WO2000031131A1

WO2000031131A1 - Fragments peptidiques a activite inhibitrice de la mort cellulaire

Info

Publication number: WO2000031131A1
Application number: PCT/JP1999/006322
Authority: WO
Inventors: Masaki Hirashima; Hiroaki Maeda; Chikateru Nozaki
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1998-11-19
Filing date: 1999-11-12
Publication date: 2000-06-02
Anticipated expiration: 2001-05-19
Also published as: DE69940927D1; CA2351558A1; EP1132402A1; CA2351558C; JP4485062B2; ATE432287T1; EP1132402B1; US7598349B2; US7199097B1; EP1132402A4; US20050281808A1; AU1179500A

Description

明細書

細胞死抑制活性を有するぺプチド断片

技術分野

本願発明は、新たな機能を有する蛋白質に関する。詳細には、本願発明は、細胞死抑制活性を有するぺプチド断片又はべプチド断片群及びその精製方法並びに前記べプチド断片又はべプチド断片群に対する抗体に関する。さらに詳細には、本願発明は、各種疾患例えば細胞死に関連した疾病に対する病態悪ィヒ阻止、予防又は治療剤及び細胞培養における細胞死を抑制することによる有用物質生産を可能にする添加物となりうるぺプチド断片又はべプチド断片群並びに前記べプチド断片又はべプチド断片群に対する抗体に関する。

背景技術

細胞死は、高等生物の神経系、内分泌系、免疫系における基本的な制御に重要な働きをしているばかりでなく、多くの疾病に深く関わっていることが指摘されている（Thompson C. B. , Science, vol. 267, p. 1456-1462 (1995) )。例えば、全身性ェリテマト一デスのような自己免疫疾患、神経細胞死による神経変性疾患、臓器移植に伴う臓器移植傷害等、これらはアポトーシスが関与する細胞死の影響による疾患として捉えることができる。

ところで、細胞死を引き起こす要因には外的要因と内的要因がある。外的要因としては、細胞死を促進するものとして実体的に物質として捉えられているものは、免疫系に関与する T N F (Zheng し， et al. , Nature, vol. 377, p. 348-351

(1995) )、 F a s リガンド（Suda Τ· , et al. , Cell, vol. 75, p. 1169-1178 (1993) )、ダルココルチコイド（Wyllie A. H. , Nature, vol. 284, p. 555- 556 (1980) )等があり主としてこれらに起因するもの、他にも細胞増殖に必要なエリスロポェチン、インターロイキン、神経成長因子等の増殖因子や栄養因子の欠乏によるもの等があり、生理的条件の変化によってアポトーシスによる細胞死が惹起される。さらに、放射線、温度、制癌剤、カルシウムィオノフォア、活性酸素等による非生理的なストレスが情報となってアポトーシスが誘導される場合がある。他にも、火傷、毒物、虚血、補体攻撃、溶解性ウィルス感染、過剰な薬物投与や放射線投与によりネクローシスが生じる。内的要因としては、細胞内 C a ^{2 +}濃度、核酸代謝、アミノ酸代謝、エネルギ一代謝等の代謝系の変化などがあり、これら要因により細胞を死に至らしめる。これらのアポトーシスシグナルをコント口ールすることができれば各種疾患の病態悪化阻止、予防又は治療に利用可能なはずであるが、機序が単純ではないため現在確認されている物質 ·要因の制御だけでは医療への応用は実現困難な状況にある。

—方、現在までに確認されている細胞死を抑制する物質としては、ほとんどのアポト一シスシグナルを抑制するとされている細胞内因子である b c 1—2や b c 1 一 X等が知られているが（Boise L. H. , et al. , Cell, vol. 74， p. 597-608 (1993) )、これらは細胞内に発現される必要があり細胞外に添加してもほとんど意味をなさない。それに対して、細胞外の因子としては、活性酸素によるアポト一シスを抑制するスーパーォキサイドデイスムターゼ（以下、 S O Dと称することがある）（Greenlundし J. , et al. , Neuron, vol. 14, p. 303-315 (1995) )、力タラ一ゼ（Sandstrom P. A. and Buttke T. M. , Proc Natl Acad Sci USA, vol. 90, p. 4708-4712 (1993) )、グルタチオンペルォキシダ一ゼ（Kayanoki Y. , et al. , J.

Biochem, vol. 119, p. 817- 822 (1996) )等が報告されているが、これらだけで全ての細胞死を効果的に抑制することはできない。

細胞を培養する際、主として培養細胞自身由来もしくは添加物由来の物質による細胞に対するストレスが原因で細胞死が誘導されるが、同じ条件で全ての細胞に対する細胞死が誘導されるわけではない。通常、そのような環境に適応する細胞には、ストレスによる細胞死誘導シグナルを閾値以下に保っために必要な蛋白質が、細胞内外にすでに発現されているか、新たに誘導されている箬である。それらの蛋白質としては転写因子、合成酵素、代謝酵素、酸化還元酵素、リン酸化酵素、脱リン酸化酵素、転移酵素、アポトーシス抑制蛋白等が考えられる。つまり、個々の細胞でストレスに対する感受性に差が生じるのは、それらの蛋白質の発現量に差があるためであると予想される。そこで、細胞死の機序がそれぞれ異なるにせよ、あるストレスによる細胞死に対して抑制する因子を外から添加することにより、その細胞死誘導のシグナルを閾値以下に保つことが可能であれば、培養細胞の場合だけではなく、生体内でも同様のストレスが生じた場合に起こる細胞死を抑制することが可能と考えられる。

また、細胞死と疾患には密接な関係が存在しているため、生体内の細胞死抑制効果を示す物質を数多く同定することにより多くの細胞死をコント口ールすることができれば、疾患の治療等、医療への応用が実現できるばかりでなく、同様に、培養細胞の効果的培養系への応用も可能となる。実際、前述のように細胞内の細胞死抑制因子として b c 1— 2、 b c 1一 X等が、細胞外の細胞死を抑制する因子としては活性酸素によるアポトーシスを抑制する S〇D、力タラ一ゼ、グルタチオンペルォキシダーゼ等が存在するが、これらの因子を細胞外に添加することにより全ての細胞死が抑制されることは難しい。それは、その作用機序の差異により、細胞死の発生過程が異なるためである。そのことを考慮すれば、種々の細胞死に対して、有意に、そしてより特異的に細胞死を抑制する活性を同定する必要がある。つまり、既知の物質により抑制を受けない細胞死に対しては、細胞死を有意に抑制する物質を探索することが必要とされている。また、生体内の細胞死抑制物質は生体の恒常性を保つ働きを有する物質として存在している可能性は高く、それらを同定する意味は大きい。

細胞の無血清培養時もしくは特殊な条件下での培養時には、培養時のストレスにより起こるアポトーシスが度々観察される。このような細胞死が誘導される条件で細胞培養を実施し、その細胞死を抑制する活性を指標に各種クロマトグラフィ一手法を用いて血液中の有効成分を精製すれば、細胞死を抑制する蛋白質成分を調製することができる。

発明の開示

種々の検討の結果、セレノプロテイン Pの C末端側 1 0 3アミノ酸残基からなる配列又は当該ァミノ酸配列のうち 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ酸配列又は前記いずれかのァミノ酸配列の部分配列を有する、ぺプチド断片又は前記べプチド断片を起源とする一連のぺプチド断片群が、優れた細胞死抑制活性を有することが判明した。なお、本願発明でいうペプチド断片群とは、糖鎖の有無、荷電の相違、断片化の多様性等に起因する微細構造の異なるぺプチド断片の集合体を意味する。

本願発明による特に好ましいペプチド断片群は、式（I ) ： Lys Arg Cys lie Asn Gin Leu Leu Cys し ys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu (配列番号 1 ) 及び Z又は式

( I D :

Thr Gly Ser Ala lie Thr Xaa Gin Cys Lys Glu Asn Leu Pro Ser Leu Cys Ser Xaa Gin Gly Leu Arg Ala Glu Glu Asn lie (配列番号 2 )

(式中、 Xaa はセレノシスティンを表す）で表されるアミノ酸配列もしくは当該ァミノ酸配列の部分配列を有するものである。

また、その精製過程における知見により、当該ペプチド断片又はペプチド断片群は（a )分子量分画膜に基づき 1 0 k D a〜3 0 k D aの分子量画分に回収され、 ( b )ィオン交換樹脂への結合性の検討の結果、血中で p H 7力ら p H 8の間に等電点を示す構造と p H 8以上に等電点を示す構造を有し、（ c )非還元系 S D S—

P AG Eでは分子量 1 3〜1 4 k D aの 2本のバンド及びそれらに糖鎖の付加された 1 6〜1 7 k D aの 2本のバンドを示し、また（ d )還元条件下での S D S—

P AG Eでは、前記バンドに加えて 3〜4 k D a、 7〜9 k D a ΆΧ 1 0〜： I 2 k D aのバンドを呈する性状を有すること、さらに断片化された前記ペプチドにも活性が存在することが明らかになった。

図面の簡単な説明

図 1は、本願発明の細胞死抑制活性を有するぺプチド断片又はぺプチド断片群の各種精製工程での、電気泳動図（銀染色、ウェスタンブロッテイング）である。図 2は、本願発明の細胞死抑制活性を有する精製ペプチド断片又はペプチド断片群の純度を示す電気泳動図（銀染色、ウェスタンブロッテイング）である。

図 3は、抗セレノプロテイン P抗体結合担体力ラムを用いて精製された本願発明の細胞死抑制活性を有する精製ぺプチド断片又はべプチド断片群の純度を示す電気泳動図（銀染色）である。

図 4は、本願発明の細胞死抑制活性を有する精製べプチド断片又はぺプチド断片群の N—グリコシダーゼ処理後の挙動を示す電気泳動図である。

図 5は、本願発明の細胞死抑制活性を有する精製べプチド断片又はぺプチド断片群の還元カルボキシメチル化後の挙動を示す電気泳動図（銀染色）である。

図 6は、本願発明の細胞死抑制活性を有する精製べプチド断片又はべプチド断 δ

片群の還元カルボキシメチルイヒ後の挙動を示す電気泳動図（ウェスタンブロッティング）である。

図 7は、本願発明のペプチド断片又はペプチド断片群とその他の蛋白質の、細胞死抑制活性に関する比較試験の結果を示す図である。

図 8は、本願発明のペプチド断片又はペプチド断片群と他の抗酸化剤の、細胞死抑制活性に関する比較試験の結果を示す図である。

図 9は、脂肪酸により誘導される細胞死に対する本願発明のぺプチド断片又はぺプチド断片群の細胞死抑制活性を示す図である。

図 1 0は、脂肪酸により誘導される細胞死に対する本願発明のペプチド断片又はぺプチド断片群とビタミン Εで代表される抗酸化剤の、細胞死抑制活性に関する比較試験の結果を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

細胞死抑制活性を有する因子をスクリ一ニングするためには、細胞死を誘導する培養系を構築する必要がある。本願発明では、好適な一例としてアルブミン添加無血清培地を用いたヒト巨核芽球系の D a m i細胞の培養系をスクリーニング方法として用いた。 D a m i細胞は R P M I 1 6 4 0、 D— MEM、 F - 1 2 の 1 ： 2 ： 2混合培地（0 . 1 % B S A及ぴ 0 . 0 5 μ M 2—メルカプトエタノール含）により継代可能であるが、アルブミン不含培地では殆ど増殖しない。このとき、培地中に 0 . 0 1から 0 . 5 %のヒト血清アルブミンが存在する条件下においては細胞は正常に増殖するが、 4日目以降に全ての細胞が徐々にではなく突然死する。この培養系に活性画分の希釈試料を添加することにより細胞死抑制活性の大小を比較することが可能である。

アツセィには D a m i細胞の利用が最も効果的であるが、特にこの細胞に限定されるものではなく、同様の条件で細胞死が生じるものであればどのような細胞を用いても細胞死抑制活性をスクリーニングすることは可能である。他にも適用可能な細胞としては、 C EM、 M o 1 t 4等の細胞が例示される。また、このァッセィ系に用いるアルブミンは細胞死を観察できるアルブミンならどのようなァノレブミンでもよいが、例えば S I GMA社製のヒト血清アルブミン F— Vは好ましい態様の一つである。上述のアツセィ系に基づいて、体内成分とりわけ血液由来の成分に着眼し、銳意活性探索を検討した結果、本願発明者らはヒトを初めとする哺乳動物の血漿又は血清中に所望の活性を見出すに至った。検出された細胞死抑制活性画分は、ヒト血漿及び血清を原料とした場合では 1 6 0 0〜3 2 0 0倍希釈まで細胞死抑制活性を示し、牛胎児血清を原料とした場合では 1 0 0倍希釈以下の活性を示した。本明細書では、細胞死抑制活性を定量化する際、希釈倍率 1 0 0以下を 0、それ以上の希釈倍率の値をそのまま活性値として表す。

本願発明により提供される活性物質であるべプチド断片群は、一般的な酵素類よりも熱、変' 剤、幅広い p H、血中のプロテアーゼに対して安定であるため、広範な精製法を適用することが可能である。すなわち、種々のクロマトグラフィ一工程、例えば、へパリンクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィ ―、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ一等、適用可能な種々の担体を用いた分画方法の他、硫酸アンモニゥム沈殿分画、分子量膜分画、等電点分画、電気泳動分画等、種々の分画法が利用可能である。これらの分画法を適宜組み合わせることにより、所望の細胞死抑制活性を分画することが可能である。その望ましい糸且み合わせの一例を実施例 2に示す。態様の概略は、操作順に従って、へパリンクロマトグラフィー、硫酸アンモニゥム沈殿分画、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィ —、疎水クロマトグラフィー、へパリンクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィーである。

この組み合わせにより、得られる活性画分は純度的に推定夾雑物 5 %以下、例えばヒト血漿を出発原料とした場合、 2 X 1 0 ⁵/ 1 m g蛋白質/ m 1の活性を示す状態で精製することが可能である。出発原料の血漿の活性が約 2 0〜 4 0 / 1 m g蛋白質/ m 1程度であるので、比活性で推定 5 , 0 0 0〜 1 0 , 0 0 0倍程度上昇する。

上述のごとく精製同定された本願発明の血漿中の細胞死抑制活性成分は、下記の性質によつて特徴づけられる物質である。ン結合性

へパリンカラムへの結合性を調べると、細胞死抑制活性成分は弱レ、へパリン結合や生を示す。この知見により、本願発明の細胞死抑制活性成分は相対的に正電荷を帯びている物質であり、血球、血管内皮等血中においてストレスに曝されやすい細胞表面のへパラン硫酸と結合することにより細胞表面の保護に関与する物質であることが予想される。

分子量分画膜による活性の挙動

血漿中のへパリン結合画分について、分画分子量 10 kD a、 30 kDa、 5 0 kD aの膜により抑制活性を濃縮すると、分画分子量 1 O kDaで 90〜9 5%、 30 kD aで 10〜20%、 50 k D aで 0〜 10 %の活性が回収される。このことより、本願発明の細胞死抑制活性成分は、他のへパリン結合蛋白が存在する条件下において、その 80〜90%は10 kD a〜30 k D aの分子量を示すが、一部にはそれ以上の分子量を示すこともあることから、修飾、重合、プロセシングの差に起因する分子量の異なる活性物質が一部存在することも示唆される。

硫酸アンモニゥム分画

粗分画の試料は 2 M程度で全ての活性が沈殿する。ただし、厳密には、全ての活性を沈殿させるためには 3 M程度の硫酸アンモニゥムを添加する必要がある。本願発明の活性成分は、塩析操作により他の蛋白質と共沈することもあるが比較的塩析されにくレ、性質を示す。

ィオン交換樹脂への結合性

2 OmM程度の適当な緩衝液を用いた場合、 pH8.0以上で陰イオン交換体へ一部結合性を示すが、全ての活性が完全に結合することはない。また、 pH7. 0以下で陽イオン交換体への結合性を示す。このことから、本願発明の活性成分は血中で pH 7から pH 8の間に等電点を示す構造と、 pH 8以上に等電点を示す構造を有する物質であることが推察される。

疎水クロマトグラフィ一による分画

Macro-Prep Methyl HIC、Macro- Pr印 t-butyl HIC担体を用いた場合、 20m M T r i s (pH8.0)、 200 mM N a C 1、 1.2 M硫酸アンモニゥム存在下での活性画分の吸着はほとんど観察されない。 1.5 Mまで硫酸アンモニゥム濃度を高めると 3〜 5割が吸着され、さらに 2〜 2.4 -Mまで硫酸アンモニゥム濃度を高めるとほとんど全ての活性を吸着させることができる。異なる担体を用いた場合も、同様の条件により本願発明の活性成分を効果的に精製することが可能である。

ゲル濾過による分画

へパリン結合画分についてゲル濾過ク口マトグラフィ一を用いて分画した場合、分子量が 30 kDa〜40 kDaのサイズに殆どの活性が回収されるが、実際に得られる本願発明の活性物質は電気泳動で明らかに 30 k D a以下の分子量を示すこと力ら、他の分子と結合しやすい可能性のある物質と予想される。

PAGE (ポリアクリドアミドゲル電気泳動）

本願発明の活性物質を未変性 P AG Eにより分画すると活性が単一のバンドに収束しないことから、活性物質は単一の構造ではなく、 2量体の形成、荷電の違レ、、糖鎖の付加又は本願発明の活性物質を構成するべプチド断片の断片化の形態の相違等により多様な分子量の状態で存在していることが示唆される。 SDS— P AG Eでは、非還元状態での電気泳動において、分子量約 13〜 14 k D aの 2本のバンド及びそれらに糖鎖の付加された約 16〜17 kD aの 2本のバンドを示すペプチドにより構成されていることを確認することができる。また、還元条件では、それらに加えて約 3〜4 kDa、約 7〜9 kDa及び約 10〜： 1 2 k Daのバンドが出現することから、内部に S— S結合を持つ約 1 3〜14 kDa 及び約 16〜 17 kD aのノくンドに相当するぺプチドの一部に内部切断が生じているものが存在し、還元により S— S結合が切断され、前述の新たなサイズのぺプチドが出現することを示している。このことは、約 3〜4 kDaのペプチド断片に対する抗体が約 7〜 9 k D a及び約 10〜 12 k D aのぺプチド断片以外の全てのペプチド断片と反応することからも支持される。また、還元状態で得られる約 3〜4 kDaのペプチド自体にも細胞死抑制活性が存在することより、このペプチド部位が最も活性に関係する領域である可能性は高い。

N末端アミノ酸配列分析

上記 PAGEで確認されたペプチド断片は、ヒトセレノプロテイン Pの c DN Aから推定されるアミノ酸配列中の C末端側 1 0 3アミノ酸残基部分と高い相同性を示す物質であることが明らかになつた。

N末端ァミノ酸配列分析の結果、本願発明の細胞死抑制活性を有するぺプチド断片又は当該ペプチド断片と起源を同じくするペプチド断片群は、 ①ヒト ·セレノプロテイン Pの 2 6 0位の L y sより始まる、 Lys Arg Cys He Asn Gin Leu

Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu (配列番号 1 ) の配列、及び②ヒトセレノプロテイン Pの 2 9 3位のトレオニンより始まる Thr Gly Ser Ala lie Thr Xaa Gin Cys Lys Glu Asn Lys Pro Ser Leu Cys Ser Xaa Gin Gys Leu Arg Ala Glu Glu Asn lie (配列番号 2 ) (Xaa はセレノシスティンである）の配列を含むペプチドを基本ュニットとしていることが判明した。本願発明の活性物質は、構成ュニットとしての前記べプチド断片の結合体又は複合体として存在し細胞死抑制活性を発揮する。一方、構成ユニットの各々にも活性が認められる。さらに、糖鎖の付加の相違、荷電の違い、また断片化の形態の相違、とりわけペプチド断片の C末端側の多様性等により多様な分子種が混在しており、混在状態においても本願発明の細胞死抑制活性を呈する。従って、本願発明の活性物質には、細胞死抑制活性を呈する限りにおいて、活性を有する個々のペプチド断片及びその部分断片のみならず、多様なぺプチド断片の集合体、即ちべプチド断片群が包含される。

ところで、これまでセレノプロテイン Pには本願発明で特徵づけられるサイズを有するプロセスされたフォームが存在するという報告はなされておらず、ましてこの部位のみで活性を持つことを示唆する報告もなされていなレ、。

セレノプロテイン pは 1 9 7 7年にグルタチオンぺロキシダ一ゼ

(gulutathione-peroxidase)とは異なるセレン含有タンパク質として確認され、 1 9 8 2年にセレンがセレノシスティン（selenocysteine)の形態で取り込まれていることが明らかにされた。さらに、 1 9 9 1年にセレノプロテイン Pの c D N Aのクローニングにより全長のアミノ酸配列が明らかにされ、その結果、当該蛋白質は最大 1 0個のセレノシスティンを含む可能性等が示された（Hill K. E.及び Burk R. F. , Biomed. Environ. Sci. , 10, p. 198-208 (1997) )。しかし、実際には、組換え蛋白の発現や、精製セレノプロテイン Pにおける本願発明中の活性べプチド断片又は活性べプチド断片群に相当するアミノ酸配列の同定等はなされておらず、活性部位の同定もなされていない。また、抗セレノプロテイン P抗体を用いてヒトセレノプロテイン Pを精製したという報告もあるが、用いられた抗体がセレノプロテイン Pの N末端側を認識する抗体に相当するため、今回得られたペプチド断片のみの精製も不可能である。よって、本願発明で特徴づけられる活性ぺプチド断片又は活性べプチド断片群についての活性評価を行なったのは、本願が最初である。

セレノプロテイン Pの活性としては、セレンに由来する抗酸化活性、ダルタチオンペルォキシダーゼ活性が報告されているが、現在までに、本願発明により得られたべプチド断片又はぺプチド断片群が生体に存在し優れた活性を示すという報告はなく、当然、本願発明中に特徴づけられる活性の存在も報告されていない。その他の蛋白との活性比較

本願発明の細胞死抑制活性を示すぺプチド断片又はべプチド断片群以外のセレノ蛋白及び抗酸ィヒ関連蛋白について、 D a m i細胞の細胞死抑制活性の有無を相対比較すると、ダルタチオンペルォキシダーゼ、 S O Dには若干の活性が観察される。し力し、本願発明の細胞死抑制活性を示すペプチド断片又はペプチド断片群と比較した場合、これらは 1 / 1 0 0以下の活性しか示さず、この活性は殆ど無いに等しい値である。また、本願発明の活性物質に関連性の高い完全長のセレノプロテイン pとの比較では、断片化された本願発明の活性物質の細胞死抑制活性に関する顕著な優位性が認められ、「断片化」の意義の重要性が如実に示される。つまり、本願発明の活性物質は、本願発明により特徴づけられる明らかな細胞死抑制活性を示す蛋白質としては知り得る限り唯一の血中成分であり、この存在を明らかにしたことに大きな意義が存在する。

なお、上述の知見に基づき本願発明により得られたぺプチド断片をリ一ド物質として、化学合成物をデザインすることも可能である。

前述の本願発明の細胞死抑制活性を示すぺプチド断片を免疫原として用いることにより、このような新規なぺプチドを認識し結合する抗体を得ることができる。本願発明のぺプチド断片又はべプチド断片群を含むものであれば免疫原としての能力を有するが、実施例 2で調製した画分を使用するのが望ましい。また、ぺプチド合成機を用いる方法あるいは遺伝子組換え技術により大腸菌、酵母等の微生物に産生させる方法等を用いて、本願発明のペプチド断片、又はその一部に相当するペプチドを得、免疫原とすることもできる。さらに、本願発明のペプチド断片もしくはその一部をコ一ドする遺伝子を組み込んだ動物細胞用の発現プラスミドも D N Aワクチンとしての免疫原として使用可能である。

そのようなペプチド断片の望ましいアミノ酸配列として、 Lys Arg Cys lie Asn Gin Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu lie Phe Glu Lys Thr Gly Ser Ala lie Thr Xaa Gin Cys Lys Glu Asn Leu Pro Ser Leu Cys Ser Xaa Gin Gly Leu Arg Ala Glu Glu Asn lie Thr Glu Ser Cys Gin Xaa Arg Leu Pro Pro Ala Ala Xaa Gin lie

Ser Gin Gin Leu lie Pro Thr Glu Ala Ser Ala Ser Xaa Arg Xaa Lys Asn Gin Ala Lys Lys Xaa Glu Xaa Pro Ser Asn (Xaa はセレノシスティンである）（配列番^" 3 ) 3Dるレヽ ί3» Lys Arg Cys lie Asn Gin Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg (配列番号 4 ) が挙げられるが、これに限定されるものではない。

免疫する哺乳動物は限定されるものではないが、抗血清を得る場合にはゥサギ等が望ましく、後に述べるモノクローン抗体を細胞融合等で得る場合にはマウスが望ましい。動物の週齢は、例えばマウスでは 5〜1 0週齢がよい。性は雌雄どちらでもよい。免疫用抗原は、例えば適当なアジュバントに懸濁させるカ又は生理食塩水等に溶解して、動物の腹腔内、皮下、静脈内等に投与するのが好ましレ、。この免疫操作を 2〜3週間隔で 1〜5回行なう。最終免疫は、例えば免疫用抗原を生理食塩水に懸濁させ、動物の静脈内に投与する。このような免疫動物から採血し抗血清を調製するか、あるいは脾臓細胞を調製し、 Kohler G.と

Milstein Cの方法（Nature, vol. 256， p. 495 (1975) )に基づいて、抗体を産生するハイプリドーマを得ることができる。例えばマウスの場合、免疫したマウスの脾細胞とマウスミエ口一マ細胞とを細胞融合してハイブリドーマを得る。

ハイプリドーマを培養する培地としては、ハイプリドーマの培養に適した培地であればよく、一般的には、 R P M I 1 6 4 0培地又は£ & _§ 1 eの M E M培地に、牛胎児血清（5〜： 1 0 %)、 L—グルタミン（3 . 5〜4 . 0 g ）及び抗生物質 (ペニシリン Gゃストレプトマイシン等）を添加したものが用いられる。また、 A S F 1 0 4 (味の素 ¾ )、 CM— B (三光純薬)等の無血清培地を用いることもできる。得られたハイプリドーマの中から、本願発明ペプチドに特異的なモノクローン抗体を産生するもののみをスクリーニングする。スクリーニングは、例えば、ハイプリドーマの培養上清を一部採取し、それが本願発明ペプチド断片又はその一部分に相当するペプチドと反応するかどうかを、 E I A法あるいは R I A 法、ウェスタンプロット法等の公知の方法で調べることが可能である。この方法は免疫動物の抗体の力価が上昇しているかどうかを知る方法としても使用できる。産業上の利用可能性

一般的に、何らかのストレス（例えば、止血状態、炎症の発生、臓器障害、細胞の損傷、血管の損傷、細菌感染、ウィルス感染など）が生じると遊離の脂肪酸量が 3倍以上も増加し細胞毒性が出現すると報告されている（「脂質の化学」、 p . 1 7 0 - 1 7 9 , 中村治雄編朝倉書店（1 9 9 0年）；「脳卒中実験ハンドブック」、 p . 4 3 7 - 4 7 1、佐野圭司監修アイビ一シー（1 9 9 0年））。この知見からも、ストレス状態が維持される環境では、種々の細胞の感受性の差があるにせよ、脂肪酸による細胞への悪影響が出現すると予想される。つまり、手術時のストレス（出血、止血、虚血）、疾患や移植などに伴う虚血後の再灌流のストレス、持続的な炎症によるストレスなどに対して、本願発明のセレノプ口ティン Ρに由来する活性べプチド断片又はべプチド断片群が細胞の抗酸化能を上げることにより細胞への悪影響を低減させ、病態悪化を防ぐことができる。また、同様の機序で細胞内の酸化ストレスを上昇させる現象に対して、当該活性べプチド断片又はべプチド断片群は細胞内の抗酸ィヒ能を上昇させることにより細胞を安定化する働きが期待できる。

本願発明中の活性べプチド断片又はべプチド断片群は生体內においてプロセスされた活性フォームとして血中で機能しており、ストレス由来により起きる細胞死を防御し、細胞の安定維持に働いていると予想される。つまり、過剰のストレスを防御しきれない場合などには細胞死が生じるはずであるから、このような時、本願発明の活性べプチド断片又はべプチド断片群を外部から補給することが可能であれば、重篤な疾患への移行を未然に防ぐことも可能であるし、治療につなげることができる。本願発明の活性べプチド断片又は活性べプチド断片群が予防ないし治療可能な疾患として、具体的には、酸化ストレスに起因して影響を受ける疾患、例えば、 A I D S (後天性免疫不全症候群）、パ一キンソン病、アルッハイマ一病等が挙げられる。また、動脈硬化の原因因子として酸化 L D Lが関与していることから、動脈硬化の病態悪化の P ii：、治療、予防等への使用も考えられる。あるいは心筋梗塞、脳梗塞や,移植等再灌流傷害が観察される疾病にも有効である。

とりわけ A I D Sに対しては、セレン蛋白と A I D S H I V (ヒト免疫不全ウィルス）との間に密接な関連があることが、近年、報告されている。すなわち、 H I V感染に伴って血清中のセレン濃度が低下し、その際、セレン濃度の低下と

C D 4細胞数の低下や mortality とに相関があるとの報告がある（Olmsted L. et al.， Biol. Trace El em. Res. , vol. 20, p. 59- 65, 1989 ; Allard J. P. et al. , Am. J. Clin. Nutr. , vol. 67, p. 143-147, 1998) 。また、 H I Vの核酸配列にはフレームシフトさせるとセレン蛋白を合成できる配列が存在しており、実際、 H I Vを感染させた Tリンパ球腫は、本来合成すべきセレン蛋白（ダルタチオンペルォキシダーゼなどの抗酸化酵素）を合成できなくなることが報告されている（Taylor E. W. et al. , Biol. Trace El em. Res. , vol. 56， p. 63-91, 1997 ; Gladyshev V. . et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 96, p. 835-839, 1999) 。さらに、 A I D Sにおける Tリンパ球の細胞死における酸化ストレスの関与が示唆されている（Romero - Alvira D. et al. , Med. Hypotheses, vol. 51, p. 169-173, 1998) 。

実際、セレン定量の結果、 A I D S患者は血中セレン濃度が正常人と比較して半分程度しか存在していないことがわかっている。この際に A I D S患者の血中セレノプロテイン P濃度も正常人と比較して異なる可能性があるため、 E I Aの測定系を用いて A I D S患者の血漿中のセレノプロテイン P量を測定したところ、早く病態が悪化した患者より病態の進行の遅い患者及び発症しない患者の方がセレノプロテイン Pの量が多い傾向のあることが観察された。また、 A I D S患者と健常人血漿中のセレノプロテイン Pの状態を比較するために抗セレノブロティン P抗体固定化担体を用いた免疫沈降を試みたところ、患者の病態の進行の遅いグループ及び発症しないグループは健常人と類似のパターンを示したのに対し、早く病態の悪化した患者のグループは健常人と明らかに異なるパターンを示す傾向にあることを確認した。これらの結果より、セレノプロテイン Pは A I D Sの症状改善、発症予防に有用である可能性が示唆された。

このように、血中セレン濃度、とりわけセレノプロテイン P濃度と A I D Sとの関連が示唆されているが、セレノプロテイン Pの特定の配列を有する C末端側部分断片がセレノプロテイン P自体と比較して有意に高レ、細胞死抑制活性を有し、それゆえ A I D Sの予防 ·治療に有用であることについては、これまで全く知られていなかった。

その他にも、 B細胞及び T細胞系の培養においても、この活性ペプチド断片又はぺプチド断片群が有効に働レ、ていることは明らかであるから、免疫細胞系の安定化、制御等を行なうことによる、免疫促進、制御薬等への応用も可能である。また、培養細胞においても過剰のストレス由来の細胞死を防ぐことにより、有用な生体物質を産生させる場合などにおける培養条件の効率化などに利用可能である。

本願発明のぺプチド断片又はその一部からなるぺプチド並びに当該べプチド断片との結合能を有する抗体は、ウェスタンプロット法、 E L I S A法等の抗原検出系に利用することができ、診断薬を構築する材料となる。また、上記の抗体を適当な担体に結合させ、これを用いたァフィ二ティークロマトグラフィ一により、本願発明の活性を有するペプチド断片を精製することができる。さらに、 B細胞及び T細胞系の培養においてもこの活性ペプチド断片が有効に働いていることは明らかであり、加えて本願発明の活性ペプチド断片の免疫時の知見による、免疫原としての活性べプチド断片に対する抗体が B細胞に影響を与えている、との示唆を勘案すれば、免疫細胞系の安定化、制御等を行なうことによる、本願発明の抗体の免疫促進、制御薬等への応用も可能である。

以下に、実施例を挙げて本願発明をさらに具体的に説明する。なお、以下に示す実施例では、特に断りのない限り、和光純薬、宝酒造、東洋紡及び New

England BioLabs 社製の試薬を使用した。実施例 1

(アツセィ法）

0.05 μΜ 2ΜΕ及び 0. 1%B S Αを含有する無血清培地 S F〇3 (三光純薬社製）で継代可能な D a m i細胞（Greenberg S. M.， et al.， Blood vol.72, p.1968-1977 (1988) に記載： 1 X 10⁶細胞/ d i s h/ 3 m 1 ) 1 m 1に R PM

1 1640/D-MEM/F- 12の 1 : 2 : 2混合培地（ S A培地）を 2 m 1添加後、 3日間培養し、アツセィ時に当該細胞を回収した。細胞を 50%PBS/S A/0.03%HS A(S I GMAネ ± )により 2回洗浄し、同培地で 3 X 10⁴細胞 /m 1になるように懸濁後、得られた細胞懸濁液をサンプル添加ゥエルのみ 2 00 μ K 段階希釈のためのゥエルには 100 μ 1ずつを 96 w e 1 1プレートに分注した。サンブノレ添加ゥエルにアツセィ試料を 2 μ 1添加し撹拌後、 100 μ 1細胞懸濁液が入ったゥエルに対して段階希釈した。 37°Cの C〇₂インキュベータ一で 4〜 5日間培養し判定した。

アツセィの評価法としては培養 4日目以降、活性のない we 1 1の細胞は死滅し活性のある we 1 1の細胞は生存し続けることから、生細胞が被検試料の何倍希釈まで存在するかで評価した。

実施例 2

(細胞死抑制活性成分の精製）

以下の精製工程における活性の追跡は、すべて実施例 1に記載のァッセィ法に拠った。

血漿中の細胞死抑制活性はへパリン結合性を示す。そこで、先ず、血漿中のへパリン結合画分を集めるためにへパリンカラムを用いた分画を行なった。ヒト血漿を出発原料とし、血漿中のへパリン結合蛋白をへパリンカラム（H印 arin Sepharose: Pharmacia社製）に吸着させた後、 0.3M塩化ナトリゥムで洗浄後、 2 M塩化ナトリウムにより吸着画分を溶出した。目的の細胞死抑制活性の殆どは

0.3M塩化ナトリゥム洗浄画分に回収されるが、活性物質の精製には 2M塩化ナトリウム溶出画分を用いた。

へパリンに結合した細胞死抑制活性の粗分画を実施するために、硫酸アンモニゥム沈殿による分画を行なった。 2M塩化ナトリゥムへパリン溶出画分の総量に対して 31.3 %W/V (約 2 M)の硫酸アンモニゥムを添加し、沈澱物を回収した。沈殿物を水に溶解し、分子量 3, 500カツトの透析膜を用いて水に対して透析した。透析の完了した溶液を回収後、その総量に対して 1/50量の 1M

T r i s塩酸緩衝液（pH8.0)を添力□し、さらに、 20mM T r i s塩酸緩衝液（ρΗ8· 0)を用いて OD 280の値で 20〜30になるように溶液濃度を調整した。この溶液から不溶物質を除去するため、 1.0 μπα及び 0.45 μπιの濾過フィルタ一を用いて濾過した。

20 mM T r i s塩酸緩衝液（ p H 8.0 )により平衡化した陰ィオン交換ク口マトグラフィ一担体 (Macro- prep High Q: BioRad社製）に、濾過済みの蛋白溶液を通液し、陰イオン交換クロマトグラフィーを実施した。この時、非吸着画分及び 5 OmM塩化ナトリゥム溶出画分に活性が存在していたため、この画分を回収し混合した。陰イオン交換クロマトグラフィーにより得られた活性画分に対して、 1 Mクェン酸緩衝液（pH4.0)と IV [タエン酸を 6 ： 4の割合で混合した溶液を総量の 1/50量添カ卩し、 20 mMクェン酸緩衝液（ p H約 4.0 )となるように蛋白溶液を調製した。

2 OmMクェン酸緩衝液（pH 4. 0 )により平衡ィ匕した陽イオン交換クロマトグラフィ一担体 (Macro-prep High S: BioRad 社製）に、前述の蛋白溶液を通液し、陽イオン交換クロマトグラフィーを実施した。 22 OmM塩化ナトリゥムを含む 20mMクェン酸緩衝液（pH4.0)で洗浄後、 550 mM塩化ナトリウムを含む 2 OmMクェン酸緩衝液（pH 4.0 )により溶出される画分に活性が存在したため、この画分を回収した。

得られた 55 OmM塩化ナトリウム溶出画分の総量に対して 1M T r i sァミノメタン溶液を 1/30量添加し、 pHを約 7.5に調整した。この溶液に対して 3.5M硫酸アンモニゥム溶液（1M T r i s塩酸緩衝液（pH8.5)を 1/5 0量添加し p Hを約 7.5に調整）を 2 / 3量添加後、硫酸ァンモニゥム濃度が 1.

4M、塩化ナトリウム濃度が 33 OmMになるように塩濃度を調整した。さらに、不溶物質を除去するために、 0.45 μπιの濾過フィルターを用いて濾過した。次に 1.4 Μ硫酸アンモニゥム及び 33 OmM塩化ナトリゥムを含む 2 OmM T r i s塩酸緩衝液（ p H7.5)で平衡化した疎水クロマトダラフィ一担体 (Macro-prep Methyl HIC: BioRadネ： h )に前述の濾過済み蛋白溶液を通液し、疎水クロマトグラフィーを実施した。非吸着画分及び平衡化緩衝液（pH 7.5)洗浄画分に活性が存在したため、この画分を回収した。吸着画分には殆ど活性は存在しなかった。活性画分を疎水クロマトグラフィー担体に結合させるために、活性画分に対して硫酸アンモニゥム濃度が 2.0Mになるように上記の約 pH7.5 の 3.5 M硫酸アンモニゥム溶液を添加した。 2.0M硫酸アンモニゥム及び 24 OmM塩化ナトリウムを含む 2 OmM T r i s塩酸緩衝液（ p H 7.5 )により平衡化した疎水クロマトグラフィー担体 (Macro- prep Methyl HIC: BioRad社製）に試料を通液し、活性成分を吸着させた。平衡化緩衝液により洗浄後、吸着している活性を 2 OmM T r i s塩酸緩衝液（ p H 8.0 )により溶出した。回収した活性画分を水に対して 1昼夜透析し、この回収した活性画分をへパリンカラムに確実に吸着させるために、 1Mクェン酸緩衝液（pH4.5)を 1/50量添加し、 p Hを約 5.0に調整した。以上、図 1参照のこと。

20 mMリン酸緩衝液（ p H 6.5 ) (緩衝液 A)及ぴ 2 M塩化ナトリウムを含む 20 mMリン酸緩衝液 (pH6.2) (緩衝液 B )を調製し、緩衝液 Aで平衡化したへパリンカラム（Hi- Trap Heparin： Pharmacia社製）に p H調整した活性画分を通液した。その後、緩衝液 Bを緩衝液 Aに対して 5 %混合した溶液（ 0. 1 M Na C l)によりカラムの 2倍量洗浄した後、さらに、緩衝液 Bの緩衝液 Aに対して 20%混合した溶液（0.4 M Na C l)により溶出し、活性画分を回収した。ここで得られた活性画分を 15mg/m 1程度の濃度まで膜濃縮器 (Centriprep 3： Amicon社製）により濃縮した。濃縮した活性画分の総量に対して 2 %の酢酸を添加後、 0.45 / mの濾過フィルタ一により不溶物の除去を行なった。

2 %酢酸及び 500 mM塩化ナトリゥムを含む溶液により平衡化したゲル濾過クロマトグラフィ一担体（Superdex 200pg: Pharmacia社製）に活性画分を 1 m 1 通液し、ゲル濾過クロマトグラフィーを実施し、活性を分画後、回収した。

0.1 %トリフルォロ酢酸及び 1 %ィソプロパノールを含む 1 %ァセトニトリルにより平衡化した C4逆相 HPLC(Wakosil 5C4-200 6 mmX 15 Omm：和光純薬社製）に前述の画分を通液し、平衡化溶媒で洗浄後、 0. 1%トリフノレオ口酢酸及び 1%ィソプロパノールを含む条件下で 1%から 40%ァセトニトリノレのリニアグラジェント溶出により得られた活性画分を回収した。ここまでの各精製工程における活性及び比活性の推移を表 1にまとめる。精製工程蛋白濃度 (mg ml) 活性比活性

①原料血漿 64 2400 3 8

②へパリン溶出硫酸アンモニゥム処理 2 2. 6 1 28 00 5 6 6

③陰イオン交換ク Dマト、素通り画分 2. 1 4800 2 2 8 6

④陰イオン交換ク pマ卜、吸着，溶出 0. 4 1 600 4 0 00

⑤陽イオン交換マ卜、吸着 .溶出 2. 8 1 2800 4 5 7 1

⑥疎水ク pマト、吸着 ·溶出 6. 8 2 56 00 3 7 6 5

⑦ HiTrapへパリン、吸着 ·溶出 1. 6 2 56 00 6 000

⑧ C 4逆相 HP LC 0. 9 2 04800 2 2 7 5 5 6 得られた活性画分をさらに細かく分画するためにイオン交換ク口マトグラフィ一担体 M i n i Q (Pharmacia社製）による分画を実施した。 20 mMエタノールァミン（pH 9. 1 5)の条件下で塩ィ匕ナトリウムによるリニアグラジェント溶出を行なった。分画された画分には全て活性が存在しており、全ての画分が後述の実施例 4で得られた抗体と反応した。つまり活性物質はいくつかの構造の異なる状態で存在していることが確認された。

この段階での目的の活性物質は、電気泳動による解析の結果、非還元状態で 1 0 kD aから 3 0 k D aの数本のバンドより構成され、還元状態では 3〜4 kD aと 7〜9 kD aにスメァなバンドが 1本、 1 3〜：！ 4 kD aに 2本、 1 6〜1 7 kD aに 2本の最低 6本のバンドを示した。これらのバンドは全て実施例 4に示す抗体を用いたウェスタンプロッティングにより検出可能であった。非還元状態での電気泳動において、 2 8〜2 9 k D a近傍にも抗体に反応する蛋白が確認されることより、 2量体を形成しているものも存在している可能性が示唆された。図 2参照のこと。

実施例 3

(活性成分の N末端配列解析）

気相シーケンサーによるアミノ酸配列解析の結果、本願発明の活性画分は、 Lys Arg Cys lie Asn Gin Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu (配列番号 1 ) の配列及び Thr Gly Ser Ala lie Thr Xaa Gin Cys Lys Glu Asn Leu Pro Ser Leu し ys Ser Xaa Gin Gly Leu Arg Ala Glu Glu Asn lie (配列番号 2 ) (Xaa はセレノシスティンである）の配列を含むペプチドより構成されていた。この画分のシークェンス解析時のアミノ酸回収量より予想されるそれぞれの存在比は 1 ： 1から 2 ： 1の範囲であった。また、この 2種のペプチド以外の蛋白由来のアミノ酸の回収は 5 % 以下であった。この 2種のペプチドは還元状態でのゲル濾過クロマトグラフィ一及び C 4逆相 H P L Cにより分離されるため、 S— Sにより結合しているものが存在することが予想された。

還元状態での C 4 H P L Cにより分離されたぺプチドの中で 3〜 4 k D aの分子量を示すペプチドはシークェンス解析の結果、 Lys Arg Cys lie Asn Gin Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser (酉己列番号 5 ) の配列を示し、 7〜9 k D aが大部分を占める画分は、 Thr Gly Ser Ala lie Thr Xaa υΐη Cys Lys Glu Asn Leu Pro Ser Leu Cys Ser Xaa Gin Gly Leu Arg Ala

Glu Glu Asn lie (配列番号 2 ) の配列を示した。また、 1 3〜1 4 k D a、 1 6〜 1 7 k D aの画分ち Lys Arg Cys lie Asn Gin Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser (配列番号 5 ) の配列を示した。これらの得られたアミノ酸配列は、下記表 2に示す公表されているヒト 'セレノプロティンPのc D NA配列（Hill K. E. , et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 90, p. 537-541 (1993) )より推測されるアミノ酸配列のシグナル以降 2 6 0 番目のリジンより始まる断片と 2 9 3番目のトレオニンより始まる断片に相当することが推察された。表 2

Met Trp Arg Ser Leu Gly Leu Ala Leu Ala Leu Cys Leu Leu Pro Ser Gly Gly Thr (シグナル配列)

Glu Ser Gin Asp Gin Ser Ser Leu Cys Lys Gin Pro Pro Ala Tr 15 Ser lie Arg Asp Gin Asp Pro Met Leu Asn Ser Asn Gly Ser Val 30

Thr Val Val Ala Leu Leu Gin Ala Ser Xaa Tyr Leu Cys lie lie 45 Glu Ala Ser Lys Leu Glu Asp Leu Arg Val Lys Leu Lys Lys Glu 60 Gly Tyr Ser Asn lie Ser Tyr lie Val Val Asn His Gin Gly lie 75 Ser Ser Arg Leu Lys Tyr Thr His し eu Lys Asn し ys Val Ser Glu 90 His lie Pro Val Tyr Gin Gin Glu Glu Asn Gin Thr Asp Val Trp 105

Thr Leu Leu Asn Gly Ser Lys Asp Asp Phe Leu lie Tyr Asp Arg 120 Cys Gly Arg Leu Val Tyr His Leu Gly Leu Pro Phe Ser Phe Leu 135 Thr Phe Pro Tyr Val Glu Glu Ala lie Lys lie Ala Tyr Cys Glu 150 Lys Lys Cys Gly Asn Cys Ser Leu Thr Thr Leu Lys Asp Glu Asp 165 Phe Cys Lys Arg Val Ser Leu Ala Thr Val Asp Lys Thr Val Glu 180

Thr Pro Ser Pro His Tyr His His Glu His His His Asn His Gly 195 His Gin His Leu Gly Ser Ser Glu Leu Ser Glu Asn Gin Gin Pro 210 Gly Ala Pro Asn Ala Pro Thr His Pro Ala Pro Pro Gly Leu His 225 His His His Lys His Lys Gly Gin His Arg Gin Gly His Pro Glu 240 Asn Arg Asp Met Pro Ala Ser Glu Asp Leu Gin Asp Leu Gin Lys 255

Lys Leu Cys Arg Lys Arg Cys lie Asn Gin し eu . Leu Cys Lys Leu 270 Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys 285 Arg His Leu lie Phe Glu Lys Thr Gly Ser Ala lie Thr Xaa Gin 300 Cys Lys Glu Asn Leu Pro Ser Leu Cys Ser Xaa Gin Gly Leu Arg 315 Ala Glu Glu Asn He Thr Glu Ser Cys Gin Xaa Arg Leu Pro Pro 330

Ala Ala Xaa Gin lie Ser Gin Gin Leu lie Pro Thr Glu Ala Ser 345 Ala Ser Xaa Arg Xaa Lys Asn Gin Ala Lys Lys Xaa Glu Xaa Pro 360 Ser Asn

(Xaa はセレノシスティン）（配列番号 6 ) 実施例 4

(活性成分に対する抗体の作製）

実施例 2で示された物質が、同一の物質由来のバンドであることを明らかにするために、以下に示すようにポリクロ一ナルぺプチド抗体及びモノクローン抗体を作製した。これらの抗体を用いたウェスタンブロッテイングの結果、電気泳動で観られる全てのバンドが同一のモノクローン抗体及ぴぺプチド抗体により認識されることから、均一の構造ではないが全て同一の構造を持つベプチド断片であることを確認した。

①ぺプチド抗体の調製

ぺプチド抗体については、還元条件下で活性画分のゲル濾過及び C 4逆相 H P

L Cを実施することにより 3〜4 k D aのぺプチドを分取し、そのアミノ酸配列解析の結果に従って 2 0アミノ酸を合成し、ゥサギに免疫することにより抗体を得た。詳細には、先ず、 N H ₂ _ Lys Arg Cys lie Asn Gin Leu Leu Cys し ys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg— C O O H (配列番号 4 ) のぺプチドをペプチド合成機により合成し、 C 1 8逆相 H P L Cにより精製した。精製したぺプチドをダルタルアルデヒド法により K L Hと 1 ： 1で結合し、その 2 0 0 gをニュージーランドホワイトゥサギ 2匹に接種した。初免疫感作は背部皮下経路でフロイント完全アジュバント存在下 1回接種し、さらに 2週間毎にフロイント不完全アジュバント存在下、背部皮下経路で 3回追加免疫を行ない採血した。抗血清の E I Aによる免疫原との反応性は、 4 0， ◦ 0 0倍まで抗体価の上昇がみられた。この抗血清を出発材料としてァガロースに抗原を結合させた担体によるァフィ二ティ一精製を行なった。得られた抗体は抗血清と同様の反応性を示した。

②モノクローン抗体の作製

B a 1 b / cマウスに、初免疫感作として腹腔内経路でフロイント完全アジュバント存在下で実施例 2に記載の本願発明活性成分の精製画分 5 0 gを 1回接種した後、 2週間毎に腹腔内経路でフロイント不完全アジュバント存在下で 2回免疫した。その 1週後に静脈内経路で当該精製画分を 5 0 g接種した。最終免疫から 3日後に、常法に従いマウスより脾臓細胞を採取した。マウス 5匹のうち、抗血清を用いたウェスタンプロットにより免疫原と反応の強かった 2匹の脾臓細胞は、通常の細胞数の 1 10と極端に少なく、免疫原に対する抗体が B細胞に影響を与えていることが予想された。この得られた細胞をミエローマ細胞 P 3 X 63 Ag 8U. 1 (P 3U 1) (ATCC寄託番号 CRL— 1597 : Curr. Top. Microbiol. Immunol.， vol.81, p.1 (1978) )と細胞数 1対:！〜 2の割合で混合し、遠心処理（1, 500 r pm、 5分）して上清を除き、沈殿した細胞塊を充分ほぐした後、予め 37°Cに加温しておいた lmlのポリエチレングリコール溶液（4 5%ポリエチレングリコール 4000、 55% RPMI培地）を攪拌しながら加えた。 37でで 5分間ィンキュベートした後、液の全量が 50mlとなるようにゆっくりと R PM I培地を加えた。遠心分離（ 1 , 300 r p m、 7分)後、上清を除去して緩やかに細胞をほぐした。これにエスタロン CM— B培地（三光純薬社製） 50m lを加え、メスピペットを用いて緩やかに細胞を懸濁した。この細胞懸濁液を 4〜 5枚の 96ゥヱル細胞培養プレ一トの各ゥエルに 100 μ 1ずつ分注し、 5%炭酸ガスを含む 37°Cの C〇₂インキュベーター内で培養した。翌日に、 HAT培地（エスクロン CM— B培地にヒポキサンチン 1 X 10⁴M、チミジン 1.5 X 10— ³M、アミノプテリン 4 X 10一⁷ Mになるよう添加したもの）を各ゥエルに 100 1ずつ分注し、 5%炭酸ガスを含む37°〇の〇〇₂ィンキュベータ一内で培養した。ハイブリドーマのコロニーが十分生育したものから HT培地 (上記 HAT培地からアミノプテリンを除いたもの）に交換し、培養上清の一部を分取し、以下に述べるスクリーニング法にて目的のハイプリドーマを選別した。

目的のハイブリドーマの選別は下記の E I A法、ウェスタンブロッテイング法を糸且み合わせて実施した。

( 1 ) E I A法

96穴のマイクロテストプレー卜に前記のごとく作製した合成ペプチド抗原、もしくは精製抗原（蛋白質濃度 2 μ g/m l)を 5 1 /穴で加え、 4°Cで一晚ィンキュペートすることにより固相化した。さらに、 1 %B S A (ゥシ血清アルブミン)溶液 300 μ 1を加え、同様にィンキュベートしてマスキングを行なった。このようにして作製した抗原固相化プレートに細胞融合法によって得られたハイブリドーマ及びクローニング後のハイブリドーマの培養上清を加えて、 4 で 1. 5時間インキュベート後、 PB Sで 3回洗浄し、ペルォキシダ一ゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体溶液（力ッペル社製、 5, 000倍希釈）を 1 00 μ 1 /穴加えた。 4°Cで 1時間インキュベート後、 PBSにて 5回洗浄し、その後 TMB Z基質溶液を加え、常法により発色させその吸光度を波長 450 nmにて測定した。こうして精製抗原と反応するハイプリドーマクローンを選択した。この方法により、ハイプリドーマ約 500個から陽性コロニーとして 1 6個を選択した。

(2)ウェスタン'プロッティング法

E I Aで得られた陽性コロニーについてウェスタンブロッテイング法によるスクリ一二ングを行なった。精製抗原を 1 7. 5 %の S D S _ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、 PVDF膜上に移行させ、膜を 0.4〜0. 5 cm幅に切断した。各細片をハイプリドーマ培養上清液に浸し、 1時間 3 7°Cでインキュペートした。その後、細片を TB ST(0. 05%Twe e n含）で 3回洗浄した後、アルカリフォスファタ一ゼ標識抗マウス I gG(TAG〇ネ；の 1 : 200 0希釈液中で 37°C、 1時間インキュベートした。 TBSTで 3回洗浄後、 BC

I P/NBTを用いる発色試薬（B i o-Ra d社製）で発色させ、精製抗原の発色バンドを示すハイプリドーマを選択しクローニングした。クロ一ニング後のハイブリドーマクローンについても同様の手法で選別した。上記の選別方法によつて所望のモノクローン抗体を産生するハイプリドーマが 2クローン得られた。実施例 5

(抗セレノプロティン P抗体結合担体力ラムを用いたセレノプロテイン P断片の精製）

血漿中のへパリンセファロース結合画分を 2M硫酸アンモニゥムにより沈殿させ、その沈殿画分に対して 5倍容量以上の 2 OmM T r i s緩衝液（pH8. 0) を用いて沈殿を溶解させた。この溶液に存在するセレノプロテイン Pを前記実施例 4に記載の抗セレノプロテイン P抗体を担体に結合させた抗セレノプロテイン P抗体結合担体カラムに吸着させ、リン酸化生理食塩水（PB S)で洗浄した。その後、 4 M尿素を含有する 2 OmMクェン酸緩衝液（pH4. 0) によりセレノプロテイン Pを溶出し、当該溶出液をさらに 2 OmMクェン酸緩衝液（pH4. 0 ) で平衡化した陽イオン交換体（Macropr印 High S、 BioRad 社）に吸着させた。これを、塩化ナトリウムによる塩濃度勾配溶出し、細胞死抑制活性を示すセレノプロテイン p断片画分を回収した。このとき、全長のセレノプロテイン Pを得ることが可能であるが、この物質は蛋白質当たりの細胞死抑制活性は明らかに弱い値を示した。本方法によれば、短時間の精製が可能であるため、蛋白質当たりの細胞死抑制活性の強レ、セレノプロテイン P断片を得ることができた。ここで得られた断片もまた、糖鎖の有無、分子間結合の有無、内部切断の有無などにより種々の大きさの分子種を含む混合画分であり、非還元電気泳動で 1 0〜 3 0 k D aのサイズを示すセレノプロテイン P断片群であった。図 3参照のこと。

実施例 6

(m i n i Q活性画分の N—グリコシダーゼの処理）

活性画分の糖鎖結合の有無を確認するため、 m i n i Qにより分画された活性フラクションにつレ、て N—グリコシダ一ゼ Fによる N型糖鎖の切断を行なった。反応は 1 5 0 mM T r i s ( p H 7. 4 )中で実施した。その結果、明らかに、 1 6〜1 7 k D aの 2本のペプチドが 1 3〜1 4 k D aのサイズにシフトすることを確認した。他のペプチドには大きな変化は観察されなかった。図 4参照のこと。実施例 7

(還元カルボキシメチル化）

さらに、詳細な情報を得るために、本願発明のペプチド断片又はペプチド断片群について還元カルボキシメチル化処理後の逆相 C 4 H P L Cによる分離を行ない、得られたペプチドについての電気泳動及びアミノ酸配列解析を実施した。電気泳動の結果、未処理の状態では 7〜 9 k D aと予想される 2本のべプチドが還元カルボキシメチル化による影響で 1 2〜1 4 k D aに相当する移動距離に変化した F 3のべプチド断片及び未処理の状態で 1 0〜 1 2 k D aの分子量を示すと予想される F 2の 1 6〜1 8 k D aの 2本のべプチド断片だけが Lys Arg Cys

He Asn ijin Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg (酉己列番号 4 ) の配列よりなるぺプチド断片を含んでいないことをぺプチド抗体との反応性から確認した。

ァミノ酸配列解析の結果、 F 2及び F 3の画分に含まれる前記のぺプチド断片は Thr Gly Ser Ala lie Thr Xaa Gin Cys Lys Glu Asn Leu Pro Ser Leu Cys Ser Xaa Gin (配列番号 7) (Xaa はセレノシスティン）の配列を示し、 N—グリカナーゼ処理により F 2の 16〜18 kDaのバンドが F 3のバンドにシフトしていることより、 F 2が F 3のフラグメントに糖鎖が付加したものであることを確認した。また、 N—グリカナーゼ処理により分子量がシフトするぺプチドの存在する画分を含めペプチド抗体で反応が観られる画分は全て Lys Arg Cys lie Asn Gin Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser (酉己列番号 5) の配列を示した。

実施例 3の結果及び上述の結果を勘案すれば、活性物質の① 3〜 4 k D a、 ② 7〜9 kDa、 ③ 10〜1 2 kDa、 ④ 13〜： 14 kDa、 ⑤ 16〜17 kDa のバンドに相当する各ぺプチド断片の中で、 ①、 ④及び⑤は 260番目のリジンより始まる断片、 ②及び③は 293番目のトレオニンより始まる断片であることが理解される。また、非還元条件では①、 ②及び③のペプチド断片は得られないこと力ら、これらのペプチド断片は、元来 S— Sにより結合しているユニット構造を有する④又は⑤のペプチド断片が内部切断されて生じたものであることが確認された。 ⑤については N—ダリカナーゼ処理により④のサイズにシフ卜すること、加えて①に対する抗体により認識されることより、 ④に糖鎖が付カ卩したものであることが確認された。その他、糖鎖の付加によらないサイズの異なるバンドがそれぞれのサイズ近傍に確認されることから、 C末端側の長さの異なるぺプチドが数種存在することが推察された。図 5及び図 6参照のこと。

実施例 8

(他の蛋白質との活性比較）

本願発明の活性成分に属さないその他のセレノ蛋白及び抗酸化関連蛋白質の細胞死抑制活性の有無について検討した。相対比較するため、抗酸化関連セレノ蛋白としてダルタチオンペルォキシダーゼ（S I GMA社製）、その他の抗酸化関連蛋白としてグルタチオンレダクターゼ（オリエンタル酵母ネ±^)、グルタチオン S トランスフェラーゼ（S I GMA社）、スーパ一ォキサイドデイスムターゼ（生化学工業社製）を用いて、 D am i細胞の細胞死抑制活性の有無を検討した。活性測定試料としては 70 /zM相当を等量用いた。アツセィの結果、ダルタチオンペルォキシダーゼ、スーぺーォキサイドデイスムターゼには若干の活性が観察されたが、これらは本願発明に特徴づけられる細胞死抑制活性を示すぺプチド断片又はペプチド断片群と比較した場合 1/100程度の活性しか示さず、明らかに、本願発明の細胞死抑制活性を示すぺプチド断片又はべプチド断片群が優位な活性を示した。図 7参照のこと。

さらに、抗体ァフィ二ティーカラムを用いて調製された完全長セレノプロティン Pとの上記と同じ評価系での細胞死抑制活性の比較では、断片化された本願発明のぺプチド断片又はべプチド断片群の、比活性で 80倍以上という顕著な優位性が示され、「断片化」の意義を確認することができた。表 3参照のこと。

¾3.

fi 蛋白濃度（ug/ml) 活性比活性

完全長セレノプロテイン P 40 く 100 く 2500 本願発明べプチド断片 10 2000 200000 実施例 9

(他の抗酸化剤との活性比較）

脂質酸化の抗酸化剤として一般的に有用であるとされているビタミン E及び過酸化水素の除去に働いている力タラ一ゼについて、本願発明の HS A存在下、無血清培養下で誘導される細胞死をどの程度抑制するものか検討した。

無血清培地 S F〇 3 (三光純薬）（ 0.05 μ M 2 MEカロ、 0. 1 %B S A含）で継代可能な D a m i細胞（ 1 X 10⁶細胞 (1 i s hZ 3 m 1 ) 1 m 1に R PM I

1 640/D-MEM F- 12の 1 : 2 : 2混合培地（ S A培地）を 2 m 1添加後、 3日間培養し、アツセィ時にその細胞を回収した。その細胞を 50%PBS /S A/0.03%HS A(S I GMA社）により 2回洗浄し、同培地で 3 X

10⁴/m 1になるように懸濁後、細胞懸濁液をサンプル添加ゥエルのみ 190 1、段階希釈のためのゥ工ルには 100 1ずつを、 96 we 1 1プレートに分注した。

アツセィ試料として 20 μΜのビタミン E、カタラーゼ及びセレノプロテイン P断片をそれぞれサンプノレ添加ゥエルに 10 μ 1ずつ添加し、攪拌後、 100 μ 1細胞懸濁液が入ったゥエルに対して段階希釈を行なった。培養は 37°Cの C〇₂インキュベーターで 4〜5日間行ない、判定した。アツセィの評価法としては培養 4日目以降、細胞死抑制に必要な試料濃度の相対比較を実施した。その結果、カタラーゼは細胞死抑制活^"生は示さず、ビタミン Eは 125nMまでは細胞死を抑制したが 62 nMでは細胞死を抑制できなかった。これに対してセレノプロテイン P断片は 60 pi [まで細胞死を抑制することが可能であった。また、この結果より、ビタミン Eで細胞死が抑制されたことから本願ァッセィ系においては HSA(S I GMA)に結合している脂肪酸類の過酸化が細胞死を誘導していると予想され、さらに、ビタミン Eよりも効果的に細胞死を抑制するセレノプロティン P断片はビタミン Eが有効である現象に対してなお有効に作用することが予想された。図 8参照のこと。

実施例 10

(脂肪酸により誘導される細胞死の抑制活性）

種々の二重結合を分子内に 2個以上有する長鎖の脂肪酸 (例えば、

eicosaaienoic acid, dihomo - γ -丄 inolenic acid, docosadienoic acid, docosatrienoic acid, adrenic acid, e i cosapentaeno i c acid,

docosahexaenoic acid, linoleic acid, Iinolenic acid, arachidonic acid)は全て、セレノプロテイン P非存在下の無血清培養において 1 ΟμΜの濃度で細胞死を誘導した。この中で、強く細胞死を誘導するァラキドン酸 (arachidonic acid), リノール酸（linoleic acid)及ぴリノレン酸（Iinolenic acid)についてそれらが細胞死を誘導する濃度、並びにそれを抑制するセレノプロテイン Pの濃度について詳細に検討した。

無血清培地 S F O 3 (三光純薬）（ 0. 05 M 2 MEカロ、 0. 1 % B S A含）で継代可能な D am i細胞（1 X 10⁶細胞 (1 i s hZ 3 m 1 ) 1 m 1に R PM I 164 O/D- E /F-12の 1 : 2 : 2混合培地（ S A培地）を 2 m 1添加後、 3日間培養し、アツセィ時にその細胞を回収した。その細胞を SAZ0.0

5 %脱脂肪酸 B S A (和光純薬社）により 2回洗浄し、 2〜 16 μ Mのァラキドン酸、リノール酸及ぴリノレン酸を含有する同培地で 3 X 1 O m 1になるように懸濁後、細胞懸濁液をサンプノレ添加ゥュルのみ 198 μ し段階希釈のためのゥエルには 100 μ 1ずつを 96 we 1 1プレートに分注した。これに 100 μ Mのアツセィ試料をそれぞれサンプル添加ゥエルに 2 μ 1ずつ添加し攪拌後、 1 0 0 μ 1細胞懸濁液が入ったゥエルに対して段階希釈した。培養は 3 7 °Cの C〇₂インキュベーターで 4〜 5日間行レ、、細胞死誘導とセレノプロテイン P断片による細胞死抑制の評価を 1 μ iMのセレノプロテイン P及びその希釈倍率による有効濃度を比較した。

ァラキドン酸、リノール酸等の多価の不飽和脂肪酸が 4 Μ以上存在する条件下で細胞の無血清培養を実施すると細胞死が誘導され、 1 μ Μのセレノプロティン Ρ断片によつて完全に細胞死を抑制し得ることが判明した。図 9参照のこと。 4 Μのリノール酸が存在する条件下でビタミン Εが細胞死を抑制する有効濃度カ 1 0 0 η Μ程度であるのに対し、全長セレノプロテイン Ρが同等の約 1 0 0 η Μ程度、セレノプロテイン Ρ断片が 1 0 p Mとセレノプロテイン Ρ断片が最も低濃度で有効性を示した。図 1 0参照のこと。抗酸化剤であるビタミン Εを添加することにより細胞死を抑制したことから、おそらく細胞内外で過酸化を受けた脂肪酸が細胞に損傷を与えることにより細胞死が惹起され、セレノプロテイン Ρ断片は効率的にこれを抑制しているものと考えられる。

また、 4 /i Mのリノール酸又はリノレン酸存在下で生じる D a m i細胞の細胞死の抑制効果の有無を種々の酸ィヒ還元に関する酵素類（グルタチオンペルォキシダーゼ、スーパーォキシドデイスムターゼ、グタチオンレダクターゼ、グノレタチオン一 S—トランスフェラーゼ、力タラ一ゼ）について検討したところ、ダルタチオンペルォキシダ一ゼにおいて、リノール酸存在下で生じる細胞死を 2 5 0 η Μ以上で抑制し、リノレン酸存在下で生じる細胞死を 5 0 0 η Μ以上で抑制したが、他の酵素類は 1 の濃度でも細胞死抑制効果は観察されなかった。同条件下でセレノプロテイン Ρ断片が 1 0 p Mという低濃度でも細胞死を抑制すること力ら、セレノプロテイン Ρ断片の際だった有効性が明らかとなった。また、この細胞死を誘導する脂肪酸の濃度を変化させることにより、感受性の異なる種々の細胞への脂肪酸の影響及びセレノプロテイン Ρの影響を観察することができた。通常、 2 0 μ Μのリノール酸を添加すると細胞死が誘導され、この濃度で細胞死が誘導されない細胞はセレノプロテイン Ρが発現している可能性が高い。この系を利用することにより、種々の細胞における脂肪酸によつて誘導される細胞死の抑制効果を評価することができる。この系は、 HS A(S I GMA社)添加時に誘導される細胞死と同じ現象を反映していると推察された。

これまでの実験により、巨核球系細胞株（D am i )、 T細胞系細胞株（Mo 1 t 4、 CEM、 J u r k a t)、 B細胞系細胞株（P3X63AG8.653、 P3X63AG8. Ul)、肝臓系細胞株（H e p G 2 )、神経系細胞株（ I M R 32 )、腎臓系細胞株 (CRL 1932)等で本願発明のセレノプロテイン P断片の効果が確認された。このこと力ら、セレノプロテイン P断片は、免疫系、神経系、造血系の細胞及び臓器由来の細胞に対して細胞死抑制の有効性を示すことが強く期待される。

実施例 1 1

(細胞死抑制物質の細胞培養時の添加物としての効果）

種々の細胞株（巨核球系細胞株： D a m i ；肝臓由来細胞株： H e p G 2 ；子宫由来細胞株： H e 1 a ；腎臓由来細胞株： C R L 1932 ；組織性リンパ球細胞株： U 937 ； T細胞系細胞株： J u r k a t、 Mo l t 4、 CEM ;線維芽細胞株： L 929 ；単球系細胞株： THP— 1 ； B細胞系細胞株： P3X63AG8.653、 P3X63AG8. U1；神経系細胞株： I MR 32)を R PM I 1640_ D- MEM/F - 12(1 : 2 : 2)培地（トランスフェリン、インシュリン、亜セレン酸ナトリウム不含）で、セレノプロテイン P断片の有無の条件下で培養した。その結果は、全ての細胞において、セレノプロテイン P断片の存在下では細胞状態の悪化が観察されないか悪ィヒを抑え得ることが判明した。表 4参照のこと。加えて、トランスフエリン、インシュリン存在下では全ての細胞状態の維持が可能となり、更に加えて 0.05 %B S A存在下ではより効果的であった。

また、抗セレノプロテイン P抗体固定化担体を用いてセレノプロテイン Pを完全に除去したヒト血清 5%存在条件で J u r k a t細胞を培養した際、当該細胞の増殖が悪化し細胞内抗酸化酵素の 1種である細胞内グルタチオンぺロキシダーゼ活性の低下が観察されたが、これにセレノプロテイン P断片を添加することにより、細胞増殖及びグルタチオンぺロキシダーゼ活性を正常に戻すことができた。なお、亜セレン酸ナトリウムでもこの効果は観察されたが、セレノプロテイン P 断片の効果はこれを凌いだ。また、セレン化合物であるエブセレンにはこの効果は観られなかった。以上のことから、セレノプロテイン P断片で亜セレン酸ナトリゥムを代替することが可能で、細胞培養時の添加物として有用であることが判 ¾寸

つた。

x

Claims

請求の範囲

1. セレノプロテイン Pの C末端側 1 ◦ 3アミノ酸残基からなる配列又は当該ァミノ酸配列のうち 1もしくは数個のァミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ酸配列又は前記レ、ずれかのァミノ酸配列の部分配列を有する、細胞死抑制活性を有するぺプチド断片又はべプチド断片群。

2. 式（I) ：

Lys Arg Cys lie Asn Gin Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp ier Glu Leu Ala Pro Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu (配列番号 1 ) 及び又は式（I I) ：

Thr Gly Ser Ala lie Thr Xaa Gin Cys Lys Glu Asn Leu Pro Ser Leu Cys Ser

Xaa Gin Gly Leu Arg Ala Glu Glu Asn lie (配列番号 2)

(式中、 Xaa はセレノシスティンを表す）で表されるアミノ酸配列もしくは当該ァミノ酸配列の部分配列を有する、請求項 1記載のぺプチド断片又はべプチド断片群。

3. 血漿蛋白質に由来する請求項 1又は請求項 2に記載のペプチド断片又はぺプチド断片群。

4. (a)分子量分画膜に基づき 10〜 30 k D aの分子量画分に回収され、（ b ) ィオン交換樹脂への結合性の検討の結果、血中で p H 7から p H 8の間に等電点を示す構造と p H 8以上に等電点を示す構造を有し、（ c )非還元系 S D S— P A GEでは分子量 13〜14 kD aの 2本のバンド及びそれらに糖鎖の付加された

16〜17 kD aの 2本のバンドを示し、また（ d )還元条件下での S D S— P A GEでは、前記バンドに加えて 3〜4 kD a、 7〜9 kD a及び 10〜 12 kD aのバンドを呈する、請求項 1から請求項 3のいずれかに記載のぺプチド断片又はべプチド断片群。

5. 還元条件下での SDS— PAGEにおいて、 3〜4 kDa、 7〜9 kDa及び 10〜12 kD aのバンドに相当する、請求項 1から請求項 4のいずれかに記載のぺプチド断片又はべプチド断片群。

6. 請求項 1から請求項 5のいずれかに記載の細胞死抑制活性を有するぺプチド断片又はべプチド断片群を主要構成成分とする、細胞死が関与する疾患の病態悪化阻止、予防又は治療剤。

7 . 前記細胞死が関与する疾患が、 A I D S、パーキンソン病、アルツハイマー病、動脈硬化、心筋梗塞、脳梗塞、臓器移植等再灌流傷害より選択される、請求項 6記載の病態悪化阻止、予防又は治療剤。

δ 8 . 請求項 1から請求項 5のいずれかに記載の細胞死抑制活性を有するぺプチド断片又はべプチド断片群を主要構成成分とする、酸化還元反応が関与する疾患の病態悪化阻止、予防又は治療剤。

9 . 請求項 1から請求項 5のいずれかに記載の細胞死抑制活性を有するぺプチド断片又はべプチド断片群を主要構成成分とする、免疫系細胞が関与する疾患の病0 態悪化阻止、予防又は治療剤。

1 0 . 請求項 1から請求項 5のいずれかに記載の細胞死抑制活性を有するぺプチド断片又はぺプチド断片群を主要構成成分とする、細胞培養用添加剤。

1 1 . 0 . 0 1〜 0 . 5 %ァルブミン添加無血清培地を用いたヒト巨核芽球系細胞培養系における細胞突然死現象を利用し、細胞死抑制活性を有する物質を添加し5 てその際の細胞死抑制の程度を評価する、細胞死抑制活性のスクリ一二ング方法。

1 2 . セレノプロテイン Ρの C末端側 1 0 3アミノ酸残基からなる配列又は当該アミノ酸配列のうち 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたァミノ酸配列又は前記レ、ずれかのァミノ酸配列の部分配列からなる、細胞死抑制活性を有するぺプチド断片又はべプチド断片群に対する抗体。

0 1 3 . 前記べプチド断片又はべプチド断片群が

式（I ) ：

Lys Arg Cys lie Asn Gin Leu Leu Cys Lys Leu Pro Thr Asp Ser Glu Leu Ala Pro Arg Ser Xaa Cys Cys His Cys Arg His Leu (配列番号 1 ) 及び/又は式（I I ) ：

5 Thr Gly Ser Ala lie Thr Xaa Gin Cys Lys Glu Asn Leu Pro Ser Leu Cys Ser

Xaa Gin Gly Leu Arg Ala Glu Glu Asn lie (配列番号 2 )

(式中、 Xaa はセレノシスティンを表す）で表されるアミノ酸配列もしくは当該アミノ酸配列の部分配列を有する、請求項 1 2記載の抗体。

1 4 . 前記ペプチド断片又はペプチド断片群が血漿蛋白質に由来するものである、請求項 12又は請求項 13に記載の抗体。

1 5. 前記ペプチド断片又はペプチド断片群が、（a)分子量分画膜に基づき 10 〜 30 k D aの分子量画分に回収され、（ b )ィオン交換樹脂への結合性の検討の結果、血中で pH 7から pH 8の間に等電点を示す構造と pH 8以上に等電点を示す構造を有し、（c)非還元系 SDS— PAGEでは分子量 13〜14 kDaの 2本のバンド及びそれらに糖鎖の付カ卩された 16〜1 7 kDaの 2本のバンドを示し、また（d)還元条件下での SDS— PAGEでは、前記バンドに加えて 3〜 4 kDa、 7〜9 0&及び10〜： L 2 k D aのバンドを呈することを特徴とする、請求項 12から請求項 14のいずれかに記載の抗体。