cuestión. Ejemplos de sustratos de proteasa son la caseína y los sustratos de pNA, tales como Suc-AAPF-pNA (disponible, por ejemplo, en Sigma S-7388). Otro ejemplo es Protazyme AK (caseína reticulada teñida con azurina preparada como comprimidos por Megazyme T-PRAK). El ejemplo 2 de WO 01/58276 describe ensayos de proteasa adecuados. Un ensayo preferido es el ensayo de Protazyme del ejemplo 2D (el pH y la temperatura deben ajustarse a la proteasa en cuestión tal como se ha descrito de manera general anteriormente).
[0043] No hay limitaciones en el origen de la serina proteasa estable frente al ácido para su uso según la invención. Por lo tanto, el término proteasa incluye no solo proteasas naturales o de tipo salvaje, sino también cualquier mutante, variantes, fragmentos, etc., de las mismas que presenten actividad de proteasa, así como proteasas sintéticas, tales como proteasas barajadas y proteasas consenso. Dichas proteasas modificadas genéticamente pueden prepararse como se conoce generalmente en la técnica, p. ej., mediante mutagénesis dirigida, mediante PCR (usando un fragmento de PCR que contiene la mutación deseada como uno de los cebadores en las reacciones de PCR) o por mutagénesis aleatoria. La preparación de proteínas de consenso se describe en, p. ej., EP 0897985.
[0044] En una realización preferida, la secuencia de aminoácidos de la fitasa tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 27, SEQ ID N.°: 28, SEQ ID N.°: 29, SEQ ID N.°: 30, SEQ ID N.°: 31, SEQ ID N.°: 32, SEQ ID N.°: 33, SEQ ID N.°: 34, SEQ ID N.°: 35, SEQ ID N.°: 36, SEQ ID N.°: 37, SEQ ID N.°: 38, SEQ ID N.°: 39, SEQ ID N.°: 40, SEQ ID N.°: 41, SEQ ID N.°: 42, SEQ ID N.°: 43, SEQ ID N.°: 44, SEQ ID N.°: 45, SEQ ID N.°: 46, SEQ ID N.°: 47 o la SEQ ID N.°: 48. En una realización más preferida, la secuencia de aminoácidos de la fitasa tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 27, SEQ ID N.°: 28, SEQ ID N.°: 29, SEQ ID N.°: 30, SEQ ID N.°: 31, SEQ ID N.°: 32, SEQ ID N.°: 33, SEQ ID N.°: 34, SEQ ID N.°: 35, SEQ ID N.°: 36, SEQ ID N.°: 37, SEQ ID N.°: 38, SEQ ID N.°: 39, SEQ ID N.°: 40, SEQ ID N.°: 41, SEQ ID N.°: 42, SEQ ID N.°: 43, SEQ ID N.°: 44, SEQ ID N.°: 45, SEQ ID N.°: 46, SEQ ID N.°: 47 o la SEQ ID N.°: 48. En una realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos de la fitasa tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 27, SEQ ID N.°: 28, SEQ ID N.°: 29, SEQ ID N.°: 30, SEQ ID N.°: 31, SEQ ID N.°: 32, SEQ ID N.°: 33, SEQ ID N.°: 34, SEQ ID N.°: 35, SEQ ID N.°: 36, SEQ ID N.°: 37, SEQ ID N.°: 38, SEQ ID N.°: 39, SEQ ID N.°: 40, SEQ ID N.°: 41, SEQ ID N.°: 42, SEQ ID N.°: 43, SEQ ID N.°: 44, SEQ ID N.°: 45, SEQ ID N.°: 46, SEQ ID N.°: 47 o la SEQ ID N.°: 48. En una realización aún más preferida, la secuencia de aminoácidos de la fitasa tiene al menos un 95 %, tal como al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con el polipéptido de la SEQ ID N.°: 27, SEQ ID N.°: 28, SEQ ID N.°: 29, SEQ ID N.°: 30, SEQ ID N.°: 31, SEQ ID N.°: 32, SEQ ID N.°: 33, SEQ ID N.°: 34, SEQ ID N.°: 35, SEQ ID N.°: 36, SEQ ID N.°: 37, SEQ ID N.°: 38, SEQ ID N.°: 39, SEQ ID N.°: 40, SEQ ID N.°: 41, SEQ ID N.°: 42, SEQ ID N.°: 43, SEQ ID N.°: 44, SEQ ID N.°: 45, SEQ ID N.°: 46, SEQ ID N.°: 47 o la SEQ ID N.°: 48.
[0045] Para calcular el porcentaje de identidad, se puede usar cualquier programa informático conocido en la técnica. Ejemplos de dichos programas informáticos son el algoritmo Clustal V (Higgins, D. G. y Sharp, P. M. (1989), Gene (Ámsterdam), 73, 237-244; y el programa GAP suministrado en el paquete del programa GCG versión 8 (Manual del programa para el paquete Wisconsin, versión 8, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE. UU. 53711) (Needleman, S. B. y Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453.
[0046] Para los propósitos de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.
48: 443-453) implementado en el programa Needle del paquete Em Bo SS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros utilizados son la penalización por abertura de gap de 10, penalización por extensión de gap de 0.5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (EMBOSS versión de BLOSUM62). El resultado de Needle etiquetado como "identidad más larga" (obtenida usando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:
(Residuos idénticos x 100)/(Longitud del alineamiento - Número total de espacios en el alineamiento) [0047] En otra realización particular, la proteasa para su uso según la invención, además de ser estable frente al ácido, también es termoestable.
[0048] El término termoestable para las proteasas significa una o varias de las siguientes: que la temperatura óptima es al menos 50 °C, 52 °C, 54 °C, 56 °C, 58 °C, 60 °C, 62 °C, 64 °C, 66 °C, 68 °C o al menos 70 °C.
[0049] Una serina proteasa disponible comercialmente derivada de Nocardiopsis es Ronozyme®ProAct® (DSM Nutritional Products AG).
[0050] En el uso según la invención, actualmente se contempla que la proteasa se administre en una dosis de entre 5000 unidades/kg de pienso y 30000 unidades/kg de pienso, preferiblemente entre 7000 unidades/kg de pienso y 28000 unidades/kg de pienso, entre 8000 unidades/kg de pienso y 26000 unidades/kg de pienso, entre 9000 unidades/kg de pienso y 24 000 unidades/kg de pienso, entre 10 000 unidades/kg de pienso y 22 000 unidades/kg de pienso, entre 11 000 unidades/kg de pienso y 20 000 unidades/kg de pienso, entre 12 000 unidades/kg de pienso y 18 000 unidades/kg de pienso, o entre 13 000 unidades/kg de pienso y 17 000 unidades/kg de pienso o, por ejemplo, en una de las siguientes cantidades (rangos de dosificación): 5000 unidades/kg de pienso, 7000, 8000, 9000, 10000, 11 000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18 000, 19000, 20000, 22000, 24000, 26000, 28 000, 30000 unidades/kg de pienso. Una unidad de proteasa (PROT) es la cantidad de enzima que libera 1 pmol de p-nitroanilina a partir del sustrato 1 mM (Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pnA) por minuto a pH 9.0 y 37 °C.
Combinaciones de fitasa y proteasa
[0051] En una realización particular, la invención se refiere a un método para mejorar la tasa de conversión alimenticia en animales monogástricos, el cual comprende el paso de aplicar al animal monogástrico un pienso con una cantidad eficaz de una o más enzimas proteolíticas en combinación con al menos una fitasa donde: a. la fitasa se administra en cantidades tales que la actividad específica en el pienso final está entre 1000 FYT/kg de pienso y 4000 FYT/kg de pienso y
b. la proteasa se administra en una dosis de entre 10000 unidades/kg de pienso y 30000 unidades/kg de pienso.
[0052] En una realización, el animal monogástrico se selecciona del grupo que consta de cerdos, animales porcinos (que incluyen, entre otros, lechones, cerdos en crecimiento y cerdas); aves de corral, pavos, patos, codornices, gallinas de Guinea, gansos, palomas (incluyendo los pichones) y pollo (pollos de engorde, polluelos, ponedoras). En una realización preferida, el animal monogástrico se selecciona del grupo que consta de pollos, pollos de engorde, polluelos y ponedoras.
[0053] En una realización preferida, la fitasa se aplica a una dosis de entre 2 y 4 veces la dosis comercial estándar para esa fitasa.
[0054] En una realización particular, la invención se refiere a un método para mejorar la tasa de conversión alimenticia en animales monogástricos, el cual comprende el paso de aplicar al animal monogástrico un pienso con una cantidad eficaz de una o más enzimas proteolíticas en combinación con al menos una fitasa donde: a. la fitasa se obtiene de la familia Enterobacteriaceae y se administra en cantidades tales que la actividad específica en el pienso final está entre 1000 FYT/kg de pienso y 4000 FYT/kg de pienso y
b. la proteasa es una serina proteasa estable frente al ácido obtenida de la clase Actinobacteria y se administra en una dosis de entre 10000 unidades/kg de pienso y 30000 unidades/kg de pienso.
[0055] En una realización preferida, la fitasa se aplica a una dosis de entre 2 y 4 veces la dosis comercial estándar para esa fitasa.
[0056] En una realización, el animal monogástrico se selecciona del grupo que consta de cerdos, animales
porcinos (que incluyen, entre otros, lechones, cerdos en crecimiento y cerdas); aves de corral, pavos, patos, codornices, gallinas de Guinea, gansos, palomas (incluyendo los pichones) y pollo (pollos de engorde, polluelos, ponedoras). En una realización preferida, el animal monogástrico se selecciona del grupo que consta de pollos, pollos de engorde, polluelos y ponedoras.
[0057] En una realización, la fitasa se obtiene de la familia Enterobacteriaceae y la serina proteasa estable frente al ácido se obtiene de la familia Nocardiopsaceae, preferiblemente del género Nocardiopsis. En una realización, la fitasa se obtiene del género Escherichia y la serina proteasa estable frente al ácido se obtiene del género Nocardiopsis. En una realización, la fitasa se obtiene del género Citrobacter y la serina proteasa estable frente al ácido se obtiene del género Nocardiopsis. En una realización, la fitasa se obtiene del género Buttiauxella y la serina proteasa estable frente al ácido se obtiene del género Nocardiopsis. En una realización, la fitasa se obtiene del género Hafnia y la serina proteasa estable frente al ácido se obtiene del género Nocardiopsis [0058] En otra realización, la fitasa se obtiene de la familia Enterobacteriaceae y la serina proteasa estable frente al ácido se obtiene de la familia Pseudonocardiaceae. En otra realización, la fitasa se obtiene de la familia Enterobacteriaceae y la serina proteasa estable frente al ácido se obtiene de la familia Micromonosporaceae. En otra realización, la fitasa se obtiene de la familia Enterobacteriaceae y la serina proteasa estable frente al ácido se obtiene de la familia Nocardioidaceae. En otra realización, la fitasa se obtiene de la familia Enterobacteriaceae y la serina proteasa estable frente al ácido se obtiene de la familia Bacillaceae, preferiblemente el género Bacillus.
[0059] En una realización particular, la invención se refiere a un método para mejorar la tasa de conversión alimenticia en animales monogástricos, el cual comprende el paso de aplicar al animal monogástrico un pienso con una cantidad eficaz de una o más enzimas proteolíticas en combinación con al menos una fitasa donde: a. la fitasa se obtiene de la familia Peniophoraceae y se administra en cantidades tales que la actividad específica en el pienso final está entre 1000 FYT/kg de pienso y 4000 FYT/kg de pienso y
b. la proteasa es una serina proteasa estable frente al ácido obtenida de la clase Actinobacteria y se administra en una dosis de entre 10000 unidades/kg de pienso y 30000 unidades/kg de pienso.
[0060] En una realización preferida, la fitasa se aplica a una dosis de entre 2 y 4 veces la dosis comercial estándar para esa fitasa.
[0061] En una realización, el animal monogástrico se selecciona del grupo que consta de cerdos, animales porcinos (que incluyen, entre otros, lechones, cerdos en crecimiento y cerdas); aves de corral, pavos, patos, codornices, gallinas de Guinea, gansos, palomas (incluyendo los pichones) y pollo (pollos de engorde, polluelos, ponedoras). En una realización preferida, el animal monogástrico se selecciona del grupo que consta de pollos, pollos de engorde, polluelos y ponedoras.
[0062] En una realización, la fitasa se obtiene del género Peniophora y la serina proteasa estable frente al ácido se obtiene de la familia Nocardiopsaceae, preferiblemente del género Nocardiopsis. En otra realización, la fitasa se obtiene de la familia Peniophoraceae y la serina proteasa estable frente al ácido se obtiene de la familia Peniophoraceae. En otra realización, la fitasa se obtiene de la familia Peniophoraceae y la serina proteasa estable frente al ácido se obtiene de la familia Micromonosporaceae. En otra realización, la fitasa se obtiene de la familia Peniophoraceae y la serina proteasa estable frente al ácido se obtiene de la familia Nocardioidaceae. En otra realización, la fitasa se obtiene de la familia Peniophoraceae y la serina proteasa estable frente al ácido se obtiene de la familia Bacillaceae, preferiblemente el género Bacillus.
[0063] En una realización particular, la invención se refiere a un método para mejorar la tasa de conversión alimenticia en animales monogástricos, el cual comprende el paso de aplicar al animal monogástrico un pienso con una cantidad eficaz de una o más enzimas proteolíticas en combinación con al menos una fitasa donde: a. la fitasa se obtiene de la familia Enterobacteriaceae y se administra en cantidades tales que la actividad específica en el pienso final está entre 1000 FYT/kg de pienso y 4000 FYT/kg de pienso;
b. la proteasa es una serina proteasa estable frente al ácido obtenida de la clase Actinobacteria y se administra en una dosis de entre 10000 unidades/kg de pienso y 20000 unidades/kg de pienso; y c. El animal monogástrico se selecciona del grupo que consta de pollos, pollos de engorde, polluelos y ponedoras.
[0064] En una realización preferida, la fitasa se aplica a una dosis de entre 2 y 4 veces la dosis comercial estándar para esa fitasa.
[0065] En una realización, la fitasa se obtiene de la familia Enterobacteriaceae y la serina proteasa estable frente al ácido es una proteasa S1 obtenida de la familia Nocardiopsaceae, preferiblemente del género Nocardiopsis. En una realización, la fitasa se obtiene del género Escherichia y la serina proteasa estable frente al ácido es una proteasa S1 obtenida del género Nocardiopsis. En una realización, la fitasa se obtiene del género Citrobacter y la
serina proteasa estable frente al ácido es una proteasa S1 obtenida del género Nocardiopsis. En una realización, la fitasa se obtiene del género Buttiauxella y la serina proteasa estable frente al ácido es una proteasa S1 obtenida del género Nocardiopsis. En una realización, la fitasa se obtiene del género Hafnia y la serina proteasa estable frente al ácido es una proteasa S1 obtenida del género Nocardiopsis
[0066] En otra realización, la fitasa se obtiene de la familia Enterobacteriaceae y la serina proteasa estable frente al ácido es una proteasa S8 obtenida de la familia Pseudonocardiaceae. En otra realización, la fitasa se obtiene de la familia Enterobacteriaceae y la serina proteasa estable frente al ácido es una proteasa S8 obtenida de la familia Micromonosporaceae. En otra realización, la fitasa se obtiene de la familia Enterobacteriaceae y la serina proteasa estable frente al ácido es una proteasa S8 obtenida de la familia Nocardioidaceae. En otra realización, la fitasa se obtiene de la familia Enterobacteriaceae y la serina proteasa estable frente al ácido se obtiene de la familia Bacillaceae, preferiblemente el género Bacillus.
[0067] En una realización particular, la invención se refiere a un método para mejorar la tasa de conversión alimenticia en animales monogástricos, el cual comprende el paso de aplicar al animal monogástrico un pienso con una cantidad eficaz de una o más enzimas proteolíticas en combinación con al menos una fitasa donde:
a. la fitasa se obtiene de la familia Peniophoraceae y se administra en cantidades tales que la actividad específica en el pienso final está entre 1000 FYT/kg de pienso y 4000 FYT/kg de pienso;
b. la proteasa es una serina proteasa estable frente al ácido obtenida de la clase Actinobacteria y se administra en una dosis de entre 10000 unidades/kg de pienso y 20000 unidades/kg de pienso; y c. El animal monogástrico se selecciona del grupo que consta de pollos, pollos de engorde, polluelos y ponedoras.
[0068] En una realización preferida, la fitasa se aplica a una dosis de entre 2 y 4 veces la dosis comercial estándar para esa fitasa.
[0069] En una realización, la fitasa se obtiene del género Peniophora y la serina proteasa estable frente al ácido es una proteasa S1 obtenida de la familia Nocardiopsaceae, preferiblemente del género Nocardiopsis. En otra realización, la fitasa se obtiene de la familia Peniophoraceae y la serina proteasa estable frente al ácido es una proteasa S1 obtenida de la familia Peniophoraceae. En otra realización, la fitasa se obtiene de la familia Peniophoraceae y la serina proteasa estable frente al ácido es una proteasa S1 obtenida de la familia Micromonosporaceae. En otra realización, la fitasa se obtiene de la familia Peniophoraceae y la serina proteasa estable frente al ácido es una proteasa S1 obtenida de la familia Nocardioidaceae. En otra realización, la fitasa se obtiene de la familia Peniophoraceae y la serina proteasa estable frente al ácido es una proteasa S8 obtenida de la familia Bacillaceae, preferiblemente el género Bacillus.
[0070] En una realización particular, la invención se refiere a un método para mejorar la tasa de conversión alimenticia en animales monogástricos, el cual comprende el paso de aplicar al animal monogástrico un pienso con una cantidad eficaz de una o más enzimas proteolíticas en combinación con al menos una fitasa donde:
a. la fitasa se obtiene del género Citrobacter y se administra en cantidades tales que la actividad específica en el pienso final está entre 1500 FYT/kg de pienso y 3500 FYT/kg de pienso;
b. la proteasa es una serina proteasa S1 estable frente al ácido obtenida del género Nocardiopsis y se administra en una dosis de entre 10000 unidades/kg de pienso y 20000 unidades/kg de pienso; y c. El animal monogástrico se selecciona del grupo que consta de pollos, pollos de engorde, polluelos y ponedoras.
[0071] En una realización particular, la invención se refiere a un método para mejorar la tasa de conversión alimenticia en animales monogástricos, el cual comprende el paso de aplicar al animal monogástrico un pienso con una cantidad eficaz de una o más enzimas proteolíticas en combinación con al menos una fitasa donde:
a. la fitasa se obtiene del género Buttiauxella y se administra en cantidades tales que la actividad específica en el pienso final está entre 1000 FYT/kg de pienso y 2000 FYT/kg de pienso;
b. la proteasa es una serina proteasa S1 estable frente al ácido obtenida del género Nocardiopsis y se administra en una dosis de entre 10000 unidades/kg de pienso y 20000 unidades/kg de pienso; y c. El animal monogástrico se selecciona del grupo que consta de pollos, pollos de engorde, polluelos y ponedoras.
[0072] En una realización particular, la invención se refiere a un método para mejorar la tasa de conversión alimenticia en animales monogástricos, el cual comprende el paso de aplicar al animal monogástrico un pienso con una cantidad eficaz de una o más enzimas proteolíticas en combinación con al menos una fitasa donde:
a. la fitasa se obtiene del género Buttiauxella y se administra en cantidades tales que la actividad específica en el pienso final está entre 1000 FYT/kg de pienso y 2000 FYT/kg de pienso;
b. la proteasa es una serina proteasa S8 estable frente al ácido obtenida del género Bacillus y se administra en una dosis de entre 10000 unidades/kg de pienso y 20000 unidades/kg de pienso; y
c. El animal monogástrico se selecciona del grupo que consta de pollos, pollos de engorde, polluelos y ponedoras.
[0073] En una realización particular, la invención se refiere a un método para mejorar la tasa de conversión alimenticia en animales monogástricos, el cual comprende el paso de aplicar al animal monogástrico un pienso con una cantidad eficaz de una o más enzimas proteolíticas en combinación con al menos una fitasa donde:
a. la fitasa se obtiene del género Escherichia y se administra en cantidades tales que la actividad específica en el pienso final está entre 1000 FYT/kg de pienso y 2000 FYT/kg de pienso;
b. la proteasa es una serina proteasa S8 estable frente al ácido obtenida del género Bacillus y se administra en una dosis de entre 10000 unidades/kg de pienso y 20000 unidades/kg de pienso; y
c. El animal monogástrico se selecciona del grupo que consta de pollos, pollos de engorde, polluelos y ponedoras.
[0074] En una realización particular, la invención se refiere a un método para mejorar la tasa de conversión alimenticia en animales monogástricos, el cual comprende el paso de aplicar al animal monogástrico un pienso con una cantidad eficaz de una o más enzimas proteolíticas en combinación con al menos una fitasa donde:
a. la fitasa se obtiene del género Escherichia y se administra en cantidades tales que la actividad específica en el pienso final está entre 1000 FYT/kg de pienso y 2000 FYT/kg de pienso;
b. la proteasa es una serina proteasa S8 estable frente al ácido obtenida del género Bacillus y se administra en una dosis de entre 10000 unidades/kg de pienso y 20000 unidades/kg de pienso; y
c. El animal monogástrico se selecciona del grupo que consta de pollos, pollos de engorde, polluelos y ponedoras.
Piensos para animales
[0075] En una realización particular, la fitasa y la proteasa están bien definidas en la forma en la que se agregan al pienso o cuando se incluyen en un aditivo para pienso. Bien definido significa que el preparado enzimático es al menos un 50 % puro en una base proteica. En otras realizaciones particulares, el preparado enzimático es al menos un 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 o al menos un 95 % puro. La pureza puede determinarse por cualquier método conocido en la técnica, p. ej., mediante SDS-PAGE o mediante cromatografía de exclusión por tamaño (véase el ejemplo 12 de WO 01/58275).
[0076] Un preparado enzimático bien definido es beneficioso. Por ejemplo, es mucho más fácil dosificar correctamente al pienso una enzima que está esencialmente libre de interferir o contaminar otras enzimas. El término "dosificar correctamente" se refiere en particular al objetivo de obtener resultados consistentes y constantes, y a la capacidad de optimizar la dosificación en función del efecto deseado.
[0077] Para los propósitos actuales, el término animal incluye a todos los animales, incluidos los seres humanos. En una realización particular, las variantes y composiciones de fitasa de la invención pueden usarse como un aditivo para piensos de animales no humanos. Ejemplos de animales son los rumiantes y los no rumiantes, como vacas, ovejas y caballos. En una realización particular, el animal es un animal no rumiante. Los animales no rumiantes incluyen animales monogástricos, p. ej., cerdos o animales porcinos (incluyendo, entre otros, lechones, cerdos en crecimiento y cerdas); aves de corral, tales como pavos, patos, codornices, gallinas de Guinea, gansos, palomas (incluyendo los pichones) y pollo (incluyendo, entre otros, pollos de engorde, polluelos, gallinas ponedoras (denominadas en el presente documento ponedoras); caballos (incluyendo, entre otros, sangre caliente, sangre fría y sangre templada), crustáceos (incluyendo, entre otros, gambas y langostinos) y peces (incluyendo, entre otros, serviola, arapaima, barbo, lubina, anjiva, bocachico, besugo, siluro, cachama, carpa, bagre, catla, sabalote, salvelino, cíclidos, cobia, bacalao, robaleta, dorada, corvina, anguila, gobio, pez dorado, gourami, mero, guapote, fletán, pez gato de cristal, labeo, lai, locha, caballa, pez de leche, mojarra, mújol, pacú, chromide verde, pejerrey, perca, lucio, pámpano, bermejuela, salmón, vundu, sauger, lubina, dorada, shiner, durmiente, cabeza de serpiente, pargo, róbalo, lenguado, pez conejo, esturión, pez luna, ayu, tenca, terror, tilapia, trucha, atún, rodaballo, corégono, lucioperca y pescado blanco). En una realización, el animal monogástrico se selecciona del grupo que consta de cerdos, animales porcinos (que incluyen, entre otros, lechones, cerdos en crecimiento y cerdas); aves de corral, pavos, patos, codornices, gallinas de Guinea, gansos, palomas (incluyendo los pichones) y pollo (pollos de engorde, polluelos, ponedoras). En una realización preferida, el animal monogástrico se selecciona del grupo que consta de pollos, pollos de engorde, polluelos y ponedoras.
[0078] El término pienso o composición de pienso significa cualquier compuesto, preparado, mezcla o composición adecuada o destinada a ser ingerida por un animal. El pienso se puede administrar al animal antes, después o simultáneamente a la dieta. Esto último es lo preferido.
[0079] La composición de la invención, cuando está pensada para añadirse al pienso para animales, puede designarse como un aditivo para piensos de animales. Dicho aditivo siempre comprende las enzimas en cuestión, preferiblemente en forma de composiciones estabilizadas líquidas o secas. El aditivo puede comprender otros componentes o ingredientes del pienso para animales. Las denominadas premezclas para pienso de animales son ejemplos particulares de dichos aditivos para pienso de animales. Las premezclas pueden contener las enzimas en cuestión y, además, al menos una vitamina y/o al menos un mineral.
[0080] En un ejemplo preferido, la fitasa y la proteasa, que se añaden al pienso a través de una composición de aditivo para pienso, se dosifican de manera que el pienso final tenga las siguientes dosis:
Fitasa: al menos 2000 FYT/kg de pienso y Proteasa: 15000 unidades/kg de pienso o
Fitasa: 3000 FYT/kg de pienso y Proteasa: 15000 unidades/kg de pienso.
[0081] En otro ejemplo preferido, la fitasa y la proteasa, que se añaden al pienso a través de una composición de aditivo para pienso, se dosifican de manera que el pienso final tenga las siguientes dosis:
Fitasa: de 1700 a 2300 FYT/kg de pienso y Proteasa: de 12000 a 18000 unidades/kg de pienso o Fitasa: de 2700 a 3300 FYT/kg de pienso y Proteasa: de 12000 a 18000 unidades/kg de pienso.
[0082] Por consiguiente, en una realización particular, además de los componentes polipeptídicos, la composición de la invención puede comprender o contener al menos una vitamina liposoluble y/o al menos una vitamina hidrosoluble y/o al menos un oligoelemento. También se puede incluir al menos un macromineral.
[0083] Ejemplos de vitaminas liposolubles son las vitaminas A, D3, E y vitamina K, p. ej., vitamina K3
[0084] Ejemplos de vitaminas hidrosolubles son la vitamina B12, la biotina y la colina, la vitamina B1, la vitamina B2, la vitamina B6, la niacina, el ácido fólico y el pantotenato, p. ej., Ca-D-pantotenato.
[0085] Ejemplos de oligoelementos son el manganeso, el zinc, el hierro, el cobre, el yodo, el selenio y el cobalto.
[0086] Ejemplos de macrominerales son el calcio, el fósforo y el sodio.
[0087] Además, los ingredientes opcionales de los aditivos para pienso son los agentes colorantes, los compuestos aromáticos, los estabilizadores, las enzimas adicionales y los péptidos antimicrobianos.
[0088] Los componentes enzimáticos adicionales de la composición de la invención incluyen al menos un polipéptido que tiene actividad xilanasa; y/o al menos un polipéptido que tiene actividad endoglucanasa; y/o al menos un polipéptido que tiene actividad endo-1,3(4)-beta-glucanasa.
[0089] La actividad de xilanasa puede medirse usando cualquier ensayo, en el que se emplee un sustrato, que incluya endoenlaces 1,4-beta-D-xilosídicos en xilanos. Hay diferentes tipos de sustratos disponibles para la determinación de la actividad de xilanasa, p. ej., comprimidos de arabinoxilano reticulado Xylazyme (de MegaZyme), o dispersiones de polvo insolubles y soluciones de arabinoxilano teñido de azo.
[0090] La actividad de endoglucanasa se puede determinar usando cualquier ensayo de endoglucanasa conocido en la técnica. Por ejemplo, se pueden aplicar varios sustratos que contengan celulosa o beta-glucano. Un ensayo de endoglucanasa puede usar beta-glucano de AZCL-cebada o preferiblemente (1) AZCL-HE-celulosa o (2) Azo-CM-celulosa como sustrato. En ambos casos, la degradación del sustrato se sigue espectrofotométricamente a OD595 (ver el método Megazyme para los AZCL-polisacáridos para el ensayo de endohidrolasas en http://www.megazyme.com/booklets/AZCLPOL.pdf.
[0091] La actividad de endo-1,3(4)-beta-glucanasa se puede determinar usando cualquier ensayo de endo-1,3(4)-beta-glucanasa conocido en la técnica. Un sustrato preferido para las mediciones de la actividad de endo-1,3(4)-beta-glucanasa es un sustrato de beta-glucano de cebada con colorante azo y reticulado, en el que las mediciones se basan en principios de determinación espectrofotométrica.
[0092] Para analizar la actividad xilanasa, endoglucanasa, beta-1,3(4)-glucanasa y proteasa, el pH y la temperatura del ensayo deben adaptarse a la enzima en cuestión (preferiblemente un pH cercano al pH óptimo y una temperatura cerca de la temperatura óptima). Un pH de ensayo preferido está en el rango de 2-10, preferiblemente 3-9, más preferiblemente pH 3 o 4 o 5 o 6 o 7 u 8, por ejemplo pH 3 o pH 7. Una temperatura de ensayo preferida está en el rango de 20-80 °C, preferiblemente 30-80 °C, más preferiblemente 40-75 °C, incluso más preferiblemente 40-60 °C, preferiblemente 40 o 45 o 50 °C. La actividad enzimática se define mediante referencia a los ciegos apropiados, p. ej., tampón ciego.
[0093] Ejemplos de péptidos antimicrobianos (AMP) son CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1,
Thanatina, Lactoferrina, Lactoferricina y Ovispirina, por ejemplo, Novispirina (Robert Lehrer, 2000), y variantes o fragmentos de los mismos que retienen la actividad antimicrobiana. Otros ejemplos son los polipéptidos antifúngicos (AFP) como los derivados de Aspergillus giganteus y Aspergillus niger, así como las variantes y fragmentos de los mismos que retienen la actividad antifúngica, tal como se describe en WO 94/01459 y PCT/DK02/00289.
[0094] En una realización particular, el aditivo para piensos de animales de la invención está destinado a incluirse (o se ha prescrito que tiene que incluirse) en dietas o piensos para animales a niveles de 0.0010-12.0 %, o 0.0050-11.0 %, o 0.0100-10.0 % ; más particularmente 0.05-5.0 %; o 0.2-1.0 % (% significa g de aditivo por 100 g de pienso). Esto es así en particular para las premezclas.
[0095] En consecuencia, las concentraciones de los componentes individuales del aditivo para pienso animal, p. ej., la premezcla, se pueden encontrar multiplicando la concentración final en el pienso del mismo componente por, respectivamente, 10-10000; 20-2000; o 100-500 (refiriéndose a los tres intervalos de inclusión porcentuales anteriores).
[0096] Las concentraciones finales en el pienso de componentes importantes pueden reflejar los requisitos nutricionales del animal, que generalmente son conocidos por el nutricionista experto, y se presentan en publicaciones como las siguientes: NRC, Nutrient requirements in swine, novena edición revisada 1988, subcomité de nutrición porcina, comité de nutrición animal, consejo de agricultura, consejo nacional de investigación. National Academy Press, Washington, D.C. 1988; y NRC, Nutrient requirements of poultry, novena edición revisada 1994, subcomité de nutrición de aves de corral, comité de nutrición animal, consejo de agricultura, consejo nacional de investigación, National Academy Press, Washington, D.C. 1994.
[0097] La composición de la invención se puede preparar según métodos conocidos en la técnica, p. ej., mezclando la fitasa y la proteasa con los ingredientes adicionales, si los hay.
[0098] Las composiciones o dietas de piensos para animales tienen un contenido relativamente alto de proteínas Una composición de pienso para animales según la invención tiene un contenido de proteína bruta de 50-800, o 75-700, o 100-600, o 110-500, o 120-490 g/kg, y además comprende una composición de la invención.
[0099] Además, o como alternativa (al contenido de proteína bruta indicado anteriormente), la composición de pienso para animales de la invención tiene un contenido de energía metabolizable de 10-30, 11-28, 11-26 o 12 25 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de 0.1-200, o 0.5-150, o 1-100, o 4-50 g/kg; y/o un contenido de fósforo disponible de 0.1-200, o 0.5-150, o 1-100, o 1-50, o 1-25 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0.1-100, o 0.5 75, o 1-50, o 1-30 g/kg; y/o un contenido de metionina más cisteína de 0.1-150, o 0.5-125, o 1-80 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0.5-50, o 0.5-40, o 1-30 g/kg.
[0100] La proteína bruta se calcula como nitrógeno (N) multiplicado por un factor 6.25, es decir, proteína bruta (g/kg) = N (g/kg) x 6.25 como se indica en Animal Nutrition, 4a edición, Capítulo 13 (Eds. P. McDonald, R. A. Edwards y J. F. D. Greenhalgh, Longman Scientific and Technical, 1988, ISBN 0-582-40903-9). El contenido de nitrógeno se puede determinar mediante el método Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis, 14a edición, Association of Official Analytical Chemists, Washington DC). Pero también se pueden usar otros métodos, como el llamado método Dumas en el que la muestra se quema en presencia de oxígeno y la cantidad de gases nitrosos formados se analiza y recalcula como nitrógeno.
[0101] La energía metabolizable se puede calcular sobre la base de la publicación de NRC Nutrient Requirements of Swine (1988) págs. 2-6, y la European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Países Bajos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.
[0102] En una realización particular, la composición de pienso para animales de la invención contiene al menos una proteína vegetal o una fuente de proteínas. Ejemplos de proteínas vegetales o fuentes de proteínas son la soja, los guisantes y las semillas de colza de las familias de las leguminosas y de la brassica, y los cereales como la cebada, el maíz, la avena, el arroz, el centeno, el sorgo y el trigo.
[0103] Las dietas para animales pueden, por ejemplo, fabricarse como pienso en harina (no granulado) o granulado.
[0104] Típicamente, los piensos molidos se mezclan, y se añaden cantidades suficientes de vitaminas y minerales esenciales de acuerdo con las especificaciones para la especie en cuestión.
[0105] La fitasa y la proteasa de la invención se pueden agregar en forma de formulación enzimática sólida o líquida, o en forma de aditivo para pienso, tal como una premezcla. Normalmente se agrega una composición sólida antes o durante la etapa de mezcla; y típicamente se agrega una composición líquida después de la etapa de granulación.
[0106] La fitasa y la proteasa de la invención cuando se agregan al pienso para animales llevan a un valor nutricional mejorado del pienso, p. ej., mejoran la tasa de crecimiento y/o el aumento de peso y/o la conversión alimenticia (es decir, el peso del alimento ingerido en relación con el aumento de peso) del animal.
[0107] En realizaciones particulares, el aumento de peso es al menos un 101, un 102, un 103, un 104, un 105, un 106, un 107, un 108, un 109 o al menos un 110 % del control (sin adición de enzimas).
[0108] En realizaciones particulares adicionales, la conversión alimenticia es como máximo (o de no más de) un 99, un 98, un 97, un 96, un 95, un 94, un 93, un 92, un 91 o como máximo un 90 %, en comparación con el control (sin adición de enzimas).
[0109] La presente invención se describe además mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención.
Ejemplo 1: actividad específica de las fitasas
[0110] La actividad específica de las fitasas se puede determinar en muestras altamente purificadas dializadas frente acetato de sodio 20 mM, pH 5.5. La pureza se puede verificar de antemano en un gel de poli(acrilamida) con SDS que muestra la presencia de un solo componente.
[0111] La concentración de proteína se puede determinar mediante análisis de aminoácidos de la siguiente manera: se hidroliza una parte alícuota de la muestra en HCl 6N, fenol al 0.1 % durante 16 horas a 110 °C en un tubo de vidrio evacuado. Los aminoácidos resultantes se cuantifican usando un sistema de análisis de aminoácidos Applied Biosystems 420A que funciona según las instrucciones del fabricante. A partir de las cantidades de los aminoácidos, se puede calcular la masa total, y por lo tanto también la concentración de proteína en la parte alícuota hidrolizada.
[0112] La actividad de fitasa se determina en unidades de FYT, y la actividad específica se calcula como la actividad de fitasa medida en unidades de FYT por mg de proteína enzimática variante de fitasa. La actividad de fitasa se puede determinar usando el siguiente ensayo.
Determinación de la actividad de fitasa
[0113] 75 microlitros de solución enzimática con contenido de fitasa, diluida adecuadamente en acetato de sodio 0.25 M, 0.005 % (p/v) de Tween-20, pH 5.5, se dispensa en un pocillo de placa de microtitulación, p. ej., NUNC 269620, y se añaden 75 microlitros de sustrato (preparados mediante la disolución de 100 mg de fitato de sodio del arroz (Aldrich Cat. n.° 274321) en 10 ml de tampón de acetato de sodio 0.25 M, pH 5.5). La placa se sella, se incuba durante 15 minutos y se agita con 750 rpm a 37 °C. Después de la incubación, se agrega reactivo de parada de 75 microlitros (el reactivo de parada se prepara mezclando 10 ml de solución de molibdato (10 % (p/v) de heptamolibdato de amonio en solución de amoniaco al 0.25 % (p/v)), 10 ml de vanadato de amonio (0.24 % de producto comercial de Bie & Berntsen, número de catálogo LAB17650) y 20 ml de ácido nítrico al 21.7 % (p/v)) y la absorbancia a 405 nm se mide en un espectrofotómetro de placa de microtitulación. La actividad de fitasa se expresa en la unidad de FYT, siendo un FYT la cantidad de enzima que libera 1 micromol de ortofosfato inorgánico por minuto en las condiciones anteriores. Un valor absoluto para la actividad de fitasa medida se puede obtener por referencia a una curva estándar preparada a partir de diluciones apropiadas de fosfato inorgánico, o por referencia a una curva estándar hecha a partir de diluciones de un preparado de enzima fitasa con actividad conocida (tal preparado enzimático estándar con una actividad conocida está disponible bajo pedido en Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd).
Ejemplo 2: Ensayo de pollos de engorde in vivo 1
[0114] Se investigó el efecto sobre el rendimiento de crecimiento de los pollos de engorde usando piensos con diferentes cantidades y combinaciones de enzimas (Ronozyme®ProAct y Ronozyme®HiPhos). La prueba duró 21 días y tuvo 7 tratamientos con 6 jaulas replicadas de 6 aves por jaula.
[0115] La dieta (dieta NC), tal como se usó en el ensayo, fue una dieta con concentraciones bajas de avP/Ca y moderadas de fitato (tabla 1). Las condiciones experimentales se muestran en la tabla 2 y los resultados se presentan en la tabla 3.
T l 1: Di
T l ^Tr mi n x rim n l ^T
[0116] En particular, los resultados de TCA muestran que la proteasa se beneficia cada vez más de una dosificación cada vez mayor de fitasa. Con respecto a la combinación de los productos enzimáticos Ronozyme®ProAct y Ronozyme®HiPhos como se ha mostrado anteriormente en el presente documento, el efecto realmente fuerte de la proteasa se observó sorprendentemente a 3000 FYT/kg de actividad de fitasa. Ejemplo 3: Ensayo de pollos de engorde in vivo 2
[0117] Se investigó el efecto sobre el rendimiento de crecimiento de los pollos de engorde usando piensos con diferentes cantidades y combinaciones de fitasa y proteasa (Ronozyme®ProAct y Axtra®PHY). Los tratamientos individuales se dan en la tabla 4. El ensayo tuvo una duración de 36 días y cada tratamiento tenía 6 jaulas replicadas de 18 aves por jaula.
[0118] La dieta (dieta NC) tal como se usa en el ensayo es una dieta con baja avP/Ca (ver tabla 5 y tabla 6).
^
^ ^ ^ ^ ^ ^
T l : Di
Claims (14)
1. Método para aumentar la ganancia de peso y/o mejorar la tasa de conversión alimenticia en animales de granja, el método comprende el paso de aplicar al animal un pienso con una cantidad eficaz de una o más enzimas proteolíticas en combinación con al menos una fitasa en donde:
a. la fitasa se administra en cantidades tales que la actividad específica en el pienso final está entre 1000 FYT/kg de pienso y 4000 FYT/kg de pienso y
b. la proteasa es una serina proteasa estable frente al ácido administrada en una dosis de entre 10000 unidades/kg de pienso y 30000 unidades/kg de pienso.
2. Método según la reivindicación 1, donde:
a. la fitasa se administra en una o más de las siguientes cantidades: 1000, 2000 o 3000 FYT/kg de pienso y
b. la proteasa se administra en una de las siguientes cantidades: 10000 unidades/kg de pienso, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000, 20000 unidades/kg de pienso
3. Método según la reivindicación 2, donde las enzimas se administran de la siguiente manera:
a. Fitasa: 3000 FYT/kg de pienso y
b. Proteasa: 15000 unidades/kg de pienso.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la fitasa se clasifica como perteneciente al grupo EC 3.1.3.26.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la fitasa se obtiene de la familia Enterobacteriaceae.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la proteasa es una serina proteasa estable frente al ácido obtenida u obtenible a partir de la clase Actinobacteria.
7. Método según la reivindicación 6, donde la proteasa es una serina proteasa estable frente al ácido obtenida de Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235 (A1918L1), Nocardiopsis prasina DSM 15649 (NN018335L1), Nocardiopsis prasina (anteriormente alba) DSM 14010 (NN18140L1), Nocardiopsis sp. DSM 16424 (NN018704L2), Nocardiopsis alkaliphila DSM 44657 (NN019340L2) y Nocardiopsis lucentensis DSM 44048 (NN019002L2), así como proteasas homólogas.
8. Uso de una o más enzimas proteolíticas en combinación con al menos una fitasa en el pienso para animales con el fin de aumentar la ganancia de peso y/o mejorar la tasa de conversión alimenticia en animales de granja, donde:
a. la fitasa se administra en cantidades tales que la actividad específica en el pienso final está entre 1000 FYT/kg de pienso y 4000 FYT/kg de pienso y
b. la proteasa es una serina proteasa estable frente al ácido administrada en una dosis de entre 10000 unidades/kg de pienso y 30000 unidades/kg de pienso.
9. Uso según la reivindicación 8, en el que:
a. la fitasa se administra en una o más de las siguientes cantidades: 1000, 2000 o 3000 FYT/kg de pienso y
b. la proteasa se administra en una de las siguientes cantidades: 10000 unidades/kg de pienso, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 16000, 17000, 18000, 19000, 20000 unidades/kg de pienso.
10. Uso según la reivindicación 9, en el que las enzimas se administran de la siguiente manera:
a. Fitasa: 3000 FYT/kg de pienso y
b. Proteasa: 15000 unidades/kg de pienso.
11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde la fitasa se clasifica como perteneciente al grupo EC 3.1.3.26.
12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, donde la fitasa se obtiene de la familia Enterobacteriaceae.
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, donde la proteasa es una serina proteasa estable frente al ácido obtenida u obtenible a partir de la clase Actinobacteria.
14. Uso según la reivindicación 13, donde la proteasa es una serina proteasa estable frente al ácido obtenida de Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235 (A1918L1), Nocardiopsis prasina DSM 15649 (NN018335L1), Nocardiopsis prasina (anteriormente alba) DSM 14010 (NN18140L1), Nocardiopsis sp. DSM 16424 (NN018704L2), Nocardiopsis alkaliphila DSM 44657 (NN019340L2) y Nocardiopsis lucentensis DSM 44048 (NN019002L2), así como proteasas homólogas.
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