WO1999061648A1

WO1999061648A1 - Procede de production de l-ribose

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Publication number: WO1999061648A1
Application number: PCT/JP1999/002793
Authority: WO
Inventors: Tomoko Kawaguchi; Mari Hara; Makoto Ueda
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1998-05-27
Filing date: 1999-05-27
Publication date: 1999-12-02
Anticipated expiration: 2000-11-27
Also published as: EP1083234A9; US6348326B1; JP3890744B2; EP1083234B1; EP1083234A4; EP1083234A1; DE69942542D1; JPH11332592A

Description

明細書

Lーリボースの製造方法技術分野本発明は、安価な糖を出発原料とした多段階の生物反応による L—リボースの製造方法に関する。従来の技術近年、非天然型の糖類は医薬及び農薬の中間原料として注目されている。リボ —スに関しては天然型の D体は D N Aの構成糖としては勿論、種々のビタミンゃ補酵素の構成糖として全生物界に豊富に分布しているにもかかわらず、非天然型の L体はほとんど供給の目処が立っていないのが現状である。現在知られている Lーリボースの主な生産方法としては、 L—ァラビノースを原料としたコバルト触媒による合成法が挙げられる。一方、微生物を用いて L—リボースを生産する方法としてはァシネト/ クタ一 ·力ノレコアセティカス（Acinetobacter calcoace ticus ) D L— 2 8株の産出する酵素が L—リブロースを異性化し、 L—リボースを生産することが唯一報告されている（Journal of Fermentation and Bioeng ineering Vol. 81, No. 6, 493-497. 1996) 。

上記の酵素反応の原料である L—リブロースの製造方法としては、 Lーァラビノースイソメラーゼによる Lーァラビノースの異性化による方法（Methods Enzy m. Anal. (3rd Ed. ) (1984) vol. 6 442-449) と、精製されたリビトールを原料とした微生物反応により製造する方法（Biochem. J. vol. 64 : 385, 1956) が知られているが、両方法とも原料である L—ァラビノースとリビトールは安価とは言い難く、工業的規模で安定的に Lーリブロースを供給するプロセスまでは報告されていない。

上記 2通りの Lーリブロース生産方法の一方の原料であるリビトールの微生物による製造方法として D—リボースを原料として酵素反応により製造する方法 (特公昭 4 5 - 2 0 7 1号公報、特公昭 4 9 - 1 2 7 1 8号公報）、グルコースなどの発酵により製造する方法（特公平 6 - 3 0 5 9 1号公報、特公平 6 - 3 0 5 9 2号公報、特公平 6— 3 0 5 9 3号公報、特公平 6— 3 0 5 9 4号公報）、及ぴ藻類の炭酸固定による方法（特公昭 4 4一 1 6 3 5 0号公報）が報告されている。

しかしながら、上記のいずれの技術を組み合わせても、工業的規模で L—リボ —スを生産するに至ってはおらず、従って、工業的規模で L—リボースを製造し、かつ生産された Lーリボース含有液から Lーリボースを高純度、高収率で単離精製する技術は全く知られていなかった。

実際に従来の方法を用いて工業的規模で Lーリボースを生物学的に生産しょうとした場合、種々の問題点が生じる。つまり第 1段階である、リビトールを製造するに当たって、従来法の中では安価な原料であるグルコースなどの発酵による方法が望ましいが、この従来法でもエリスリトールなどの他の糖アルコールは効率的に製造できても、リビトールに関しては必ずしも満足のいく生産性を得られてはいない。

第 2段階である、リビトールを L—リブロースに変換する技術に関して、従来法では原料のリビトールは精製されたものでなければならなかった。結晶リビト —ルは原料としては極めて高価である。また上述の発酵リビトールを利用する場合には、エリスリトールゃグリセロールといったポリアルコールが多く含まれ、この中から収率よくリビトールのみを分離精製することは極めて困難であった。そこで、工業的に安価に L一リブロースを生産するために、リビトールを含有する発酵液または粗精製リビトールからリビトールを精製することなく直接 L—リブロースに変換させる方法が望まれていた。

また、リビトールの代わりに L—ァラビノースを原料とする場合であっても、 Lーァラビノースは安価とはいえず、 Lーリブロースの収率も低い。

第 3段階である、 L—リプロ一スを L—リボースに変換する反応においても、従来の技術では原料の L—リブロースは精製されたものである必要があった。精製 L—リブロースは極めて高価な原料であり、上述の Lーリブロース含有液から単離精製することは極めて困難であった。そこで目的物質である Lーリボースを工業的規模で安価に生産するために、リビトールを含有する発酵液または粗精製リビトールからリビトールを精製することなく直接 L一リブロースに変換させ、さらにその L—リブロース含有反応液から Lーリブロースを精製することなく直接 Lーリボースに変換する方法が望まれていた。

一方、多段階生物反応による夾雑物の極めて多い L—リボース含有液からの L 一リボースの単離精製法は全く知られていないため、有効な方法を開発する必要がめつた。発明の開示本発明者らは、上述の問題を解決すべく鋭意検討した結果、安価な原料であるグルコース等を出発物質として用い、数段階の微生物反応と精製を組み合わせることにより、重要な医農薬中間体である非天然型の L _リボースを安価に効率よく製造できる方法を見出し、本発明を完成するに至った。

即ち本発明の要旨は、グルコース等の糖質原料を出発原料とし、数段階の生物学的手法を用いて; L—リボースを生産することを特徴とする L—リボースの製造方法に存する。具体的には、本発明は、グルコース等の糖質原料からリビトールを生産する能力を有する微生物を用いてグルコースからリビトールを生成するェ程（以下、「第 1工程」と称することもある）と、リビトールから L—リブ口一スを生産する能力を有する微生物を用いてリビトールから L—リブロースを生成する工程（以下、「第 2工程」と称することもある）と、 L—リブロースから L 一リボースを生産する能力を有する微生物を用いて L—リブロースから L—リボ —スを生成する工程（以下、「第 3工程」と称することもある）を含む、 L—リボースの製造方法である。

さらに、本発明の好ましい態様として、上記の生物学的手法を用いて生産した L—リボース含有液をゲル型濾過材に接触させること、及び、該 L—リボース含有液に有機溶媒を添加し、反応液中に残存する未反応の Lーリブロースを析出させずに L—リボースを単独で析出させることを含む方法が挙げられる。以下、本発明を詳細に説明する。

本発明は、グルコース等の糖質原料を出発原料とし、数段階の生物学的手法を用いて L—リボースを生産することを特徴とするが、上記で延べた第 1工程、第 2工程及び第 3工程を経る方法がその一例として挙げられる。以下はその方法を例として説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

本発明の製造方法における第 1工程は、グルコース等の糖質原料からリビトールを製造する工程である。第 1工程で使用する微生物としては、グルコース等の糖質原料からリビトールを生産する能力を有する微生物であれば、特に限定されないが、好ましくはトリコスポロノイデス（Trichosporonoides) 属に属する微生物が挙げられ、さらに好ましくは、トリコスポロノイデス .マディダ（Trichosp oronoides. madida) 、卜ジコスポロノィデス · ニグレスセンス (Trichosporonoi des. nigrescens) 、卜リコスポロノイデス - エドセファリス (Trichosporonoide s. oedocephalis) 、卜リコスポロノイデス，メガチリェンシス (Trichosporonoi des. megachillensis) 、卜リコスポロノイデス · ス / チュラータ (Trichosporon oides. spathulata) の種に属する微生物が挙げられ、さらに好ましくは、トリコスポロノイデス ' エドセファリスとトリコスポロノイデス . メガチリェンシスの種に属する微生物が挙げられる。例えばトリコスポロノイデス ·マディダに属する微生物として C B S 240. 79カ、トリコスポロノイデス .ニグレスセンスに属する微生物として CB S 26 8. 81、 CB S 269. 8 1が、トリコスポロノイデス ' エドセフアリスに属する微生物として C B S 568. 85、 CB S 64 9. 6 6が、トリコスポロノイデス · メガチリェンシスに属する微生物として CB S 56 7. 85が、トリコスポロノイデス ' スパチュラ一タに属する微生物として CB S 24 1. 79、 C B S 24 2. 79A、 CB S 242. 79 Bが挙げられる。これらの菌抹は、 Cenatraalbureau voor Schimmelcultures力ら入手することができる。なお、上記微生物は、野生株の他、 UV照射、 N—メチル — N' —ニトロソグァ二ジン（NTG) 処理、ェチルメタンスルホネート（EM S) 処理、亜硝酸処理、ァクリジン処理等による変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。変異株の具体例としてはトリコスポロノイデス · メガチリ δ

ェンシス M C I 3 4 4 2株が挙げられる。同株は、平成 9年 6月 2日に、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号 305-8566 日本国茨城県つくば市東 1-1-3) に F E R M P - 1 6 2 5 4の受託番号で寄託され、平成 9年 1 1月 1 9日にブダペスト条約にもとづく国際寄託に移管され、 F E R M B P— 6 1 7 6の受託番号が付与されている。

第 1工程においては、上記微生物は 1種あるいは 2種以上が用いられる。

次に、本発明の第 1工程について具体的に説明する。

第 1工程において、微生物は糖質原料を炭素源として定法通り培養される。つまり、微生物は 6 0 % (W/V) 以下、好ましくは 2 0〜 4 5 %の糖質原料を含む培地に植菌される。糖質原料としては、グルコース、フルクト一ス、シュ一クロース、マルトース、グリセロール等、及びそれらの混合物が挙げられる。これらの中ではグルコースが好ましい。用いる糖質原料の形態は特に制限されず、粉体、糖蜜、廃糖蜜等を用いることができる。また、炭素源としては微生物が資化しうるフルクト一スなどの炭水化物、グリセロールなどのアルコール類、有機酸などを適宜加えることができる。さらにこの培地には微生物が資化しうる窒素源が含まれる。窒素源としては、酵母エキス、コーンスティ一プリカ一、 N Zァミン、トリプト一ス、ペプトン、ポリペプトン、魚肉エキス、肉エキスその他の有機窒素源、あるいは硝酸ナトリウム、その他の無機窒素源、好ましくは、酵母エキスやコーンスティ一プリカ一、が適宜使用される。培地中に含まれる窒素源の初発濃度は好ましくは、酵母エキスの場合 0 . 5〜 4 . 0 %、コーンスティープリカ一の場合、 1 . 0〜 8 . 0 %である。好ましい窒素源の濃度はグルコース等の糖質原料の濃度に影響される。上述の炭素源、窒素源のほかに、無機イオンゃビタミン類を必要に応じ添加することは有効である。無機イオンとしては、リン酸ィオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、モリブデンイオンその他が用いられる。ビタミン類としては、チアミン、イノシトール、パントテン酸、ニコチン酸アミドなどが挙げられる。また、上述のグルコースその他の炭素源、窒素源、無機イオン、ビタミン類は、必要に応じて培養中の適当な時点で追補添カロしてもよレ、。

培養は好気的条件下で行う。本発明において、微生物はリビトール以外にエリスリトールとグリセロールを副生する場合があるが、リビトールの生成比率を効率よくするためには十分な通気を行うことが重要である。

培養温度は通常 2 0〜 3 7 °C、好ましくは 2 7〜 3 2 °Cで、通常 2 4時間から 2週間行う。本発明の製造方法における第 2工程は、リビトールから L—リブロースを製造する工程である。第 2工程で使用する微生物としては好気的反応条件下、リビトールを L _リブロースに変換する能力を有する微生物であれば特に限定はされないが、リビトールから L—リブロースを製造し、かつリビトール以外の副生産されたポリアルコールを資化する能力を有する微生物が好ましく、より好ましくは、ァセトパクター（Acetobacter) 属、アルカリゲネス（Alcaligenes ) 属、ァシネトバクタ一（Acinetobacter )属、ァグロパクテリゥム（Agrobacterium) 属、アルス口 / クタ一（Arthrobacter)属、ァェロモナス（Aeromonas) 属、才ーレ才ノくクテリウム（Aureobacterium)属、ノくチノレス（Bacillus)属、ブレビノクテリゥム (Brev ibacterium) 属、クレブシエラ（Klebsiella)属、オタロバク卜ラム（Ochrobactru m)属、リゾビゥム（Rhizobium) 属、セラチア（Serratia)属、ロドバクタ一（Rhodo bacter) 属、コリ /くクテリウム（Corynebacterium) 凰、ェンテロ/ベクター（Ent erobacter)属、グノレコノノクタ一 (Gluconobacter) 属、ミクロコッカス (Microco ecus) 属、ノヽラコッカス (Paracoccus)属、シユードモナス (Pseudomonas ) 属に属する微生物である。特にダルコノバクタ一属に属する微生物が、 L—リブ口一スの生成効率の点からも、ポリアルコールの資化性の点からも好ましい。

本発明において使用するダルコノバクタ一（Gluconobacter) 属に属する微生物は、例；^ば Gluconobacter frateurii , Gluconobacter oxydans等力 ^挙げられる。さらに具体的な代表株として Gluconobacter frateuri i IFO 2508 、 Gluconobact er oxydans IFO 3293 が挙げられる。

本発明において使用するァセトパクター属に属する微生物は、例えば、 Acetob actor acinus等が挙げられ、具体的な菌株としては、 Acetobactor acinus FERM P-2507が挙げられる。

本発明において使用するアルカリゲネス属に属する微生物は、例えば Alcalige nes aquamarinus, Alcaligenes epoxylyticus, Alcal igenes margaritae, Alcal igenes paradoxus, Alcal igenes xylosoxidans subsp. xylosoxidansカ挙げられ ligenes epoxylyticus FERM P - 2511， Alcaligenes margaritae FERM P-2512, Al caligenes xylosoxidans subsp. xylosoxidans I AM 12684, Alcal igenes parado xus Biotype I DSM66, Alcal igenes paradoxus Biotype II DSM30162力 S挙げられる。

本発明において使用するァシネトパクター属に属する微生物は、例えば Acinet obacter tartarogenesカ挙げられる。さらに具体的には、 Acinetobacter tartar ogenesIF013644が挙げられる。

本発明において使用するァルスロバクタ一属に属する微生物は、例えば Arthro bacter atrocyaneus, Arthrobacter pascens, Arthrobacter ramousus等力挙けられる。さら iこ具体的 ίこ（ま Arthrobacter pascens IF012139, Arthrobacter atr ocyaneus JCM 1329， Arthrobacter ramousus JCM1334等力 ΐ挙げられる。

本発明において使用するァグロバクテリゥム属に属する微生物は、例えば Agro bacterium radiobacter, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium viscosum が挙げられる。さらに具体的な代表株として Agrobacterium radiobacter NRRL B - 11291， Agrobacterium tumefaciens IAM13129, Agrobacterium viscosum IF013 652 が挙げられる。

本発明において使用するォ一レオパクテリゥム属に属する微生物は、 Aureobac terium testaceum力挙けられる。さらに具体的な代表株として Aureobacterium testaceum JCM1353 が挙げられる。

本発明において使用するバチルス属に属する微生物は、例えば Baci llus alvei, Bacillus coagulansが挙げられる。さらに具体的な代表株として Bacil lus alve i IF03343, Bacillus coagulans AHU 1631 が挙げられる。

本発明において使用するブレビバクテリゥム属に属する微生物は、 Brevibacte rium busi llum が挙げられる。さらに具体的な代表株として Brevibacterium bus ilium IA 1489 が挙げられる。

本発明において使用するコリネバクテリゥム属に属する微生物は、 Corynebac terium f laccumf aciens カけられる。さらに具体的な代表株として Corynebac terium f laccumfaciens ATCC12813 が挙げられる。

本発明において使用するェンテロバクタ一属に属する微生物は、 Enterobacter aerogenes力 S挙デられる。さらに具体的な代表株として Enterobacter aerogenes IF013534 が挙げられる。

本発明において使用するクレブシエラ属に属する微生物は、例えば Klebsiella planticola, Klebsiel la oxytoca ， Klebsiella terrigena力 ΐ挙けられる。さらに具体的な代表株として Klebsiella planticola NCIB11885, Klebsiella oxytoc a JCM1665, Klebsiella terrigena JCM1687 が挙げられる。

本発明において使用するミクロコッカス属に属する微生物は、例えば Micrococ cus roseus力 S挙デられる。さらに具体的な代表株として Micrococcus roseus IFO 3764 が挙げられる。

本発明において使用するォクロバクトラム属に属する微生物は、 Ochrobactrum s anthropi力 ΐ挙げられる。

さらに具体的な代表株として Ochrobactrums anthropi I AM 13993が挙げられる。本発明において使用するパラコッカス属に属する微生物は、例えば Paracoccus denitrificansカ挙 Iテられる。さらに具体的な代表株として Paracoccus denitri ficans IF013301 が挙げられる。

本発明において使用するシユードモナス属に属する微生物は、例えば Pseudomo nas f luorecens, Pseudomonas synxantha カ挙けられる。さらに具体的な代表株として Pseudomonas f luorecens IFO 3903, Pseudomonas f luorecens ATCC13525, Pseudomonas synxantha IAM13256 挙げられる。

本発明において使用するァエロモナス属に属する微生物は、例えば Aeromonas panctata、具体的に ίま、 Aeromonas panctata IF013288 力 ^s挙げ、られる。

本発明において使用するリゾビゥム属に属する微生物は、例えば Rhizobium va lidum IF013648が挙げられる。

本発明において使用するセラチア属に属する微生物は、例えば Serratia marce scens 力挙けられ、例；^ば Serratia marcescens IF03054 、 Serratia marcescen s ATCC13880 が挙げられる。

本発明において使用する口ドパクター属に属する微生物は、例えば Rhodobacte r sphaeroides 、例； ίま Rhodobacter sphaeroides IF012003力挙げ'られる。上記微生物は、 Institute for Fermentation ( I F O ) 、 Institute of Appli ed Microbiology ( I AM) 、 Deutsche Sammlung fon Mlkroorganismen und Zel lkulturen GmbH ( D S M) 、 Japan Collect ion of Microorganisms ( J C M) 、 Laboratory of Culture Collection of Microorganisms ( A H U ) 、 American T ype Culture Collection ( A T C C ) 、 The National Collections of Industri al and Marin Bacteria ( N C I M B ) から入手することができる。

なお、上記微生物は、野生株の他、 U V照射、 N—メチル一 N，一ニトロソグァニジン（N T G ) 処理、ェチルメタンスルホネート（E M S ) 処理、亜硝酸処理、ァクリジン処理などによる変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組み換え法などの遺伝的手法により誘導される組み換え株などいずれの株であってもよレ、。上記微生物はリビトール以外の副生されたポリアルコールを資化し、リビト —ルを効率的に; L—リブロースに変換できるので、その後の L—リブロースの分離 ·精製工程における負荷を著しく軽減することが出来る。

本工程においては、上記微生物は 1種あるいは 2種以上が用いられる。

次に、本発明の第 2工程について具体的に説明する。

本工程で用いるリビトールは、精製されたものであってもよく、リビトール以外の物質を含有する未精製の発酵液または該発酵液を部分精製したものであってもよい。具体的には、リビト一ル含有液は、菌体を含んでいても良いし、遠心分離などにより菌体を除去したものでもよい。またリビトールの発酵に用いた微生物を蒸気滅菌などにより殺菌したものでも良いし、殺菌を行っていない発酵液でも良い。またこの発酵液を簡便な方法を用いて精製させたものでもよい。例えば発酵液を除菌後、濃縮し晶析させたものでも良いし、また、カラムクロマトダラフィ一などで部分精製させたものでも良い。また発酵液を適当な緩衝液、例えば、酢酸バッファ一、リン酸バッファ一、トリスバッファー、等、あるいは水を用いて希釈しても良い。あるいは濃縮させても良い。これらの発酵液に微生物を好気的条件で作用させ、 L—リブロースを生成させる。

本発明の第 2工程での微生物培養に用いる培地は微生物が生育でき、 L—リブロース生産能を誘導し、かつ、好ましくはポリアルコールの資化性を誘導する培地であれば、いずれでもよい。さらに培地は液体状でも良いし固体培地でも良い。炭素源としては上記微生物が資化しうるグルコースなどの炭水化物、グリセロールなどのアルコール類、有機酸などが挙げられ、適宜一種あるいは 2種以上が選ばれる。好ましくはポリアルコ一ルの資化性を誘導するグリセロールなどのアルコール類が挙げられる。窒素源としては本微生物が資化しうる窒素源であればいずれでも良いが、好ましくは、酵母エキス、コーンスティ一プリカ一、 N Zアミン、トリプト一ス、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、魚肉エキス、その他の有機窒素源、あるいは硝酸ナトリウム、その他の無機窒素源が適宜 1種あるいは 2種使用される。培地中に含まれる炭素源及ぴ窒素源の濃度は 0 . 0 1 %〜2 0 %の間で用いられる。炭素源、窒素源のほかに、無機イオンやビタミン類を必要に応じ添加することは有効である。無機イオンとしては、リン酸イオン、ナトリゥムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、モリブデンイオン、カルシウムイオン、コバルトイオン、その他金属イオン類等が適宜数種類用いられる。ビタミン類としては、チアミン、イノシトール、パントテン酸、ニコチン酸アミドなどが挙げられ、適宜用いられる。また、上述のグルコースその他の炭素源、窒素源、無機イオン、ビタミン類は、必要に応じて培養中の適当な時点で追補添加してもよい。

培養は好気的条件下で行う。培養温度は 4 °Cから 5 0 °Cの範囲で行われるが、好ましくは 2 0から 4 0 °Cの範囲である。通気量は 0. OOlvvn！〜 2vvm好ましくは 0. 5〜1. 5vvmの範囲で行われる。 11は2〜 1 0、好ましくは 3〜 9の間である。培養は、通常 1 0時間から 2日間行う。

次に、第 2工程に供する菌体は、培養液そのままを用いてもよいし、遠心分離等により集菌したものであってもよい。培養して得られた菌体をそのまま、あるいは培養して得られた菌体を公知の手法で処理したもの、即ち、アセトン処理、凍結乾燥処理、界面活性剤処理あるいはトルエン処理など菌体を物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物を用いることができる。また、これらの菌体または菌体処理物から、リビトールに作用し、 L—リブロースを生産する能力を有する酵素画分を粗精製物あるいは精製物として取り出して用いることも可能である。さらには、このようにして得られた菌体、菌体処理物、酵素画分等をポリアクリルアミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いることも可能である。そこで本発明において、「微生物」の用語は、上述の菌体、菌体処理物、酵素画分、およびそれらの固定化物全てを含有する概念として用いられる。

反応は好気的条件下で行う。反応温度は 4 °Cから 5 0 °Cの範囲で行われるが好ましくは 2 0から 4 0 °Cの範囲である。 p Hは 2〜 1 0、好ましくは 3〜 8の間である。撹拌が十分に行われていれば特に通気の必要は無いが、好ましくは 0 . 0 1 V v m〜 1 V v mの間で通気する。反応に用いる菌体量は湿潤菌体量換算でリビトール含有発酵液に対し 0 . 0 0 1 %〜 5 0 % (重量 Z体積）の間で用いられる。リビトールの濃度は特に限定されないが、好ましくは 0 . 1から 1 5 %の間である。含有されるポリアルコールの濃度は特に限定されない。反応は、通常 1時間から 2週間行う。

反応により得られた L—リブロースは、上記で得られた培養液を精製せずにそのまま用いても良いし、培養液から公知の方法により分離精製した後に第 3段階の反応に供することもできる。即ち、培養終了後、まず微生物菌体を遠心分離等の既存の方法で除去する。除菌に先立ち、培養液に熱を加え、殺菌を行ってもよレ、。除菌された液は通常の分離方法、即ちクロマトグラフィーなどを用いることで容易に精製できる。工業的には、イオン交換樹脂を用いた疑似移動相型クロマトグラフィ一により分離することも可能である。分離精製の工程においては、必要に応じて脱塩、脱色など、通常の糖の精製における操作を加えることもできる。本発明の製造方法における第 3工程は、 L—リブロースから Lーリボースを製造する工程である。第 3段階で使用する微生物としては、 L一リブロースを異性化して Lーリボースを生産する能力を有する微生物であれば、特に限定されない力好ましくはァシネトパクター属またはセル口モナス属に属する微生物であり、更に好ましくは、ァシネトバクタ一 'カルコァセティカス（Acinetobacter calc oaceticus ) もしくセノレ口モナス · ゲリタ、、 (Cel lulomonas gerida ) 、セノレ口モナスビアゾテア（Cellulomonas biazotea ) またはセルロモナス ' フラビゲナ（Cel lulomonas flavigena) の種に属する微生物が挙げられる。ァシネトバクタ一属に属する微生物としてァシネトバクタ一 .カルコァセティカス（Acinetob acter calcoaceticus ) D L— 2 8株、セノレ口モナス · ゲリダ (Cellulomonas g erida ) に属する微生物として J C M 1 4 9 0が、セルロモナス ♦ ビアゾテア

(Cellulomonas biazotea ) に属する微生物として A T C C 4 8 6が、セルロモナスフラビゲナ（Cellulomonas flavigena) に属する微生物として A T C C 4 8 2等が挙げられる。これらの微生物は、 Japan Collect ion of Microorganisms

( J C M) 及び American Type Culture Collection ( A T C C ) カら入手することができる。

また上記微生物は、野生株の他、紫外線照射や N- メチル- Ν' -ニトロ- Ν - ニトロソグァ二ジン（N T G ) 処理、ェチルメタンスルホネート（E M S ) 処理、亜硝酸処理、ァクリジン処理等通常知られた方法による変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株などのいずれの株であってもよい。また、上記微生物の代わりに、欧州公開第 8 0 7 6 8 2号公報に記載のような酵素（L—リブロース異性化酵素）を用いてもよい。本工程においては、上記微生物を 1種あるいは 2種以上が用いられる。次に、本発明の第 3工程について具体的に説明する。

本工程で用いる L—リブロースは、精製されたものであってもよく、 L—リブロース以外の物質を含有する未精製の発酵液または該発酵液を部分精製したものであってもよい。具体的には、 L—リブロース含有液は、第 1および第 2工程で用いた菌体を含んでいても良いし、遠心分離などにより菌体を除去したものでもよい。また、第 1及び第 2工程で用いた微生物を蒸気滅菌などにより殺菌したものでも良いし、殺菌を行っていない発酵液でも良い。またこの発酵液を簡便な方法を用いて精製させたものでもよい。例えば L—リブロース発酵液を除菌後、濃縮し晶析させたものでも良いし、また、カラムクロマトグラフィーなどで部分精製させたものでも良い。また発酵液を適当な緩衝液、例えば、酢酸バッファー、リン酸バッファ一、トリスバッファ一、等、あるいは水を用いて希釈しても良い。あるいは濃縮させても良い。これらの発酵液に微生物を好気的条件で作用させ、 L—リボースを生成させる。

本発明の第 3工程において微生物は定法通り培養される。つまり、炭素源としては上記微生物が資化しうるグルコースなどの炭水化物、グリセロールなどのァルコール類、有機酸など、好ましくはグルコース、グリセロール、スクロース等が、更に好ましくはスクロースが用いられる。またこれらの炭素源は培養中に必要に応じて 1種類あるいは複数種類適宜加えることができる。さらにこの培地には上記微生物が資化しうる窒素源が含まれる。窒素源としては、アミノ酸類、酵母エキス、大豆ペプチド、大豆粉末、コーンスティープリカ一、 N Zァミン、トリプトース、ペプトン、ポリペプトン、肉エキス、魚肉エキスその他の有機窒素源、あるいは硝酸ナトリウム、その他の無機窒素源、好ましくは、酵母エキスや大豆ペプチド、ポリペプトンが適宜使用される。上述の炭素源、窒素源のほかに、無機イオンゃビタミン類を必要に応じ添加することは有効である。無機イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン、モリブデンイオンその他が用いられる。ビタミン類としては、チアミン、イノシト一ル、パントテン酸、ニコチン酸アミドなどが挙げられる。また、上述のスクロースその他の炭素源、窒素源、無機イオン、ビタミン類は、必要に応じて培養中の適当な時点で追補添加してもよい。

培養は好気的条件下で行う。本発明において、 L—リブロースから L—リボースを生産するイソメラ一ゼを高活性に発現させるために通常 0 . 1〜 2 . 0 V V m、好ましくは 0 . 5〜 2 . O v v mで通気を行う。

培養温度は、通常 2 0〜3 7 °C、好ましくは 2 7〜 3 2 °Cで、通常 1 2時間から 4 8時間行う。

次に、異性化反応に供する菌体は、培養液そのままを用いてもよいし、遠心分離等により集菌したものであってもよい。培養して得られた菌体をそのまま、あるいは培養して得られた菌体を公知の手法で処理したもの、即ち、アセトン処理、凍結乾燥処理、界面活性剤処理あるいはトルエン処理など菌体を物理的または酵素的に破砕したもの等の菌体処理物を用いることができる。また、これらの菌体または菌体処理物から、 L一リブロースに作用し、 L _リボースを生産する能力を有する酵素画分を粗精製物あるいは精製物として取り出して用いることも可能である。さらには、このようにして得られた菌体、菌体処理物、酵素画分等をポリアクリルァミドゲル、カラギ一ナンゲル等の担体に固定化したもの等を用いることも可能である。そこで本発明において、「微生物」の用語は、上述の菌体、菌体処理物、酵素画分、およびそれらの固定化物全てを含有する概念として用いられる。特に好ましい実施形態としては菌体をトルエン処理することが挙げられる。 Lーリブロース液に菌体とトルエンを加えてもよい。好ましくは、培養終了液から菌体を濃縮分離しトルエン処理を行った後、異性化反応に供する。

異性化反応は、 p H 4〜9 . 5、好ましくは _P H 8 . 5〜9 . 0に調整した L 一リブロース水溶液に上記菌体あるいは菌体処理物をリブロース 1 g当たり、 2 ュニット以上、好ましくは 6ュニット以上になるように添加し、温度 1 0 °C〜 5 0 °C、好ましくは、 2 0 °C〜4 0 °Cで行う。反応が進行するにつれ、反応液の p Hが低下するため、水酸化ナトリウム等のアルカリ溶液にて p Hを 9 . 0付近に制御することが好ましい。用いた菌体の量により、反応は数秒から数日で L—リボースと L—リブロースが平衡に達して終了する。以上 3工程により生成した L—リボースを精製する。本発明者らは鋭意検討の結果、通常の種々の精製技術をある順序、条件に従って組み合わせることにより、反応液から L -リボースを分離精製するに至った。本発明の製造方法において、 Lーリボースはグルコース等の糖質原料を出発原料として、例えば 3段階の生物反応により得られるが、この様に多段階の生物反応を行った場合、得られた L一リボース含有液は、未反応の Lーリブロース以外にも微生物由来のタンパク質等の高分子物質、塩類、副反応で生成したと思われる有機酸類や、ジヒドロキシァセトン、その他少量の糖類、着色成分等の夾雑物を含む。これらの夾雑物は精製の早い時期に出来るだけ取り除いておくことが、その後の精製にとって望ましい。反応終了後、まず微生物菌体を遠心分離等の既存の方法で除去する。除菌に先立ち、培養終了液に熱を加え、酵素失活およぴ澱下げを行ってもよい。さらに除菌前または除菌後に炭酸飽充を行うことはその後の精製に大変有効である。除菌された液は L—リボース以外に未だ上述の夾雑物が多く含まれる。これらは通常の方法、即ちクロマトグラフィーゃ晶析技術を用いることで除去できる。夾雑物が多い場合は特に晶析に先立ってゲル型濾過材に接触させ、夾雑物の多くを除去することが好ましい。本発明で用いるゲル型濾過材としては、 Lーリボースと他の成分とを効率よく分離することが出来るものであれば特に限定されないが、好ましくはカチオン系イオン交換体が挙げられ、更に好ましくは架橋度 4〜 8 %のアル力リ金属またはアル力リ土類金属型のカチオン系イオン交換体が挙げられる。かかるイオン交換体の具体例としては、 U B K— 5 3 0、 U B K— 5 3 5、 U B K— 5 5 0、 U B K— 5 5 5 (いずれも三菱化学製）等が挙げられる。これらを用いてクロマト分離を行うことが好ましい。

具体的な精製手段としては、例えば上述したゲル型濾過材を脱塩水にてスラリ —化し、十分に気泡を除去した後分離カラムに充填する。該カラムに、充填した濾過材容量の 1 / 2〜 1 1 0 0、好ましくは 1 / 5〜： 1 Z 2 0量の粗 Lーリボース含有液を送入し、次いで水で溶出させて Lーリボース画分とその他の画分とに分画する。この L—リボース画分を、通常知られた方法により脱塩脱色後、晶析を行うことにより高純度の Lーリボースを得ることができる。

また工業的には分離効率を上げ、溶離水の使用量を減らす目的で、公知の種々のクロマト分離手法や疑似移動床法を用いることにより、さらに効果的な分画を行うこともできる。

分離精製の工程においては、必要に応じて脱塩、脱色など、通常の糖の精製における操作を加えることもできる。

最終的に精製された L—リボース液には未反応の L—リブロースが残存するが、この混合液より L—リボース結晶を得るには、 Lーリボース含有液に有機溶媒を添加し、反応液中に残存する未反応の L—リブロースを析出させずに Lーリボースを単独で析出させる方法が好ましい。 L—リボース含有液は十分に濃縮され、好ましくはプリックス 6 0以上、さらに好ましくはブリックス 8 5以上、さらに好ましくはプリックス 9 0以上に濃縮される。この濃縮シロップを 4 °Cに放置すると L—リボースのみが析出する。しかしこのような低温晶析では析出するまでの時間が長く、また析出率も満足のいくものではない場合が多く、好ましくは有機溶媒添加による方法が挙げられる。つまり、上述の十分に濃縮された L—リボース含有シロップに、シロップの 1 / 2〜 1 0倍量好ましくは 1〜 3倍量の有機溶媒を加え、十分に撹拌後、微量の Lーリボース結晶を加え、 4でで2 4時間放置する。添加する有機溶媒としては、メタノール、エタノール等の低級アルコール類、アセトン、へキサン、ァセトニトリル、トルエンなどが挙げられ、好ましくはエタノール、 1—プロパノール、 2—プロパノール、更に好ましくはェタノールが挙げられる。晶析に先立って再度クロマト分離を行い、 Lーリボース含有液中から L一リブロースを除いておけば、さらに晶析率は上昇する。発明を実施するための最良の形熊以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、その要旨を越えない限り本発明の技術分野における通常の変更をすることができる。実施例 1

1 ) リビト一ル発酵上清の製造

30 L容量のジャーにグルコース 30%、魚肉エキス 2%からなる培地 1 8 L を入れ、トリコスポロノイデスメガチリェンシス（MC I 3442) の種培養 1 80mLを接種した。種培養液は、予めバッフル付きフラスコを用いてダルコ —ス 30 %、酵母エキス 1 %からなる培地中で 30°C、 2日間、 1 60 r pmの振とう培養により得られた。ジャーは 330 r pm、 l v vm、 30°Cの条件で制御され、 5日間培養を行った。得られた培養液から遠心分離により清澄な培養上清 1 2 Lを得た。この発酵を 5回行い、リビトール発酵上清 60 Lを得た。各成分の濃度はリビトール 80 g/L, エリスリトール 4 g/L、グリセロール 4 0 g ZLであった。

2) 粗 L—リブロース液の製造

グルコノバクタ一 . フラテゥリ（Gluconobacter frateurii) (IF02508) を 1 % グリセロール、 0. 5%酵母エキス、 0. 5 %ポリペプトンよりなる培地 1 00 m 1 を入れた 500m lバッフル付きフラスコ 2本に接種した。 1 60 r p mで回転する振とう培養機にセットし、 30°Cで 1 日間培養を行った。 30 Lジャ一フアーメンターに 3 %グリセロール、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%ポリぺプトンよりなる培地を 20 1仕込み、 1 20度 20分殺菌した。これに先の培養液を 200m l植菌し、 3 0度で、 p Hを 5以下にならないように 5 N水酸化ナトリゥムでコントロールしながら 1 日培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して、培養上清除き、ダルコノバクタ一 ' フラテゥリの菌体を得た。

上記 1) で製造したリビトール発酵上清液を 1 5 L仕込んだ 30 Lジャーファ —メンターに入れ、得られたダルコノバクタ一の菌体を入れ、 30°C、通気 l v vm、撹拌 330 r pmの条件で反応した。反応 1 日後、反応液 1 m 1を遠心分離にかけて菌体を除き、反応上清を下記表 1に示す条件で高速液体クロマトダラフィー分析した。リビトールは完全に変換され、エリスリトール及ぴグリセ口一ルは検出されなかった。生成した L—リブロースは 78. 2 g/Lであった。グリセロールはジヒドロキシアセトンに変換されており、生成量は 23. 3 g/L であった。エリスリトールはエリスルロースに変換されていたが、生成量の測定はスタンダードの試薬が、純度不明瞭のため、正確な測定ができなかった。

高速液体クロマトグラフィー分析条件

カラム MC I GE L CK08 E

8mmI.D. X 300 mm (三菱化学株式会社製）溶離液蒸留水

流速 1. Om l /分

カラム温度 60°C

1食出 ¾5 R I

3) 粗 L—リボース液の製造

上記 2) で得られた L—リブロース含有発酵液に、異性化反応に供する菌体のトルエン処理物が加えられた。即ち、 2) で得られた L—リブロース液は、除菌その他の処理を施すことなく、同一ジャー内で連続して異性化反応が行われた。具体的には 2) の反応終了時点で Lーリブロース含有発酵液を水酸化ナトリウム水溶液により p H9. 0に調整し、続いて下記 4) で得られたトルエン処理菌体 1 Lを加えて、異性化反応を開始した。ジャーは反応温度 28 °C、 1 1 2 r p m に制御され、 p Hは 1 ON水酸化ナトリウム水溶液にて 8〜8. 5の間で緩やかに制御された。 24時間後 Lーリボースと L一リブロースの混合比が約 7 ： 3に達し、反応は終了した。

遠心分離により反応終了液から菌体を除き清澄な粗 Lーリボース液 15 L を得た。含有する L—リボースは 39. 1 g/L, L—リブロースは 16 0 g ZL、ジヒドロキシアセトンは 7 g ZLであった。

4) 異性化反応用トルエン処理菌体の製造

ァシネトノクタ一♦ 力ノレコアセティカス (Acinetobacter calcoaceticus ) D L— 28株の種培養液をスクロース 2. O gZL、酵母エキス 5. 0 g/L, 大豆ペプチド 5. 0 g/L, N a C 1 5 g/L、 K2H P O₄ 3 g/L, K H₂P θ 4 l gZL、リジン一塩酸塩 5 g L ( p H 7. 0) よりなる培地 20 Lを入れた 30 Lジャーに 1 %接種した。種培養は予め同一培地を用いてバッフル付きフラスコで 160 r pm、 30。Cで 12時間振とう培養して得られた。ジヤーは 300 r pm、 l v vm、 30 °Cの条件で制御され、 1 6時間培養を行つた。得られた培養終了液を遠心分離して上清を除き、 1 0倍濃縮菌体液を 1. 7 Lを得た。この濃縮菌体 1. 7 Lにトルエンを 27 mL加え、 15分間激しく混合した。

ァシネトバクタ一 'カルコァセティカス DL— 28株に代えて、セルロモナス . ゲリダ J CM1490、セルロモナス . ビアゾテア ATCC486、セルロモナスフラビゲナ ATCC 482等も同様に用いることができる。

5) 粗 Lーリボース液の精製

3) で得られた粗リボース液をエバポレーターにてプリックス 40まで濃縮した後、カラムクロマトグラフィーの原料に供した。

特開昭 63 - 158105号公報に記載された疑似移動床型のクロマト分離系 (充填された充填床の前端と後端とが流体通路で連結され、流体の循環を可能にしたもの）において、充填材として N a型の強力チオン交換樹脂（ダイヤイオン UBK— 530，三菱化学社製）を使用し、脱着剤として水を使用した。内径 2 8 mm, 充填層高 500 mmの直列に連結した 4本のカラムに前記充填材を合計で 1 24 OmL充填した充填床を 65°Cに保ち、床內を容積流速 60 OmL/h rで通液し、供給はすべて第 1カラム、抜き出しはすべて第 4カラムとし、下記表 2に示すタイムスケジュールで定常となるまで分離操作を行った。定常状態に達した後の各画分の組成を、下記表 3に示す。 L—リボースの回収率は 8 1 . 8 %であった。また、原料に含まれていた着色成分も多くは L—リボース以外のその他の画分に分離されており、 L—リボース画分の着色はクロマト分離前に比べて大幅に軽減されていた。表 2 供給 ·抜出工程 1 0 8分

原料流量 1 0 0 m 1 / h

製品画分流量 1 2 0 m 1 / h

溶離水流量 6 0 0 m 1 / h

副製品流量 5 8 0 m 1 / h

循環工程 1 3 . 0分

循流直 6 0 0 m 1 / h 表 3 原料 L—リボ- -ス画分その他

•高分子 4 0 . 0 1 . 2 6 7 . 1

L一リブロース 1 7 . 7 1 3 . 8 1 9 . 8

L一リボース 4 2 . 3 8 5 . 0 1 3 . 1

得られた L—リボース含有画分を分子量分画 1 0 0 0 0の中空糸型限外濾過膜にて濾過した後、カチオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、続いてァニオン交換樹脂を充填したカラムに通液した。以上の脱塩脱色工程を経た L—リボース含有液は無色透明であるが、場合により若干の着色成分の残ることがあった。その場合は少量の活性炭を加え 6 0 °Cで 1時間撹拌後、ケィソゥ土濾過により活性炭を除くことで残る着色成分を除いた。このようにして得られた無色透明の L一リボース含有液をエバポレーターにてブリックス 8 7まで濃縮後、シロップの 2 倍容量のエタノールを添加し、微量の L—リボース結晶を種晶として加え、 4°C で 24時間静置したところ、 L—リボース結晶が析出した。この結晶を冷ェタノ —ルで数回洗浄した後乾固し、純度 99. 9%の結晶を得た。晶析率は 70%でめった。

尚、晶析後の母液からエタノールを留去し、再度濃縮してエタノールおよび種晶を加え、低温で放置することで 2番晶、 3番晶を得ることができた。実施例 2

1 ) リビト一ル発酵上清の製造

実施例 1の 1 ) と同様に培養を行い、培養上清 1 2 Lを得た。培養上清中の成分の濃度はリビト一ル 80 gZL、エリスリトール 5 g / L、グリセ口ール 50 gZLであった。

2) 粗 L—リブロース液の製造

ダルコノバクタ一 · フラテゥリ（ I FO 2508) を実施例 1と同様に培養して、培養液 1 8 Lを得た。培養終了後、培養液を遠心分離して培養上清を除き、菌体を 10 OmMのリン酸緩衝液バッファ一（p H 7. 0) 1. 8 Lに懸濁した。

30 Lジャーに、 1) で得られたリビトール発酵上清 1 2 Lを入れ、ダルコノパクター懸濁液を 1. 8 Lを加えて、 30°Cにて 300 r p mで撹拌し、通気 1 ^ 111で1 日間反応を行った。反応終了液を遠心分離して菌体を除き清澄な粗 L —リブロース液 1 2. 5 Lを得た。生成した L—リブロース濃度は 75 g/L、ジヒドロキシアセトン 29 g/Lであった。

3) 粗 L—リボース液の製造

セルロモナス ' ゲリダ（J CM1 490) をスクロース 2. 0 g/L, 酵母エキス 5. 0 g/L, 大豆ペプチド 5. 0 g/L, N a C 1 5 g/L, K 2ΗΡ〇4 3 g/L、 ΚΗ2Ρ 04 1 g/L, L—リボース 1 5 g/L ( p H 7. 0) よりなる培地 1 8 Lを入れた 30 Lジャーに 1 %接種した。種培養は予め同一培地を用いてバッフル付きフラスコで 1 60 r pm、 30°Cで 1 8時間振とう培養して得られた。ジャーは 300 r pm、 l v vm、 30 °Cの条件で制御され、 1 8時間培養を行った。得られた培養終了液を遠心分離し、集菌した。菌体ペレットにグリシン—塩酸緩衝液（5 OmM、 p H 8. 5) 1. 8 Lを加え均一に懸濁した後、トルエンを 60mL加え、 1 5分間激しく混合した。このように調製したトルエン処理菌体 1. 2 Lを、 2) で得られた粗 L—リブロース液 1 2. 5 Lに加え、均一になるよう緩やかに撹拌しつつ 30°Cで 24時間反応を行った。途中、 I N Na OHによって p H8. 5に制御した。得られた反応終了液を遠心分離して菌体を除き、さらに 0. 22 μ m孔径の精密濾過膜を通して清澄な粗 L—リボース液 1 2 Lを得た。 L—リボース濃度は 30 g "L、 L—リブロース濃度は 1 3 gZ であった。

4) 粗 Lーリボース液の精製

3) で得られた粗リボース液をエバポレ一ターにて濃縮し、 2. 7 Lの粗リボ —スシロップを得た。このシロップの濃度はプリックス 63、 L—リボースの対固形分比率は HP LCのピーク面積換算で約 38%、 L—リブロースの比率は 1 5%であった。このシロップをカラムクロマトグラフィーの原料に供した。即ちイオン交換榭脂 UBK— 550 (三菱化学社製） 32 OmLを充填したカラム 4 本を直列に接続し、カラム温度を 65°Cに保った状態でその一方の端から流速 6 00 mL/h rで粗リボースシロップ 64mLを供給した。次いで水を流速 60 OmL/h rで送入し、シロップをカラム内で展開、分離させながらカラム末端に移動させた。水を送入して 78分後から目的とする L—リボースが流出し始めた。さらに 1 2分してから流出液を Lーリボース含有画分として採取を開始した。水の送入開始から 1 24分後 L—リボースの流出がほぼ終わったので、サンプル回収を停止した。この L—リボース含有画分中の Lーリボースの対固形分比率は HP LCのピーク面積換算で 80%、 L—リブロースの比率は 1 4 %であり、 L —リボースの回収率は 80. 1 %であった。この L—リボース画分をさらに実施例 1記載と同様の脱塩脱色処理をした後、プリックス 90まで濃縮し 4°Cで 1ケ月静置したところ、 L—リボース結晶が析出した。この結晶を冷アルコール等で洗浄し、乾固したところ純度 99%の L一リボース結晶が得られた。実施例 3 実施例 1の疑似移動床法にて得られた L—リボース含有画分をさらにカラムク口マトグラフィ一により精製した。

実施例 1 と同様のクロマト分離系を用い、充填材として C a型の強力チオン交換樹脂（ダイヤイオン UBK— 5 55，三菱化学社製）を使用した。下記表 4に示すタイムスケジュールで定常となるまで分離操作を行った。定常状態に達した後の各画分の組成を、下記表 5に示す。 L—リボースの回収率は 72. 4%であつた。表 4 供給 ·抜出工程 9. 6分

原料流量 75 m 1 /h

製品画分流量 244 m 1 /h

溶離水流量 600 m 1 /h

副製品流量 43 1 m 1 /h

循環工程 23. 0分

循直 600 m 1 /h 表 5 原料 L - -リボー -ス画分その他

•高分子 1. 2 0. 0 3. 2

L -リブロース 1 3. 8 2. 0 3 3. 5

L一リボース 85. 0 98. 0 63. 2

得られた L—リボース画分を実施例 1と同様に脱塩脱色処理した後、ブリックス 8 7まで濃縮し、 2—プロパノールを 2倍量と微量の Lーリボース結晶を加え、 4°Cで 1 2時間撹拌したところ純度 9 9. 5 %の L—リボース結晶が得られた。なお、各実施例において得られた培養上清に含まれるリビトールなどの糖類含量は高速液体クロマトグラフィ一により各々下記表 6に示す条件で測定した。各糖質の保持時間は下記分析条件 Aにおいて、グルコース 1 0. 57分、リビトーノレ 1 2. 22分、エリスリトール 1 3. 36分、グリセ口一ル 1 5. 09分である。また、下記分析条件 Bにおいて、 L—リブロース 22. 8分、 L—リボース 24. 0分である。表 6 高速液体クロマトグラフィー分析条件 A

カラム MC I GE L CK08 EH

8mmI.D. X 300匪（三菱化学株式会社製）溶離液 1 N リン酸水溶液

流速 0. 6m l /分

カラム温度 50。C

1¾ ίϋ ¾5 R I 高速液体クロマトグラフィー分析条件 B

カラム： MC I GE L CK08 EC

8 mml. D. X 300 mm (三菱化学株式会社製）溶離液水

0. 6m l Z分

カラム温度 75°C

梗出 ¾= R I 産業上の利用可能性本発明によれば、数段階の生物学的反応により、安価なグルコース等の糖質原料を出発原料として Lーリボースを効率よく生産することができる。

Claims

請求の範囲

1. 糖質原料からリビトールを生産する能力を有する微生物を用いて糖質原料からリビトールを生成する工程と、リビトールから L一リブロースを生産する能力を有する微生物を用いてリビトールから Lーリブロースを生成する工程と、 L—リブロースから L—リボースを生産する能力を有する微生物を用いて L—リブロースから L—リボースを生成する工程を含む Lーリボースの製造方法。

2. 前記糖質原料がグルコースである請求項 1記載の方法。

3. グルコースからリビトールを生産する能力を有する微生物がトリコスポ口ノイデス属に属することを特徴とする請求項 1記載の方法。

4. 微生物がトリコスポロノイデス 'マディダ、トリコスポロノイデス ·二グレスセンス、トリコスポロノイデス 'エドセフアリス、トリコスポロノイデス • メガチリェンシスおよびトリコスポロノイデス .スパチュラータから選ばれるとを特徴とする請求項 3記載の方法。

5. 微生物がトリコスポロノイデス ' エドセファリスおよびトリコスポロノイデス ·メガチリェンシスから選ばれることを特徴とする請求項 3に記載の方法。

6. トリコスポロノイデス属に属する微生物が、トリコスポロノイデス 'マデイダ CB S 240. 79、トリコスポロノイデス ' ニグレスセンス CB S 2 68. 8 1及び〇83269. 8 1、トリコスポロノイデス 'エドセフアリス CB S 568. 85および CB S 649. 66、トリコスポロノイデス ' メガチリエンシス CB S 567. 85、トリコスポロノイデス ' スパチュラータ CB S 241. 79、 CB S 242. 79 A及び CB S 242. 79 Bから選ばれることを特徴とする請求項 4に記載の方法。

7. トリコスポロノイデス属に属する微生物がトリコスポロノイデス ·エドセファリス CB S 568. 85およびトリコスポロノイデス · メガチリエンシス CB S 567. 85から選ばれることを特微とする請求項 5に記載の方法。

8. リビトールから L—リブロースを生産する能力を有する微生物が、リビトール以外の副生産されたポリアルコールを資化する能力を有する微生物であることを特徴とする請求項 1又は 3記載の方法。

9. リビトールから L一リブロースを生産する能力を有する微生物が、ァセトバクタ一属、アルカリゲネス属、ァシネトパクター属、ァグロバクテリウム属、ァルスロバクター属、ァエロモナス属、オーレォバクテリウム属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、クレブシエラ属、ォクロバクトラム属、リゾピウム属、セラチア属、ロドパクター属、コリネバクテリウム属、ェンテロバクター属、グルコノバクター属、ミクロコッカス属、パラコッカス属およびシユードモナス属に属する微生物から選ばれることを特徴とする請求項 1又は 3記載の方法。

1 0. 微生物がダルコノパクター属に属することを特徵とする請求項 8に記載の方法。

1 1. 微生物がダルコノバクタ一 · フラテゥリおよびダルコノバクタ一 ·ォキシダンスに属する微生物から選ばれることを特徴とする請求項 1 0記載の方法。

1 2. 微生物がダルコノバクタ一 · フラテゥリ I FO 2 508およびダルコノバクタ一 ·ォキシダンス I FO 3293から選ばれることを特徴とする請求項 1 1記載の方法。

1 3. リビトールが、リビトール以外の物質を含有する未精製の発酵液または該発酵液を部分精製したものであることを特徴とする請求項 1又 8記載の方法。

1 4. L—リブロースから L—リボースを生産する能力を有する微生物が、セル口モナス属およびァシネトパクター属に属する微生物から選ばれることを特徴とする請求項 1、 3、 8又は 9のいずれか一項に記載の方法。

1 5. 微生物が、セルロモナス 'ゲリダ、セルロモナス ' ビアゾテアおよびセルロモナス · フラビゲナから選ばれることを特徴とする請求項 14記載の方法。

1 6. 微生物がセルロモナス ·ゲリダ J CM 1 490、セルロモナス · ビァゾテア ATCC 486およびセルロモナスフラビゲナ ATCC482から選ばれることを特徴とする請求項 1 5記載の方法。

1 7. L—リブロースが、 L一リブロース以外の物質を含有する未精製の発酵液または該発酵液を部分精製したものであることを特徴とする請求項 14に記載の方法。

1 8. 生成した L—リボースを含む反応液をゲル型濾過材に接触させることを特徴とする請求項 1記載の方法。

1 9 . ゲル型濾過材との接触により L—リボースをクロマト分離することを特徴とする請求項 1 8記載の方法。

2 0 . ゲル型濾過材がカチオン系のイオン交換体であることを特徴とする請求項 1 9記載の方法。

2 1 . 生成した L—リボースを含む反応液に有機溶媒を添加し、反応液中に残存する未反応の L—リブロースを析出させずに L—リボースを単独で析出させることを特徴とする請求項 1記載の方法。

2 2 . 有機溶媒が、低級アルコール類、アセトン、へキサン、ァセトニトリルまたはトルエンであることを特徵とする請求項 2 1記載の方法。