WO1998048019A1 - Procedimiento de inactivacion de genes que codifican para enzimas del catabolismo del fenilacetato, plasmidos que intervienen y cepas transformadas con los mismos - Google Patents

Procedimiento de inactivacion de genes que codifican para enzimas del catabolismo del fenilacetato, plasmidos que intervienen y cepas transformadas con los mismos Download PDF

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    • C12R2001/82—Penicillium chrysogenum

Definitions

  • Ortho-hydroxylation of phenylacetate is the first step of this route.
  • the homogentisate is catabolized through fumaroyl acetoacetate in fumarate and acetoacetate, which are incorporated into the Krebs cycle (see Fernández Ca ⁇ ón y Pe ⁇ alva, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92: 9132-9136, 1995).
  • genetic engineering techniques lacking the aforementioned limitations, to eliminate the ability to completely or partially catabolize phenylacetate.
  • An essential requirement for conducting genetic engineering is the cloning and characterization of the gene or genes that mediate the aforementioned harmful characteristic of penicillin-producing fungi.
  • the object of the present invention is intended to solve the existing problems of the State of the Art listed above. It consists of characterizing a fungal gene coding for a phenylacetate 2-hydroxylase activity, an enzyme that catalyzes the first enzymatic step of the catabolism of phenylacetate in Aspergillus and Penicillium and its use to eliminate the gene present in the genome of penicillin-producing fungi by recombinant DNA technology.
  • the present patent describes how this gene is inactivated in a genetically engineered strain. This strain, which is unable to catabolize phenylacetate, produces higher levels of penicillin than the parental strain.
  • the sequence of a 1,986 base pair (bp) genomic DNA fragment of A. nidulans, which includes the new gene used for the present invention is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the gene was called phacA (phac by the use of phenylacetate (phenylacetate)) and codes for an enzyme that ortho-hydroxylates phenylacetate (said reaction being the first step of the catabolism of phenylacetate in A. nidulans).
  • phacA phac by the use of phenylacetate (phenylacetate)
  • codes for an enzyme that ortho-hydroxylates phenylacetate said reaction being the first step of the catabolism of phenylacetate in A. nidulans.
  • the nucleotide sequence of the complementary DNA clones (cDNA) covering the entire coding region and its subsequent alignment with the genomic DNA sequence revealed the following characteristics of this gene:
  • the gene codes for a 518 amino acid polypeptide.
  • the first methionine is encoded by an ATG triplet at position 82, while the end codon (TAG) is located at position 1810. These positions correspond to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the coding region is interrupted by three introns of 65, 56 and 53 nucleotides in length (SEQ ID NO. 1).
  • the 518 residue deducted polypeptide is shown in the three-letter amino acid code, below its corresponding exons in SEQ ID NO: 1 and also, in an isolated context, in SEQ ID NO: 2.
  • the molecular weight of the protein deducted is 58.495 g / mol.
  • the new DNA compound whose structure is described in detail in SEQ ID NO: 1 and which was isolated from a natural microorganism, can be fully synthesized using automatic DNA synthesizers.
  • the protein encoded by the new DNA compound could be encoded by alternative DNA sequences. These are included in the present invention.
  • any natural genetic variant derived from the new DNA compound described above is considered equivalent thereto.
  • These genetic variants include homologous genes in organisms closely related to A. Nidulans in evolutionary terms, such as P. chrysogenum. These genes can be easily identified using the DNA compound of A. nidulans as a hybridization probe as described below.
  • nidulans can be used as a molecular probe for the search for functional homologous genes in genomic libraries or cDNAs of other fungal species by hybridization.
  • its use is described to track a library of P. chrysogenum, demonstrating that the homologous gene to the phacA of A.
  • Nidulans can be isolated from industrial strains of P. chrysogenum.
  • the sequence of a genomic DNA fragment of 2,558 bp of P. chrysogenum isolated by hybridization with a phacA gene probe is shown in SEQ ID NO: 3.
  • Nidulans was designated pahA (by phenylacetate hydroxilation).
  • the pahA gene of P. chrysogenum codes for a 516 amino acid polypeptide that shows 84% identity with the amino acid sequence of PhacA, the protein product of the phacA gene of A.
  • the product sequence of the Pai ⁇ A gene of P. chrysogenum is shown in SEQ ID N0: 4.
  • this new DNA compound isolated from P. chrysogenum is also included in the present invention, as well as other homologous genes that can be isolated from other fungal species by similar procedures.
  • Cloned genes can be used to generate loss-of-function mutations through inverse genetics.
  • a new recombinant DNA molecule can be constructed in an Escherichia coli vector, carrying a truncated version of the fungal gene, which can be used to inactivate the endogenous gene by transformation.
  • this recombinant plasmid may contain the 5 'region of the phacA gene of A. nidulans, followed by a modification in the coding region of the phacA gene consisting of the 289 bp Nael-Kpnl fragment being replaced by a 3.2 kb Xhal fragment containing the argB * gene of TO . nidulans (see Fig. 1).
  • the 3 'region of the phacA gene is arranged.
  • the expression of this mutant phacA gene would result in a truncated PhacA protein in residue 297 and, therefore, lacking 221 carboxyterminal residues.
  • These last residues, absent in the mutant protein comprise the aforementioned peptide that includes the Cys residue, which is involved in the binding of heme groups and is essential for the activity of this type of protein.
  • a linear DNA fragment containing the aforementioned regions can be separated from the vector sequences by means of suitable restriction enzymes and then purified by standard techniques. This linear fragment can be used for the transformation of a strain argB ⁇ of A. Nidulans in prototroph for arginine.
  • Reverse genetically generated nidulans that lack the function of the phacA gene cannot grow in phenylacetate as the only carbon source. However, they grow in 2-hydroxyphenylacetate or 2,5-dihydroxyphenylacetate.
  • the new DNA compound (the phacA gene of A. nidulans) codes for an enzymatic activity required for ortho-hydroxylation of phenylacetate, an essential step for the use of phenylacetate in A.
  • Nidulans P. chrysogenum does not use phenylacetate as the only carbon source but, as shown above, it contains a gene that codes for an enzyme counterpart
  • PhacA Therefore, the new DNA compound provides a method to eliminate lateral metabolic conversions that may decrease the accumulation of phenylacetate available for penicillin biosynthesis.
  • P. chrysogenum a methodology similar to that described can be applied to inactivate the pahA gene, using the new P. crysogrenum DNA compound included in this invention and any of the transformation markers already available for P. chrysogenum, for example the trpC gene. It will also be appreciated that other transformation markers other than argB (in A. nidulans) or trpC (in P. chrysogenum) could be used to disrupt the coding region of the new DNA compound.
  • FIG. 2 shows one such method, the which can be used to alter the pahA gene of P. chrysogenum.
  • an internal region of the pahA gene has been replaced by a chimeric gene where the promoter of the gdh gene of P. chrysogenum (gene encoding the enzymatic activity glutamate dehydrogenase) controls the expression of the bacterial gene ble ", which confers resistance to the antibiotic fleomycin.
  • transformants can be selected for their ability to grow in media containing fleomycin (Kolar, M., Punt , PJ, van del Hondel, CAMJJ and Schwab, H. Gene 62: 127-134, 1988).
  • the transformants of A. Nidulans with the substitution of the phacA gene described above produce 3 to 8 times more penicillin than the parental strain and are less dependent on the amount of phenylacetate added (see Figure 3 ).
  • reducing phenylacetate from the 0.125% (w / v) to 0.0625% (w / v) results in a significant decrease in penicillin production levels in the wild strain
  • transformants lacking phacA gene function produce high penicillin levels , with both concentrations of phenylacetate.
  • this invention not only concerns the phacA gene and its counterparts.
  • other genes that intervene in the metabolism of phenylacetate could be inactivated using a method similar to that described here.
  • This invention that is, that the penicillin productivity of fungal organisms can be improved by inactivating individual phenylacetate metabolism genes through the use of reverse genetics, also covers these alternative possibilities.
  • cDNA clones corresponding to the phacA gene were isolated by differential selection of a cDNA library, following the steps described below:
  • the strain of A. A26 nidulans from the Fungal Genetics Stock Center collection was grown at 37 ° C - li in suitably supplemented minimum medium containing (in g / 1) KP0, H 2 , (13.6), (NH 4 ) 2 S0 4 / 2.0; MgSO Highlightx 7H 2 0.25 and Fe x 7H, 0.0005, with 0.3% glucose (w / v) as carbon source.
  • the time when glucose was consumed was determined by analyzing the concentration of glucose in the culture medium (using an enzymatic "kit"). This generally occurred at 18 hours of incubation with constant agitation.
  • phenylacetate was added to the culture, to a final concentration of 10 mM and the culture was stirred at 37 ° C for a further 1 hour in order to induce the expression of the mentioned genes.
  • the mycelium was collected by filtration, washed with water, frozen in liquid nitrogen, lyophilized and used to isolate total RNA. This total RNA preparation was used to isolate poly (A * ) mRNA by affinity chromatography on oligo-dT cellulose.
  • Single-stranded cDNA was prepared in the presence of reverse transcriptase of the avian myeloblastosis virus (of commercial origin), using as a template 2 ⁇ g of said isolated mycelium-induced mycelium with phenylacetate and oligo-dT (15-mer) as the initiator.
  • the reaction was incubated for 1 hour at 42 ° C in a buffer containing 10 mM Tris-HC1 pH 8.8 (at 25 ° C), 50 M KC1, 0.1% Triton X-100, 5 mM MgCl ,, 10 mM of each dNTP and 0.5 units of RNAs without.
  • the template RNA was removed by incubation for 1 hour at 60 ° C with 3M NaOH. After neutralization (with acetic acid), the single stranded DNA was recovered by centrifugation by precipitation with 2.5 volumes of absolute ethanol for 2 hours at -80 ° C. This cDNA was subtracted with a 30-fold excess of poly (A * ) RNA isolated from the mycelium collected at the time of glucose depletion, following the procedure described by Sargent, TD, Methods Enzymol. 152: 423-432, 1987. The cDNA-RNA hybrid molecules were separated by hydroxyapatite chromatography at 68 ° C and discarded.
  • the remaining cDNA is hybridized as mentioned, with an excess of poly (A * ) RNA from mycelium grown in the absence of phenylacetate. Again, the mo- cDNA-RNA hybrid cells as indicated and the resulting single-stranded cDNA population was collected, which represented transcripts of genes preferably expressed in the presence of phenylacetate.
  • This cDNA was uniformly labeled with [ ⁇ ⁇ J P] dCTP and excess of all other dNTPs, in the presence of the Klenow fragment of the DNA polymerase and random sequence hexanucleotides as "primers".
  • the population obtained from cDNAs labeled with 32 P (specific activity> 10 at cpm / mg) was used as a probe to track a cDNA library constructed as described in section c).
  • the synthesis reaction of the first cDNA chain was performed as described above.
  • the cDNA-RNA hybrid obtained was converted into a double stranded cDNA introducing random breaks in the RNA chain with RNase H, which were used as starting points by Escherichia coli DNA polymerase I.
  • RNase H Random breaks in the RNA chain with RNase H
  • synthetic adapters containing the blunt phosphorylated end and the EcoRI protrusion were incubated with the double stranded cDNA in the presence of T4 DNA ligase.
  • the EcoRI end cDNAs were purified and phosphorylated with T4 polynucleotide kinase and ATP.
  • the phosphorylated cDNA was mixed with the arms of the ⁇ gtlO vector previously digested with EcoRI and dephosphorylated and the mixture was incubated with T4 DNA ligase.
  • the recombinant DNA molecules were packaged in vitro, using commercial packaging extracts.
  • Recombinant phages in which a cDNA insert had inactivated the el gene (in which the EcoRI site is present) were selected by their lytic phenotype in an E strain.
  • coli hfl F-, thi -1, thr-1, leuB ⁇ , lacYl, tonA21, supE44, hflA150, [chr:: Tnl0].
  • the cDNA library was plated using E. coli strain C600 hfl " and the lysis plates obtained were transferred in duplicate to nitrocellulose filters.
  • One of the replicas was hybridized with the" more "cDNA probe (described in a )) and the second replica was hybridized with the cDNA probe "less” (described in b).)
  • the clones that hybridized with the "more” probe were selected and purified and did not hybridize with the "less” probe.
  • the cDNA inserts were cleaved from the vector by digestion with the Notl endonuclease, using the Notl cut sites included in the EcoRI adapter.
  • the inserts of the selected clones were subcloned into plasmid pBluescript SK (+) digested with Notl and then sequenced by standard procedures.
  • the sequences of the cAD ⁇ inserts were translated in the six possible reading frames and were compared using the BLAST algorithm with the conceptual translation in the six reading frames of the GenBank and EMBL public access AD ⁇ sequence databases. with the SwissProt and PIR protein sequence databases.
  • One of the sequences of the cAD ⁇ inserts generated an extensive framework of open reading, not interrupted by termination codons.
  • the deduced amino acid sequence showed a significant identity with amino acid sequences of the proteins of the cytochrome P450 family, which are generally involved in oxidation reactions.
  • the open reading frame codes for a phenylacetate 2-hydroxylase.
  • This cDNA insert was used to hybridize new cDNA clones corresponding to this gene. These clones were sequenced by both chains and the nucleotide sequence obtained showed a complete open reading frame of 1,554 bp in length (without the translation termination codon) that codes for a 518 amino acid polypeptide (SEQ ID NO: 2) .
  • SEQ ID NO: 2 The identity of this sequence with members of the family of cytochrome P450 proteins unambiguously established that this deduced protein represents a new member of this family.
  • a genomic DNA library of A. nidulans built in ⁇ EMBL4 vector was screened with a cDNA probe labeled with J P corresponding to the almost complete transcript. Positive clones were purified and their inserts were characterized by restriction enzyme digestion and hybridization with the aforementioned probe. In this way, the hybridization zone of two adjacent BamHI fragments 2.4 and 1.9 kb in length was mapped.
  • Fig. 4 shows a restriction map of the genomic region that contains these fragments. These BamHI fragments were subcloned into pBluescript SK (+). The recombinant plasmid containing the 2.4 kb BamHI fragment was designated pBS-FG4A, while the plasmid carrying the 1.9 kb BamHI fragment was designated pBS-FG4B. EXAMPLE 2. CLONING AND CHARACTERIZATION OF THE PAHA GENE OF P. CHRYSOGENUM, FUNCTIONAL HOMOLOGY OF THE GENE PhacA OF Nidulans
  • the double stranded cDNA was inserted between the EcoRI and Xhol restriction sites of the ⁇ ZAP phage vector, placing the 5 'region of the transcripts next to the EcoRI site.
  • the library was packaged with packaging extracts "Gigapack II Gold" (Stratagene) generating about 10 'independent clones. Tracking this cDNA library was performed according to standard procedures (Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. ), using as a probe an EcoRV fragment of 1,174 bp internal to the pahA gene ( Figure 5).
  • pPhacA in the only Xbal site of pUCA-B, to give pPhacA:: argB + .
  • pPhacA starting from the lacZ promoter of pUC18, pPhacA :: argB includes a 0.94 kb fragment of the 5 'region of the phacA gene, sequentially followed by the first 297 codons of its genomic sequence, the 3.2 kb fragment that contains the argB gene, the genomic sequence of the phacA gene corresponding to codons 393-518 and 1.2 kb of the 3 'region of the phacA gene.
  • a linear fragment containing all these regions can be purified from the plasmid by EcoRI digestion ( Figure 6).
  • a strain of A can be constructed by transformation. nidulans that include a disruption-deletion mutation in the phacA gene using this linear fragment of
  • chrysogenum pahA gene by hybridization with the phacA gene of A. nidulans present in the CECT 20195 transformant or alternatively by hybridization with synthetic oligonucleotides based on SEQ ID No: 1.
  • plasmid pALfleo7 deposited in the Spanish Type Culture Collection (CECT), University of Valencia, Research Building, Burjasot Campus, 46100 Valencia, dated February 20, 1997, as CECT 4849
  • plasmid pALP696 would be constructed as indicated in figure 7 of this patent.
  • Figure 3 shows that the highest penicillin levels corresponding to the phacA + control strain were obtained at 24 hours using 0.125% phenylacetate in the production medium.
  • the production level reached at this time was 1.8 ⁇ g / ml penicillin.
  • the decrease in half of the phenylacetate concentration reduced the maximum penicillin levels produced by this strain to
  • Figure 3 also shows that, in stark contrast, the highest penicillin levels in a culture of the AphacA strain reached 5.6 ⁇ g / ml, that is, levels 3.1 times higher than those of its parental strain.
  • the increase in penicillin production was not affected by the reduction of the initial concentration of phenylacetate to 0.0255%.
  • Figure 1 Strategy used to generate a disruption-deletion mutation in the phacA gene of A. Nidulans by homologous recombination. The supposed crossings are shown with large crosses in bold.
  • Figure 2 •. Strategy used to generate a disruption-deletion mutation in the pahA gene of P. chrysogenum by homologous recombination. The supposed cross-links are shown with large discontinuous crosses.
  • Figure 3 Production of penicillin from a transformed strain phacA :: argB of A. Nidulans compared to a wild type strain (phacA * ). Abcisas: time in hours (h); Ordered: penicillin production ( ⁇ g / ml). Continuous line: Phenylacetate concentration of 0.125%; Dashed line: Phenylacetate concentration of 0.0625%.
  • Figure 4 Restriction map of the genomic region that includes the phacA gene of A. nidulans, showing the fragments that were subcloned to generate pFG4A and pFG4B. In dark stroke the 3 introns.
  • Figure 5 Restriction map of the genomic region that includes the pahA gene of P.
  • NAME ANTIBI ⁇ TICOS, S.A.U. STREET: Avda. de Burgos, 8 -A CITY: Madrid STATE OR PROVINCE: Madrid COUNTRY: Spain ZIP CODE: 28036 PHONE: 91-3841200 FACS ⁇ MIL: 91-3841220
  • TITLE "PROCESS OF INACTIVATION OF GENES THAT CODIFY FOR ENZYMES OF THE CATABOLISM OF THE PHENYLACETATE, INTERESTING PLASMIDS AND BLOODS TRANSFORMED WITH THEM".
  • DESTINATARIO ANTIBI ⁇ TICOS, S.A.U.
  • TELECOMMUNICATIONS INFORMATION TELEPHONE: 91 7009400 FACS ⁇ MIL: 91 3193810 TELEX OR EMAIL: elzaburu@elzaburu.es
  • TYPE nucleotides
  • TYPE nucleotides
  • GGC CTC CCG GAG ATT CCT GGT ATA CCC ATA TTT GGC AAT CTA TTG CAG 508 Gly Leu Pro Glu He Pro Gly He Pro He Phe Gly Asn Leu Leu Gln
  • GGT AAT ATC TTG AAG GAT CCC GAG GCT AAG CTG AAT GAT G GTGAGTTACA 1290 Gly Asn He Leu Lys Asp Pro Glu Ala Lys Leu Asn Asp
  • AAATCTCGCG AAATCTTTGT GAATGTTGGT ATTGAGTACT CATCTATCGT CTAG CC 1346
  • ES 81) Designated states: AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE , DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, GM, GW, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR,
  • Applicant for all designated States except US: KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN,
  • ANTIBI ⁇ TICOS S.A. [ES / ES]; Avenida de Burgos, 8- A, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, E-28036 Madrid (ES).
  • the procedure is preferably applied to the ph ⁇ cA gene of A. nidul ⁇ ns and the p ⁇ hA gene of P. chrysogenum, genes that code respectively for competing enzymes for this substrate with the biosynthetic enzymes of penicillin.
  • the non-expression of these enzymes favors the synthesis of this antibiotic, increasing its production, with a lower demand for phenylacetate per unit of culture.
  • a method of inactivation in microorganisms, of genes encoding phenylacetate catabolism enzymes and competing for this compound with penicillin biosynthetic enzymes which consists of an integrative transformation by homologous recombination between at least one exogenous DNA compound and at least a part of the sequence of the gene to be inactivated.
  • the transforming DNA compound is a circular molecule containing at least one expressible fragment of the gene to be inactivated.
  • the transforming DNA compound is a linear molecule that contains at least one DNA fragment not included in the sequence of the gene to be inactivated, but which contains at least one transformation marker that disrupts the coding sequence thereof.
  • the transforming DNA molecule contains, in whole or in part, a copy of the sequence of the gene to be inactivated with a mutation, preferably, of change of reading frame, without sense or deletion, which results in a phenotype of loss of function of said gene. 5.
  • the microorganism undergoing transformation in which the gene is inactivated is capable of producing penicillin G or V.
  • a method according to claim 11, wherein the gene that is inactivated encodes a polypeptide represented by SEQ ID NO: 2, or similar sequences that express P450 phenylacetate 2-hydroxylase activity.
  • a method according to claims 1 to 6, 8 and 10, wherein the gene that is inactivated is represented by SEQ ID NO: 3, its mimicked gene sequences and / or homologous genes.
  • a method according to claim 13, wherein the gene that is inactivated encodes a polypeptide represented by SEQ ID N0: 4, or similar sequences that exhibit P450 activity phenylacetate 2-hydroxylase.
  • a transformed strain of Aspergillus nidulans and mimics derived therefrom that incorporates at least one exogenous DNA compound consisting of a truncated, incomplete or inactive sequence of at least one gene that codes for a phenylacetate catabolism enzyme and which inactivates the endogenous gene after integration by homologous recombination.
  • a transformed strain according to claims 15 to 19 characterized in that it consists of a pure strain of A. CECT20195 nidulans, their imitants and / or transformed derivatives.
  • a plasmid pPhacA :: argB of inactivation of the pipedic gene of A.
  • nidulans as shown in the restriction map of Figure 6 and consisting of plasmid pUC18 containing a 6.8 kb EcoRI insert which includes the phacA gene of A.
  • Inactivated nidulans by inserting a 3.2 kb fragment that in turn contains the argB gene from A.
  • 23. A transformed strain of P. chrysogenum according to claim 22, wherein the gene to be inactivated codes for an enzyme that mediates phenylacetate hydroxylation.
  • 27. A plasmid pALP696 of inactivation of the P. chrysogenum pahA gene, as shown in the restriction map of Figure 7 and consisting of plasmid pBC KS + containing a 7.9 kb I left insert which includes the P. chrysogenum inactivated pahA gene by inserting a 2.0 kb fragment that in turn contains the .ble * gene of S. Malawistanus expressed under the control of the gdh promoter of P. chrysogenum.

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Abstract

Procedimiento de inactivación de genes que codifican para enzimas del catabolismo de fenilacetato, plásmidos que los contienen y cepas transformadas con los mismos. El procedimiento se aplica preferentemente al gen phacA de A. nidulans y al gen pahA de P. chrysogenum, genes que codifican respectivamente para enzimas competidoras por este sustrato con las enzimas biosintéticas de penicilina. La no expresión de estas enzimas favorece la síntesis de este antibiótico, incrementando su producción, con una demanda de fenilacetato menor por unidad de cultivo.

Description

La orto-hidroxilación del fenilacetato es el primer paso de esta ruta. Una segunda reacción hidroxilante convierte el 2 -hidroxifenilacetato en 2 , 5-dihidroxifenilacetato (= homogentisato) . El homogentisato es catabolizado a través de fumarilacetoacetato en fumarato y acetoacetato, los cuales se incorporan en el ciclo de Krebs (véase Fernández Cañón y Peñalva, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 92:9132-9136, 1995) .
La capacidad de los citados hongos filamentosos para catabolizar parcial o totalmente fenilacetato es una característica perjudicial en la producción de penicilina. Por lo tanto, la eliminación total o parcial de esta característica daría como resultado cepas con capacidad de producción de penicilina G mejorada. La eliminación mediante mutagénesis clásica de esta característica perjudicial (es decir, de la capacidad para catabolizar parcial o totalmente fenilacetato) en los hongos productores de penicilina, exigiría enormes esfuerzos de selección entre un gran número de cepas. Por otra parte, dicha mutagénesis con frecuencia origina segundas mutaciones que podrían eliminar características útiles de las cepas parentales, generando, por ejemplo, mutaciones auxotró- ficas o mutaciones que disminuyan el vigor de crecimiento o conidiación críticos para la fermentación industrial. Por lo tanto, es adecuado usar técnicas de ingeniería genética, carentes de las citadas limitaciones, para eliminar la capacidad de catabolizar total o parcialmente fenilacetato. Un requisito esencial para realizar ingeniería genética dirigida es la clonación y la caracterización del o de los genes que median la anteriormente mencionada característica perjudicial de los hongos productores de penicilina.
Descripción detallada de la invención
El objeto de la presente invención pretende resolver los problemas existentes del Estado de la Técnica anteriormente enumerados. Consiste en caracterizar un gen fúngico que codifica para una actividad fenilacetato 2-hidroxilasa, enzima que cataliza el primer paso enzimático del catabolismo de fenilacetato en Aspergillus y Penicillium y su uso para eliminar el gen presente en el genoma de los hongos productores de penicilina mediante tecnología de ADN recom- binante. La presente patente describe cómo este gen es inactivado en una cepa construida por ingeniería genética. Esta cepa, que es incapaz de catabolizar fenilacetato, produce niveles más altos de penicilina que la cepa parental . Además, la producción máxima de penicilina de esta cepa re- combinante requiere un menor exceso de fenilacetato que el que necesita la cepa parental. La inactivación del catabolismo de fenilacetato usando el (los) anterior (es) compuesto (s) de ADN tiene como resultado una mejora importante de la producción de penicilina.
La secuencia de un fragmento de ADN genómico de 1.986 pares de bases (pb) de A. nidulans , que incluye el nuevo gen usado para la presente invención se muestra en SEQ ID NO:l. El gen se denominó phacA (phac por la utilización de phenylacétate (fenilacetato) ) y codifica para una enzima que orto-hidroxila fenilacetato (siendo dicha reacción el primer paso del catabolismo de fenilacetato en A . nidulans) . La secuencia de nucleótidos de los clones de ADN complementario (cADN) que cubren la región codificante com- pleta y su posterior alineamiento con la secuencia de ADN genómico revelaron las siguientes características de este gen:
- El gen codifica para un polipéptido de 518 aminoácidos. La primera metionina está codificada por un triplete ATG en posición 82, mientras que el codón de fin (TAG) está situado en la posición 1810. Estas posiciones se corresponden con la secuencia de nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 1.
- La región codificante está interrumpida por tres intrones de 65, 56 y 53 nucleótidos de longitud (SEQ ID NO. 1). - El polipéptido deducido de 518 residuos se muestra en el código de aminoácidos de tres letras, debajo de sus correspondientes exones en SEQ ID NO: 1 y también, en un contexto aislado, en SEQ ID NO: 2. El peso molecular de la proteína deducida es de 58.495 g/mol . Una búsqueda realizada utilizando el servidor de acceso público BLAST del Centro Nacional de Información de Biotecnología (NCBI, USA) en las bases de datos de secuencias de proteínas (por ejemplo S issProt y PIR) y en la traducción conceptual de bases de datos de secuencias de ADN (por ejemplo las bases de datos GenBank y EMBL) en los seis marcos de lectura posibles, revelaron similaridad de la secuencia de aminoácidos con miembros de la familia del citocromo P450 (proteína hemo- tiolada) . Estas proteínas intervienen generalmente en pro- cesos oxidativos. De hecho, las secuencias entre los residuos 431 a 439 corresponden al péptido que contiene el aminoácido cisteína Gly-X-Gly-X-X-X-Cys-X-Gly (donde X indica cualquier aminoácido) que interviene en la unión del grupo hemo, el cual es característico de estas proteínas hemotio- ladas.
El nuevo compuesto de ADN, cuya estructura se describe con detalle en SEQ ID NO : 1 y que se aisló de un microorganismo natural, puede ser sintetizado totalmente utilizando εintetizadores de ADN automáticos. Además, debido a la naturaleza degenerada del código genético, la proteína codificada por el nuevo compuesto de ADN podría ser codificada por secuencias de ADN alternativas. Estas se incluyen en la presente invención. Por otro lado, cualquier variante genética natural derivada del nuevo compuesto de ADN ante- riormente descrito se considera equivalente al mismo. Estas variantes genéticas incluyen genes homólogos en organismos estrechamente relacionados con A . nidulans en términos evolutivos, tales como P. chrysogenum . Estos genes pueden ser fácilmente identificados usando el compuesto de ADN de A . nidulans como sonda de hibridación tal y como se describirá a continuación. El gen phacA de A . nidulans puede ser utilizado como sonda molecular para la búsqueda de genes homólogos funcionales en genotecas genómicas o de cADN de otras especies fúngicas mediante hibridación. Así por ejemplo, en la pre- senté patente se describe su utilización para rastrear una genoteca de P . chrysogenum, demostrando que el gen homólogo al phacA de A . nidulans puede ser aislado de cepas industriales de P. chrysogenum . La secuencia de un fragmento de ADN genómico de 2.558 pb de P . chrysogenum aislado por hibridación con una sonda del gen phacA se muestra en SEQ ID NO : 3. El gen de P . chrysogenum homólogo al phacA de A . nidulans se designó pahA (por phenylacetate hydroxilation (hidroxilación de fenilacetato) ) . El gen pahA de P . chrysogenum codifica para un polipéptido de 516 aminoácidos que muestra un 84 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de PhacA, el producto proteico del gen phacA de A . nidulans . La secuencia del producto del gen paiíA de P . chrysogenum se muestra en SEQ ID N0:4. Como se ha indicado anteriormente, este nuevo compuesto de ADN aislado de P. chrysogenum también se incluye en la presente invención, así como los demás genes homólogos que se puedan aislar de otras especies de hongos por procedimientos similares.
Los genes clonados pueden ser usados para generar mutaciones de pérdida de función mediante genética inversa. Para ello, se puede construir una nueva molécula de ADN recombinante en un vector de Escherichia coli , portador de una versión truncada del gen fúngico, el cual puede ser usado para inactivar el gen endógeno por transformación. Por ejemplo, este plásmido recombinante puede contener la región 5' del gen phacA de A . nidulans , seguida de una modificación en la región codificante del gen phacA consistente en que el fragmento Nael-Kpnl de 289 pb se substituya por un fragmento Xhal de 3.2 kb que contenga el gen argB* de A . nidulans (véase la Fig. 1) . A continuación se dispone la región 3' del gen phacA . La expresión de este gen phacA mutante tendría como resultado una proteína PhacA truncada en el residuo 297 y, por lo tanto, carente de 221 residuos carboxiterminales . Estos últimos residuos, ausentes en la proteína mutante, comprenden al anteriormente mencionado péptido que incluye el residuo Cys , el cual interviene en la unión de grupos hemo y es esencial para la actividad de este tipo de proteínas. Un fragmento lineal de ADN que contenga las regiones anteriormente mencionadas se puede separar de las secuencias del vector por medio de enzimas de restricción adecuadas y seguidamente purificarse por técnicas estándar. Este fragmento lineal puede utilizarse para la transformación de una cepa argB~ de A . nidulans en protótrofa para arginina .
Como el ADN utilizado en la transformación carece de secuencias requeridas para su replicación autónoma, los transformantes protótrofos resultan de la integración del fragmento de ADN en el genoma. Uno de los posibles modos de integración que originarían un fenotipo argB* ocurriría a través de un doble entrecruzamiento entre la molécula de ADN lineal y el locus phacA residente en el genoma del hongo, tal como se esquematiza en la Figura 1. Este acontecimiento de doble entrecruzamiento tiene como resultado la substitución del gen phacA original por el gen truncado generado in vitro, originando la pérdida de la función phacA . Los transformantes portadores de dicha substitución
(es decir, con la mutación de pérdida de función) pueden ser reconocidos por su patrón de hibridación cuando su ADN genómico es digerido con las enzimas de restricción adecuadas y analizado mediante hibridación por la técnica de Southern, utilizando como sondas los genes phacA o argB marcados radiactivamente con 32P . De esta forma, los patrones de hibridación de otros tipos de transformantes pue- den ser distinguidos con facilidad de los correspondientes a una substitución génica. Los transformantes que carecen de la función proporcionada por el gen phacA pueden ser purificados para posteriores ensayos utilizando técnicas estándar .
En contraste con la cepa de tipo silvestre, los trans- formantes de A . nidulans generados por genética inversa que carecen de la función del gen phacA no pueden crecer en fenilacetato como única fuente de carbono. Sin embargo, crecen en 2 -hidroxifenilacetato o 2 , 5-dihidroxifenilacetato. Esto demuestra que el nuevo compuesto de ADN (el gen phacA de A . nidulans) codifica para una actividad enzima- tica requerida para la orto-hidroxilación de fenilacetato, paso esencial para la utilización de fenilacetato en A . nidulans . P . chrysogenum no usa fenilacetato como única fuente de carbono pero, como anteriormente se muestra, con- tiene un gen que codifica para un homólogo de la enzima
PhacA . Por tanto, el nuevo compuesto de ADN proporciona un método para eliminar conversiones metabólicas laterales que puedan disminuir la acumulación de fenilacetato disponible para la biosíntesis de penicilina. En P. chrysogenum se puede aplicar una metodología similar a la descrita, para inactivar el gen pahA, usando el nuevo compuesto de ADN de P. crysogrenum incluido en esta invención y cualquiera de los marcadores de transformación ya disponibles para P . chrysogenum, por ejemplo el gen trpC. También se apreciará que se podrían utilizar otros marcadores de transformación diferentes de argB (en A . nidulans) o trpC (en P. chrysogenum) para interrumpir la región codificante del nuevo compuesto de ADN. Estos incluyen otros marcadores auxotróficos (por ejemplo pyrG o riboB) y genes de resistencia a antibióticos (por ejemplo, los genes que confieren resistencia a fleomicina o higromi- cina B en hongos). Tales métodos, básicamente equivalentes a los usados aquí, están comprendidos también en la presente invención. La Figura 2 muestra uno de dichos métodos, el cual se puede usar para alterar el gen pahA de P . chrysogenum . En este caso, en la construcción de inactivación, se ha substituido una región interna del gen pahA por un gen quimérico donde el promotor del gen gdh de P. chrysogenum (gen que codifica para la actividad enzimática glutamato deshidrogenasa) controla la expresión del gen bacteriano ble" , el cual confiere resistencia al antibiótico fleomi- cina. El plásmido que incluye la construcción de inactivación se denomina pALP696. Por tanto, los transformantes se pueden seleccionar por su capacidad para crecer en medios que contengan fleomicina (Kolar, M., Punt, P.J., van del Hondel, C.A.M.J.J. y Schwab, H. Gene 62: 127-134, 1.988).
Adicionalmente se pueden usar otras estrategias para generar, por genética inversa, mutaciones de pérdida de función en un gen que haya sido clonado y caracterizado. Por ejemplo, la transformación con un plásmido circular portador de un fragmento interno del gen diana origina, tras la integración homologa de una sola copia del ADN transformante, dos copias incompletas del gen carentes de funcionalidad si se elige adecuadamente el fragmento incluido en el plásmido. Los métodos que utilizan éstas u otras estrategias diferentes para generar una mutación de pérdida de función en el gen deseado por medio de genética inversa también se incluyen en esta invención. Las cepas fúngicas en las que se han eliminado las enzimas que intervienen en la modificación o catabolismo de fenilacetato muestran propiedades mejoradas de producción de penicilina. No obstante, su capacidad de crecimiento en los medios de producción de penicilina es indistinguible de la de la cepa parental. Por ejemplo, los transformantes de A . nidulans con la substitución del gen phacA anteriormente descrita (es decir, carente de actividad fenilacetato 2 -hidroxilasa) producen de 3 a 8 veces más penicilina que la cepa parental y son menos dependientes de la canti- dad de fenilacetato adicionada (véase la Figura 3) . De este modo, mientras que la reducción de fenilacetato desde el 0,125 % (p/v) al 0,0625 % (p/v) da como resultado una importante disminución de los niveles de producción de penicilina en la cepa silvestre, los transformantes que carecen de la función del gen phacA producen niveles de penicilina elevados, con ambas concentraciones de fenilacetato .
Finalmente, esta invención no sólo concierne al gen phacA y sus homólogos. Utilizamos aquí el gen que codifica para fenilacetato 2 -hidroxilasa, porque esta enzima cátaliza el primer paso de la ruta catabólica de fenilacetato y las cepas de producción de P . chrysogenum secretan cantidades importantes de 2 -hidroxifenilacetato . Una vez caracterizados, se podrían inactivar otros genes que intervienen en el metabolismo de fenilacetato utilizando un método si- milar al aquí descrito. Esta invención, es decir, que la productividad de penicilina de los organismos fúngicos puede ser mejorada inactivando genes individuales del metabolismo del fenilacetato mediante el uso de genética inversa, también cubre estas posibilidades alternativas.
Ej emplos
EJEMPLO 1. CLONACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DEL GEN phacA de A . nidulans .
Los clones de cADN correspondientes al gen phacA se aislaron mediante selección diferencial de una genoteca de cADN, siguiendo los pasos que se describen a continuación:
a) Obtención de una población de cADN correspondiente a transcritos de genes que se expresan preferentemente al cultivar el hongo en presencia de fenilacetato (para su uso como sonda "más" en el rastreo de la genoteca) .
La cepa de A . nidulans A26 de la colección Fungal Genetics Stock Center (Departamento de Microbiología, Centro Médico de la Universidad de Kansas) se cultivó a 37° C - li en medio mínimo adecuadamente suplementado que contenía (en g/1) KP0,H2, (13,6), (NH4)2S04/ 2,0; MgSO„ x 7H20, 0,25 y Fe x 7H,0, 0,0005, con glucosa al 0,3 % (p/v) como fuente de carbono. El momento en que se consumió la glucosa se determinó analizando la concentración de glucosa en el medio de cultivo (utilizando un "kit" enzimático) . Esto ocurrió generalmente a las 18 horas de incubación con agitación constante. Dos horas después se añadió fenilacetato al cultivo, hasta una concentración final de 10 mM y el cultivo se agitó a 37°C durante 1 hora más con el fin de inducir la expresión de los genes mencionados. Después de este tiempo, se recogió el micelio por filtración, se lavó con agua, se congeló en nitrógeno líquido, se liofilizó y se usó para aislar ARN total. Esta preparación de ARN total se usó para aislar mARN poli (A*) mediante cromatografía de afinidad en oligo-dT celulosa. Se preparó cADN monocatenario en presencia de transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (de origen comercial) , utilizando como molde 2 μg de dicho mARN aislado de micelio inducido con fenilacetato y oligo-dT (15-mer) como iniciador. La reacción se incubó durante 1 hora a 42 °C en un tampón que contenía 10 mM Tris- HC1 pH 8,8 (a 25°C) , 50 M KC1 , 0,1 % Tritón X-100, 5 mM MgCl,, 10 mM de cada dNTP y 0,5 unidades de ARNsin. Tras la síntesis de la primera cadena, se eliminó el ARN molde mediante incubación durante 1 hora a 60°C con NaOH 3M. Después de la neutralización (con ácido acético) , el ADN monocatenario se recuperó por centrifugación mediante precipitación con 2,5 volúmenes de etanol absoluto durante 2 horas a -80°C. Este cADN se sustrajo con un exceso de 30 veces de ARN poli (A*) aislado del micelio recogido en el momento del agotamiento de la glucosa, siguiendo el procedimiento descrito por Sargent, T.D., Methods Enzymol . 152: 423-432, 1.987. Las moléculas híbridas cADN-ARN se separaron por cromatografía en hidroxiapatito a 68 °C y se desecharon. El cADN restante se híbrido como se ha mencionado, con un exceso de ARN poli (A*) procedente de micelio cultivado en ausencia de fenilacetato. De nuevo se desecharon las mo- léculas híbridas cADN-ARN como se ha indicado y se recogió la población de cADN monocatenario resultante, la cual representaba transcritos de genes expresados preferentemente en presencia de fenilacetato. Este cADN fue marcado uniformemente con [α~JP] dCTP y exceso de todos los demás dNTPs, en presencia del fragmento Klenow de la ADN polime- rasa y hexanucleótidos de secuencia aleatoria como "primers". La población obtenida de cADNs marcados con 32P (actividad específica > 10a cpm/mg) se usó como sonda para rastrear una genoteca de cADN construida como se describe en el apartado c) .
b) Obtención de una sonda de cADN correspondiente a genes transcritos en ausencia de fenilacetato (sonda "menos"). Se sintetizó cADN monocatenario y se marcó con P como se describe en el apartado a) , pero usando mARN procedente de micelio cultivado hasta el agotamiento de la glucosa del medio de cultivo e incubado durante 1 hora más a 37°C en ausencia de fenilacetato.
c) Construcción de una genoteca de cADN en el vector λgtlO, usando cADN obtenido de micelio cultivado en presencia de 10 mM de fenilacetato como única fuente de carbono.
Para construir esta genoteca se realizó la reacción de síntesis de la primera cadena de cADN tal y como se describe anteriormente. El híbrido cADN-ARN obtenido se convirtió en cADN de doble cadena introduciendo roturas aleatorias en la cadena de ARN con ARNasa H, las cuales se utilizaron como puntos iniciadores por la ADN polimerasa I de Escherichia coli . Para añadir extremos EcoRI a este preparado romo de cADN, se incubaron adaptadores sintéticos que contenían el extremo fosforilado romo y el saliente EcoRI con el cADN de doble cadena en presencia de T4 ADN ligasa. A continuación, se purificaron los cADNs de extremo EcoRI y se fosforilaron con T4 polinucleótido quinasa y ATP. El cADN fosforilado se mezcló con los brazos del vector λgtlO previamente digeridos con EcoRI y desfosforilados y la mezcla se incubó con T4 ADN ligasa. Las moléculas de ADN re- combinante se empaquetaron in vitro, utilizando extractos de empaquetamiento comerciales . Los fagos recombinantes en los que un inserto de cADN había inactivado el gen el (en el cual está presente el sitio EcoRI) se seleccionaron por su fenotipo lítico en una cepa de E . coli hfl (F-, thi -1 , thr-1 , leuBβ, lacYl , tonA21 , supE44 , hflA150 , [chr : :Tnl0] .
De esta forma se obtuvieron un total de 107 clones recombinantes .
d) Rastreo de la genoteca.
La genoteca de cADN se plaqueó utilizando la cepa E. coli C600 hfl" y las placas de lisis- obtenidas fueron trans- feridas por duplicado a filtros de nitrocelulosa. Una de las réplicas fue hibridada con la sonda cADN "más" (descrita en a) ) y la segunda réplica se híbrido con la sonda cADN "menos" (descrita en b) ) . Seguidamente se seleccionaron y purificaron los clones que hibridaron con la sonda "más" y no hibridaron con la sonda "menos" .
e) Identificación del cADN correspondiente al gen phacA .
Los insertos de cADN se escindieron del vector mediante digestión con la endonucleasa Notl , utilizando los sitios de corte Notl incluidos en el adaptador EcoRI . Los insertos de los clones seleccionados fueron subclonados en plásmido pBluescript SK(+) digerido con Notl y seguidamente fueron secuenciados por procedimientos estándar. Las secuencias de los insertos de cADΝ fueron traducidos en los seis posibles de marcos de lectura y se compararon usando el algoritmo BLAST con la traducción conceptual en los seis marcos de lectura de las bases de datos de secuencia de ADΝ de acceso público GenBank y EMBL o con las bases de datos de secuencia de proteína SwissProt y PIR. Una de las se- cuencias de los insertos de cADΝ generó un extenso marco de lectura abierto, no interrumpido por codones de terminación. La secuencia de aminoácidos deducida mostró una identidad significativa con secuencias de aminoácidos de las proteínas de la familia del citocromo P450, las cuales intervienen generalmente en reacciones de oxidación. Como se demostrará más adelante (véase el Ejemplo 3), el marco de lectura abierto codifica para una fenilacetato 2-hidro- xilasa. Este inserto de cADN se utilizó para obtener por hibridación nuevos clones de cADN correspondientes a este gen. Estos clones se secuenciaron por ambas cadenas y la secuencia de nucleótidos obtenida mostró un marco de lectura abierto completo de 1.554 pb de longitud (sin el codón de terminación de la traducción) que codifica para un polipéptido de 518 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) . La identidad de esta secuencia con miembros de la familia de las proteínas citocromo P450 estableció sin ambigüedad que esta proteína deducida representa un nuevo miembro de esta familia.
f) Clonación del gen phacA .
Una genoteca de ADN genómico de A . nidulans construida en el vector λEMBL4 se rastreó con una sonda de cADN marcada con JP correspondiente al transcrito casi completo. Se purificaron los clones positivos y sus insertos fueron caracterizados mediante digestión con enzimas de restricción e hibridación con la sonda anteriormente mencionada. De esta forma se mapeó la zona de hibridación de dos fragmentos contiguos BamHI de 2,4 y 1,9 kb de longitud. En la
Fig. 4 se muestra un mapa de restricción de la región genó- mica que contiene estos fragmentos. Dichos fragmentos BamHI se subclonaron en pBluescript SK(+) . El plásmido recombinante que contenía el fragmento BamHI de 2,4 kb se designó pBS-FG4A, mientras que el plásmido que portaba el fragmento BamHI de 1,9 kb se designó pBS-FG4B. EJEMPLO 2. CLONACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DEL GEN pahA DE P. chrysogenum, HOMOLOGO FUNCIONAL DEL GEN phacA DE A . nidulans .
a) Clonación y determinación de la secuencia de nucleó- tidos del gen pahA de P. chrysogenum .
Una genoteca genómica de P. chrysogenum isconsin 54-
1255, construida con fragmentos parciales Sau3A clonados en el sitio BamHI de λEMBL4 , fue rastreada con una sonda marcada radiactivamente (con 32P) consistente en un cADN de longitud casi completa del gen phacA . Alrededor de 12.000 clones fueron transferidos a filtros de celulosa por medio de técnicas estándar. Seguidamente se hibridaron durante 24 h a 37°C en un tampón que contenía 50 % de formamida, 5 x solución de Denhart, 5 x SSC, 0,1 % de SDS, 50 μg/ml de ADN monocatenario de esperma de arenque sonicado y 50 ng de la sonda marcada. El lavado final de los filtros hibridados se realizó en 0,2 x SSC, 0,1 % SDS a 37°C. Mediante este procedimiento se purificaron 10 clones y su ADN fue aisla- do. Seguidamente los insertos de dichos clones fueron caracterizados mediante digestión con enzimas de restricción e hibridación con la sonda antedicha. La región de hibridación se localizó en un fragmento Xhol de 2,55 kb, cuyo mapa de restricción se muestra en la Fig. 5. Este fragmento de ADN se subclonó en el plásmido pBluescript SK(+) dando lugar al plásmido denominado pALP520. La secuencia nucleo- tídica del fragmento Xhol que incluía el gen pahA (Fig. 5) se determinó por el método del didesoxinucleótido (Sanger, F., Nicklen, S. y Coulson, A.R. (1.977) Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467) .
b) Construcción de una genoteca de cADN de P . chrysogenum a partir de ARN purificado en condiciones de producción de penicilina. Caracterización del cADN correspondiente al gen pahA . El micelio procedente de cultivos en termentador de una cepa industrial de P. chrysogenum, cultivada en condiciones de producción de penicilina G, se recogió a las 100, 124 y 148 horas de incubación y se utilizó para obtener mARN poli(A+) con el "Poly (A) Quick mRNA Purification Kit" (Stratagene) . Este poli(A+) mARN se utilizó como molde para la construcción de una genoteca de cADN utilizando el "ZAP- cDNA Synthesis Kit" (Stratagene) según las recomendaciones del fabricante. El cADN de doble cadena se insertó entre los sitios de restricción EcoRI y Xhol del vector fágico λZAP, situando la región 5' de los transcritos al lado del sitio EcoRI . La genoteca fue empaquetada con extractos de empaquetamiento "Gigapack II Gold" (Stratagene) generando alrededor de 10' clones independientes. El rastreo de esta genoteca de cADN se realizó conforme a procedimientos estándar (Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1.989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York), utilizando como sonda un fragmento EcoRV de 1.174 pb interno al gen pahA (Figura 5) . De esta forma se aislaron doce clones recombinantes positivos, (denominados desde #1 hasta #12) y se eligió para su caracterización el clon con el inserto de mayor tamaño (aproximadamente 1.600 pb) . Seguidamente se determinó la secuencia de nucleótidos com- pleta de este clon, observando que incluía un marco abierto de lectura (ORF) de 1.548 pb, el cual codifica para un polipéptido de 516 aminoácidos con un peso molecular de 58.112 Da y una identidad del 84 % con la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen phacA de A . nidulans . Como ocurría con su gen homólogo de A . nidulans , la investigación de las bases de datos mostró una identidad considerable de la proteína PahA con miembros de la familia de proteínas P450. La proteína PahA contiene la secuencia
Gly-X-Gly-X-X-X-Cys-X-Gly (residuos 430-438, SEQ ID NO:4) que caracteriza este tipo de proteínas (véase la Descrip- - li ción Detallada de esta invención) . De estos resultados se concluye que el gen pahA de P . chrysogenum es el homólogo del gen phacA de A . nidulans .
EJEMPLO 3. INACTIVACIÓN DEL GEN phacA DE A . nidulans MEDIANTE GENÉTICA INVERSA.
El alelo silvestre del gen phacA de A . nidulans fue sustituido por un alelo mutado, en el cual se había supri- mido parte de su región codificante, presumiblemente esencial para su función (residuos 298 a 392 en SEQ ID NO:l), siendo sustituida por el gen a gr-ET . Por lo tanto, esta manipulación genética trunca el gen phacA en el codón 297 generando un alelo mutado nulo. Por otra parte, se purificó un fragmento Kpnl-EcoRI de
1,7 kb, a partir de pBS-FG4B (Figura 4) y se subclonó en pUC18 digerido con estas dos enzimas, originando el plásmido pUCB . Seguidamente, se purificó un fragmento Nael de
1,9 kb a partir de pBS-FG4A (Figura 4) y se clonó en pBluescript SK(+) digerido con Smal . Se seleccionó un plásmido en el que la cadena codificante del gen phacA incompleto (comenzando en el sitio Nael) se encontraba en la misma orientación que el gen que codifica para β-galacto- sidasa en el vector. Este plásmido fue denominado pBSA. Se purificó un fragmento de ADN de Xbal-HindIII a partir de pBSA y se insertó en pUCB digerido con Xbal-HindIII , originando el plásmido pUCA-B. Finalmente, se insertó un fragmento de ADN de 3,2 kb, que contenía el gen argB* de A . nidulans en el único sitio Xbal de pUCA-B, para dar pPhacA: :argB+ . Comenzando a partir del promotor lacZ de pUC18, pPhacA::argB incluye un fragmento de 0,94 kb de la región 5 ' del gen phacA, seguido secuencialmente por los primeros 297 codones de su secuencia genómica, el fragmento de 3,2 kb que contiene el gen argB, la secuencia genómica del gen phacA correspondiente a los codones 393-518 y 1,2 kb de la región 3 ' del gen phacA . Un fragmento lineal que contenga todas estas regiones puede purificarse a partir del plásmido mediante digestión EcoRI (Figura 6) . Asimismo, se puede construir por transformación una cepa de A . nidulans que incluya una mutación de disrupción- deleción en el gen phacA utilizando este fragmento lineal de
EcoRI y siguiendo la estrategia resumida en esquema descrito anteriormente. Para ello, se transformaron protoplastos de la cepa de A . nidulans biAl , methGl , argB2 , con 2 μg de dicho fragmento de ADN, utilizando el protocolo de Tilburn, J., Scazzocchio, C, Taylor, G.G., Zabicky-Zissman, J.H., Lockington, R.A. y Davies, R.W. (1.983) Gene 26: 205-211. Los transformantes se seleccionaron por prototrofía de arginina usando un medio selectivo apropiado y seguidamente se purificaron. Se aisló ADN del micelio correspondiente a una serie de transformantes, se digirió con PstI y se analizó por hibridación de Southern, utilizando sondas específicas de los genes phacA y argB . Varios transformantes mos- traron el patrón de hibridación esperado para el suceso de doble entrecruzamiento que se muestra en la Figura 1. Por ejemplo, usando como sonda el fragmento Ps tl de 0,9 kb del gen phacA (véase la Fig. 4) , se comprobó que la banda de hibridación individual Pstl de 0,9 kb de la cepa receptora había sido sustituida por una banda de 3,8 kb en los transformantes que presentaban el tipo de integración que se muestra en la Figura 1. Esta banda también híbrido con la sonda argB . Dos de estos transformantes se eligieron para su posterior caracterización y fueron designados AphacA #1 y AphacA #2. Estas cepas transformadas poseían capacidad para crecer en medios de cultivo con fenilalanina, 2-hidroxi- fenilacetato o 2 , 5-dihidroxifenilacetato como única fuente de carbono, pero por el contrario, no crecían en medios de cultivo con fenilacetato como única fuente de carbono. Esto respalda la conclusión de que la enzima citocromo P450 codificada por el gen phacA de A . nidulans (y por extensión la codificada por el gen pahA de P. chrysogenum) posee una actividad que hidroxila fenilacetato a 2 -hidroxifenilace- tato, catalizando esta actividad el primer paso de la vía de utilización de fenilacetato en A . nidulans (ver Estado de la
Técnica) . La cepa de A . nidulans AphacA #1, que era fenotí- picamente indistinguible de la cepa AphacA #2, se ha depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) , Universidad de Valencia, Edificio de Investigación, Campus de Burjasot, 46100, Valencia, con fecha 19 de Junio de 1996, como A . nidulans biAl veAl methGl argB2 phacA : : [pPhacA : : argB"] con el número de acceso CECT 20195. La obtención de transformantes de P. chrysogenum con el gen pahA inactivado es muy evidente para cualquier experto en el arte. Simplemente consistiría en aislar el gen pahA de P. chrysogenum por hibridación con el con el gen phacA de A . nidulans presente en el transformante CECT 20195 o alternativamente mediante hibridación con oligonucleótidos sintéticos basados en SEQ ID No : 1. Posteriormente y utilizando el plásmido pALfleo7 (depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) , Universidad de Valencia, Edificio de Investigación, Campus de Burjasot, 46100 Valencia, con fecha 20 de Febrero de 1997, como CECT 4849) se construiría el plásmido pALP696 tal y como se indica en la figura 7 de la presente patente .
EJEMPLO 4. ENSAYO DE LA INACTIVACIÓN DE LA FUNCIÓN DEL GEN phacA Y DEL INCREMENTO EN LA PRODUCCIÓN DE PENICILINA.
Para comprobar si eliminando la actividad fenilacetato 2 -hidroxilasa codificada por el gen phacA se conseguía una producción de penicilina mejorada, se realizaron experimentos para medir los niveles de penicilina producidos por la cepa AphacA en comparación con una cepa phacAX Ambas cepas fueron comparadas mediante fermentación en matraz en un medio mínimo que contenía 2,5 % (p/v) de lactosa como principal fuente de carbono y 2,5 % (p/v) de corn steep sólido, con diferentes cantidades de fenilacetato sódico (en p/v) según se indica. Los cultivos se inocularon en todos los casos con igual número de conidiosporas viables (2 x 10G/ml) y se incubaron a 37°C con agitación orbital (250 r.p.m.). Se tomaron muestras a diferentes tiempos, se filtraron a través de Miracloth y los sobrenadantes se utilizaron para medir por bioensayo la penicilina producida.
Para el bioensayo se mezcló 1 mi de un cultivo de Micrococus luteus crecido hasta una DO600 = 6 con 1 1 del medio Antibiotic N° 1 (Difco) a 50°C. Esta mezcla se vertió en placas Petri de 13,6 cm (65 ml/placa) . En pocilios de 8 itim de diámetro se dispusieron muestras de 100 μl correspondientes a los sobrenadantes de los cultivos (adecuadamente diluidas en tampón de fosfato sódico 10 mM, pH 6,8) . Las placas se incubaron durante 2 horas a 4°C y a continuación durante otras 22 h a 37°C. Posteriormente se midió el diámetro de los halos de inhibición del crecimiento bacteriano originados por la penicilina presente en las muestras y se estimó la cantidad de antibiótico comparando con una recta de calibración realizada con diferentes cantidades de penicilina G potásica.
La Figura 3 muestra que los niveles más altos de penicilina correspondientes a la cepa control phacA+ se obtuvieron a las 24 horas utilizando un 0,125 % de fenilacetato en el medio de producción. El nivel de producción alcanzado a este tiempo fue de 1,8 μg/ml penicilina. La disminución a la mitad de la concentración de fenilacetato redujo los niveles máximos de penicilina producidos por esta cepa a
1,1 μg/ml.
La Figura 3 también muestra que, en marcado contraste, los niveles más altos de penicilina en un cultivo de la cepa AphacA alcanzaron 5,6 μg/ml, es decir, niveles 3,1 veces más altos que los de su cepa parental. Además, como resultado de la inactivación del gen phacA, el incremento de producción de penicilina no se vio afectado por la reducción de la concentración inicial de fenilacetato al 0, 0625 %.
Se concluye que una mutación de disrupción-deleción del gen phacA que codifica una actividad fenilacetato 2- hidroxilasa, realizada por medio de técnicas de genética inversa como se esquematiza en la Figura 1, origina al menos dos ventajas en la producción de penicilina por A . nidulans : (i) los niveles de penicilina se elevan considerablemente y (ii) la producción de penicilina depende en menor grado del suministro externo de fenilacetato.
Descripción detallada de las figuras.
Figura 1 : Estrategia usada para generar una mutación de disrupción-deleción en el gen phacA de A . nidulans mediante recombinación homologa. Los supuestos entrecruzamientos se muestran con cruces grandes en negrita.
Figura 2 •. Estrategia usada para generar una mutación de disrupción-deleción en el gen pahA de P. chrysogenum mediante recombinación homologa. Los supuestos entrecruza- mientos se muestran con cruces grandes discontinuas.
Figura 3. Producción de penicilina de una cepa transformada phacA::argB de A . nidulans en comparación con una cepa de tipo silvestre (phacA* ) . Abcisas: tiempo en horas (h) ; Ordenadas: producción de penicilina (μg/ml). Línea continua: Concentración de fenilacetato de 0.125%; Línea discontinua : Concentración de fenilacetato de 0.0625%. Figura 4 : Mapa de restricción de la región genómica que incluye el gen phacA de A . nidulans , mostrando los fragmentos que fueron subclonados para generar pFG4A y pFG4B . En trazo oscuro los 3 intrones . Figura 5 : Mapa de restricción de la región genómica que incluye el gen pahA de P . chrysogenum, mostrando el fragmento Xhol de 2,55 kb que fue subclonado para generar pALP520. En trazo más oscuro los 3 intrones . Figura 6 : Mapa de restricción y características relevantes de la construcción de inactivación pPhacA: :argB+ . En trazo oscuro la región de secuenciación que incluye el gen phacA;
En trazo blanco las zonas flanqueantes anterior y posterior al gen phacA - En trazo rayado la región argB". Figura 7: Mapa de restricción y características relevantes de la construcción de inactivación pALP696. En trazo oscuro la región de secuenciación que incluye el gen pahA (1.745 pb) ; En trazo blanco las zonas flanqueantes anterior y posterior al gen pahA (4.143 pb) ; En trazo rayado la región de resistencia a bleomicina, gen bleR (2.048 pb) .
LISTADO DE SECUENCIAS
INFORMACIÓN GENERAL:
SOLICITANTE:
NOMBRE: ANTIBIÓTICOS, S.A.U. CALLE: Avda . de Burgos, 8 -A CIUDAD: Madrid ESTADO O PROVINCIA: Madrid PAÍS: España CÓDIGO POSTAL: 28036 TELEFONO: 91-3841200 FACSÍMIL: 91-3841220
TITULO: "PROCEDIMIENTO DE INACTIVACIÓN DE GENES QUE CODIFICAN PARA ENZIMAS DEL CATABOLISMO DEL FENILACETATO, PLASMIDOS QUE INTERVIENEN Y CEPAS TRANSFORMADAS CON LOS MISMOS".
NUMERO DE SECUENCIAS: 4
DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
DESTINATARIO: ANTIBIÓTICOS, S.A.U.
CALLE: Avda. de Burgos, 8 -A
CIUDAD: Madrid
ESTADO O PROVINCIA: Madrid
PAÍS: España
CÓDIGO POSTAL: 28036
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
TIPO DE MEDIO: DISCO 3.5" ORDENADOR : PC SISTEMA OPERATIVO: WINDOWS SOPORTE LÓGICO: WORD INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE: NOMBRE: ALBERTO DE ELZABURU NUMERO DE REGISTRO: 232/1 NUMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: PCT-42
INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES: TELEFONO: 91 7009400 FACSÍMIL: 91 3193810 TELEX O CORREO ELECTRÓNICO: elzaburu@elzaburu.es
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.: 1
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
LONGITUD: 1986 pares de bases
TIPO: nucléotidos
NUMERO DE HEBRAS: 2
CONFIGURACIÓN: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
HIPOTÉTICA: NO
ANTI -SENTIDO: NO
FUENTE DE ORIGEN : Aspergillus nidulans
FUENTE INMEDIATA : plás ido pPhacA : : argB*
POS ICIÓN EN EL GENOMA : desconocida
CARACTERÍSTICA :
NOMBRE/CLAVE : secuencia codif icante
SITUACIÓN : 82 . . 1810
OTRAS INFORMACIONES : gen phacA
DESCRI PCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 1
C CAGCCAGATA TAAAGGCCGT 21
CCTTAGACGA CTTGATCTTA CTCTGGTTTC TAAAAGTTCA CTGATTATCG CAAGGTATCC 81
ATG TCT CTT CAA ACÁ ATC GGG ATC GCC GCT GTC GCG GTG GTC TAT TTT 129 Met Ser Leu Gln Thr H e Gly H e Ala Ala Val Ala Val Val Tyr Phe 5 10 15 CTC ATC CGC TAC TTC AAC CGC ACÁ GAC ATC CCA AAG ATC AAG GGT CTC 177 Leu He Arg Tyr Phe Asn Arg Thr Asp He Pro Lys He Lys Gly Leu
20 25 30
CCT GAA GTT CCA GGC GTA CCG ATC TTT GGC AAC CTC ATC CAG CTC GGT 225 Pro Glu Val Pro Gly Val Pro He Phe Gly Asn Leu He Gln Leu Gly
35 40 45
GAC CAG CAC GCG ACC GTA GCG CAG AAA TGG GCG AAG AAA TTT GGA CCT 273 Asp Gln His Ala Thr Val Ala Gln Lys Trp Ala Lys Lys Phe Gly Pro
50 55 60
GTT TTC CAG GTT CGC ATG GGG AAT AAA GTGAGTTCAG TGTCTGCATT TGTAAC 326 Val Phe Gln Val Arg Met Gly Asn Lys 65 70
AGAC GACAATATTG CGAGAATAAT TCTGACCTAA CACAG CGC GTT GTC TTC GCA 380
Arg Val Val Phe Ala 75 AAC ACC TTC GAC TCT GTC CGT CAG CTA TGG ATC AAA GAT CAG TCC GCG 428 Asn Thr Phe Asp Ser Val Arg Gln Leu Trp He Lys Asp Gln Ser Ala
80 85 90
CTC ATC TCC CGG CCG ACC TTT CAC ACC TTC CAC AGT GTA GTT TCC AGC 476 Leu He Ser Arg Pro Thr Phe His Thr Phe His Ser Val Val Ser Ser 95 100 105 110
TCT CAG GGA TTC ACC ATC GGA ACG TCG CCG TGG GAC GAG TCG TGC AAG 524 Ser Gln Gly Phe Thr He Gly Thr Ser Pro Trp Asp Glu Ser Cys Lys
115 120 125
CGT CGT CGG AAG GCT GCA GCT ACÁ GCC TTG AAC CGC CCG GCT ACC CAG 572 Arg Arg Arg Lys Ala Ala Ala Thr Ala Leu Asn Arg Pro Ala Thr Gln
130 135 140
TCG TAT ATG CCT ATT ATC GAT CTT GAG TCG ATG TCG AGT ATC CGG GAA 620 Ser Tyr Met Pro He He Asp Leu Glu Ser Met Ser Ser He Arg Glu
145 150 155
TTG CTC AGG GAT AGC GCG AAT GGA ACÁ ATG GAT ATC AAC CCG ACÁ GCG 668 Leu Leu Arg Asp Ser Ala Asn Gly Thr Met Asp He Asn Pro Thr Ala
160 165 170
TAC TTC CAG CGG TTC GCG TTG AAC ACG AGC TTA ACÁ TTG AAC TAT GGA 716 Tyr Phe Gln Arg Phe Ala Leu Asn Thr Ser Leu Thr Leu Asn Tyr Gly 175 180 185 190 ATC CGA ATC GAG GGC AAT GTG AAC GAT GAG CTT TTG CGC GAA ATT GTC 764 He Arg He Glu Gly Asn Val Asn Asp Glu Leu Leu Arg Glu He Val
195 200 205
GAT GTC GAG CGC GGG GTG TCG AAC TTC CGG AGT ACC AGC AAC CAG TGG 812 Asp Val Glu Arg Gly Val Ser Asn Phe Arg Ser Thr Ser Asn Gln Trp
210 215 220
CAG GAC TAT ATC CCG CTC CTG AGA ATC TTC CCG AAG ATG AAC CGC GAG 860 Gln Asp Tyr He Pro Leu Leu Arg He Phe Pro Lys Met Asn Arg Glu
225 230 235
GCT GAG GAG TTC CGG GTG CGG AGA GAC AAG TAT CTT ACC TAT CTT TTG 908 Ala Glu Glu Phe Arg Val Arg Arg Asp Lys Tyr Leu Thr Tyr Leu Leu
240 245 250
GAT GTT CTC AAG GAT CGC ATT GCA AAG GGA ACC GAC AAG CCC TGT ATT 956 Asp Val Leu Lys Asp Arg He Ala Lys Gly Thr Asp Lys Pro Cys He 255 260 265 270
ACT GGA AAC ATC CTC AAA GAC CCT GAG GCT AAG CTC AAT GAT G GTATG 1004 Thr Gly Asn He Leu Lys Asp Pro Glu Ala Lys Leu Asn Asp
275 280
CCGTC CGGTCCTGTC CGCGCTTGAA GGAAAATAAA GATTAACAGA GTCTAG CC GAG 1060
Ala Glu 285 ATT AAA TCG ATC TGC TTG ACC ATG GTC TCC GCC GGC CTC GAT ACT GTT 1108 He Lys Ser He Cys Leu Thr Met Val Ser Ala Gly Leu Asp Thr Val
290 295 300
CCG GGC AAC TTG ATC ATG GGC ATC GCG TAC CTC GCC TCC GAA GAC GGC 1156 Pro Gly Asn Leu He Met Gly He Ala Tyr Leu Ala Ser Glu Asp Gly
305 310 315
CAA AGG ATC CAG AAG CGC GCC CAC GAC GAG ATC ATG AAA GTC TAC CCG 1204 Gln Arg He Gln Lys Arg Ala His Asp Glu He Met Lys Val Tyr Pro
320 325 330
GAC GGC GAT GCA TGG GAG AAA TGC CTG CTC GAA GAG AAA GTC CCC TAC 1252 Asp Gly Asp Ala Trp Glu Lys Cys Leu Leu Glu Glu Lys Val Pro Tyr 335 340 345 350
GTC ACÁ GCT TTG GTC AAA GAA ACC CTC CGC TTC TGG ACT GTC ATT CCC 1300 Val Thr Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Arg Phe Trp Thr Val He Pro 355 360 365 ATC TGT CTG CCT AGA GAA AAC ACC AAG GAT ATT GTC TGG AAC GGA GCC 1348 He Cys Leu Pro Arg Glu Asn Thr Lys Asp He Val Trp Asn Gly Ala
370 375 380
GTT ATC CCT AAG GGA ACG ACC TTT TTC ATG AAC GCC TAC GCT GCA GAC 1396 Val He Pro Lys Gly Thr Thr Phe Phe Met Asn Ala Tyr Ala Ala Asp
385 390 395
TAC GAC GAA ACÁ CAC TTC ACC AAT CCA CAC GCC TTT GAA CCA GAA CGC 1444 Tyr Asp Glu Thr His Phe Thr Asn Pro His Ala Phe Glu Pro Glu Arg
400 405 410
TAC CTC ACC GCC TCA TCT GAC GGC TCC GGC ACT CCA CAC TAC GGC TAC 1492 Tyr Leu Thr Ala Ser Ser Asp Gly Ser Gly Thr Pro His Tyr Gly Tyr 415 420 425 430
GGC GCG GGC TCG CGC ATG GTACCTCCCC CACAACCCAC ATGTTATATA GACAAT 1546 Gly Ala Gly Ser Arg Met
435 ACTG ATTTATTATG AAG TGC GCT GGC TCG CAT CTT GCG AAC CGC GAG CTC 1596
Cys Ala Gly Ser His Leu Ala Asn Arg Glu Leu 440 445
TTC ACC GCT TAC GTC CGT - CTG ATC ACÁ GCA TTT ACC ATG CAT CCA GCT 1644 Phe Thr Ala Tyr Val Arg Leu He Thr Ala Phe Thr Met His Pro Ala
450 455 460
AAG AGG GCT GAG GAT CGG CCG ATC CTC GAT GCG ATT GAG TGT AAT GCG 1692 Lys Arg Ala Glu Asp Arg Pro He Leu Asp Ala He Glu Cys Asn Ala
465 470 475
ATC CCG ACC GCT TTG ACG ACG GAG CCG AAG CCC TTC AAG GTT GGG TTT 1740 He Pro Thr Ala Leu Thr Thr Glu Pro Lys Pro Phe Lys Val Gly Phe 480 485 490 495
AAA CCG AGA GAT CCT GTC TTG GTA AGG AAA TGG ATT GCG GAG AGT GAG 1788 Lys Pro Arg Asp Pro Val Leu Val Arg Lys Trp He Ala Glu Ser Glu
500 505 510
GAG AGG ACG AAG CAC CTG AAT TAGTTTTTCT TTTCTTTCTT GCGTGCAAGT TAC 1842 Glu Arg Thr Lys His Leu Asn
515 AGCGCAATTT ATACTTAGCT GGGACATGGT CGATTGGAGT ATACTGATTT CAGCAACAGC 1902 GCAAATAAAA ATAAGGCAAC CAATAGAAAT GCAACAATAT GCAATCTCCC AAGACCATTA 1962 AATGGTTGAT CAGATGATCC CAAG 1986 INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.: 2
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
LONGITUD: 518 aminoácidos
TIPO: aminoácidos
NUMERO DE HEBRAS: 1
CONFIGURACIÓN: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
FUENTE DE ORIGEN: Aspergillus nidulans
CARACTERÍSTICA:
OTRAS INFORMACIONES : secuencia de aminoácidos del enzima fenilacetato 2 hidroxilasa CARACTERÍSTICA: OTRAS INFORMACIONES: Peso molecular 58495 Da.
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO : 2
Met Ser Leu Gln Thr He Gly He Ala Ala Val Ala Val Val Tyr
5 10 15
Phe Leu He Arg Tyr Phe Asn Arg Thr Asp He Pro Lys He Lys
20 25 30
Gly Leu Pro Glu Val Pro Gly Val Pro He Phe Gly Asn Leu He
35 40 45
Gln Leu Gly Asp Gln His Ala Thr Val Ala Gln Lys Trp Ala Lys
50 55 60
Lys Phe Gly Pro Val Phe Gln Val Arg Met Gly Asn Lys Arg Val
65 70 75
Val Phe Ala Asn Thr Phe Asp Ser Val Arg Gln Leu Trp He Lys
80 85 90
Asp Gln Ser Ala Leu He Ser Arg Pro Thr Phe His Thr Phe His
95 100 105
Ser Val Val Ser Ser Ser Gln Gly Phe Thr He Gly Thr Ser Pro
110 115 120
Trp Asp Glu Ser Cys Lys Arg Arg Arg Lys Ala Ala Ala Thr Ala
125 130 135
Leu Asn Arg Pro Ala Thr Gln Ser Tyr Met Pro He He Asp Leu
140 145 150
Glu Ser Met Ser Ser He Arg Glu Leu Leu Arg Asp Ser Ala Asn
155 160 165
Gly Thr Met Asp He Asn Pro Thr Ala Tyr Phe Gln Arg Phe Ala
170 175 180
Leu Asn Thr Ser Leu Thr Leu Asn Tyr Gly He Arg He Glu Gly
185 190 195
Asn Val Asn Asp Glu Leu Leu Arg Glu He Val Asp Val Glu Arg
200 205 210 Gly Val Ser Asn Phe Arg Ser Thr Ser Asn Gln Trp Gln Asp Tyr
215 220 225
He Pro Leu Leu Arg He Phe Pro Lys Met Asn Arg Glu Ala Glu
230 235 240
Glu Phe Arg Val Arg Arg Asp Lys Tyr Leu Thr Tyr Leu Leu Asp
245 250 255
Val Leu Lys Asp Arg He Ala Lys Gly Thr Asp Lys Pro Cys He
260 265 270
Thr Gly Asn He Leu Lys Asp Pro Glu Ala Lys Leu Asn Asp Ala
275 280 285
Glu He Lys Ser He Cys Leu Thr Met Val Ser Ala Gly Leu Asp
290 295 300
Thr Val Pro Gly Asn Leu He Met Gly He Ala Tyr Leu Ala Ser
305 310 315
Glu Asp Gly Gln Arg He Gln Lys Arg Ala His Asp Glu He Met
320 325 330
Lys Val Tyr Pro Asp Gly Asp Ala Trp Glu Lys Cys Leu Leu Glu
335 340 345
Glu Lys Val Pro Tyr Val Thr Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Arg
350 355 360
Phe Trp Thr Val He Pro He Cys Leu Pro Arg Glu Asn Thr Lys
365 370 375
Asp He Val Trp Asn Gly Ala Val He Pro Lys Gly Thr Thr Phe
380 385 390
Phe Met Asn Ala Tyr Ala Ala Asp Tyr Asp Glu Thr His Phe Thr
395 400 405
Asn Pro His Ala Phe Glu Pro Glu Arg Tyr Leu Thr Ala Ser Ser
410 415 420
Asp -Gly Ser Gly Thr Pro His Tyr Gly Tyr Gly Ala Gly Ser Arg
425 430 435
Met Cys Ala Gly Ser His Leu Ala Asn Arg Glu Leu Phe Thr Ala
440 445 450
Tyr Val Arg Leu He Thr Ala Phe Thr Met His Pro Ala Lys Arg
455 460 465
Ala Glu Asp Arg Pro He Leu Asp Ala He Glu Cys Asn Ala He
470 475 480
Pro Thr Ala Leu Thr Thr Glu Pro Lys Pro Phe Lys Val Gly Phe
485 490 495
Lys Pro Arg Asp Pro Val Leu Val Arg Lys Trp He Ala Glu Ser
500 505 510
Glu Glu Arg Thr Lys His Leu Asn
515
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO . : 3
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
LONGITUD: 2558 pares de bases
TIPO: nucléotidos
NUMERO DE HEBRAS: 2
CONFIGURACIÓN: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico HIPOTÉTICA: NO
ANTI -SENTIDO: NO
FUENTE DE ORIGEN: Penicillium chrysogenum
FUENTE INMEDIATA: plásmido pALP520
POSICIÓN EN EL GENOMA: desconocida
CARACTERÍSTICA:
NOMBRE/CLAVE: secuencia codificante
SITUACIÓN: 371..2094
CARACTERÍSTICA:
OTRAS INFORMACIONES: gen pahA
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO : 3
CTCGAGAAGG TCTGTTGACA CGAGTCCACA AGATGTTGCG AAGTATATAA TATGAGAAAT 60 GGATATACAG CGGAAAATTG AAGTTTCATT CCGCGGGGGC GGGGAACAAG AGGAAGCGCG 120 GAATGAACAT TCCGTCTATG CGCGGTGGAG AGATCTTCGA ACTGGGGACT TGTGGACTTG 180 GACCTATGAG AGAGCTGCCT TTACTGATTC TGGGACTTGT GGCCAATGAA ACATGTCATG 240 GATGTTACAG CTTTCTTTAT GCGACTCTCT AAACTCGGAA ATATGCCGTA GCCGAAATGC 300 AGGAAAGGCT GGGCTATAAG AGATGCATGC TCCCACCGAA CGTCTGCAAT TCCTTGTTTC 360 ACTCTATATC ATG GCC ATC CAA ACÁ CTC GCA GTC GCC GTG ATC ACG GTG GTC 412 Met Ala He Gln Thr Leu Ala Val Ala Val He Thr Val Val 5 10
TAT TTC GTC ATT CGA TAC TTC AAC CGC ACT GAT ATC CCT AAG ATT AAA 460 Tyr Phe Val He Arg Tyr Phe Asn Arg Thr Asp He Pro Lys He Lys 15 20 25 30
GGC CTC CCG GAG ATT CCT GGT ATA CCC ATA TTT GGC AAT CTA TTG CAG 508 Gly Leu Pro Glu He Pro Gly He Pro He Phe Gly Asn Leu Leu Gln
35 40 45
CTA GGA GAT CAA CAT GCC AC GTC ACG GGG AAA TGG GCA AAG AAA TTT 556 Leu Gly Asp Gln His Ala Thr Val Thr Gly Lys Trp Ala Lys Lys Phe
50 55 60
GGC CCA GTT TTC CAA GTG CGC ATG GGA AAC AAG GTAAGTAATC AAATAATCTT 609 Gly Pro Val Phe Gln Val Arg Met Gly Asn Lys 65 70 TTAAATCGGA CATTCTGATA ATCTAATGCC CTTTTAG CGC ATC GTG TTC GCC AAC 664
Arg He Val Phe Ala Asn 75 GGC TTT GAC TCC GTT CGT CAA TTG TGG ATT AAG GAC TCG TCG GCT CTG 712 Gly Phe Asp Ser Val Arg Gln Leu Trp He Lys Asp Ser Ser Ala Leu 80 85 90 95
ATC TCC CGC CCA ACT TTC CAC ACT TTC CAC AGC GTC GTC TCC AGT TCA 760 He Ser Arg Pro Thr Phe His Thr Phe His Ser Val Val Ser Ser Ser
100 105 110
CAG GGC TTC ACG ATC GGA ACT TCC CCG TGG GAT GAT TCC TGT AAG AAA 808 Gln Gly Phe Thr He Gly Thr Ser Pro Trp Asp Asp Ser Cys Lys Lys
115 120 125
CGT CGC AAG GCA GCT GCC ACT GCG CTG AAT CGA CCG GCC GTG CAA TCG 856 Arg Arg Lys Ala Ala Ala Thr Ala Leu Asn Arg Pro Ala Val Gln Ser
130 135 140
TAT ATG CCC ATC ATC GAT CTT GAA TCC AAT TCC AGC ATC AAA GAA CTG 904 Tyr Met Pro He He Asp Leu Glu Ser Asn Ser Ser He Lys Glu Leu
145 150 155
TAC CGG GAC AGC CAA AAT GGC AAA CGT GAT GTG AAT CCC ACT GCA TAC 952 Tyr Arg Asp Ser Gln Asn Gly Lys Arg Asp Val Asn Pro Thr Ala Tyr 160 165 170 175
TTC CAG CGA TAC GCT TTC AAC ACC AGT TTG ACT TTG AAC TAT GGA TTC 1000 Phe Gln Arg Tyr Ala Phe Asn Thr Ser Leu Thr Leu Asn Tyr Gly Phe
180 185 190
CGC ATC GAG GGC AAT GTG GAT GAT ACG CTG CTG CAT GAG ATT GTG GAT 1048 Arg He Glu Gly Asn Val Asp Asp Thr Leu Leu His Glu He Val Asp
195 200 205
GTG GAG CGT GGT GTG TCC AAC TTC CGC AGC ACT TCG AAC AAC TGG CAG 1096 Val Glu Arg Gly Val Ser Asn Phe Arg Ser Thr Ser Asn Asn Trp Gln
210 215 220
GAC TAC ATT CCC CTA TTG CGC ATT TTC CCC AAG ATG AAC AAT GAG GCC 1144 Asp Tyr He Pro Leu Leu Arg He Phe Pro Lys Met Asn Asn Glu Ala
225 230 235
GCT GAC TTC CGG GGT CGC CGT GAT AAA TAT CTG ACC TAC TTG CTC GAT 1192 Ala Asp Phe Arg Gly Arg Arg Asp Lys Tyr Leu Thr Tyr Leu Leu Asp 240 245 250 255 ATG CTC AAG GAT CGA ATC GCC AAG GGA ACC GAT AAG CCT TGC ATC ACT 1240 Met Leu Lys Asp Arg He Ala Lys Gly Thr Asp Lys Pro Cys He Thr
260 265 270
GGT AAT ATC TTG AAG GAT CCC GAG GCT AAG CTG AAT GAT G GTGAGTTACA 1290 Gly Asn He Leu Lys Asp Pro Glu Ala Lys Leu Asn Asp
275 280
AAATCTCGCG AAATCTTTGT GAATGTTGGT ATTGAGTACT CATCTATCGT CTAG CC 1346
Ala 285 GAG GTG AAA TCG ATC TGT TTG ACT ATG GTG TCG GCT GGC CTT GAC ACC 1394 Glu Val Lys Ser He Cys Leu Thr Met Val Ser Ala Gly Leu Asp Thr
290 295 300
GTT CCG GGC AAC TTG ATT ATG GGA ATT GCC TAC CTG GCA TCT GAA GAC 1442 Val Pro Gly Asn Leu He Met Gly He Ala Tyr Leu Ala Ser Glu Asp
305 310 315
GGC CAA AGA ATT CAG AAA AAG GCC TAT GAT GCA ATC ATG GAG GTA TAC 1490 Gly Gln Arg He Gln Lys Lys Ala Tyr Asp Ala He Met Glu Val Tyr
320 325 330
CCG GAC GGC GAT GCT TGG GAG AAA TGT TTG GTG GAG GAG AAG GTC CCT 1538 Pro Asp Gly Asp Ala Trp Glu Lys Cys Leu Val Glu Glu Lys Val Pro
335 340 345
TAT GTG ACG GCA CTG GTC AAG GAG GTC TTG CGC TTC TGG ACG GTC ATT 1586 Tyr Val Thr Ala Leu Val Lys Glu Val Leu Arg Phe Trp Thr Val He 350 355 360 365
CCT ATT TGT CTG CCA CGC GAG AGC ACC AAG GAT ATC CAG TGG AAT GGA 1634 Pro He Cys Leu Pro Arg Glu Ser Thr Lys Asp He Gln Trp Asn Gly
370 375 380
GCT ACÁ ATC CCT GCC GGG ACG ACC TTT TTC ATG GTATGTTGCG CCTTGCTTCT 1687 Ala Thr He Pro Ala Gly Thr Thr Phe Phe Met
385 390
GTCCCTTTCG GGACGTTGCT AACAGGATCT GATAG AAT GTT TGG GCT GCC GAT 1740
Asn Val Trp Ala Ala Asp 395 TAC GAT GAA GAT CAC TTT AAG GAT GCC GAT AAA TTC ATC CCG GAG CGT 1788 Tyr Asp Glu Asp His Phe Lys Asp Ala Asp Lys Phe He Pro Glu Arg 400 405 410 TAT TTG GAG GCC AGT GAG GGT GCA GGC ACT CCA CAC TAT GCA TAT GGA 1836
Tyr Leu Glu Ala Ser Glu Gly Ala Gly Thr Pro His Tyr Ala Tyr Gly
415 420 425 430
GCG GGA TCA CGT ATG TGT GCA GGC TCA CAT CTC GCC AAT CGC GAG CTG 1884
Ala Gly Ser Arg Met Cys Ala Gly Ser His Leu Ala Asn Arg Glu Leu
435 440 445
TTC ACT GCT TTT ATC CGC CTC GTC ACT GCT TTC AAC ATG CAC ACG GCG 1932 Phe Thr Ala Phe He Arg Leu Val Thr Ala Phe Asn Met His Thr Ala
450 455 460
AAG GAG ACG GCC GAC CGA CCG ATT CTG AAT GCA ATT GAG TGC AAT TTG 1980 Lys Glu Thr Ala Asp Arg Pro He Leu Asn Ala He Glu Cys Asn Leu
465 470 475
ATT CCG ACÁ GCC TTG ACÁ ACC GAG CCG AAG CCA TTC AAG GTT GGC TTT 2028 He Pro Thr Ala Leu Thr Thr Glu Pro Lys Pro Phe Lys Val Gly Phe"
480 485 490
AGT GCA CGC GAC CCT AAG AAG CTT GAG CAG TGG ATT GCT GAG AGC GAT 2076 Ser Ala Arg Asp Pro Lys Lys Leu Glu Gln Trp He Ala Glu Ser Asp 495 500 505 510
GAA CGG ACC AAA GAT CTA TAAGAGGAAG TTTTATCTGA TATGATTCCC TTTTTTTTTT Glu Arg Thr Lys Asp Leu
515 TCGGAGGCTA TTTATGTATC TACTTGAATA TATGTGAAAT AAAGGCAATG AAGTATAGAT 2194 ATAGACCTGC CCAGGTGAGA CCTACATGTA TGTAATCGAC GTCTCCCAGT ACCTATTTAG 2254 GAACCGAATA GAAATTTGAG TGATGAAGGG TGAAGAATAA CCTCAGAGAA CATAGGTCTA 2314 CTAAGATCTG CTAATTCTTA GACTCCTTTC CCTGAATTAT TGCCAATTTC CCCAGTTGTC 2374 TCTCTCCTCT ATGACTCCCG GCCTTGTCAC ACCGGCGGAA TCTCCCCGCA TTTTCCTCGA 2434 CCTCACCCTT TTCTTCCTCT TCACCCTCTC CCCATCCACT TGAAATGAAC CTCTGATCGC 2494 AATCAATTGC ATCCCGAAGT CATTTTGGAT GATGAATAAT CCGCAGATGT ACCCTGTCCT 2554 CGAG 2558
INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO . : 4
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 516 pares de bases TIPO: aminoácidos NUMERO DE HEBRAS: 1
CONFIGURACIÓN: lineal
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
CARACTERÍSTICA:
OTRAS INFORMACIONES : secuencia de aminoácidos del enzima fenilacetato 2 hidroxilasa CARACTERÍSTICA: OTRAS INFORMACIONES: peso molecular 58112 Da.
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO : 4
Met Ala He Gln Thr Leu Ala Val Ala Val He Thr Val Val Tyr Phe
1 5 10 15
Val He Arg Tyr Phe Asn Arg Thr Asp He Pro Lys He Lys Gly Leu
20 25 30
Pro Glu He Pro Gly He Pro He Phe Gly Asn Leu Leu Gln Leu Gly
35 40 45
Asp Gln His Ala Thr Val Thr Gly Lys Trp Ala Lys Lys Phe Gly Pro
50 55 60
Val Phe Gln Val Arg Met Gly Asn Lys Arg He Val Phe Ala Asn Gly 65 70 75 80
Phe Asp Ser Val Arg Gln Leu Trp He Lys Asp Ser Ser Ala Leu He
85 90 95
Ser Arg Pro Thr Phe His Thr Phe His Ser Val Val Ser Ser Ser Gln
100 105 110
Gly Phe Thr He Gly Thr Ser Pro Trp Asp Asp Ser Cys Lys Lys Arg
115 120 125
Arg Lys Ala Ala Ala Thr Ala Leu Asn Arg Pro Ala Val Gln Ser Tyr
130 135 140
Met Pro He He Asp Leu Glu Ser Asn Ser Ser He Lys Glu Leu Tyr 145 150 155 160
Arg Asp Ser Gln Asn Gly Lys Arg Asp Val Asn Pro Thr Ala Tyr Phe
165 170 175
Gln Arg Tyr Ala Phe Asn Thr Ser Leu Thr Leu Asn Tyr Gly Phe Arg 180 185 190 He Glu Gly Asn Val Asp Asp Thr Leu Leu Hxs Glu He Val Asp Val
195 200 205
Glu Arg Gly Val Ser Asn Phe Arg Ser Thr Ser Asn Asn Trp Gln Asp
210 215 220
Tyr He Pro Leu Leu Arg He Phe Pro Lys Met Asn Asn Glu Ala Ala 225 230 235 240
Asp Phe Arg Gly Arg Arg Asp Lys Tyr Leu Thr Tyr Leu Leu Asp Met
245 250 255
Leu Lys Asp Arg He Ala Lys Gly Thr Asp Lys Pro Cys He Thr Gly
260 265 270
Asn He Leu Lys Asp Pro Glu Ala Lys Leu Asn Asp Ala Glu Val Lys
275 280 285
Ser He Cys Leu Thr Met Val Ser Ala Gly Leu Asp Thr Val Pro Gly
290 295 300
Asn Leu He Met Gly He Ala Tyr Leu Ala Ser Glu Asp Gly Gln Arg 305 310 315 320
He Gln Lys Lys Ala Tyr Asp Ala He Met Glu Val Tyr Pro Asp Gly
325 330 335
Asp Ala Trp Glu Lys Cys Leu Val Glu Glu Lys Val Pro Tyr Val Thr
340 345 350
Ala Leu Val Lys Glu Val Leu Arg Phe Trp Thr Val He Pro He Cys
355 360 365
Leu Pro Arg Glu Ser Thr Lys Asp He Gln Trp Asn Gly Ala Thr He
370 375 380
Pro Ala Gly Thr Thr Phe Phe Met Asn Val Trp Ala Ala Asp Tyr Asp 385 390 395 400
Glu Asp His Phe Lys Asp Ala Asp Lys Phe He Pro Glu Arg Tyr Leu
405 410 415
Glu Ala Ser Glu Gly Ala Gly Thr Pro His Tyr Ala Tyr Gly Ala Gly
420 425 430
Ser Arg Met Cys Ala Gly Ser His Leu Ala Asn Arg Glu Leu Phe Thr
435 440 445
Ala Phe He Arg Leu Val Thr Ala Phe Asn Met His Thr Ala Lys Glu
450 455 460
Thr Ala Asp Arg Pro He Leu Asn Ala He Glu Cys Asn Leu He Pro 465 470 475 480 Thr Ala Leu Thr Thr Glu Pro Lys Pro Phe Lys Val Gly Phe Ser Ala
485 490 495
Arg Asp Pro Lys Lys Leu Glu Gln Trp He Ala Glu Ser Asp Glu Arg
500 505 510
Thr Lys Asp Leu 515
Oficina Internacional
Figure imgf000037_0001
SOLICITUD INTERNACIONAL PUBLICADA EN VIRTUD DEL TRATADO DE COOPERACIÓN
EN MATERIA DE PATENTES (PCT)
(51) Clasificación Internacional de Patentes 6 (11) Número de publicación internacional: WO 98/48019 C12N 15/53, 9/06, 15/90 Al
(43) Fecha de publicación internacional: 29 de Octubre de 1998 (29.10.98)
(21) Solicitud internacional: PCT/ES98/00101 José Manuel [ES/ES]; Avenida de Burgos, 8-A, E-28036 Madrid (ES).
(22) Fecha de la presentación internacional:
17 de Abril de 1998 (17.04.98) (74) Mandatario: DE ELZABURU MÁRQUEZ, Alberto; Calle Miguel Ángel, 21 , E-28010 Madrid (ES).
(30) Datos relativos a la prioridad:
P 9700833 18 de Abril de 1997 ( 18.04.97) ES (81) Estados designados: AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, GM, GW, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR,
(71) Solicitante (para todos los Estados designados salvo US): KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN,
ANTIBIÓTICOS, S.A. [ES/ES]; Avenida de Burgos, 8- A, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, E-28036 Madrid (ES). SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW, Patente ARIPO (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW),
(72) Inventores; e Patente euroasiática (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ,
(75) Inventores/solicitantes (sólo US): FERNANDEZ CAÑÓN, TM), Patente europea (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, José Manuel [ES/ES]; Calle Velazquez, 146, E-28002 FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), Patente OAPI Madrid (ES). RODRÍGUEZ SAIZ, Marta [ES/ES]; Calle (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, Tui, 6, Io C, Pontevedra, E-36209 Vigo (ES). DIEZ TG). GARCÍA, Bruno [ES/ES]; Calle Generalisimo Franco, 7, Trabajo del Cerecedo, E-24192 León (ES). BARREDO FUENTE, José Luis [ES/ES]; Calle Moisés de León, 15 Publicada - 2°B, E-24006 León (ES). VITALLER ALBA, Alejandro Con informe de búsqueda internacional. [ES/ES]; Calle Carmen, 3, E-24001 León (ES). SALTO Con una indicación relativa a material biológico depositado, MALDONADO, Francisco [ES/ES]; Calle del Ábrego, presentada de conformidad con lo dispuesto en la Regla 33 - 2°C, Prado de Somosaguas, E-28023 Madrid (ES). I3bis, separadamente, y no con la descripción. PEÑALVA SOTO, Miguel Ángel [ES/ES]; Avenida de Burgos, 8-A, E-28036 Madrid (ES). MINGOT ASCENςAO,
(54) Title: PROCESS FOR THE INACTIVATION OF GENES WHICH CODE FOR ENZYMES FOR THE CATABOLISM OF PHENYL ACÉTATE, PLASMIDS INVOLVED IN SUCH PROCESS AND STRAINS TRANSFORMED THEREWITH
(54) Título: PROCEDIMIENTO DE INACTIVACIÓN DE GENES QUE CODIFICAN PARA ENZIMAS DEL CATABOLISMO DEL FENILACETATO, PLASMIDOS QUE INTERVIENEN Y CEPAS TRANSFORMADAS CON LOS MISMOS
(57) Abstract phacA
Figure imgf000037_0002
Procedimiento de inactivación de genes que codifican para enzimas del catabolismo de fenilacetato, plásmidos que los contienen y cepas transformadas con los mismos. El procedimiento se aplica preferentemente al gen phαcA de A. nidulαns y al gen pαhA de P. chrysogenum, genes que codifican respectivamente para enzimas competidoras por este sustrato con las enzimas biosintéticas de penicilina. La no expresión de estas enzimas favorece la síntesis de este antibiótico, incrementando su producción, con una demanda de fenilacetato menor por unidad de cultivo.
ÚNICAMENTE PARA INFORMACIÓN
Códigos utilizados para identificar a los Estados parte en el PCT en las páginas de portada de los folletos en los cuales se publican las solicitudes internacionales en el marco del PCT
AL Albania ES España LS Lesotho SI Eslovema
AM Armenia FI Finlandia LT Lituama SK Eslovaquia
AT Austria FR Francia LU Luxemburgo SN Senegal
AU Australia GA Gabán LV Letoma sz Swazilandia
AZ Azerbaiyán GB Reino Unido MC Monaco TD Chad
BA Bosnia y Herzegovina GE Georgia MD República de Moldova TG Togo
BB Barbados GH Ghana MG Madagascar TJ Tayikistán
BE Bélgica GN Guinea MK Ex República Yugoslava de TM Turkmenistán
BF Burkina Faso GR Grecia Macedo a TR Turquía
BG Bulgaπa HU Hungría ML Malí TT Trinidad y Tabago
BJ Ben IE Irlanda MN Mongoha UA Ucrania
BR Brasil IL Israel MR Mauritania UG Uganda
BY Belarus IS Islandia MW Malawi US Estados Unidos de Améπca
CA Canadá IT Italia MX México uz Uzbekistán
CF República Centroafπcana JP Japón NE Níger VN Viet Nam
CG Congo KE Kenya NL Países Bajos YU Yugoslavia
CU Suiza KG Kirguistán NO Noruega ZW Zimbabwe
CI Cote d'Ivoire KP República Popular NZ Nueva Zelandia
CM Camerún Democrática de Corea PL Polonia
CN China KR República de Corea PT Portugal
CU Cuba KZ Kazakstán RO Rumania cz República Checa LC Santa Lucía RU Federación de Rusia
DE Alemania LI Liechtenstein SD Sudán
DK Dinamarca LK Sπ Lanka SE Suecia
EE Estoma LR Libeπa SG Singapur REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de inactivación en microorganismos, de genes que codifican para enzimas del catabolismo del fenilacetato y que compiten por este compuesto con las enzimas biosintéticas de penicilina, que consiste en una transformación integrativa por recombinación homologa entre al menos un compuesto de ADN exógeno y al menos una parte de la secuencia del gen que se va a inactivar.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el compuesto de ADN transformante es una molécula cir- cular que contiene al menos un fragmento expresable del gen que se va a inactivar.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que el compuesto de ADN transformante es una molécula lineal que contiene al menos un fragmento de ADN no incluido en la secuencia del gen a inactivar, pero que contiene al menos un marcador de transformación que interrumpe la secuencia codificante del mismo.
4. Un procedimiento según las reivindicaciones anteriores, en el que la molécula de ADN transformante con- tiene, total o parcialmente, una copia de la secuencia del gen que se va a inactivar con una mutación, preferentemente, de cambio de marco de lectura, sin sentido o delección, que tenga como resultado un fenotipo de pérdida de función de dicho gen. 5. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el microorganismo objeto de transformación en el que se inactiva el gen es capaz de producir penicilina G o V.
6. Un procedimiento según la reivindicación 5, en el que el microorganismo productor de penicilina G o V, es un hongo . 7. Un procedimiento según las reivindicaciones 1 a 6, en el que el microorganismo transformado es Aspergillus nidulans .
8. Un procedimiento según las reivindicaciones 1 a 6, en el que el microorganismo transformado es Penicillium chrysogenum .
9. Un procedimiento según las reivindicaciones 1 a 7, en que el compuesto de ADN transformante utilizado es in- cluible, total o parcialmente, en un vector, preferentemen- te en el plásmido pPhacA: :argB .
10. Un procedimiento según las reivindicaciones 1 a 6 y 8, en que el compuesto de ADN transformante utilizado es incluible, total o parcialmente, en un vector, preferentemente en el plásmido pALP696. 11. Un procedimiento según las reivindicaciones 1 a 7 y 9, en que el gen que se inactiva está representado por SEQ ID NO : 1 , sus secuencias génicas mutadas y/o genes homólogos .
12. Un procedimiento según la reivindicación 11, en que el gen que se inactiva codifica para un polipéptido representado por SEQ ID NO : 2 , o secuencias similares que expresen actividad P450 fenilacetato 2 -hidroxilasa .
13. Un procedimiento según las reivindicaciones 1 a 6, 8 y 10, en que el gen que se inactiva está representado por SEQ ID NO : 3 , sus secuencias génicas imitadas y/o genes homólogos .
14. Un procedimiento según la reivindicación 13 , en que el gen que se inactiva codifica para un polipéptido representado por SEQ ID N0:4, o secuencias similares que ex- presen actividad P450 fenilacetato 2 -hidroxilasa .
15. Una cepa transformada de Aspergillus nidulans y imitantes derivados de la misma que incorpora al menos un compuesto de ADN exógeno que consiste en una secuencia truncada, incompleta o inactiva de al menos un gen que co- difica para una enzima del catabolismo de fenilacetato y que inactiva el gen endógeno tras su integración por recombinación homologa.
16. Una cepa transformada de A . nidulans según la reivindicación 15, en la que el gen a inactivar codifica para una enzima que media la hidroxilación de fenilacetato.
17. Una cepa transformada de A . nidulans según las reivindicaciones 15 y 16, en la que el gen que se inactiva es phacA, cuya secuencia y regiones flanqueantes se describen en SEQ ID NO:l, sus secuencias génicas imitadas y genes homólogos.
18. Una cepa transformada de A . nidulans según la reivindicación 17, en la que el gen que se inactiva es homólogo a phacA, de procedencia distinta de A . nidulans y cuya homología con la secuencia de ADN del gen phacA de A . nidulans es suficiente para mediar recombinación homologa con el locus endógeno de A . nidulans .
19. Una cepa transformada de A . nidulans según las reivindicaciones 15 a 18, en la que el gen que se inactiva codifica para un polipéptido representado por la secuencia proteica SEQ ID NO : 2 , o secuencias similares que expresen actividad P450 fenilacetato 2-hidroxilas .
20. Una cepa transformada según las reivindicaciones 15 a 19, caracterizada por consistir en una cepa pura de A . nidulans CECT20195, sus imitantes y/o derivados transfor- mados .
21. Un plásmido pPhacA::argB de inactivación del gen piícA de A . nidulans tal y como se muestra en el mapa de restricción de la Figura 6 y que consiste en el plásmido pUC18 que contiene un inserto EcoRI de 6,8 kb el cual in- cluye el gen phacA de A . nidulans inactivado mediante la inserción de un fragmento de 3,2 kb que a su vez contiene el gen argB de A . nidulans .
22. Una cepa transformada de Penicilliu chrysogenum y imitantes derivados de la misma que contiene un compuesto de ADN que consiste en una secuencia truncada, incompleta o inactiva de un gen que codifica para una enzima del catabolismo de fenilacetato y que inactiva el gen endógeno tras su integración por recombinación homologa. 23. Una cepa transformada de P . chrysogenum según la reivindicación 22, en la que el gen a inactivar codifica para un enzima que media la hidroxilación de fenilacetato.
24. Una cepa transformada de P . chrysogenum según las reivindicaciones 22 y 23, en la que el gen es phcA, cuya secuencia y la de sus regiones flanqueantes se describen en SEQ ID NO : 3 , sus secuencias génicas mutadas y/o genes homólogos .
25. Una cepa transformada de P. chrysogenum según las reivindicaciones 22 a 24, en la que el gen que se inactiva codifica para un polipéptido representado por la secuencia proteica SEQ ID N0:4, o secuencias similares que expresen actividad P450 fenilacetato 2-hidroxilasa definida.
26. Una cepa transformada de P. chrysogenum según la reivindicación 24, en la que el gen es phacA de A . nidulans o cualquier otro compuesto de ADN homólogo aislado de una fuente distinta de P. chrysogenum y cuya homología con la secuencia del ADN de pahA de P. chrysogenum es suficiente para mediar recombinación homologa con el locus endógeno de P. chrys ogenum . 27. Un plásmido pALP696 de inactivación el gen pahA de P. chrysogenum, tal como se muestra en el mapa de restricción de la Figura 7 y que consiste en el plásmido pBC KS+ que contiene un inserto Salí de 7,9 kb el cual incluye el gen pahA de P. chrysogenum inactivado mediante la inserción de un fragmento de 2,0 kb que a su vez contiene el gen .ble* de S . hindustanus expresado bajo el control del promotor gdh de P. chrysogenum .
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