WO1999040119A1 - Anticuerpo monoclonal que reconoce el oligosacarido acido sialico n-glicolilado-galactosa-glucosa en tumores malignos y composicion que lo contiene - Google Patents

Anticuerpo monoclonal que reconoce el oligosacarido acido sialico n-glicolilado-galactosa-glucosa en tumores malignos y composicion que lo contiene Download PDF

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Ana María VAZQUEZ LOPEZ
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to the branch of immunology and human medicine, in particular to the generation and selection of monoclonal antibody (AcM) against the oligosaccharide sequence Sialic acid N-glycolylated-Galactose-Glucose, which can be used for the diagnosis and treatment of certain neoplastic diseases.
  • AcM monoclonal antibody
  • the oligosaccharide structures can be found as part of glycoproteins and glycolipids, indistinctly present in normal and pathological tissues.
  • Aberrant glycosidation has been described for approximately 100% of malignant neoplasms. Frequent changes in aberrant glycosidation are: the expression of neo-antigens, variations in the composition of oligosaccharide sequences, increase or decrease of sialic acid molecules in oligocanands and increase in the density of molecules on the cell surface, among others (Hakomori SH et al. Curr. Opin. In Immunol. 1991, (3) 646-653.) In addition, of the changes in the mechanisms of sialyl transferases that can be found, there are also variations in sialic acid-dependent hydroxylases N-acetylated activated.
  • Gangliosides are glycosphingolipids that contain sialic acid in their structure and are characterized by being present in most vertebrate cells. These molecules are found in normal tissues and may have greater expression in tumors, with a different organization and conformation on the surface of malignant cells (Hakomori, SH., 1985, Cancer Res. 45, 2405-2414; Miraldi, F. , 1989, Seminars in Nuclear Medicine, XIX, 282-294).
  • the humoral immune response against carbohydrate antigens is generally of the IgM isotype.
  • the coupled oligosaccharide sequences to lipids they are usually less immunogenic than glycoproteins.
  • the use of glycolipids as immunogens therefore requires their coupling to carrier proteins or their incorporation into liposomes or bacterial strains such as Microbacterium tuberculosis or Salmonella minnesota strain R595.
  • the response generated against gangliosides is thymus-independent and this aspect has been reported by Livingston and collaborators repeatedly (Livingston, PO et al, 1982, Proc. Nati. Acad. Sci. 84, 2911-2915; Livingston, PO et al , 1989, Cancer Res. 49, 7045-7050).
  • the antibodies generated against gangliosides specifically, when they have been studied in the sera of the different species, have as fundamental characteristics low affinity, considerable cross-reactivity and short life (Livingston, PO, 1991, Immunology and Allergy Clinics of North America, 11, 401 -423; Portoukalian, J. et al, 1991, Int. J. Cancer, 49, 893-899).
  • N-glycolylated form in oligosaccharides is common in normal and pathological tissues of all vertebrate species, with the exception of chickens and humans, where they are only found in tumor and fetal tissues. Normal tissues of these last two species have only the N-acetylated variant (Nishimakit et al, 1979, J. Immunology, 122, 2314; Higashi H. et al, 1985, Cancer Res., 45, 3796).
  • the concentration of the N-glycolylated glycolipid variant was less than 0.05% of the total sialic acid, Marquina and collaborators found in the breast tumors values around 10% of the total bound sialic acid to lipid (Marquina, G. et al, 1996, Cancer Res. 56, 5165).
  • IgM isotype antibodies that generally recognize more than one ganglioside molecule, for example human monoclonal antibodies 2-39M and 32-27M (Furukawa K. , et al, 1988, J. Biological Chemistry, 263, 18507) and murine antibodies GMR8 and GMR3 (Ozawa H. et al, 1992, Biochem. Biophys., Vol. 294, 2, 427).
  • Watarai (Watarai, S. et al. 1995. J. Biochem. 117, 1062) generated the SHS-1 monoclonal antibody against the N-glycolylated i-active ganglioside and Nakumara obtained the YK-3 monoclonal antibody against the ( NGc-NGc) GD lc (Nakumara et al, 1995, J. of Biolog. Chemist, Vol 270, 8, 3876). Recently Vázquez et al. (Vázquez, AM et al, 1995, Hybridoma, Vol.
  • Monoclonal antibodies against gangliosides have also been obtained using these molecules in the form of lactones or from ganglioside-containing cell lines (US Patents 5,308,614; 5,240,833; 5,389,530 and 5,500,215).
  • IgMs generally have low affinity for the antigen and are difficult to use for diagnostic or therapy purposes, when it is intended to bind them with radioactive isotopes. Although they are good complement fixers and guarantee good cytotoxicity, the possibility of purification becomes quite cumbersome compared to IgG, when this is done on a large scale.
  • N-glycolylated expressed in 90% of breast tumors studied by immunohistochemistry (Devine, P.L., et al. 1991, Cancer Res. 51 (21), 5826-36).
  • JAM3 a monoclonal antibody designated as JAM3 has been published, which recognizes the N-acetylated and N-glycolylated forms of a 250 kD protein present on the surface of the cysts caused by the invasion of Entamoeba (Avron, B., et al. Mol Biochem Parasitol 1987 (3): 257-266).
  • the novelty of the present invention consists in obtaining a highly specific monoclonal antibody against the oligosaccharide sequence N-glycolylated-Galactose-Glucose sialic acid, present in both gangliosides and glycoproteins.
  • N-glycolylated-Galactose-Glucose sialic acid present in both gangliosides and glycoproteins.
  • the fact of being an IgG1 isotype immunoglobulin gives it the advantage that being more specific has more affinity for the molecules it recognizes, which favors its biological activity
  • this antibody showed the ability to cause cell death directly in the tumor cells that carry said oligosaccharide sequence.
  • ganglioside NGcGM3 a modification of the technique of Hakomori et al. Is used. (Hakomori, S. et al. 1974, Methods in Enzimology, Vol 32, Part B, p. 350), from natural sources known as for example horse erythrocytes.
  • the yield of ganglioside NGcGM3 extraction was between 180 and 300 mg per liter of horse erythrocytes, with a purity greater than 90% that could be corroborated using high-performance liquid chromatography, according to the method of Gazzotti (Gazzotti, G. et al 1985, J. of Chromatography, 348, 371-378). OBTAINING THE IMMUNOGEN.
  • the ganglioside NGcGM3 is hydrophobically coupled to very low density human lipoproteins (VLDL), which were obtained as described by Dumontet et al. (Dumontet, C. et al. 1994. Immunol Immunother Cancer. 38 : 311-318)
  • VLDL very low density human lipoproteins
  • mice or other mammalian species were immunized with vaccine preparations containing between 0.03 and 0.5 mg of the NGcGM3 ganglioside coupled to VLDL per dose and an adjuvant, among which alumina, complete and incomplete adjuvant of Freund or Montanide ISA 51 can be selected.
  • an adjuvant among which alumina, complete and incomplete adjuvant of Freund or Montanide ISA 51 can be selected.
  • Animals are immunized with several doses, between 2 and 8, at time intervals that can vary between 7 and 14 days. Administration is performed subcutaneously or intramuscularly with volumes between 0.1 and 0.2 ml. Other possible immunization routes to be used are intravenous and intraperitoneal. Animals that received this dose range show a specific response against the ganglioside with which they were immunized. As a result of this immunization, between 70 and 100% of the animals had a specific IgG response against the ganglioside NGcGM3.
  • Spleen cells should preferably be chosen although others may also be used.
  • hybridomas These cells fuse with myeloma cells and give hybrid cells or hybridomas the ability to expand infinitely "in vivo" and "in vitro.”
  • any of the known methods for cell fusion can be used.
  • an immunoenzymatic assay is preferably used, although other immunoassay methods can also be used.
  • the procedure of this assay is the recognition of hybridoma supernatants by gangliosides and the Antigen-Antibody binding can be visualized by using a second antibody labeled by an enzyme, which binds to the antibody produced by the hybridoma under appropriate conditions and is, in turn, detected.
  • the hybridoma once selected, is cloned at least 2 times (for example, by limiting dilution).
  • the AcM obtained can be produced "in vitro" in a suitable culture medium, any of those described in the state of the art and subsequently purified from the supernatant of said culture. In this case, between 1 and 8% of the secretory clones were specific against the ganglioside N-Glicolil GM3.
  • Another method of producing antibodies consists in the injection of the hybridoma in animals (for example, syngeneic animals).
  • the hybridoma causes the formation of non-solid tumors that provide a large concentration of the desired antibody, at the blood level and in the peritoneal exudate of the host animal.
  • the purification of the monoclonal antibodies is made from ascites fluid, which is obtained by inoculating 0.2 x 10 5 cells of the hybridoma producing the monoclonal antibodies, in the peritoneal cavity of Balb / C mice, previously treated with adjuvant Incomplete of Freund, as ascitgenic agent.
  • the ascites liquid is diluted in half in 1.5 M glycine buffer, 3M NaCl, pH, 8.9 and applied to an A-sepharose protein matrix, at a flow rate of 60 ml / h. Elution of the AcMs is performed using 0.14 M citrate buffer, pH 6.
  • the concentration of the purified AcMs is estimated by the Lowry Method (Lowry, G. H., 1951, J. Biol. Chem., 193, 256) and using the absorption coefficient of murine IgGl at 280 nm. The specificity is confirmed by the ELISA technique. Between 2 and 5 mg of antibodies per ml of ascites were obtained, with a percentage (%) of purity greater than 95%, which was corroborated by low pressure liquid chromatography.
  • the solvent system Chloroform: Methanol: 0.25% KC1 and 2.5 M NH 3 ) (5: 4: 1) (volrvol) is used to run the glycolipids in thin layer chromatography.
  • the visualization of the bands was carried out by chemical development with Orcinol.
  • the plates are plasticized with a solution of polyisobutyl methacrylate and dried at room temperature overnight.
  • the blockages last for about 30 minutes, with a 1% bovine serum albumin solution, dissolved in phosphate buffered saline (TFS), pH 7, 4.
  • TFS phosphate buffered saline
  • Direct cytoxicity was measured using different methods, which revealed values between 50 and 85% of dead cells, with respect to the total number of cells studied.
  • the generated mAbs can be used both for diagnosis and for therapy, by means of marking with some radioactive isotope, for example, Tc99, Re 186 and Re 188.
  • the method of labeling antibodies by isotopes has been previously described by Schwarzn and Steinstrasser (Schwarzn A., and Steinstrasser, A. 1987, J. Nuc ⁇ . Med. 28, 721) and modified by Mather and Ellison (Mather SJ and Ellison D, (1990, J. Nuc ⁇ . Med. 31, 692-697 )
  • the quality control of the marking is performed on Whatmann 3MM paper chromatography and the% of the marking was between 98 and 100%.
  • mice were inoculated with the P3X63 tumor and another 10 mice were used normal control, to which the tumor was not inoculated. Enough time was expected for the tumor to have grown, then the Tc99-labeled AcM 14F7 was injected intravenously into the 20 mice.
  • the monitoring of the biodistribution of the AcM obtained against the oligosaccharide sequence is done at 4 and 24 hours post-injection to groups of 5 animals (5 healthy and 5 with tumor), which are sacrificed taking from them the main organs and the tumor, those that are heavy and whose gamma emission is quantified separately at the end of the experiment.
  • Monoclonal antibodies were distributed in healthy animals preferably in blood, liver and kidney, while in animals that had a tumor, it was found in the anterior organs and preferably in the tumor at 24h.
  • the mAbs labeled with radioactive isotopes can be used to detect tumors where the oligosaccharide sequence is expressed
  • Radioactivity can be studied throughout the body with the gamma camera.
  • the images are acquired at 5 minutes, and 1, 3, 5, 24 and 48 hours after the injection, showing the location of the AcM only in the tumor and in the excretion organs.
  • AcMs can also be directly or indirectly coupled to therapeutic agents such as drugs, radioisotopes, immunomodulators, lectins and toxins.
  • therapeutic agents such as drugs, radioisotopes, immunomodulators, lectins and toxins.
  • biological response modifiers immunomodulators
  • lymphokines such as: Tumor Necrosis Factor, Macrophage Activating Factor, Colony Stimulating Factor, Interferons, etc.
  • Consecutive cuts made from the histologically evaluated blocks were used to perform the immunomarking by the streptavidin peroxidase biotin complex method described previously (Hsu, SM and Raine, L. 1981. J. Histochem Cytochem. 29; 1349-1353).
  • Dewaxed and rehydrated cuts were treated with 3% hydrogen peroxide (methanol solution) for 30 minutes, to eliminate endogenous peroxidase activity.
  • the cuts were incubated with the purified AcMs. Subsequently, biotinylated anti-mouse serum and streptavidin peroxidase complex (Dakopatts) are added at room temperature.
  • the sheets are washed with running water contrasted with Mayer's hematoxylin, coated with a mounting medium containing balm and covered with coverslips.
  • the reaction with the enzyme produces a brown-brown color.
  • Fragments of fresh biopsies of pathological tissue were obtained within the hour after the surgical excision, which were frozen and subsequently cut, kept frozen until they were studied.
  • the fetal tissue sections were obtained from fetuses between 12 and 18 weeks. Normal adult tissue fragments are obtained from deaths due to accidents and / or brain death within the hour after exitus letalis. Of the tumors studied, those of the lung and central nervous system with various etiologies were negative, as were the cuts of normal human tissues, while those of melanoma and breast were all positive, as well as the fetal tissues of the digestive system (liver , stomach, small and large intestine) and renal system.
  • mice that are inoculated with the tumor that has the white ganglioside are treated with the antibodies obtained.
  • Doses may vary from 0.01 mg / kg. of weight at 200 mg / kg. of weight in one or more administrations daily, for one or several days.
  • the generated mAbs can be administered parenterally by injection (intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intracavity or transdermal).
  • mice treated with antibodies have a survival rate between 30 and 80% compared to mice in the control group, which is corroborated with the Log Ram test (Cox and Oakes (1984) Analysis of survival Data edits.Chapman Hall), where significant differences were found between the group treated with the AcM and the control, less than 0.05%.
  • EXAMPLE 1 Specific IgG response against NGcGM3, from mice immunized with the vaccine preparation NGcGM3 / VLDL / Freund Complete Adjuvant, measured by an immunoenzymatic technique.
  • mice Female Balb / C mice between 6-8 weeks were injected intramuscularly with 0.2 mg of the human NGcGM3 / VLDL vaccine, with Freund's complete adjuvant in the first dose and Freund's incomplete the following (produced by the firm SIGMA) mixed in equal volume. Each animal received 6 doses, the first 4 weekly and 2 successive every 14 days. Blood extractions were performed prior to the first dose and every 2 weeks.
  • Antibody levels were measured in the animals' serum, using an indirect ELISA on Polysorp plates (from Nunc), where gangliosides were immobilized following the methodology described below:
  • NAcGM3 and NGcGM3 gangliosides were dissolved separately in methanol (4 ⁇ g / ml) and 50 ⁇ l / well was added. The plate was placed at 37 ° C for an hour and a half to evaporate the methanol. Subsequently, 100 ml / 0.05M TRIS-HC1 buffer well, pH 7.8, containing 2% bovine serum albumin (SAB) was added and incubated at room temperature for one hour. Then 50 ⁇ l of the sera were diluted in the same buffer and incubated overnight at room temperature.
  • SAB bovine serum albumin
  • SSTF phosphate buffer saline
  • mice immunized with the vaccine preparation more than 70% had OD values at 405 nm greater than 0.5 against NGcGM3, although all immunized animals showed IgG response against NGcGM3, no response being seen against NAcGM3, despite the minimal difference between these two molecules.
  • Figure 2 shows the maintenance of the specific antibody response (isotype IgG) against the ganglioside NGcGM3, after three months of receiving the last dose of immunization, no response being seen against the NAcGM3.
  • EXAMPLE 2 Obtaining monoclonal antibodies against NGcGM3.
  • the antibodies were generated by immunization of Balb / C mice using the procedure described in Example 1.
  • mice were reinmunized with the NGcGM3 / VLDL immunogen, using Freund's complete adjuvant. Subsequently, the spleens of the mice were removed and a cell suspension was prepared, pressing the tissue through a stainless steel sieve or perfusing the spleen. Cell fusion was performed as described by Kohler and Milstein (Nature, 1975, No. 256, 495-497) with some modifications.
  • the non-secretory murine myeloma cells P3 / X63 Ag8 6.5.3 were fused with the murine splenocytes, in a 1: 10 ratio, in 0.5 ml of a fusion medium containing 42% polyethylene glycol (3000-3600 Sigma ) in RPMI 1640 medium.
  • the cells were grown in HAT selective medium (hypoxanthine / aminopterin / thymidine) at 37 ° C, with a humid atmosphere of 5% CO 2 , after cell fusion. Between 10 and 15 days after the fusion, the detection test for the presence of antibodies in the hybridoma culture supernatant was initiated, using the ELISA technique of Example 1.
  • HAT selective medium hyperxanthine / aminopterin / thymidine
  • the cells (hybridomas) in culture that reacted with the ganglioside of interest were selected and twice cloned by the limiting dilution method, in the presence of conditioning cells.
  • the specificity of the antibodies produced by the selected hybridomas in culture was determined using the indirect ELISA technique with a glycolipid battery.
  • the number of specific clones against the ganglioside NGcGM3 was 5.5%.
  • One of these clones obtained was called 14F7.
  • EXAMPLE 3 Determination of the subclass of monoclonal antibody 14F7.
  • the indirect ELISA technique was used in plates coated with NGcGM3, as described in Example 1, although replacing the serum with dilutions of the supernatant culture of the hybrid or purified monoclonal antibody.
  • High resolution thin plate chromatography was used to separate glycolipids.
  • the solvent system used was Chloroform: Methanol: 0.25% KCL and 2.5 M NH3 (5: 4: 1) v: v and the visualization of the bands was done by chemical development with
  • PIBM polyisobutylmethacrylate
  • the blocking for the elimination of nonspecific interactions was done for 30 minutes with a 1% bovine serum albumin solution, dissolved in phosphate buffered saline pH between 7.2 and 7.4. Immediately it was incubated with the AcM 14F7 at a concentration between 0.01 and 0.02 mg / ml in the blocking solution.
  • the first wash with phosphate buffered saline was performed. It was then incubated with a rabbit antiserum against mouse immunoglobulins conjugated to Horse Radish Peroxidase (DAKO), diluted in the blocking solution.
  • DAKO Horse Radish Peroxidase
  • EXAMPLE 5 Recognition of tumor and fetal tissues, by monoclonal antibody 14F7.
  • the tissues were fixed in a 10% buffered formalin solution and dehydrated, clarified and included in paraffin. Histopathology was evaluated in sections stained with hematoxylin eosin. Consecutive cuts made from the histologically evaluated blocks were used to perform the immunomarking by the method of streptavidin peroxidase biotin complex described previously (Hsu, SM and Raine, L. 1981. J. Histochem Cytochem. 29; 1349-1353).
  • Dewaxed and rehydrated cuts were treated with 3% hydrogen peroxide (methanol solution) for 30 minutes, to eliminate endogenous peroxidase activity.
  • the cuts were incubated with the AcM 14F7 (purified) for 1 hour at room temperature. Subsequently biotinylated anti-mouse serum and streptavidin peroxidase complex (Dakopatts) were added at room temperature.
  • the sheets were washed with running water contrasted with Mayer's hematoxylin, coated with a mounting medium containing balm and covered with coverslips.
  • the reaction with the enzyme produces a brown-brown color.
  • Normal adult tissue fragments were obtained from deaths due to accidents and / or brain death within the hour after exitus letalis.
  • Fresh biopsy fragments of pathological tissue were obtained within the hour after surgical excision, fetal tissues were obtained from normal human fetuses, between 12 and 18 weeks, within 1 hour after induced abortion. All tissues were washed in saline, immediately frozen in liquid nitrogen and kept frozen at -80 ° C.
  • the frozen fragments were cut in Leica cryostat at - 25 ° C obtaining serial cuts at 5 um that were air dried and used immediately or kept at -20 ° C wrapped in Aluminum foil and were post-fixed in 4% paraformaldehyde for 20 minutes.
  • Figure 6 shows the immunohistochemical study of AcM 14F7 in normal human tissues, where no recognition is seen by the AcM in the membrane and in the cytoplasmic region of these tissues.
  • Figure 7 shows the same study for pathological tissues, with all the breast and melanoma tumors analyzed, 33/33 and 20/20 respectively, being positive. In the study of 70 lung tumors with different etiologies, all were negative and the same result was obtained in 33 of the tumors of different origin of the central nervous system.
  • Figure 8 shows the recognition of AcM 14F7 by the tissues of the digestive system and by the fetal kidney.
  • EXAMPLE 6 Recognition of the NGcGM3 ganglioside by the
  • the cell lines used were the murine P3X63 myeloma expressing GM3 and NGcGM3 described by Muthing, J. et al. (J. Biochem 1 16, 64-73, (1994) and Melanoma B16 expressing GM3.
  • the cells were cultured in RPMI medium with 8% serum and 10 7 cells / ml of a phosphate buffer solution were adjusted to concentration saline pH 7.4 containing 0.02% sodium azide and 1% bovine serum albumin 0.1 ml of the cell suspension was added to each tube and then 0.05 ml of the AcM 14F7 solution dissolved in phosphate buffered saline with The purpose of obtaining a final concentration of 0.1 mg / ml and incubated for 30 minutes at 4 ° C. After this time, it was washed with the solution where the cells were dissolved.
  • EXAMPLE 7 Study of direct cytotoxicity of monoclonal antibody 14F7.
  • the murine cell line, Myeloma P3X63 was incubated with monoclonal antibody 14F7, as described in Example 6. After washing, 0.01 ml of a solution of propidium iodide in phosphate buffered saline was added to the cells to determine the cell viability using the flow cytometer.
  • EXAMPLE 8 Study of the biodistribution of the monoclonal antibody 14F7 labeled with Te 99, in healthy Balb / C mice and with the Myeloma P3X63 tumor.
  • mice 20 female Balb / C mice with weights between 20-22 g (10 healthy and 10 who were inoculated with the P3X63 myeloma tumor intraperitoneally were injected intravenously with the AcM 14F7 labeled with Tc99.
  • Radioactivity quantification studies in the different organs were performed in 5 animals of each group, at 4 and 24 hours after injection. The animals were sacrificed and the weights of each of the organs were taken. The weights were measured on a Sartorius scale and the radioactivity of all the tubes was determined at the same time, about 25 hours after the start of the experiment on a model gamma counter (WIZARD 1470) from WALLAC.
  • the marking methodology was previously described by Schwarz and Steinstrasser (1987) and modified by Muther and Ellison in 1990.
  • the labeled 14F7 AcM was removed in healthy mice by the renal and hepatic route (Figure 11).
  • mice with the Myeloma P3X63 tumor the recognition of the tumor by the AcM 14F7 could be verified at 4 hours (12% of the total radioactivity injected per gram of tissue) and at 24 hours 35% of the total radioactivity injected per gram of tissue.
  • the elimination of the antibody was mainly by the renal route ( Figure 12).
  • EXAMPLE 9 Antitumor effect of monoclonal Antibody 14F7 in Balb / C mice with ascites P3X63 myeloma.
  • mice Female Balb / C mice weighing 20-22 g, were injected intravenously with 6 doses of the 14F7 monoclonal antibody (a first group with 0.1 and a second group with 0.2 mg) every 2 days, in phosphate buffered saline . Three days before the experiment, the peritoneal cavity was irritated with Freund's Incomplete Adjuvant to favor the killing of 10,000 murine P3X63 myeloma cells, which were inoculated on day 0 of the experiment by the same intraperitoneal route, coinciding with the start of therapy passive with the 14F7 monoclonal antibody, only this intravenously.
  • EXAMPLE 10 Inhibition of tumor growth of solid myeloma P3X63 in nude mice.
  • mice Ten female athymic mice, from the open NMRI, weighing between 20 and 22 grams were inoculated subcutaneously with 10 6 cells of the murine tumor line Myeloma P3X63 on day 0 of the experiment. The animals were divided into two groups of 5. One group began intraperitoneal treatment with the AcM
  • Figure 14 shows the inhibition of tumor growth in mice treated with the AcM 14F7, with respect to the control group, significant differences being observed between the two groups.
  • Figure 1 Shows the levels of serum antibodies against NGcGM3 and not against GM3 on day 56 of the experiment, in mice immunized with the vaccine preparation NGcGM3 / VLDL / Freund's Complete Adjuvant.
  • Figure 2 Determination by ELISA of the isotype of the antibody response against the ganglioside NGcGM3, in the serum of a mouse after three months of receiving the fourth dose of 0.2 mg of NGcGM3 / VLDL / Freund's Complete Adjuvant.
  • Figure 3 Determination of the subclass of immunoglobulins (IgG) to which the 14F7 monoclonal antibody belongs, by the ELISA technique.
  • IgG immunoglobulins
  • Figure 4 Recognition by immunostaining on thin layer chromatography of the N-glycolylated and N-acetylated gangliosides that were used during the specificity study of the Monoclone J 14F7 Antibody.
  • Figure 5 Recognition of the NGcGM3 ganglioside by the 14F7 Monoclonal Antibody using immunostaining on thin layer chromatography.
  • Figure 6 Non-recognition in normal adult tissue sections with the 14F7 Monoclonal Antibody by immunohistochemical studies.
  • Figure 7 Recognition by immunohistochemistry of some malignant and benign human tumors by the Monoclonal Antibody 14F7.
  • Figure 8 Recognition by immunohistochemistry of AcM 14F7 in normal human fetal tissue.
  • Figure 9 Recognition by the AcM 14F7 of the Myeloma P3X63 cell line expressing the ganglioside NGcGM3, by Flow Cytometry.
  • Figure 10 Cytotoxic effect independent of complement of AcM
  • Figure 12 Biodistribution of the 14F7 Monoclonal Antibody labeled with Tc99. Results of% gamma radiation with respect to the weight in grams of the organ analyzed in Balb / C animals with the P3X63 myeloma tumor.
  • Figure 14 In vivo inhibition of tumor growth "in vivo" of the murine tumor Myeloma P3X63 (solid) in nude mice of the NMRI open strain.
  • the indications refer to the microorganism mentioned in the d escription page 16 .l ⁇ nea 5

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Abstract

La presente invención se relaciona con la rama de la inmunología y la medicina humana, en particular con la generacíon y selección de un anticuerpo monoclonal (AcM) que reconoce el oligosacárido Acido Siálico N-Glicolilado-Galactosa-Glucosa (N-GcNeu-Gal-Glu) presente en tumores malignos. Uno de los objetos de esta invención es proporcionar un AcM de tipo IgG1 que poseen la característica de reconocer con alta especificidad la secuencia oligosacáridica, Acido Siálico N-Glicolilado-Galactosa-Glucosa presente en tejidos malignos de mama así como en melanomas y tumores de hígado, estómago, colon, recto y riñón. También posee la capacidad de provocar citólisis directa en las células tumorales portadoras de esta secuencia oligosacarídica, de aquí que pueda ser usado para el diagnóstico y el tratamiento de ciertas enfermedades neoplásicas. Otro objeto de la presente invención es proporcionar el hibridoma productor del AcM mencionado, así como la composición farmacéutica que lo contiene, para el tratamiento de enfermedades neoplásicas.

Description

ANTICUERPO MONOCLONAL QUE RECONOCE EL OLIGOSACARIDO ACIDO SIÁLICO N-GLICOLILADO-GALACTOSA-GLUCOSA EN TUMORES MALIGNOS Y COMPOSICIÓN QUE LO CONTIENE . Sector Técnico La presente invención se relaciona con la rama de la inmunología y la medicina humana, en particular con la generación y selección de anticuerpo monoclonal (AcM) contra la secuencia oligosacarídica Acido siálico N-glicolilado-Galactosa-Glucosa, que pueda ser usado para el diagnóstico y el tratamiento de ciertas enfermedades neoplásicas. Técnica Anterior
Las estructuras oligosacarídicas pueden encontrarse formando parte de glicoproteínas y glicolípidos, indistintamente están presentes en tejidos normales y patológicos.
La glicosidación aberrante ha sido descrita para aproximadamente el 100% de las neoplasias malignas. Cambios frecuentes en la glicosidación aberrante son: la expresión de neo-antígenos, variaciones en la composición de las secuencias oligosacarídicas, aumento o disminución de las moléculas de ácido siálico en los oligosácandos y aumento de la densidad de moléculas en la superficie celular, entre otros (Hakomori S. H. et al. Curr. Opin. in Immunol. 1991,(3) 646-653.) Además, de los cambios en los mecanismos de las sialil-tranferasas que pueden encontrarse, también hay variaciones en las hidroxilasas dependientes del ácido siálico N-acetilado activado.
Los gangliósidos son glicoesfíngolípidos que contienen ácido siálico en su estructura y se caracterizan por estar presentes en la mayoría de las células de vertebrados. Estas moléculas se encuentran en los tejidos normales y pueden tener mayor expresión en los tumores, con una organización y conformación diferente en la superficie de células malignas (Hakomori, SH., 1985, Cáncer Res. 45, 2405-2414; Miraldi, F., 1989, Seminars in Nuclear Medicine, XIX, 282-294).
La respuesta inmune humoral contra antígenos carbohidratos es generalmente de isotipo IgM. Las secuencias oligosacarídicas acopladas a lípidos, por lo general son menos inmunogénicas que las glicoproteínas. La utilización de glicolípidos como inmunógenos requiere por lo tanto de su acoplamiento a proteínas transportadoras o su incorporación a liposomas o a cepas bacterianas como el Microbacterium tuberculosis o la cepa R595 de Salmonella minnesota.
La respuesta generada contra gangliósidos es timo-independiente y este aspecto ha sido reportado por Livingston y colaboradores en reiteradas ocasiones (Livingston, P.O. et al, 1982, Proc. Nati. Acad. Sci. 84, 2911-2915; Livingston, P.O. et al, 1989, Cáncer Res. 49, 7045- 7050). Los anticuerpos generados contra gangliósidos específicamente, cuando han sido estudiados en los sueros de las diferentes especies, poseen como características fundamentales baja afinidad, considerable reactividad cruzada y corta vida (Livingston, P.O., 1991, Immunology and Allergy Clinics of North America, 11, 401-423; Portoukalian, J. et al, 1991 , Int. J. Cáncer, 49, 893-899).
La expresión de la forma N-glicolilada en los oligosacáridos es común en tejidos normales y patológicos de todas las especies de vertebrados, con excepción de los pollos y los humanos, donde sólo se encuentran en los tejidos tumorales y fetales. Los tejidos normales de estas dos últimas especies poseen únicamente la variante N-acetilada (Nishimakit et al, 1979, J. Immunology, 122, 2314; Higashi H. et al, 1985, Cáncer Res., 45, 3796).
Estudios de la composición de oligosacáridos en algunos tumores humanos arrojaron la presencia de la forma N-glicolilada tanto en glicolípidos como en glicoproteínas de células tumorales procedentes de melanoma (Hirabayashi, Y, et al. 1987, J. Cáncer Res., 78, 614 -620; Said T. et al. 1991 Arch. Dermatol. Res. 282 (3) 179- 182; Kawashima I. et al. 1993, J. Biochem (Tokio) (2) 186- 193; Kawachi S. et al., 1992, J. Dermatol (11) 827-830), así como en tumores de colon, especialmente en glicolípidos (Miyoshi, I., et al, 1986, Mol. Immunol., 23 (6), 631; Higashi H., et al, 1985, Cáncer Research, 45, 3796-3802). Adicionalmente, se han realizado estudios para comprobar la presencia de la forma N-glicolilada del gangliósido en algunas muestras tumorales de hígado, teratoma, linfomas, etc, (Kawai T. et al. 1991 Cáncer. Res. (51) 1242- 1246). Si bien en todos los casos anteriores la concentración de la variante N-glicolilada de glicolípidos fue menor del 0,05% del total de ácido siálico, Marquina y colaboradores encontraron en los tumores de mamas valores alrededor del 10% del total de ácido siálico unido a lípido (Marquina, G. et al, 1996, Cáncer Res. 56, 5165).
La generación de anticuerpos monoclonales contra la variante N- glicolilada de gangliósidos ha proporcionado hasta el momento, anticuerpos de isotipo IgM que reconocen generalmente más de una molécula de gangliósidos, por ejemplo los anticuerpos monoclonales humanos 2-39M y 32-27M (Furukawa K., et al, 1988, J. Biological Chemistry, 263, 18507) y los anticuerpos murinos GMR8 y GMR3 (Ozawa H. et al, 1992, Biochem. Biophys., Vol. 294, 2, 427). Otros autores han reportado la generación de alguna especie específica de anticuerpos contra gangliósidos N-glicolilados, siempre de isotipo IgM, entre ellos se encuentran, el anticuerpo monoclonal Y-2-HD 1, contra NGcGM2 (Samai Y. et al, 1988, Bioch Biophys. Act., 958, 368) y el anticuerpo monoclonal MK2-34 contra la misma molécula (Miyake, M. et al, 1990, Cáncer Res. 48, 6154).
Sin embargo, Watarai (Watarai, S. et al. 1995. J. Biochem. 117, 1062) generó el anticuerpo monoclonal SHS- 1 contra el gangliósido i-activo N- glicolilado y Nakumara obtuvo el anticuerpo monoclonal YK-3 contra el (NGc-NGc) GD lc (Nakumara et al, 1995, J. of Biolog. Chemist, Vol 270, 8, 3876). Recientemente Vázquez y colaboradores (Vázquez, A. M. et al, 1995, Hybridoma, Vol. 14, 6, 551) reportaron la generación del anticuerpo monoclonal P3, que reconoce a la mayoría de las moléculas de gangliósidos que contengan la forma N-glicolilada de ácido siálico, así como a glicolípidos sulfatados. AcMs contra gangliósidos han sido generados como el HMA1 por
Nagai y colaboradores (Nagai Y. et al. Patente US 4,965, 198), los cuales obtuvieron un anticuerpo monoclonal específico contra el gangliósido NGcGM2 a partir de ratones que tenían una enfermedad autoinmune, aunque además reportaron varios de estos anticuerpos que adicionalmente reconocían otros gangliósidos N-glicolilados, designados como PyK, YH02, YH03, YH04, YH05, YH06 y YH07. Por otra parte en la patente US 4,942, 131 de Yamasaki, M. et al., se reporta la generación de los AcMs YH08, YH09, YH10 e YH11 contra el gangliósido 4-O-Acetil-NGcGM3, igualmente en ratones con enfermedad autoinmune.
También se han obtenido anticuerpos monoclonales contra gangliósidos utilizando estas moléculas en forma de lactonas o a partir de líneas celulares que contiene gangliósidos (Patentes US 5,308,614; 5,240,833; 5,389,530 y 5,500,215).
De igual forma diferentes anticuerpos monoclonales, tanto murinos como humanos, se han obtenido contra los gangliósidos GD3, GD2 y GM2, todos de la forma N-acetilada, la mayoría de ellos pertenecientes a las subclases IgM e IgG3 (Pukel, C.S. et al, 1982, J. Exp. Med., 115, 1133- 1 147; Hirabayashi, Y. et al, 1985, J. Biol. Chem., 260, 13328- 13333; Solicitud de Patente WO 86/00909; Miyake, M. et al, 1988, Cáncer Res., 48, 6154-6160; Kawashima, I. et al, 1992, Molecular Immunology, 29, 625-632; Kotani, M. et al, 1992, Biochimica et Biophysica Acta, 11 17, 97- 103).
La inmunoterapia pasiva con anticuerpos monoclonales contra gangliósidos se ha usado en ensayos clínicos para el tratamiento de algunos tumores como melanomas y neuroblastomas. Los tratamientos en melanomas han sido intralesión o sistémicos, y aunque los resultados parecen ser prometedores, sólo un reducido número de pacientes tuvieron remisiones totales o parciales (Houghton, A.N. et al, 1985, Proc. Nati. Acad. Sci., 82, 1242; Dippold, W.G. et al, 1988, J. Cáncer Cli. Oncol., 24, 865; Vadhan-Raj, S. et al, 1988, J. Clin. Oncol., 6, 1636; Saleh M.N. et al, 1992, Cáncer Res., 52, 4332-4347). Estos anticuerpos mostraron efectos en estudios de citotoxicidad, mediada por complemento o mediada por células (Ravindramath M.H. et al, 1991 , ínter. Rev. Immunol., 7, 303).
Hasta el momento, todos los anticuerpos monoclonales obtenidos contra gangliósidos N-glicolilados son de isotipo IgM y la toxicidad que provocan es mediada por complemento.
Las IgM poseen generalmente baja afinidad por el antígeno y es difícil utilizarlas para propósitos de diagnóstico o terapia, cuando se pretende unirlas con isótopos radiactivos. Aunque son buenas fijadoras de complementos y garantizan una buena citotoxicidad, la posibilidad de purificación se hace bastante engorrosa en comparación con las IgG, cuando esto se realiza a gran escala.
Por otra parte anticuerpos monoclonales contra glicoproteínas N- glicoliladas han sido poco reportados y su objetivo de trabajo ha sido dirigido fundamentalmente con fines de diagnóstico.
Un anticuerpo monoclonal designado como 3E 1.2, fue descrito por
Devine y colaboradores, el cual reconoce a una mucina (glicoproteica)
N-glicolilada expresada en el 90% de los tumores de mama estudiados por inmunohistoquímica (Devine, P.L., et al. 1991, Cáncer Res. 51 (21), 5826-36).
Igualmente se ha publicado un anticuerpo monoclonal designado como JAM3, que reconoce las formas N-acetilada y N-glicolilada de una proteína de 250 kD presente en la superficie de los quistes provocados por la invasión de Entamoeba (Avron, B., et al. Mol Biochem Parasitol. 1987 (3): 257-266).
Divulgación de la Invención
La novedad de la presente invención consiste en la obtención de un anticuerpo monoclonal altamente específico contra la secuencia oligosacarídica Acido siálico N- gficolilado-Galactosa-Glucosa, presente tanto en gangliósidos como en glicoproteínas. Además, el hecho de ser una inmunoglobulina de isotipo IgGl, le da la ventaja que al ser más específica presenta más afinidad por las moléculas que reconoce, lo cual favorece su actividad biológica Inesperadamente este anticuerpo mostró la capacidad de provocar la muerte celular de forma directa en las células tumorales que portan dicho secuencia oligosacarídica. Descripción detallada de la Invención OBTENCIÓN DEL GANGLIÓSIDO NGcGM3.
Para la obtención del gangliósido NGcGM3 se utiliza una modificación de la técnica de Hakomori y colaboradores. (Hakomori, S. et al. 1974, Methods in Enzimology, Vol 32, Part B, pág. 350), a partir de fuentes naturales conocidas como por ejemplo eritrocitos de caballos. El rendimiento de la extracción del gangliósido NGcGM3 estuvo entre 180 y 300 mg por litro de eritrocitos de caballo, con una pureza superior al 90% que pudo corroborarse utilizando cromatografía líquida de alta eficiencia, según el método de Gazzotti (Gazzotti, G. et al. 1985, J. of Chromatography, 348, 371-378). OBTENCIÓN DEL INMUNÓGENO.
Para la obtención del inmunógeno, el gangliósido NGcGM3 se acopla hidrofóbicamente a las lipoproteínas humanas de muy baja densidad (VLDL), las cuales fueron obtenidas según lo descrito por Dumontet y colaboradores (Dumontet, C. et al. 1994. Cáncer Immunol Immunother. 38: 311-318)
ESQUEMA DE INMUNIZACIÓN.
Para la obtención de AcMs de tipo IgG contra gangliósidos se utiliza la siguiente metodología de inmunización. Los ratones u otra especie de mamíferos se inmunizaron con preparaciones vacunales que contienen entre 0.03 y 0.5 mg del gangliósido NGcGM3 acoplado a VLDL por dosis y un adyuvante, entre los que se puede seleccionar alúmina, adyuvante completo e incompleto de Freund o Montanide ISA 51.
Antes y durante el período de inmunización se toman muestras de sangre de los animales para la obtención de sueros, con el objetivo de monitorear los anticuerpos generados en los animales contra el gangliósido usado como antígeno, utilizando cualquiera de los métodos de inmunoensayo conocidos para la detección de la reacción antígeno- anticuerpo (Ag-Ac).
Los animales se inmunizan con varias dosis, entre 2 y 8, a intervalos de tiempo que pueden variar entre 7 y 14 días. La administración es realizada por vía subcutánea o intramuscular con volúmenes entre 0.1 y 0.2 mi. Otras vías de inmunización posible a usarse son la endovenosa y la intraperitoneal. Los animales que recibieron este rango de dosis muestran una respuesta específica contra el gangliósido con el que se inmunizaron. Como consecuencia de esta inmunización, entre el 70 y el 100% de los animales tuvieron respuesta IgG específica contra el gangliósido NGcGM3.
OBTENCIÓN DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES. Para la producción de los AcMs específicos contra el gangliósido NGcGM3, los ratones con títulos de anticuerpos séricos contra el mismo recibieron una nueva inmunización con el preparado vacunal, 3 días antes de ser obtenidas las células formadoras de anticuerpos. Deben elegirse preferiblemente las células del bazo aunque otras pueden usarse también.
Estas células se fusionan con las células de mieloma y le proporcionan a las células híbridas o hibridomas la capacidad de expandirse infinitamente "in vivo" e "in vitro". Para ello, cualquiera de los métodos conocidos para la fusión celular pueden ser utilizados. Para determinar los anticuerpos producidos por los hibridomas, preferiblemente se utiliza un ensayo inmunoenzimático, aunque otros métodos de inmunoensayo también pueden ser usados. El procedimiento de este ensayo es el reconocimiento de los sobrenadantes de los hibridomas por los gangliósidos y la unión Antígeno-Anticuerpo puede visualizarse al usar un segundo anticuerpo marcado por una enzima, que se une al anticuerpo producido por el hibridoma en condiciones apropiadas y es, a su vez, detectado.
El hibridoma, una vez seleccionado, es clonado al menos 2 veces (por ejemplo, por dilución limitante). El AcM obtenido puede ser producido "in vitro" en un medio de cultivo adecuado, cualquiera de los que se encuentran descritos en el estado de la técnica y posteriormente purificado a partir del sobrenadante de dicho cultivo. En este caso, entre el 1 y el 8% de los clones secretores fueron específicos contra el gangliósido N-Glicolil GM3.
Otro método de producción de anticuerpos, consiste en la inyección del hibridoma en animales (por ejemplo, animales singénicos). El hibridoma provoca la formación de tumores no sólidos que proporcionan una gran concentración del anticuerpo deseado, a nivel sanguíneo y en el exudado peritoneal del animal huésped.
PURIFICACIÓN DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES.
La purificación de los anticuerpos monoclonales se hace a partir del líquido ascítico, que se obtiene por la inoculación de 0,2 x 105 células del hibridoma productor de los anticuerpos monoclonales, en la cavidad peritoneal de ratones Balb/C, previamente tratados con adyuvante incompleto de Freund, como agente ascitogénico.
El líquido ascítico se diluye a la mitad en tampón glicina 1,5 M, NaCl, 3M, pH, 8,9 y se aplica a una matriz de proteína A-sefarosa, a una velocidad de flujo de 60 ml/h. La elución de los AcMs se realiza utilizando tampón citrato 0, 14 M, pH 6.
La concentración de los AcMs purificados se estima por el Método de Lowry (Lowry, G. H., 1951, J. Biol. Chem., 193, 256) y utilizando el coeficiente de absorción de las IgGl murinas a 280 nm. La especificidad se confirma por la técnica ELISA. Se obtuvieron entre 2 y 5 mg de anticuerpos por mi de ascitis, con un porciento (%) de pureza mayor de un 95%, lo que fue corroborado por cromatografía líquida de baja presión.
ESTUDIOS DE ESPECIFICIDAD.
Para determinar la especificidad de los anticuerpos monoclonales obtenidos se realizan estudios inmunoenzimáticos en placas ELISA y en cromatografía en capa fina de los AcMs producidos, empleando los gangliósidos N-acetilados (GM 1, GM2, GM3, GM 1, GD la, GD lb, GD3 y GTlb) y N-glicolilados (GM3, GM2, GM la, GM lb, GD lc y GD3).
Para la corrida de los glicolípidos en la cromatografía de capa fina con alta resolución se utiliza el sistema de solventes (Cloroformo: Metanol : KC1 0,25% y 2,5 M NH3 ) (5:4: 1) (volrvol). La visualización de las bandas se realizó por revelado químico con Orcinol.
Las placas se plastican con una solución de poliisobutilmetacrilato y se secan a temperatura ambiente toda la noche. Los bloqueos duran alrededor de 30 minutos, con una solución de albúmina de suero bovino al 1%, disuelta en tampón fosfato salino (TFS), pH 7, 4. A continuación los anticuerpos monoclonales se incuban en la solución de bloqueo.
Al terminar se lava con TFS y se añade el conjugado anti- inmunoglobulina de ratón acoplado a peroxidasa durante 1 hora. Seguidamente se procede a realizar un nuevo lavado y entonces se adiciona la solución con el substrato de la enzima, hasta visualizar las bandas. Finalmente se compara el revelado químico con el inmunológico. Se obtuvo como resultado que la IgG reconoció únicamente al gangliósido NGcGM3. DETERMINACIÓN DE CITOTOXICIDAD.
Para determinar si los anticuerpos generados provocan la muerte celular directa o por alguna de las otras formas de citotoxicidad, 107 células/ mi del mieloma murino P3X63, que contiene NGcGM3 se incuban a 4°C y 37°C respectivamente con el anticuerpo monoclonal entre 0,01 y 1 mg/ml, durante 30 minutos. Entonces se realizan estudios de viabilidad celular, utilizando el método de Tripán Azul. Pueden contarse las células muertas por el efecto del anticuerpo o añadiendo ioduro de propidium u otro marcador de viabilidad, esta vez en el citómetro de flujo por aumento de la fluorescencia en la región del rojo.
Para estudiar la citotoxicidad mediada por complemento se utilizaron 107 células/ml y se añaden los anticuerpos monoclonales en concentraciones entre 0,01 y 0,5 mg/ml. Diluciones desde 1/20 hasta 1/2 del suero de conejo que posee altas concentraciones de las proteínas del complemento se adicionan y se incuban durante 1 hora a 37°C. Los conteos de viabilidad celular, según lo descrito en el párrafo anterior, se realizaron para determinar citotoxicidad directa o el método de estudio de la viabilidad celular utilizando la liberación de Cr51 en el sobrenadante de cultivo procedente de las células de Mieloma P3X63 marcadas previamente con el isótopo radiactivo.
La citoxicidad directa fue medida empleando diferentes métodos, los que revelaron valores entre 50 y 85% de células muertas, respecto al total de células estudiadas.
DETERMINACIÓN DE LA BIODISTRIBUCIÓN DE LOS ANTICUERPOS MONOCLONALES.
Los AcMs generados pueden ser usados tanto para el diagnóstico como para la terapia, mediante el mareaje con algún isótopo radiactivo, por ejemplo, Tc99, Re 186 y Re 188. El procedimiento de mareaje de los anticuerpos mediante isótopos ha sido previamente descrito por Schwarzn y Steinstrasser (Schwarzn A., and Steinstrasser, A. 1987, J. Nucí. Med. 28, 721) y modificado por Mather y Ellison (Mather S. J. and Ellison D, (1990, J. Nucí. Med. 31, 692-697). El control de calidad del mareaje es realizado en cromatografía de papel Whatmann 3MM y el % de mareaje estuvo entre 98 y 100%.
Para determinar la posible utilidad del AcM, a 10 ratones les fue inoculado el tumor P3X63 y otros 10 ratones fueron utilizados control normal, a los cuales no se les inoculó el tumor. Se esperó el tiempo suficiente para que el tumor hubiera crecido, entonces se inyectó por vía intravenosa el AcM 14F7 marcado con Tc99 en los 20 ratones.
El monitoreo de la biodistribución del AcM obtenido contra la secuencia oligosacarídica se hace a las 4 y 24 horas post-inyección a grupos de 5 animales (5 sanos y 5 con tumor), los cuales son sacrificados tomándose a partir de ellos los órganos principales y el tumor, los que son pesados y cuya emisión gamma es cuantificada por separado al final del experimento.
Los anticuerpos monoclonales se distribuyeron en los animales sanos preferiblemente en sangre, hígado y riñon, mientras que en los animales que poseían tumor, se encontró en los órganos anteriores y preferiblemente en el tumor a las 24h.
RECONOCIMIENTO DE TEJIDOS TUMORALES Y FETALES POR EL AcM.
Los AcMs marcados con isótopos radiactivos, según lo descrito en estado del arte, pueden ser empleados para detectar tumores donde se encuentra expresada la secuencia oligosacarídica
La radiactividad puede ser estudiada en todo el cuerpo con la cámara gamma. Las imágenes son adquiridas a los 5 minutos, y 1, 3, 5, 24 y 48 horas después de la inyección, apreciándose la localización del AcM sólo en el tumor y en los órganos de excreción.
Los AcMs también pueden ser acoplados directa o indirectamente a agentes terapéuticos tales como drogas, radioisótopos, inmunomoduladores, lectinas y toxinas. Dentro de los modificadores de la respuesta biológica (inmunomoduladores) que de alguna forma pueden aumentar la destrucción del tumor por los AcMs de la invención se incluyen linfoquinas como: Factor de Necrosis Tumoral, Factor Activador de Macrófagos, Factor Estimulante de Colonias, Interferones, etc.
Con fines de diagnóstico, estudios inmunohistoquímicos se llevaron a cabo. Para ello los tejidos fueron fijados en una solución de formalina tamponada al 10% y se deshidrataron, clarificaron y se incluyeron en parafina. La histopatología se evaluó en cortes teñidos con hematoxilina eosina.
Cortes consecutivos confeccionados a partir de los bloques evaluados histológicamente fueron usados para realizar el inmunomarcaje por el método del complejo biotina estreptavidina peroxidasa descrito previamente ( Hsu, S. M. y Raine, L. 1981. J. Histochem Cytochem. 29; 1349- 1353 ).
Los cortes desparafinados y rehidratados se trataron con 3% de peróxido de hidrógeno (solución de metanol) durante 30 minutos, para eliminar la actividad peroxidasa endógena. Los cortes se incubaron con los AcMs purificados. Posteriormente se añade suero anti-ratón biotinilado y complejo estreptavidina peroxidasa (Dakopatts) a temperatura ambiente.
Entre las incubaciones, los cortes se lavaron con una solución salina tamponada con Tris-HCl. La reacción de la Peroxidasa (POD) se reveló con H2O2 al 30 % y 3-3 diaminobencidina.
Las láminas se lavan con agua corriente contrastadas con hematoxilina de Mayer, recubiertas con un medio de montaje que contiene bálsamo y tapadas con cubreobjetos. La reacción con la enzima produce una coloración carmelita-marrón.
Se realizaron estudios en tejidos tumorales humanos de mama, pulmón, piel y sistema nervioso central, así como en tejidos fetales y normales de adultos.
Los fragmentos de biopsias frescas de tejido patológico se obtuvieron dentro de la hora posterior a la exéresis quirúrgica, los cuales fueron congelados y cortados posteriormente, manteniéndose en congelación hasta su estudio.
La utilización de tejidos fetales para los estudios se debe a que la asociación de los gangliósidos como antígenos oncofetales, ha sido reportada reiteradamente, así como la similitud de la expresión de estas moléculas en el tejido fetal y tumoral humano (Cahan, L. et al. 1982
Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 79:7629-7633)
Los cortes de tejidos fetales se obtuvieron de fetos entre 12 y 18 semanas. Los fragmentos de tejidos normales de adultos se obtienen a partir de fallecidos por accidentes y/o muerte encefálica dentro de la hora posterior al exitus letalis. De los tumores estudiados, los de pulmón y sistema nervioso central con diversas etiologías fueron negativos, al igual que los cortes de los tejidos humanos normales, mientras que los de melanoma y mama resultaron todos positivos, así como los tejidos fetales del sistema digestivo (hígado, estómago, intestino delgado y grueso) y sistema renal.
EFECTO ANTITUMORAL.
Para demostrar el efecto antitumoral de los anticuerpos monoclonales contra el gangliósido NGcGM3, animales a los cuales se les inocula el tumor que posee el gangliósido blanco (Mieloma P3X63), son tratados con los anticuerpos obtenidos. Las dosis pueden variar de 0,01 mg/kg. de peso a 200 mg/kg. de peso en una o más administraciones diariamente, por uno o varios días. Los AcMs generados pueden ser administrados parenteralmente por inyección (intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intracavidad o transdérmica).
En un experimento tipo, los ratones tratados con los anticuerpos, tienen un índice de sobrevida entre un 30 y un 80% comparado con los ratones del grupo control, lo cual se corrobora con el test de Log Ram (Cox and Oakes (1984) Analysis of survival Data edits.Chapman Hall), donde se encontraron diferencias significativas entre el grupo tratado con el AcM y el control, menor del 0.05%.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN:
EJEMPLO 1: Respuesta IgG específica contra NGcGM3, de los ratones inmunizados con el preparado vacunal NGcGM3/ VLDL/ Adyuvante Completo de Freund, medida por una técnica inmunoenzimática.
Ratones Balb/C hembras entre 6-8 semanas fueron inyectados por vía intramuscular con 0,2 mg del preparado vacunal NGcGM3/VLDL humana, con el adyuvante completo de Freund en la primera dosis y el incompleto de Freund las siguientes (producidos por la firma SIGMA) mezclados en igual volumen. Cada animal recibió 6 dosis, las primeras 4 semanalmente y las 2 sucesivas cada 14 días. Se realizaron extracciones de sangre previo a la primera dosis y cada 2 semanas.
Los niveles de anticuerpos fueron medidos en el suero de los animales, utilizando un ELISA indirecto en placas de Polysorp (de la firma Nunc), donde se inmovilizaron los gangliósidos siguiendo la metodología que a continuación se describe:
Los gangliósidos NAcGM3 y NGcGM3 se disolvieron por separado en metanol (4μg/ml) y se añadieron 50 μl/pozo. Se colocó la placa a 37°C durante una hora y media para evaporar el metanol. Posteriormente se añadieron 100 ml/pozo de tampón TRIS-HC1 0,05M, pH 7.8, que contenía 2% de seroalbúmina bovina (SAB) y durante una hora se incubó a temperatura ambiente. A continuación 50 μl de los sueros fueron diluidos en el mismo tampón y se incubaron toda la noche a temperatura ambiente. Los pozos se lavaron 4 veces con 200 μl de solución salina de tampón fosfato (SSTF) y se añadieron 50 μl de un antisuero antiinmunoglobulinas de ratón conjugado con biotina a la dilución adecuada, 1 hora y media a 37°C.
Posteriormente se repitió el lavado con SSTF y se adicionaron 50 μl de una dilución de estreptavidina fosfatasa alcalina con una dilución acorde. Finalmente se realizó el último lavado y 100 μl del sustrato p- nitrofenilfosfato disuelto en tampón dietanolamina, pH 9.8 (1 mg/ml). La absorbancia se midió en un lector de ELISA a 405 nm.
En el Figura 1 se muestran los resultados de D.O. a 405 nm de los sueros de cada animal diluidos 1/80 el día 56 del experimento. La respuesta contra NGcGM3 y contra GM3 fue determinada a través de un ELISA donde se usó un conjugado anti-IgG de ratón biotinilado y estreptavidina-fosfatasa alcalina procedentes de la firma Jackson.
De los ratones inmunizados con el preparado vacunal más del 70% tuvieron valores de D.O. a 405 nm superiores a 0,5 contra NGcGM3, aunque todos los animales inmunizados mostraron respuesta IgG contra NGcGM3, no apreciándose respuesta contra el NAcGM3, pese a la mínima diferencia existente entre estas dos moléculas.
En la Figura 2 se muestra el mantenimiento de la respuesta de anticuerpos (isotipo IgG) específica contra el gangliósido NGcGM3, luego de tres meses de recibir la última dosis de inmunización, no apreciándose respuesta contra el NAcGM3.
EJEMPLO 2: Obtención de anticuerpos monoclonales contra NGcGM3.
Los anticuerpos fueron generados por la inmunización de ratones Balb/C utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.
Tres días antes de la fusión, los animales fueron reinmunizados con el inmunógeno NGcGM3/VLDL, empleando el adyuvante completo de Freund. Posteriormente se extirparon los bazos de los ratones y se preparó una suspensión celular, prensando el tejido a través de un tamiz de acero inoxidable o perfundiendo el bazo. La fusión celular se realizó según lo descrito por Kóhler y Milstein (Nature, 1975, No. 256, 495-497) con algunas modificaciones.
Las células de mieloma murino no secretor P3/X63 Ag8 6.5.3, se fusionaron con los esplenocitos murinos, en una proporción 1: 10, en 0,5 mi de un medio de fusión que contenía 42% de polietilenglicol (3000-3600 Sigma) en medio RPMI 1640.
Las células se cultivaron en medio selectivo HAT (hipoxantina/aminopterina/timidina) a 37°C, con una atmósfera húmeda de CO2 5%, después de la fusión celular. Entre los 10 y 15 días posteriores a la fusión, se inició el ensayo de detección de la presencia de anticuerpos en el sobrenadante de los cultivos del hibridoma, utilizando la técnica de ELISA del Ejemplo 1.
Se seleccionaron las células (hibridomas) en cultivo que reaccionaban con el gangliósido de interés y dos veces se clonaron por el método de dilución limitante, en presencia de células acondicionadoras. La especificidad de los anticuerpos producidos por los hibridomas en cultivo seleccionados, se determinó usando la técnica de ELISA indirecta con una batería de glicolípidos.
El número de clones específico contra el gangliósido NGcGM3 fue 5.5%. Uno de estos clones obtenidos fue denominado 14F7.
EJEMPLO 3: Determinación de la subclase del anticuerpo monoclonal 14F7.
Para la determinación de la clase de inmunoglobulinas a la que pertenece el anticuerpo monoclonal objeto de la invención, se utilizó la técnica de ELISA indirecto en placas recubiertas con NGcGM3, tal como se describió en el Ejemplo 1, aunque sustituyendo el suero por diluciones del sobrenadante de cultivo del híbrido o del anticuerpo monoclonal purificado.
Se añadieron AcMs anti IgGl, IgG2a, IgG2b e IgG3 murinos producidos en ratas y conjugados con biotina por la firma Pharmingen, diluidos en el tampón de incubación. Después de 1 hora a 37° C se realizaron lavados y se adicionó el conjugado Streptavidina- fosfatasa alcalina en el tampón de incubación. Como controles para cada subclase se utilizaron anticuerpos monoclonales murinos, previamente caracterizados.
Finalmente se le añadió la solución substrato. La lectura de las absorbancias se efectuó de forma similar a la descrita anteriormente. En la Figura 3 se muestra que el anticuerpo monoclonal 14F7 pertenece a la subclase IgG 1. EJEMPLO 4: Estudio de especificidad del Anticuerpo monoclonal
14F7 utilizando la inmunotinción sobre cromatografía en placa delgada de alta resolución.
La cromatografía sobre placa delgada de alta resolución se utilizó para separar los glicolípidos. El sistema de solventes empleado fue Cloroformo: Metanol: KCL 0,25% y 2,5 M de NH3 (5:4: 1) v:v y la visualización de las bandas se hizo mediante revelado químico con
Orcinol (Svennerholm L. 1964, J. Lipid. Res., 5, 145), mientras que para la inmunotinción se utilizó el método de Kawashima Y. y col. 1993 (J. Biochem, 114, 186).
Las placas donde previamente se realizaron las cromatografías en placa fina fueron plastificadas por inmersión durante 75 segundos en una solución de 0, 1% de poliisobutilmetacrilato (PIBM) en N-hexano. A continuación las placas se secan a temperatura ambiente durante 30 minutos, entonces se aplica una solución de PIBM al 1% en los bordes de las placas, manteniéndose a temperatura ambiente toda la noche.
El bloqueo para la eliminación de interacciones inespecíficas se hizo por 30 minutos con una solución de albúmina de suero bovino al 1 %, disuelta en tampón fosfato salino pH entre 7,2 y 7,4. Inmediatamente se incubó con el AcM 14F7 a una concentración entre 0.01 y 0.02 mg / mi en la solución de bloqueo.
Entre este paso y el siguiente, se realizó el primer lavado con tampón fosfato salino. Se incubó seguidamente con un antisuero de conejo contra inmunoglobulinas de ratón conjugado con Peroxidasa de Rábano de Caballo (DAKO), diluido en la solución de bloqueo.
Transcurrida 1 hora de incubación con agitación a temperatura ambiente las placas se lavaron nuevamente y se añadió la solución de sustrato consistente en 0,4 mg/ml de ortofenilendiamina (C6H8N2 ) Sigma, en tampón citrato-fosfato 80 mM pH 5 con 0, 12% de Peróxido de Hidrogeno (H2O2) (Riedel de Haen). La reacción fue detenida con lavados sucesivos de tampón fosfato.
La reacción reveló especificidad solamente por el gangliósido NGcGM3 y no por los otros gangliósidos N-glicolilados evaluados como GM la , GM lb , GM2 y N-acetilados (Figuras 4 y 5).
EJEMPLO 5: Reconocimiento de tejidos tumorales y fetales, por el anticuerpo monoclonal 14F7.
Los tejidos fueron fijados en una solución de formalina tamponada al 10% y se deshidrataron, clarificaron y se incluyeron en parafina. La histopatología se evaluó en cortes teñidos con hematoxilina eosina. Cortes consecutivos confeccionados a partir de los bloques evaluados histológicamente fueron usados para realizar el inmunomarcaje por el método del complejo biotina estreptavidina peroxidasa descrito previamente (Hsu, S. M. y Raine, L. 1981. J. Histochem Cytochem. 29; 1349- 1353 ).
Los cortes desparafinados y rehidratados se trataron con 3% de peróxido de hidrógeno (solución de metanol) durante 30 minutos, para eliminar la actividad peroxidasa endógena. Los cortes se incubaron con el AcM 14F7 (purificado) durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente se añadió suero anti-ratón biotinilado y complejo estreptavidina peroxidasa (Dakopatts) a temperatura ambiente.
Entre las incubaciones, los cortes se lavaron con una solución salina tamponada con Tris-HCl . La reacción de la Peroxidasa (POD) se reveló al usar 5 mi de una solución tamponada de Tris 0.005 mi de H2O2 al 30 % y 3 mg de 3-3 diaminobencidina.
Las láminas se lavaron con agua corriente contrastadas con hematoxilina de Mayer, recubiertas con un medio de montaje que contiene bálsamo y tapadas con cubreobjetos. La reacción con la enzima produce una coloración carmelita-marrón. Los fragmentos de tejido normal de adultos se obtuvieron de fallecidos por accidentes y/ o muerte encefálica dentro de la hora posterior al exitus letalis. Los fragmentos de biopsias frescas de tejido patológico se obtuvieron dentro de la hora posterior a la exéresis quirúrgica, los tejidos fetales se obtuvieron a partir de fetos normales humanos, entre 12 y 18 semanas, dentro de 1 hora posterior al aborto inducido. Todos los tejidos se lavaron en solución salina, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se conservaron congeladas a -80°C.
Los fragmentos congelados fueron cortados en criostato Leica a - 25°C obteniéndose cortes seriados a 5 um que se secaron al aire y se utilizaron inmediatamente o se conservaron a -20°C envueltos en papel de aluminio y fueron post-fijados en paraformaldehído al 4% durante 20 minutos.
En la Figura 6 se muestra el estudio inmunohistoquímico del AcM 14F7 en los tejidos normales humanos, donde no se aprecia reconocimiento por el AcM en la membrana y en la región citoplasmática de estos tejidos.
En la Figura 7 se muestra el mismo estudio para tejidos patológicos, resultando positivos todos los tumores de mama y melanoma analizados, 33/33 y 20/20 respectivamente. En el estudio realizado en 70 tumores de pulmón con diversas etiologías todos fueron negativos y el mismo resultado se obtuvo en 33 de los tumores de diferente origen del sistema nervioso central.
En la Figura 8 se muestra el reconocimiento del AcM 14F7 por los tejidos del sistema digestivo y por el riñon fetal. EJEMPLO 6: Reconocimiento del gangliósido NGcGM3 por el
AcM 14F7 en líneas celulares por citometría de flujo.
Las líneas celulares utilizadas fueron el Mieloma P3X63 murino que expresa GM3 y NGcGM3 descrito por Muthing , J. et al. (J. Biochem 1 16, 64-73,( 1994) y el Melanoma B16 que expresa GM3. Las células fueron cultivadas en medio RPMI con suero al 8% y se ajustaron a concentración 107 células / mi de una solución de tampón fosfato salino pH de 7,4 conteniendo 0.02% de azida sódica y 1% de albúmina de suero bovino 0, 1 mi de la suspensión celular se le añadió a cada tubo y seguidamente 0.05 mi de la solución del AcM 14F7 disuelto en tampón fosfato salino con el propósito de obtener una concentración final 0.1 mg/ml e incubado durante 30 minutos a 4°C. Transcurrido este tiempo se lavó con la solución donde estaban disueltas las células.
Posteriormente los cultivos se centrifugaron durante 5 minutos a bajas revoluciones para precipitar las células. Entonces el conjugado anti-ratón (IgG+IgM) biotinilado (Jackson) fue adicionado y transcurrido 30 minutos a 4°C realizándose otro lavado, finalmente 0.002 mg de estreptavidina-fluoresceina (FITC) (Jackson) fueron adicionados e incubados en las mismas condiciones anteriores. Se realizó el último lavado, esta vez con tampón fosfato salino. Se decantó luego de la última centrifugación y se resuspendieron las células en 0,6 mi de la última solución de lavados. El 80% de las células de la línea de Mieloma P3X63 fueron marcadas por el anticuerpo monoclonal 14F7 (Figura 9).
EJEMPLO 7: Estudio de citotoxicidad directa del anticuerpo monoclonal 14F7.
La línea celular murina, Mieloma P3X63 se incubó con el anticuerpo monoclonal 14F7, según lo descrito en el Ejemplo 6. Después del lavado se le añadió a las células 0,01 mi de una solución de ioduro de propidium en tampón fosfato salino para determinar la viabilidad celular usando el citómetro de flujo.
Los resultados evidenciaron que el 78% de las células murieron (Figura 10).
EJEMPLO 8: Estudio de la biodistribución del anticuerpo monoclonal 14F7 marcado con Te 99, en ratones Balb/C sanos y con el tumor Mieloma P3X63.
20 Ratones Balb/C hembras con pesos entre 20-22 g (10 sanos y 10 a los cuales se les inoculó el tumor Mieloma P3X63 por vía intraperitoneal fueron inyectados por vía intravenosa con el AcM 14F7 marcado con Tc99. La relación de concentración de mareaje fue de 0.03 mg de AcM 14F7 / 60 DCi de Tc99.
Los estudios de cuantificación de radiactividad en los diferentes órganos se realizaron en 5 animales de cada grupo, a las 4 y las 24 horas después de la inyección. Los animales fueron sacrificados y se tomaron los pesos de cada uno de los órganos. La medición de los pesos se hizo en una balanza Sartorius y se determinó la radiactividad de todos los tubos a la vez, alrededor de 25 horas después de iniciado el experimento en un contador gamma modelo (WIZARD 1470) de la firma WALLAC. La metodología del mareaje fue previamente descrita por Schwarz y Steinstrasser ( 1987) y modificada por Muther y Ellison en 1990.
El AcM 14F7 marcado fue eliminado en los ratones sanos por vía renal y hepática (Figura 11). En los ratones con el tumor Mieloma P3X63 pudo comprobarse el reconocimiento del tumor por el AcM 14F7 a las 4 horas (12% de la radiactividad total inyectada por gramo de tejido) y a las 24 horas 35% de la de la radiactividad total inyectada por gramo de tejido. La eliminación del anticuerpo fue principalmente por la vía renal (Figura 12).
EJEMPLO 9: Efecto antitumoral del Anticuerpo monoclonal 14F7 en ratones Balb/C con Mieloma P3X63 ascítico.
Ratones Balb/C hembras de 20-22 g de peso, se inyectaron por vía intravenosa con 6 dosis del anticuerpo monoclonal 14F7 (un primer grupo con 0.1 y un segundo grupo con 0,2 mg) cada 2 días, en solución tampón fosfato salino. Tres días antes del experimento, fue irritada la cavidad peritoneal con Adyuvante Incompleto de Freund para favorecer el prendimiento de 10 000 células del Mieloma P3X63 murino, que fueron inoculadas el día 0 del experimento por la misma vía intraperitoneal, coincidiendo con el inicio de la terapia pasiva con el anticuerpo monoclonal 14F7, sólo que éste por vía intravenosa. Mientras el control de buen pronóstico (mejor tratamiento) utilizado para comparar fue un tercer grupo tratado por vía intravenosa con Ciclofosfamida. (Shangai Hua Lian Pharmaceutical Corp.) a la dosis de 20 mg/kg. de peso corporal, que consistía en una dosis semanal durante todo el experimento. Como control del experimento se utilizó el tratamiento intravenoso con solución tampón fosfato salino pH 7,4. En la Figura 13, aparecen los resultados de sobrevida de los 4 grupos previamente descritos. Es de resaltar que en los grupos tratados con el AcM 14F7 (0.1 y 0.2 mg) y con 20 mg/kg. de peso de Ciclofosfamida se observó que no hubo prendimiento tumoral en algunos animales. Los resultados de sobrevida favorecieron a los grupos tratados con el AcM 14F7. El día 30 del experimento, mientras no quedaba vivo ninguno de los animales del grupo control, se mantenían con vida 6 animales, tanto del primer grupo (0, 1 mg del AcM) como del grupo tratado con Ciclofosfamida y 7 animales del segundo grupo (0,2 mg del AcM). A los 60 días del tratamiento, dos animales del primer grupo, así como dos del grupo tratado con Ciclofosfamida sobrevivieron, mientras que en el segundo grupo fueron 5 los animales que quedaron con vida.
EJEMPLO 10: Inhibición del crecimiento tumoral del Mieloma P3X63 sólido en ratones atímicos.
Diez ratones atímicos hembras, procedentes de la abierta NMRI, con peso entre 20 y 22 gramos fueron inoculados por vía subcutánea con 106 células de la línea tumoral murina Mieloma P3X63 el día 0 del experimento. Los animales se dividieron en dos grupos de 5. Un grupo empezó el tratamiento por vía intraperitoneal con el AcM
14F7 purificado, 0.15 mg por dosis (6 dosis) cada 2 días. Mientras el otro servía de control y recibió por la misma vía el mismo número y frecuencia de dosis de igual volumen de tampón fosfato salino.
La Figura 14 muestra la inhibición del crecimiento de los tumores en los ratones tratados con el AcM 14F7, respecto al grupo control, apreciándose diferencias significativas entre los dos grupos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS:
Figura 1: Muestra los niveles obtenidos de anticuerpos séricos contra NGcGM3 y no contra GM3 el día 56 del experimento, en ratones inmunizados con el preparado vacunal NGcGM3/ VLDL/ Adyuvante Completo de Freund.
Figura 2: Determinación por ELISA del isotipo de la respuesta de anticuerpos contra el gangliósido NGcGM3, en el suero de un ratón luego de tres meses de recibir la cuarta dosis de 0,2 mg de NGcGM3/VLDL/ Adyuvante Completo de Freund. Figura 3: Determinación de la subclase de inmunoglobulinas (IgG) a la que pertenece el anticuerpo monoclonal 14F7, por la técnica de ELISA.
Figura 4: Reconocimiento por inmunotinción sobre cromatografía en capa fina de los gangliósidos N-glicolilados y N-acetilados que fueron utilizados durante el estudio de especificidad del Anticuerpo MonoclonaJ 14F7.
Figura 5: Reconocimiento del gangliósido NGcGM3 por el Anticuerpo Monoclonal 14F7 utilizando la inmunotinción sobre la cromatografía en capa fina. Figura 6: No reconocimiento en cortes de tejido normal de adulto con el Anticuerpo Monoclonal 14F7 por estudios inmunohistoquímicos.
Figura 7: Reconocimiento por inmunohistoquímica de algunos tumores humanos malignos y benignos por el Anticuerpo Monoclonal 14F7. Figura 8: Reconocimiento por inmunohistoquímica del AcM 14F7 en tejido fetal humano normal.
Figura 9: Reconocimiento por el AcM 14F7 de la línea celular Mieloma P3X63 que expresa el gangliósido NGcGM3, mediante Citometría de Flujo. Figura 10: Efecto citotóxico independiente de complemento del AcM
14F7 utilizando la línea celular Mieloma P3X63, mediante la técnica de Ioduro de Propidium, por Citometría de Flujo. Figura 11: Biodistribución del Anticuerpo Monoclonal 14F7 marcado con Tc99. Resultados de % de radiación gamma respecto al peso en gramos del órgano analizado en animales Balb/C normales.
Figura 12: Biodistribución del Anticuerpo Monoclonal 14F7 marcado con Tc99. Resultados de % de radiación gamma respecto al peso en gramos del órgano analizado en animales Balb/C con el tumor Mieloma P3X63.
Figura 13: Efecto antitumoral de la terapia pasiva del Anticuerpo
Monoclonal 14F7 en grupos de ratones Balb/C inoculados con el tumor murino Mieloma P3X63 ascítico, tratados con 0, 1 y 0,2 mg de dicho anticuerpo, comparado un grupo tratado con Ciclofosfamida 20mg/kg de peso y un grupo control.
Figura 14: Inhibición del crecimiento tumoral "in vivo" del tumor murino Mieloma P3X63 (sólido) en ratones atímicos de la cepa abierta NMRI.
INDICACIÓN RELATIVA AL DEPOSITO DE UN MICRO-OR(jANISMO
(Regla 13 bis del PCT)
Las indicaciones se refieren al microorganismo mencionado en la descripción página 16 .línea 5
B. IDENTIFICACIÓN DEL DEPOSITO Otros depósitos están identificados en una hoja suplementaria D
Nombre de la institución de depósito Centre for Applied Microbiology and Research (CAMR) & European Collection of Cell Cultures (ECACC)
Dirección de la institución de depósito (comprendidos el distrito postal y el país)
ECACC, CAMR
Salisbury,Wiltshire SPA OJG U.K.
Fecha de depósito n° de orden
19 de Octubre de 1998 98101901
C. INDICACIONES SUPLEMENTARIAS (en caso necesario) Se adjunta una hoja separada para la continuación de estos datos D
D. ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS QUE SE FACILITAN LAS INDICACIONES (caso de que lu inriiririnnf t no se faciliten para iodos los estados designados)
E. INDICACIONES SUMINISTRADAS POR SEPARADO (en caso necesario)
Las indicaciones numeradas a continuación serán presentadas posteriormente en la Oficina internacional tespeciíicar la naturaleza general de las indicaciones por ejem. "n° de orden del depósito")
Reservado a la Oficina internacional
1 [ Esta hoja se ha recibido en la Oficina internacional
Funcionario autoπzado
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The Budapest Treaty of 1977, with the European Collecüon of Cell Cultures on 19™ OCTOBER 1998
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Dr P J Packer,
Head of Q ality Control
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European C dleclion OÍ CβU Cultur»*. Cimtre for Λpphcd Micπimυlήgy & lios .irr.h
SUiabury. Wiltóhiro s?* ωα. UK.
7M- +W 1680 615512 fax: +U 10HO « 1 131 ,0
S.Vail βc CCφCamr.org.Uk W*i> Xltc: www.cΛinr.υrfc'.uk
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Claims

REIVINDICACIONES:
1. Anticuerpo monoclonal generado contra el gangliósido NGcGM3 caracterizado porque reconoce específicamente la secuencia oligosacarídica Acido siálico N-glicolilado-Galactosa-Glucosa en gangliósidos y glicoproteínas, pertenece a la subclase IgGl y provoca actividad citolítica de las células tumorales portadoras de dicha secuencia.
2. Anticuerpo monoclonal según reivindicación 1 caracterizado porque dicha actividad citolítica de las células tumorales portadoras de la secuencia oligosacarídica Acido siálico N-glicolilado-Galactosa- Glucosa puede ser directa o mediada por complemento.
3. Anticuerpo monoclonal según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque se denomina 14F7, obtenido a partir αel hibridoma designado con el mismo nombre y depositado bajo el número de acceso provisional 98101901 en la colección ECACC, UK y con fecha Octubre 19, 1998
4. Hibridoma productor del anticuerpo monoclonal de la reivindicación 3 depositado bajo el número de acceso provisional 98101901en la colección ECACC, UK y con fecha Octubre 19, 1998
5. Una composición farmacéutica que contiene una cantidad el anticuerpo monoclonal de las reivindicaciones de la 1 a la 3, y que contiene adicionalmente un diluente o un excipiente adecuado.
6. Una composición farmacéutica según la reivindicación 5 donde dicho anticuerpo puede estar unido a agentes terapéuticos tales como drogas, radioisótopos, inmunomoduladores, lectinas y toxinas.
7. Una composición farmacéutica según las reivindicaciones 5 y 6 para ser usada en el tratamiento de neoplasias malignas.
8. Una composición farmacéutica según la reivindicación 7 para el tratamiento del cáncer de mama, renal, del sistema digestivo y melanoma humano.
9. Un reactivo que contiene el anticuerpo monoclonal de las reivindicaciones de la 1 a la 3, acoplado a marcadores como enzimas, cromóforos, materiales quimioluminiscentes o radionucleótidos.
10. Un reactivo según la reivindicación 9 para la detección de células tumorales.
1 1. Un reactivo según la reivindicación 10 para la detección de células de tumores humanos de melanoma, mama, sistema digestivo taies como hígado, colon, estómago y recto, así como riñon.
PCT/CU1999/000001 1998-02-05 1999-02-05 Anticuerpo monoclonal que reconoce el oligosacarido acido sialico n-glicolilado-galactosa-glucosa en tumores malignos y composicion que lo contiene Ceased WO1999040119A1 (es)

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