WO1997049714A1 - Verfahren zur kombination von paralleler oligonukleotidsynthese und darstellung von oligomer-chips - Google Patents

Verfahren zur kombination von paralleler oligonukleotidsynthese und darstellung von oligomer-chips Download PDF

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    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries

Definitions

  • the invention relates to a method for combining parallel oligonucleotide synthesis and preparation of oligomer chips.
  • oligonucleotides are required for these applications. This has raised the problem of having to produce different oligomers in small quantities at the same time.
  • oligomer chip technology plays an increasing role in diagnostic DNA analysis in molecular biology. Also regarding many methods of genome analysis, e.g. for “sequencing by hybridization", there is great potential in the use of matrices to which ordered oligonucleotide screens have been applied.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method with which it is possible to provide in a simple manner different oligonucleotides which can serve as "oligomer chips" for hybridization experiments on the one hand, but can also be removed in an orderly manner and thus are available on the other hand for molecular biological reactions like PCR or Are DNA sequencing.
  • the inventors are in the process of developing their new method of "oligomer chip technology" (Southern, EM et al., Genomics 1 3, 1008-1017; Caviani-Pease, AC et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 91, 5022-5026), which has hitherto been used for the sequencing of DNA.
  • This technique uses a matrix with short oligonucleotide sequences attached to it as a target for hybridization experiments. Care is taken to ensure that the oligonucleotides bound to the matrix are firmly attached to it.
  • hybridization analyzes of DNA by means of oligomer chip technology or to remove the oligonucleotides in an orderly manner, in order then to use them for PCR purposes or in the enzymatic sequencing of DNA or as a probe for hybridizations.
  • a polymer film or a glass surface can be used as the matrix on which the oligonucleotides are bound, but an aminated polypropylene film which is further surface-modified is preferred.
  • a possible surface modification is the attachment of alkylamino groups, preferably methylamino groups. This is done, for example, by shaking an aminated polypropylene film in a mixture of dry dichloromethane, dry dioxane, p-nitrophenyl chloroformate and triethylamine for a few hours. After washing with dichloromethane, the film is shaken in a mixture of pyridine and acetic anhydride for a few hours, as a result of which remaining amino groups are saturated on the surface.
  • the film is then washed with dichloromethane and taken up in acetonitrile or dimethylformamide. 1, 6-bis (methylamino) hexane is added and that The mixture is shaken for a few hours to several days. After washing with DMF, methanol and acetone, the methylamino-modified membrane is dried.
  • a protruding matrix in particular a methylamino-modified membrane, can be clamped in a synthesis chamber, for example one as shown in Fig. 1.
  • 3'-succinate derivatives of protected nucleosides (dA NPEOC , dC NPE0C , dG NPE0C / NPE , dT and fluorescein-labeled dC) can be applied to the matrix, the 3'-succinate derivatives as described in Kierzek et al. (Biochemistry 25, pp. 7840-7846 (1 986)).
  • nucleoside 3'-succinates are mixed with an organic solvent, for example N-methylmorphoiin and acetonitrile, before 0 - [ ⁇ ethoxycarbonyl) cyanomethyleneamino] N, N, N ', N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate ( TOTU) is added.
  • organic solvent for example N-methylmorphoiin and acetonitrile
  • TOTU 0 - [ ⁇ ethoxycarbonyl) cyanomethyleneamino] N, N, N ', N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate
  • This reaction mixture is fed into the synthesis chamber and a simple preset cycle is activated in the chamber. This cycle looks, for example, such that the rows on the matrix, preferably the methylamino-modified polypropylene film, are moistened with the reaction mixture and incubated for a certain time, for example 30 minutes.
  • the reagents are then rinsed and the series washed a few times with an organic solvent such as acetonitrile.
  • an organic solvent such as acetonitrile.
  • this is treated with a mixture of pyridine and acetic anhydride for several hours.
  • the matrix removed from the synthesis chamber can be treated in a mixture of acetane hydride, pyridine and N-methylimidazole. After washing with DMF, methanol and acetone, the matrix is dried.
  • the matrix is removed from the synthesis chamber and shaken in 1 M 1,8-diazabicyclo- (5.4.0) -undec-7en (DBU) in acetonitrile to deprotect the oligonucleotides.
  • DBU 1,8-diazabicyclo- (5.4.0) -undec-7en
  • the matrix is washed, e.g. with acetonitrile and acetone.
  • the desired area of the resulting oligomer chip is cut out and after an incubation in 30% aqueous ammonia for a few hours, for example 2 hours, the detached Most oligonucleotide products lyophilized and used for PCR or DNA sequencing methods.
  • the ⁇ -eliminating base protecting groups 2-nitrophenylethyl (NPE) and 2- (4-nitrophenyl) ethoxycarbonyl (NPEOC) are used. These functions allow the biopolymer to be deprotected by the strong but non-nucleophilic base DBU, while the oligonucleotides remain bound on the matrix.
  • Fig. 1 Reaction chamber for oligonucleotide synthesis on polypropylene film, the device being aligned so that it allows a 90 ° rotation of the polypropylene film between the synthesis steps.
  • Fig. 3 Separation of the solid-phase bound oligonucleotides from the
  • NPE / NPEOC strategy allows the alternative use of the oligomer chips for either hybridization experiments (option I) or as a source for the isolation of individual primer molecules (option II).
  • Fig. 4 Activation of the methylamino-modified polypropylene film
  • Fig. 5 Exemplary hybridizations to oligomer arrangements on polypropylene membranes.
  • s 2.6), dC bz (column 1) and dC "(column 4.8 ) were applied to a polypropylene film using an 8-channel synthesizer, the film was then removed from the reaction chamber and rotated through 90 °, after which 7 different oligonucleotides were synthesized (AH), the 49 sites with 28 different sequences A channel was left empty in both dimensions as a control (lanes 5 and D).
  • Fig. 6 PCR amplification of a plasmid insert. Both commercial
  • Primers were used for the reaction which is shown in lane 1.
  • each of the primers was replaced by oligonucleotides isolated from a 0.16 cm 2 piece of the polypropylene film treated according to the invention.
  • Marker (lane D) is HindIII-digested DNA-DNA and plasmid pUC1 8-DNA cut with Fspl.
  • a polyoxymethylene (POM) block was made to contain 8 channels, each 1 mm deep, 70 mm long and 4 mm wide, with two holes at both ends for connection to the inlet and outlet of a conventional DNA synthesizer .
  • the polypropylene film was held in place by a silicone seal and a plexiglass cover screwed onto the POM base (Fig. 1).
  • Foil in the polyoxymethylene block applied.
  • 5 mg of the desired nucleoside 3'-succinate were mixed with 25 ⁇ ⁇ N-methylmorphoiin and 10 ml acetonitrile before adding 4 mg TOTU.
  • the bottle with the mixture was immediately connected to a DNA synthesizer and a simple pre-programmed cycle in the device was activated: first the rows were wetted with the reaction mixture and the reaction was incubated for 30 min; then the reagents were purged with argon and the series was washed several times with acetonitrile.
  • acetic anhydride and N-methiimidazole in acetonitrile were applied.
  • the derivatized polypropylene membranes were removed from the chamber and mixed in a mixture of 10 ml of acetic anhydride, 10 ml of dry pyridine and 1 ml of N-methylimidazole for 2 hours shaken in a polypropylene box. After subsequent washing with DMF, methanol and acetone, the films were dried and stored at 4 ° C until used.
  • the oligonucleotide synthesis was carried out on the polypropylene film as shown in Table 1 above. After complete synthesis, the films were removed from the chamber and shaken in 1 M DBU in acetonitrile in a polypropylene box at 40 ° C. overnight. The membrane was washed with acetonitrile and acetone before being used either for hybridization experiments or to detach the oligomers.
  • Oligonucleotide probes were end-labeled with [y 32 ?] ATP under standard conditions.
  • the desired locations of the oligomer arrangement were cut out on the polypropylene film. After incubation in 30% aqueous ammonia for 2 h, the detached oligonucleotide products were lyophilized and used for the PCR and DNA sequencing experiments without further purification.
  • a PCR was carried out on the recombinant plasmid pTZ18R under standard conditions, as previously described (Scholler et al., Nucleic Acids Res. 23, pages 3842-3849, (1 995)).
  • Primers were 26 and 29 mers that bind to the vector next to each side of the insert DNA.
  • An amount of oligonucleotides covering an area of 0.16 cm 2 corresponded to the polypropylene surface was used in the reactions with 25 ⁇ ⁇ volume.
  • a PCR was carried out: primer annealing and extension at 68 ° C, strand denaturation at 95 ° C. The products were compared on an agarose gel with the results obtained with conventional commercial primer molecules which had been used in a concentration of 1 ⁇ M. As can be seen from Fig. 6, there was no significant difference in quality and quantity of the PCR products.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur parallelen Synthese von Oligonukleotiden auf einer Alkylamino-modifizierten Matrixoberfläche, dadurch gekennzeichnet, daß 3-Succinat-Derivate von geschützen Nukleosiden darauf angebracht werden und Oligonukleotidsynthese mittels automatisierter DNA-Synthese stattfindet. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des bei dem Verfahren entstehenden Oligomer-Chips.

Description

"Verfahren zur Kombination von paralleler Oligonukleotidsynthese und Dar¬ stellung von Oligomer-Chips"
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kombination von paralleler Oligonukleo¬ tidsynthese und Darstellung von Oligomer-Chips.
Angeregt durch die Kombination von Festphasentechnologie und der Phosphor- amiditchemie, gab es große Fortschritte in der Automation der DNA-Synthese.
Heute findet die Herstellung synthetischer Oligonukleotide, die für biologische, biomedizinische und physikalische Anwendungen gebraucht werden, in automa¬ tisierten DNA-Synthesegeräten statt. Diese Geräte produzieren Oligonukleotide im Nano- bis Mikromol-Bereich. Jedoch gab es in den letzten Jahren zwei gegen- läufige Tendenzen bezüglich der Oligomersynthese. Für klinische Anwendungen, wie z.B. für die Antisense-Strategie, sind Gramm- oder sogar Kilogramm-Mengen an Oligonukleotiden erforderlich, was eine Erhöhung des Maßstabs bei der Oligo¬ mersynthese notwendig macht. Dagegen sind für Anwendungen in der Moleku¬ larbiologie, z.B. bei der Polymerasekettenreaktion oder beim Sequenzieren von DNA, nur Oligomermengen im Picomolbereich erforderlich. Allerdings werden für diese Anwendungen eine Anzahl unterschiedlicher Oligonukleotide benötigt. Dies hat das Problem aufgeworfen, gleichzeitig verschiedene Oligomere in kleinen Mengen produzieren zu müssen. Andererseits spielt in der Molekularbiologie die sogenannte "Oligomer-Chip Technologie" eine zunehmende Rolle in der diagno- stischen DNA-Analyse. Auch bezüglich vieler Methoden der Genomanalyse, z.B. für das "Sequenzieren durch Hybridisieren", steckt ein großes Potential in der Verwendung von Matrizen, auf die geordnete Oligonukleotid-Raster aufgebracht wurden.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem es möglich ist, auf einfache Weise möglichst verschie¬ dene Oligonukleotide bereitzustellen, die einerseits als "Oligomer-Chips" für Hybridisierungsexperimente dienen können, andererseits aber auch geordnet ablösbar und somit verfügbar für molekularbiologische Reaktionen wie PCR oder DNA-Sequenzierung sind.
Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Verfahren gemäß Patentanspruch 1 . Bevor¬ zugte Ausführungsformen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Die Erfinder sind bei der Entwicklung ihres neuen Verfahrens von der "Oligomer- chip-Technologie" (Southern, E.M. et al., Genomics 1 3, 1008-1017; Caviani- Pease, A.C. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91 , 5022-5026) ausgegangen, die bisher für die Sequenzierung von DNA eingesetzt wurde. Bei dieser Technik wird eine Matrix mit kurzen daran gebundenen Oligonukleotidsequenzen als Ziel für Hybridisierungsexperimente eingesetzt. Dabei wird darauf geachtet, daß die an die Matrix gebundenen Oligonukleotide fest damit verbunden sind.
Von den Erfindern wurde nun diese Bindung der Oligonukleotide an die Matrix so modifiziert, daß es einerseits möglich ist, den entstehenden Oligomerchip zu
Hybridisierungsanalysen von DNA mittels Oligomerchip-Technologie einzusetzen oder die Oligonukleotide geordnet abzulösen, um sie dann für PCR-Zwecke oder bei der enzymatischen Sequenzierung von DNA bzw. als Sonde für Hybridi¬ sierungen einzusetzen.
Als Matrix, auf der die Oligonukleotide gebunden werden, kann eine Poiymerfolie oder eine Glasoberfläche eingesetzt werden, bevorzugt ist jedoch eine aminierte Polypropylenfolie, die weiter oberflächenmodifiziert wird. Eine mögliche Ober¬ flächenmodifizierung ist die Anbringung von Alkylamino-Gruppen, bevorzugt Methylamino-Gruppen. Dies geschieht beispielsweise dadurch, daß eine aminier¬ te Polypropylenfolie in einem Gemisch von trockenem Dichlormethan, trockenem Dioxan, p-Nitrophenylchlorformiat und Triethylamin für einige Stunden geschüt¬ telt wird. Nach Waschen mit Dichlormethan, wird die Folie in einem Gemisch von Pyridin und Acetanhydrid für einige Stunden geschüttelt, wodurch ver- bliebene Aminogruppen auf der Oberfläche abgesättigt werden. Nachfolgend wird die Folie mit Dichlormethan gewaschen und in Acetonitril oder Dimethylfor- mamid aufgenommen. Es wird 1 ,6-Bis(methylamino)-hexan zugesetzt und das Gemisch für einige Stunden bis mehrere Tage geschüttelt. Nach Waschen mit DMF, Methanol und Aceton, wird die Methylamino-modifizierte Membran ge¬ trocknet.
Eine vorstehende Matrix, insbesondere eine Methylamino-modifizierte Membran, kann in eine Synthesekammer, z.B. eine wie in Abb. 1 gezeigt, eingespannt werden. Auf die Matrix können 3'-Succinatderivate von geschützten Nukleosi- den (dANPEOC, dCNPE0C, dGNPE0C/NPE, dT und Fluorescein-markiertes dC) aufgebracht werden, wobei die 3'-Succinatderivate wie in Kierzek et al. (Biochemistry 25, S. 7840-7846 ( 1 986)) beschrieben, hergestellt werden können. Für das Aufbringen werden gewünschte Nukleosid-3'-Succinate mit einem organischen Lösungs¬ mittel, z.B. N-Methylmorphoiin und Acetonitril, gemischt, bevor 0-[{Ethoxycarbo- nyl)cyanomethylenamino]N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluorborat (TOTU) zugesetzt wird. Dieses Reaktionsgemisch wird in die Synthesekammer gespeist und ein einfacher voreingegebener Zyklus in der Kammer aktiviert. Dieser Zyklus sieht beispielsweise so aus, daß die Reihen auf der Matrix, vorzugsweise der Methylamino-modifizierten Polypropylenfolie, mit dem Reaktionsgemisch be¬ feuchtet werden und für eine bestimmte Zeit, z.B. 30 Minuten, inkubiert wer¬ den. Dann werden die Reagentien abgespült und die Reihen einige Male mit einem organischen Lösungsmittel, wie Acetonitril, gewaschen. Zum Blockieren der restlichen Methylaminogruppen auf der Matrix wird diese mit einem Gemisch von Pyridin und Acetanhydrid für mehrere Stunden behandelt. Alternativ kann die aus der Synthesekammer entfernte Matrix in einem Gemisch von Acetanhy¬ drid, Pyridin und N-Methyiimidazol behandelt werden. Nach Waschen mit DMF, Methanol und Aceton wird die Matrix getrocknet.
Für die Oligonukleotidsγnthese kann es günstig sein, nachstehendes Schema zu verwenden. Zur Durchführung eignet sich z.B. die in Fig. 1 gezeigte Synthese¬ kammer. Modifikationen des Schemas hinsichtlich Abfolge der Schritte, Aus- tausch der Reagentien bzw. Lösungsmittel und Inkubationszeiten liegen im
Können des Fachmanns und das Schema soll für die Erfindung in keinster Weise beschränkend ausgelegt werden. TABELLE 1
Schema einer Oligonukieotidsynthese
Schritt Reaαenz oder Lösunαsmittel Zeit (s)
Waschen Acetonitril 30
Detritylierung 3 % TCA in Dichlormethan 80
Waschen Acetonitril 210
Koppeln 75 mM Phosphoramidit + 0,5 M Tetrazol in Acetonitril 40
Waschen Acetonitril 30
Ablösen Acetanhydrid/N-Methylimidazol in Acetonitril 50
Oxidation 1 M t-Butylhydroperoxid in Acetonitril 130 Waschen Acetonitril 120
Nach vollständiger Synthese wird die Matrix aus der Synthesekammer entfernt und in 1 M 1 ,8-Diazabicyclo-(5.4.0)-undec-7en (DBU) in Acetonitril zur De- protektion der Oligonukleotide geschüttelt. Vor dem Einsatz in Hybridisierungs- experimenten oder dem Ablösen der Oligomere wird die Matrix gewaschen, z.B. mit Acetonitril und Aceton.
Zum Ablösen der einzelnen Oligonukleotide wird die gewünschte Fläche des entstandenen Oligomerchips ausgeschnitten und nach einer Inkubation in 30% wässrigem Ammoniak für einige Stunden, z.B. 2 Stunden, werden die abgelö- sten Oligonukleotidprodukte lyophilisiert und für die PCR oder DNA-Sequenzie¬ rungsmethoden genutzt.
Bei der vorstehend beschriebenen NPE/NPEOC-Strategie werden die ß-eliminie- rende Basenschutzgruppen 2-Nitrophenylethyl (NPE) und 2-(4-Nitrophenyl)- ethoxycarbonyl (NPEOC) verwendet. Diese Funktionen erlauben die Deprotektion des Biopolymers durch die starke, aber nicht-nukleophile Base DBU, während die Oligonukleotide auf der Matrix gebunden bleiben.
Die vorliegende Erfindung wird nun weiter mit Bezug auf die folgenden Ab¬ bildungen beschrieben:
Abb. 1 : Reaktionskammer für die Oligonukleotidsynthese auf Polypropylen¬ folie, wobei das Gerät so ausgerichtet ist, daß es eine 90° Rotation der Polypropylenfolie zwischen den Syntheseschritten erlaubt.
Abb. 2: Anbringung einer Probe und Ablösung durch Ammoniak (NH40H), verwendet für die Standardsynthese freier Oligonukleotide (a) und für die Herstellung von Oligonukleotid-Anordnungen (b); X = 0; X = NH
Abb. 3: Abtrennnung der Festphasen-gebundenen Oligonukleotide von der
Oberfläche. Anwendung der "NPE/NPEOC-Strategie" erlaubt die alternative Verwendung der Oligomerchips für entweder Hybridis- ierungsexperimente (Option I) oder als Quelle für die Isolation einzelner Primermoleküie (Option II) .
Abb. 4: Aktivierung der Methylamino-modifizierten Polypropylenfoiie und
Kopplung der geeignet geschützten Nukleoside.
Abb. 5: Exemplarische Hybridisierungen zu Oligomeranordnungen auf Poly¬ propylenmembranen. (a), (b): 4 verschiedene Startnukleoside, dCNPEOC (Säulen 3,7), dA NP Eoc (Säu|en 2,6), dCbz (Säule 1 ) und dC" (Säulen 4,8) wurden an eine Polypropyienfolie unter Verwendung eines 8-Kanal-Syn- thesegeräts aufgebracht. Die Folie wurde dann aus der Reaktions- kammer entfernt und um 90° gedreht. Nachfolgend wurden 7 verschiedene Oligonukleotide synthetisiert (A-H), die 49 Plätze mit 28 verschiedenen Sequenzen erzeugen. Ein Kanal wurde in beiden Dimensionen als Kontrolle leer gelassen (Spuren 5 und D). Nach Oligomerdeprotektion wurden einige Plätze (z.B. B2,6,8; C8; E8) zur Analyse ausgeschnitten. Die verbleibende Folie wurde mit einem (a) 9-mer d(CTATAGTGA) und (b) einem 1 2-mer d(GAn) hybridisiert. Komplementäre Sequenzen sind unterstrichen. In (c) und (d) wurde die Folie zwischen den Syntheseschritten um 90° gedreht. Es wurden Nonamere hybridisiert, deren Sequenzen Bruch- punkte der Synthese abdecken.
Abb. 6: PCR-Amplifikation eines Plasmid-Inserts. Beide kommerziellen
Primer wurden für die Reaktion verwendet, die in Spur 1 aufgetra¬ gen ist. In den Spuren B und C wurde jeder der Primer durch Oligo- nukleotide ersetzt, die von einem 0, 1 6 cm2 Stück der erfindungs¬ gemäß behandelten Polypropylenfolie isoliert worden sind. Marker (Spur D) ist Hindlll-verdaute Λ-DNA und mit Fspl geschnittene Plasmid pUC1 8-DNA.
BEISPIEL
Ein Polyoxymethylen (POM)-Block wurde so hergestellt, daß er 8 Kanäle von jeweils 1 mm Tiefe, 70 mm Länge und 4 mm Breite mit 2 Löchern an beiden Enden für den Anschluß an den Einlaß und Auslaß eines üblichen DNA-Synthese- geräts enthält. Der Polypropylenfilm wurde durch eine Silikonabdichtung und einen Plexiglasdeckel, der auf die POM-Basis geschraubt ist, an Ort und Stelle gehalten (Fig. 1 ). Um eine perfekte Abdichtung zu erhalten, wurde auf das O 97/49714 PC17DE97/01332
gesamte Gerät mittels einer Klammer zusätzlicher Druck angewendet. Durch Entfernen der Polypropylenfolie nach einem einzelnen oder mehreren Zyklen, Rotation um 90° und fortgesetzte Synthese erlaubt dieses einfache und kleine Instrument die Synthese von bis zu 64 verschiedenen Oligomeren. Eine aminierte Polypropylenfolie (8 x 8 cm2) wurde in einem Gemisch von 25 ml trockenem
Dichlormethan, 25 ml trockenem Dioxan, 0,2 g p-Nitrophenylchlorformiat und 160 μ\ Triethylamin für 2 h bei Raumtemperatur leicht geschüttelt. Nach Wa¬ schen mit Dichlormethan wurde die Folie in einem 1 : 1 -Gemisch von Pyridin und Essigsäureanhydrid für 2 h geschüttelt, wodurch die auf der Oberfläche ver- bliebenen Aminogruppen abgesättigt wurden. Nachfolgend wurde die Folie mit
Dichlormethan gewaschen und in 50 ml Acetonitril oder Dimethylformamid (DMF) aufgenommen; es wurden 0,2 ml 1 ,6-Bis-(methylamino)-hexan hinzuge¬ fügt und das Gemisch wurde bei 40°C für 48 h geschüttelt. Nach aufeinand¬ erfolgendem Waschen mit DMF, Methanol und Aceton wurde die Methylamino- modifizierte Propylenfolie getrocknet und bei 4°C aufbewahrt.
3'-Succinatderivate von geschützten Nukleosiden (dANPE0C, dCNPEOC, dGNPE0C/NPE, dT und Fluorescein-markiertes dC ( = dC") wurden durch das von Kierzek et al. (Biochemistry 25, Seiten 7840-7846 (1986)) beschriebene Verfahren hergestellt und auf einer Methylamino-modifizierten Polypropylenfolie, nach Befestigen der
Folie in dem Polyoxymethylen-Block, aufgebracht. Dazu wurden 5 mg des gewünschten Nukleosid-3'-Succinats mit 25 μ\ N-Methylmorphoiin und 10 ml Acetonitril vor Zugabe von 4 mg TOTU gemischt. Die Flasche mit dem Gemisch wurde sofort mit einem DNA-Synthesegerät verbunden und ein einfacher vor- programmierter Zyklus in dem Gerät wurde aktiviert: zuerst wurden die Reihen mit dem Reaktionsgemisch benetzt und die Reaktion wurde 30 min inkubiert; dann wurden die Reagenzien mit Argon fortgespült und die Reihen wurden einige Male mit Acetonitril gewaschen. Um restliche Methylamino-Gruppen auf der Polypropylenfolie zu blockieren, wurde Essigsäureanhydrid und N-Methyiimidazol in Acetonitril aufgebracht. Alternativ wurden die derivatisierten Polypropylen¬ membranen aus der Kammer entfernt und in einem Gemisch von 10 ml Essig¬ säureanhydrid, 10 ml trockenem Pyridin und 1 ml N-Methylimidazol für 2 h in einer Polypropylenbox geschüttelt. Nach nachfolgendem Waschen mit DMF, Methanol und Aceton wurden die Folien getrocknet und bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
Die Oligonukleotidsynthese wurde auf der Polypropylenfolie wie in der vorste¬ henden Tabelle 1 ersichtlich ausgeführt. Nach kompletter Synthese wurden die Folien aus der Kammer entfernt und in 1 M-DBU in Acetonitril in einer Polypropy¬ lenbox bei 40°C über Nacht geschüttelt. Die Membran wurde mit Acetonitril und Aceton gewaschen, bevor sie entweder für Hybridisierungsexperimente oder zum Ablösen der Oligomere eingesetzt wurde.
Oligonukleotidsonden wurden mit [y32?] ATP unter Standardbedingungen end¬ markiert. Die Oligomeranordnungen wurden in 600 mM NaCI, 60 mM Natriumci- trat, pH 7,5, 7,2% Natrium-N-Lauroylsacrosjn für 1 h prähybridisiert und dann in 10 ml der selben Lösung, die ungefähr 1 Mcpm radioaktiv markierte Oligomer- sonde (Konzentration = 6 picomol/ml) enthielt, für 1 8 h bei 4°C inkubiert. Nach 30minütigem Waschen bei 4°C wurde eine Autoradiographie bei -70°C durch¬ geführt. Die Sonden wurden von den Folien durch Inkubation in Hybridisierungs- puffer bei 65°C für 3 h abgelöst. Die Ergebnisse der Hybridisierungen sind in Abb. 5, insbesondere den Abb. 5A und 5B, gezeigt.
Zum Ablösen der einzelnen Oligonukleotide wurden die gewünschten Plätze der Oligomeranordnung auf der Polypropylenfolie ausgeschnitten. Nach Inkubation in 30% wäßrigem Ammoniak für 2 h wurden die abgelösten Oligonukleotid- produkte lyophilisiert und für die PCR und DNA-Sequenzierungsexperimente ohne weitere Reinigung eingesetzt.
Um die Eignung der Oligomere für die PCR zu testen, wurde eine PCR bei dem rekombinanten Plasmid pTZ18R unter Standardbedingungen, wie bereits früher beschrieben (Scholler et al., Nucleic Acids Res. 23, Seiten 3842-3849, ( 1 995)) durchgeführt. Primer waren 26- und 29-Mere, die an den Vektor direkt neben jeder Seite der Insert-DNA binden. Eine Oligonukleotidmenge, die einer Fläche von 0, 1 6 cm2 der Polypropylenoberfläche entsprach, wurde in den Reaktionen mit 25 μ\ Volumen verwendet. Eine PCR wurde ausgeführt: Primer-Annealing und Extension bei 68°C, Strangdenaturierung bei 95°C. Auf einem Agarosegel wurden die Produkte mit den Ergebnissen verglichen, die mit üblichen kom- merziellen Primermolekülen erhalten wurden, die in einer Konzentration von 1 μM eingesetzt worden waren. Wie aus Abb. 6 ersichtlich, ergab sich kein signifikan¬ ter Unterschied bezüglich Qualität und Quantität der PCR-Produkte.
Auch die Verwendung in einer enzymatischen Sequenzierungsreaktion zeigte, daß die erfindungsgemäß erhaltenen und abgelösten Oligomere gegenüber käuflichen keine signifikanten Qualitätsunterschiede zeigen.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur parallelen Synthese von Oligonukleotiden auf einer Alkyla- mino-modifizierten Matrixoberfläche, dadurch gekennzeichnet, daß 3- Succinat-Derivate von geschützten Nukleosiden darauf angebracht wer¬ den und Oligonukleotidsynthese mittels automatisierter DNA-Synthese stattfindet.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Matrixoberfläche mit Methylamino- Gruppen modifiziert ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die 3'-Succinat-Derivate von dANPEOC, dCNPE0C, dGNPE0C/NPE, dT und Fluorescein-markiertem dC sind.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Matrix in einer Synthesekammer mit mehreren Kanälen eingespannt ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Matrix aus Glas oder einem Polymer, bevorzugt Polypropylen, ist.
6. Verwendung des bei dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 entstehenden Oligomer-Chips in Hybridisierungsexperimente oder als
Quelle hochqualitativer Biopolymere.
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