JP2000513216A - 並行オリゴヌクレオチド合成の組合せ方法およびオリゴマーチップの調製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、保護ヌクレオシドの３−スクシネート誘導体をアルキルアミノ修飾マトリックス表面に適用させ、自動ＤＮＡ合成によりオリゴヌクレオチド合成を行なうことを特徴とする、該マトリックス表面でのオリゴヌクレオチドの並行合成方法に関する。また、本発明は、該方法で生成したオリゴマーチップの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 並行オリゴヌクレオチド合成の組合せ方法およびオリゴマーチップの調製 本発明は、並行オリゴヌクレオチド合成の組合せ方法およびオリゴマーチップ の調製に関する。 固相技術とホスホロアミダイト化学との組合せにより刺激され、ＤＮＡ合成の 自動化に重要な進展があった。今日、生物学、生物医学および物理学的適用のた めに用いられる合成オリゴヌクレオチドの製造は、自動ＤＮＡ合成装置で行なわ れる。これらの装置は、ナノモル〜マイクロモルレンジ内でオリゴヌクレオチド を製造する。しかしながら、オリゴマー合成に関する２つの対立する動向が過去 数年間に出現した。アンチセンスストラテジーのような臨床適用は、グラムまた はキログラムもの量のオリゴヌクレオチドを必要とし、このことは、オリゴマー 合成に関する標準を上げることを必要とする。それに対して、ポリメラーゼ連鎖 反応またはＤＮＡのシーケンス等の分子生物学における適用には、わずかピコモ ルレンジ内のオリゴマー量しか必要でない。しかしながら、これらの適用に関し ては多くの異なるオリゴヌクレオチドが要求される。これは、同時に少量の異な るオリゴマーを製造しなければならないという問題を生じさせた。他方、分子生 物学における診断的ＤＮＡ分析に関して、いわゆる「オリゴマーチップ技術」が だんだん重要な役割を果している。また、「ハイブリダイゼーションによるシー ケンス」等のためのゲノム分析の多くの方法という観点から、規定のオリゴヌク レオチドフレームが表面に適用されたマトリックスの使用が重要な可能性を含ん でいる。 したがって、本発明の目的は、一方ではハイブリダイゼーション実験に「オリ ゴマーチップ」として役立つであろうし、一方では規則的に除去可能であるので ＰＣＲまたはＤＮＡシーケンス等の分子生物学的反応に利用可能な、簡単な様式 でできる限り種類の異なるオリゴヌクレオチドを供給する方法を提供することに ある。 この目的は、請求項１記載の方法により達成される。好ましい態様は、従属項 となる。 本発明者らは、これまでＤＮＡシーケンスに使用されてきた「オリゴマーチッ プ技術」（サザン(Southern，E．M.)ら、Genomics 13，1008-1017;カビアーニー ピース(Caviani-Pease，A．C.)ら、Proc．Natl．Acad．Sci.，U.S.A．91，5022- 5026）における新規方法の開発を基礎にした。この技術は、ハイブリダイゼーシ ョン実験の目標として、そこに結合した短いオリゴヌクレオチド配列を有するマ トリックスを使用する。この点に関して、マトリックスに結合したオリゴヌクレ オチドは、そこに強固に結合しているという事実に注意が払われる。 他方、現在、本発明者らは、オリゴマーチップ技術によるＤＮＡのハイブリダ イゼーション分析用に得られたオリゴマーチップを使用すること、または規則的 にオリゴヌクレオチドを除去し、次いで、ＰＣＲ目的用もしくは酵素的ＤＮＡシ ーケンスにおいておよびハイブリダイゼーション用プローブとして、それぞれ、 それらを使用することが可能となるように、オリゴヌクレオチドのマトリックス へのこの結合を修飾している。 オリゴヌクレオチドが結合するマトリックスとして、ポリマーシートまたはガ ラス表面を使用することができる。しかしながら、さらに表面を修飾したアミネ ート化ポリプロピレンシートが好ましい。可能な表面の修飾は、アルキルアミノ 基、好ましくはメチルアミノ基の結合である。例えば、これは、アミネート化ポ リプロピレンシートを、乾燥ジクロロメタン、乾燥ジオキサン、ｐ−ニトロフェ ニルクロロホルメートおよびトリエチルアミンの混合物中で、数時間振盪させて なされる。ジクロロメタンで洗浄後表面に残ったアミノ基を飽和させるために、 ピリジンと無水酢酸との混合物中で、該シートを数時間振盪させる。その後、該 シートをジクロロメタンで洗浄し、アセトニトリルまたはジメチルホルムアミド 中で処理する。１，６−ビス（メチルアミノ）−ヘキサンを加え、混合物を数時 間〜数日振盪させる。ＤＭＦ、メタノールおよびアセトンを用いて洗浄後、メチ ルアミノ−修飾メンブランを乾燥させる。 前記マトリックス、特にメチルアミノ修飾メンブランを、例えば、図１に示し たようなもの等の合成チャンバー中に固定することができる。キールゼック(Kie rzek)ら、（Biochemistry 25，pp．7840-7846(1986)）に記載のように製造する ことができる保護ヌクレオシド（ｄＡ^NPEOC、ｄＣ^NPEOC、ｄＧ^NPEOC/NPE、ｄＴ およびフルオレセイン標識ｄＣ）の３’−スクシネート誘導体を、マトリックス 上に適用する。適用のためには、Ｏ−[（エトキシカルボニル）シアノメチレン アミノ]−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレー ト（ＴＯＴＵ）を添加する前に、所望のヌクレオシド−３’−スクシネートを、 Ｎ−メチルモルフォリンおよびアセトニトリル等の有機溶媒と混合する。この反 応混合物を合成チャンバー内に送り込み、該チャンバー中で１回の一定のサイク ルが活性化される。このサイクルは、例えば、マトリックス、好ましくはメチル アミノ修飾ポリプロピレンシート上の列を、反応混合物で湿らせ、３０分間等の 一定の時間インキュベートするようなものである。次いで、試薬をリンスして、 該列をアセトニトリル等の有機溶媒で数回洗浄する。マトリックス上の残りのメ チルアミノ基をブロックするためには、後者を、ピリジンと無水酢酸との混合物 で数時間処理する。別法として、合成チャンバーから取り除いたマトリックスを 、無水酢酸、ピリジンおよびＮ−メチルイミダゾールの混合物で処理することが できる。ＤＭＦ、メタノールおよびアセトンで洗浄した後、該マトリックスを乾 燥させる。 オリゴヌクレオチド合成は、以下のスキームを使用することが好ましい。例え ば、図１に示された合成チャンバーは、この合成を行なうのに適する。工程の順 序に関するスキームの変更、試薬および溶媒それぞれの交換、ならびにインキュ ベート時間は、当業者の力の及ぶ範囲内であり、該スキームは、本発明を限定し て解釈したり、見なすものでは全くない。 表１ オリゴヌクレオチド合成のスキーム工程 試薬または溶媒 時間（秒） 洗浄 アセトニトリル ３０ 脱トリチル化 ジクロロメタン中３％ＴＣＡ ８０ 洗浄 アセトニトリル ２１０ カップリング アセトニトリル中７５ｍＭ ホスホロー アミダイト＋０．５Ｍテトラゾール ４０ 洗浄 アセトニトリル ３０ 除去 アセトニトリル中無水酢酸／Ｎ−メチル− イミダゾール ５０ 酸化 アセトニトリル中１Ｍ ｔ−ブチル− ヒドロパーオキシド １３０ 洗浄 アセトニトリル １２０ 合成が完了したとき、該マトリックスを合成チャンバーから除去し、オリゴヌ クレオチドの脱保護のために、アセトニトリル中１Ｍ１，８−ジアザビシクロ（ ５．４．０）−ウンデク−７−エン（ＤＢＵ）で振盪する。それがハイブリダイ ゼーション実験に使用されるかオリゴマーを除去する前に、例えば、アセトニト リルおよびアセトンで該マトリックスを洗浄する。 個々のオリゴヌクレオチドを除去するためには、得られるオリゴマーチップの 所望の表面領域を削り取った後、３０％アンモニア水で数時間、例えば、２時間 インキュベートし、除去したオリゴヌクレオチド産物を凍結乾燥して、ＰＣＲま たはＤＮＡシーケンス法に使用する。 前記ＮＰＥ／ＮＰＥＯＣストラテジーにおいて、β脱離塩基保護基、２−ニト ロフェニルエチル（ＮＰＥ）および２−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボ ニル（ＮＰＥＯＣ）を用いる。これらの官能基は、強力であるが非求核性のＤＢ Ｕ塩基によるバイオポリマーの脱保護を可能にする一方、該オリゴヌクレオチド は、該マトリックスに結合したままである。 本発明を以下の図面を参照しながらより詳細に記載する。 図１：ポリプロピレンシート上のオリゴヌクレオチド合成用反応チャンバー、該 装置は、合成工程の間ポリプロピレンシートの９０°の回転が可能になる ように調整される。 図２：遊離のオリゴヌクレオチドの標準合成（ａ）、およびオリゴヌクレオチド アレイの製造（ｂ）に使用される試料の結合とアンモニア（ＮＨ₄ＯＨ） による除去；Ｘ＝Ｏ；Ｘ＝ＮＨ。 図３：固相に結合したオリゴヌクレオチドの表面からの除去。「ＮＰＥ／ＮＰＥ ＯＣストラテジー」の適用は、ハイブリダイゼーション実験のため（オプ ションＩ）または個々のプライマー分子の単離用の供給源として（オプシ ョンII）、オリゴマーチップの別の用途を可能にする。 図４：メチルアミノ修飾ポリプロピレンシートの活性化と連結と適切に保護され たヌクレオシドのカップリング。 図５：ポリプロピレンメンブラン上のオリゴマーアレイとの典型的なハイブリダ イゼーション。 （ａ）、（ｂ）：４つの異なる出発ヌクレオシド、ｄＣ^NPEOC（カラム３ 、７）、ｄＡ^NPEOC（カラム２、６）、ｄＣ^bz（カラム１）およびｄＣ^fl （カラム４、８）を８チャンネル合成装置を用いてポリプロピレンシート に適用した。次いで、該シートを反応チャンバーから除去し、９０°回転 させた。次いで、７つの異なるオリゴヌクレオチドを合成し（Ａ−Ｈ）、 ２８個の異なる配列を有する４９部位を生成した。対照として、両次元で チャンネルを空にしておいた（レーン５とＤ）。オリゴマーの脱保護後、 いくつかの部位（例えば、Ｂ２、６、８；Ｃ８；Ｅ８）を、分析目的のた めに切り出した。残りのシートを（ａ）９マーｄ（ＣＴＡＴＡＧＴＧＡ） および（ｂ）１２マーｄ（ＧＡ₁₁）とハイブリダイズした。相補的配列に 下線を引いている。（ｃ）および（ｄ）においては、該シートは、合成工 程の間９０°転させた。配列が合成のブレークポイントをカバーするノナ マーがハイブリダイズした。 図６：プラスミドインサートのＰＣＲ増幅。レーン１にプロットした市販の両プ ライマーを反応に用いた。レーンＢおよびＣにおいて、各プライマーを、 本発明により処理したポリプロピレンシートの０．１６ｃｍ²片から単離 したオリゴヌクレオチドにより置換した。マーカー（レーンＤ）は、Ｈｉ ｎｄIII で消化したλ- ＤＮＡおよびＦｓｐＩで切り出したプラスミドｐ ＵＣ１８ＤＮＡである。実施例 ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）ブロックを、それぞれが１ｍの深さ、７０ｍｍ の長さで４ｍｍの幅を有する８チャンネルおよび通常のＤＮＡ合成装置の入口と 出口に接続するための両末端の２つの穴を含むように調製した。ポリプロピレン フィルムを、ＰＯＭの基部上にネジで留められたシリコーンシールとパースペク スカバーにより保持した（図１）。完全密封するために、クランプにより装置全 体にさらに圧力をかけた。１または数回のサイクル、９０°回転および合成の続 行後に該ポリプロピレンフィルムを除去するために、この単純かつ小さな器具は 、６４個までの異なるオリゴマーの合成を可能にする。アミネート化ポリプロピ レンシート（８ｘ８ｃｍ²）を、２５ｍｌの乾燥ジクロロメタン、２５ｍｌの乾 燥ジオキサン、０．２ｇのｐ−ニトロフェニルクロロホルメートおよび１６０μ ｌのトリエチルアミンの混合物中、室温で２時間かすかに振盪させた。ジクロロ メタンで洗浄後、該シートを、ピリジンと無水酢酸との１：１混合物中で２時 間振盪させ、それにより表面上に残ったアミノ基を飽和させる。その後、該シー トをジクロロメタンで洗浄し、５０ｍｌのアセトニトリルまたはジメチルホルム アミド（ＤＭＦ）で処理した。０．２ｍｌの１，６−ビス−（メチルアミノ）ヘ キサンを添加し、該混合物を４０℃で４８時間振盪させた。ＤＭＦ、メタノール およびアセトンでの連続洗浄後、メチルアミノ修飾プロピレンシートを乾燥させ 、４℃で貯蔵した。 保護ヌクレオシド（ｄＡ^NPEOC、ｄＣ^NPEOC、ｄＧ^NPEOC/NPE、ｄＴおよびフル オレセイン標識ｄＣ（＝ｄＣ^fl）の３’−スクシネート誘導体は、キールゼック (Kierzek)ら、（Biochemistry 25，pp．7840-7846(1986)）に記載の方法により 製造し、ポリオキシメチレンブロックにメチルアミノ修飾ポリプロピレンシート を固定後、該シート上に適用した。この目的のために、４ｍｇのＴＯＴＵを添加 する前に、５ｍｇの所望のヌクレオシド−３’スクシネートを、２５μｌのＮ− メチルモルフォリンおよび１０ｍｌのアセトニトリルと混合した。混合物を有す るボトルをすぐにＤＮＡ合成装置に接続し、該装置において、前もってプログラ ムされた１回のサイクルが活性化された：まず、列を反応混合物で湿らせ、反応 を３０分間インキュベートした。次いで、アルゴンを用いて試薬を洗浄除去し、 列を数回アセトニトリルで洗浄した。ポリプロピレンシート上の残りのメチルア ミノ基をブロックするために、無水酢酸とＮ−メチルイミダゾールのアセトニト リル液を適用した。別法として、誘導化ポリプロピレンメンブランをチャンバー から除去し、ポリプロピレンのボックス内で、１０ｍｌの無水酢酸、１０ｍｌの 乾燥ピリジンおよび１ｍｌのＮ−メチルイミダゾールの混合液中で２時間振盪し た。引き続くＤＭＦ、メタノールおよびアセトンでの洗浄後、該シートを乾燥さ せ、使用するまで４℃で保存した。 オリゴヌクレオチド合成を、前記表１の通り、ポリプロピレンシート上で行な った。合成が完了した後、該シートをチャンバーから除去し、ポリプロピレンの ボックス内で、１Ｍ ＤＢＵのアセトニトリル液中で４０℃で一晩振盪した。該 メンブランを、ハイブリダイゼーション実験またはオリゴマーの除去に使用する 前に、アセトニトリルとアセトンで洗浄した。 オリゴヌクレオチドプローブを標準条件下で、［γ³²Ｐ］ＡＴＰで末端標識し た。オリゴマーアレイを、６００ｍＭ ＮａＣｌ、６０ｍＭクエン酸ナトリウム 、ｐＨ７．５、７．２％ナトリウム−Ｎ−ラウロイルサルコシン中で１時間プレ ハイブリダイズし、次いで、約１Ｍｃｐｍの放射性標識オリゴマープローブ（濃 度＝６ピコモル／ｍｌ）を含む同溶液１０ｍｌ中で、４℃で１８時間インキュベ ートした。４℃で３０分の洗浄後、オートラジオグラフィーを−７０℃で行なっ た。該プローブを、６５℃で３時間、ハイブリダイゼーション緩衝液中でのイン キュベーションにより該シートから除去した。ハイブリダイゼーションの結果を 図５、具体的には図５Ａと５Ｂに示す。 一本鎖のオリゴヌクレオチドを除去するために、ポリプロピレンシート上のオ リゴマーアレイの所望の部位を切り出した。３０％アンモニア水での２時間のイ ンキュベーション後、除去したオリゴヌクレオチド生成物を凍結乾燥して、さら なる精製なしに、ＰＣＲおよびＤＮＡシーケンス実験に使用した。 ＰＣＲ用のオリゴマーの適合性を試験するために、以前に記載したように、標 準条件下で組換えプラスミドｐＴＺ１８Ｒを用いてＰＣＲを行なった（ショラー (Scholler)ら、Nucleic Acids Res．23，pp．3842-3849，(1995)）。プライマー は、インサートＤＮＡの各端に隣接したベクターに直接結合する２６マーと２９ マーであった。０．１６ｃｍ²のポリプロピレン表面領域に相当するオリゴヌク レオチド量を、２５μｌの容量で反応に用いた。ＰＣＲを行なった：６８℃での プライマーアニーリングと伸長、９５℃での鎖の変性。アガロースゲル上で、生 成物を、１μＭの濃度で使用される通常の市販のプライマー分子で得られた結果 と比較した。図６の通り、ＰＣＲ産物の質と量に関して、有意な差は生じなかっ た。 また、酵素的シーケンス反応での使用により、本発明によって得られ、除去さ れたオリゴマーは、市販品とは有意な質の違いを示さないことも示された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ホヘイゼル，ヨルク ドイツ連邦共和国 ヴィースロッホ デー ―69168 リヒャルト―ワーグナー―シュ トラーセ ２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 保護ヌクレオシドの３−スクシネート誘導体をアルキルアミノ修飾マトリ ックス表面に結合させ、自動ＤＮＡ合成によりオリゴヌクレオチド合成を行なう ことを特徴とする、該マトリックス表面でのオリゴヌクレオチドの並行合成方法 。 ２． 該マトリックス表面がメチルアミノ基で修飾されている請求項１記載の方 法。 ３． ３’−スクシネート誘導体がｄＡ^NPEOC、ｄＣ^NPEOC、ｄＧ^NPEOC/NPE、ｄ Ｔおよびフルオレセイン標識ｄＣ由来である請求項１または２記載の方法。 ４． 該マトリックスが複数のチャンネルを有する合成チャンバーに固定されて いる請求項１〜３いずれか記載の方法。 ５． 該マトリックスがガラスまたはポリマー、好ましくはポリプロピレンで作 られている請求項１〜４いずれか記載の方法。 ６． 請求項１〜５いずれか記載の方法で生成したオリゴマーチップの、ハイブ リダイゼーション実験におけるまたは高品質バイオポリマーの供給源としての使 用。