WO1998041856A1

WO1998041856A1 - Detecteur electrochimique par chromatographie en phase liquide, chromatographe en phase liquide et methode d'analyse associee

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Publication number: WO1998041856A1
Application number: PCT/JP1998/001031
Authority: WO
Inventors: Tomohiko Kimura; Osamu Shirota
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 1997-03-14
Filing date: 1998-03-12
Publication date: 1998-09-24
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Description

明細書液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器、液体クロマトグラフィー装置、及びかかる装置を用いた分析方法技術分野

本発明は、液体クロマトグラフィ一用の検出器及び液体ク口マトグラフィ一装置にかかり、特に被分析試料の分離状況を電極反応を用いて電気化学的に検出する液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器及び該検出器を用いた液体クロマトグラフィー装置に関する。従来の技術

クロマトグラフィーとは、複雑な混合物を分離又は分析するために用いられる技法の一^ ^である。

この技法は様々な方法を含むが、共通する特徴はこの技法が、常に移動する所謂移動相と固定されて移動しない固定相の 2つの空間から成ることである。そして、分離又は分析したい対象である被分析混合物試料を移動相中に導入し、移動相とともに、巨視的には固定相中を、微視的には固定相を構成する部材の表面と接しながら移動をさせる。

この時、混合物試料中の含有成分は固定相に対する親和性が各々異なることから、固定相を通過する速度が各成分間で異なってくるつまり、より強い親和性を有する成分は、より遅い通過速度を示すその結果、移動相の移動に伴って、それぞれの成分に分離されていく。そして、通過時間を標準試料等が示すそれと比較すれば、各成分の同定が可能であり、混合物試料の分析と分離が可能となる。

このクロマトグラフィーは、移動相と固定相の組み合わせの選択により幾つかの種類に分類される。そして、移動相を被分析試料が溶解可能な液体である溶媒とするものは液体クロマトグラフィ一と称され、適用できる被分析試料も多く、非常に有効な手段として広く用いられている。

液体クロマトグラフィーは、固定相の選択により、具体的には固定相に固体を選択するか、液体を選択するかによって、液一固クロマトグラフィーと液一液クロマトグラフィ一に更に分類される力、通常は" 液体クロマトグラフィー" と言えば液一固クロマトグラフィ一を指すというのが一般的になっている。

液体クロマトグラフィ一は通常、被分析試料を移動相たる溶剤の流れに従って分離を行う多孔性の微粒子等の固定相を充填してなるカラムからなる分離部と、分離部に移動相たる溶剤を送液する送液部と、分離部の被分析試料の分離状況を検出する検出部から構成される。

そして、従来、液体クロマトグラフィーにおいては、分離部におけるより優れた分離能力の達成が常に課題とされてきたが、最近はこの分離部の分離能とともに、検出部における極微量にしか存在しない物質のための高感度検出が強く求められるに至っている。

検出部における検出装置は現在 4種類のものが主に用いられていそれは、 ①被分析試料の紫外光吸収特性の差異に従って被分析試料の分離状況を検出する吸光光度検出器、 ②被分析試料の蛍光発光特性の差異に従って被分析試料の分離状況を検出する蛍光検出器、 ③被分析試料の電気化学的特性の差異に従って被分析試料の分離状況を検出する電気化学検出器、 ④示差屈折率を測定して被分析試料の分離状況を検出する示差屈折率検出器、の 4種類である。

この中で、電気化学検出器は高い選択性と感度を有するため、最近各種の微量分析特に糖や生体成分の分析に急速に利用されはじめている。

電気化学検出器は電気化学的に活性な物質が電極表面上で酸化あるいは還元を受ける際の電極反応電流を測定するものであり、電流測定検出器と電量測定検出器がある。何れも通常は定電位での電極反応を利用したものであるが、電量検出器は 1 0 0 %近い電解効率を得るために電極の表面積を大きくする必要があり、 S N比はあまり上がらないという欠点を有する。

それに対し、電流測定検出器では、電極の表面積や使用するセル容積を微小にした設計では電解効率は低いものの、電量検出器よりも高感度の検出が可能であり、極微量の被分析物質を対象とする生体成分の分析には専らこの型の検出器が使用されている。

よって、本発明においては、かかる電気化学検出器は、この電流測定検出器のことを指している。

電気化学検出器は高感度で選択的である反面、その使用において幾つかの課題を有している。

先ず第一に、電気化学的に活性な目的の被分析物質を一定の電位条件下で酸化或いは還元反応して、分析を行う場合、電極反応を担う作用電極は反応に必要な程度の比較的長時間の間一定電圧に維持される必要があるとされてきた。

その場合、移動相たる溶剤中の電気化学的に活性な痕跡量の不純物（金属イオンや他の有機不純物イオンや酸化還元性のある陰ィォン等）は少しずつだがある程度の時間をかけて作用電極上に集合又は吸着してしまう。

その結果、作用電極表面での目的とする被分析物質の酸化又は還元反応はこの吸着不純物に妨害され、被分析物質に十分な電位が供給できず、実際の検出感度を落とすという問題を生じていた。

よって、このような吸着不純物の妨害を抑制すること、つまり作用電極上への不純物の吸着を抑え、可能な限り無くすることが重要な課題となる。

また、電極上で十分な反応が起きるためには移動相たる溶剤が良通電性であることが必要があり、そのため、十分な塩濃度を有する極性溶媒を用いる必要がある。このような高極性の溶媒を用いる液体クロマトグラフィーのモードには、その固定相と被分析試料の間の相互作用の機構の差異、ひいては充塡剤の差異により、逆相モード液体クロマトグラフィ一やイオン交換クロマトグラフィー等がある o

これらのモードに電気化学検出器を使用する場合、移動相は水系溶剤が通常は用いられてきた。

しかし、従来の逆相モード液体クロマトグラフィーゃイオン交換クロマトグラフィーにおいてもそうであるように、移動相の特性は分離する被分析物質の特性に合わせて選択される必要があり、具体的には溶剤の所謂極性を制御して、若しくは被分析試料の分離を行いながら適当に変化させるなどして、最適な分離が行われる必要がのる。

その様な溶剤の極性の制御は通常は水にメ夕ノールゃァセトニトリル等、有機物溶剤としては比較的極性が高く、水に可溶なものを添加して移動相溶剤とすることによりなされる。

しかし、溶剤中に有機溶剤を多量に含有しているものを従来の電気化学検出器で移動相溶剤として使用すると、被分析試料の分析により得られるクロマトグラムのベースラインにおいて、その安定性が損なわれ、該検出器での分析が困難となることがあった。

これは、参照電極の標準としての機能を、溶剤に含有される有機溶剤、特に参照電極中の電極本体に到達した有機溶剤が低下させているためと推定されている。

従って、参照電極において、移動相である溶剤が含有する有機溶剤の影響が及ばないようにすることが課題となる。

そこで、本発明の目的は、上記の課題を解決した新規な液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器及び液体クロマトグラフィーを提供することである。

また、本発明の別の目的は、作用電極表面上での不純物イオンの吸着を抑え、それらによる被分析試料の電極反応の妨害を抑制し、更に、多量の有機溶剤を移動相に用いることを可能とした参照電極を使用した液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器及び液体クロマトグラフィ一を提供することである。発明の開示

請求項 1記載の発明は、液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器において、参照電極と作用電極と対極とを有して構成される 3 極式ポテンシォスタツ卜からなる液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器において、

該 3極式ポテンシォスタツトを構成する参照電極は、電極本体と該電極本体を保護して収納する内筒と外筒の二つの筒体からなり、内筒は該電極本体を電解液ともに収納し、外筒は該内筒を電解液ともに収納して構成することにより、該電極本体を二つの電解液層と筒体で二重に保護する 2重構造を有し、

該作用電極は、該作用電極の接続する該装置の電子回路のプログラム機能により電位を周期的に変化させうるものであることを特徴とする。

請求項 2記載の発明は、液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器において、

電極電位の基準となる参照電極と、

被電解物質に直接作用する作用電極と、

電解反応を補助する対極と、

該参照電極と該作用電極と該対極の 3種電極をそれぞれ支持し、更に該 3種電極に及んで該 3種電極各々を繫ぐとともに両端の開口部をそれぞれ移動相である溶剤の流入口及び流出口とする内腔を有し、該内腔中を流れる該溶剤と該 3種電極それぞれとを接触可能としているセルと、

該 3種電極各々と接続しポテンシォスタツト並びに電位発生回路並びに電界電流測定増幅回路を有する電子回路とからなり、該セルの該内腔中を流れる溶剤中の被分析試料を該作用電極上での電極反応により酸化又は還元させ、該酸化又は還元反応により該対極と該作用電極との間に生じる電流を検出して被分析試料の検出を行う液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器において、

該参照電極は、電極本体と、

該電極本体を支持する支持具と、

液体の浸出不能な部材からなり該支持具取付け用の取付け開口部と更に少なくとも一つの開口部分を内開口部として有する筒状体であって、該内開口部をカーボン材で充塡して塞ぎ、該支持具との間で該電極本体を第一の電解質溶液とともに該電極本体と該内筒外部との電気的導通を確保しつつ密封収納する内筒と、

液体の浸出不能な部材からなり該支持具取付け用の取付け開口部と更に少なくとも一つの開口部分を外開口部として有する筒状体であって、該外開口部をカーボン材で充填して塞ぎ、該支持具との間で該電極本体を収納した該内筒を第二の電解質溶液とともに該電極本体と該外筒外部との電気的導通を確保しつつ密封収納する外筒と、からなり、

該電子回路が更に該作用電極の電位を周期的に変化させることが可能なプログラム機能を有することを特徴とする。

請求項 3記載の発明は、請求項 2記載の液体クロマトグラフィー用電気化学検出器において、

前記プログラム機能は前記電位発生回路が有し、前記電位発生回路が周期的に前記作用電極での発生電位を変化させることを可能としていることを特徴とする。

請求項 4記載の発明は、液体クロマトグラフィ一装置において、移動相たる溶剤を外部の溶剤槽からくみ上げて該溶剤の流路となる送液管を通して溶剤の送液をする少なくとも一つのポンプと、該ポンプから送液された溶剤中に被分析試料を注入して溶解させる注入口を形成する自動又は手動操作可能な被検物質注入装置と、送液された溶剤中の被分析試料を溶剤の流れに従って各含有試料成分に分離する少なくとも一つのカラムと、

該カラムで分離された被分析試料の分離状況を検出する検出装置と、からなる液体クロマトグラフィー装置において、

該検出装置に請求項 3記載の液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器を用いることを特徴とする。

請求項 5記載の発明は、請求項 4記載の液体クロマトグラフィ一装置において、

前記検出装置は、請求項 3記載の液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器と検出した被分析試料の分離状況を示すクロマトグラムを描く記録計とからなり、更に、移動相たる溶剤の p Hを調整するために該装置とは別に用意された P H調整用溶液をくみ上げて該装置内に供給する P H調整用ポンプを有し、前記カラムでの被分析試料の分離の後に該分離された被分析試料の置かれる環境を所望の P H値に設定することを可能としたことを特徴とする。

請求項 6記載の発明は、液体クロマトグラフィ一装置を用いた分析方法において、

有機溶剤及び Z又は水に電解質を溶解して調製されて外部の溶剤槽に充塡された少なくとも一種の溶剤を移動相とし、該溶剤槽から該溶剤を少なくとも一つのポンプでくみ上げ、該溶剤の流路となる送液管を通して溶剤の送液をし、

該ポンプから送液された溶剤中に、被分析試料を該溶剤中に注入する注入口を形成する自動又は手動操作可能な被検物質注入装置を通して被分析試料を注入して溶解させ、

送液された溶剤中の被分析試料を少なくとも一つのクロマトグラフィ一用カラムを用いて溶剤の流れに従って被分析試料中の各含有試料成分に分離し、

該カラムで分離された被分析試料の分離状況を、参照電極と作用電極と対極とを有して構成される 3極式ポテンシォス夕ットからなる液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器であって、該 3極式ポテンシォスタツトを構成する参照電極は、電極本体と該電極本体を保護して収納する内筒と外筒の二つの筒体からなり、内筒は該電極本体を電解液ともに収納し、外筒は該内筒を電解液ともに収納して構成することにより、該電極本体を二つの電解液層と筒体で二重に保護する 2重構造を有し、該作用電極は、該作用電極の接続する該装置の電子回路のプログラム機能により電位を周期的に変化させうるものである液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器を用いて検出することを特徴とする。

請求項 7記載の発明は、請求項 6記載の液体クロマトグラフィー装置を用いた分析方法において、

前記ポンプとは別に設けられた少なくとも一^ ^の p H調整用ボンプを用いて、移動相たる溶剤の p Hを調整するための p H調整用溶液を該送液管における前記カラムと前記電気化学検出器を繋ぐ部位の内部に供給し、前記カラムでの分離によって各含有成分に分離された被分析試料を所望の P H環境下に置いたうえで、被分析試料の分離状況を前記の電気化学検出器により検出することを特徴とする。請求項 1及び請求項 2及び請求項 3記載の発明によれば、参照電極を密封して保護する筒状体を内筒と外筒を用いて二重とすることが可能となる。

そして、その時、内筒と外筒は何れも力一ボン材で充填されて塞がれた開口部を有しており、内筒は電極本体とともに電解質液を収納し、外筒は該内筒とともに自身と該内筒との間に電解質液収納して有している。

カーボン材を充填した開口部は参照電極が接触する移動相たる溶剤等外部環境からの有機溶剤の進入を防止するが、該外部との電気的な導通は可能であり、参照電極において電極としての性能を損なわせることはない。

よって、電極特性を低下させること無く、参照電極が接触する移動相たる溶剤等外部環境からの有機溶剤の進入を保護用の筒を二重構造とすることにより二重に防止し、有機溶剤の参照電極を構成する電極本体への到達を実質的に抑止した参照電極を提供できる。また、電位発生回路等がプログラム機能を有することなどにより、電子回路が、電極反応を担う作用極上に供給される電位を任意に変化すること、特に、その変化を周期的なものとすることが可能となる。

従って、被分析試料の電気化学的特性に対応させて定められた電解電位を一定時間作用電極上で維持した後、イオン性等の不純物の吸着が起こる前に吸着を防ぐために、又は吸着した不純物が電極から脱離するように、作用電極上の電位を変化させ、又はその極性を変化させることが可能である。

この時、作用電極上の電位の変化は所望のプログラミングがなされており、又は周期的に変化するようにされており、電極上が所望の電解電位に維持されている間のみ電流の検出を行うことは容易であり、電位の変化に対応させて所望の時点で所望の時間検出を行えば、電極の変化による電流検出の不具合が起きることはない。

以上より、参照電極で使用する電極本体の有機溶剤からの保護を二重にして、電極本体への有機溶剤の到達をを実質的に抑止することにより、多量の有機溶剤を移動相に用いることを可能とするとともに、作用電極表面への印加電位を周期的に極性を変化させる等、望みの変化をさせることにより電極上での不純物イオンの吸着を抑え、それらによる被分析試料の電極反応の妨害を抑制する液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器を提供することことが可能となる。請求項 4及び請求項 5及び請求項 6及び請求項 7記載の発明によれば、用いる検出器の参照電極において、使用する電極本体の有機溶剤からの保護を二重にして、電極本体への有機溶剤の到達を実質的に抑止することにより、多量の有機溶剤を移動相として用いることを可能としている。さらに、用いる検出器の作用電極表面への印加電位を周期的に極性を変化させる等、望みの変化をさせることにより作用電極上での不純物ィォンの吸着を抑え、それらによる被分析試料の電極反応の妨害を抑制することが可能となる。

よって、有機溶剤を移動相たる溶剤に用いることが可能となり、カラムにおいて高い分離能を示すことが可能であり、電気化学検出器における被分析試料の高感度の検出が可能な液体クロマトグラフィ一用装置及びかかる装置を用いた液体クロマトグラフィ一による分析方法を提供できる。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明にかかる実施例である液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器の構成の概略を示す図である。

第 2図は、本発明にかかる実施例である液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器に用いる参照電極の分解斜視図である。

第 3図は、本発明にかかる実施例である液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器に用いるセルの分解斜視図である。

第 4図は、本発明にかかる実施例である液体クロマトグラフィ一装置の構成の概略を示す図である。

第 5図は、分析に用いた試料とその構造を説明する図である。第 6図は、本発明にかかる実施例によるクロマトグラムと比較例である吸光度検出器によるクロマトグラムを比較して示す図である発明を実施するための最良の形態

本発明の実施例を図面を用いて説明する。

先ず初めに、本発明にかかる実施例である液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器について説明する。

図 1 は本発明にかかる実施例である液体クロマトグラフィー用電気化学検出器の構成の概略を示す図である。そして、図 2は本発明にかかる実施例である液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器に用いる参照電極の分解斜視図である。

本発明にかかる実施例である液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器 1 は、電極電位の基準となる参照電極 2と、被電解物質に直接作用する作用電極 3と、電解反応を補助する対極 4 と、参照電極 2と作用電極 3と対極 4の 3種電極をそれぞれ支持し、更に 3種電極（ 2 , 3 , 4 ) に及んで 3種電極（ 2， 3 , 4 ) 各々を繫ぐとともに両端の開口部をそれぞれ移動相である溶剤の流入口及び流出口とする内腔 5を有し、内腔 5中を流れる該溶剤と 3種電極（ 2 , 3 , 4 ) それぞれとを接触可能としているセル 6 と、 3種電極（ 2 , 3 , 4 ) 各々と接続し、ポテンシォスタツト 7並びに電位発生回路 8並びに電界電流測定増幅回路 9を有する電子回路 1 0 とからなる。そして、セル 6の内腔 5中を流れる溶剤中の被分析試料を作用電極 3上での電極反応により酸化又は還元させ、該酸化又は還元反応により対極 4 と作用電極 3 との間に生じる電流を検出して被分析試料の検出を行うものである。

この液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器 1 においては、参照電極 2は、電極本体 1 1 と、電極本体 1 1を支持する支持具 1 2 と、液体の浸出不能な部材からなり支持具 1 2取付け用の取付け開口部 1 3 と更にもう一つの開口部分を内開口部 1 4 として有する筒状体であって、内開口部 1 4を力一ボン材 1 5で充塡して塞ぎ、支持具 1 2との間で電極本体 1 1を第一の電解質溶液とともに電極本体 1 1 と筒状体外部との電気的導通を確保しつつ密封収納する内筒 1 6と、液体の浸出不能な部材からなり支持具 1 2取付け用の取付け開口部 1 7ともう一つの開口部分を外開口部 1 8 として有する筒状体であって、外開口部 1 8を力一ボン材 1 9で充塡して塞ぎ、支持具 1 2との間で電極本体 1 1を収納した内筒 1 6を第二の電解質溶液とともに電極本体 1 1 と筒状体外部との電気的導通を確保しつつ密封収納する外筒 2 0 とからなる。このとき、電極本体 1 1には塩化第一銀電極を用いた。そして、電極本体 1 1 とともに内筒 1 6中に密封される第一の電解質溶液は塩化銀を飽和した塩化力リゥム溶液（濃度は 3 . 3 m o 1 /リットル）とした。そして、内筒 1 6とともに外筒 2 0に密封される第二の電解質溶液は塩化力リゥム溶液（濃度は 3 . 3 m 0 1 リットル）とした。

さらに、内筒 1 6 と外筒 2 0の材質については非導電性の物質からなり、水溶液を密封可能で、長時間の使用後も電解質溶液に侵されることの無く、密封する電解質液中や、接触する移動相たる有機溶剤中に不純物となりうる物質が溶け込まないように安定な部材であれば如何なるものでもよい。

本実施例においては、内筒 1 6の材質は 4 ーフッ化工チレンと 6 一フッ化プロピレンの共重合体からなる樹脂とし、外筒 2 0の材質は 3—フッ化塩化ェチレンとした。

そして、電子回路 1 0は更に作用電極 3の電位を周期的に変化させることが可能なように、電位発生回路 8にプログラム機能を有しており、電位発生回路 8は周期的に作用電極 3の発生電位を変化させることを可能としている。

本実施例においては、作用電極への電圧印加はパルスによりなされるようにプログラムされており、作用電極 3の電位を所望の値で所望の時間の間維持した後、その極性を逆にして同じ時間の間維持し、更にこの過程を繰り返すように設定されている。この時、電圧印加にかかるパルスの周波数は約 1 H z ( 1秒間の間に正 ·逆の電圧印加が一周期）とし、試料分析にかかる電流検出は所望の電位に作用電極 3が維持されている時間内のみ行われる。

尚、電圧印加にかかるパルスの周波数は 1 H zに限るものではなく、被分析試料等の特性に合わせ変えることが可能である。

図 3は本発明にかかる実施例である液体クロマトグラフィー用電気化学検出器に用いるセルの分解斜視図であり、参照電極の設置の方法や、移動相たる溶剤の流路を形成する内腔の形成状況等を示す図である。

セル 6は参照電極 2と参照電極 2を設置する設置用開口部 3 2 と溶媒の出入口となる二つの送液用開口部 3 3 と突起部 3 4を有する内部が空洞な金属製のセルプロック 3 1 とプロック 3 1 を電気化学検出器 1中に設置するための取付け部 3 5 と非導電性の樹脂製のセルスべ一サ 3 6 と作用電極 3 とセルガイド 3 7 と絶縁座 3 9 と端子 4 0を有する作用電極用の電極押さえ 3 8からなる。

そして、参照電極 2は開口部 3 2に揷入されてセルプロック 3 1 に固定される。

セルスぺ一サ 3 6 とセルガイド 3 8 と電極押さえ 3 8は突起部 3 4を用いてそれぞれが自身の内部に有する穴 4 4にその突起部 3 4 を挿入することにより、セルブロック 3 1側からセルスぺ一サ 3 6、セルガイド 3 8及び電極押さえ 3 9の順番でセルプロック 3 1 に固定される。

その際、作用電極 3は金製であり、セルガイド 3 7中に設けられたガイド部 4 1にはめ込まれ、セルスぺーサ一 3 4 と電極押さえ 3 9の間に固定される。この時、電極押さえ 3 9の有する端子は作用電極 3 と接触し、作用電極 3 と外部との電気的な導通を可能にしている。

尚、作用電極には白金ゃグラッシーカーボンも使用可能である。また、セルスぺ一サ一 3 4は作用電極 3と接する対応部分の内に穴部 4 2を有しており、この穴部 4 2がセルプロック 3 1の送液用開口部 3 2と重なり、セルブロック 3 1上にセルスぺ一サ 3 6、作用電極 3、セルガイド 3 8及び電極押さえ 3 9が固定されたときに作用電極 3 とセルプロック 3 1の外壁との間に空隙を形成する。

この空隙は、送液用開口部 3 3を介して移動相たる溶剤の流路となる内腔の一部を形成しており、内腔を流れる溶剤と作用電極 3 との接触を可能とし、ひいては被分析試料の分析に用いられる作用電極上の電極反応を可能としている。

よって、セルブロック 3 1 の部材については酸性条件下やアル力リ性条件下で劣化することの無い部材を選択することが望ましく、また、その一部である導電性部分の使いやすい適当な部位が対極 4 (図中に位置を特定しない）を構成することから、酸やアルカリに強い金属を用いることが望ましい。

次に、本発明にかかる実施例である液体クロマトグラフィ一装置、及びかかる装置を用いた分析方法について説明する。

図 4は本発明にかかる実施例である液体クロマトグラフィ一装置の構成の概略を示す図である。

本発明にかかる実施例である液体クロマトグラフィー装置 1 0 1 は、移動相たる溶剤を外部の溶剤槽 1 0 2からくみ上げて溶剤の流路となる送液管 1 0 3を通して溶剤の送液をするポンプ 1 0 4 , 1 0 5 と、ポンプ 1 0 4 , 1 0 5から送液された溶剤中に被分析試料を注入して溶解させる注入口を形成する自動又は手動操作可能な被検物質注入装置 1 0 6 と、送液された溶剤中の被分析試料を溶剤の流れに従って各含有試料成分に分離する液体クロマトグラフィ一用カラム 1 0 7 と、カラム 1 0 7で分離された被分析試料の分離状況を検出する検出装置とからなる。そして、この検出装置は、上記の液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器 1 と検出した被分析試料の分離状況を示すクロマトグラムを描く記録計（図示されない）とからなる。

液体クロマトグラフィー用カラム 1 0 7にはシリカゲルやシリカゲルの表面にォク夕デシルシランゃォクチルシランゃァミノ、シァノ、フニル、ナフチル等を結合させて化学修飾して形成される化学結合型充塡剤や多孔性高分子からなる充塡剤を充填したカラムや、多孔性高分子粒の表面にスルホン酸基や 4級アンモニゥ厶基等のィオン交換官能基を導入して形成されたイオン交換樹脂を充塡した力ラム等が使用可能である。更に、移動相たる溶剤の p Hを調整するために装置 1 0 1 とは別に用意された p H調整用溶液をくみ上げてカラム 1 0 7と電気化学検出器 1をつなぐ送液管 1 0 3部分に供給する p H調整用ポンプ 1 0 8を有し、カラム 1 0 7での被分析試料の分離の後に該分離された被分析試料の置かれる環境を所望の P H値に設定することを可能とし、従って当然に該 p H値を有する環境下で被分析試料の分離状況の検出を行うことを可能としている。

勿論、 p H調整が必要ない場合は、 p H調整用ポンプ 1 0 8を省略し、 p H調整用溶液も使用しない。

また、本実施例においては、溶剤槽 1 0 2を 2つ設けており、一方に水、他方に有機溶剤等それぞれ別種の溶剤を充塡し、対応する 2つのポンプ 1 0 4， 1 0 5で汲み上げ、送液管 1 0 3中で混合することにより、移動相を形成している。そして、液体クロマトグラフィ一装置 1 0 1を用いて分析作業中、ポンプ 1 0 4 と 1 0 5の送液圧の変化させて移動相たる混合溶剤の含有構成溶剤の比率を変化させることも可能である。

尚、溶剤の種類は 2種に限られる必要はなく、 1種類でもよく、また、 3種以上としてもよい。その場合、用いる溶剤または溶剤槽の数に対応させて用いるポンプの数を決める。

次に、本発明にかかる実施例である液体クロマトグラフィ一装置を用いて実際に試料の分析を行い、その効果について評価を行った。図 5は分析に用いた試料とその構造を説明する図である。

分析に用いた試料は尿中のイブプロフェン代謝物であり、それは図中の番号（①〜⑤）が示すように 5種類ある。これら 5種類の代謝物はそれぞれ類似の構造を有するが、代謝物①， ②， ⑤はそれぞれ分子内に糖であるグルク口ン酸を抱合して有している。

グルクロン酸等の糖は塩基性環境下では水素イオンを解離し、ァ二オンとなり、通常の電気化学的分析が可能な程度の電気化学的活性を有するようになる。よって、代謝物①， ②， ⑤はそれぞれ分子内に抱合する糖であるグルクロン酸の効果により、塩基性条件下で電気化学的活性を有し、分子内にグルクロン酸を抱合しない代謝物③と④は電気化学的活性を有しない。

しかし、何れもイブプロフェン構造に由来するベンゼン環を分子内に有しており、紫外光による吸光度分析は可能である。

従って、イブプロフエン代謝物①〜⑤は紫外光による吸光度分析によっては何れも検出されてしまう力電気化学検出器によれば代謝物①， ②， ⑤のみ選択的に検出されうる。

つまり電気化学的分析を行えば、類似構造を有する複雑な混合物中から、電気化学的に不活性で不要な成分に妨害されること無く、分析の必要な糖などの電気化学的に活性な物質のみを選択的に高感度で検出することが可能となり、分析によって被分析試料中における糖等に関して得られる情報は飛躍的に正確なものとなる。

ィブプロフェン代謝物の分析条件を示す。

溶剤には水と有機溶剤であるァセトニトリルを用い、それぞれ別個の溶剤槽に充塡し、対応する二つのポンプを用いて、混合して移動相を形成した。そして、その混合比率については、所望の初期の混合比率から所望の速度で分析作業中徐々にァセトニトリルの比率が高くなるように制御されて、分析は行われた。

そして、水とァセトニトリルからなる移動相たる溶剤には、その濃度が 5 O m m o 1 リツトルとなるように調製された電解質となるリン酸ニ水素力リゥムを溶解し、ィブプロフヱン代謝物（①〜 ⑤）の有するカルボキシル基において水素ィオンの解離を抑制してカラム中での分離を十分なものとするために酸性（p Hは 2 . 4 5 ) に設定された。

カラムについては内径 1 . 5 m mで長さが 2 5 0 m mの所謂逆相の分析用カラム（CAPCELL PAK C18 UG120 ) を用い、分離作業中は 4 0 ° Cに保持された。イブプロフェン代謝物（①〜⑤）の分離後、移動相たる溶剤の p

Hを調整し求める成分のァニオン化を行うために、 p H調製用の溶剤として、 0 . 6規定の水酸化ナトリウム溶液を用いた。そして、移動相の p Hは 1 3に調整された。

尚、比較例として 2 1 0 n mの紫外光を用いた吸光度検出器を用レ、、カラムで分離された被分析試料の一部を移動相たる溶剤の p H 調整がなされる前に分析し、本発明にかかる実施例の示す結果との比較を行った。

次に、イブプロフヱン代謝物の分析結果をその得られたクロマトグラムにより示す。

図 6は本発明にかかる実施例によるクロマトグラムと比較例である吸光度検出器によるクロマトグラムを比較して示す図である。図 6より、 5種類の尿中イブプロフヱン代謝物中のグルクロン酸抱合体（①， ②、 ⑤）のみが本実施例にかかる液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器により選択的に検出され、その際、ベースラインの乱れもないことが分かった。

以上の結果より、被分析試料中の糖又糖を抱合した物質を分析したい場合に、被分析試料が糖以外の多数の成分を含有したのもであっても、有機溶剤等分離に最適な溶剤を用いて最適な分離を行つた後、その糖又糖を抱合した物質のみを選択的に検出し、正確な分析結果を得ることが可能であることが分かった。

Claims

請求の範囲

1. 参照電極（ 2) と作用電極（ 3 ) と対極（ 4 ) とを有して構成される 3極式ポテンシォス夕ットからなる液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器（ 1 ) において、

該 3極式ポテンシォスタツトを構成する参照電極（ 2 ) は、電極本体（ 1 1 ) と該電極本体（ 1 1 ) を保護して収納する内筒（ 1 6 ) と外筒（ 2 0 ) の二つの筒体からなり、内筒（ 1 6 ) は該電極本体（ 1 1 ) を電解液ともに収納し、外筒（ 2 0 ) は該内筒（ 1

6 ) を電解液ともに収納して構成することにより、該電極本体（ 1 1 ) を二つの電解液層と筒体で二重に保護する 2重構造を有し、該作用電極（ 3 ) は、該作用電極の接続する該装置の電子回路 ( 1 0 ) のプログラム機能により電位を周期的に変化させうるものであることを特徴とする液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器 _c

2. 電極電位の基準となる参照電極（ 2) と、

被電解物質に直接作用する作用電極（ 3) と、

電解反応を補助する対極（ 4 ) と、

該参照電極（ 2 ) と該作用電極（ 3 ) と該対極（ 4 ) の 3種電極をそれぞれ支持し、更に該 3種電極（ 2, 3, 4 ) に及んで該 3種電極（ 2， 3, 4 ) 各々を繋ぐとともに両端の開口部をそれぞれ移動相である溶剤の流入口及び流出口とする内腔（ 5 ) を有し、該内腔（ 5 ) 中を流れる該溶剤と該 3種電極（ 2, 3, 4 ) それぞれとを接触可能としているセル（ 6 ) と、

該 3種電極（ 2, 3, 4 ) 各々と接続しポテンシォスタツト（

7) 並びに電位発生回路（ 8 ) 並びに電界電流測定増幅回路（ 9 ) を有する電子回路（ 1 0 ) とからなり、

該セル（ 6 ) の該内腔（ 5 ) 中を流れる溶剤中の被分析試料を該作用電極（ 3 ) 上での電極反応により酸化又は還元させ、該酸化又は還元反応により該対極（ 4 ) と該作用電極（ 3 ) との間に生じる電流を検出して被分析試料の検出を行う液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器（ 1 ) において、

該参照電極（ 2 ) は、電極本体（ 1 1 ) と、

該電極本体（ 1 2 ) を支持する支持具（ 1 2) と、

液体の浸出不能な部材からなり該支持具（ 1 2) 取付け用の取付け開口部（ 1 3 ) と更に少なくとも一つの開口部分を内開口部（ 1 4 ) として有する筒状体であって、該内開口部（ 1 4 ) をカーボン材で充塡して塞ぎ、該支持具（ 1 2 ) との間で該電極本体（ 1 1 ) を第一の電解質溶液とともに該電極本体（ 1 1 ) と該内筒外部との電気的導通を確保しつつ密封収納する内筒（ 1 6 ) と、

液体の浸出不能な部材からなり該支持具（ 1 2 ) 取付け用の取付け開口部（ 1 7 ) と更に少なくとも一つの開口部分を外開口部（ 1 8 ) として有する筒状体であって、該外開口部（ 1 8 ) を力一ボン材（ 1 9 ) で充塡して塞ぎ、該支持具（ 1 2) との間で該電極本体 ( 1 1 ) を収納した該内筒（ 1 6 ) を第二の電解質溶液とともに該電極本体（ 1 1 ) と該外筒外部との電気的導通を確保しつつ密封収納する外筒（ 2 0 ) と、からなり、

該電子回路（ 1 0 ) が更に該作用電極（ 3 ) の電位を周期的に変化させることが可能なプログラム機能を有することを特徴とする液体クロマトグラフィー用電気化学検出器。

3. 請求項 2記載の液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器において、

前記プログラム機能は前記電位発生回路（ 8 ) が有し、前記電位発生回路（ 8 ) が周期的に前記作用電極（ 3 ) での発生電位を変化させることを可能としていることを特徴とする液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器。

4. 移動相たる溶剤を外部の溶剤槽（ 1 0 2 ) からくみ上げて該溶剤の流路となる送液管（ 1 0 3 ) を通して溶剤の送液をする少なくとも一つのポンプ（ 1 0 4 , 1 0 5 ) と、該ポンプ（ 1 0 4 , 1 0 5 ) から送液された溶剤中に被分析試料を注入して溶解させる注入口を形成する自動又は手動操作可能な被検物質注入装置（ 1 0 6 ) と、

送液された溶剤中の被分析試料を溶剤の流れに従って各含有試料成分に分離する少なくとも一つのカラム（ 1 0 7) と、

該カラムで分離された被分析試料の分離状況を検出する検出装置と、からなる液体クロマトグラフィー装置（ 1 0 1 ) において、該検出装置に請求項 3記載の液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器（ 1 ) を用いることを特徴とする液体クロマトグラフィー装

5. 請求項 4記載の液体ク口マトグラフィ一装置において、前記検出装置は、請求項 3記載の液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器（ 1 ) と検出した被分析試料の分離状況を示すクロマトグラムを描く記録計とからなり、

更に、移動相たる溶剤の p Hを調整するために該装置（ 1 0 1 ) とは別に用意された P H調整用溶液をくみ上げて該装置内に供給する P H調整用ポンプ（ 1 0 8 ) を有し、前記カラム（ 1 0 7 ) での被分析試料の分離の後に該分離された被分析試料の置かれる環境を所望の P H値に設定することを可能としたことを特徴とする液体クロマトグラフィ一装置。

6. 有機溶剤及び Z又は水に電解質を溶解して調製されて外部の溶剤槽（ 1 0 2 ) に充墳された少なくとも一種の溶剤を移動相とし、該溶剤槽から該溶剤を少なくとも一つのポンプ（ 1 0 4 , 1 0 5 ) でくみ上げ、該溶剤の流路となる送液管（ 1 0 3 ) を通して溶剤の送液をし、

該ポンプ（ 1 0 4, 1 0 5 ) から送液された溶剤中に、被分析試料を該溶剤中に注入する注入口を形成する自動又は手動操作可能な被検物質注入装置（ 1 0 6 ) を通して被分析試料を注入して溶解させ、送液された溶剤中の被分析試料を少なくとも一^つのク aマトグラフィ一用カラム（ 1 0 7) を用いて溶剤の流れに従って被分析試料中の各含有試料成分に分離し、

該カラム（ 1 0 7) で分離された被分析試料の分離状況を、参照電極（ 2 ) と作用電極（ 3 ) と対極（ 4 ) とを有して構成される 3 極式ポテンシォスタツトからなる液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器（ 1 ) であって、該 3極式ポテンシォスタツトを構成する参照電極（ 2 ) は、電極本体（ 1 1 ) と該電極本体（ 1 1 ) を保護して収納する内筒（ 1 6 ) と外筒（ 2 0 ) の二つの筒体からなり、内筒（ 1 6 ) は該電極本体（ 1 1 ) を電解液ともに収納し、外筒

( 2 0 ) は該内筒を電解液ともに収納して構成することにより、該電極本体（ 1 1 ) を二つの電解液層と筒体で二重に保護する 2重構造を有し、該作用電極（ 3 ) は、該作用電極（ 3 ) の接続する該装置の電子回路（ 1 0 ) のプログラム機能により電位を周期的に変化させうるものである液体クロマトグラフィ一用電気化学検出器（

1 ) を用いて検出することを特徴とする液体クロマトグラフィー装置を用いた分析方法。

7. 請求項 6記載の液体クロマトグラフィ一装置を用いた分析方法において、

前記ポンプとは別に設けられた少なくとも一つの p H調整用ボンプ（ 1 0 8 ) を用いて、移動相たる溶剤の p Hを調整するための p H調整用溶液を該送液管（ 1 0 3 ) における前記カラム（ 1 0 7 ) と前記電気化学検出器（ 1 ) を繫ぐ部位の内部に供給し、前記カラム（ 1 0 7) での分離によって各含有成分に分離された被分析試料を所望の P H環境下に置いたうえで、被分析試料の分離状況を前記の電気化学検出器（ 1 ) により検出することを特徴とする液体クロマトグラフィ一装置を用いた分析方法。