WO2000012564A1

WO2000012564A1 - High-purity polysaccharide containing hydrophobic groups and process for producing the same

Info

Publication number: WO2000012564A1
Application number: PCT/JP1999/001683
Authority: WO
Inventors: Junzo Sunamoto; Kazunari Akiyoshi; Ryuzo Hosotani; Akio Hayashi; Hiroki Fukui
Original assignee: NOF Corp
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 1998-08-31
Filing date: 1999-03-31
Publication date: 2000-03-09
Anticipated expiration: 2001-02-28
Also published as: US20020143160A1; US6566516B1; AU755283B2; DE69925355D1; EP1026174A1; AU3054599A; EP1026174A4; DE69925355T2; EP1026174B1; KR20010031457A; JP3416951B2; KR100541752B1

Description

明細書高純度疎水性基含有多糖類およびその製造方法技術分野

本発明は、高純度疎水性基含有多糖類およびその製造方法に関する。背景技術

水溶性高分子には、天然高分子、半合成高分子、合成高分子がある。例えば、天然高分子としては、デンプン、海藻などの炭水化物類；アラビアゴムなどの植物性粘質物；ニカヮなどのタンパク質があげられる。半合成高分子としては、ビスコースなどのセルロース系高分子があげられる。合成高分子としては、ポリビニルアルコール、ポリビュルピリジン、ポリグリセリンなどがあげられる。これらの水溶性高分子の誘導体で、疎水性基を有する高分子の一部のものは、医薬物を含有する薬物運搬体を被覆する被覆材料などの医用材料として使用されている。例えば、リボソームマイクロカプセル、マイクロスフェアー、 O ZWエマノレションおよび赤血球ゴ一スト等の薬物運搬体を疎水性基含有多糖類で被覆した多糖類被覆運搬体は、この運搬体に含まれている医薬品の自然流出が抑制されるほか、運搬体の細胞特異的移行率が向上することが知られている。

特に水溶性高分子が多糖類で、疎水性基がステリル基である化合物、すなわち多糖類ーステロール誘導体は、リボソームの多糖被覆剤（特開昭 6 1— 6 9 8 0 1号）、脂肪乳剤の被覆剤（特開昭 6 3— 3 1 9 0 4 6号）、多糖被覆ェマルジョン作製時の高分子界面活性剤（特開平 2— 1 4 4 1 4 0号）として既に開示されておリ、その合成方法の 1つとして特開昭 6 1 - 6 9 8 0 1号の技術が開示されている。

近年、薬物運搬体としてリポソームおよび O/Wエマルションが有望とされているが、これらの薬物運搬体を多糖類で被覆することによリ、生体内外での化学的 ·物理的安定性を向上させるのみならず、さらに特定の細胞群に対する標的指向性も発揮されることが報告されている { Bu l l . Ch em. So c . J pn . , 62 , 第 791 - 7 96頁（1989) }。

この時に用いる多糖類一コレステロール誘導体の合成方法としては、特開昭 6

1 - 6 9 8 0 1号に示されるように、多糖類とモノクロロ酢酸との反応による力ルポキシメチル化多糖類の合成（工程 1 ) 、

カルボキシメチル化多糖類とエチレンジアミンとの反応による N— ( 2—アミノエチル）力ルバモイルメチル化多糖類の合成（工程 2 ) 、

N— ( 2—アミノエチル）力ルバモイルメチル化多糖類とコレステリルクロ口ホルメイトとの反応による N— [ 2— (コレステリルォキシカルボニルアミノ）ェチル] 力ルバモイルメチル化多糖類の合成（工程 3 )

の 3つの工程からなる方法がこれまで採用されてきた。

しかし特開昭 6 1 - 6 9 8 0 1号において開示されている方法では、工程 2におけるカルボキシル基が未反応のまま最後まで残りやすく、多糖被覆した際のリポソームまたはェマルジヨンの物理化学的安定性、細胞特異性、および適合性などにおいて、カルボキシ基の負荷電の影響を防止しえないという問題が残されている。また合成における工程数が長いという問題も残されている。

この問題を解決するために、特開平 3— 2 9 2 3 0 1号には、 1段階目にジィソシアナ一ト化合物とステロールとを反応させて、アルカンの一端の α—位にステリル基を持ち、他端の ω—位にイソシアナ一ト基を持つモノイソシアナ一ト化合物を合成した後、 2段階目にそのモノィソシアナ一ト化合物と多糖類とを反応させることによって、多糖類にステリル基を簡便に導入できる合成法が開示されている。

しかし、この方法においては、 1 ) 1段階目の反応において 1分子のジイソシアナート化合物と 2分子のステロールとが反応した副生物（以下、ステロール二量体という場合がある）力透析またはエタノールを用いた再沈殿による精製方法では完全に除去できず、このためステロール二量体が不純物として最終的に多糖類ーステロール誘導体に残存する、 2 ) 2段階目の反応においてモノイソシァナート化合物と反応しなかった未置換の多糖類（未反応の多糖類という場合もある）力不純物として最終的に多糖類ーステロール誘導体に混在するという問題力 ^sある。

多糖類ーステロール誘導体を、薬物の運搬体として用いる場合、あるいはリポソーム等に被覆して用いる場合には、よリ副生物の少ない高純度の多糖類ーステロール誘導体が望まれる。

前記の多糖類ーステロール誘導体、さらに多糖類以外の水溶性高分子とステロ

—ル以外の疎水性基が結合した両親媒性の複合体として、例えばポリエチレングリコールのアルキルジエステルについては、詳細な報告がされている { Do j i n Ne ws No . 85, 第 3 -1 1頁（1997年） } 。

しかし、前述のように高純度の疎水性基含有水溶性高分子は、その製造方法の困難性からこれまで報告されていない。

本発明の第 1の目的は、未置換の多糖類およびステロール二量体などの不純物の含有量が少ない高純度の疎水性基含有多糖類を容易に効率よく製造することができる高純度疎水性基含有多糖類の製造方法を提案することである。

本発明の第 2の目的は、上記製造方法にょリ得られる高純度疎水性基含有多糖類を提供することである。発明の開示

本発明者らは、前記従来の問題点に鑑み鋭意検討した結果、精製工程において、再沈殿溶媒にケトン系溶媒を用いること、また超遠心分離による精製または非プロトン性極性溶媒による精製を組み合せることによリ、高純度疎水性基含有多糖類が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は次の高純度疎水性基含有多糖類およびその製造方法である。

(1) 第 1段階反応として、炭素数 1 2〜50の水酸基含有炭化水素またはステロールと、〇CN— R¹— NCO (式中、 R¹は炭素数：！〜 50の炭化水素基である。）で表されるジイソシアナート化合物とを反応させて、炭素数 1 2〜5 0の水酸基含有炭化水素またはステロールが 1分子反応したィソシアナ一ト基含有疎水性化合物を製造し、

第 2段階反応として、前記第 1段階反応で得られたイソシアナ一ト基含有疎水性化合物と多糖類とをさらに反応させて、疎水性基として炭素数 12〜50の炭化水素基またはステリル基を含有する疎水性基含有多糖類を製造する方法において、

第 2段階反応の反応生成物をケトン系溶媒で精製する高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

(2) 多糖類がプルラン、アミロぺクチン、アミロース、デキストラン、ヒドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレデキストラン、マンナン、レバン、ィヌリン、キチン、キトサン、キシログルカンおよび水溶性セルロースからなる群よリ選択される 1種以上である上記（1) 記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

(3) ケトン系溶媒がアセトン、メチルェチルケトン、ジェチルケトンおよぴジイソプロピルケトンからなる群よリ選択される 1種以上である上記（1) または（2) 記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

(4) 疎水性基含有多糖類は、一 XH基〔式中、 Xは酸素原子または NYで表される含窒素基（ここで、 Yは水素原子または炭素数 1〜 1 0の炭化水素基である。）〗を有する多糖類において、その多糖類を構成する糖単位 1 00個あたリ、 0. ：!〜 1 0個の一 XH基が、下記式（ 1 )

H H

(1)

〔式中、 Xは前記 Xと同じである。 R¹は炭素数 1〜50の炭化水素基、 R²は炭素数 1 2〜50の炭化水素基またはステリル基を示す。〕

で表される疎水性基で置換された疎水性基含有多糖類である

上記（1) ないし（3) のいずれかに記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

(5) 式（1) における R ²がステリル基である上記（4) 記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

(6) ケトン系溶媒で精製した精製物中の疎水性基含有多糖類の含有量が 8 0重量％以上である上記（1) ないし（5) のいずれかに記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

(7) 未置換の多糖類の含有量が 20重量％以下である上記（6) の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

(8) ジイソシアナ一ト化合物中の 2個の NCO基が 2個とも炭素数 1 2〜 50の水酸基含有炭化水素またはステロールと反応した不純物の含有量が 0. 0

5重量％以下である上記（6) または（7) 記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

(9) ケトン系溶媒で精製した精製物を超音波処理して水に微分散させ、次に超遠心分離にょリさらに精製を行う上記（1) ないし（8) のいずれかに記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

(10) 超遠心分離によリ精製した精製物中の疎水性基含有多糖類の含有量が 98重量％以上である上記（9) 記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法

(1 1) 未置換の多糖類の含有量が 2重量％以下である上記（1 0) 記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

(12) ジイソシアナート化合物中の 2個の NCO基が 2個とも炭素数 1 2

〜 50の水酸基含有炭化水素またはステロールと反応した不純物の含有量が 0. 05重量％以下である上記（1 0) または（1 1) 記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

(13) ケトン系溶媒で精製した精製物を非プロトン性極性溶媒に溶解した後、その溶液に水を加えて混合し、未置換の多糖類を水層に移行させ、次に層分離した水層を分離除去することによリさらに精製を行う上記（1) ないし（8) のいずれかに記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

(14) ケトン系溶媒で精製した精製物に対して 3〜50重量倍の非プロトン性極性溶媒を添加して溶解した後、その溶液に対して 5重量倍以上の水を添加して精製を行う上記（1 3) 記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

(1 5) 非プロトン性極性溶媒が N， N—ジメチルホルムアミド、 N, N— ジメチルァセトアミドおよびジメチルスルホキシドからなる群よリ選択される 1 種以上である上記（1 3) または（14) 記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

(16) 非プロトン性極性溶媒を用いて精製した精製物中の疎水性基含有多糖類の含有量が 98重量％以上である上記（13) ないし（1 5) のいずれかに記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

(1 7) 未置換の多糖類の含有量が 2重量％以下である上記（1 6) 記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

(18) ジイソシアナート化合物中の 2個の NCO基が 2個とも炭素数 1 2

〜50の水酸基含有炭化水素またはステロールと反応した不純物の含有量が 0. 02重量％以下である上記（16) または（1 7) 記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

(19) 第 1段階反応として、炭素数 1 2〜 50の水酸基含有炭化水素またはステロールと、 OCN— R¹— NCO (式中、 R¹は炭素数：！〜 50の炭化水素基である。）で表されるジイソシアナート化合物とを反応させて、炭素数 1 2〜 50の水酸基含有炭化水素またはステロールが 1分子反応したイソシアナ一ト基含有疎水性化合物を製造し、 (

il )

第 2段階反応として、前記第 1段階反応で得られたイソシアナ一トと多糖類とをさらに反応させて、疎水性基として炭素数 1 2〜50の炭化水素基またはステリル基を含有する疎水性基含有多糖類を製造し、

次に第 2段階反応の反応生成物をケトン系溶媒で精製して得られる高純度疎水性基含有多糖類であって、

一 XH基〔式中、 Xは酸素原子または NYで表される含窒素基（ここで、 Yは水素原子または炭素数 1 ~10の炭化水素基である。）〕を有する多糖類において、その多糖類を構成する糖単位 1 00個あたリ、 0. 1〜1 0個の— XH基が、下記式（1)

〔式中、 Xは前記 Xと同じである。 R¹は炭素数 1〜50の炭化水素基、 R²は炭素数 1 2〜 50の炭化水素基またはステリル基を示す。〕

で表される疎水性基で置換された疎水性基含有多糖類を 80重量％以上含有する高純度疎水性基含有多糖類。 o

(20) 多糖類がプルラン、アミロぺクチン、アミロース、デキストラン、ヒドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレデキストラン、マンナン、レノくン、ィヌリン、キチン、キトサン、キシログルカンおょぴ水溶性セルロースからなる群よリ選択される 1種以上である上記（1 9) 記載の高純度疎水性基含有多糖類。

(21) 式（1) における R ²がステリル基である上記（1 9) または（2 0) 記載の高純度疎水性基含有多糖類。

(22) 未置換の多糖類の含有量が 20重量％以下である上記（ 1 9) ないし（21 ) のいずれかに記載の高純度疎水性基含有多糖類。

(23) ジイソシアナート化合物中の 2個の NCO基が 2個とも炭素数 1 2

〜 50の水酸基含有炭化水素またはステロールと反応した不純物の含有量が 0. 05重量％以下である上記（1 9) ないし（22) のいずれかに記載の高純度疎水性基含有多糖類。

(24) ケトン系溶媒で精製した精製物を超音波処理して水に微分散させ、次に超遠心分離にょリさらに精製して得られるものである上記（1 9) ないし（ 23) のいずれかに記載の高純度疎水性基含有多糖類。

(25) ケトン系溶媒で精製した精製物を非プロトン性極性溶媒に溶解した後、その溶液に水を加えて混合し、未置換の多糖類を水層に移行させ、次に層分離した水層を分離除去することによリさらに精製して得られるものである上記（ 1 9) ないし（23) のいずれかに記載の高純度疎水性基含有多糖類。図面の簡単な説明

図 1は、実施例 1 _ 2で得られたプルラン一コレステロール誘導体（CHP) の¹ H— NMRスぺクトルを示した図である。

図 2の（a) は実施例 1一 2で得られたプルラン一コレステロール誘導体（C

HP) の超音波照射前のサンプルを S E C (サイズ排除クロマトグラフィー）で分析した結果の図でぁリ、（b ) は超音波照射 3 0分後のサンプルを S E Cで分析した結果の図である。図 2の（c ) は超遠心分離を行った後の上澄み溶液を S E Cによリ分析した結果の図でぁリ、（d ) は超遠心分離を行った後の下層を再び水に膨潤させて超音波処理を行った溶液を、 S E Cによリ分析した結果の図である。縦軸は示差屈折計の強度（単位なし）である（以下、同様）。

図 3は、実施例 2 _ 1で得られたマンナン一コレステロール誘導体（C HM) の¹ H— NM Rスぺクトルを示した図である。

図 4は、実施例 2— 2で得られたマンナン一コレステロール誘導体（C HM) の¹ H— NM Rスぺクトルを示した図である。

図 5は実施例 1一 2で得られたプルラン一コレステロール誘導体（C H P ) を非極性溶媒で精製し、超音波照射した後サンプルを S E C (サイズ排除クロマトグラフィー）で分析した結果の図である。発明を実施するための最良の形態

本発明において、「高純度」とは、炭化水素基ゃステリル基の疎水性基がジィソシアナ一ト化合物と反応した二量体、および未置換の多糖類の含有量が少ないことを意味する。

本発明で用いる炭素数 1 2〜5 0の水酸基含有炭化水素は、疎水性基を導入する原料として用いるものである。本発明で用いる炭素数 1 2〜5 0の水酸基含有炭化水素基としては、例えばラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチノレァノレコーノレ、ステアリルアルコーノレ、ァラキニルアルコール、ドコサノーノレ、ペンタコサノーノレ、へキサコサノーノレ、ォクタコサノーノレ等のァノレコーノレ由来の水酸基含有炭化水素基があげられる。これらの中では、入手が容易なことから、炭素数 1 2〜3 5、特に 1 2〜2 0のアルコールが好ましい。炭素数 1 2〜5 0 の水酸基含有炭化水素は 1種単独で使用することもできるし、 2種以上を組み合せて使用することもできる。疎水性基を導入する原料として用いる水酸基含有炭化水素の炭素数が 1 2未満の場合、疎水性の凝集効果が十分発揮できにくくなリ、好ましくない。一方、炭素数が 5 0を越えると入手が困難になリ、好ましくない。

本発明で用いるステロールは疎水性基を導入する原料として用いるものである。本発明で用いるステロールとしては、例えばコレステロール、スチグマステロール、 /8—シトステロール、ラノステロール、エルゴステロール等があげられる。これらの中では、入手性等からコレステロールが好ましい。ステロールは 1種単独で使用することもできるし、 2種以上を組み合せて使用することもできる。また炭素数 1 2〜5 0の水酸基含有炭化水素基とステロールとは併用してもよい本発明で用いるジイソシアナート化合物は、 O C N— R ¹— N C O (式中、 R ¹ は炭素数 1〜5 0の炭化水素基である。）で表されるジイソシアナート化合物である。 R ¹の炭素数が 5 0を越えると入手が困難になリ、好ましくない。ジイソシアナ一ト化合物の具体的なものとしては、 R ¹がエチレン基であるエチレンジイソシアナ一ト、ブチレン基であるブチレンジイソシアナート、へキサメチレン基であるへキサメチレンジィソシアナ一ト、ジフエニルメタン基であるジフエ二ルメタンジイソシアナ一トなどがあげられる。

本発明で用いる多糖類としては、例えば天然または半合成の多糖類を用いることができる。具体的には、プルラン、アミロぺクチン、アミロース、デキストラン、ヒドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシェチレデキストラン、マンナン、レバン、ィヌリン、キチン、キトサン、キシログルカンおよび水溶性セルロースからなる群から選択される 1種以上があげられる。これらの中ではプルラン、マンナン、キシログノレ力ン、アミロぺクチン、アミロース、デキストラン、ヒドロキシェチルセルロース等が好ましい。またキチン、一部脱ァセチル化したキチン、キトサン等の窒素原子を含有する多糖類も好ましい。多糖類は 1種単独で用いることもできるし、 2種以上を組み合せて用いることもできる。本発明の製造方法にょリ製造される疎水性基含有多糖類は、一 XH基〔式中、 Xは酸素原子または NYで表される含窒素基（ここで、 Yは水素原子または炭素数 1〜1 0の炭化水素基である。）〕を有する多糖類において、その多糖類を構成する糖単位 1 00個あたリ、 0. 1〜 1 0個、好ましくは 0. 1〜6個のー H基が、前記式（1) で表される疎水性基で置換された疎水性基含有多糖類である。

前記式（1) において、 R¹は前記ジイソシアナート化合物由来の基である。

R²は炭素数 12〜50の水酸基含有炭化水素基および Zまたはステロール由来の基である。 R²で表される基の具体的なものとしては、ラウリル基、ミリスチル基、セチル基、ステアリル基、コレステリル基、スチグマステリル基、 /3—シトステリル基、ラノステリル基、エルゴステリル基等があげられる。ょリ好ましくは、ミリスチル基、ステアリル基、コレステリル基があげられる。

本発明の製造方法では、プルラン、マンナンのように多糖類を構成する単糖に

CH₂OH基が結合している多糖類を使用した場合、 CH₂OH基の OH基および単糖に直接結合している OH基のどちらの基も前記式（1) で表される疎水性基で置換されるが、置換される割合は CH₂OH基の OH基の方が圧倒的に多く、単糖に直接結合している OH基の割合は小さい。

またキトサンのように CH₂OH基おょぴ NH₂基が結合している多糖類を使用した場合、 CH₂OH基の OH基、 NH₂基および単糖に直接結合している OH基のいずれの基も前記式（1) で表される疎水性基で置換されるが、置換される割合は CH₂OH基の OH基および NH₂基が圧倒的に多く、単糖に直接結合している OH基の割合は小さい。

本発明の製造方法は、下記の工程 1〜工程 3または工程 1〜工程 4の工程を含んでいる。以下の製造方法の説明では、多糖類としてプルラン、疎水性基としてステリル基を用いた場合について説明するが、他のものを用いた場合も同様にして製造することができる。なお本発明の製造方法に係る反応を下記反応式（ I ) および反応式（Π) に示す。反応式（I ) が工程 1、反応式（Π) が工程 2に対応している。

反応式 (I)

OCN— R¹— NCO + R²-OH

(2) (3)

R²:ステリル基

(ジイソシアナ一ト）

0 0 0

II II

OCN— R^ -C-O-R² + ρ2_ο— C-N~R~N— C-0— FT

H H H

(4) (5)

(ステリルイソシアナート） (ステロール二；！体）

反応式 (II)

(6) (4)

丄

[工程 1 ]

反応式（I ) に示されているように、本発明に使用するアルカン類の一端にステリル基と他端にイソシアナ一ト基を持つステリルイソシアナ一トは、式（4 ) で表される化合物でぁリ、式（2 ) で表されるジイソシアナート化合物と、式（ 3 ) で表されるステロールとの反応にょリ得られる。式（4 ) で表される化合物を製造するにあたリ、有機溶媒中、塩基性触媒の存在下に、式（2 ) で表されるジイソシアナート化合物の一端のイソシアナート基と、式（3 ) で表されるステロールの水酸基とを反応させて、一端がウレタン結合でステロールと結合し、残リの一端がイソシアナート基のまま未反応で残存している、式（4 ) で表されるステアリルイソシアナートを製造する。この反応では、式（5 ) で表されるステロール二量体が副生成物として通常約 1 0重量％生成する。

[工程 2 ]

反応式（I I ) に示されているように、前記工程 1で得られた式（4 ) で表されるステアリルイソシアナ一トと、式（6 ) で表される多糖類（プルラン）とを反応させ、式（7 ) で表される多糖類ーステロール誘導体（疎水性基含有多糖類）を製造する。この反応は、有機溶媒中、塩基性触媒存在下に、式（6 ) で表される多糖類の水酸基と式（4 ) で表されるステリルイソシアナ一卜とを付加反応させる。

[工程 3 ]

上記工程 2で得られ反応生成物をケトン系溶媒にて再沈殿させて精製する（以下、この精製をケトン精製という）。このケトン精製にょリ、工程 1で副生成するステロール二量体が主として除去され、高純度の多糖類一ステロール誘導体（疎水性基含有多糖類）を得ることができる。本発明においては、ケトン精製した精製物をケトン精製物と表記する。またケトン精製物はさらに反応溶媒を除去するために、透析法により精製することもできる。

[工程 4 ] 1 ) 前記の工程 3で得られるケトン精製物（透析した精製物も含む）を、超遠心分離にょリさらに精製する。この超遠心分離による精製にょリ、未置換の多糖類（未反応の多糖類）が主として除去され、さらに高純度の疎水性基含有多糖類を得ることができる。

2 ) 本発明の製造方法では、上記 1 ) の超遠心分離による精製の代わリに、非プロトン性極性溶媒を用いて精製することもできる。非プロトン性極性溶媒を用いた精製は、前記の工程 3で得られるケトン精製物（透析した精製物も含む）に対して非プロトン性極性溶媒を加えて溶解させ、その溶液に対して水を加え、撹拌機等でよく混合し、層分離した水層を除去する。この非プロトン性極性溶媒による精製にょリ、未置換の多糖類（未反応の多糖類）が主として除去され、さらに高純度の疎水性基含有多糖類を得ることができる。この操作は何度も繰リ返し行ってもよく、 2〜3回繰り返すことによって、疎水性基含有多糖類の純度はさらに向上する。さらに、非プロトン性極性溶媒除去を行って、疎水性基含有多糖類を粉末状の固体として得ることもできる。

以下、本発明における各工程をさらに詳細に説明する。

前記工程 1において、式（4 ) で表される化合物を製造する工程は、有機溶媒中、塩基性触媒の存在下で式（2 ) で表されるジイソシアナート化合物と式（3 ) で表されるステロールとを反応させることからなる。ここでジイソシアナート化合物の使用量は、ステロールに対して 1〜3 0モル当量、好ましくは 1 0〜2 0モル当量である。また塩基性触媒としてアミン類の添加が望ましく、その結果効率よく反応が進行する。

反応に使用する有機溶媒としては、エーテル系溶媒、非プロトン性極性溶媒、ハロゲン系溶媒、脂肪族および芳香族炭化水素系溶媒などがあげられる。エーテル系溶媒としては、例えばェチルエーテル等の脂肪族エーテル、テトラヒドロフラン等の複素環式エーテルなどがあげられる。また非プロトン性極性溶媒としては、例えばアセトン、ジメチルホルムアミド（D M F ) 、ジメチルスルホキシド ( D M S O ) 等があげられる。ハロゲン系溶媒としては、例えば塩化メチレン、クロ口ホルム等があげられる。脂肪族炭化水素溶媒としては、例えばペンタン、へキサン等があげられる。芳香族炭化水素溶媒としては、例えばベンゼン、トルェン等があげられる。これらの中では、芳香族炭化水素が好ましい。

反応式（ I ) の反応で用いるアミン類としては、トリェチルァミン、ピリジンなどがあげられる。ァミン類の使用量はステロールに対して 1〜 2 0モル当量、好ましくは 1〜 3モル当量である。また反応時の温度および時間は用いるジィソシアナ一ト化合物および溶媒などによリ異なリ、反応の進行状態によリ設定されるが、反応温度は好ましくは室温から 1 0 0 °C、反応時間は好ましくは 3〜 2 4 時間である。

反応は乾燥した溶媒および塩基性触媒を用いることが好ましく、さらに不活性ガス雰囲気下で行うことが望ましい。不活性ガスとしては、例えば窒素、ァルゴン等があげられる。

前記工程 2において、式（7 ) で表される化合物を製造する工程は、有機溶媒中、塩基性触媒の存在下で式（6 ) で表される多糖類と前記の工程 1で製造した式（4 ) で表されるステリルイソシアナート化合物とを反応させることからなる。多糖類とステリルイソシアナ一ト化合物の仕込み比は、多糖類に対するステリル基の導入量にょリ設定されるが、多糖類の 1 0 0単糖単位に対して 0 . 1〜1

0モル当量の範囲が望ましい。

反応に使用する有機溶媒としては、エーテル系溶媒、非プロトン性極性溶媒、ハロゲン系溶媒、脂肪族および芳香族炭化水素系溶媒などがあげられる。エーテル系溶媒としては、例えばェチルエーテル等の脂肪族エーテル、テトラヒドロフラン等の複素環式エーテルなどがあげられる。また非プロトン性極性溶媒としては、例えばアセトン、ジメチルホルムアミド（D M F ) 、ジメチルスルホキシド ( DM S O ) 等があげられる。ハロゲン系溶媒としては、例えば塩化メチレン、クロ口ホルム等があげられる。脂肪族炭化水素溶媒としては、例えばペンタン、 1 b へキサン等があげられる。芳香族炭化水素溶媒としては、例えばベンゼン、トルェン等があげられる。これらの中では、非プロトン性極性溶媒が好ましい。反応式（Π ) の反応で用いる塩基性触媒としてはァミン類が好ましく、例えばトリェチルァミン、ピリジンなどがあげられる。ァミン類の使用量は多糖類に対して 1〜 1 0モル当量、好ましくは 1〜3モル当量である。反応時の温度および時間は用いる多糖類および溶媒などによリ異なリ、反応の進行状態にょリ設定されるが、反応温度は好ましくは室温〜 1 0 0 °C、反応時間は好ましくは 3 0分〜 2 4時間である。

前記工程 3のケトン精製に使用するケトン系溶媒としては、アセトン、メチルェチルケトン、ジェチルケトンおよぴジィソプロピルケトン等からなる群よリ選択される 1種以上があげられる。ケトン系溶媒の使用量は工程 2で得られた反応溶液に対して 4 ~ 5 0重量倍、好ましくは 8〜 2 0重量倍である。前記工程 2で得られ反応生成物をケトン系溶媒に添加すると、多糖類ーステロール誘導体（疎水性基含有多糖類）は沈殿し、工程 1で副生成するステロール二量体はケトン系溶媒に溶解するので、沈殿物を分取することによリ高純度の多糖類ーステロール誘導体を得ることができる。沈殿物は凍結乾燥法、真空乾燥法などの方法にょリ乾燥することができる。ケトン精製は、透析法、エタノールを用いた再沈殿精製法、カラムクロマトグラフィ一法などの従来の精製法に比べてステロール二量体の除去率が高く、このため高純度の疎水性基含有多糖類を容易に得ることができる。

ケトン精製物中の疎水性基含有多糖類の含有量は 8 0重量％以上、好ましくは 9 0重量％以上である。また未置換の多糖類の含有量は 2 0重量％以下、好ましくは 1 0重量％以下である。さらにジイソシアナ一ト化合物中の 2個の N C O基が 2個とも疎水性基と反応した不純物の含有量は 0. 05重量％以下、好ましくは 0. 0 1重量％以下である。

前記工程 4の 1) の超遠心分離による精製法では、前記工程 3のケトン精製物に水を加えて超音波照射した後、超遠心分離を行う。ここで用いる水としては、蒸留水、イオン交換水等があげられる。水の使用量はケトン精製物に対して 5〜 1 00重量倍、好ましくは 30〜60重量倍である。超遠心分離は、 1万〜 20 万 G、好ましくは 3万〜 10万 Gで、 1~24時間、好ましくは 3〜1 5時間行うのが望ましい。超遠心分離を行うと、分子量が大きい多糖類—ステロール誘導体が下層、分子量が小さい未置換の多糖類が上層に層分離するので、下層を分取することによリ、高純度の多糖類ーステロール誘導体を得ることができる。超遠心分離した精製物中の疎水性基含有多糖類の含有量は 98重量％以上、好ましくは 99. 9重量％以上である。また未置換の多糖類の含有量は 2重量％以下、好ましくは 0. 1重量％以下である。さらにジイソシアナート化合物中の 2 個の NCO基が 2個とも疎水性基と反応した不純物の含有量は 0. 05重量％以下、好ましくは 0. 0 1重量％以下である。超遠心分離による精製を行うことにょリ、 99. 9重量％以上の高純度のものも容易に得ることができる。

前記工程 4の 2) の非プロトン性極性溶媒による精製において使用できる非プ口トン性極性溶媒としては、例えば N， N—ジメチルホルムアミド（DMF) 、 N, N—ジメチルァセトアミド（DMAc) 、 1， 3—ジメチル一 2—イミダゾリジノン（DMI) およぴジメチルスルホキシド（DMSO) 等からなる群よリ選択される 1種以上があげられる。非プロトン性極性溶媒の使用量は、前記工程 3で得られたケトン精製物に対して 3〜50重量倍、好ましくは 5〜 1 5重量倍である。 3重量倍未満ではケトン精製物を溶解するには少なく、 50倍超重量では後に水を加えたときに二層分離せずに混和してしまうので好ましくない。ケトン精製物を非プロトン性極性溶媒に溶解させる温度は 0〜1 50°C、好ましくは室温〜 1 oo°cである。なお、非プロトン性極性溶媒以外の溶媒は、疎水性基含 1 o 有多糖類および未置換の多糖類が溶解しないため、好ましくない。

前記工程 4の 2 ) において使用できる水としては、蒸留水、イオン交換水、純水等があげられる。水の使用量はケトン精製物を非プロトン性極性溶媒に溶解した溶液に対して 5重量倍以上、好ましくは 1 0〜 1 0 0重量倍である。 5重量倍未満では二層分離せず、混和してしまうため好ましくない。一方 1 0 0重量倍よリ多いと、未置換の多糖類の著しい除去効率の向上が望めないため好ましくない。水は所定量を一度に入れてから撹拌機等で混合するのがよく、撹拌しながら加えると混和して二層分離しにくいので好ましくない。また二層分離工程は、静置させても遠心機等で強制的に分離させてもよい。

ケトン精製物を非プロトン性極性溶媒に溶解した溶液に水を加えて混合し、水層と非プロトン性極性溶媒層とに二層分離させると、未置換の多糖類は水層に移行し、目的とする疎水性基含有多糖類は非プロトン性極性溶媒層に溶解したままの状態にあるので、水層を除去することによリ、未置換の多糖類を除去することができる。水層を除去した非プロトン性極性溶媒溶液から非プロトン性極性溶媒を除去することによリ、高純度の疎水性基含有多糖類を得ることができる。非プ口トン性極性溶媒の除去には、クロマトグラフィー、凍結乾燥または再沈殿等の方法があげられる。特に再沈殿における貧溶媒としてはケトン系またはアルコール系溶媒が望ましく、例えばアセトン、メチルェチルケトン、メタノール、エタノール等があげられる。貧溶媒の使用量は、再沈殿させる溶液に対して 4〜 5 0 重量倍、好ましくは 8 〜 2 0重量倍である。沈殿物は凍結乾燥法、真空乾燥法などの方法によリ乾燥することができる。

非プロトン性極性溶媒による精製は、前記工程 4の 1 ) の超遠心分離による精製に比べ、ょリ簡便にかつ効率よく処理することができる。これによリ、医薬品等、生体に用いる場合に求められる高純度な疎水性基含有多糖類のよリ大量製造が可能となる。

非プロトン性極性溶媒で精製した精製物中の疎水性基含有多糖類の含有量は 9 8重量％以上、好ましくは 9 9 . 9重量％以上である。また未置換の多糖類の含有量は 2重量％以下、好ましくは 0 . 1重量％以下である。さらにジイソシアナ一ト化合物中の 2個の N C O基が 2個とも疎水性基と反応した不純物の含有量は 0 . 0 2重量％以下、好ましくは 0 . 0 1重量％以下である。非プロトン性極性溶媒で精製することによリ、 9 9 . 9重量％以上の高純度のものも容易に得ることができる。

以上のような本発明の製造方法によれば、これまで目的生成物中に残存し、完全除去が極めて困難であった副生成物のステロール二量体、および未置換の多糖類を簡便に効率よく除去することができ、これによリ高純度の高純度疎水性基含有多糖類を得ることができる。

本発明の高純度疎水性基含有多糖類は、前記本発明の製造方法によリ得られる高純度疎水性基含有多糖類であって、前記式（1 ) で表される疎水性基を有し、純度が 8 0重量％以上、好ましくは 9 0重量％以上の高純度の疎水性基含有多糖類である。本発明の高純度疎水性基含有多糖類は、前記式（1 ) で表される疎水性基にょリ凝集して微分散した溶液を形成することができ、その結果コアーシェル型の高分子ミセルの形成能がある。

本発明の高純度疎水性基含有多糖類は、医薬物を含有する薬物運搬体を被覆する被覆材料などの医用材料として使用することができる。例えば、リボソームマイク口カプセル、マイクロスフェアー、 ozwエマノレシヨンまたは赤血球ゴースト等の薬物運搬体を被覆する被覆材料として使用することができる。この場合、本発明の高純度疎水性基含有多糖類は副生物および未置換の多糖類の含有量が少なく高純度であるので、医用材料として安全に使用することができる。

以上の通リ、本発明の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法は、ケトン系溶媒を用いて精製しているので、未置換の多糖類およびステロール二量体などの不純物の含有量が少ない高純度の疎水性基含有多糖類を容易に効率よく製造することができる。また超遠心分離による精製または非プロトン性極性溶媒による精製を組み合せて行うことによリ、さらに高純度の疎水性基含有多糖類を製造することができる。

本発明の高純度疎水性基含有多糖類は、上記製造方法にょリ得られるので、高純度であリ、このため医用材料として安全に使用することができる。

以下、実施例によリ本発明をさらに具体的に説明する。

実施例 1一 1

《N— ( 6 f ソシアナ一トへキシル）コレステリル力ルバメートの合成》

1 1 iterのナス型フラスコに、コレステロ一ノレ 25 g (0. 065 m o 1 ) 、トルエン 300 m 1を加えて溶解し、さらにトリェチルァミン 1 7 m 1 (0. 1 2 m o 1 ) を加えた。そこへ、トルエン 300 m 1に溶解したへキサメチレンジィソシアナ一ト 161 g (0. 96 m o 1 , 14. 8 e q . ) を加え、窒素雰囲気下、 80°Cで約 6時間反応させた。反応終了後、トルエンと過剰のへキサメチレンジィソシアナ一トを減圧除去した。得られた黄色オイル状の残渣を室温で一夜放置することにより、淡黄色の結晶が生成した。結晶を取リ出し、約 1 liter のへキサンを加え、激しく振とうした後、上澄み液をデカンテーシヨンにょリ除去した。この洗浄操作を計 4回行った後、室温で 3時間減圧乾燥することにより白色の固体（結晶）を得た。収量（収率）： 18. 25 g (50. 9%) 上記生成物の¹ H— NMRと I Rの測定結果を下記に示す。

^-NMR ( ( 6 ) P P m, i n CDC 1₃、 TMS) ：

0. 68— 2. 35 (m, 43 H) 、

1. 34 - 1. 55 (m, 8 H) 、

3 14-3 18 (m, 2 H)

3 27-3 32 ( t , J = 6 6 H z , 2 H) 、

4 4 一 4 6 (m, 2 H) 、

5 38 (m, 1 H) 。

R (KB cm— ¹) : 3 260、 2320、 1680、 1 1 30 以上のデータから、得られた化合物が下記式（4 a) で表される N— (6一^ ソシアナ一トへキシル）コレステリルカルパメートであることを確認した。

H

(4 a) また得られた白色結晶をプレパラティブ TLC (Me r c k社製、 S i 1 i c a g e l 60 F ₂₅₄、展開溶媒：へキサンノ酢酸ェチル = 2 Z 1 ) を用いて展開した。その結果、副生成物である下記式（5 a) で表されるコレステロ一ルニ量体（1 {値： 0. 65) の存在が確認された。 TLC上のコレステロール二量体のパンドをァセトンで抽出して定量した結果、白色結晶中にコレステロ一ルニ量体が 8重量％混在していることを確認した。

(5 a) 実施例 1一 2

《プルラン一コレステロール誘導体（CHP) の合成》ム

1 literのナス型フラスコに、プルラン（平均分子量： 108000) 40 g (無水グルコースユニットとして 248 mm o 1 ) とジメチルスルホキシド（D MSOと略記する場合がある） 420m lを加え、窒素雰囲気下 80 °Cで撹拌して溶解させた。この溶液に、実施例 1— 1で合成した N— (6一^ f ソシアナートへキシル）コレステリルカルバメート 1. 78 g (3. 21 mm o 1 ) をピリジン 31. 6 g (0. 4 Omo 1 ) に溶解した溶液を加え、 90°Cで 3時間反応させた。

反応終了後、ジメチルスルホキシドを減圧除去し、得られたオイル状の残渣をアセトン 6 literに滴下して沈殿を生成させ、精製した。上澄み液を除去後、得られた沈殿にアセトン 4 literを加え、室温でー晚放置した。沈殿を濾別採取した後、減圧乾燥した。得られた固体をジメチルスルホキシドに溶解し、これを透析膜（スぺクトロポア社製 S p e c t r a ZP o r 3，分画分子量： 3500 ) に充填し、蒸留水に対して一週間透析した。得られたポリマー溶液 1. 5 lit erを常法にょリ凍結乾燥することによって、白色の固体（以下、アセトン精製物という場合がある）を得た。収量 31. 7 g (収率 76. 2%) 。

上記ァセトン精製物の¹ H— NMRと I Rの測定結果を下記に示す。

XH-NMR ( ( δ ) P pm、 D M S O— d ₆ノ D ₂0 = 20/ 1 , v o l ) ：

0. 68 - 2. 40、

2. 60-4. 60、

4. 70- 5. 30。

I R (KB r , cm-リ： 1 680、 1 1 80— 900。

以上のデータから、得られた化合物が下記式（7 a) で表されるプルランーコレステロール誘導体（以下、 CHPと略記する場合がある）であることを確認した。

(7 a) 上記アセントで精製した精製物をプレパラティブ TLC (Me r c k社製、 S i l i c a g e l 60 F ₂₅₄、展開溶媒：へキサンノ酢酸ェチル = 2 / 1 ) を用いて分析した。その結果、前記式（5 a) で表されるコレステロール二量体（R f 値： 0. 65) の存在は確認されなかった。またアセントで精製した精製物を¹ H— NMR解析し、プロトン比によリコレステロール二量体の含有率を算出した。その結果、コレステロール二量体の存在は確認されなかった。従って、上記アセントで精製した精製物中の前記式（5 a) で表されるコレステロール二量体の含有量は 0重量％である。

また精製に使用したアセトンを回収し、そこに含まれているコレステロール二量体を定量した。その結果、回収アセトン中に含まれているコレステロール二量体の含有量は 0. 140 gであった。実施例 1一 2で原料として用いた N— (6 —イソシアナ一トへキシル）コレステリル力ルバメート 1. 78 g (3. 2 1m mo l ) 中に含まれているコレステロール二量体の量は 0. 1 42 gである（実施例 1一 1において、コレステロール二量体の含有量が 8重量％であることが確認されている。実施例 1 _ 1参照）と算出されるので、これらのデータからコレステロール二量体の除去量を算出した。結果を表 1に示す。

以上のようにして得られた、目的物である式（7 a) で表されるプルランーコレステロ一ノレ誘導体の¹ H— NMRスぺクトルを図 1に示す。また¹ H— NMRスぺクトルの積分値から、プルラン一コレステロール誘導体におけるプルランへのコレステロール基の導入率を、次の数式（A) により算出した。

(100 + 2 x) /51 x = b/a ··· (A)

ここで用いた記号は次の通リである。

a ：コレステロール基由来のピーク面積（δ = 0. 68〜 2. 40) b ：プルラン由来のピーク面積（ δ =4. 70〜5. 30)

X ：単糖 1 00個当たりのコレステロール基の置換度

上記計算の結果、前記式（7 a) で表されるプルラン一コレステロール誘導体におけるコレステロール基の置換度は単糖 1 00個当たリ 1. 1個であることが分かった。

比較例 1

《エタノール再沈試験》

実施例 1― 2と同じ方法でプルランーコレステロール誘導体を合成した。反応終了後、エタノールに再沈殿させて精製し、プルラン一コレステロール誘導体を得た。

上記エタノールで精製した精製物を実施例 1一 2と同様にプレパラティブ TL Cを用いて分析した。その結果、前記式（5 a) で表されるコレステロール二量体（R f 値： 0. 65) の存在が確認された。またエタノールで精製した精製物を実施例 1—2と同様に¹ H— NMR解析してコレステロール二量体の含有率を算出した。その結果、コレステロール二量体が 0. 4重量％の量で含まれていたまた精製に使用したエタノールを回収し、そこに含まれているコレステロール二量体を定量した結果、 0. 016 gであった。このデータから実施例 1一 2と同様にしてコレステロール二量体の除去量を算出した。結果を表 1に示す。

表 1から、再沈溶媒にアセトンを用いて精製することによリ、コレステロール二量体をほぼ完全に除去できることが確認された。

実施例 1一 3

《プルラン一コレステロール誘導体（CHP) の精製》

実施例 1— 2で合成したプルラン一コレステロール誘導体（CHP) 40 m g に純水 2 Om lを加え、プローブ型のソニケ一ター（T omy URP社製、プローブ外径 =5mm) を用い、 40 Wで 30分間、超音波照射した。この時容器の外側を氷水で冷却し、常に溶液の温度を 4 °C以下に保った。

次に、超音波照射後のサンプルを 10m 1ずつ遠心管にとり、 55000 Gで、 25°Cで 10時間、超遠心分離を行った。これによリ相分離が生じ、未置換のプルラン（未反応のプルラン）が上澄み液、プルラン一コレステロール誘導体（ CHP) が下層に分離された。

超音波照射前と後のサンプルを S E C (サイズ排除クロマトグラフィー）で分析した。 SECの条件は次の通リである。結果を図 2の（a) 、 (b ) にそれぞれ示す。

使用機器： TOSOH HP SECシステム（東ソ一（株）製、商標）カラム： TSK— g e l G4000 SWX L (東ソ一（株）製、商標）溶離液： 0. 02 %— N a N₃イオン交換水

流量： 0. 5 m 1 / m i n

温度： 35 °C

検出器： R I (示差屈折計）

図 2の（b) のピーク面積から計算して、低分子量のプルラン（未置換のプルラン）がアセトン精製物中に約 5重量％含まれていることが分かった。また超遠心分離を行った後の上澄み溶液を S ECによリ解析した。結果を図 2の（c) に示す。また下層のゲル（沈殿物）を再び水に膨潤させ、上記と同じ超音波処理を行った溶液を S ECによリ解析した。結果を図 2の（d) に示す。これらの結果から、上澄みに不純物質である低分子量のプルラン（未置換のプルラン）がほぼ 1 00重量％除かれていること、また沈降物中には低分子量のプルランが含まれていないことが確認された。

以上の結果から、前記式（7 a) で示されるプルラン一コレステロール誘導体 (CHP) が高純度で得られることが確認された。結果を表 2にまとめる。

表 2

実施例 2— 《マンナン一コレステロール誘導体（CHM) の合成 1》

実施例 1— 2と同じ反応操作にょリ、マンナン（シグマ社製、市販品）と、 N ― (6—イソシアナ一トへキシル）コレステリル力ルバメートを反応させた。各原料の仕込み量を以下に示した。

1 ) マンナン（Mw : 85000) : 26. 2 g (無水マンノースュニットとして 162 mm o 1 )

2) N- (6—イソシアナ—トへキシル）コレステリル力ルバメート： 1. 0 8 g ( 1. 95 mm o 1 )

3) ピリジン： 1 9. 2 g (243 mm o 1 )

4) ジメチルスルホキシド： 320 m 1

反応終了後、アセトン溶媒で再沈殿して精製を行った。次に透析を行った後、凍結乾燥することによリ白色の固体を 21. 5 g (収率 79. 5%) 得た。上記ァセトン精製物の¹ H— NMRと I Rの測定結果を下記に示す。

!H-NMR ( ( δ ) P Pm、 DMS O- d ₆/D₂0= 20/1, v o l ) ：

0. 68 - 2. 40、

2. 60 -4. 60、

4. 60— 5. 40。

I R (KB r , cm- ： 1 680、 1 1 80— 900

以上のデータから、得られた化合物が下記式（7 b) で表されるマンナンーコレステロール誘導体（CHM) であることを確認した。

(7 b)

上記アセントで精製した精製物を実施例 1—2と同様にプレパラティブ T LC を用いて分析した。その結果、前記式（5 a) で表されるコレステロール二量体 (R i値： 0. 65) の存在は確認されなかった。またアセントで精製した精製物を¹ H— NMR解析し、プロトン比によリコレステロール二量体の含有率を算出した。その結果、コレステロール二量体の存在は確認されなかった。従って、上記アセントで精製した精製物中の前記式（5 a) で表されるコレステロール二量体の含有量は 0重量％である。

以上のようにして得られた前記式（7 b) で表される化合物の¹ H— NMRスベクトルを図 3に示す。この化合物におけるマンナンへのコレステロール基の導入率を実施例 1一 2と同様に算出した。その結果、コレステロール基の置換度は単糖 100個当たリ 1. 1個であることが分かった。

次に、上記で得られたァセトン精製物を実施例 1一 3と同様に超遠心分離によリ精製し、低分子量のマンナン（未置換のマンナン）を分離した。結果を表 3に示す。表 3

実施例 2— 2

《マンナン一コレステロール誘導体（CHM) の合成 2》

実施例 1一 2と同じ反応操作により、マンナン（シグマ社製、市販品）と、 N - (6—イソシアナ一トへキシル）コレステリル力ルバメートを反応させた。各原料の仕込み量を以下に示した。

1 ) マンナン（Mw : 8 5 0 0 0 ) ： 5 g (無水マンノースュニットとして 3 1 mm o 1 )

2 ) N— ( 6—ィソシアナ一トへキシル）コレステリルカルバメート： 1 3 8 m g 0 - 25 mm o 1 )

3 ) ピリジン： 3. 7 g ( 4 7 mm o 1 )

4 ) ジメチルスルホキシド： 7 5 m 1

反応終了後、アセトン溶媒で再沈殿して精製を行った。次に透析を行った後、凍結乾燥することによリ白色の固体を 4. 0 5 g (収率 7 8 . 8 %) 得た。上記ァセトン精製物の¹ H— NMRと I Rの測定結果を下記に示す。

aH-NMR ( ( δ ) p p m、 DMS O— d ₆/D₂0= 20/1, v o l ) ： 0. 68 - 2. 40、

2. 60 -4. 60、

4. 6 0— 5. 4 0。

I R (K B r , c m— ¹) : 1 6 8 0、 1 1 8 0— 9 0 0 以上のデータから、得られた化合物が前記式（7 b) で表されるマンナンーコレステロール誘導体（CHM) であることを確認した。

上記アセントで精製した精製物を実施例 1一 2と同様にプレパラティブ T L C を用いて分析した。その結果、前記式（5 a ) で表されるコレステロール二量体 (R f 値： 0. 6 5) の存在は確認されなかった。またアセントで精製した精製物を¹ H— NMR解析し、プロトン比によリコレステロール二量体の含有率を算出した。その結果、コレステロール二量体の存在は確認されなかった。従って、上記アセントで精製した精製物中の前記式（5 a ) で表されるコレステロール二量体の含有量は 0重量％である。

以上のようにして得られたマンナン一コレステロール誘導体（CHM) の¹ H

— NMRスぺクトルを図 4に示す。この化合物におけるマンナンへのコレステロール基の導入率を実施例 1 _ 2と同様に算出した。その結果、コレステロール基の置換度は単糖 1 0 0個当たリ 0. 8個であることが分かった。

次に、上記で得られたァセトン精製物を実施例 1一 3と同様に超遠心分離によリ精製し、低分子量のマンナン（未置換のマンナン）を分離した。結果を表 4に示す。

表 4

実施例 3〜 6

《高純度ステリル基含有多糖類の製造》

天然由来の多糖であるキシログルカン（実施例 3) 、アミロース（実施例 4) 、デキストラン（実施例 5 ) および合成多糖類であるヒドロキシェチルセル口一ス（実施例 6 ) を用い、実施例 1一 2および実施例 1一 3と同様の反応操作によリ高純度多糖類一コレステロール誘導体を得た。

各種解析にょリ、コレステリル基の導入量、アセトン精製によるコレステロ一ルニ量体の除去率（重量％) と含有率（重量％) を求めた。また未置換の多糖類の含有率を遠心精製前後でそれぞれ求めた。結果を表 5にまとめて示す。

O o 表 5

* 1 単糖 1 0 0個当たりの導入基の数

表 5からから、プルラン、マンナンと同様に他の多糖類体でもコレステリル基を導入でき、かつコレステロール二量体および未置換の多糖類が除去できることが分かった。

実施例 7— 1

《N— (6—イソシアナ一トへキシル）ステアリル力ルバメートの合成（ステアリルプルランの合成）〉>

1 1 iterのナス型フラスコに、ステアリルアルコール 3. 48 g (1 2. 9m _m o 1 ) 、トルェン 50 m 1を加えて溶解し、さらにピリジン 2. 04 g (25 . 8 mm o 1 ) を加えた。そこへ、トルエン 50 m 1に溶角？したへキサメチレンジイソシアナ一ト 30 g (1 78 mm o 1， 14. 8 e q . ) を加え、窒素雰囲気下、 80°Cで約 3時間反応させた。反応終了後、トルエンおよび過剰のへキサメチレンジイソシアナートを減圧除去することによリ、淡黄色の結晶が生成した。結晶を取リ出し、約 1 literのへキサンを加え、激しく振とうした後、上澄み液をデカンテーシヨンにより除去した。この洗浄操作を計 4回行った後、室温で 3時間減圧乾燥することによリ白色の固体（結晶）を 2. 75 g得た（収率 48 - 7%) 。

上記生成物の¹ H— N M Rの測定結果を下記に示す。

XH-NMR ( ( δ ) P Pm、 CDC 1₃、 TMS ) ：

0. 88 ( t， d = 6. 8 H z , 3 H) 、

1. 1 0 - 1. 65 (m, 40 H) ,

3 1 4-3 18 (m, 2 H) 、

3 29 ( t J = 6. 6 H z , 2 H) 、

4 0 1 -4 06 (m, 2 H) 、 4. 6 1 (m， 1 H) 。

以上のデータから、得られた化合物が下記式（8) で表される N— （6—イソシアナ一トへキシル）ステアリル力ルバメートであることを確認した。 O

OCN— (CH₂)₆ - N - C一 0-(CH₂)₁₇CH₃

H

(8) また得られた白色結晶を実施例 1— 1と同様にプレパラティブ TLCに展開した。その結果、副生成物である下記式（9) で表されるステアリル二量体（R ί 値： 0. 68) の存在が確認された。 T L C上のステアリル二量体のバンドをァセトンで抽出して定量した結果、白色結晶中にステアリル二量体が 3重量％混在していることが確認された。

CH₃(CH₂)₁₇— 0

(9) 実施例 7 _ 2

《ステアリル一プルラン誘導体（STP) の合成》

100m lのナス型フラスコに、プルラン（Mw : 1 08000) 2. 0 g ( 無水グルコースユニットとして 12. 3 mm o 1 ) とジメチルスルホキシド 30 m lを加え、窒素雰囲気下 80°Cで撹拌して溶解させた。この溶液に、実施例 7 — 1で合成した N— (6 Tソシアナ一トへキシル）ステアリルカルパメート 7 0 m g (0 - 148 mm o 1 ) をピリジン 1. 4 7 g (14. 6 mm o 1， 1. 2 e q. ) に溶解した溶液を加え、 90°Cで 2時間反応させた。

反応終了後、ジメチルスルホキシドを減圧除去し、得られたオイル状の残渣をアセトン 30 Om 1に滴下して沈殿を生成させ、精製した。上澄み液を除去後、得られた沈殿にアセトン 20 Om 1を加え、室温でー晚放置した。沈殿を濾別採取した後、減圧乾燥した。得られた固体をジメチルスルホキシドに溶解し、これを透析膜（S p e c t r a社、 S p e c t r a ZP o r 3，分画分子量： 350 0) に充填し、蒸留水に対して一週間透析した。得られたポリマー溶液 1 5 Om 1を凍結乾燥することによリ、白色の固体（以下、アセトン精製物という場合がある）を 1. 60 g得た（収率 79. 2%) 。

XH-NMR ( ( δ ) p pm、 DMSO— d ₆/D₂0 = 20/1, v o l ) ： 0. 86— 1. 70、

2. 60-4. 60、

4. 60- 5. 30。

I R (KB r , cm-リ： 1680、 1 180— 900

以上のデータから、得られた化合物が下記式（10) で表されるステアリル一プルラン誘導体（STP) であることを確認した。

(10) 上記アセントで精製した精製物を実施例 1― 2と同様にプレパラティブ T LC を用いて分析した。その結果、前記式（9) で表されるステアリル二量体の存在は確認されなかった。またアセントで精製した精製物を¹ H— NMR解析し、プ口トン比によリステアリル二量体の含有率を算出した。その結果、ステアリル二量体の存在は確認されなかった。従って、上記アセントで精製した精製物中の前記式（9) で表されるステアリル二量体の含有量は 0重量％である。

また¹ H— NMRスぺクトルの積分値から、ステアリル基のプルランへの導入率を下記数式（B) によリ算出した。

(1 00 + 2 x) /43 x = b/a .·' (Β)

ここで、用いた記号は次の通リである。

a ：ステアリル基由来のピーク面積（ δ = 0. 86〜： I . 70)

b ·· プルラン由来のピーク面積（ δ =4. 60〜5. 30)

X ：単糖 100個当たリのステアリル基の置換度

上記計算の結果、ステアリル—プルラン誘導体におけるステアリル基の置換度は単糖 1 00個当たリ 0. 8個であることが分かった。

次に、上記で得られたァセトン精製物を実施例 1一 3と同様に超遠心分離によリ精製し、低分子量のプルラン（未置換のプルラン）を分離した。結果を表 6に示す。

表 6 アセトン精製物の S TPの含有量（重量⁰ /₀)

超遠心分離精製物の S TPの含有量（重量％)

未置換のプルランの含有量（重量％)

ステアリル二量体の含有量（重量％) 実施例 8— 1

《非プロトン極性溶媒による精製》

実施例 1— 2によって得たプルラン―コレステロール誘導体 1 0 gを、非極性溶媒であるジメチルスルホキシド（DMS O) 7 O gに溶解した後、この溶液へ水 1 40 0 gを加えてマグネチックスターラーで 1 0分間撹拌した。撹拌終了後、そのまま室温で 1時間静置した。上澄み層をデカンテーシヨンにょリ除去し、取リ出した量と同量の水を加えてマグネチックスターラーで 1 0分間撹拌し、その後 1時間静置した。この操作を計 2回行い、精製した。次に、下層に水 1 00 O gを加えた後、 2 日間凍結乾燥した。その結果、白色固体を 7. 5 g得た（収率 75%) 。結果を表 7および表 8にまとめる。

得られた白色固体に水を加えて 0. 2重量％溶液とし、プローブ型のソュケ一ター（T omy UR P、プローブ外径 5mm、 40W) で 1 5分間超音波照射した。超音波照射後のサンプルを下記条件でサイズ排除クロマトグラフィー（S E C) 分析した。結果を図 5に示した。図 5ではプルランのピークは見られず、未置換のプルランが除去された高純度プルラン一コレステロール誘導体が得られたことがわかる。

• S E Cの分析条件

使用機器： TOSOH HP S ECシステム（東ソ一（株）製、商標）カラム： T SK— g e l G 4 000 SWX L (東ソ一（株）製、商標）溶離液： 0. 0 2%— N a N₃イオン交換水

流量： 0. 5m l / i n

温度： 3 5°C

検出器： R I (示差屈折計）

実施例 8— 2〜 8 _ 6

表 7および表 8に示す疎水性基含有多糖類および非プロトン性極性溶媒を使用し、また表 7および表 8に示す精製条件で、実施例 8 _ 1 と同様の操作で精製操作を行った。すべて二層分離操作を 2回繰リ返して精製を行った。結果を表 7および表 8にまとめる。

得られた各疎水性基含有多糖類を S E C分析した結果、どの実施例のものも未置換の多糖類のピークは見られず、ほぼ 1 0 0重量％の疎水性基含有多糖類に精製されたことが確認された。

t

O ο 表 7 アセトン精製物結果

* 1 単糖 100個当たリの導入基の数

t to

〇 01 〇表 8 非プロトン性極性溶媒による精製および結果

DMS O ジメチルスルホキシド

DMF N, N—ジメチルホルムアミド

DMA c N, N ジメチルァセトアミド

非プロトン性極性溶媒を用いた精製方法においては、約 5時間で 1 0 gを精製

することができ、収率も 6 5重量％以上で良好であった。また 1回当たりの精製

工程は約 2時間であった。また精製量に関しても原理的に制限がなく、容易に大

量精製が可能である。以上の点から、非プロトン性極性溶媒を用いた精製方法は

5 工業的な大量製造に非常に有効であることが分かる。

産業上の利用可能性

本発明の製造方法にょリ得られる高純度疎水性基含有多糖類は、医薬物を含有

する薬物運搬体を被覆する被覆材料などの医用材料として使用することができる

1 0 。例えば、リボソームマイクロカプセル、マイクロスフェアー、 O /Wエマルシ

ョンまたは赤血球ゴースト等の薬物運搬体を被覆する被覆材料として使用するこ

とができる。この場合、本発明の高純度疎水性基含有多糖類は副生物および未置

換の多糖類の含有量が少なく高純度であるので、医用材料として安全に使用する

ことができる。

Claims

請求の範囲

1 . 第 1段階反応として、炭素数 1 2〜5 0の水酸基含有炭化水素またはステロールと、 O C N— R ¹— N C O (式中、 R ¹は炭素数：！〜 5 0の炭化水素基である。）で表されるジイソシアナ一ト化合物とを反応させて、炭素数 1 2〜5 0 の水酸基含有炭化水素またはステロールが 1分子反応したイソシアナ一ト基含有疎水性化合物を製造し、

第 2段階反応として、前記第 1段階反応で得られたイソシアナート基含有疎水性化合物と多糖類とをさらに反応させて、疎水性基として炭素数 1 2〜5 0の炭化水素基またはステリル基を含有する疎水性基含有多糖類を製造する方法において、

2 . 多糖類がプルラン、アミロぺクチン、アミロース、デキストラン、ヒドロキシェチノレセル口一ス、ヒドロキシェチノレデキストラン、マンナン、レバン、ィヌリン、キチン、キトサン、キシログルカンおよび水溶性セルロースからなる群よリ選択される 1種以上である請求の範囲第 1項記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

3 . ケトン系溶媒がアセトン、メチルェチルケトン、ジェチルケトンおよびジイソプロピルケトンからなる群よリ選択される 1種以上である請求の範囲第 1 項または第 2項記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

4 . 疎水性基含有多糖類は、一 X H基〔式中、 Xは酸素原子または N Yで表される含窒素基（ここで、 Yは水素原子または炭素数 1〜 1 0の炭化水素基である。）〕を有する多糖類において、その多糖類を構成する糖単位 1 00個あたリ、 0. 1 ~ 10個の— XH基が、下記式（ 1 )

H

(1)

〔式中、 Xは前記 Xと同じである。 R¹は H炭素数 1〜50の炭化水素基、 R²は炭素数 1 2~ 50の炭化水素基またはステリル基を示す。〕

請求の範囲第 1項ないし第 3項のいずれかに記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

5. 式（1) における R²がステリル基である請求の範囲第 4項記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

6. ケトン系溶媒で精製した精製物中の疎水性基含有多糖類の含有量が 80 重量％以上である請求の範囲第 1項ないし第 5項のいずれかに記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

7. 未置換の多糖類の含有量が 20重量％以下である請求の範囲第 6項記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

8. ジイソシアナート化合物中の 2個の NCO基が 2個とも炭素数 1 2〜5

0の水酸基含有炭化水素またはステロールと反応した不純物の含有量が 0. 05 重量％以下である請求の範囲第 6項または第 7項記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

9 . ケトン系溶媒で精製した精製物を超音波処理して水に微分散させ、次に超遠心分離によリさらに精製を行う請求の範囲第 1項ないし第 8項のいずれかに記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

1 0 . 超遠心分離により精製した精製物中の疎水性基含有多糖類の含有量が 9 8重量％以上である請求の範囲第 9項記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

1 1 . 未置換の多糖類の含有量が 2重量％以下である請求の範囲第 1 0項記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

1 2 . ジイソシアナート化合物中の 2個の N C O基が 2個とも炭素数 1 2〜

5 0の水酸基含有炭化水素またはステロールと反応した不純物の含有量が 0 . 0 5重量％以下である請求の範囲第 1 0項または第 1 1項記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

1 3 . ケトン系溶媒で精製した精製物を非プロトン性極性溶媒に溶解した後、その溶液に水を加えて混合し、未置換の多糖類を水層に移行させ、次に層分離した水層を分離除去することによリさらに精製を行う請求の範囲第 1項ないし第 8項のいずれかに記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

1 4 . ケトン系溶媒で精製した精製物に対して 3〜 5 0重量倍の非プロトン性極性溶媒を添加して溶解した後、その溶液に対して 5重量倍以上の水を添加して精製を行う請求の範囲第 1 3項記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

1 5 . 非プロトン性極性溶媒が Ν， Ν—ジメチルホルムアミド、 Ν， Ν—ジメチルァセトアミドおよびジメチルスルホキシドからなる群よリ選択される 1種以上である請求の範囲第 1 3項または第 1 4項記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

1 6 . 非プロトン性極性溶媒を用いて精製した精製物中の疎水性基含有多糖類の含有量が 9 8重量％以上である請求の範囲第 1 3項ないし第 1 5項のいずれかに記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

1 7 . 未置換の多糖類の含有量が 2重量％以下である請求の範囲第 1 6項記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

1 8 . ジイソシアナート化合物中の 2個の N C〇基が 2個とも炭素数 1 2〜 5 0の水酸基含有炭化水素またはステロールと反応した不純物の含有量が 0 . 0 2重量％以下である請求の範囲第 1 6項または第 1 7項記載の高純度疎水性基含有多糖類の製造方法。

1 9 . 第 1段階反応として、炭素数 1 2〜5 0の水酸基含有炭化水素またはステロールと、 O C N— R ¹— N C O (式中、 R ¹は炭素数：！〜 5 0の炭化水素基である。 ) で表されるジイソシアナート化合物とを反応させて、炭素数 1 2〜5 0の水酸基含有炭化水素またはステロールが 1分子反応したィソシアナ一ト基含有疎水性化合物を製造し、

第 2段階反応として、前記第 1段階反応で得られたイソシアナ一トと多糖類とをさらに反応させて、疎水性基として炭素数 1 2〜5 0の炭化水素基またはステリル基を含有する疎水性基含有多糖類を製造し、

— XH基〔式中、 Xは酸素原子または NYで表される含窒素基（ここで、 Yは水素原子または炭素数 1〜1 0の炭化水素基である。）〕を有する多糖類において、その多糖類を構成する糖単位 100個あたリ、 0. 1〜1 0個の一 XH基が、下記式（1)

0 0

U

X一 C R¹— N— C一〇一

H

(1)

で表される疎水性基で置換された疎水性基含有多糖類を 80重量％以上含有する高純度疎水性基含有多糖類。

20. 多糖類がプルラン、アミロぺクチン、アミロース、デキストラン、ヒドロキシェチノレセノレ口一ス、ヒドロキシェチノレデキストラン、マンナン、レノン、ィヌリン、キチン、キトサン、キシログルカンおよび水溶性セルロースからなる群よリ選択される 1種以上である請求の範囲第 1 9項記載の高純度疎水性基含有多糖類。

21. 式（1) における R²がステリル基である請求の範囲第 1 9項または第 20項記載の高純度疎水性基含有多糖類。

2 2 . 未置換の多糖類の含有量が 2 0重量％以下である請求の範囲第 1 9項ないし第 2 1項のいずれかに記載の高純度疎水性基含有多糖類。

2 3 . ジイソシアナート化合物中の 2個の N C O基が 2個とも炭素数 1 2〜 5 0の水酸基含有炭化水素またはステロールと反応した不純物の含有量が 0 . 0 5重量％以下である請求の範囲第 1 9項ないし第 2 2項のいずれかに記載の高純度疎水性基含有多糖類。

2 4 . ケトン系溶媒で精製した精製物を超音波処理して水に微分散させ、次に超遠心分離によリさらに精製して得られるものである請求の範囲第 1 9項ないし第 2 3項のいずれかに記載の高純度疎水性基含有多糖類。

2 5 . ケトン系溶媒で精製した精製物を非プロトン性極性溶媒に溶解した後、その溶液に水を加えて混合し、未置換の多糖類を水層に移行させ、次に層分離した水層を分離除去することによリさらに精製して得られるものである請求の範囲第 1 9項ないし第 2 3項のいずれかに記載の高純度疎水性基含有多糖類。