WO2000022120A1 - Polypeptides (mbp1) capables d'interagir avec les mutants oncogeniques de la proteine p53 - Google Patents

Polypeptides (mbp1) capables d'interagir avec les mutants oncogeniques de la proteine p53 Download PDF

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protein
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mbpl
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Emmanuel Conseiller
Laurent Debussche
William Gallagher
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Aventis Pharma SA
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to the field of biology and regulation of the cell cycle. More particularly, the present invention relates to novel polypeptides capable of interacting specifically with oncogenic forms of the p53 protein.
  • the wild-type p53 protein is involved in regulating the cell cycle and in maintaining the integrity of the cell genome.
  • This protein the main function of which is to activate the transcription of certain genes, is capable of blocking the cell in the G1 phase of the cell cycle when mutations appear during the replication of the genome, and d 'trigger a number of DNA repair processes.
  • This blocking in Gl phase is mainly due to the activation of the p2I / WAFl gene.
  • this protein is capable of inducing the phenomenon of programmed cell death, called apoptosis.
  • the p53 protein acts as a tumor suppressor, eliminating cells that are abnormally differentiated or whose genome has been damaged.
  • the p53 protein contains 393 amino acids, which define 5 functional domains (see Figure 1):
  • the transcription activator domain consisting of amino acids 1 to 73, capable of binding certain factors of the general transcription machinery such as the TBP protein.
  • This area is also the site of a number of post-translational modifications. It is also the site of numerous interactions of the p53 protein with many other proteins and in particular with the cellular protein MDM2 or the EBNA5 protein of Epstein-Barr virus (EBV), capable of block the function of wild protein.
  • this domain has amino acid sequences called PESTs of susceptibility to proteolytic degradation.
  • the nuclear localization signal consisting of amino acids 315 to 325, essential for the correct addressing of the protein in the compartment where it will exercise its main function.
  • This region 325 to 355 forms a structure of type: ⁇ -sheet (326-334)-elbow (335-336) - ⁇ helix (337-355).
  • the alterations of functions localized in this region are essentially due to the interaction of the wild protein with the different mutant forms which can lead to variable effects on the function of the wild protein.
  • the regulatory domain consisting of amino acids 365 to 393, which is the site of a certain number of post-translational modifications (glycosylations, phosphorylations, RNA binding, ...) which modulate the function of the p53 protein in a positive or negative way.
  • This domain plays an extremely important role in modulating the activity of wild protein.
  • weak mutants the product of which is a non-functional protein, which, in the case of a mutation in only one of the two alleles, does not affect the functioning of the wild protein encoded by the other allele.
  • the main representative of this category is the H273 mutant specific for familial Li-Fraumeni syndrome of hypersensitivity to cancerous conditions.
  • Mutants in this category have lost their transactivating capacity and are more stable than wild-type protein. They are incapable of inhibiting the transformation of rat embryonic fibroblasts and they function as oncogenes by cooperating with the activated form of RAS in the transformation of rat embryonic fibroblasts (Eliyahu et al, Nature 312 (1984) 646 / Parada et al, Nature 312 (1984) 649). This behavior can be explained by two different mechanisms which are not mutually exclusive;
  • these mutants generate a non-functional protein, which, in the case of a mutation in only one of the two alleles and by interaction with the wild-type protein, is capable of blocking the functioning thereof by the formation of mixed oligomers which are not -actives which can no longer bind to the DNA sequences specific for the wild-type protein.
  • a mechanism is invoked in the case where the malignant transformation of the cells is observed after transfection of the mutants in the presence of endogenous p53.
  • these mutants can also exhibit a "gain in function" phenotype.
  • Their expression in non-tumorigenic cells not expressing endogenous p53 leads to the appearance of tumors in athymic mice (Dittmer et al,
  • the present invention therefore results from the discovery by the applicant of new polypeptides capable of interacting specifically with different forms of the p53 protein. More precisely, the present invention results from the identification, isolation and characterization of a new protein and of the corresponding gene, said protein being characterized in that it is capable of interacting specifically with the oncogenic forms of p53 and with mutants H175 and G281 in particular. This protein is called MBPl for p53 Mutant Binding Protein. The present invention also results from the demonstration that another protein, fibulin2, is capable of interacting specifically with the oncogenic forms of p53 and with the mutants H 175 and G281 in particular.
  • the present invention also results from the discovery of the particular properties of these new protein partners of p53 which, unexpectedly, also prove to be capable of blocking the anti-proliferative effects of the wild form of p53.
  • these polypeptides have a positive effect on cell growth.
  • the MBPl protein has the characteristics of an immortalizing oncogene by cooperating with the activated form of the Ras protein for cell transformation.
  • these polypeptides constitute a therapeutic target of choice for the treatment of cancers linked to mutations in the p53 protein.
  • polypeptides which have intrinsic oncogenic properties, constitute potential new targets for the treatment of cancer in general.
  • a first object of the invention therefore relates to polypeptides capable of interacting specifically with the oncogenic forms of p53. These polypeptides are further capable of stimulating cell growth and blocking the antiproliferative effects of the wild form of p53.
  • these polypeptides comprise all or part of a sequence chosen from the polypeptide sequences SEQ ID No. 9 (C-terminal fragment of murine MBP1) or SEQ ID No. 16 (murine MBP1) or a derivative of these.
  • these polypeptides comprise all or part of a sequence chosen from the polypeptide sequences SEQ ID No. 31 (human C-terminal fragment MBPl) or SEQ ID No. 22 (human MBPl) or a derivative of those -this.
  • these polypeptides comprise all or part of the polypeptide sequence SEQ ID No. 33 (C-terminal fibulin-2 murine fragment) or a derivative thereof.
  • polypeptides of the invention are represented by the polypeptide sequence SEQ ID No. 22 or its derivatives
  • derived polypeptide sequence designates any polypeptide sequence differing from the sequence considered, obtained by one or more modifications of genetic and / or chemical nature, and possessing the capacity to interact with the mutated oncogenic forms of p53 .
  • modification of genetic and / or chemical nature one can hear any mutation, substitution, deletion, addition and / or modification of one or more residues.
  • Such derivatives can be generated for different purposes, such as in particular that of modifying their properties of binding to mutated oncogenic forms of p53, or of increasing their therapeutic efficacy or of reducing their side effects, or that of conferring on them new properties. pharmacokinetics and / or biological.
  • another subject of the invention relates to the polypeptide sequences which exhibit biological functions comparable to those of the polypeptides according to the invention and in particular the capacity to interact with the mutated oncogenic forms of p53 and which exhibit a degree of identity at least 80% and preferably at least 90% with the polypeptide sequence SEQ ID No 16 or the polypeptide sequence SEQ ID No 22 or the polypeptide sequence SEQ ID No 33.
  • the polypeptide sequences according to the invention have at least 95% and more preferably at least 97% of identity with the polypeptide sequence SEQ ID No 16 or the polypeptide sequence SEQ ID No 22 or the polypeptide sequence SEQ ID N ° 33.
  • polypeptide sequences according to the invention have at least 98% identity and more preferably at least 99% identity with the polypeptide sequence SEQ ID No. 16 or the polypeptide sequence SEQ ID No. 22 or the polypeptide sequence SEQ ID No. 33.
  • derived polypeptide sequence also includes fragments of the polypeptide sequences indicated above. Such fragments can be generated in different ways. In particular, they can be synthesized chemically, on the basis of the sequences given in the present application, using the peptide synthesizers known to those skilled in the art. They can also be synthesized genetically, by expression in a cellular host of a nucleotide sequence coding for the peptide sought. In this case, the sequence nucleotide can be prepared chemically using an oligonucleotide synthesizer, based on the peptide sequence given in the present application and the genetic code.
  • the nucleotide sequence can also be prepared from the sequences given in the present application, by enzymatic cleavages, ligation, cloning, etc., according to techniques known to those skilled in the art, or by screening DNA libraries with elaborate probes from these sequences.
  • Another subject of the present invention relates to the nucleotide sequences SEQ ID No 15, SEQ ID No 21 and SEQ ID No 32 coding respectively for the polypeptide sequences presented in the sequences SEQ ID No 16, or SEQ ID No 22 or SEQ ID N ° 33.
  • the nucleotide sequences comprise all or part of the sequence SEQ ID No. 15 or SEQ ID No. 21 or their derivatives.
  • the nucleotide sequences comprise all or part of the nucleotide sequence SEQ ID No. 32 (cDNA corresponding to the C-term fragment of murine fibulin-2) or of its derivatives.
  • the nucleotide sequences comprise the sequence SEQ ID No. 23 (murine cDNA MBP1, partial sequence), or the sequence SEQ ID No. 30 (cDNA corresponding to the C-term fragment of human MBPl).
  • the nucleotide sequence is represented by the sequence SEQ ID No. 21 or its derivatives.
  • derived nucleotide sequence designates any sequence different from the sequence considered due to the degeneracy of the genetic code, obtained by one or more modifications of genetic and / or chemical nature, as well as any sequence hybridizing with these sequences or fragments thereof and coding for a polypeptide according to the invention.
  • modification of genetic and / or chemical nature one can hear any mutation, substitution, deletion, addition and / or modification of one or more residues.
  • derived nucleotide sequence also includes sequences homologous to the sequence considered, originating from other cellular sources and in particular from cells of human origin, or from other organisms.
  • the present invention relates to any nucleotide sequence which has at least 70% identity and preferably at least 85% identity with the nucleotide sequence SEQ ID No. 21 or the nucleotide sequence SED ID No. 15 or the sequence nucleotide SEQ ID No. 32.
  • the nucleotide sequence according to the invention has at least 90% and more preferably at least 93% identity with the nucleotide sequence SEQ ID No 21 or the nucleotide sequence SED ID No 15 or the nucleotide sequence SEQ ID N ° 32.
  • sequences according to the invention have at least 95% and more preferably 97%, even 98% or even 99% identity with the nucleotide sequence SEQ ID N ° 21 or the nucleotide sequence SED ID N ° 15 or the nucleotide sequence SEQ ID N ° 32.
  • Such homologous sequences can be obtained by hybridization experiments.
  • the hybridizations can be carried out from nucleic acid libraries, using as probe, the native sequence or a fragment thereof, under variable hybridization conditions.
  • Another subject of the invention relates to nucleotide sequences capable of hybridizing under conditions of high stringency with the nucleotide sequences defined above.
  • high stringency condition means that hybridization occurs if the nucleotide sequences have at least 95% and preferably at least 97% identity.
  • Such sequences can in particular be used as detection probes with RNA or cDNA or genomic DNA to isolate nucleotide sequences coding for polypeptides according to the invention.
  • Such probes generally have at least 15 bases.
  • these probes are at least 30 bases and can have more than 50 bases.
  • these probes have between 30 and 50 bases.
  • the nucleotide sequences according to the invention can be of artificial origin or not. They can be genomic sequences, cDNA, RNA, hybrid sequences or synthetic or semi-synthetic sequences. These sequences can be obtained for example by screening DNA libraries (cDNA library, genomic DNA library) by means of probes produced on the basis of sequences presented above. Such libraries can be prepared from cells of different origins by standard molecular biology techniques known to those skilled in the art.
  • the nucleotide sequences of the invention can also be prepared by chemical synthesis or also by mixed methods including chemical or enzymatic modification of sequences obtained by screening of libraries.
  • the nucleic acids of the invention can be prepared according to any technique known to those skilled in the art.
  • the name oncogenic forms or mutated oncogenic forms of p53 denotes the dominant-oncogenic mutants, whose product is a protein that has lost the ability to bind DNA and is actively involved in neoplastic transformation. Mutants in this category have lost their transactivating capacity and are more stable than wild-type protein. Representatives of this category of p53 mutants include the mutant forms H175, G281, W248, and A143.
  • Another object of the present invention relates to a process for the preparation of the polypeptides according to the invention according to which a cell containing a nucleotide sequence according to the invention is cultivated, under conditions of expression of said sequence and the polypeptide produced is recovered.
  • the part coding for said polypeptide is generally placed under the control of signals allowing its expression in a cellular host.
  • the choice of these signals can vary depending on the cell host used.
  • the nucleotide sequences of the invention can be part of a vector which can be autonomously replicating or integrative. More particularly, autonomously replicating vectors can be prepared using autonomously replicating sequences in the chosen host. As integrative vectors, these can be prepared, for example, by using sequences homologous to certain regions of the host genome, allowing, by homologous recombination, the integration of the vector.
  • the present invention also relates to host cells transformed with a nucleic acid comprising a nucleotide sequence according to the invention.
  • the cellular hosts which can be used for the production of the peptides of the invention by the recombinant route are both eukaryotic and prokaryotic hosts.
  • suitable eukaryotic hosts there may be mentioned animal cells, yeasts, or fungi.
  • yeasts mention may be made of yeasts of the genus Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, or Hansenula.
  • insect cells SF9 or SF21
  • COS CHO
  • C127 cells of neuroblastomas humans etc.
  • the mushrooms there may be mentioned more particularly Aspergillus ssp. or Trichoderma ssp.
  • prokaryotic hosts it is preferred to use the following bacteria E.coli, Bacillus, or Streptomyces.
  • the host cells are advantageously represented by recombinant yeast strains for the expression of the nucleic acids of the invention as well as the production of proteins derived from these.
  • the host cells comprise at least one sequence or a sequence fragment chosen from the nucleotide sequences SEQ ID No 15, No 21, No 32, No 23 and No 30 for the production of the polypeptides according to the invention .
  • nucleic acid sequences Another application of the nucleic acid sequences according to the invention is the production of antisense oligonucleotides or genetic antisenses usable as pharmaceutical agents.
  • the antisense sequences are small oligonucleotides, complementary to the coding strand of a given gene, and therefore capable of specifically hybridizing with the transcribed mRNA, inhibiting translation into protein.
  • the subject of the invention is therefore the antisense sequences capable of inhibiting, at least partially, the expression of polypeptides capable of interacting with p53 such as the protein MBP1 or fibulin2.
  • Such sequences can consist of all or part of the nucleotide sequences defined above and can be obtained by fragmentation, etc. or by chemical synthesis.
  • nucleotide sequences according to the invention can be used for the transfer and production in vitro, in vivo or ex vivo of antisense sequences or for the expression of proteins or polypeptides capable of interacting with the p53 protein.
  • nucleotide sequences according to the invention can be incorporated into viral or non-viral vectors, allowing their administration in vitro, in vivo or ex vivo.
  • the vector of the invention can be for example a plasmid, a cosmid or any DNA not encapsulated by a virus, a phage, an artificial chromosome, a recombinant virus etc. It is preferably a plasmid or a recombinant virus.
  • viral vectors in accordance with the invention, mention may very particularly be made of vectors of the adenovirus, retrovirus, adeno-associated virus, herpes virus or vaccinia virus type.
  • the present application also relates to defective recombinant viruses comprising a heterologous nucleic sequence coding for a polypeptide according to the invention.
  • the invention also allows the production of nucleotide probes, synthetic or not, capable of hybridizing with the nucleotide sequences defined above or of the corresponding mRNAs.
  • probes can be used in vitro as a diagnostic tool, for the detection of the polypeptides according to the invention and in particular of the human MBPl protein or of fibulin 2.
  • These probes can also be used for the detection of genetic anomalies (poor splicing, polymorphism, point mutations, etc.).
  • These probes can also be used for the detection and isolation of homologous nucleic acid sequences coding for the polypeptides as defined above, from other cellular sources and preferably from cells of human origin.
  • the probes of the invention generally comprise at least 10 nucleotides, preferably at least 15 nucleotides, and more preferably at least 20 nucleotides. Preferably, these probes are marked prior to their use. For this, different techniques known to those skilled in the art can be used (radioactive, enzymatic labeling, etc.).
  • the invention also relates to the use of nucleotide probes, synthetic or not, capable of hybridizing with the nucleotide sequences coding for the protein MBP1 for carrying out diagnostic tests for cancerous tissues, based on the detection of the level of expression. from MBPl.
  • nucleotide probes which can be used for this application, mention may in particular be made of the sequences SEQ ID No. 27 and SEQ ID No. 28. These nucleotide probes make it possible to detect the amplification of the expression of the protein MBPl. These probes can be RNA or DNA probes.
  • the present invention demonstrates that an amplification of messenger RNA coding for the human MBPl protein can be detected in certain types of human tumors and in particular in the case of colon cancers.
  • the invention also relates to a method of diagnosing cancer comprising detecting the amplification of the expression of the gene coding for the human MBPl protein.
  • Another object of the invention resides in antibodies or fragments of polyclonal or monoclonal antibodies directed against a polypeptide as defined above.
  • Such antibodies can be generated by methods known to those skilled in the art.
  • these antibodies can be prepared by immunization of an animal against a polypeptide whose sequence is chosen from the sequences SEQ ID No. 9 (murine C-terminal MBPl fragment) or SEQ ID No. 31 (human C-terminal MBPl fragment) ) or the polypeptide sequences SEQ ID No. 22 (human MBPl) or SEQ ID No. 33 (C-term Fibulin-2 fragment) or any fragment or derivative thereof, then blood collection and isolation of antibodies.
  • These antibodies can also be generated by preparing hybridomas according to techniques known to those skilled in the art.
  • a subject of the invention is also single chain ScFv antibodies derived from the monoclonal antibodies defined above.
  • Such single chain antibodies can be obtained according to the techniques described in US Patents 4,946,778, US 5,132,405 and US 5,476,786.
  • the antibodies or antibody fragments according to the invention can in particular be used to inhibit and / or reveal the interaction between p53 and the polypeptides as defined above.
  • Another object of the present invention relates to a method of identifying compounds capable of binding to the polypeptides according to the invention.
  • the detection and / or isolation of these compounds can be carried out according to the following steps:
  • a molecule or a mixture containing different molecules, possibly unidentified, is brought into contact with a polypeptide of the invention under conditions allowing interaction between said polypeptide and said molecule in the event that the latter has an affinity for said polypeptide, and,
  • such a method makes it possible to identify molecules capable of opposing or blocking the activity of stimulating cell growth of the polypeptides according to the invention and in particular of the human MBPl protein or Fibulin 2 or fragments derived from these proteins. These molecules are also likely to have anti-cancer properties and to oppose the function of immortalizing oncogenes presented by MBP1 or the polypeptides derived from MBP1 which cooperate with the activated form of the Ras protein for cell transformation.
  • Another object of the invention relates to the use of a ligand identified and / or obtained according to the method described above as a medicament.
  • Such Ligands are indeed capable of treating certain ailments involving a dysfunction of the cell cycle and in particular cancers.
  • Another object of the present invention relates to a method for identifying compounds capable of modulating or totally or partially inhibiting the interaction between the mutated oncogenic forms of p53 and the polypeptides according to the invention.
  • a mutated form of p53 or a fragment thereof to a polypeptide according to the invention is carried out; it may be mutated forms of p53 such as H175, G281, W248, or A143 or a fragment thereof, it is preferably the H 175 form or also the G281 form.
  • this method of the invention is suitable for the detection and / or isolation of agonists and antagonists of the interaction between the mutated forms of p53 and the polypeptides of the invention.
  • the invention provides a method of identifying molecules capable of block the interaction between mutated forms of p53 and human MBPl protein or human fibulin 2. Such a method makes it possible to identify molecules capable of opposing the effects of the action of the polypeptides according to the invention with the mutated forms of p53.
  • such compounds are capable of preventing oncogenic cooperation between the MBP1 protein and the oncogenic mutant forms of p53 such as in particular H 175.
  • another object of the invention relates to the use of a ligand or of a modulator identified and / or obtained according to the method described above as a medicament.
  • ligands or modulators are indeed capable of treating certain ailments involving a dysfunction of the cell cycle and in particular of cancers.
  • the invention also provides non-peptide or non-exclusively peptide compounds which can be used pharmaceutically. It is indeed possible, from the active protein motifs described in the present application, to produce molecules inhibiting the interaction of MBP1 or fibulin2 with the oncogenic mutated forms of p53, these molecules being not exclusively peptide and compatible with pharmaceutical use.
  • the invention relates to the use of a polypeptide of the invention as described above for the preparation of non-peptide, or not exclusively peptide, pharmacologically active molecules, by determination of the structural elements of this polypeptide which are important for its activity and reproduction of these elements by non-peptide or not exclusively peptide structures.
  • the invention also relates to pharmaceutical compositions comprising one or more molecules thus prepared.
  • the subject of the invention is also any pharmaceutical composition comprising as active principle at least one ligand obtained according to one and / or the other of the methods described above, and / or at least one antibody or antibody fragment, and / or an antisense oligonucleotide, and / or a non-exclusively peptide compound as described above.
  • compositions according to the invention can be used to modulate the interaction of the mutated oncogenic forms of p53 with the MBP1 or Fibulin 2 polypeptides and therefore can be used to modulate the proliferation of certain cell types. More particularly, these pharmaceutical compositions are intended for the treatment of diseases involving a dysfunction of the cell cycle and in particular for the treatment of cancers. These are in particular cancers associated with the presence of oncogenic mutants of p53.
  • Figure 1 Functional domains of the wild-type p53 protein.
  • TA Field activating transcription
  • DNB DNA binding domain
  • NLS nuclear location signal
  • OL domain of oligomerization
  • REG regulatory domain.
  • Figure 2 Interaction between the protein C-mbpl and the proteins p53 and H 175 in mammalian cells.
  • Figure 3 Interaction between the protein C-fibulin2 and the proteins p53 and H 175 in mammalian cells.
  • Figure 4 Comparison of protein sequences encoded by mMBPl (murine) and hMBPl (human) cDNAs.
  • Figure 5 Comparative effects of the proteins C-mbpl and murine MBPl on growth cell of tumor cells.
  • Figure 6 Expression of mRNA coding for the protein MBPl in mice.
  • Figure 7 Expression of mRNA coding for the protein MBPl in different human tissues.
  • Figure 8 Expression of messenger RNA encoding the human MBPl protein in colon tumors.
  • the human p53 gene was cloned by an amplification chain reaction
  • PCR on DNA from a human placenta bank (Clontech) using oligonucleotides 5'-1 and 3'-393.
  • Oligonucleotide 5'-l (SEQ ID No. 1): AGATCTGTATGGAGGAGCCGCAG
  • Oligonucleotide 3'-393 (SEQ ID N ° 2):
  • the cDNA carrying a point mutation on amino acid 175 of the human p53 protein was obtained by site-directed mutagenesis on the p53 DNA (described in example 1-a) using the Amersham kit. , using the oligonucleotide H 175 of sequence:
  • the cDNA carrying a point mutation on amino acid 248 of the human p53 protein was obtained by site-directed mutagenesis on the p53 DNA (described in example 1-a) using the Amersham kit. , using the oligonucleotide W248 of sequence:
  • the cDNA carrying a point mutation on amino acid 273 of the human p53 protein was obtained by site-directed mutagenesis on the p53 DNA (described in example 1-a) using the Amersham kit. , using the oligonucleotide H273 of sequence: Oligonucleotide H273 3 '(SEQ ID No. 5):
  • the cDNA carrying a point mutation on amino acid 281 of the human p53 protein was obtained by site-directed mutagenesis on the p53 DNA (described in example 1-a) using the Amersham kit. , using the oligonucleotide G281 of sequence:
  • This fragment was designated G281.
  • This example describes the construction of a cDNA encoding amino acids 73 to 393 of the wild-type human p53 protein (73-393wt).
  • This cDNA was obtained by amplification chain reaction (PCR) on the p53 DNA (described in example 1-a) with the oligonucleotide 3 '-393 (SEQ ID No. 2) and the oligonucleotide 5'-73 next:
  • This example describes the construction of a cDNA coding for amino acids 73 to 393 of the H 175 mutant of the human p53 protein (73-393H 175).
  • This cDNA was obtained by amplification chain reaction (PCR) on the DNA of the mutant (described in example 1-b) with the oligonucleotides 3 '-393 (SEQ ID No. 2) and 5'-73 (SEQ ID N ° 7).
  • EXAMPLE 2 Construction of the Expression Vectors in Yeast of the 73-393 t and 73-393H175 Fragments Fused to the DNA Binding Domain of the Gal4 Protein and of the Different Forms of the Whole Human (Wild and Mutated) P53 to the GaI4 protein transcription activation domain
  • This example describes the construction of vectors allowing the expression in yeast of the fragments 73-393wt and 73-393H175 in the form of a fusion with the DNA binding domain of the protein Gal4 (DB) of yeast S. cerevisiae for their use in the double-hybrid system and for the screening of cDNA libraries fused to the transcription activation domain (transactivator) of the same Gal4 protein (TA).
  • DB DNA binding domain of the protein Gal4
  • TA transcription activation domain
  • Fragments 73-393wt and 73-393H175 were cloned into the vector pPC97 (Chevray et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 5789) using the recognition site by the restriction enzyme Bgl II .
  • This example describes the obtaining of the H 175 protein partners by the double-hybrid system using the mouse embryo cDNA library pPC67 (Chevray et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 5789 ), and the characterization, using the same double-hybrid system, of these partners in terms of specificity of interaction with the different forms of the human p53 protein (wild and mutated).
  • the YCM17 strain used for the isolation of partners and for the characterization of their interaction with the different forms of the human p53 protein by the double-hybrid system is a yeast strain of the genus Saccharomyces cerevisiae which has the following genotype:
  • This yeast strain makes it possible to detect a positive response in a double-hybrid system by the appearance of the Ura + phenotype and / or the Ura + / LacZ + double phenotype.
  • the strain TG1 used for the purification of plasmid DNAs is a strain of bacteria of the genus E.coli which has the following genotype:
  • the YCM17 strain was transformed by the method of Gietz et al (Yeast 11 (1995) 355) with l ⁇ g of the plasmid pMAl thus allowing the obtaining of the YMA1 strain which expresses the protein DB-H175.
  • the YMA1 strain was transformed by the same method as that used in Example Cl.3 using lOO ⁇ g of DNA from the pPC67 library, allowing 3.5.10 7 transformants to be obtained, of which 404 have the Ura + phenotype and 14 the double Ura + / LacZ + phenotype.
  • the plasmid DNA contained in the 14 clones having the double Ura + / LacZ + phenotype was isolated by the method of Ward (Nucl. Acids Res. 18 (1990) 5319) before being used to transform the TG1 strain.
  • the corresponding plasmids from the library were then purified and grouped into two different subgroups of plasmids, each containing a cDNA encoding two different proteins:
  • C-fibulin2 the fusion proteins with the activation domain of the transcription of Gal4
  • TA-C- mbpl the fusion proteins with the activation domain of the transcription of Gal4
  • TA-C- fibulin2 the fusion proteins with the activation domain of the transcription of Gal4
  • the plasmids pPC86, TA-C-MBP1 and TA-C-FIB2 were reintroduced into the strain YCM17 by co-transformation with different plasmids : the plasmid pPC97 coding for the protein DB, the plasmid pMAl coding for the protein DB-H175, the plasmid pECIO coding for the protein DB-wt and the plasmid pPC76 coding for a fusion protein between the DNA link domain of the Gal4 protein and a fragment of the human Fos protein (amino acids 132 to 211) (Chevray et al, Proc.
  • Table 1 Specificity of the interaction between the DB-H175 protein and the TA-C-mbpl and TA-C-fibulin2 proteins
  • the cDNAs encoding C-mbpl and C-fibulin2 were extracted from the plasmids TA-C-MBPl and TA-C-FIB2, then cloned into the vector pPC97 using the recognition sites by the restriction enzymes Sal I and Not I .
  • the fusion proteins with the DNA binding domain of Gal4 thus obtained are called respectively DB-C-mbpl and DB-C-fibulin2 and the corresponding plasmids DB-C-MBP1 and DB-C-FIB2.
  • the proteins DB-C-mbpl and DB-C-fibulin2 were tested against fusions of the activation domain of the transcription of Gal4 with the whole forms of the protein p53 (wild or mutant) described in the example 2-b, using a yeast strain different from the YCM17 strain, the PCY2 strain
  • Table 2 Specificity of the interaction between the proteins DB-C-mbpl and DB-C- fibulin2 and the proteins TA-H175 and TA-G281
  • This example describes the construction of plasmids for the expression of different proteins in mammalian cells and the characterization of the interaction between the proteins C-mbpl and C-fibulin2 and the different forms of the protein p53 in mammalian cells.
  • This example describes the construction of a vector allowing the expression in mammalian cells of proteins carrying a label derived from the protein c-myc (amino acids 410-419) and recognized by the antibody 9E10 (Oncogene Science).
  • This construction was carried out using as base vector the mammalian expression vector pSV2, described in DNA Cloning, A practical approach Vol.2, D.M. Glover (Ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985.
  • the cDNA comprising the sequence coding for the c-myc tag as well as a cloning multisite (MCS) was constructed from the following 4 oligonucleotides: c-myc 5 '(SEQ ID N ° 10):
  • oligonucleotides have complementarities two by two (c-myc 5 '/ c-myc 3', MCS 5 '/ MCS 3') and overlapping complementarities (c-myc 3 '/ MCS 5') allowing obtaining the desired nucleotide sequence by simple hybridization and ligation.
  • These oligonucleotides were phosphorylated using T4 kinase, then hybridized all together and inserted into the expression vector pSV2 previously digested with the restriction enzymes Bgl II and Sac I. The resulting vector is the vector pBFA 107.
  • the cDNAs coding for the proteins C-mbpl and C-fibulin2 were extracted from the plasmids TA-C-MBP1 and TA-C-FIB2 and cloned in the mammalian expression vector pBFA 107 using the recognition sites by the enzymes of restriction Sal I and Not I.
  • the plasmids pBFA107-C-MBPl and pBFA107-C-FIB2 are thus obtained
  • This example describes the demonstration in mammalian cells of the interaction between the proteins C-mbpl and C-fibulin2 and the different forms of the protein p53. These experiments were carried out by transient transfection and co-immunoprecipitation in H1299 cells (tumor cells of the 'Non Small Cell Lung Cancer' type) deficient for the two alleles of the p53 protein (Mitsudomi et al, Oncogene 1 (1992) 171). .
  • the cells (10 6 ) are seeded in 10 cm diameter petri dishes containing 8 ml of DMEM medium (Gibco BRL) added with 10% of heat-inactivated fetal calf serum, and cultured overnight in an incubator co. (5%) at 37 ° C.
  • the different constructions are then transfected using lipofectAMINE (Gibco BRL) as transfection agent in the following manner: 6 ⁇ g of total plasmid (3 ⁇ g of each plasmid coding for each of the two partners) are incubated with 20 ⁇ l of lipofectAMINE (Gibco BRL) for 30 min with 3 ml of Opti-MEM medium (Gibco BRL) (transfection mixture).
  • the cells are rinsed twice with PBS and then incubated for 4 h at 37 ° C. with the transfection mixture, after which the latter is aspirated and replaced with 8 ml of DMEM medium supplemented with 10% fetal calf serum. heat inactivated and cells returned to grow at 37 ° C.
  • PBS then scraped, washed again twice in PBS and resuspended in 200 ⁇ l of lysis buffer (HNTG: Hepes 50 mM pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10% glycerol) added with protease inhibitors (Aprotinin 2 ⁇ g / ml, pepstatin 1 ⁇ g / ml, leupeptin 1 ⁇ g / ml, E64 2 ⁇ g / ml and Pefabloc 1 mM), incubated 30 min at 4 ° C and centrifuged 15 min at 15,000 ⁇ m and 4 ° C.
  • HNTG Hepes 50 mM pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 10% glycerol
  • protease inhibitors Aprotinin 2 ⁇ g / ml, pepstatin 1 ⁇ g / ml, leupeptin
  • the cell extract thus obtained is subjected to a “pre-clearing” step by incubation for 1 hour at 4 ° C. with 16 ⁇ l of a pre-immune rabbit serum, then 30 min at 4 ° C. with 200 ⁇ l of immunoprecipitin (Gibco BRL) prepared according to the supplier's recommendations. Subsequently, the cell extract thus cleaned is separated into 3 equal batches, each of which is incubated overnight at 4 ° C.
  • the pellet containing the immunoprecipitin is then washed twice with 1 ml of HNTG buffer supplemented with protease inhibitors, then resuspended in 30 ⁇ l of deposition buffer on acrylamide gel (Laemmli, Nature 227 (1970) 680) and incubated 5 min at 95 ° C. After 15 sec centrifugation at 15,000 ⁇ m, the supernatants are deposited on polyacrylamide gel in denaturing medium (Novex) and the proteins separated using the XCell II migration system (Novex) according to the supplier's recommendations, then transferred to the PVDF membrane ( NEN Life Science Products) using the same XCell I system
  • Antico ⁇ s 9E10 and DO1 used for revealing the transferred proteins are coupled to biotin LCnHS (Pierce) according to the supplier's recommendations.
  • the transfer membranes are firstly incubated for 1 h at 4 ° C. in 10 ml of TTBSN buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.02% NaN 3 , Tween 20 0.1 %) supplemented with 3% serum bovine albumin (BSA) (TTBSN-BSA), then 2 h at room temperature with 10 ml of a TTBSN-BSA solution containing the biotinylated antico ⁇ s 9E10 (1 ⁇ g / ml).
  • TTBSN buffer 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.02% NaN 3 , Tween 20 0.1 % supplemented with 3% serum bovine albumin (BSA) (TTBSN-BSA)
  • TTBSN-BSA serum bovine albumin
  • the membranes are then incubated for 1 h at room temperature with 10 ml of a TTBSN-BSA solution containing ExtrAvidin-Peroxidase (Sigma Immuno Chemicals) at l / e 5000, again washed 6 times TTBSN and treated with ECL reagent (Amersham) for the revelation of proteins by chemiluminescence.
  • the same membranes are then treated with the biotinylated DOl antico ⁇ s after having been previously dehybridized (Ellis et al, Nature 343 (1990) 377) and following the same protocol as for the antico ⁇ s 9E10.
  • the H 1299 cells were transfected with the following combinations of plasmids before immunoprecipitation and Western-blot:
  • This control is used to examine whether or not H 175 can interact either with the myc tag or with a fusion between the myc tag and any protein, the protein Sam68 described by Lock et al (Cell 84 (1996) 23), n not supposed to interact with the different forms of the p53 protein.
  • the H 1299 cells were transfected with the following combinations of plasmids before immunoprecipitation and Western-blot:
  • the p53 protein can adopt two different conformations during the cell cycle; the so-called 'suppressor' conformation (wild conformation, PAb 1620 + / PAb 240 -) and the so-called 'promoter' conformation (mutant conformation, PAb 1620 - / PAb 240 +) (Milner & Watson, Oncogene 2 (1990) 1683).
  • proteins C-mbpl and C-fibulin 2 are also capable of having an effect on specific functions of the wild form of the protein p53.
  • This example describes the effects of the protein C-mbpl on a property of the oncogenic mutant H 175, its capacity to cooperate with the mutated form of the proto-oncogene Ras (Ras-Val 12) in the oncogenic transformation of rat embryonic fibroblasts Fibroblasts rat embryos (REF) were prepared from rats
  • the cells contained in each of the dishes are scraped and then reseeded on three 10 cm petri dishes and cultured for 15 days before being stained with violet crystal according to the protocol described by C. Finlay ( Methods in Enzymology 255 (1995) 389). The transformation centers are then visualized and counted.
  • the plasmids used during this series of experiments are the following:
  • pSG5 (Stratagene)
  • expression plasmid of the Ras-Vall2 protein pEJ-Ras (Shih & Weinberg,
  • Each transfection point contains a mixture of three plasmids at a rate of 7 ⁇ g of each plasmid.
  • the results of two independent experiments are reported in Table 3.
  • Example 6 Effect of the C-mbpl and C-fibulin2 Proteins and Relationship with the Effects of the Different Forms of the P53 Protein on the Cell Growth of Tumor Cells
  • This example describes the effects of the proteins C-mbpl and C-fibulin2 on the cell growth of tumor cells and their relationship with the effects of the different forms of the protein p53 on this same cell growth.
  • the plasmids used during this series of experiments are the following:
  • Protocol for forming colonies resistant to neomycin 48 hours after transfection, the cells are scraped and transferred to 2 Petri dishes of 10 cm in diameter and re-cultured with 10 ml of DMEM medium supplemented with 10% inactivated fetal calf serum with heat and containing 400 ⁇ g / ml of geneticin (G418). After a selection of 15 days in the presence of G418, the number of Neo- - colonies is determined by counting after staining with fuchsin.
  • the proteins C-mbpl and C-fibulin2 are capable of blocking the antiproliferative effect of the protein p53, and this independently of their proliferative effect - the proliferative effect of the proteins C-mbpl and C-fibulin2 is greatly increased in the presence of the protein H 175
  • Example 7 Cloning of cDNAs encoding the whole form of the murine and human MBP1 proteins.
  • This example describes the cloning of cDNAs encoding the whole murine MBP1 protein and the use of these data for the cloning of a human MBP1 homolog.
  • the cDNA coding for the C-terminal part of the murine mbpl protein was cloned by amplification chain reaction (PCR) on the DNA of the murine embryo SuperScript library (8.5 days) (Gibco BRL) using the oligonucleotide 3'-mMBP1 and the oligonucleotide SP6 (Gibco BRL).
  • Oligonucleotide 3'-mMBPl (SEQ ID N ° 14): CGGTACTGGCAGAGGTAACTGG
  • This amplification made it possible to obtain a single product having a size of approximately 800 base pairs which was then cloned directly after PCR into the vector pCRII (Invitrogene) and sequence.
  • the sequence thus obtained shows an overlap of 368 base pairs with C-MBP 1 (SEQ ID No. 8) with a strict sequence identity on this common part.
  • the murine MBPl gene sequence was used for a homology search in Genbank. This research made it possible to show a strong homology with the sequence of a human EST (gl 548384). From this sequence, two cDNA fragments were cloned by amplification chain reaction (PCR) on the DNA of the SuperScript library of human testis (Gibco BRL) using the oligonucleotides 3'-hMBPl and SP6 ( Gibco BRL) on the one hand, and the oligonucleotides 5'-hMBPl and T7 (Gibco BRL) on the other hand.
  • PCR amplification chain reaction
  • Oligonucleotide 3'-hMBPl (SEQ ID No. 17): CTCCGCTCCGAGGTGATGGTC
  • Oligonucleotide 5'-hMBP 1 (SEQ ID No. 18):
  • This example describes the compared effects of the proteins C-mbpl and murine mbpl on the cell growth of tumor cells and their relationship with the effects of the protein H 175 on this same cell growth.
  • pSV2-Neo conferring resistance to neomycin: pSV2-Neo for a total amount of 0.4 ⁇ g
  • neomycin resistant colony formation protocol used is that described in Example 6.
  • the results of this experiment are presented in Table 6 and Figure 5.
  • the results of this experiment show that the murine mbpl protein has the same characteristics as the C-mbpl protein, namely a positive effect on cell growth which is greatly increased in the presence of the H175 protein.
  • This example describes the compared effects of the proteins C-mbpl, murine mbpl and human mbpl in an experiment of oncogenic cooperation with the Ras-Vall2 protein.
  • Human MBPl have the same characteristics as the C-mbpl protein, namely the ability to cooperate with the Ras-Vall2 protein for the transformation of rat embryonic fibroblasts.
  • the fibroblasts thus transformed have a very particular mo ⁇ hological aspect which differs from that obtained with the oncogene c-myc.
  • Example 9 Expression of the MBPl Protein in Mice and in Human Tissues This example describes the study of the expression of the messenger RNA of MBP1 in mice and in various human tissues.
  • the mMBPl and hMBPl probes consist of the corresponding cDNAs.
  • the GAPDH probe (control) was generated by amplification chain reaction (PCR) on the DNA of the SuperScript library of human testis (Gibco BRL) (GAPDH) using the following oligonucleotides:
  • Antisense-GAPDH oligonucleotide (SEQ ID No. 25): AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC
  • the probes were radiolabeled with 32 P-dCTP using the Rediprime kit
  • the probes used in this experiment are the mMBPl and GAPDH probes.
  • the membranes used in this experiment contain one of the mouse embryo mRNAs obtained at different stages of development, and the other of the mRNAs representative of different tissues of adult mice.
  • this messenger presents variations in expression levels during development, with a high abundance in the early stages (7 days) then a significant decrease (11 days) to reach an apparently constant level.
  • 3 - this messenger is moderately expressed in all of the adult tissues tested, with the exception of an important expression in the lungs and the testes.
  • This example describes the study of the expression of the messenger RNA of MBP1 in different human tissues.
  • the probes used in this experiment are the hMBPl and GAPDH probes.
  • the membranes used contain mRNAs representative of different human tissues.
  • the results of this experiment ( Figure 7) clearly indicate that:
  • the mRNAs coding for the human protein (s) mbp 1 as well as their murine counterpart exhibit a high level of expression in tissues with a high growth rate, and that the product (s) of the human MBPl gene could therefore also be involved in cell growth processes.
  • proteins C-mbpl, MBP1 and C-fibulin2 exhibit an intrinsic proliferative activity, and the protein C-mbpl acts as an immortalizing oncogene by cooperating with the activated form of the protein Ras for cell transformation.
  • proteins C-mbpl, MBPl and C-fibulin2 exhibit an intrinsic proliferative activity, and the proteins C-mbpl and MBPl act as immortalizing oncogenes by cooperating with the activated form of the protein Ras for cell transformation.
  • MBP1 protein has increased oncogenic properties compared to the c-MBP 1 polypeptide.
  • the chromosomal localization of the MBPl gene was carried out according to a four-step protocol (Lichter et al, Science 247 (1990) 64) (Heng et al, Chromosoma 102 (1993) 325) (Kischkel et al, Cytogenet. Cell Genêt. 82 (1998) 95): - labeling of the cDNA with biotin by nick-translation
  • this region of chromosome 11 is also the site of amplification events associated with different solid tumors (esophagus, head and neck, bladder, breast and lung) (Lammie & Peters, Cancer Cells 3 (1991) 413).
  • the MBPl gene could therefore not only be associated with a certain number of cancers but also with a large number of pathologies presenting disorders of renal, neurodegenerative, bone and other types.
  • pathologies we can cite in particular: acute renal deficiencies such as those associated with Mac Ardle's disease, retinis pigmentosa and certain forms of blindness and deafness such as those associated with Usher syndrome type 1B, hyperthyroidism such as form associated with endocrine neoplasia type I, pathologies linked to a defect in retinal pigmentation such as those encountered in Best's dystrophy, insulin-dependent diabetes, neurodegenerative pathologies such as those associated with cerebrospinal ataxia 5, retinal dystrophies, kidney disorders such as the forms encountered in Bardet-Biedl syndrome, and osteoporosis.
  • This example describes a semi-quantitative analysis of the expression of the messenger RNA coding for the human protein MBPl, carried out in parallel on 9 colon tumors and 9 samples of healthy tissue (colon) from the same patients.
  • RNA NOW solution (Ozyme) and the protocol recommended by the supplier.
  • a cDNA synthesis was carried out using the First-Strand cDNA Synthesis kit (Amersham Pharmacia Biotech) using 1.5 ⁇ g of total RNA and according to the supplier's recommendations.
  • the MBPl and ⁇ -actin (control) genes were amplified by PCR using an amount of cDNA for which the level of PCR product is directly correlable with the concentration of substrate and the following cycle program: 1 cycle 2min at 95 ° C
  • oligonucleotides used for these amplifications are the following
  • Sense oligonucleotide-MBPl (SEQ ID No. 27) GCCCTGATGGTTACCGCAAGA
  • Antisense-MBPl oligonucleotide AGCCCCCATGGAAGTTGACAC
  • Sense- ⁇ -actin oligonucleotide (SEQ ID No. 29) GTGGGGCGCCCCAGGCACCA
  • Antisense- ⁇ -actin oligonucleotide (SEQ ID No. 26)
  • PCR products thus generated were then analyzed by electrophoresis on 1% agarose gel.
  • the results presented in FIG. 8 clearly show that the messenger RNA coding for the human MBPl protein is amplified in five of the tumors studied in comparison with the healthy tissue originating from the same patient, regardless of the grade of the tumor and independently of their status regarding the Ras and p53 genes.
  • results of this example therefore show that an amplification of the messenger RNA coding for the human MBPl protein can be detected in certain types of human tumors and therefore underline a potential role of the protein MBPl in the appearance and / or the development of these tumors.

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Abstract

La présente invention concerne le domaine de la biologie et de la régulation du cycle cellulaire. Plus particulièrement, la présente invention concerne de nouveaux polypeptides capables d'interagir spécifiquement avec les formes oncogéniques de la protéine p53.

Description

POLYPEPTIDE (MBPl) CAPABLE D' INTERAGIR AVEC LES MUTANTS ONCOGENIQUES DE LA PROTEINE P53
La présente invention concerne le domaine de la biologie et de la régulation du cycle cellulaire. Plus particulièrement, la présente invention concerne de nouveaux 5 polypeptides capables d' interagir spécifiquement avec les formes oncogéniques de la protéine p53.
La protéine p53 sauvage intervient dans la régulation du cycle cellulaire et dans le maintien de l'intégrité du génome de la cellule. Cette protéine, dont la fonction principale est d'être un activateur de la transcription de certains gènes, est 0 susceptible de bloquer la cellule en phase Gl du cycle cellulaire lors de l'apparition de mutations au cours de la réplication du génome, et d'enclencher un certain nombre de processus de réparation de l'ADN. Ce blocage en phase Gl est dû principalement à l'activation du gène p2I/WAFl. De plus, en cas de mauvais fonctionnement de ces processus de réparation ou en cas d'apparition d'événements mutationnels trop 5 nombreux pour être corrigés, cette protéine est capable d'induire le phénomène de mort cellulaire programmée, appelé apoptose.
De cette façon, la protéine p53 agit comme un supresseur de tumeur, en éliminant les cellules anormalement différenciées ou dont le génome a été endommagé.
0 La protéine p53 comporte 393 acides aminés, qui définissent 5 domaines fonctionnels (voir Figure 1) :
- le domaine activateur de la transcription, constitué par les acides aminés 1 à 73, capable de lier certains facteurs de la machinerie générale de transcription comme la protéine TBP. Ce domaine est aussi le siège d'un certain nombre de modifications 5 post-traductionnelles. Il est également le siège de nombreuses interactions de la protéine p53 avec de nombreuses autres protéines et notamment avec la protéine cellulaire MDM2 ou la protéine EBNA5 du virus d'Epstein-Barr (EBV), capables de bloquer la fonction de la protéine sauvage. De plus, ce domaine possède des séquences d'acides aminés dites PEST de susceptibilité à la dégradation protéolytique.
- le domaine de liaison à l'ADN, localisé entre les acides aminés 73 et 315. La conformation de ce domaine central de p53 régule la reconnaissance de séquences d'ADN spécifiques de la protéine p53. Ce domaine est le siège de deux types d'altérations affectant la fonction de la protéine sauvage :
(i) l'interaction avec des protéines bloquant la fonction de la protéine p53 comme l'antigène 'grand T' du virus SV40 ou les protéines virales E6 des virus HPV16 et HPV18 capables de provoquer sa dégradation par le système de l'ubiquitine. Cette dernière interaction ne peut se faire qu'en présence de la protéine cellulaire E6ap (enzyme E3 de la cascade de l'ubiquitinilation).
(ii) les mutations ponctuelles qui affectent la fonction de la protéine p53 et dont la quasi-totalité observée dans les cancers humains sont localisées dans cette région.
- le signal de localisation nucléaire, constitué des acides aminés 315 à 325, indispensable au bon adressage de la protéine dans le compartiment où elle va exercer sa principale fonction.
- le domaine d'oligomérisation, constitué des acides aminés 325 à 355. Cette région 325 à 355 forme une structure de type : feuillet β (326-334)-coude (335-336)- hélice α (337-355). Les altérations de fonctions localisées dans cette région sont essentiellement dues à l'interaction de la protéine sauvage avec les différentes formes mutantes qui peuvent conduire à des effets variables sur la fonction de la protéine sauvage.
- le domaine de régulation, constitué des acides aminés 365 à 393, qui est le siège d'un certain nombre de modifications post-traductionnelles (glycosylations, phosphorylations, fixation d'ARN,...) qui modulent la fonction de la protéine p53 de façon positive ou négative. Ce domaine joue un rôle extrêmement important dans la modulation de l'activité de la protéine sauvage.
Le fonctionnement de la protéine p53 peut être perturbé de différentes façons :
- par le blocage de sa fonction par un certain nombre de facteurs comme par exemple l'antigène 'grand T' du virus SV40, la protéine EBNA5 du virus d'Epstein- Barr, ou la protéine cellulaire MDM2.
- par la déstabilisation de la protéine par augmentation de sa susceptibilité à la protéolyse, notamment par interaction avec la protéine E6 des virus du papillome humain HPV16 et HPV18, qui favorise l'entrée de la p53 dans le cycle d'ubiquitinilation. Dans ce cas l'interaction entre ces deux protéines ne peut se faire que par la fixation préalable d'une protéine cellulaire, la protéine E6ap dont le site de fixation est mal connu.
- par des mutations ponctuelles au niveau du gène de la protéine p53.
- par délétion d'un ou des deux allèles de p53
Les deux derniers types de modifications sont retrouvés dans environ 50% des différents types de cancer. A cet égard, les mutations du gène de la proéine p53 répertoriées dans les cellules cancéreuses touchent une très grande partie du gène codant pour cette protéine, et ont pour résultats des modifications variables du fonctionnement de cette protéine. On peut cependant noter que ces mutations sont en grande majorité localisées dans la partie centrale de la protéine p53 dont on sait qu'elle est la région de contact avec les séquences génomiques spécifiques de la protéine p53. Ceci explique pourquoi la plupart des mutants de la protéine p53 ont comme principale caractéristique de ne plus pouvoir se fixer aux séquences d'ADN que reconnaît la protéine sauvage et ainsi de ne plus pouvoir exercer leur rôle de facteur de transcription. On regroupe actuellement l'ensemble de ces modifications dans deux catégories :
- les mutants dits faibles, dont le produit est une protéine non-fonctionnelle, qui, dans le cas de mutation sur un seul des deux allèles, n'affecte pas le fonctionnement de la protéine sauvage codée par l'autre allèle. Le principal représentant de cette catégorie est le mutant H273 spécifique du syndrome familial de Li-Fraumeni d'hypersensibilité aux affections cancéreuses.
- les mutants dominant-oncogéniques, dont le produit est une protéine qui a perdu la capacité de se lier à l'ADN et qui participe activement à la transformation néoplasique. Les mutants de cette catégorie ont perdu leur capacité transactivatrice et sont plus stables que la protéine sauvage. Ils sont incapables d'inhiber la transformation des fibroblastes embryonnaires de rat et ils fonctionnent comme oncogènes en coopérant avec la forme activée de RAS dans la transformation de fibroblastes embryonnaires de rat (Eliyahu et al, Nature 312 (1984) 646 / Parada et al, Nature 312 (1984) 649). Ce comportement peut être expliqué par deux mécanismes différents non exclusifs l'un de l'autre ;
(i) ces mutants génèrent une protéine non-fonctionnelle, qui, dans le cas de mutation sur un seul des deux allèles et par interaction avec la protéine sauvage, est capable de bloquer le fonctionnement de celle-ci par formation d'oligomères mixtes non-actifs qui ne peuvent plus se fixer aux séquences d'ADN spécifiques de la protéine sauvage. Un tel mécanisme est invoqué dans le cas où l'on observe la transformation maligne des cellules après transfection des mutants en présence de p53 endogène.
(ii) ces mutants peuvent de plus présenter un phénotype "gain de fonction". Leur expression dans des cellules non tumorigènes n'exprimant pas de p53 endogène conduit à l'apparition de tumeurs chez la souris athymique (Dittmer et al,
Nature Genetics 4 (1993) 42). Ces mutants sont capables d'activer la trancription des gènes comme MDR ou PCNA n'ayant pas de séquences consensus reconnues par p53 ; activation qui se fait probablement par recrutement des facteurs de transcription spécifiques des mutants et qui peut participer à l'apparition du phénotype tumoral (Chin et al, Science 255 (1992) 459; Deb et al, J. Virol. 66 (1992) 6164). Enfin, il a été rapporté récemment que ces mutants peuvent perturber l'attachement de certaines régions de l'ADN (MAR/SAR) au réseau de la matrice nucléaire (Mϋller et al, Oncogene 12 (1996) 1941).
De nombreux partenaires cellulaires ont été décrits pour la protéine p53. Certains intéragissent aussi bien avec les conformations sauvage et mutées de la protéine et d'autres sont spécifiques de l'une ou l'autre des conformations (Iwabuchi et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 6098). Il est concevable que certaines de ces propriétés 'gain de fonction' puissent être médiées par des partenaires protéiques spécifiques des mutants de p53, cependant de tels partenaires n'ont encore jamais été identifiés. L'identification de tels partenaires permettrait de nouvelles approches dans les thérapies anti-cancéreuses basées sur la modification ou le contrôle de ces interactions et sur l'obtention de composés capables d'interférer dans l'interaction de ces partenaires protéiques avec les différentes formes de p53. La présente invention satisfait ce besoin et apporte en outre d'autres avantages.
Dans le but d'étudier ce phénotype "gain de fonction" susceptible d'impliquer des interactions protéine-protéine spécifiques de ce type de mutant, le système double-hybride a été utilisé pour rechercher des partenaires spécifiques du mutant H 175, principal représentant de cette catégorie de mutants. Une banque de cDNA d'embryon de souris, fusionnée à la séquence du domaine de transactivation de GAL4 (TA), a été criblée dans la souche de levure YCM17 en utilisant comme protéine appât le domaine 73-393 du mutant H 175 fusionné au domaine de liaison à l'ADN de Gal4 (DB). Ce criblage a permis d'isoler deux cDNA codant pour deux protéines différentes : la protéine MBPl et la Fibuline-2..
Les interactions entre ces deux protéines et le mutant H 175 de la protéine p53 ont pu être confirmées en cellules mammifères et des effets fonctionnels ont pu être démontrés, aussi bien sur des propriétés de la forme mutée de la p53 que sur des propriétés de la forme sauvage.
La présente invention résulte donc de la mise en évidence par la demanderesse de nouveaux polypeptides capables d'interagir spécifiquement avec différentes formes de la protéine p53. Plus précisément la présente invention résulte de l'identification, l'isolement et la caractérisation d'une nouvelle protéine et du gène correspondant, la dite protéine étant caractérisée en ce qu'elle est capable d'interagir spécifiquement avec les formes oncogéniques de p53 et avec les mutants H175 et G281 en particulier. Cette protéine est appelée MBPl pour p53 Mutant Binding Protein. La présente invention résulte également de la mise en évidence qu'une autre protéine, la fibuline2, est capable d'interagir spécifiquement avec les formes oncogéniques de p53 et avec les mutants H 175 et G281 en particulier.
La présente invention résulte également de la découverte des propriétés particulières de ces nouveaux partenaires protéiques de p53 qui de manière inattendue s'avèrent également être capables de bloquer les effets anti-prolifératifs de la forme sauvage de p53.
Ces nouveaux partenaires protéiques de p53 présentent en outre une synergie d'action très importante avec les mutants oncogéniques de p53, cette synergie s'exerce aussi bien pour la coopération oncogénique avec la forme activée de la protéine Ras que sur l'effet prolifératif des formes mutées de p53.
De plus et indépendamment de toute interaction avec p53, ces polypeptides présentent un effet positif sur la croissance cellulaire. En outre, un de ces partenaires, la protéine MBPl, présente les caractéristiques d'un oncogene immortalisant en coopérant avec la forme activée de la protéine Ras pour la transformation cellulaire.
De part la spécificité et les effets synergiques que présentent ces nouveaux partenaires de p53 vis à vis de certaines formes mutées de p53, ces polypeptides constituent une cible thérapeutique de choix pour le traitement des cancers liés aux mutations de la protéine p53.
En outre, ces polypeptides qui présentent des propriétés oncogéniques intrinsèques, constituent de nouvelles cibles potentielles pour le traitement du cancer en général.
Un premier objet de l'invention concerne donc des polypeptides capables d'interagir spécifiquement avec les formes oncogéniques de p53. Ces polypeptides sont en outre capables de stimuler la croissance cellulaire et de bloquer les effets anti-prolifératifs de la forme sauvage de p53.
Selon un premier mode de réalisation, ces polypeptides comprennent tout ou partie d'une séquence choisie parmi les séquences polypeptidiques SEQ ID N° 9 (fragment C-terminal de MBPl murine) ou SEQ ID N°16 (MBPl murine) ou un dérivé de celles-ci.
Selon un autre mode de réalisation, ces polypeptides comprennent tout ou partie d'une séquence choisie parmi les séquences polypeptidiques SEQ ID N°31 (fragment C-terminal MBPl humaine) ou SEQ ID N°22 (MBPl humaine) ou un dérivé de celles-ci.
Enfin selon encore un autre mode de réalisation, ces polypeptides comprennent tout ou partie de la séquence polypeptidique SEQ ID N° 33 (fragment C-terminal Fibuline-2 murine) ou un dérivé de celle-ci.
De manière préférée les polypeptides de l'invention sont représentés par la séquence polypeptidique SEQ ID N°22 ou ses dérivées
Au sens de la présente invention, le terme séquence polypeptidique dérivée désigne toute séquence polypeptidique différant de la séquence considérée, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, et possédant la capacité d'interagir avec les formes mutées oncogéniques de p53. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus. De tels dérivés peuvent être générés dans des buts différents, tels que notamment celui de modifier leurs propriétés de liaison au formes mutées oncogéniques de p53, ou d'augmenter leur efficacité thérapeutique ou de réduire leurs effets secondaires, ou celui de leur conférer de nouvelles propriétés pharmacocinétiques et/ou biologiques.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne les séquences polypeptidiques qui présentent des fonctions biologiques comparables à celles des polypeptides selon l'invention et notamment la capacité à interagir avec les formes mutées oncogéniques de p53 et qui présentent un degré d'identité d'au moins 80 % et de préférence au moins 90 % avec la séquence polypeptidique SEQ ID N° 16 ou la séquence polypeptidique SEQ ID N°22 ou la séquence polypeptidique SEQ ID N°33.
De préférence, les séquences polypeptidiques selon l'invention présentent au moins 95 % et de préférence encore au moins 97 % d'identité avec la séquence polypeptidique SEQ ID N° 16 ou la séquence polypeptidique SEQ ID N°22 ou la séquence polypeptidique SEQ ID N°33.
De manière plus particulièrement préférée, les séquences polypeptidiques selon l'invention présentent au moins 98 % d'identité et de préférence encore au moins 99 % d'identité avec la séquence polypeptidique SEQ ID N° 16 ou la séquence polypeptidique SEQ ID N°22 ou la séquence polypeptidique SEQ ID N°33.
Le terme séquence polypeptidique dérivée comprend également les fragments des séquences polypeptidiques indiquées ci-dessus. De tels fragments peuvent être générés de différentes façons. En particulier, ils peuvent être synthétisés par voie chimique, sur la base des séquences données dans la présente demande, en utilisant les synthétiseurs peptidiques connus de l'homme du métier. Ils peuvent également être synthétisés par voie génétique, par expression dans un hôte cellulaire d'une séquence nucléotidique codant pour le peptide recherché. Dans ce cas, la séquence nucléotidique peut être préparée chimiquement en utilisant un synthétiseur d'oligonucléotides, sur la base de la séquence peptidique donnée dans la présente demande et du code génétique. La séquence nucléotidique peut également être préparée à partir des séquences données dans la présente demande, par coupures enzymatiques, ligature, clonage, etc, selon les techniques connues de l'homme du métier, ou par criblage de banques d'ADN avec des sondes élaborées à partir de ces séquences.
Un autre objet de la présente invention concerne les séquences nucléotidiques SEQ ID N°15, SEQ ID N°21 et SEQ ID N°32 codant respectivement pour les séquences polypeptidiques présentées dans les séquences SEQ ID N° 16, ou SEQ ID N°22 ou SEQ ID N°33.
Selon un mode particulier de l'invention, les séquences nucléotidiques comprennent tout ou partie de la séquence SEQ ID N° 15 ou SEQ ID N° 21 ou de leurs dérivées.
Selon un autre mode de l'invention, les séquences nucléotidiques comprennent tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID N° 32 (cDNA correspondant au fragment C-term de fibuline-2 murine) ou de ses dérivées.
Selon encore un autre mode, les séquences nucléotidiques comprennent la séquence SEQ ID N°23(cDNA MBPl murine , séquence partielle), ou la séquence SEQ ID N°30 (cDNA correspondant au fragment C-term de MBPl humaine).
Selon un mode préféré, la séquence nucléotidique est représentée par la séquence SEQ ID N° 21 ou ses dérivées.
Au sens de la présente invention, le terme séquence nucléotidique dérivée désigne toute séquence différant de la séquence considérée en raison de la dégénérescence du code génétique, obtenue par une ou plusieurs modifications de nature génétique et/ou chimique, ainsi que toute séquence hybridant avec ces séquences ou des fragments de celles-ci et codant pour un polypeptide selon l'invention. Par modification de nature génétique et/ou chimique, on peut entendre toute mutation, substitution, délétion, addition et/ou modification d'un ou plusieurs résidus.
Le terme séquence nucléotidique dérivée comprend également les séquences homologues à la séquence considérée, issues d'autres sources cellulaires et notamment de cellules d'origine humaine, ou d'autres organismes.
A cet égard la présente invention concerne toute séquence nucléotidique qui présente au moins 70 % d'identité et de préférence au moins 85 % d'identité avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°21 ou la séquence nucléotidique SED ID N° 15 ou la séquence nucléotidique SEQ ID N°32.
De préférence, la séquence nucléotidique selon l'invention présente au moins 90 % et de préférence encore au moins 93 % d'identité avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°21 ou la séquence nucléotidique SED ID N°15 ou la séquence nucléotidique SEQ ID N°32.
De manière plus particulièrement préférée, les séquences selon l'invention présentent au moins 95 % et de préférence encore 97 %, voire 98 % ou même 99 % d'identité avec la séquence nucléotidique SEQ ID N°21 ou la séquence nucléotidique SED ID N° 15 ou la séquence nucléotidique SEQ ID N°32.
De telles séquences homologues peuvent être obtenues par des expériences d'hybridation. Les hybridations peuvent être réalisées à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde, la séquence native ou un fragment de celle-ci, dans des conditions variables d'hybridation. Un autre objet de l'invention concerne des séquences nucléotidiques capables de s'hybrider dans des conditions de stringence élevée avec les séquences nucléotidiques définies ci-avant.
A cet égard, le terme condition de stringence élevée signifie que l'hybridation se produit si les séquences nucléotidiques présentent au moins 95 % et préférentiellement au moins 97 % d'identité.
Comme indiqué ci-avant, de telles séquences peuvent être notamment utilisées comme sondes de détection avec du RNA ou du cDNA ou du DNA génomique pour isoler des séquences nucléotidiques codant pour des polypeptides selon l'invention. De telles sondes ont généralement au moins 15 bases. De préférence, ces sondes font au moins 30 bases et peuvent avoir plus de 50 bases. De manière préférée, ces sondes ont entre 30 et 50 bases.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être d'origine artificielle ou non. Il peut s'agir de séquences génomiques, d'ADNc, d'ARN, de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques. Ces séquences peuvent être obtenues par exemple par criblage de banques d'ADN (banque d'ADNc, banque d'ADN génomique) au moyen de sondes élaborées sur la base de séquences présentées ci-avant. De telles banques peuvent être préparées à partir de cellules de différentes origine par des techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent également être préparées par synthèse chimique ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. D'une manière générale les acides nucléiques de l'invention peuvent être préparés selon toute technique connue de l'homme du métier.
Au sens de la présente invention la dénomination formes oncogéniques ou forme mutées oncogéniques de p53 désigne les mutants dominant-oncogéniques, dont le produit est une protéine qui a perdu la capacité de se lier à l'ADN et qui participe activement à la transformation néoplasique. Les mutants de cette catégorie ont perdu leur capacité transactivatrice et sont plus stables que la protéine sauvage. Les représentants de cette catégorie de mutants de p53 sont notamment les formes mutantes H175, G281, W248, et A143.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de préparation des polypeptides selon l'invention selon lequel on cultive une cellule contenant une séquence nucléotidique selon l'invention, dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le polypeptide produit. Dans ce cas, la partie codant pour ledit polypeptide est généralement placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Le choix de ces signaux (promoteurs, terminateurs, séquence leader de sécrétion, etc.) peut varier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. Par ailleurs, les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent faire partie d'un vecteur qui peut être à réplication autonome ou intégratif. Plus particulièrement, des vecteurs à réplication autonome peuvent être préparés en utilisant des séquences à réplication autonome chez l'hôte choisi. S'agissant de vecteurs intégratifs, ceux-ci peuvent être préparés, par exemple, en utilisant des séquences homologues à certaines régions du génome de l'hôte, permettant, par recombinaison homologue, l'intégration du vecteur.
La présente invention a également pour objet des cellules hôtes transformées avec un acide nucléique comportant une séquence nucléotidique selon l'invention. Les hôtes cellulaires utilisables pour la production des peptides de l'invention par voie recombinante sont aussi bien des hôtes eucaryotes que procaryotes. Parmi les hôtes eucaryotes qui conviennent, on peut citer les cellules animales, les levures, ou les champignons. En particulier, s'agissant de levures, on peut citer les levures du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Schwanniomyces, ou Hansenula. S'agissant de cellules animales, on peut citer les cellules d'insectes (SF9 ou SF21), les cellules COS, CHO, C127, de neuroblastomes humains etc. Parmi les champignons, on peut citer plus particulièrement Aspergillus ssp. ou Trichoderma ssp. Comme hôtes procaryotes, on préfère utiliser les bactéries suivantes E.coli, Bacillus, ou Streptomyces.
Selon un mode préféré, les cellules hôtes sont avantageusement représentées par des souches de levures recombinantes pour l'expression des acides nucléiques de l'invention ainsi que la production des protéines dérivées de ceux-ci.
Préférentiellement, les cellules hôtes comprennent au moins une séquence ou un fragment de séquence choisis parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N°15, N°21, N°32, N°23 et N° 30 pour la production des polypeptides selon l'invention.
Une autre application des séquences d'acides nucléiques selon l'invention est la réalisation d'oligonucléotides antisens ou d'antisens génétiques utilisables comme agents pharmaceutiques. Les séquences antisens sont des oligonucléotides de petite taille, complémentaires du brin codant d'un gène donné, et de ce fait capables d'hybrider spécifiquement avec l'ARNm transcrit, inhibant la traduction en protéine. L'invention a ainsi pour objet les séquences antisens capables d'inhiber, au moins partiellement , l'expression de polypeptides capables d'interagir avec la p53 comme la protéine MBPl ou la fibuline2. De telles séquences peuvent être constituées par tout ou partie des séquences nucléotidiques définies ci-avant et peuvent être obtenus par fragmentation, etc. ou par synthèse chimique.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour le transfert et la production in vitro, in vivo ou ex vivo de séquences antisens ou pour l'expression de protéines ou de polypeptides capables d'interagir avec la protéine p53. A cet égard les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être incorporées dans des vecteurs viraux ou non viraux, permettant leur administration in vitro, in vivo ou ex vivo.
Un autre objet de l'invention concerne en outre tout vecteur comprenant une séquence nucléotidique définie ci-avant. Le vecteur de l'invention peut être par exemple un plasmide, un cosmide ou tout ADN non encapsidé par un virus, un phage, un chromosome artificiel, un virus recombinant etc. Il s'agit de préférence d'un plasmide ou d'un virus recombinant.
A titre de vecteurs viraux conformes à l'invention on peut tout particulièrement citer les vecteurs de type adénovirus, rétrovirus, virus adéno- associés, virus de l'herpès ou virus de la vaccine. La présente demande a également pour objet des virus recombinants défectifs comprenant une séquence nucléique hétérologue codant pour un polypeptide selon l'invention.
L'invention permet également la réalisation de sondes nucléotidiques, synthétiques ou non, capables de s'hybrider avec les séquences nucléotidiques définies ci-avant ou des ARNm correspondants. De telles sondes peuvent être utilisées in vitro comme outil de diagnostic, pour la détection des polypeptides selon l'invention et notamment de la protéine MBPl humaine ou de la fibuline 2. Ces sondes peuvent également être utilisées pour la mise en évidence d'anomalies génétiques (mauvais épissage, polymorphisme, mutations ponctuelles, etc). Ces sondes peuvent ausi être utilisées pour la mise en évidence et l'isolement de séquences d'acides nucléiques homologues codant pour les polypeptides tels que définis précédemment, à partir d'autres sources cellulaires et préférentiellement de cellules d'origines humaines. Les sondes de l'invention comportent généralement au moins 10 nucléotides, de préférence au moins 15 nucléotides, et de préférence encore au moins 20 nucléotides. Préférentiellement, ces sondes sont marquées préalablement à leur utilisation. Pour cela, différentes techniques connues de l'homme du métier peuvent être employées (marquage radioactif, enzymatique, etc).
L'invention concerne également l'utilisation de sondes nucléotidiques, synthétiques ou non, capables de s'hybrider avec les séquences nucléotidiques codant pour la protéine MBPl pour la réalisation de test de diagnostic de tissus cancéreux , basés sur la détection du niveau d'expression de MBPl. A titre d'exemple de sondes nucléotidiques utilisables pour cette application, on peut citer notamment les séquences SEQ ID N°27 et SEQ ID N°28. Ces sondes nucléotidiques permettent de détecter l'amplification de l'expression de la protéine MBPl. Ces sondes peuvent être des sondes ARN ou ADN. La présente invention met en évidence qu'une amplification de TARN messager codant pour la protéine MBPl humaine peut-être décelée dans certains types de tumeurs humaines et notamment dans le cas de cancers du colon. A cet égard, l'invention concerne également un procédé de diagnostic du cancer comportant le fait de détecter l'amplification de l'expression du gène codant pour la protéine MBPl humaine.
Un autre objet de l'invention réside dans des anticorps ou fragments d'anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre un polypeptide tel que défini ci-avant. De tels anticorps peuvent être générés par des méthodes connues de l'homme du métier. En particulier ces anticorps peuvent être préparés par immunisation d'un animal contre un polypeptide dont la séquence est choisie parmi les séquences SEQ ID N°9 (fragment C-terminal MBPl murine) ou SEQ ID N°31 (fragment C-terminal MBPl humaine) ou les séquences polypeptidiques SEQ ID N°22 (MBPl humaine) ou SEQ ID N°33 (fragment C-term Fibuline-2) ou tout fragment ou dérivé de celles-ci, puis prélèvement du sang et isolement des anticorps. Ces anticorps peuvent également être générés par préparation d'hybridomes selon les techniques connues de l'homme de l'art.
L'invention a également pour objet des anticorps simple chaîne ScFv dérivés des anticorps monoclonaux définis ci-avant. De tel anticorps simple chaîne peuvent être obtenus selon les techniques décrites dans les brevet US 4,946,778, US 5,132,405 et US 5,476,786.
Les anticorps ou fragments d'anticorps selon l'invention peuvent notamment être utilisés pour inhiber et/ ou révéler l'interaction entre la p53 et les polypeptides tels que définis ci-avant.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'identification de composés capables de se lier aux polypeptides selon l'invention. La mise en évidence et/ou l'isolement de ces composés, peut-être réalisée selon les étapes suivantes :
- on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec un polypeptide de l'invention dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci posséderait une affinité pour ledit polypeptide, et,
- on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide de l'invention.
Selon un mode particulier, un tel procédé permet d'identifier des molécules capables de s'opposer ou de bloquer l'activité de stimulation de la croissance cellulaire des polypeptides selon l'invention et notamment de la protéine MBPl humaine ou Fibuline 2 ou des fragments dérivés de ces protéines. Ces molécules sont également susceptibles de présenter des propriétés anti-cancéreuses et de s'opposer à la fonction d'oncogènes immortalisants que présentent MBPl ou les polypeptides dérivés de MBPl qui coopèrent avec la forme activée de la protéine Ras pour la transformation cellulaire.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un ligand identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme médicament. De tels ligands sont en effet susceptibles de traiter certaines affections impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire et notamment les cancers.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé d'identification de composés capables de moduler ou d'inhiber totalement ou partiellement l'interaction entre les formes mutées oncogènes de p53 et les polypeptides selon l'invention.
La mise en évidence et/ou l'isolement de modulateurs ou de ligands capables de moduler ou d'inhiber totalement ou partiellement l'interaction entre les formes mutées oncogènes de p53 et les polypeptides selon l'invention, peut-être réalisée selon les étapes suivantes :
- on réalise la liaison d'une forme mutée de p53 ou d'un fragment de celle-ci à un polypeptide selon l'invention ; il peut s'agir des formes mutées de p53 telles que H175, G281, W248, ou A143 ou d'un fragment de celles-ci, il s'agit préférentiellement de la forme H 175 ou encore de la forme G281.
- on ajoute un composé à tester pour sa capacité à inhiber la liaison entre la forme mutée de p53 et les polypeptides selon l'invention ;
- on détermine si la forme mutée de p53 ou les polypeptides selon l'invention sont déplacés de la liaison ou empêchés de se lier ;
- on détecte et/ou isole les composés qui empêchent ou qui gênent la liaison entre la forme mutée de p53 et les polypeptides selon l'invention.
Dans un mode particulier, ce procédé de l'invention est adapté à la mise en évidence et/ou l'isolement d'agonistes et d'antagonistes de l'interaction entre les formes mutées de p53 et les polypeptides de l'invention. Toujours selon un mode particulier, l'invention fournit un procédé d'identification de molécules capables de bloquer l'interaction entre les formes mutées de p53 et la protéine MBPl humaine ou fibuline 2 humaine. Un tel procédé permet d'identifier des molécules capables de s'opposer aux effets de l'action des polypeptides selon l'invention avec les formes mutées de p53. En particulier de tels composés sont susceptibles de prévenir la coopération oncogénique entre la protéine MBPl et les formes mutantes oncogéniques de p53 telle notamment H 175.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'un ligand ou d'un modulateur identifié et/ou obtenu selon le procédé décrit ci-avant comme médicament. De tels ligands ou modulateurs sont en effet susceptibles de traiter certaines affections impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire et notamment des cancers.
L'invention fournit également des composés non peptidiques ou non exclusivement peptidiques utilisables pharmaceutiquement. Il est en effet possible, à partir des motifs protéiques actifs décrits dans la présente demande, de réaliser des molécules inhibitrices de l'interaction de MBPl ou de la fibuline2 avec les formes mutées oncogéniques de p53, ces molécules étant non exclusivement peptidiques et compatibles avec une utilisation pharmaceutique. A cet égard, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide de l'invention tel que décrit ci-avant pour la préparation de molécules non-peptidiques, ou non exclusivement peptidiques, actives pharmacologiquement, par détermination des éléments structuraux de ce polypeptide qui sont importants pour son activité et reproduction de ces éléments par des structures non-peptidiques ou non exclusivement peptidiques. L'invention a aussi pour objet des compositions pharmaceutiques comprenant une ou plusieurs molécules ainsi préparées.
L'invention a encore pour objet toute composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un ligand obtenu selon l'un et/ou l'autre des procédés décrit ci-avant, et/ou au moins un anticorps ou fragment d'anticorps, et/ou un oligonucléotide antisens, et/ou un composé non exclusivement peptidiques tels que décrits ci-avant.
Les compositions selon l'invention peuvent être utilisées pour moduler l'interaction des formes mutées oncogènes de p53 avec les polypeptides MBPl ou Fibuline 2 et de ce fait peuvent être utilisées pour moduler la prolifération de certain type cellulaires. Plus particulièrement ces compositions pharmaceutiques sont destinées au traitement des maladies impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire et notamment au traitement des cancers. Il s'agit en particulier des cancers associés à la présence de mutants oncogéniques de p53.
D'autres avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent et qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des Figures
Figure 1 : Domaines fonctionnels de la protéine p53 sauvage. TA : Domaine activateur de la transcription; DNB : domaine de liaison à l'ADN; NLS : signal de localisation nucléaire; OL : domaine d'oligomérisation; REG : domaine de régulation.
Figure 2 : Interaction entre la protéine C-mbpl et les protéines p53 et H 175 en cellules mammifères.
Figure 3 : Interaction entre la protéine C-fibulin2 et les protéines p53 et H 175 en cellules mammifères.
Figure 4 : Comparaison des séquences protéiques codées par les ADNc mMBPl (murine) et hMBPl (humaine).
Figure 5 : Effets comparés des protéines C-mbpl et MBPl murine sur la croissance cellulaire de cellules tumorales.
Figure 6 : Expression de l'ARNm codant pour la protéine MBPl chez la souris.
Figure 7 : Expression de l'ARNm codant pour la protéine MBPl dans différents tissus humains.
Figure 8 : Expression de l'ARN messager codant pour la protéine MBPl humaine dans des tumeurs du colon.
Exemple 1 - Construction des différents fragments nucléotidiques nécessaires au criblage
1-a - Construction du cDNA codant pour la p53 sauvage humaine
Le gène de la p53 humaine a été clone par réaction d'amplification en chaîne
(PCR) sur de l'ADN d'une banque de placenta humain (Clontech) en utilisant les oligonucléotides 5'-l et 3'-393.
Oligonucléotide 5'-l (SEQ ID N° 1) : AGATCTGTATGGAGGAGCCGCAG
Oligonucléotide 3'-393 (SEQ ID N° 2) :
AGATCTCATCAGTCTGAGTCAGGCCCTTC
Ce produit a ensuite été clone directement après PCR dans le vecteur pCRII (Invitrogène).
1-b - Construction des cDNA codant pour les différentes formes mutées de la p53 humaine l-b.(i) - Construction du cDNA codant pour le mutant H 175 de la p53 humaine
Le cDNA portant une mutation ponctuelle sur l'acide aminé 175 de la protéine p53 humaine (Arginine -> Histidine) a été obtenu par mutagénèse dirigée sur l'ADN de p53 (décrit dans l'exemple 1-a) au moyen du kit Amersham, en utilisant l'oligonucléotide H 175 de séquence :
Oligonucléotide H 175 3' (SEQ ID N° 3) : GGGGCAGTGCCTCAC Ce fragment a été désigné H 175.
1-b. (ii) - Construction du cDNA codant pour le mutant W248 de la p53 humaine
Le cDNA portant une mutation ponctuelle sur l'acide aminé 248 de la protéine p53 humaine (Arginine -> Tryptophane) a été obtenu par mutagénèse dirigée sur l'ADN de p53 (décrit dans l'exemple 1-a) au moyen du kit Amersham, en utilisant l'oligonucléotide W248 de séquence :
Oligonucléotide W248 3' (SEQ ID N° 4) : GGGCCTCCAGTTCAT Ce fragment a été désigné W248.
1-b (iii) - Construction du cDNA codant pour le mutant H273 de la p53 humaine
Le cDNA portant une mutation ponctuelle sur l'acide aminé 273 de la protéine p53 humaine (Aspartate -> Histidine) a été obtenu par mutagénèse dirigée sur l'ADN de p53 (décrit dans l'exemple 1-a) au moyen du kit Amersham, en utilisant l'oligonucléotide H273 de séquence : Oligonucléotide H273 3' (SEQ ID N° 5) :
ACAAACATGCACCTC Ce fragment a été désigné H273.
1-b (iv) - Construction du cDNA codant pour le mutant G281 de la p53 humaine
Le cDNA portant une mutation ponctuelle sur l'acide aminé 281 de la protéine p53 humaine (Asparagine -> Glycine) a été obtenu par mutagénèse dirigée sur l'ADN de p53 (décrit dans l'exemple 1-a) au moyen du kit Amersham, en utilisant l'oligonucléotide G281 de séquence :
Oligonucléotide G281 3' (SEQ ID N° 6) : GCGCCGGCCTCTCCC
Ce fragment a été désigné G281.
1-c - Construction des cDNA codant pour les fragments 73-393 de la p53 humaine sauvage et du mutant H175
1-c (i) - Construction du cDNA codant pour le fragment 73-393 de la p53 humaine sauvage
Cet exemple décrit la construction d'un cDNA codant pour les acides aminés 73 à 393 de la protéine p53 humaine sauvage (73-393wt).
Ce cDNA a été obtenu par réaction d'amplification en chaîne (PCR) sur l'ADN de p53 (décrit dans l'exemple 1-a) avec l'oligonucléotide 3 '-393 (SEQ ID N° 2) et l'oligonucléotide 5'-73 suivant :
5'-73 (SEQ ID N° 7) : AGATCTGTGTGGCCCCTGCACCA 1-c (ii) - Construction du cDNA codant pour le fragment 73-393 du mutant H175
Cet exemple décrit la construction d'un cDNA codant pour les acides aminés 73 à 393 du mutant H 175 de la protéine p53 humaine (73-393H 175).
Ce cDNA a été obtenu par réaction d'amplification en chaine (PCR) sur l'ADN du mutant (décrit dans l'exemple 1-b) avec les oligonucléotides 3 '-393 (SEQ ID N° 2) et 5'-73 (SEQ ID N° 7).
Exemple 2 - Construction des vecteurs d'expression dans la levure des fragments 73-393 t et 73-393H175 fusionnés au domaine de liaison à l'ADN de la protéine Gal4 et des différentes formes de la p53 humaine entière (sauvage et mutée) fusionnées au domaine d'activation de la transcription de la protéine GaI4
Cet exemple décrit la construction de vecteurs permettant l'expression dans la levure des fragments 73-393wt et 73-393H175 sous forme d'une fusion avec le domaine de liaison à l'ADN de la protéine Gal4 (DB) de la levure S. cerevisiae pour leur utilisation dans le système double-hybride et pour le criblage de banques de cDNA fusionnés au domaine d'activation de la transcription (transactivateur) de la même protéine Gal4 (TA).
2-a - Construction des vecteurs d'expression de levure des fragments 73-393wt et 73-393H175 fusionnés au domaine de liaison à l'ADN de la protéine Gal4
Les fragments 73-393wt et 73-393H175 ont été clones dans le vecteur pPC97 (Chevray et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 5789) en utilisant le site de reconnaissance par l'enzyme de restriction Bgl II.
Les produits de ces constructions portent les noms suivants: 73-393wt dans pPC97 --> (plasmide pMAl) --> DB-wt
73-393H175 dans pPC97 -> (plasmide pEC16)-> DB-H175
2-b - Construction des vecteurs d'expression de levure des différentes formes de la p53 humaine entière (sauvage et mutée) fusionnées au domaine d'activation de la transcription de la protéine Gal4
Les différentes formes de la p53 humaine entière (sauvage et mutée) ont été clones dans le vecteur pPC86 (Chevray et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 5789) en utilisant le site de reconnaissance par l'enzyme de restriction Bgl II.
Les produits de ces constructions portent les noms suivants:
p53 dans pPC86 -> (plasmide pEC10)--> TA-wt
H 175 dans pPC86 --> (plasmide pEC20)--> TA-H175
H273 dans pPC86 --> (plasmide pEC87)-> TA-H273
G281 dans pPC86 --> (plasmide pEC88)-> TA-G281
Exemple 3 - Clonage par le système double-hybride des partenaires de la protéine H175, et caractérisation de cette interaction en terme de spécificité dans la levure
Cet exemple décrit l'obtention des partenaires de la protéine H 175 par le système double-hybride en utilisant la banque de cDNA d'embryon de souris pPC67 (Chevray et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 5789), et la caractérisation, à l'aide du même système double-hybride, de ces partenaires en terme de spécificité d'interaction avec les différentes formes de la protéine p53 humaine (sauvage et mutée).
3-a - Isolement des partenaires de la protéine H175
3-a (i) - Génotype de la souche YCM17 La souche YCM17 utilisée pour l'isolement des partenaires et pour la caractérisation de leur interaction avec les différentes formes de la protéine p53 humaine par le système double-hybride est une souche de levure du genre Saccharomyces cerevisiae qui possède le génotype suivant:
MATa, Agal4, Δgal80, lys2, his3, trpi, leu2, ade2, ura3, cani, metl6::URA3 pGALl- 10 LacZ.
Cette souche de levure permet de détecter une réponse positive en système double-hybride par l'apparition du phénotype Ura+ et/ou du double phénotype Ura+/LacZ+.
3-a (ii) - Génotype de la souche TG 1
La souche TG1 utilisée pour la purification des ADN plasmidiques est une souche de bactérie du genre E.coli qui possède le génotype suivant:
supE, hsdD5, thi, D(lac-proAB), F'[tra D36 proA+B+ ladq lacZDM15]
3-a (iii) - Construction de la souche YMA1
La souche YCM17 a été transformée par la méthode de Gietz et al (Yeast 1 1 (1995) 355) avec lμg du plasmide pMAl permettant ainsi l'obtention de la souche YMA1 qui exprime la protéine DB-H175.
3-a (iv) - Isolement des partenaires de la protéine H 175
La souche YMA1 a été transformée par la même méthode que celle utilisée dans l'exemple Cl.3 en utilisant lOOμg d'ADN de la banque pPC67, permettant l'obtention de 3,5.107 transformants parmi lesquels 404 présentent le phénotype Ura+ et 14 le double phénotype Ura+/LacZ+.
L'ADN plasmidique contenu dans les 14 clones présentant le double phénotype Ura+/LacZ+ a été isolé par la méthode de Ward (Nucl. Acids Res. 18 (1990) 5319) avant d'être utilisé pour transformer la souche TG1. Les plasmides correspondants issus de la banque ont ensuite été purifiés et regroupés en deux sous-groupes de plasmides différents contenant chacun un cDNA codant pour deux protéines différentes:
- un cDNA codant pour la partie C-terminale (SEQ ID N° 8) d'un nouveau gène.
- un cDNA codant pour la partie C-terminale de la fibuline 2 murine (acides aminés 863 à 1195 (SEQ ID N° 32)) (Pan et al, J. Cell. Biol. 123 (1993) 1269).
Les protéines codées par ces deux cDNA sont appelées respectivement C-mbp 1 (mbp = 'p53 Mutant Binding Protein') et C-fibuline2, les protéines de fusion avec le domaine d'activation de la transcription de Gal4 sont nommées TA-C-mbpl et TA-C- fibuline2 et les plasmides correspondants sont nommés TA -C-MBP 1 et TA-C-FIB2
3 - b - Caractérisation de l'interaction entre les protéines C-mbpl et C-fibuline2 et la protéine H175 dans la levure
3 - b (i) - Caractérisation de la spécificité de l'interaction entre la protéine
DB-H175 et les protéines TA-C-mbpl et TA-C-fibuline2
Dans le but de tester la spécificité des interactions décrites dans l'exemple 3-a (iv), les plasmides pPC86, TA-C-MBP1 et TA-C-FIB2 ont été réintroduits dans la souche YCM17 par co-transformation avec différents plasmides : le plasmide pPC97 codant pour la protéine DB, le plasmide pMAl codant pour la protéine DB-H175, le plasmide pECIO codant pour la protéine DB-wt et le plasmide pPC76 codant pour une protéine de fusion entre le domaine de liason à l'ADN de la protéine Gal4 et un fragment de la protéine Fos humaine (acides aminés 132 à 211) (Chevray et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 (1992) 5789) (DB-Fos). Après la co-transformation, les différents clones obtenus ont été testés pour les phénotypes associés aux gènes URA3 et LacZ Les résultats de cette expérience sont présentés dans le Tableau 1.
TA TA-C-mbpl TA-C-fibuline2
DB Ura - / LacZ- Ura - / LacZ- Ura - / LacZ-
DB-H175 Ura - / LacZ- Ura + / LacZ+ Ura + / LacZ+
DB-wt Ura - / LacZ- Ura - / LacZ- Ura - / LacZ-
DB-Fos Ura - / LacZ- Ura - / LacZ- Ura - / LacZ-
Tableau 1 : Spécificité de l'interaction entre la protéine DB-H175 et les protéines TA- C-mbpl et TA-C-fibuline2
Ces résultats montrent que l'interaction entre la protéine DB-H175 et les protéines TA-C-mbpl et TA-C-fibuline2 est spécifique et qu'une telle interaction ne peut être obtenue ni avec la protéine DB seule, ni avec la protéine DB-wt ni avec la protéine contrôle DB-Fos.
3-b (ii) - Construction de protéines de fusion entre le domaine liaison à l'ADN de Gal4 et les protéines C-mbpl et C-fibuline2
Les cDNA codant pour C-mbpl et C-fibuline2 ont été extraits des plasmides TA-C-MBPl et TA-C-FIB2, puis clones dans le vecteur pPC97 en utilisant les sites de reconnaissance par les enzymes de restriction Sal I et Not I.
Les protéines de fusion avec le domaine de liaison à l'ADN de Gal4 ainsi obtenues sont appelées respectivement DB-C-mbpl et DB-C-fibuline2 et les plasmides correspondants DB-C-MBP1 et DB-C-FIB2. 3-b (iii) Caractérisation de la spécificité de l'interaction entre les DB-C-mbpl et DB-C-fibuline2 et les protéines TA-H175 et TA-G281
Dans le but de vérifier que l'interaction potentielle entre les protéines C-mbpl et C-fibuline2 et la protéine H 175 n'est pas un artefact dû à la fusion de l'un ou l'autre des partenaires avec l'un ou l'autre des domaines de Gal4, et de confirmer la spécificité de l'interaction avec la forme mutante de la protéine p53, une nouvelle expérience d'interaction dans la levure a été effectuée en utilisant des fusions différentes de celles de l'exemple 3-b (i).
Dans cette expérience, les protéines DB-C-mbpl et DB-C-fibuline2 ont été testées contre les fusions du domaine d'activation de la transcription de Gal4 avec les formes entières de la protéine p53 (sauvage ou mutante) décrites dans l'exemple 2-b, en utilisant une souche de levure différente de la souche YCM17, la souche PCY2
(Chevray et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 5789).
Les résultats de cette expérience sont présentés dans le Tableau 2.
TA TA-wt TA-H175 TA-H273 TA-G281
DB LacZ - LacZ - LacZ - LacZ - LacZ -
DB-C-mbpl LacZ - LacZ - LacZ + LacZ - LacZ +
DB-C- LacZ - LacZ - LacZ -i- LacZ - LacZ + fibuline2
Tableau 2: Spécificité de l'interaction entre les protéines DB-C-mbpl et DB-C- fibuline2 et les protéines TA-H175 et TA-G281
Ces résultats permettent d'une part de confirmer l'interaction observée lors du criblage. D'autre part, ces résultats mettent en évidence, la spécificité de l'interaction entre les protéines C-mbpl et C-fibuline2 et certaines formes mutées de la protéine p53. En ce qui concerne cette spécificité, il est intéressant de noter, que ces protéines n' interagissent pas avec le mutant H273. En effet, ce mutant présente une conformation équivalente à celle de la protéine p53 sauvage car il est reconnu par l'anticorps PAb 1620 qui est spécifique de la forme sauvage et pas par l'anticorps PAb 240 qui est spécifique de la forme mutée (Medcalf et al, Oncogene 7 (1992) 71). Ainsi, l'ensemble des données obtenues dans la levures montrent clairement que les deux protéines C-mbpl et C-fibuline2 sont des partenaires potentiels spécifiques des mutants oncogéniques de la protéine p53.
Exemple 4 - Interaction entre les protéines C-mbpl, C-fibuline2 et les différentes formes de la protéine p53 en cellules mammifères
Cet exemple décrit la construction de plasmides pour l'expression des différentes protéines en cellules mammifères et la caractérisation de l'interaction entre les protéines C-mbpl et C-fibuline2 et les différentes formes de la protéine p53 en cellules mammifères.
4-a Construction des plasmides d'expression des différentes protéines en cellules mammifères
4-a (i) Construction du vecteur d'expression pBFA 107
Cet exemple décrit la construction d'un vecteur permettant l'expression dans des cellules mammifères de protéines portant une étiquette dérivée de la protéine c- myc (acides aminés 410-419) et reconnue par l'anticorps 9E10 (Oncogene Science). Cette construction a été effectuée en utilisant comme vecteur de base le vecteur d'expression mammifère pSV2, décrit dans DNA Cloning, A practical approach Vol.2, D.M. Glover (Ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985.
Le cDNA comprenant la séquence codant pour l'étiquette c-myc ainsi qu'un multisite de clonage (MCS) a été construit à partir des 4 oligonucléotides suivants : c-myc 5' (SEQ ID N°10):
GATCCATGGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGA c-myc 3' (SEQ ID N°l l):
GATCTCAGGTCCTCCTCGGAGATCAGCTTCTGCTCCATG MCS 5' (SEQ ID N°12):
GATCTCGGTCGACCTGCATGCAATTCCCGGGTGCGGCCGCGAGCT MCS 3' (SEQ ID N°13):
CGCGGCCGCACCCGGGAATTGCATGCAGGTCGACCGA
Ces quatre oligonucléotides présentent des complémentarités deux à deux (c- myc 5' / c-myc 3', MCS 5' / MCS 3') et des complémentarités chevauchantes (c-myc 3' / MCS 5') permettant l'obtention de la séquence nucléotidique désirée par simple hybridation et ligation. Ces oligonucléotides ont été phosphorylés à l'aide de la T4 kinase, puis hybrides tous ensemble et insérés dans le vecteur d'expression pSV2 préalablement digéré par les enzymes de restriction Bgl II et Sac I. Le vecteur résultant est le vecteur pBFA 107.
4-a (ii) - Construction des plasmides d'expression des protéines C-mbpl et C- fibuline2 étiquetées
Les cDNA codant pour les protéines C-mbpl et C-fibuline2 ont été extraits des plasmides TA-C-MBP1 et TA-C-FIB2 et clones dans le vecteur d'expression mammifère pBFA 107 en utilisant les sites de reconnaissance par les enzymes de restriction Sal I et Not I. On obtient ainsi les plasmides pBFA107-C-MBPl et pBFA107-C-FIB2
4-a (iii) Construction des plasmides d'expression des différentes formes de la protéine p53 Les cDNA codant pour les différentes formes de la protéine p53 (wt, H 175, H273 et G281) ont été insérés dans les vecteurs d'expression pSV2 et pcDNA3 (Invitrogen) en utilisant le site de reconnaissance par l'enzyme de restriction Bgl II.
4 b - Interaction entre les protéines C-mbpl et C-fibuline2 et les différentes formes de la protéine p53 en cellules mammifères
Cet exemple décrit la mise en évidence dans des cellules mammifères de l'interaction entre les protéines C-mbpl et C-fibuline2 et les différentes formes de la protéine p53. Ces expériences ont été effectuées par transfection transitoire et co- immunoprécipitation dans les cellules H1299 (cellules tumorales de type 'Non Small Cell Lung Cancer') déficientes pour les deux allèles de la protéine p53 (Mitsudomi et al, Oncogene 1 (1992) 171).
Les cellules (106) sont ensemencées dans des boites de Pétri de 10 cm de diamètre contenant 8 ml de milieu DMEM (Gibco BRL) additioné de 10% de sérum de veau foetal inactivé à la chaleur, et cultivées sur la nuit dans un incubateur à CO. (5%) à 37°C. Les différentes constructions sont alors transfectées en utilisant la lipofectAMINE (Gibco BRL) comme agent de transfection de la façon suivante: 6 μg de plasmide total (3 μg de chaque plasmide codant pour chacun des deux partenaires) sont incubés avec 20 μl de lipofectAMINE (Gibco BRL) pendant 30 min avec 3 ml de milieu Opti-MEM (Gibco BRL) (mélange de transfection). Pendant ce temps, les cellules sont rincées deux fois au PBS puis incubées 4 h à 37°C avec le mélange de transfection, après quoi celui-ci est aspiré et remplacé par 8 ml de milieu DMEM additionné de 10% de sérum de veau foetal inactivé à la chaleur et les cellules remises à pousser à 37°C.
Vingt quatre heures après la transfection, les cellules sont lavées une fois en
PBS puis grattées, lavées de nouveau deux fois en PBS et remises en suspension dans 200μl de tampon de lyse (HNTG: Hepes 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 1%, glycérol 10%) additionné d'inhibiteurs de protéases (Aprotinine 2 μg/ml, pepstatine 1 μg/ml, leupeptine 1 μg/ml, E64 2 μg/ml et Pefabloc 1 mM), incubées 30 min à 4°C et centrifugées 15 min à 15.000 φm et 4°C. L'extrait cellulaire ainsi obtenu est soumis à une étape de 'pré-clearing' par incubation lh à 4°C avec 16μl d'un sérum de lapin pré-immun, puis 30 min à 4°C avec 200μl d'immunoprecipitin (Gibco BRL) préparée selon les recommandations du fournisseur. Par la suite, l'extrait cellulaire ainsi nettoyé est séparé en 3 lots égaux dont chacun est incubé la nuit à 4°C avec un anticoφs différent; 3 μg d'anticoφs 9E10 (anti myc), 1 μg d'anticoφs DO1 (anti p53) (Oncogene Science) et 1 μg d'anticoφs PAb416 (anti SV40 T-Ag utilisé comme anticoφs contrôle) (Oncogene Science). Ce mélange [extrait cellulaire/anticoφs] est ensuite additionné de 30μl d'immunoprecipitin et incubé 30 min à 4°C avant d'être centrifugé 30 sec à 15.000 φm. Le culot contenant l'immunoprecipitin est ensuite lavé deux fois par 1 ml de tampon HNTG additionné d'inhibiteurs de protéases, puis resuspendu dans 30 μl de tampon de dépôt sur gel d'acrylamide (Laemmli, Nature 227 (1970) 680) et incubé 5 min à 95°C. Après centrigugation 15 sec à 15.000 φm, les surnageants sont déposés sur gel de polyacrylamide en milieu dénaturant (Novex) et les protéines séparées en utilisant le système de migration XCell II (Novex) suivant les recommandations du fournisseur, puis transférées sur membrane de PVDF (NEN Life Science Products) à l'aide du même système XCell I
Les anticoφs 9E10 et DO1 utilisés pour la révélation des protéines transférées sont couplés à la biotine LCnHS (Pierce) suivant les recommandations du fournisseur.
Les membranes de transfert sont tout d'abord incubées 1 h à 4°C dans 10 ml de tampon TTBSN (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, NaN3 0,02%, Tween 20 0, 1%) additionné de 3% d'albumine bovine sérique (BSA) (TTBSN-BSA), puis 2 h à température ambiante avec 10 ml d'une solution de TTBSN-BSA contenant l'anticoφs 9E10 biotinylé (1 μg/ml). Après 6 lavages par 10 ml de tampon TTBSN, les membranes sont ensuite incubées 1 h à température ambiante avec 10 ml d'une solution de TTBSN-BSA contenant de l'ExtrAvidin-Peroxidase (Sigma Immuno Chemicals) au l/5000e, lavées de nouveau 6 fois au TTBSN et traitées au réactif ECL (Amersham) pour la révélation des protéines par chemiluminescence. Les mêmes membranes sont ensuite traitées par l'anticoφs DOl biotinylé après avoir été préalablement deshybridées (Ellis et al, Nature 343 (1990) 377) et en suivant le même protocole que pour l'anticoφs 9E10.
4 - b (i) - Interaction entre la protéine C-mbpl et les différentes formes de la protéine p53 en cellules mammifères
Dans cet exemple, les cellules H 1299 ont été transfectées avec les combinaisons de plasmides suivantes avant immunoprécipitation et Western-blot :
pBFA107 / pBFA107-C-MBPl (3 μg) + pSV2 / pSV2-p53 (sauvage ou mutant)
(3 μg)
De plus la combinaison suivante servant de contrôle a été effectuée : pBFA107-Sam68 (3 μg) + pSV2-H175 (3 μg)
Ce contrôle sert à examiner si H 175 peut ou non interagir soit avec l'étiquette myc soit avec une fusion entre l'étiquette myc et une protéine quelconque, la protéine Sam68 décrite par Lock et al (Cell 84(1996)23), n'étant pas censée interagir avec les différentes formes de la protéine p53.
Les résultats de cette expérience qui sont présentés dans la Figure 2 montrent que : - la protéine C-mbpl peut interagir avec la protéine H 175 dans des cellules mammifères
- cette interaction est bien spécifique de la protéine C-mbpl car la protéine H 175 n'intragit pas avec le contrôle myc-Sam68 4-b (ii) - Interaction entre la protéine C-fibuline2 et les différentes formes de la protéine p53 en cellules mammifères
Dans cet exemple, les cellules H 1299 ont été transfectées avec les combinaisons de plasmides suivantes avant immunoprécipitation et Western-blot :
pBFA107 / pBFA107-C-FIB2 (3 μg) + pSV2 / pSN2-p53 (sauvage ou mutant) (3 μg)
Les résultats de cette expérience qui sont présentés dans la Figure 3 montrent que la protéine C-fibuline2 peut interagir spécifiquement avec la protéine H 175 dans des cellules mammifères.
La conclusion générale de ces expériences est que les protéines C-mbpl et C- fibuline2 sont capables d'interagir spécifiquement en cellules mammifères avec la protéines H175. Ces résultats de même que ceux obtenus dans la levure (exemple 3) sont en accord avec :
1/ la classification des mutants de la protéine p53 :
- H 175 et G281: dominants oncogéniques
- H273: mutant faible 2/ la classification des différentes formes de la protéine p53 en terme de conformation et de reconnaissance par des anticoφs conformationnels :
- H 175 et G281 : conformation mutante, PAb 1620 - / PAb 240 +
- p53 et H273 : conformation sauvage, PAb 1620 + / Pab 240 -
L'ensemble des ces données montrent que les protéines C-mbpl et C- fibuline2 interagissent avec les formes de la protéine p53 présentant une conformation mutée, et qu'elles sont susceptibles d'avoir un effet sur des fonctions spécifiques des formes mutées de la protéine p53.
De plus, de par la littérature, on sait qu'une fraction de la protéine p53 peut exhiber une conformation mutante dans les cellules mammifères, en particulier : 1/ la protéine p53, capable de se lier à l'ADN (Hupp et al, Nucl. Acids Res. 21 (1993) 3167), peut adopter une conformation mutante lorsqu'elle se lie à l'ADN (Halazonetis et al, EMBO J. 12 (1993) 1021)
2/ la protéine p53 peut adopter deux conformations différentes au cours du cycle cellulaire; la conformation dite 'suppresseur' (conformation sauvage, PAb 1620 + / PAb 240 -) et la conformation dite 'promoteur' (conformation mutante, PAb 1620 - / PAb 240 +) (Milner & Watson, Oncogene 2 (1990) 1683).
On peut donc supposer que les protéines C-mbpl et C-fibuline 2 sont également susceptibles d'avoir un effet sur des fonctions spécifiques de la forme sauvage de la protéine p53.
Exemple 5 - Effet de la protéine C-mbpl sur la coopération oncogénique entre la protéine H175 et la protéine Ras-Vall2
Cet exemple décrit les effets de la protéine C-mbpl sur une propriété du mutant oncogénique H 175, sa capacité à coopérer avec la forme mutée du proto- oncogène Ras (Ras-Val 12) dans la transformation oncogénique de fibroblastes embryonnaires de rat Les fibroblastes embryonnaires de rat (REF) ont été préparés à partir de rats
OFA (IFA-CREDO) selon la méthode décrite par C. Finlay (Methods in Enzymology 255 (1995) 389). Après décongélation, les cellules (1,5.10°) sont ensemencées dans des boites de Pétri de 10 cm de diamètre contenant 8 ml de milieu DMEM (Gibco BRL) additioné de 10% de sérum de veau foetal et cultivées sur la nuit dans un incubateur à CO, (5%) à 37°C, puis sont transfectées par les différents mélanges de plasmides (21 μg d'ADN) en utilisant le réactif CellPhect (Pharmacia) suivant les recommandations du fournisseur. 24 h après la fin de la transfection, les cellules contenues dans chacune des boites sont grattées puis réensemencées sur trois boites de Pétri de 10 cm et cultivées pendant 15 jours avant d'être colorées au cristal violet suivant le protocole décrit par C. Finlay (Methods in Enzymology 255 (1995) 389). Les foyers de transformation sont alors visualisés et comptés.
Les plasmides utilisés au cours de cette série d'expériences sont les suivants:
- plasmide tampon: pSG5 (Stratagene) - plasmide d'expression de la protéine Ras-Vall2: pEJ-Ras (Shih & Weinberg,
Cell 29 (1982) 161)
- plasmide d'expression de la protéine c-myc entière: pSVc-mycl (Land et al, Nature 304 (1983) 596)
- plasmide d'expression de la protéine H 175: pSV2-H175 (exemple 4-a (iii)) - plasmide d'expression de la protéine C-mbpl: pBFA107-C-MBPl (exemple 4-a
(ϋ))
Chaque point de transfection contient un mélange de trois plasmides à raison de 7 μg de chaque plasmide. Les résultats de deux expériences indépendantes sont reportés dans le Tableau 3.
Expérience 1 Expérience 2
contrôle 0 0
Ras-Vall2 0 0 c-myc 0 NT
H175 0 NT
C-mbpl 0 NT
Ras-Val 12 + c-myc 1 1 1 16 *
Ras- Val 12 + c-myc + C-mbp 1 113 12 *
Ras-Vall2 + H175 0 16
Ras-Val 12 + C-mbpl 0 3
Ras- Val 12 + H 175 + C-mbp 1 13 30
Tableau 3. Effet de la protéine C-mbpl sur la coopération oncogénique entre la protéine H 175 et la protéine Ras-Val 12 (NT: non testé , *: expérience effectuée avec
3 μg de plasmide pSVc-mycl)
Les résultats de ces expériences montrent que :
- C-mbpl peut coopérer avec la forme activée de Ras pour la transformation des REF
- il existe une synergie entre les protéines H 175 et C-mbpl dans la coopération oncogénique avec Ras qui est spécifique de cette association car C-mbpl ne présente aucun effet sur la coopération oncogénique Ras / c-myc.
Exemple 6 - Effet des protéines C-mbpl et C-fibuline2 et relation avec les effets des différentes formes de la protéine p53 sur la croissance cellulaire des cellules tumorales Cet exemple décrit les effets des protéines C-mbpl et C-fibuline2 sur la croissance cellulaire des cellules tumorales et leur relation avec les effets des différentes formes de la protéine p53 sur cette même croissance cellulaire.
Ces effets des protéines C-mbpl et C-fibuline2 sur la croissance cellulaire ont été testés sur la lignée cellulaire H 1299 dans une expérience de formation de colonies résistantes à la néomycine suite à la transfection par des plasmides exprimant ces protéines.
Ces expériences de transfection ont été effectuées selon le protocole décrit dans l'exemple 4-b en utilisant 105 cellules par point et 1,5 μg d'ADN total.
Les plasmides utilisés au cours de cette série d'expériences sont les suivants:
- plasmides d'expression des protéines p53 et H175: pSV2-p53 et pSV2-H175.
- plasmide d'expression de la protéine C-mbpl: pBFA107-C-MBPl (exemple 4-a (ii))
- plasmide d'expression de la protéine C-fibuline2: pBFA107-C-FIB2 (exemple 4-a
(ϋ)) - plasmide conférant la résistance à la néomycine: pSV2-Neo pour une quantité totale de 0,4 μg
Protocole de formation de colonies résistantes à la néomycine : 48h après transfection, les cellules sont grattées et transférées dans 2 boites de Pétri de 10 cm de diamètre et remises en culture avec 10 ml de milieu DMEM additionné de 10% de sérum de veau foetal inactivé à la chaleur et contenant 400 μg/ml de généticine (G418). Après une sélection de 15 jours en présence de G418, le nombre de colonies Neo- - est déterminé par comptage après coloration à la fuchsine.
Les résultat de ces expériences sont reportés dans les Tableaux 4 et 5. Nombre de colonies résistantes à la Néomycine
Protéine exprimée Expérience 1 Expérience 2 Expérience 3 moyenne
Vecteur 36 (1,00) 52 (1,00) 73 (1,00) 1,00
C-mbpl lOOng 45 (1,25) 49 (1,06) 69 (0,95) 1,09
C-mbpl 500ng 51 (1,42) 71 (1,37) 1 10(1,51) 1,43
C-mbpl lOOOng 70( 1,94) 83 (1,60) 160 (2,19) 1,90
p53 sauvage lOOng 7 (0,19) 12 (0,23) 10 (0,14) 0,19
C-mbpl lOOng 6 (0,17) 14 (0,27) 8 (0,11) 0,18
C-mbpl 500ng 19 (0,53) 28 (0,54) 23 (0,32) 0,46
C-mbpl lOOOng 32 (0,89) 50 (0,96) 51 (0,70) 0,85
p53 sauvage 200ng 2 (0,06) 5 (0,10) 8 (0,11) 0,08
C-mbpl lOOng 2 (0,06) 4 (0,08) 6 (0,08) 0,08
C-mbpl 500ng 5 (0,14) 8 (0,15) 16 (0,22) 0,17
C-mbpl lOOOng 9 (0,25) 20 (0,38) 28 (0,38) 0,35
H175 lOOng 41 (1,14) 47 (0,90) 61 (0,84) 0,96
C-mbpl lOOng 33 (0,92) 65 (1,25) 70 (0,96) 1,04
C-mbpl 500ng 67 (1,86) 101 (1,94) 123 (1,68) 1,83
C-mbpl lOOOng 162 (4,50) 128 (2,46) 316 (4,33) 3,76
H175 200ng 39 (1,08) 60 (1,15) 66 (1,10) 1,1 1
C-mbpl lOOng 43 (1,19) 54 (1,04) 75 (1,03) 1,10
C-mbpl 500ng 59 (1,64) 129 (2,48) 163 (2,23) 2,12
C-mbpl lOOOng 131 (3,64) 282 (5,42) 299 (4,10) 4,39
Tableau 4: Effet de la protéine C-mbpl sur la croissance cellulaire de cellules tumorales Nombre de colonies résistantes à la Néomycine
Protéine exprimée Expérience 1 Expérience 2 Expérience 3 moyenne
Vecteur 36(1,00) 52 (1,00) 73(1,00) 1,00
C-fibuline2 lOOng 35 (0,97) 56(1,08) 80(1,10) 1,05
C-fibuline2500ng 48 (1,33) 68(1,31) 102(1,40) 1,35
C-fibuline2 lOOOng 60( 1,67) 87(1,67) 194(2,66) 2,00
p53 sauvage lOOng 7(0,19) 12 (0,23) 10(0,14) 0,19
C-fibuline2 lOOng 10 (0,28) 11(0,21) 13(0,18) 0,22
C-fibuline2500ng 15 (0,42) 30 (0,58) 26 (0,36) 0,45
C-fibuline2 lOOOng 35 (0,97) 44 (0,85) 45 (0,62) 0,81
p53 sauvage 200ng 2 (0,06) 5(0,10) 8(0,11) 0,09
C-fibuline2 lOOng 3 (0,08) 6(0,12) 6 (0,08) 0,09
C-fibuline2500ng 4(0,11) 10(0,19) 16(0,22) 0,16
C-fibuline2 lOOOng 10 (0,28) 18 (0,35) 28 (0,38) 0,34
H175 lOOng 41(1,14) 47 (0,90) 61 (0,84) 0,96
C-fibuline2 lOOng 47(1,31) 54(1,04) 84(1,15) 1,17
C-fibuline2500ng 84 (2,33) 95 (1,83) 156(2,14) 2,10
C-fibuline2 lOOOng 143 (3,97) 138 (2,65) 270 (3,70) 3,44
H175200ng 39(1,08) 60(1,15) 66(1,10) 1,11
C-fibuline2 lOOng 51(1,42) 63(1,21) 80(1,10) 1,24
C-fibuline2500ng 74 (2,06) 146(2,81) 142(1,95) 2,27
C-fibuline2 lOOOng 158 (4,39) 230 (4,42) 284 (3,89) 4,23
Tableau 5: Effet de la protéine C-fibuline2 sur la croissance cellulaire de cellules tumorales
Les résultats de ces expériences montrent que :
- les protéines C-mbpl et C-fibuline2 ont un effet positif sur la croissance cellulaire
- les protéines C-mbpl et C-fibuline2 sont capables de bloquer l'effet anti- prolifératif de la protéine p53, et ce indépendamment de leur effet prolifératif - l'effet prolifératif des protéines C-mbpl et C-fibuline2 est fortement augmenté en présence de la protéine H 175
Exemple 7 - Clonage des ADNc codant pour la forme entière des protéines MBPl murine et humaine.
Cet exemple décrit le clonage des ADNc codant pour la protéine MBPl murine entière et l'utilisation de ces données pour le clonage d'un homologue humain de MBPl.
7 a - Clonage de l'ADNc codant pour la forme entière de la protéine mbpl murine
L'ADNc codant pour la partie C-terminale de la protéine mbpl murine a été clone par réaction d'amplification en chaine (PCR) sur l'ADN de la banque SuperScript d'embryon murin (8,5 jours) (Gibco BRL) en utilisant l'oligonucléotide 3'-mMBPl et l'oligonucléotide SP6 (Gibco BRL).
Oligonucléotide 3'-mMBPl (SEQ ID N° 14) : CGGTACTGGCAGAGGTAACTGG
Cette amplification a permis d'obtenir un produit unique présentant une taille d'environ 800 paires de bases qui a ensuite été clone directement après PCR dans le vecteur pCRII (Invitrogene) et séquence. La séquence ainsi obtenue (SEQ ID N° 23) montre un recouvrement de 368 paires de bases avec C-MBP 1 (SEQ ID N° 8) avec une identité stricte de séquence sur cette partie commune. De plus, en 5' de cette partie commune, on trouve une séquence additionnelle de 445 paires de bases présentant une phase de lecture ouverte et un codon d'initiation de la traduction.
Les deux fragments représentés par ces séquences ont ensuite été rassemblés par une ligation à trois partenaires en utilisant les sites de reconnaissance par les enzymes de restriction EcoR I, Pst I et Not I et le plasmide pBC-SK+ (STRATAGENE) permettant ainsi la reconstitution de l'ADNc MBPl murin entier (mMBPl) (SEQ ID N° 15).
7-b Clonage de l'ADNc codant pour la forme entière de la protéine mbpl humaine
La séquence du gène murin MBPl a été utilisée pour une recherche d'homologie dans Genbank. Cette recherche a permis de montrer une forte homologie avec la séquence d'une EST humaine (gl 548384). A partir de cette séquence, deux fragments d'ADNc ont été clones par réaction d'amplification en chaine (PCR) sur l'ADN de la banque SuperScript de testicule humain (Gibco BRL) en utilisant les oligonucléotides 3'-hMBPl et SP6 (Gibco BRL) d'une part, et les oligonucléotides 5'-hMBPl et T7 (Gibco BRL) d'autre part.
Oligonucléotide 3'-hMBPl (SEQ ID N° 17) : CTCCGCTCCGAGGTGATGGTC
Oligonucléotide 5'-hMBP 1 (SEQ ID N° 18) :
TGTAGCTACTCCAGCTACCTC
Ces amplifications ont permis d'obtenir deux produits présentant des tailles d'environ 1 100 et 700 paires de bases qui ont ensuite été clones directement après PCR dans le vecteur pCRII (Invitrogene) et séquences. Les séquences ainsi obtenues (SEQ ID N° 19 et SEQ ID N° 20) montrent un recouvrement de 325 paires avec une identité stricte de séquence sur cette partie commune.
Les deux fragments représentés par ces séquences ont ensuite été rassemblés par une ligation à trois partenaires en utilisant les sites de reconnaissance par les enzymes de restriction EcoR I, Nco I et Not I et le plasmide pBC-SK+ (STRATAGENE) permettant ainsi la reconstitution de l'ADNc MBPl humain entier (hMBPl) (SEQ ID N° 21) présentant une phase de lecture ouverte et un codon d'initiation de la traduction. La comparaison des séquences protéiques correspondant aux ADNc précédemment obtenus (Exemples 7-a et 7-b) (Figure 4) montre une identité stricte de 95% dans la phase ouverte de lecture supposée (après le site de démarrage de la traduction (ATG) supposé). Par contre, une absence d'identité et une très mauvaise homologie sont observées entre les régions situées en amont de ce site de démarrage de la traduction (ATG) putatif. Ces données permettent donc de confirmer cette position comme démarrage de la traduction et par là même que ces deux ADNc codent bien pour les formes entières des protéines MBPl humaine (SEQ ID N°22) et murine (SEQ ID N° 16).
7 - c Construction des plasmides d'expression en cellules mammifères des formes murine et humaine de la protéine mbpl
Les ADNc codant pour les formes murine et humaine de la protéine MBPl contenus dans le vecteur pBC SK+, ont été insérés dans les vecteurs d'expression pSV2 et pcDNA3 (Invitrogen) en utilisant les sites de reconnaissance par les enzymes de restriction Hind III et Not I.
Exemple 8 - Effets comparés des protéines C-mbpl et mbpl murine sur la croissance cellulaire des cellules tumorales
Cet exemple décrit les effets comparés des protéines C-mbpl et mbpl murine sur la croissance cellulaire des cellules tumorales et leur relation avec les effets de la protéine H 175 sur cette même croissance cellulaire.
Ces effets de la protéine mbpl murine sur la croissance cellulaire ont été testés sur la lignée cellulaire H 1299 dans une expérience de formation de colonies résistantes à la néomycine suite à la transfection par des plasmides portant les ADNc codant pour ces protéines.
Ces expériences de transfection ont été effectuées selon le protocole décrit dans l'exemple D2 en utilisant 105 cellules par point et 1,5 μg d'ADN total. Les plasmides utilisés au cours de cette série d'expériences sont les suivants:
- plasmide d'expression de la protéine H175: pSV2-H175.
- plasmide d'expression de la protéine C-mbpl: pBFA107-C-MBPl (exemple 4-a (ii))
- plasmide d'expression de la protéine mbpl murine: pSV2-mMBPl (exemple 7-c)
- plasmide conférant la résistance à la néomycine: pSV2-Neo pour une quantité totale de 0,4 μg
Le protocole de formation de colonies résistantes à la néomycine utilisé est celui décrit dans l'exemple 6. Les résultat de cette expérience sont présentés dans le Tableau 6 et la Figure 5.
Nombre de colonies résistantes à la Néomycine
Protéine exprimée Expérience 1 Expérience 2
Vecteur 61 ( 1,00) 71 ( 1,00)
C-mbpl lOOng 67 ( 1,10) C-mbpl 500ng 96 ( 1,57) C-mbpl lOOOng 278 ( 4,56) 239 ( 3,37)
mbpl lOOng 94 ( 1,54) mbpl 500ng 128 ( 2,10) mbpl lOOOng 419 ( 6,87) 562 ( 7,92)
H175 200ng 65 ( 1,07) 69 ( 0,97)
C-mbpl lOOng 72 ( 1,18) C-mbpl 500ng 134 ( 2,20) C-mbpl lOOOng 397 ( 6,51) 341 ( 4,80)
mbpl lOOng 81 ( 1,33) mbpl 500ng 206 ( 3,38) mbpl lOOOng 729 (1 1,95) 1215 (17,11) Tableau 6 : Effets comparés des protéines C-mbpl et mbpl murine sur la croissance cellulaire de cellules tumorales
Les résultats de cette expérience montrent que la protéine mbpl murine présente les mêmes caractéristiques que la protéine C-mbpl, à savoir un effet positif sur la croissance cellulaire qui est fortement augmenté en présence de la protéine H175.
De plus cet effet de la protéine mbp 1 est très fortement augmenté par rapport à la protéine tronquée C-mbpl.
Exemple 8 bis - Coopération oncogénique des protéines C-mbpl et mbpl murine et mbpl humaine avec la protéine Ras-Vall2
Cet exemple décrit les effets comparés des protéines C-mbpl, mbpl murine et mbpl humaine dans une expérience de coopération oncogénique avec la protéine Ras-Vall2.
Cette coopération oncogénique a été testée sur des fibroblastes embryonnaires de rat suite à la transfection par des plasmides portant les ADNc codant pour ces protéines et suivant le protocole décrit dans l'exemple 5.
Les résultats de cette expérience sont présentés dans le Tableau 7.
Expérience Expérience 2
contrôle
Ras-Vall2 0 0 c-myc 0 0
H175 0 0
C-mbpl 0 0 mbpl 0 0
Ras-Vall2 + c-myc 31 42
Ras-Vall2 + H175 10 15 Ras-Vall2 + C-mbpl 4 4 Ras-Vall2 + mbpl murine 5 7 Ras-Vall2 + mbpl humaine 6 6
Tableau 7: Coopération oncogénique des protéines C-mbpl, mbpl murine et mbpl humaine avec la protéine Ras-Vall2
Les résultats de cette expérience montrent que les protéine MBPl murine et
MBPl humaine présentent les mêmes caractéristiques que la protéine C-mbpl, à savoir la capacité de coopérer avec la protéine Ras-Vall2 pour la transformation de fibroblastes embryonnaires de rat.
De façon intéressante, on note aussi que les fibroblastes ainsi transformés présentent un aspect moφhologique tout à fait particulier qui diffère de celui obtenu avec l' oncogene c-myc.
Exemple 9 - Expression de la protéine MBPl chez la souris et dans les tissus humains Cet exemple décrit l'étude de l'expression de l'ARN messager de MBPl chez la souris et dans différents tissus humains.
9-a Préparation des sondes
Les sondes mMBPl et hMBPl sont constituées par les ADNc correspondants.
La sonde GAPDH (contrôle) a été générée par réaction d'amplification en chaine (PCR) sur l'ADN de la banque SuperScript de testicule humain (Gibco BRL) (GAPDH) en utilisant les oligonucléotides suivants :
Oligonucléotide sens-GAPDH (SEQ ID N° 24) :
CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT
Oligonucléotide antisens-GAPDH(SEQ ID N° 25) : AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC
Les sondes ont été radiomarquées au 32P-dCTP en utilisant le kit Rediprime
(Amersham) et les recommandations du fournisseur, et les nucléotides non incoφorés ont été éliminés par chromatographie sur des colonnes MicroSpin G-25 (Pharmacia Biotech). Les Northern blots utilisés lors de cette expérience ont été obtenus chez Clontech. Les membranes ont été préhybridées avec la solution ExpressHyb (Clontech) 45 minutes à 65°c, puis incubées 2 heures avec les sondes radiomarquées à 65°C, lavées trois fois avec du tampon 2xSSC deux fois avec du tampon 2xSSC additionné de 0,1% de SDS et enfin lavées avec du tampon 0,2xSSC additionné de 0,1% de SDS jusqu'à disparition du bruit de fond. Les membranes ont ensuite été soumises a autoradiographie et une quantification du signal a été effectuée à l'aide d'un instantimager (Packard instruments).
9-b Expression de la protéine MBPl chez la souris Cet exemple décrit l'étude de l'expression de l'ARN messager de MBPl chez la souris.
Les sondes utilisées dans cette expérience sont les sondes mMBPl et GAPDH . Les membranes utilisées dans cette expérience contiennent l'une des ARNm d'embryon de souris obtenus à différents stages du développement, et l'autre des ARNm représentatifs de différents tissus de souris adulte.
Les résultats de cette expérience (Figure 6) indiquent clairement que: 1 - un transcript unique de 1 ,8 kb est détecté aussi bien dans les ARNm d'embryon de souris que dans les tissus de souris adulte.
2 - ce messager présente des variations de niveaux d'expression au cours du développement, avec une forte abondance dans les stades précoces (7 jours) puis une diminution importante (11 jours) pour atteindre un niveau apparement constant. 3 - ce messager est modérément exprimé dans l'ensemble des tissus adultes testé à l'exception d'une expression importante dans le poumon et les testicules.
Un tel niveau d'expression de transcript élevée dans une phase du développement embryonnaire ainsi que dans des tissus présentant un taux de croissance élevé, confirme l'implication du produit du gène MBPl dans les processus de croissance cellulaire mise en évidence dans les exemples 5, 6 et 7.
9-c Expression de la protéine MBPl dans les tissus humains
Cet exemple décrit l'étude de l'expression de l'ARN messager de MBPl dans différents tissus humains.
Les sondes utilisées dans cette expérience sont les sondes hMBPl et GAPDH . Les membranes utilisées contiennent des ARNm représentatifs de différents tissus humain. Les résultats de cette expérience (Figure 7) indiquent clairement que:
1 - deux transcripts de 1,5 et 1,8 kb sont détectés dans les tissus humains.
2 - ces messagers sont modérément exprimés dans l'ensemble des tissus testés et leur profil d'expression est comparable à celui du messager murin (forte expression dans le poumon et les testicules).
Ces résultats montrent que:
- il peut exister deux formes différentes de la protéine mbpl humaine avec possibilité d' épissage alternatif du messager.
- les ARNm codant pour la(les) protéine(s) mbp 1 humaine(s) tout comme leur homologue murin présentent un niveau d'expression élevé dans des tissus à taux de croissance élevé, et que le(s) produit(s) du gène MBPl humain pourrait(ent) donc aussi être impliqué(s) dans les processus de croissance cellulaire.
Les résultats présentés dans les différents exemples montrent que les protéines C-mbpl, MBPl et C-fibuline2 interagissent spécifiquement avec les formes mutantes de la protéine p53 et que ces interactions conduisent à une synergie entre ces protéines et les mutants oncogéniques de la protéine p53 que ce soit pour la coopération oncogénique avec la forme activée de la protéine Ras ou pour l'effet prolifératif.
De plus, les protéines C-mbpl, MBPl et C-fibuline2 présentent une activité proliférative intrinsèque, et la protéine C-mbpl agit comme un oncogene immortalisant en coopérant avec la forme activée de la protéine Ras pour la transformation cellulaire.
Les résultats présentés dans les différents exemples montrent que les protéines ou polypeptides C-mbpl, MBPl et C-fibuline2 interagissent spécifiquement avec les formes mutantes de la protéine p53 et que ces interactions conduisent à une synergie entre ces protéines et les mutants oncogéniques de la protéine p53 que ce soit pour la coopération oncogénique avec la forme activée de la protéine Ras ou pour l'effet prolifératif.
De plus, les protéines C-mbpl, MBPl et C-fibuline2 présentent une activité proliférative intrinsèque, et les protéines C-mbpl et MBPl agissent comme des oncogènes immortalisants en coopérant avec la forme activée de la protéine Ras pour la transformation cellulaire.
Ces propriétés confèrent à MBPl un rôle potentiel d'oncogène. Dans au moins un des test (exemple 8 bis) la protéine MBPl présente des propriétés oncogéniques accrues par rapport au polypeptide c-MBP 1.
Enfin, la forte homologie présentée par les protéines MBPl humaine et murine (95% d'identité stricte), et la similarité d'expression tissulaire de leurs messagers respectifs, permettent de conclure que la protéine MBPl humaine, qui pourrait être présente sous forme de deux variants différents (2 messagers distincts), possède(ent) des propriétés analogues à celles de son homologue murine.
En conclusion, ces résultats décrivent la caractérisation d'une nouvelle protéine murine, MBPl, et de son(ses) homologue(s) humaine(s), qui présente des propriétés oncogéniques et qui interagit spécifiquement avec les formes mutées de la protéine p53. Cette interaction qui se traduit par un accroissement des propriétés oncogéniques de MBPl, pourrait constituer un élément fondamental de la capacité oncogénique de ces mutants de la protéine p53.
De telles propriétés semblent aussi partagées par une autre protéine présentant des homologies avec MBPl, la fibuline 2. Cette protéine faisant partie d'une famille plus large, on peut envisager que ces propriétés puissent être étendues à l'ensemble des membres de la famille des fibulines. Ces interactions montrant une forte synergie entre les pouvoirs oncogéniques des protéines MBPl, fibuline2 et mutants p53, elles constituent un point d'action potentiel dans le traitement des cancers liés aux mutations de la protéine p53. De plus, les protéines MBPl et fibuline2 qui présentent des propriétés oncogéniques intrinsèques constituent des cibles potentielles pour le traitement du cancer en général.
Exemple 10 - Localisation chromosomique du gène MBPl humain
La localisation chromosomique du gène MBPl a été effectué selon un protocole en quatre étapes (Lichter et al, Science 247 (1990) 64) (Heng et al, Chromosoma 102 (1993) 325) ( Kischkel et al, Cytogenet. Cell Genêt. 82 (1998) 95) : - marquage de l'ADNc à la biotine par nick-translation
- hybridation sur métaphases humaines normales (technologie en haute résolution)
- révélation par la fluorescéine
- visualisation et inteφrétation sur microscope à épifluorescence
Cette étude d'hybridation de la sonde MBPl sur métaphases humaines a été effectuée par analyse de 30 mitoses et a montré la présence d'un double spot sur les bras longs (bras q) des deux chromosomes 1 1 en 1 lql3. De façon intéressante, cette région du chromosome 11 a été associée à un grand nombre de pathologies :
- maladie de Mac Ardle (Lebo et al, Science 225 (1984) 57)
- Syndrome de Usher de type 1B (Weil et al, Nature 374 (1995) 60)
- néoplasie endocrine de type I (Teh et al, J. Intern. Med. 238 (1995) 249)
- dystrophie de Best (Graff et al, Genomics 24 (1994) 425) - diabète insulino-dépendent (Davies et al, Nature 371 (1994) 130)
- spinocerebellar ataxia 5 (Ranum et al, Nature Genêt. 8 (1994) 280)
- syndrome de Bardet-Biedl (Leppert et al, Nature Genêt. 7 (1994) 108)
- ostéoporose (Gong et al, Am. J. Hum. Genêt. 59 (1996) 146)
De plus cette région du chromosome 11 est aussi le site d'événements d'amplification associées à différentes de tumeurs solides (oesophage, tête et cou, vessie, sein et poumon) ( Lammie & Peters, Cancer Cells 3 (1991) 413).
Le gène MBPl pourrait donc être non seulement associé à un certain nombre de cancers mais aussi à un grand nombre de pathologies présentant des désordres de types rénaux, neuro-dégénératifs, osseux et autres. Parmi ces pathologies on peut citer notamment : les déficiences rénales aiguës telles celles associées à la maladie de Mac Ardle, les retinis pigmentosa et certaines formes de cécité et de surdité telles que celles associées au Syndrome de Usher de type 1B, l'hyperthyroïdie telle la forme associée à la néoplasie endocrine de type I, les pathologies liées à un défaut de pigmentation rétinienne telles que celles rencontrées dans la dystrophie de Best, le diabète insulino-dépendant, les pathologies neurodégénératives telles que celles associées à l'ataxie cérébrospinale 5, les dystrophies rétiniennes, les désordres rénaux telles que les formes rencontrées dans le syndrome de Bardet-Biedl, et l'ostéoporose.
Exemple 11 - Expression de l'ARN messager codant pour la protéine MBPl humaine dans des tumeurs du colon
Cet exemple décrit une analyse semi-quantitative de l'expression de l'ARN messager codant pour la protéine MBPl humaine, effectuée en parallèle sur 9 tumeurs du colon et 9 prélèvements de tissus sains (colon) provenant des mêmes patients.
Les prélèvements ont été congelés à -70°C immédiatement après ressection et l'ARN total a été préparé par homogénéisation de lOOmg de tissu en utilisant la solution RNA NOW (Ozyme) et le protocole recommandé par le fournisseur. Par la suite, une synthèse d'ADNc a été effectuée à l'aide du kit First- Strand cDNA Synthesis (Amersham Pharmacia Biotech) en utilisant 1,5 μg d'ARN total et selon les recommandations du fournisseur. Puis les gènes MBPl et β-actine (contrôle) ont été amplifiés par PCR en utilisant une quantité d'ADNc pour laquelle le niveau de produit de PCR est directement corrélable avec la concentration de substrat et le programme de cycles suivant : 1 cycle 2min à 95°C
30 cycles 30sec à 94 lmin à 45°C lmin à 72°C
1 cycle 3min à 72°C
Les oligonucléotides utilisés pour ces amplifications sont les suivants
Oligonucléotide sens-MBPl (SEQ ID N° 27) GCCCTGATGGTTACCGCAAGA
Oligonucléotide antisens-MBPl (SEQ ID N° 28) AGCCCCCATGGAAGTTGACAC
Oligonucléotide sens-β -actin (SEQ ID N° 29) GTGGGGCGCCCCAGGCACCA
Oligonucléotide antisens-β-actin (SEQ ID N° 26)
CGGTTGGCCTTGGGGTTCAGGGGGG
Les produits de PCR ainsi générés ont ensuite été analysés par électrophorèses sur gel d'agarose à 1%.
Les résultats présentés dans la figure 8 montrent clairement que l'ARN messager codant pour la protéine MBPl humaine est amplifié dans cinq des tumeurs étudiées en comparaison avec le tissu sain provenant du même patient, et ce, quelque soit le grade de la tumeur et indépendamment de leur statut concernant les gènes Ras et p53.
Les résultats de cet exemple montrent donc qu'une amplification de l'ARN messager codant pour la protéine MBPl humaine peut-être décelée dans certains types de tumeurs humaines et soulignent donc un rôle potentiel de la protéine MBPl dans l'apparition et/ou le développement de ces tumeurs.

Claims

REVENDICATIONS
1. Polypeptide capable d'interagir spécifiquement avec les formes oncogéniques de p53, de stimuler la croissance cellulaire et de bloquer les effets anti- prolifératifs de la forme sauvage de p53.
2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'une séquence choisie parmi les séquences polypeptidiques SEQ ID N° 9 ou SEQ ID N°16 ou un dérivé de celles-ci.
3. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'une séquence choisie parmi les séquences polypeptidiques SEQ ID N°31 ou SEQ ID N°22 ou un dérivé de celles-ci.
4. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie de la séquence polypeptidique SEQ ID N° 33 ou un dérivé de celle-ci.
5. Polypeptide selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est représenté par la séquence polypeptidique SEQ ID N°22.
6. Séquence nucléotidique codant pour un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 à 5.
7. Séquence nucléotidique selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence SEQ ID N° 15 ou de la SEQ ID N° 21 ou de leurs dérivées.
8. Séquence nucléotidique selon la revendication 6 caractérisée en ce qu'elle comprend tout ou partie de la séquence nucléotidique SEQ ID N° 32 ou de ses dérivées.
9. Séquence nucléotidique selon la revendication 6 ou 7 caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence SEQ ID N°15 ou la séquence SEQ ID N°30.
10. Séquence nucléotidique selon la revendication 6, 7 ou 9 caractérisée en ce qu'elle est représentée en SEQ ID N° 21.
11. Cellule hôte pour la production de polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle a été transformée avec un acide nucléique comportant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 6 à 10.
12. Procédé de préparation d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que l'on cultive une cellule contenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 6 à 10 dans des conditions d'expression de ladite séquence et on récupère le polypeptide produit.
13. Cassette d'expression comprenant une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide selon l'une des revendications 6 à 10.
14. Vecteur comprenant une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 6 à 10.
15. Vecteur selon la revendication 14 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur plasmidique, d'un cosmide ou de tout ADN non encapsidé par un virus.
16. Vecteur selon la revendication 14 caractérisé en ce qu'il s'agit d'un virus recombinant, et de préférence d'un virus recombinant défectif pour la réplication.
17. Oligonucléotide antisens d'une séquence selon la revendication 7 à 10 capable d'inhiber au moins partiellement la production de polypeptides selon l'une des revendications 1 à 5.
18. Sonde nucléotidique capable de s'hybrider avec une séquence nucléotidique selon l'une des revendications 7 à 10 ou l'ARNm correspondant.
19. Anticoφs ou fragment d'anticoφs dirigé contre un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5.
20. Anticoφs ou fragment d'anticoφs selon la revendication 19 caractérisé en ce qu'il est dirigé contre une séquence choisie parmi les séquences peptidiques présentées en SEQ ID N° 9 ou SEQ ID N°33 ou SEQ ID N°31 ou SEQ ID N°22.
21. Anticoφs ou fragment d'anticoφs selon la revendication 19 ou 20 caractérisé en ce qu'il possède la faculté de prévenir l'interaction entre les formes oncogéniques de p53 et un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5.
22. Procédé de mise en évidence ou d'identification de composés capables de se lier avec un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes : a - on met en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non-identifiées, avec un polypeptide tel que défini selon l'une des revendications 1 à 5 dans des conditions permettant l'interaction entre ledit polypeptide et ladite molécule dans le cas où celle-ci posséderait une affinité pour ledit polypeptide, et, b - on détecte et/ou isole les molécules liées au dit polypeptide.
23. Procédé de mise en évidence ou d'identification de composés capables de moduler ou d'inhiber l'interaction entre entre les formes oncogéniques de p53 et un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'on réalise les étapes suivantes : a - on réalise la liaison de la forme oncogénique de p53 ou d'un fragment de celle ci avec ledit polypeptide ; - on ajoute un composé à tester pour sa capacité à inhiber la liaison entre la forme oncogénique de p53 et ledit polypeptide ,
- on détermine le déplacement ou l'inhibition de la liaison entre la forme oncogénique de p53 ; - on détecte et/ou isole les composés qui empêchent ou qui gênent la liaison entre la forme oncogénique de p53 et ledit polypeptide ;
24. Ligand d'un polypeptide tel que défini selon les revendications 1 à 5, susceptible d'être obtenu selon le procédé de la revendication 22.
25. Ligand capable de moduler ou d'inhiber l'interaction entre les formes oncogéniques de p53 et un polypeptide tel que défini selon les revendications 1 à 5, susceptible d'être obtenu selon le procédé de la revendication 23.
26. Utilisation d'un ligand selon la revendication 24 ou 25 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement traitement des maladies impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire.
27. Utilisation d'un polypeptide capable d'interagir avec les formes mutées oncogéniques de p53 et comprenant tout ou partie d'une séquence peptidique choisie parmi les séquences SEQ ID N° 9, N° 33, N°31, ou N° 22 ou d'un dérivé de celle - ci, selon l'une des revendications 1 à 5 pour la réalisation d'un composé non peptidique ou non exclusivement peptidique capable d'interagir avec les formes mutées oncogéniques de p53, par détermination des éléments structuraux de ce polypeptide qui sont importants pour son activité et reproduction de ces éléments par des structures non peptidiques ou non exclusivement peptidiques.
28. Composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un anticoφs ou fragment d'anticoφs selon l'une des revendications 19 à 21, et/ou un oligonucléotide antisens selon la revendication 17 et/ou un ligand selon l'une des revendications 24 ou 25 et/ou un composé selon la revendication 27.
29. Composition selon la revendication 28 destinée au traitement des maladies impliquant un dysfonctionnement du cycle cellulaire.
30. Composition selon la revendication 29 destinée au traitement des cancers.
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