WO1999057249A1

WO1999057249A1 - Nicotianamine synthase and gene encoding the same

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Publication number: WO1999057249A1
Application number: PCT/JP1999/002305
Authority: WO
Inventors: Satoshi Mori; Kyoko Higuchi; Kazuya Suzuki; Naoko Nishizawa; Hiromi Nakanishi
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1998-04-30
Filing date: 1999-04-30
Publication date: 1999-11-11
Anticipated expiration: 2000-10-30
Also published as: US7192755B1; US7604972B2; CA2327261A1; AU759256B2; DE69920439T2; US20080233627A1; EP1077255A1; JP3893024B2; AU3627399A; EP1077255A4; ES2229702T3; EP1077255B1; CA2327261C; US20070150981A1; DE69920439D1; US7396668B2

Description

明細書ニコチアナミン合成酵素、それをコードする遺伝子

技術分野

本発明は、ムギネ酸の生合成経路におけるニコチアナミン合成酵素、それをコ — ドする遺伝子、当該遺伝子を含有するベクター、当該ベクターで形質転換された細胞、それを用いたニコチアナミンの製造方法、ニコチアナミン合成酵素をコードする遺伝子で形質転換された植物、及び、ニコチアナミン合成酵素に対する坊体に関する。背景技術

ムギネ酸（mugineic ac i d)を用いて土中の不溶態 F e ( I I I ) をキレート化して吸収するいわゆるストラテジー Π (Strategy- II) によって鉄を吸収するイネ科植物は、鉄のキレ一夕一（ファイトシデロフォア）を根から分泌し、根圏の鉄を可溶化して吸収する（Roemheld, 1987) 。その分泌量は鉄欠乏ストレスにより顕著に増加する。ムギネ酸類は現在までに知られている唯一のフアイトシデロフォァである（Takagi 1976) 。したがって、イネ科植物の鉄欠乏耐性能はムギネ酸類の分泌量に依存すると考えられている（Takagi et al. 1984, Roemheld and Mar schner 1986, Marschner et al. 1987, Mori et al. 1987, Kawai et al. 1988, Mori et al. 1988, Mihashi and Mori 1989, Singh et al. 1993) 。植物中でのムギネ酸類の生合成経路を第 1図に示す。まず、 S—アデノシルメチォニン合成酵素によりメチォニンから S—アデノシルメチォニンが作られる。次いで、ニコチアナミン合成酵素により 3分子の S—アデノシルメチォニンが結合して 1分子のニコチアナミンが生成される。生成したニコチアナミンは、ニコチアナミンァミノ基転移酵素により 3 " —ケト体になり、続いて何らかの還元酵素により 2 ' —デォキシムギネ酸になる。これがさらに水酸化されてムギネ酸をはじめとする他のムギネ酸誘導体になる（Mori and Nishizawa 1987, Shoj ima e t al. 1989, Shoj ima et al. 1990, Ma and Nomoto 1993) 。

第 1図における右下の化合物の R ,及び R ₂が水素原子で R が水酸基である化合物がムギネ酸である。 R ,が水素原子で、 R ₂及び R が水酸基である化合物が、 3 ーヒドロキシムギネ酸である。また、 R ₂が水素原子で R！及び R が水酸基である化合物が 3 —ェピヒドロキシムギネ酸である。

ォォムギの根から 3種の S—アデノシルメチォニン合成酵素遺伝子が単離されたが、この発現は鉄欠乏で誘導されなかった（Takizawa et al. 1996)。また、ォォムギからディファレンシャルスクリーニング法により得られた遺伝子 I d s 3 はデォキシムギネ酸を水酸化してムギネ酸にする酵素の遺伝子であると推定されるが、この発現は鉄欠乏により強く誘導される（Nakanishi et al. 1993)。さらに, ニコチアナミンァミノ基転移酵素が鉄欠乏ォォムギの根から精製 ' 単離され、その 2つの遺伝子 N a a t 一 Aと N a a t 一 Bが単離された（Takahashi et al. 19 97)。この N a a t — Aの発現も、鉄欠乏で誘導された。

S—アデノシルメチォニンからニコチアナミンを合成する反応は、脱炭酸 S - アデノシルメチォニンからポリアミンを合成する反応と似ている。しかし、ボリァミン合成酵素と違い、ニコチアナミン合成酵素は 3分子の S—アデノシルメチォニンの結合とァゼチジン環の形成を同時に触媒するものである（第 1図）。このようなニコチアナミン合成酵素は新しい型の酵素である。以前、本発明者らは鉄欠乏ォォムギ根からのニコチアナミン合成酵素の部分精製と活性の発現パターンについて報告した（Higuchi et al. 1994, Higuchi et al. 1995, Kanazawa e t al. 1995, Higuchi et al. 1996a, Higuchi et al. 1996b)。しかし、ニコチアナミン合成酵素は抽出、精製の途中で非常に分解され易く、分離精製することは困難であり、部分アミノ酸配列を決定するのに十分な量を得ることも困難であつた。本発明は、ニコチアナミン合成酵素を精製単離し、この遺伝子をクロ一ニングし、その塩基配列及びアミノ酸配列を決定し、この遺伝子を用いて鉄欠乏に対する耐性の強い植物、特にイネ科植物を提供することを目的とするものである。発明の開示

本発明は、配列表の配列番号 1 に示されるアミノ酸配列を有するニコチアナミン合成酵素、又は、その一部のアミノ酸が欠失、他のアミノ酸で置換、若しくはさらに他のアミノ酸が付加されてなるアミノ酸配列を有するニコチアナミン合成酵素に関する。

本発明は、前記のニコチアナミン合成酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子に関する。

また、本発明は、前記の遺伝子を含有してなるベクター、及び、当該べクタ一で形質転換された形質転換体に関する。

本発明は、前記形質転換体を用いてニコチアナミンを製造する方法に関する。また、本発明は、前記の遺伝子が導入された植物、特にイネ科植物、及び、これらの植物を生育させて得られる果実に関する。

本発明は、前記のニコチアナミン合成酵素をチオールプロテアーゼ阻害剤、好ましくは E— 6 4の存在下に抽出する方法に関する。

さらに、本発明は、前記のニコチアナミン合成酵素に対する抗体に関する。図面の簡単な説明

第 1図は、ムギネ酸類の生合成経路を示すものである。

第 2図は、鉄欠乏ォォムギ及び対照のォォムギの根からの精製過程での両者の比較を示すものである。

第 3図は、 3 0〜 3 5 k D a付近の分取 S D S— P A G E (ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動、以下 S D S— P A G Eと略す）を示す。横棒は各ゲル片から検出された酵素活性を相対表示したもの。

第 4図は、ゲルろ過カラムからのニコチアナミン合成酵素活性の溶出パターンを示す。黒丸印（拿）は酵素活性を示す。

第 5図は、ォォムギ由来のニコチアナミン合成酵素から決定した 6つの部分ァミノ酸配列と、コンピューター検索により得られたイネの類似の配列とを比較したものである。一致するアミノ酸残基を「：」で示した。第 6図は、 HvNASlの c D NAの全長とそこから予想されるアミノ酸配列を示したものである。下線で示した部分は、前記第 5図の部分配列と一致している部分を示している。その右側に塩基の数を示した。左側にアミノ酸残基の数を示した < 第 7図は、ォォムギから得られた前記の 7つの c D NAから予想されるァミノ酸配列の比較を示したものである。全てのクローンで一致するアミノ酸残基を「 *」で示した。

第 8図は、マルト一スバインディングプロティンー HvNASl融合蛋白質を発現している大腸菌の粗抽出物のニコチアナミン合成活性を、薄層クロマトグラフィー (T L C) で検出した結果を示すものである

第 9図は、 HvNASlをプローブとしたノーザンハイプリダイゼ一ション解析を示す。

第 1 0図は、 HvNASlをプローブとしたサザンハイプリダイゼーション解析を示す。

第 1 1図は、活性検出に用いた粗酵素試料のウエスタンプロット解析を示す。第 1 2図は、トリクロ口酢酸/アセトンで抽出した全タンパク質のウエスタンブロット解析を示す。

第 1 3図は、鉄欠乏ォォムギ及び対照のォォムギの根からの精製過程における D E A Eセファロース F F後での両者の比較を示すものである。

第 1 4図は、鉄欠乏ォォムギ及び対照のォォムギの根からの精製過程におけるエーテルトヨパール 6 5 0 M後での両者の比較を示すものである。

第 1 5図は、マルト一スバインディングブロティン— OsNASl融合蛋白質を発現している大腸菌の粗抽出物のニコチアナミン合成活性を、薄層クロマトグラフィ - (T L C) で検出した結果を示すものである

第 1 6図は、 OsNASlをプローブとしたノーザンハイプリダイゼ一ション解析を示す。

第 1 7図は、マルトースバインディングプロテイン— AtNASl、 AtNAS2又は AtNA S3融合蛋白質を発現している大腸菌の粗抽出物のニコチアナミン合成活性を、薄層クロマトグラフィー（T L C) で検出した結果を示すものである

第 1 8図はシロイヌナズナの地上部及び根から全 RNAを抽出し、 RT-PCRを行つた結果を示す。右端は陽性コントロールを示す。発明を実施するための最良の形態

本発明者らは、以前からニコチアナミン合成酵素の単離を試みてきたが（Hi guc hi et al. Plant&Soi 1 165巻 P.173〜 179 1994)、本酵素は非常に分解され易く、単離精製が非常に困難であり、部分アミノ酸配列を決定するのに十分な量すら得ることが困難であった。その後、チオールプロテア一ゼの阻害剤であるトランス一エポキシサクシ二ルーロイシルアミドー（4—グァニジノ）ブタン（trans- ep oxysuccinyl-leucylamido- (4-guanidino) butane (以一 E— 6 4と略す） ) E — 6 4によって本酵素の分解が強く抑制されることがわかってきた（Higuchi et al. Plant&Soi 1 8巻 P. 1〜177 1996 a) 。

今回、液体窒素中で細かい粉状になるまで粉枠した根を、 0. l mMのチォ一ルプロテア一ゼ阻害剤 E— 6 4を含む抽出バッファーと速やかに混合するようにしたところ、ニコチアナミン合成酵素タンパク質を単離することができ、その遺伝子も単離することができた。

さらに、本発明の酵素は、 S D S _ P AG E後に S D Sを除くと活性が回復するが、その回復の程度はかなり低く（Higuchi et al. Plant&Soil 165巻 P. 173 〜 179 1994) 、 S D S— P A G Eを行う前にさらに精製度を上げておく必要があつた。そこでカラムクロマトグラフィーの方法についても改善が行なわれた。また、本発明者らは、本発明の酵素は疎水性が比較的高いため、温和な界面活性剤である C H A P Sをバッファ一に加えることにより、分離能が上昇することを見出した。陰イオン交換クロマトグラフィー担体を何種類か試したところ、 D E AEセファロ一ス F Fと D EA Eセファセルがもっとも効果的であった。

T S Kゲル . ブチルトヨパール 6 5 0 Mに加えて、同じく疎水クロマトグラフィ一担体である T S Kゲル ' エーテルトヨパール 6 5 0 Mが 3 0〜 3 5 k D aの不純物を取り除くために効果的であった。本発明の酵素は、 S D S— P AG E後に S D Sを除くと活性が回復する 3 0〜 3 5 k D aのべプチドであることが報告されているが、活性は 3 0〜 3 5 k D a の間の広い分子量の範囲で検出されていた（第 3図参照）。第 3図は、酵素活性を有する分画における分取 S D S— PAGEの結果を示す。 S D S— PAGEは、 1 1 %アクリルアミドスラブゲルで行った。ゲルの一部をクマシ一プリリアン卜ブルーで染色し、残りを銅染色し 3 0〜 3 5 k D aを 7つに切り分けた（短い線で切った場所を表示）。第 3図の横棒は、各ゲル片から検出された酵素活性を相対表示したものである。

そこで、これらの分子量を有する蛋白質の中から、ニコチアナミン合成酵素べプチドを同定するために、鉄欠乏、及び、対照となるォォムギのそれぞれの根から精製したニコチアナミン合成酵素画分に含まれるペプチドを S D S— PAGE を用いて比較した。それぞれのォォムギの根 2 0 0 gから、後述する実施例 3に記載の方法に従い本酵素を精製した。対照の酵素活性は鉄欠乏の 1 Z 4であった。

本発明の酵素を精製する各段階の活性画分のぺプチド組成を S D S— PAGE で比較したものを、第 2図、第 1 3図、及び、第 1 4図に示す。第 2図、第 1 3 図、及び、第 1 4図は、鉄欠乏のォォムギの根 2 0 0 gからの精製過程（図中

(一）で示す）と、対照のォォムギの根 2 0 0 gからの精製過程（図中（+ ) で示す）との比較を示す。 S D S— PAGEは、 1 2 · 5 %アクリルアミドスラブゲル（Laeramli. Nature 227巻 P.680~ 685 1970) で行った。ゲルは、クマシ一ブリリアン卜ブルーで染色した。第 2図は、 D E A Eセファロ一スの前の段階のもので、上段は鉄欠乏のォォムギの根からのものを示し、下段は対照の根からのものを示す。各レーンの、レーン 1は粗抽出物 2 0 0 μ gのものを、レーン 2はブチルトヨパール 6 5 0 M後のもの 1 0 0 gのものを、レーン 3はヒドロキシルァパタイト後のもの 2 0 gのものを、レーン 4はブチルトヨパール 6 5 0 M後のもの 1 5 のものを示している。第 1 3図は、 D EAEセファロ一ス F F後のもので、各レーン 2 5 gのものである。第 1 4図は、ェ一テルトヨパール 6 5 0 M後のもので、左側は不活性分画を、右側は活性分画を示し、各画分の 1ノ 2 5を泳動させたものである。

この結果から、 D E A Eセファロ一スの前の段階までは鉄欠乏、および対照とでほとんど違いは見られなかった（第 2図参照）。 D EAEセファロース後、 3 0および 3 1 k D aのペプチドが鉄欠乏で誘導されていることがわかった（第 1 3図参照）。エーテルトヨパール後、 3 1 k D aペプチドは活性画分から除かれた。新たに 3 2および 3 3 k D aのべプチドが鉄欠乏で誘導されていることがわかる（第 1 4図参照）。 3 2および 3 3 k D aペプチドからは活性が検出されたが、 3 0 k D aペプチドからは検出されなかった（第 3図参照）。次に、本発明の酵素の分子量をゲルろ過により決定した。

ニコチアナミン合成酵素のゲルろ過により推定された分子量は、 40， 0 0 0 〜 5 0， 0 0 0であると報告されている（Higuchi et al. Plant&Soi 1 165卷 P.173〜 179 1994) 。しかし、これは S D S— P A G Eによる値と一致していな力、つた。

今回、本発明者らは、バッファ一に C H A P Sを加えてゲルろ過を行ったところ分離能が上昇し、本酵素の分子量は 3 5， 0 0 0と推定された（第 4図参照）。これは、以前に S D S— PAGEにより推定された値とよく一致した。

第 4図は、ゲルろ過カラムからのニコチアナミン合成酵素活性の溶出パターンを示す。黒丸印（翁）は酵素活性を示し、実線は 2 8 0 n mの吸光度を示す。ヒドロキシルアパタイト後の活性画分を、展開バッファ一（ 5 0 mM T r i s、 1 mM E D TA、 0. 1 M KC し 0. 0 5 % CHA P S , 0. 1 mM p - A P M S F , 3 mM DTT、 p H 8. 0 ) で平衡化したセフアクリル S 3 0 0 H R (フアルマシア社）カラム（ 1. 5 c mX 7 1 c m、 1 2 5 m l ) に通した。分子量マ一カーは、チログロブリン（M r 6 7 0, 0 0 0 ) 、ァ―グロブリン（ M r 1 5 8 , 0 0 0 ) 、ォブアルブミン（ M r 44， 0 0 0 ) 、ミオグロビン（M r 1 7 , 0 0 0 ) を用いた。線流速 1 0 c mZ時で展開した。精製したニコチアナミン合成酵素から部分アミノ酸配列を決定した。

1 k gの鉄欠乏ォォムギの根より、後述する実施例 3の方法を用いて、前述した 3 0 k D a、 3 2 k D a、および 3 3 k D aのペプチドを精製した。これらを後述する実施例 4の方法を用い部分分解した。 3 2と 3 3 k D aのべプチドは完全には分離できなかったが、配列は互いによく似ているかあるいは 3 2 k D a は 3 3 k D aの分解物であると仮定して一緒に分解した。

決定した部分配列からこれらのペプチドは互いによく似ていることがわかった (第 5図）。また、 3 3 k D a、 3 2 k D a ( 1 ) 断片は分解前の分子量とほとんど変わらない分子量であつたのでこの配列が本酵素の N末端領域であると思われた。コンピュー夕一検索によりこれらの配列とよく似た配列を持つ機能未知の遺伝子が、イネおよびシロイヌナズナにあることがわかった。特にイネの E S T — c DNAクロ一ン D 2 3 7 9 2と D 24 7 9 0は、前者については 3 3ァミノ酸残基の重なりのうち 8 0. 0 %が同一のアミノ酸、後者については 1 9ァミノ酸残基の重なりのうち 6 8. 4 %が同一のアミノ酸で非常によく似ていた（第 5 図）。

第 5図は、ォォムギ由来のニコチアナミン合成酵素から決定した 6つの部分ァミノ酸配列と、コンピュータ一検索により得られたィネの類似の配列とを比較したものである。一致するアミノ酸残基を「：」で示した。 P C Rに使用したブライマ一の配列は矢印で示した部分の塩基配列を利用した。次いで、ニコチアナミン合成酵素 c DNAのクローニングとその塩基配列を決定した。

前述した方法で得られた部分アミノ酸配列からデジエネレイトプライマ一を合成し、鉄欠乏ォォムギ根由来の c DNAに対して P C Rを行ったが、目的の DN Aは増幅されてこなかった。そこでイネの D 2 3 7 9 2と D 24 7 9 0の配列から、単一の塩基配列を持つプライマー（第 5図中に矢印で表示）を合成して P C Rを行った。 N Fおよび NRプライマーを用いた P C Rで 2 0 5 b pの断片が、 I Fおよび I Rプライマ一を用いた P C Rで 2 74 b pの断片が増幅され、これらは目的の配列を含んでいた。 2 0 5 b pの断片をプローブとして、鉄欠乏ォォムギ根ポリ（A) ⁺ RNA由来の c DNAライブラリ一をスクリーニングしたところ 1 9個のクローンが、 2 7 4 b pの断片をプローブとしてスクリーニングしたところ 8 8個のクローンが得られた。

得られたクローンのうち HvNASlと名付けたものは、 9 8 5 b pの翻訳領域を含みそこから推定されるアミノ酸配列は 3 2 8アミノ酸残基で、推定分子量 3 5， 1 4 4であった。この値は S D S — P A G Eやゲルろ過から推定された値とよく一致した。 3 2 k D aおよび 3 3 k D aぺプチドから決定された部分アミノ酸配列は全て HvNASl中に含まれていた（第 6図）。

第 6図は、 HvNASlの c D N Aの全長とそこから予想されるアミノ酸配列を示したものである。下線で示した部分は、前記第 5図の部分配列と一致している部分を示している。その右側に塩基の数を示した。左側にアミノ酸残基の数を示した。予想される p i は、 5. 2で未変性等電点電気泳動による値と一致した。 HvNA SIの他に極めてよく似た配列を持つ 6個のクローン HvNAS2、 HvNAS3、 HvNAS4、 Hv NAS5、 HvNAS6、 HvNAS7が得られた（表 1、第 7図）。

第 7図は、ォォムギから得られた前記の 7つの c D N Aから予想されるァミノ酸配列の比較を示したものである。全てのクローンで一致するアミノ酸残基を Γ *」で示した。

これらのクローンの塩基配列を配列番号 2 (HvNASl) 、配列番号 4 (HvNAS2) 、配列番号 6 (HvNAS3) 、配列番号 8 (HvNAS4) 、配列番号 1 0 (HvNAS5) 、配列番号 1 2 (HvNAS6) 、配列番号 1 4 (HvNAS7) にそれぞれ示す。また、これらのアミノ酸配列を配列番号 1 (HvNASl) 、配列番号 3 (HvNAS2) 、配列番号 5 (Hv NAS3) 、配列番号 7 (HvNAS4) 、配列番号 9 (HvNAS5) 、配列番号 1 1 (HvNAS 6) 、配列番号 1 3 (HvNAS7) にそれぞれ示す。

表 1 n a s クローンの性質

3 0 k D aぺプチドから決定された部分アミノ酸配列は全て HvNAS5に含まれていた。これらのクローンの 5 ' および 3 ' 非翻訳領域は互いに似ていなかった。イネのニコチアナミン合成酵素類似物 D 2 3 7 9 2 と D 2 4 7 9 0は、 HvNAS 1 と約 8 0 %の相同性を示した。シロイヌナズナの A C 0 0 3 1 1 4 と A B 0 0 5 2 4 5は HvNASlと約 4 5 %の相同性を示した。

得られた HvNASlの夕ンパク質を大腸菌で発現させた。

HvNAS 1の O R Fを P C Rで増幅してベクタ一 p MA L— c 2 にクローニングし, HvNASlがマルトースバインディングプロティンの C末端に融合した形で発現するようにした。融合タンパク質は I P T Gにより発現が強く誘導される。

これを用いて形質転換した大腸菌（E . c o l i ) から粗抽出物を得、融合夕ンパク質の状態でニコチアナミン合成酵素活性を測定したところ、ベクターのみでは全く活性は検出されなかったが、 HvNASlの O R Fを導入した場合には活性が検出された。結果を第 8図に示す。

第 8図は、マルトースバインディングプロティン— HvNASl融合蛋白質を発現している大腸菌の粗抽出物のニコチアナミン合成活性を、薄層クロマトグラフィー (T L C ) で検出した結果を示すものである。第 8図のレーン 1 は、標準ニコチアナミド（NA) であり、レーン 2はマルトースバインディングプロテイン（S AM) のみを発現している大腸菌のものであり、レーン 3はマルトースバインデイングプロティンー HvNASl融合蛋白質を発現している大腸菌のものである。

後述の実施例 7で述べる方法によりノーザンハイプリダイゼーション解析を行つたところ、この遺伝子は鉄欠乏の根で強く誘導されていた（第 9図）。これは本酵素活性の発現パターンと一致していた（Higuchi et al, 1994) 。第 9図は、 H vNASlをプローブとしたノーザンハイブリダイゼ一ション解析の結果を示す。全 R NAを、鉄欠乏処理開始後 1週間のものと、対照のォォムギの葉と根から抽出し、各レーンに 5 μ. gの RNAを泳動した。

また、後述の実施例 8で述べる方法によりサザンハイブリダイゼーション解析を行った。 B amH Iあるいは E c o R I あるいは H i n d IIIで DNAを断片化したところ複数の断片が検出されたが、現在得られているどのクローンも B a mH Iおよび E c o R Iでは切断されないので、ニコチアナミン合成酵素遺伝子はォォムギおよびイネのゲノム中で複数コピ一存在するものと思われた（第 1 0 図）。

第 1 0図は、 HvNAS 1をプローブとしたサザンハイブリダィゼ一シヨン解析の結果を示す。ォォムギとイネの葉から抽出したゲノム DNAを B amH I (レーン B ) 、 E c o R I (レ一ン R) 、 H i n d i I I (レーン H) で断片化し、各レーンに 1 0 X gを泳動した。

さらに、後述する実施例 9に述べた方法により調製した抗体を用い、実施例 1 0で述べる方法によりウエスタンブロット解析を行った。本酵素活性を検出するために調製した粗抽出物中では、本酵素タンパク質は操作中に速やかに分解されることがわかった（第 1 1図）。この染色パターンは本酵素活性が S D S— P A G E後に 3 0〜 3 5 k D aの間に広がって検出されること（第 3図参照）と一致した。

第 1 1図は、活性検出に用いた粗酵素試料のウエスタンプロット解析の結果を示す。 S D S— PAGEは、 1 2. 5 %アクリルアミドスラブゲルで行った。 1 0 0 I gのタンパク質を泳動した。

後述する実施例 1 0に述べる方法によりタンパク質を変性させて得られた粗抽出物中では、 3 5〜 3 6 k D aのほぼ単一のバンドとして検出された（第 1 2 図）。この値はアミノ酸配列から予想された値とよく一致した。

第 1 2図は、トリクロ口酢酸/アセトンで抽出した全タンパク質のウエスタンプロット解析の結果を示す。 S D S— P AG Eは 1 2. 5 %アクリルアミドスラブゲルで行った。 1 0 0 gのタンパク質を泳動した。根については 2 0 0 g、葉については 5 0 O gの夕ンパク質を泳動した。

2次元電気泳動を行った後ウェスタンプロット解析を行ったところ数個のスポットが検出された。このことは複数のニコチアナミン合成酵素遺伝子が得られたことと一致していた。どのスポットも鉄欠乏の根で誘導されていた。

また、 HvNASlを制限酵素 ApaLIと Xholで切り出した断片をプローブとして、鉄欠乏イネ根ポリ（A) + R N A由来の cDNAライブラリーをスクリーニングしたところ、 2 0個のクローンが得られた。これらのクローンは配列から 3種類に分けられ、そのうち 1種類だけが 0 R F全長を含んでおり、これを OsNASlと名付けた。 OsNASlの塩基配列を配列番号 1 6に、アミノ酸配列を配列番号 1 5に示す。

OsNASlの O R Fを P C Rで増幅してベクタ一 P MAL— C 2にクロ一ニングし、 OsNASlがマルト一スバインディングプロテインの C末端に融合した形で発現するようにした。融合タンパク質は I P T Gにより発現が強く誘導される。

これを用いて形質転換した大腸菌（E. coli) から粗抽出物を得、融合タンパク質の状態でニコチアナミン合成酵素活性を測定したところ、 HvNASlと同様に活性が検出された。結果を第 1 5図に示す。第 1 5図はマルトースバインディングブ口ティン - OsNASl融合タンパク質を発現している大腸菌の粗抽出物のニコチアナミン合成活性を、 T L Cで検出した結果を示すものである。第 1 5図のレーン 1 は標準ニコチアナミン（NA) であり、レーン 2はマルト一スバインディングプ口ティン - OsNASl融合タンパク質を発現している大腸菌のものであり、レーン 3 はマルト一スバインディングプロテイン - HvNASl融合タンパク質を発現している大腸菌のものである。

後述の実施例 7で述べる方法によりノーザンハイプリダイゼーション解析を行つたところ、ォォムギとは違い、イネでは鉄欠乏処理により根だけでなく葉でも発現が誘導されていた（第 1 6図）。第 1 6図は OsNASlの 0RFをプローブとしたノ —ザンハイブリダィゼーシヨン解析の結果を示す。全 R NAを、鉄欠乏処理開始後 2週間のものと、対照のイネの葉と根から抽出し、各レーンに 5 gの RNAを泳動した。

コンピューター検索によって得られた HvNASlに似たァラビドプシス（シロイヌナズナ）の塩基配列をプライマーとして、シロイヌナズナのゲノム DNAに対して P C Rを行い、シロイヌナズナのニコチアナミン合成酵素遺伝子を 3つ得た。これを AtNASl、 A AS 2、 AtNAS3 とした。

これらの遺伝子の塩基配列を配列番号 1 8 (AtNASl) 、配列番号 2 0 (AtNAS 2 ) 、配列番号 2 2 (AtNAS3 ) にそれぞれ示す。またこれらのアミノ酸配列を配列番号 1 7 (AtNASl) 、配列番号 1 9 (AtNAS 2 ) 、配列番号 2 1 (AtNAS 3 ) にそれぞれ示す。

AtNASK AtNAS 2 , A t NAS 3の 0RFを PCRで増幅してベクタ一 pMAL- c 2にクロ一ニングし、それぞれがマルトースバインディングプロテインの C末端に融合した形で発現するようにした。融合タンパク質は IPTGにより発現が強く誘導される。

これを用いて形質転換した大腸菌（E. coli) から粗抽出物を得、融合タンパク質の状態でニコチアナミン合成酵素活性を測定したところ、活性が検出された。結果を第 1 7図に示す。第 1 7図はマルト一スバインディングプロテイン - AtNA S融合タンパク質を発現している大腸菌の粗抽出物のニコチアナミン合成活性を、 TLCで検出した結果を示すものである。第 1 7図のレーン 1 は標準ニコチアナミド (NA)と S - アデノシルメチォニンであり、レーン 2はマルト一スバインディングプロテインのみを発現している大腸菌のものであり、レーン 3はマルト一スバインデイングプロテイン ― At NASI融合タンパク質を発現している大腸菌のものであり、レーン 4はマルト一スバインディングプロテイン - AtNAS 2融合タンパク質を発現している大腸菌のものであり、レーン 5はマルトースバインディングプロティン - AtNAS 3融合タンパク質を発現している大腸菌のものである。

後述の実施例 1 1で述べる方法により RT- PCRを行ったところ、 AtNASlはシロイヌナズナの根と地上部で発現しており、 AtNAS 2は根でも地上部でも発現しておらず、 AtNAS 3は根のみで発現していた（第 1 8図）。第 1 8図のレーン Mは分子量マ一力一であり、地上部、根及び陽性コントロールについて行った。各部について、レーン Cは AtNASlおよび AtNAS 2の ORF全長を増幅したものであり、レーン 1 は AtNASl特異的な増幅断片であり、レーン 2は AtNAS2特異的な増幅断片であり、レーン 3は AtNAS 3特異的な増幅断片である。

ムギネ酸類の分泌量は根乾燥重量 1 gあたり 1 日に 2 0 m gに達する（Takagi 1993)。本発明者らが検出した粗精製ニコチアナミン合成酵素活性はこれをまかなうのに足りるものであった。本酵素タンパク質が数種類以上存在していること, および活性のない 3 0 k D aぺプチドが存在していることから、これらのぺプチドが会合することにより、 3分子の S—アデノシルメチォニンを結合するのに適した構造となり最大の活性を示す、ということも考えられる。しかしゲルろ過により推定された分子量は 3 5， 0 0 0であった（第 4図）。

また、サブュニッ卜が再会合したことによる活性の上昇は現在までのところ観察されていない。さらにマルト一スバインディングプロテインとの融合タンパク質の状態でも活性を示したことから、本発明者らは、今のところ本酵素は単量体であると考えている。しかしならが、多量体を形成してより大きな活性を示すという可能性が完全に否定されているわけではない。

S—アデノシルメチォニンからニコチアナミンを合成する反応機構は、 S—ァデノシルメチォニンをメチル基供与体とするメチル基転移反応や、脱炭酸 S—ァデノシルメチォニンからスペルミジンゃスペルミンを合成する反応と似ていると思われる。これらの酵素に共通の触媒部位についてはタンパク質の高次構造中での等価なアミノ酸残基の配置の類似性が論じられている（Hashimoto et al. 199 8, Schluckebier et al. 1995) 。

将来、他の植物種のニコチアナミン合成酵素とのアミノ酸配列の比較や X線結晶構造解析から触媒部位が明らかになるであろう。

鉄欠乏によるニコチアナミン合成酵素活性の誘導はイネ科植物に特有の現象であり、ムギネ酸類の大量生合成のために必須である。イネは主要なイネ科作物の中でムギネ酸類の分泌量がもっとも少なく、石灰質土壌での鉄欠乏に非常に弱い < したがって、本発明のニコチアナミン合成酵素の遺伝子をイネ科植物、特にィネに導入し、鉄欠乏時に大量に発現させるようにして鉄欠乏耐性のある形質転換イネを作出することにより、石灰質土壌でのィネの栽培が可能となる。ィネ科植物においてはこれまで、ニコチアナミンはムギネ酸類を合成する前駆体としての役割しか考えられていなかつたが、本発明によりニコチアナミン合成酵素の遺伝子は多重遺伝子族を形成していることが明らかになったことから、ィネ科植物においても他に重要な役割をはたしていることが考えられる。

イネ科以外のムギネ酸類を分泌しない植物では、ニコチアナミンは体内で、 F e C u ^{2 +}、 Z n ^{2 +}、 M n ^{2 +}といった 2価金属陽イオンのキレ一夕一として働き、これらの金属の恒常性の維持に貢献するのではないかといわれており（S t ep h an e t a l . 1 994) 、イネ科植物でも同様の役割をはたしていることが考えられるまた、ニコチアナミン合成酵素活性は双子葉植物では、鉄欠乏により誘導されず、本発明の遺伝子の発現も鉄欠乏で誘導されないものと思われる。本発明者らは、シロイヌナズナのニコチアナミン合成酵素遺伝子をクローン化している。これらの遺伝子のプロモータ一領域を比較することにより鉄欠乏による遺伝子発現の機構が明らかにされることにより、本発明の遺伝子がィネ科植物のみならず、双子葉植物においても重要な機能を果たすことになるであろう。

配列表の配列番号 1 に本発明のニコチアナミン合成酵素のアミノ酸配列を示す。本発明のニコチアナミン合成酵素は、配列番号 1 に示されるアミノ酸配列を有するもののみならず、ニコチアナミン合成酵素の活性を失わない限り、これらのアミノ酸配列の一部、好ましくは全アミノ酸の 5 0 %以下、より好ましくは 3 0 %以下、さらに好ましくは 1 0 %以下のアミノ酸が欠失してもよいし、他のアミノ酸で置換されていてもよいし、若しくは、他のアミノ酸が更に付加していてもよいし、又は、これらの欠失、置換、付加が組み合わされていてもよい。

また、配列表の配列番号 2に本発明のニコチアナミン合成酵素をコードする塩基配列を示す。

本発明のニコチアナミン合成酵素をコードする遺伝子は、配列番号 2に示される塩基配列を有するもののみならず、前記したニコチアナミン合成酵素をコードする遺伝子を包含するものである。

本発明の前記遺伝子を導入するべクタ一としては、特に制限はないが、種々のべク夕一に導入することが可能である。好ましいベクタ一としては発現ベクターが挙げられる。本発明の組換えベクターを用いて種々の細胞を常法に従って形質転換することができる。得られた形質転換体を用いてニコチアナミドを大量に製造することができる。これらの方法は当業者によく知られている方法により行うことができる。本発明の前記遺伝子を導入する宿主としては、各種の細菌類、酵母、細胞類などが挙げられる。好ましくは、植物が挙げられ、特にイネ科植物が好ましい。遺伝子を導入する方法としては、特に制限はなく、ベクタ一を使用してもよいし、ゲノムに直接導入してもよい。

本発明のニコチアナミン合成酵素に対する抗体は、常法により本発明のニコチアナミン合成酵素を用いて製造することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもよく、必要ならば、モノクローナル抗体とすることもできる。

さらに、本発明の遺伝子を用いて、植物、好ましくはイネ科植物の品種の改良を行うこともできる。特に、鉄分が欠乏している土壌においても生育できる品種に改良するために、本発明の遺伝子を利用することができる。実施例

以下に本発明をより具体的に説明するたに実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例 1 (植物材料の調製）

ォォムギ（Hordeum vulgare L, cv ェヒメハダ力 1号）を湿らせた濾紙の上で発芽させてから標準的な水耕液（Mori and Nishizawa 1987) を用いて、自然光のもと、空調設備のない温室で成育させた。水耕液の P H値は、 0. 5 N H C 1 を用いて毎日 5. 5に合わせた。第 3葉が展開したとき鉄を除いた水耕液に移した。水耕液の p H値は、 0. 5 N N a OHを用いて毎日 7. 0 に合わせた。対照区は引き続き標準的な水耕液で成育させた。水耕液は 1週間に 1回更新した。鉄欠乏処理開始後 2週間以降に第 4、 5葉に顕著に鉄欠乏ク口口シス症状が現れたところで根を採取し、液体窒素で瞬間的に凍結させ、 — 8 0 °Cで使用時まで保管した。実施例 2 (ニコチアナミン合成酵素活性の測定）

すでに本発明者らが発表した測定方法（Higuchi et al. 1996a) を改善した方法を用いた。酵素液を反応バッファ一（5 0 mM T r i s 、 1 mM E D TA、 3 mM ジチオスレイト一ル（di thiothrei tol) (以下、 D T Tと略す）、 1 0 // M ( P—アミジノフエニル）メタンスルホニルフルオライド（（p-araidinopheny 1) methanesul fonyl fluoride) (以下、 p— A P M S Fと略す）、 1 0 M トランス一エポキシサクシ二ルーロイシルアミド一（ 4一グァニジノ）ブタン（tr ans-epoxysuccinyl-leucylamido-(4-guanidino) butane) (以下、 E - 6 4 t す）、 p H 8. 7 )でバッファー交換した。ノッファー交換には限外ろ過フィルタ一ユニット、ウルトラフリー C 3 L G C NMWL 1 0 0 0 0 (ミリポア社）を用いた。カルボキシル基が¹⁴ Cで放射能標識された S —アデノシルメチォニン (アマシャム社）を、終濃度 2 0 μ Mとなるように添加し、 1 5分間 2 5 °(：に保った。反応生成物をシリカゲル L K 6 (ワットマン社）を用い展開溶媒（フエノール： n—ブ夕ノール：ギ酸：水 = 1 2 ： 3 ： 2 ： 3 ) で薄層クロマトグラフィーにて分離した。反応生成物の放射活性はィメージアナライザー B A S - 2 0 0 0 (フジフィルム社）で検出した。タンパク質量はブラッドフォード法によるプロティンアツセィキット（バイオラッド社）を用いて測定した。実施例 3 (ニコチアナミン合成酵素の精製）

以下の操作はすべて 4 °Cで行い、ニコチアナミン合成酵素を含む画分には終濃度 1 0 Mとなるように E— 6 4を添加した。

凍結した根を液体窒素中で粉状になるまで粉枠し、根 1 0 0 gあたり 2 0 0 m 1 の抽出ノッファー（ 0. 2 M T r i s 、 1 0 mM E D TA、 5 % (v/ v ) グリセリン（glycerol) 、 1 0 mM D T T、 0. 1 mM E— 6 4、 0. 1 mM p— A P M S F、 5 % ( w v ) 不溶性ポリビニルピロリドン（ po 1 yv i nylpyrrol idone) (P V P ) 、 p H 8. 0 ) を加えて家庭用ジューサーミキサーを用いて混合した。これを、 2 2， 5 0 0 X g 3 0分間で遠心分離し上清を得た。これに硫酸アンモニゥムを終濃度 0. 4 Mとなるように加え、 1時間静置した。再度 2 2， 5 0 0 X g 3 0分間で遠心分離し上清を得た。 T S Kゲル · ブチルトヨパール 6 5 0 Μカラム（東ソ一社、根 1 0 0 gあたり力ラム体積 1 0 m l ) を吸着バッファ一（2 0 mM T r i s、 1 mM E D T A、 3 mM DTT、 0. 4 M (NH₄) ₂S O 0. 1 mM p - APMS F、 p H 8. 0 ) で平衡化したものに遠心分離上清を通しニコチアナミン合成酵素を吸着させ、溶出バッファ一（ 1 0 mM T r i s、 l mM EDTA、 3mM DTT、 0. 1 mM p— APM S F、 5 %グリセリン（glycerol) 、 0. 0 5 % 3 - [ ( 3—クロラミドプロピル）ジメチルーアンモニォ] プロパンスルホン酸 (3-[(3-cholamidopropyl) dimethyl-ammonio] propanesul fonic acid) (以下. CHAP Sと略す）、 p H 8. 0)で溶出した。

このニコチアナミン合成酵素を含む溶出画分に、塩化力リゥムを終濃度 1 0 m Mとなるように、 1 Mリン酸カリウムバッファー（P H 8 ) を終濃度 I mMとなるように加えた。吸着バッファー（ I mM K— P、 1 0 mM KC 1 、 3 mM DTT、 0. I mM p— APM S F、 p H 8. 0 ) で平衡化したヒドロキシルアパタイト 1 0 0〜 3 5 0メッシュ（ナカライ社）をタンパク質 l O O mgあたり 1 0m l用意し、これにニコチアナミン合成酵素を含む画分を通した。ニコチァナミン合成酵素は吸着されずにそのまま出てきた。

この素通り画分をすでに述べたように T S Kゲル · ブチル卜ョパール 6 5 0 M カラム（タンパク質 1 0 m gあたりカラム体積 1 m 1 ) に吸着させ、ニコチアナミン合成酵素を溶出した。

吸着バッファ一（ 2 0 mM T r i s、 1 mM EDTA、 3 mM DTT、 0. I mM p—APMS F、 0. 0 5 % CHAP S、 p H 8. 0 ) で平衡化した D EAEセファロ一ス F Fカラム（フアルマシア社、タンパク質 2 5mg あたりカラム体積 5m l ) にこのニコチアナミン合成酵素を含む溶出画分を通し、塩化カリウム濃度 0. 0 5 M， 0. 1 M, 0. 1 5 M, 0 · 2 Mで段階溶出した。ニコチアナミン合成酵素は 0. 1 5 Mで溶出された。

T S K ゲル ' エーテルトヨパール 6 5 0 Mカラム（東ソ一社、根 1 0 0 gあたりカラム体積 1 0 m l ) を吸着バッファー（2 0mM T r i s、 l mM E DTA、 3 mM DTT、 1. 2 M (NH₄) ₂S O 0. 1 mM p— APMS F、 p H 8. 0 ) で平衡化したものにこのニコチアナミン合成酵素を含む溶出画分を通した。ニコチアナミン合成酵素は吸着されずにそのまま出てきた。これをそのまますでに述べたように T S Kゲル ' プチル卜ョパール 6 5 0 Mカラムに吸着させ、ニコチアナミン合成酵素を溶出した。

以上のカラムクロマトグラフィーにより精製されたニコチアナミン合成酵素を含む画分中のペプチドをさらに、 1 1 %アクリルアミドゲルを用いてドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下 S D S— PAGEと略す）により分離した。 S D S— PAGE終了後、ゲルを 0. 3 M 塩化銅で染色し（Dzandu et al. 1988 )分離したペプチドのバンドを切りだした。このゲル片を

0. 2 5 M E D T A/ 0. 2 5 M T r i s ( p H 9. 0) で脱色し、抽出バッファ一（ 1 % S D S、 2 5 mM T r i s、 1 9 2 mM グリシン（g l yc ine)と共にすりつぶした。これを S D Sを含まないバッファ一（ 2 5mM T r

1 s、 1 9 2 mMグリシン（glycine)) を用いて電気抽出し、ペプチドを回収した, 実施例 4 (部分アミノ酸配列の決定）

単離したニコチアナミン合成酵素を、臭化シアンを用いて化学分解した（Gros s 1967) 。

S D S— P AGE終了後、ニコチアナミン合成酵素を含むゲル片に 1 0倍体積の 7 0 % ( V / V ) ギ酸、 1 % (w/v) 臭化シアンを加え 4 X：で 1晚かけて分解した。分解終了後、液体部分を回収し、減圧乾固した。これを S D S— P AG E用試料バッファーに溶かし、 1晚室温においた後、トリシンを含む 1 6. 5 % アクリルアミドゲルを用いた S D S— P A G E (Schagger and Jago , 1987) で、分解産物を分離した。泳動終了後 PVD F膜にペプチドを転写し（Towbin et al.

1979) アミドブラックで染色した。染色されたバンドを切り分け、エドマン分解気相シーケンサ一（モデル 4 9 2 Aプロテインシーケンサー、アプライドバイオシステムズ社）により、各ペプチドの N末端側からアミノ酸配列を決定した。実施例 5 (ニコチアナミン合成酵素遺伝子のクローニング）

得られた部分アミノ酸配列に基づいて合成したブライマ一を用い、鉄欠乏ォォムギ根由来の c DNAに対して P C Rを行った。得られた DNA断片をランダムプライマーキット（宝酒造）により [a- ³²P] d AT Pで放射能標識したものをプローブとして、鉄欠乏ォォムギ根ポリ（A) +RN Aから調整した p YH 2 3 c DNAライブラリ一をスクリーニングした。単離した c DNAクローンについてサイクルシークェンシングキット（島津分光）および島津 DN Aシーケンサ一 D S Q- 1 0 0 0 Lを用いて塩基配列を決定した。

HvNASlを制限酵素 ApaLIと Xholで切り出した断片をプローブとして、鉄欠乏イネ根ポリ（A) +RNA由来の cDNAライブラリ一をスクリーニングした。単離した cDNAクローンについてサイクルシークェンシングキット（島津分光）及び島津 DNAシ一ケンサー DSQ- 2000Lを用いて塩基配列を決定した。シロイヌナズナの AC 0 0 3 1 1 4と AB 0 0 5 2 4 5の塩基配列に基づいて合成したプライマ一を用い、シロイヌナズナのゲノム DNAに対して P C Rを行つた。得られた DNA断片についてサイクルシークェンシングキット（島津分光）および島津 DNAシーケンサ一 D S Q— 1 0 0 0 Lを用いて塩基配列を決定した。

決定された塩基配列を配列表の配列番号 2に示す。実施例 6 (N A S 1タンパク質の大腸菌での発現）

P C Rにより、 HvNAS 1 c DNAの最初の ATGの上流に E c o R Iサイトを、終止コドンの下流に P s t Iおよび B amH Iサイトを導入した断片を増幅した。まず得られた増幅産物を E c o R Iサイ卜と B amH Iサイトを用いて p B 1 u e s c r i p t I I S K—にサブクロ一ニングし、塩基配列が正しいことを確認した。次に E c o R Iサイトと P s t Iサイトを用いて pMAL _ c 2にクロ一二ングし、 HvNASlがマルト一スパインディングプロティンの C末端に融合した形で発現するようにした。

PCRにより、 OsNASlの最初の ATGの上流に EcoRIサイトを、終止コドンの下流に H indlllサイ卜を導入した断片を増幅した。まず得られた増幅産物を EcoRIサイ卜と Hindlllサイトを用いて pBluescriptll SK-にサブクローニングし、塩基配列が正しいことを確認した。次に EcoRIサイ卜と Hindi Πサイトを用いて pMAL- c2にク口一ニングし、 OsNASlがマルト一スバインディングプロテインの C末端に融合した形で発現するようにした。

PCRにより、 AtNASl、 AtNAS2、 A t NAS 3の最初の ATGの上流に EcoRIサイトを、終止コドンの下流に Xbalサイトを導入した断片を増幅した。まず得られた増幅産物を EcoRIサイ卜と Xbalサイトを用いて pBluescriptl I SK-にサブクローニングし、塩基配列が正しいことを確認した。次に EcoRIサイ卜と Xbalサイトを用いて pMAL - c2にクローニングし、 AtNASl、 AtNAS2、 At NAS 3がそれぞれマルトースバインデイングプロティンの C末端に融合した形で発現するようにした。この融合タンパク質を発現させる宿主として大腸菌（E. coli strain X L 1 - B l u e ) を用いた。 p M A L _ c 2— HvNASlと p M A L— c 2をそれぞれ X L 1 一 B 1 u e に導入し、アンピシリンとテトラサイクリンをそれぞれ 5 0 g Z m 1 含む L B培地で O D 6 0 0が 0 · 5になるまで 3 7でで培養した。ィソプロピル i3— D—チォガラクトビラノシド（ I P T G) を、終濃度 0. 3 mMとなるように添加し、引き続き 3 7 °Cで培養し 3時間後に集菌した。菌体を 0. 2 M N a C l 、 1 mM E D TA、 3 mM D TT、 0. 1 mM E— 6 4を含む 1 O mM トリスバッファ一 p H 7. 4に懸濁し液体窒素で凍結した。これを氷水中で融解し 1 5秒間の超音波処理を 1 0回行った。得られた粗抽出物のニコチアナミン合成酵素活性を実施例 2で述べた方法で測定した結果、酵素活性が確認された。実施例 7 (ノーザンハイブリダィゼーシヨン）

HvNASl c D NAを、 H i n d i I I と N o t I で切断した D NA断片を [ α -³²Ρ] d AT Ρで放射能標識したものをプローブとしてノーザンハイプリダイゼ一シヨンを行った。ォォムギから全 R Ν Αを抽出し（Naito et al. 1988) 、 1 . 4 % ァガロースゲル電気泳動により分離した後、ハイボンド一 N+ 膜（アマシャム社）に転写した。 OsNASlの 0RF部分を [ a- ³²P] dATPで放射能標識したものをプローブとしてノーザンハイブリダィゼ一シヨンを行った。ィネから全 RNAを抽出し 1. «ァガロースゲル電気泳動により分離した後、ハイボンド -N+ 膜（アマシャム社）に転写した。膜を 0. 5 M チャーチリン酸（Church and Gilbert 1984) 1 mM EDTA、 7 % (w/ v ) S D S、 1 0 0 g Zm 1サケ精巣 D N Aを含むバッファーを用いて 6 5 °C 1晚でプローブとハイプリダイズした。これを 4 OmMチャーチリン酸、 1 % (w/ V ) S D Sを含むバッファ一を用いて 6 5°C 1 0分間洗浄した。この洗浄をもう 1回行った後、 0. 2 x S S P E、 0. 1 % (wノ V ) S D Sを含むバッファーを用いて 6 5 °C 1 0分間洗浄した。放射活性はイメージアナライザー BAS— 2 0 0 0で検出した。

結果を第 9図及び第 1 6図に示す。実施例 8 (サザンハイブリダィゼーシヨン）

ォォムギとイネの葉からそれぞれゲノム DNAを抽出した。これを B amH I、あるいは E c 0 R I、あるいは H i n d I I Iで断片化し、 0. 8 % (w/ v ) ァガロースゲル電気泳動で分離した後、ハイボンド一 N+膜（アマシャム社）に転写した。実施例 7で述べた方法でハイブリダィズし、放射活性を検出した。

結果を第 1 0図に示す。実施例 9 (ポリクローナル抗体の調製）

ネズミ 2匹を約 1 0 0 / gの単離したニコチアナミン合成酵素を抗原として免疫した。抗原としては部分アミノ酸配列を決定したものと同じ試料を用いた。 1 回目の免疫時には完全フロイントアジュバント、 2回目以降は不完全フロイン卜アジュバントを用いた。 4回免疫した後、全採血を行い、血清を— 8 0 °Cで保存した。実施例 1 0 (ウエスタンプロット解析）

トリクロ口酢酸とアセトンを用いて全タンパク質を抽出した（Damerval et al. 1986) 。植物体を液体窒素中で粉状になるまで粉砕し、 1 0 % (w/ V ) トリクロロ酢酸、 0. 1 % ( V / V ) 2—メルカプトエタノール（2- mercaptoetlianol) を含むアセトンと混合した。 — 2 0 で 1時間静置してタンパク質を沈殿させた後、 1 6， 0 0 0 x g 3 0分遠心して沈殿を回収した。沈殿を 0. 1 % ( Vノ v ) 2 —メルカプトエタノール（2 - mercaptoethanol) を含むアセトンに懸濁し、 — 2 0でで 1時間静置してタンパク質を沈殿させた後、 1 6， O O O x gで 3 0 分遠心して沈殿を回収した。沈殿を減圧乾燥した後、試料バッファ一（ 9. 5 M 尿素（urea) , 2 % (w/ v ) トリトン一 X— 1 0 0 (Tri ton X-100) , 5 %

( V / V ) 2 — M E ) に溶かし、 1 6 , 0 0 0 X g 1 0分遠心して上清を得た。これに含まれるタンパク質を S D S — P A G E、あるいは変性 2次元電気泳動

(O' Farrel l 1975) で分離した後、 P VD F膜に転写した。この膜に対して、実施例 9で調製した抗ニコチアナミン合成酵素抗体を 1次抗体、西洋ヮサビペルォキシダ一ゼ結合抗マウス I g G (H + L ) ャギ抗体（和光純薬）を 2次抗体として、ジァミノべンジジンで発色しウエスタンブロット解析を行った。

結果を第 1 2図に示す。 S D S — P A G Eは 1 2. 5 %アクリルアミドスラブゲルで行った。 1 0 0 gのタンパク質を泳動した。根については 2 0 0 g、葉については 5 0 0 β gのタンパク質を泳動した。

実施例 11 (RT-PCR)

シロイヌナズナから全 RNAを抽出し、その 1 gを錡型として EZ rTth RNA PCR キット（パーキンエルマ一社）を用いて RT- PCRを行った。プライマ一は AtNASし AtNAS 2 , AtNAS 3それぞれに特異的なものを用いた。結果を第 1 8図に示す。産業上の利用可能性

本発明の組換えべクタ一を用いて種々の細胞を常法に従って形質転換することができ、得られた形質転換体を用いてニコチアナミドを大量に製造することができる。これらの方法は当業者に知られている方法により行うことができる。

また、本発明の遺伝子を用いて、植物、好ましくはイネ科植物の品種の改良を行うこともできる。特に、鉄分が欠乏している土壌においても生育できる品種に改良するために、本発明の遺伝子を利用することができる。

Claims

請求の範囲

1. 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列、又は、その一部のアミノ酸が欠失、他のアミノ酸で置換、若しくは他のアミノ酸が付加されてなるアミノ酸配列を有するニコチアナミン合成酵素。

2. ォォムギ由来のものである請求の範囲第 1項に記載のニコチアナミン合成酵素。

3. 配列表の配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1又は 1 3に示されるアミノ酸配列を有する請求の範囲第 1項又は第 2項に記載のニコチアナミン合成酵素。

4. ァラビドプシス由来のものである請求の範囲第 1項に記載のニコチアナミン合成酵素。

5. 配列表の配列番号 1 7、 1 9又は 2 1に示されるアミノ酸配列を有する請求の範囲第 1項又は第 4項に記載のニコチアナミン合成酵素。

6. イネ由来のものである請求の範囲第 1項に記載のニコチアナミン合成酵素。

7. 配列表の配列番号 1 5に示されるアミノ酸配列を有する請求の範囲第 1項又は第 6項に記載のニコチアナミン合成酵素。

8. 請求の範囲第 1 ~ 7項のいずれかに記載されるニコチアナミン合成酵素のァミノ酸配列をコ一ドする遺伝子。

9. 遺伝子が c DNAである請求の範囲第 8項に記載の遺伝子。

1 0. 配列表の配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2又は 1 4に示される塩基配列を有する請求の範囲第 8項又は第 9項に記載の遺伝子。

1 1. 配列表の配列番号 1 8、 2 0又は 2 2に示される塩基配列を有する請求の範囲第 8項又は第 9項に記載の遺伝子。

1 2. 請求の範囲第 8〜 1 1項のいずれかに記載の遺伝子を含有してなるベクタ

1 3. ベクターが発現べクタ一である請求の範囲第 1 2項に記載のベクタ一。

1 4. 請求の範囲第 1 2項又は第 1 3項に記載されたべクタ一で形質転換された形質転換体。

1 5. 外来遺伝子が、配列表の配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 2 0又は 2 2に示される塩基配列を有する遺伝子である請求の範囲第 1 4項に記載の形質転換体。

1 6. 宿主が細菌類である請求の範囲第 1 4項又は第 1 5項に記載の形質転換体,

1 7. 宿主が高等植物細胞である請求の範囲第 1 4項又は第 1 5項に記載の形質転換体。

1 8. 請求の範囲第 1 4〜 1 7項のいずれかに記載された形質転換体を用いて二コチアナミンを製造する方法。

1 9. 請求の範囲第 8〜 1 0項のいずれかに記載の遺伝子が導入された植物。

2 0. 種子である請求の範囲第 1 9項に記載の植物。

2 1. 請求の範囲第 1 9項又は第 2 0項に記載の植物を生育して得られた果実。

2 2. 請求の範囲第 1〜 7項のいずれかに記載のニコチアナミン合成酵素に対する抗体。

2 3. ポリクローナル抗体である請求の範囲第 2 2項に記載の抗体。

24. モノクローナル抗体である請求の範囲第 2 2項に記載の抗体。

2 5. 植物からニコチアナミン合成酵素を抽出する際に、チオールプロテアーゼ阻害剤の存在下に行うことを特徴とするニコチアナミン合成酵素を抽出する方法。

2 6. チオールプロテアーゼ阻害剤が E— 64である請求の範囲第 2 5項に記載の方法。