JPH04503155A

JPH04503155A - 中和配座エピトープを認識するｍ―ｃｓｆモノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH04503155A
Application number: JP2503081A
Authority: JP
Inventors: ハレンベック，ロバート，エフ．; コース，カーストン，イー．; リン，ジョゼフ，ダブリュ．
Original assignee: カイロン　コーポレイション
Priority date: 1989-02-10
Filing date: 1990-01-17
Publication date: 1992-06-11
Anticipated expiration: 2015-01-24
Also published as: US5491065A; EP0457804A1; ATE141290T1; EP0457804B1; WO1990009400A1; CA2008817C; DK0457804T3; ES2091816T3; JP3001969B2; CA2008817A1; DE69028095T2; DE69028095D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】中和配座エピトープを認識するＭ−Ｃ３Ｆモノクローナル抗体本発明は、一般に免疫学の分野に関し、特にマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−Ｃ３Ｆ）に対する抗体に関する。

更に詳しくは、本発明は、二量体Ｍ−Ｃ３Ｆと卓越的に関係づけられるが単量体Ｍ−Ｃ３Ｆとは関係づけられない見かけの配座エピトープに結合する、Ｍ−Ｃ３Ｆに対する中和モノクローナル抗体に関する。

過去１０年間に渡り、造血細胞の多細胞系分化に影響を与える幾つかのタンパク質が同定されている。それらのタンパク質は、卓越的に骨髄中に存する一組の共通の多分化能性幹細胞を、赤血球、好中球、好塩基球、好酸球、単球、血小板およびリンパ球へと分化させる。そのようなタンパク質は、半固形培地中での造血始原細胞のクローン増殖を支持する能力により最初に同定され、そして結果として造血コロニー刺激因子またはＣＳＦと呼称されている。

最も研究されているヒトおよびマウスの系において、Ｃ３Ｆは、それらが分化と増殖を増強するように見える細胞のタイプにより同定され特徴付けられている。

２つのＣ３Ｆは比較的系統特異的であり、それらが生産する細胞の名前がそれらに与えられている。例えば、顆粒球−ＣＳＦ　（ＣＩ、−Ｃ３Ｆ）はほとんど好中球性顆粒球を生み、そしてマクロファージ−Ｃ３Ｆ　（Ｍ−ＣＳＦ）は大部分マクロファージを生む。

それらの２つのＣ５Ｆとは対照的に、マルチ−Ｃ３Ｆ　（インターロイキン−３またはＩＬ−３としても知られる）は、多数の異なる細胞系統から成るコロニーを生成する。最後に、顆粒球−マクロファージ−Ｃ３Ｆ　（ＧＭ−Ｃ３Ｆ）は、好中球性顆粒球、マクロファージおよび好酸球並びに他の細胞タイプの生成に作用する。Ｇ−ＣＳＦとＭ−Ｃ３Ｆは、それぞれ顆粒球とマクロファージの生産に既に傾倒している一過性後期始原細胞の成長および増殖を招くと考えられる。対比して、ＧＭ−Ｃ３Ｆ）は、幾つかの異なる細胞タイプ；好中球、好酸球または単球に分化することができる造血中の初期に生産される始原細胞と相互作用すると思われる。同様に、ＩＬ−３に帰することができる活性の多様性は、比較的初期の多分化能性始原細胞から異なる系統の成熟造血細胞への細胞の成長を支持する能力の結果であると考えられる。

Ｃ３Ｆは重要な臨床用途を有すると思われるので、Ｃ３Ｆの起源を同定するため、およびＣ３Ｆがごく低レベルで存在し得る体液または細胞培養上清から該分子を精製する方法を開発するために、相当な努力が費やされている。従って、臨床研究に利用できるＣ３Ｆの量を増加させるために、様々なＣ３ＦをコードするＤＮＡ配列が同定され、適当な発現ビヒクル中にクローニングされ、そしてそれから生産される組換えタンパク質がそれらの物理的性質および生物活性に関して特徴付けられている。付随して、それらの単離および精製を容易にするための手段として使用することができ、その上療法および診断的用途を有する、種々のＣ３Ｆと反応する抗体が生産されており、また生産され続けている。

本発明の目的は、組換えと天然の両方のＭ−Ｃ３Ｆの二量体形と卓越的に結合するが単量体形とは結合しないモノクローナル抗体、および該モノクローナル抗体の利用方法を記載することである。

本発明の第二の目的は、Ｍ−Ｃ３Ｆの二量体形と関係づけられる見かけの配座エピトープに結合するモノクローナル抗体の記載であって、該エピトープは、該抗体の中和能により暴露された時、Ｍ−Ｃ３Ｆの生物活性の原因となる領域中または付近に存在し、そして生来のＭ−Ｃ３Ｆのアミノ酸４〜１５０の間に位置する。

本発明の第三の目的は、Ｍ−Ｃ３Ｆ分子の生物活性の原因となるＭ−Ｃ３Ｆの少なくとも１つのエピトープの同定であって、該エピトープは性質上立体配座的であり、そして二量体と関係づけられるが単量体Ｍ−Ｃ３Ｆとは関係づけられない。

本発明の第四の目的は、二量体Ｍ−Ｃ３Ｆ上に卓越的に存在するが単量体Ｍ−Ｃ３Ｆ上には存在しない見かけの配座エピトープと結合するモノクローナル抗体を使った対応する単量体Ｍ−Ｃ３Ｆからの二量体Ｍ−Ｃ３Ｆの再生および生物活性の回復をモニタリングする方法の記載である。

本発明の第五の目的は、活性なＭ−Ｃ３Ｆを、二量体Ｍ−Ｃ３Ｆと卓越的に結合するが単量体Ｍ−Ｃ３Ｆとは結合しないモノクローナル抗体と結合させることにより、実質的に活性なＭ−Ｃ３Ｆを実質的に不活性な形態の分子から分離する方法の記載である。

本発明の第六の目的は、実質的に活性な化学的に誘導化されたＭ−Ｃ３Ｆ分子を、二量体Ｍ−Ｃ３Ｆと卓越的に結合するが単量体Ｍ−Ｃ５Ｆとは結合しないモノクローナル抗体と結合させることにより、実質的に活性な誘導化Ｍ−Ｃ３Ｆを実質的に不活性な形態の分子から分離する方法の記載である。

本発明のそれらの目的と他の目的は、下記の発明の開示を読むことにより明らかになるであろう。

図１は、ヒトＭ−Ｃ３Ｆ　ｃＤＮＡ　α、βおよびＴの制限地図を示す、シグナル配列（白のボックス）、膜貫通領域（ＴＭ）　、βとＴクローンに共通の配列（縞のボックス）、およびβクローンに固有の配列（点のボックス）が示されている。

図２は、二量体γＭ−Ｃ３Ｆを検出するためにモノクローナル抗体３８２−５Ｈ４１Ａ８１Ｆ６を使った、再生反応中の様々な時点における再生７Ｍ−Ｃ３Ｆのクーマシー染色およびウェスタンプロットの結果を示す。

図３は、Ｍ−Ｃ３Ｆ二量体形成と生物活性との関係を示す。

本発明は、二量体Ｍ−Ｃ３Ｆに特異的な見かけの配座エビープを認識する中和モノクローナル抗体の産生に関するので、Ｍ−Ｃ３Ｆの定義が本出願人らの発明が何を包含するかの理解を容易にするであろう、コロニー刺激因子Ｍ−Ｃ３Ｆにより言及しようとするものは、特にＭｅｔｃａｌｆ、Ｄ、、　Ｊ、　Ｃｅ１１ハ脛豆しく１９７０）■＝８９の標準的な試験管内コロニー刺激アンセイに適用した時、Ｍ−Ｃ３Ｆに関連づけられる当業界で−ａに理解される生物活性のスペクトルを表すタンパク質である。このアッセイでは、Ｍ−Ｃ５Ｆは主にマクロファージコロニーの形成をもたらす。それらは幾分種特異的であるように見える。ヒ）Ｍ−Ｃ３Ｆはヒトとマウスの両方の骨髄細胞に作用し；マウスＭ−Ｃ３Ｆはヒト細胞には活性でない。

その上、最近Ｍ−Ｃ３Ｆの別の性質が認識され、それらの性質には、αまたはβ −インターフェロン、インターロイキン−２、インターロイキン−１、プロスタグランジンＥ群、および酸素還元生成物の分泌を刺激する該タンパク質の能力が含まれる。更に、Ｍ−Ｃ３Ｆは水庖性口内炎ウィルスによるウィルス感染に対するマクロファージの耐性も刺激し、そして成る条件下ではマクロファージの抗腫瘍活性を増強する。

それらの活性を招くメカニズムは現時点では解明されていないが、本発明の定義の目的上、定義の達成のための基準は、出発物質として適当な種からの骨髄細胞を使ってマクロファージコロニーの形成を刺激するＭ−Ｃ３Ｆの能力にある。

その生物活性により定義することに加えて、Ｍ−Ｃ３Ｆをその化学構造により幾分一般的な用語で定義することもできる。しかしながら、不運にも、天然に生産されるＭ−Ｃ３Ｆは科学文献の判読からはっきり明白でない０例えば、尿から精製したヒトＭ−ＣＳＦは、２５〜３５キロダルトンの見かけ分子量を有する本質的に同一の２つのサブユニットから成ると思われる。対比して、膵臓ガン細胞系ＭＩＡ　ＰａＣａ−２から精製したＭ−Ｃ３Ｆは、約２３キロダルトンの見かけ分子量を有する２つのサブユニットから成ると報告された。それらの相違は、グリコジル化の差によるか、または異なるＭ−Ｃ５Ｆタンパク質前駆体を生産する少なくとも２つの異なるようにスプライシングされるｍＲＮＡを生産する、Ｍ− Ｃ３Ｆをコードする共通の遺伝子が存在することが知られているため、Ｍ−Ｃ３Ｆ　ｍＲＮＡの異なるスプライシングの結果として生じるのかもしれない。大きい方の前駆体は、おそらく約２２３〜２２４アミノ酸を有する、３５〜４５キロダルトンのサブユニット分子量の二量体であると思われる７０〜９０キロダルトンの糖タンパク質のもとであると思われる。小さい方の前駆体は、同じく約２０〜２５キロダルトンのサブユニット分子量を有する二量体を含んで成り、そして約１４５〜１６０アミノ酸を有する４５〜５０キロダルトンの糖タンパク質を生じる。Ｍ−Ｃ３Ｆの構造的定義の範囲内において、多様な分子量の一組の関連タンパク質が存在することは明らかであろう、上記記載から、Ｍ−Ｃ３Ｆの定義が前記分子量を有するタンパク質に限定されないことも更に明らかであろう、Ｍ− Ｃ３Ｆをコードする複数のｍＲＮＡの存在を考慮すれば、上記で論じたものとは異なる分子量を有するタンパク質が発見されるだろうし、従ってＭ−Ｃ３Ｆの定義内に入ることは認識されよう。

Ｍ−Ｃ３Ｆの化学構造に関して、それの正確な構造が多数の他の要因に依存することは更に理解されるであろう。全てのタンパク質はイオン化できるアミノ基とカルボキシル基を含むので、もちろんＭ−Ｃ３Ｆが酸性もしくは塩基性塩の形態でまたは中性の形態で得ることができることは明らかである。更に、垢分子を使った誘導化（グリコジル化）、または例えば脂質、ホスフェート、アセチル基等によるＭ−Ｃ３Ｆへの共有結合またはイオン結合を含み、しばしばサツカライドとの会合を通して起こる他の化学的誘導化により、−次アミノ酸配列を増大できることは明らかである。それらの修飾は、試験管内または生体内で起こり得、後者は翻訳後プロセシング機構を通して宿主細胞により行われる。上記に定義されたようなタンパク質の活性が破壊されない限り、そのような修飾は、いかにして起こるかに関係なく、Ｍ−Ｃ３Ｆの定義内に含まれることは理解されるであろう。もちろん５０Ｍ−Ｃ３Ｆに対するそのような修飾が該分子の生物活性を定量的にまたは定性的に増加または減少させ得ることが予想され、そしてそのような化学修飾された分子もＭ−Ｃ３Ｆの定義内に含まれる。

本発明は、１）原核生物または真核生物からのＭ−Ｃ３Ｆ、好ましくは組換えＭ −Ｃ３Ｆの単離、２）Ｍ−Ｃ３Ｆによる適当な宿主動物の免疫処置、３）卓越的に二量体Ｍ−ＣＳＦを認識するが単量体Ｍ−Ｃ３Ｆを認識しないモノクローナル抗体の同定、４）単量体の存在下で二量体Ｍ　−ＣＳ　Ｆの形成についてアッセイするための、二量体ＭＣ５Ｆを認識するそれらのモノクローナル抗体の使用、および５）実質的に不活性な単量体形の分子からの生物活性二量体Ｍ−Ｃ３Ｆの分離、を包含する幾つかの観点から成る。

加えて、本発明の更なる観点としては、生物学的に活性な化学的に誘導化された二量体Ｍ−Ｃ３Ｆを不活性な単量体形の分子から分離する方法、並びに該モノクローナル抗体を使った二量体Ｍ−ＣＳＦの隔離を伴う療法的および診断的通用が挙げられる。

Ｍ−ＣＳＦは天然源から、またはＭ−Ｃ３ＦをコードするＤＮＡ配列を示すように操作されているＭ換え宿主細胞から、単離することができる。天然源からのＭ −Ｃ３ＦＯ単離に関して、５ｔａｎｌｅｙ＋Ｅ、Ｒ，ら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、（１９７７）　２５２：４３０５は、主にマクロファージ生産を刺激しそして約Ｉ　Ｘ　１０”単位／■の比活性を有するマウスＬ９２９細胞から得られたタンパク質の精製を記載している。Ｄａｓ、Ｓ、Ｊ、ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、（１９８２）−％■：　１３６７９は、ヒト尿Ｍ−Ｃ３Ｆが５Ｘ１．Ｏ’単位／■の比活性を有し、そしてマクロファージ細胞のみを生産させることを報告している。５ｔａｎｌｅｙ、Ｅ、Ｒ，およびＧｉ　１ｂｅｒｔ、　Ｌ、Ｊ、　＋Ｊｏ　ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　１ｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　（１９８１）　４２：２５３も低収量におけるＭ−Ｃ３Ｆの精製方法を記載している。Ｄａｓ、Ｓ、に、ら、Ｂｌｏｏｄ　（１９８１）　５８　：６３０は、ヒト尿Ｍ−Ｃ３Ｆの部分精製を記載している。　Ｍｕ、Ｎ、ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、（１９７９）　２５４：６２２６は、主にマクロファージの形成を刺激するＭ−Ｃ３Ｆの精製を記載している。より最近になって、出発材料としてｉｏ、ｏｏ。

２のヒト尿を使ってミリグラム量においてＭ−Ｃ３Ｆが精製されている。

上記参考文献に加えて、Ｍ−Ｃ３Ｆに起因する１または複数の性質を有するコロニー刺激因子の精製および生物活性を記載している多数の他の報告がある。ＭｏＬｏｙｏｓｈｉ、に、ら、足動Δ１　、（１９８２）　６０：１３７８は、正常なヒト尿から部分精製された物質のコロニー刺激活性を記載している。顆粒球とマクロファージの両方が生産される。Ｍｏｔｏｙｏｓｈｊ、Ｊ、ら、Ｂｌｏｏｄ（１９７８）Ｊ５：　１０１２は、正常ヒト血清から得られたコロニー刺激活性を有する物質の精製および性質を記載している。

５ｔａｎｌｅｙ、　Ｅ、Ｒ，ら、Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎ　（１９７５）　２２７２は顆粒球形成およびマクロファージ生産を調節するヒト尿からのコロニー刺激因子の部分精製を示し、一方Ｗａｎｇ、Ｆ、Ｆ、およびＧｏｌｄｗａｓｓｅｒ、Ｅ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｌ　ｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ（１９８３）　２１：２６３はマクロファージの生産に特異的であるＭ−Ｃ３Ｆ因子を精製する７段階法を記載している。最後に、Ｔａｋａｋｕ、　Ｆらの発明者による米国特許第４，３４２，８２８号は、ヒト末梢血から単離され培養された単球またはマクロファージから得ることができるコロニー刺激因子による、マクロファージからのヒト顆粒球の形成を示している。

Ｍ−ＣＳＦは、上記参考文献に記載された材料および方法を使って得ることができ、そしてＭ−Ｃ３Ｆの二量体形を認識するモノクローナル抗体を産生ずる免疫原として用いることができる。それらの参考文献はそのまま本明細書に組み込まれる。

Ｍ−Ｃ３Ｆは、クローニングされており、多数の宿主細胞中で発現されており、従って抗体を惹起せしめるための免疫原として組換えＭ−Ｃ３Ｆ　（ｒＭ−Ｃ３Ｆ）が利用可能である。実際、現在までに、本明細書中ではα、βおよびＴと呼称される３つの異なる長さを有するヒトｒＭ−Ｃ３Ｆ（ｈｒＭ−Ｃ３Ｆ）　ｃＤＮＡクローンが同定されている。それらは、単一のＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子を発現する細胞から単離されている。α、βおよびＴクローンは、それぞれ２２４．５２２および４３８アミノ酸を有するプロセシングされてないタンパク質をコードするＭ−Ｃ３Ｆ　ＤＮＡ配列を含む。種々のｃＤＮＡの制限地図を図１に示す。

それらのクローンによりコードされる組換えＭ−Ｃ３Ｆは活性形において発現されており、よってそれらの分子は適当なモノクローナル抗体を産生ずるのに使用することができる。

好ましいｒＭ−Ｃ３Ｆは、Ｅ、Ｋａｗａｓａｋｉらの発明の米国特許第４．８４７，２０１号において記載されたものである。原核生物と真核生物の両方におけるＭ−Ｃ３Ｆのα形の発現がその中に示されている。この特許明細書、並びにＭ −Ｃ３ＦのβおよびＴ形を示す上記の参考文献は、参考としてそのまま本明細書に組み込まれる。

ｒ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆは原核生物、例えば大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中では単量体形で生産されるが、生物活性については二量体の立体配座に依存する。よって、大腸菌生産物をモノクローナル抗体を惹起せしめるための免疫原として用いようとするならば、モノマーを結合させてＭ−Ｃ３Ｆの活性二量体形に再生することが好ましい。後述のようにしてｒＭ−Ｃ５Ｆ単量体を再生せしめることができる。

ｒＭ−Ｃ５Ｆは不溶性封入体として大腸菌から回収されるので、まず当業界で既知の技術を使ってまたは下記の方法を使って、封入体から単量体を精製する。最初に封入体を細胞破片から分離し、そして効果的な可溶化剤、例えば尿素中で可溶化することができる。更に、溶液は金属イオンキレート化剤および還元剤を含むこともできる。得られた溶液を清澄化し、そして当業界で既知の技術を使って、好ましくは可溶化剤、金属イオンキレート化剤および還元剤の存在下での高圧液体クロマトグラフィーにより単量体Ｍ−Ｃ３Ｆを精製する。単量体Ｍ−Ｃ５Ｆを含むクロマトグラフィー分画を同定し、そして必要であれば、約５．０　ｇａｇ／ｍｌの濃度に濃縮する。

Ｍ−Ｃ３Ｆを含む可溶化溶液を、約８．５のｐＨを有しそして適当な濃度の金属イオンキレート化剤を含む緩衝液中に、適当なタンパク質濃度、好ましくは０．２９〜０．７ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈することにより、単量体Ｍ−Ｃ３Ｆを再生せしめることができる。更に、好ましくは該溶液は、ｒＭ−ＣＳＦを再生せしめるのにかかる時間を短縮するために有効濃度の還元型および酸化型グルタチオンから成る再生式酸化／還元化学系を含む、より好ましくは、前記系は約２：１のモル比の還元型および酸化型グルタチオンから成るだろう、再生は数日間に渡って起こり、そしてアリコートを取り出し、未反応のＳＨ蟇を適当なブロンキング剤と反応させ、次いで適合性緩衝液を使って適当なりロフトグラフィー基質上で高圧液体クロマトグラフィー分析を行うことにより、再生の程度および完了をモニタリングすることができる。収量の低下にもかかわらず２３〜３７ °Ｃといった高温で再生が起こり得るけれども、好ましくは４°Ｃで再生が行われることに注目すべきである。

再生されたＭ　−ＣＳ　Ｆは、当業界で既知の様々な精製方法を使って精製することができるが、好ましくは、疎水的相互作用クロマトグラフィーが使用される。疎水性クロマトグラフィーを実施するための材料および方法は５ｈａｌ　ｊｌｅ＋　１９８４＋−捩封剋り山ロＩ陸註臆■、且虹６９により一般的に記載されている。Ｍ−Ｃ３Ｆを精製するのに使用することができる多数の疎水性クロマトグラフィー材料および固体支持体があることが認識されるだろう、好ましい疎水性クロマトグラフィー材料はＢｉｏ−Ｒａｄから入手できるＴＳＫ−フェニル− ５−Ｐ−である。

再生Ｍ−Ｃ３Ｆの純度および収量は、当業界で既知の方法、例えば還元および非還元型ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高圧液体クロマトグラフィーにより、測定することができる。

原核生物、特に大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で生産されたＭ−Ｃ３Ｆは内毒素を含むことに注意することは価値があり、内毒素は選択した精製操作により除去され得るが、そうでなければ、Ｍ−Ｃ３Ｆの活性を研究するのに使用することができるバイオアッセイに不利に影響し得る。この点で、上記の精製方法は、内毒素濃度をＭ−Ｃ３Ｆ１ｍｇあたり内毒素的０．２５　ｎｇに容易に減少させる。

様々な種からのリンパ球を用いて二量体Ｍ−Ｃ３Ｆに対するモノクローナル抗体を産生せしめることができる。しかし好ましくは、マウスまたはヒトのリンパ球が使用される。

マウスミエローマ細胞と免疫処置された牌細胞とを融合し、融合したハイブリッドを単離し、そしてモノクローナル抗体を分泌するものを同定することにより、Ｍ−Ｃ３Ｆに対するモノクローナル抗体を産生ずるマウスハイプリドーマを作製することができる。再生されたβもしくはＴ形または天然のＭ−Ｃ３Ｆもまた抗体を誘導するであろうことが予想されるけれども、好ましくは、Ｍ−Ｃ３Ｆα　ｃＤＮＡクローンによりコードされる再生二量体Ｍ−Ｃ３Ｆでマウスを免疫処置する。マウスを免疫処置するために、種々の区別可能な免疫処置プロトコルを使用することができる。例えば、−次免疫処置に次いで１または複数回の追加免疫処置で、マウスを静脈内または腹腔内的に免疫処置することができる。あるいは、リンパ球を試験管内で免疫処置することができる。マウスが免疫処置されれば、正確な免疫処置スケジュールは一般に重要でなく、使用する方法の決定因子は、下記に記載のＭＣ３Ｆ結合アッセイにより測定した時のマウス血清中の抗Ｍ− Ｃ３Ｆ抗体の存在である。

血清陽性動物から肺臓を取り出し、その中の牌細胞を用いて、適当なミエローマ細胞系との融合によりハイブリドーマを調製する。融合は、標準法、例えばＫｏｈ　ｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ。

１９７５、勤山ＬＬ具ｙ溢飢）、韮：４９５−４９７により記載された方法により達成される。この方法に対する変法が知られており、当業界で実施されている０種々の適当なミエローマ系がアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から入手可能である。融合技術は、適当な融合剤（ｆｕｓｉｏｎｇｅｎ）　、好ましくはポリエチレングリコールを使ってミエローマ細胞とマウス牌細胞とを融合せしめることを含む、融合後、融合媒質から細胞を分離し、そしてハイブリッド形成していない親細胞を致死させるために選択増殖培地、例えばＨＡまたはＨＡＴ培地中で増殖させる。

次に、多数の常用のイムノアッセイ方法のいずれか１つ（例えばラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイまたは蛍光イムノアッセイ）を使って、免疫化剤、即ち抗原としてＭ−Ｃ３Ｆを使って、抗Ｍ−Ｃ３Ｆ結合についてハイプリドーマ上清をアッセイする。Ｍ−Ｃ３Ｆに結合する抗体を分泌する陽性クローンを更に特徴付け、それらが卓越的に二量体Ｍ−ＣＳＦを認識しそしてその単量体を認識しないかどうかを決定する。

単量体に対してＭ−Ｃ３Ｆ二量体への抗体結合を区別する様々なそういったアッセイが利用可能であり、当業者に既知である。１つのそのようなアッセイはウェスタンプロットであり、この場合、Ｍ−Ｃ３Ｆを還元または非還元条件下でドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、そしてＢｕｒｎｅｔｔｅ＋　１９８１．　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｗ、。

１１２：１９５に記載されたようにしてプロットを調製し、探索する。ウェスタンプロットをブロックし、洗浄し、好ましくは１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１χウシ血清アルブミン（ｗ／ｖ）および０．１χオボアルブミン（ｗ／ｖ）を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，４）中で探索する。加えて、好ましくは洗浄剤、例えば約０．１χの濃度のＴｗｅｅｎ　２０が使用される。好ましくは、まずハイブリドーマ培養上清、またはＭ−Ｃ３Ｆ抗体を含む希釈腹水を甫ｂｓＹプロットを探索し、洗浄し、そして約３０〜６０分間１２ＳＩ−プロティンＡを使って抗体結合を暴露する。ブロフトを洗浄し、Ｘ線フィルムを使ってオートラジオグラフィーにかける。非還元Ｍ−Ｃ３Ｆが放射能標識され且つ還元Ｍ−Ｃ３Ｆが放射能標識されないことにより、二量体Ｍ−Ｃ３Ｆを認識するそれらのハイブリドーマからモノクローナル抗体を同定する。

Ｍ−Ｃ３Ｆ二量体を認識する抗体を分泌するヒトハイブリドーマも確立させることができる。これは、好ましくは、Ｍ−Ｃ３Ｆに対して免疫処置された個体からの牌細胞を、適当なヒトリンパ芽球細胞融合相手と融合させることにより行われる。後者の融合相手の例は、１９８６年３月１２日に公開されたヨーロッパ特許公開１７４，２０４号に記載されている細胞系ＦＢ３６である。あるいは、融合相手としての牌細胞の代わりに、ヒト末梢血抗体産生リンパ球を使用してもよい。末梢血液細胞の免疫処置は、Ｂｏｓｓにより町匹担溢り旦り呈μ刀駐士Ｕ工第１２１巻。

パートｒおよびＥＰＡ　８６１０６７９１．６に記載されたようにして試験管内で行うことができる。Ｍ−Ｃ３Ｆ二量体を認識するヒトモノクローナル抗体を同定するために使用した融合方法およびスクリーニング方法は、マウスハイブリドーマの生産および選択に使用するものと本質的に同じである。

適当なマウスまたはヒトＭ−Ｃ３Ｆモノクローナル抗体を獲得しそして同定する方法の実例となる上記方法は、単に採択することができる多数のそのようなアプローチの代表であることは当業者により理解されるであろう。例えば、Ｍ−Ｃ３Ｆ二量体に対する抗体を分泌する抗Ｍ−Ｃ３Ｆ抗体産生細胞系を形成せしめる別法は、抗体産生細胞の形質転換によるものである。それらおよび他の方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｒシｍ工第１２エ巻、バートＩに示されている。特に、マウスまたはヒトモノクローナル抗体を生産するのに使用することができる試験管内免疫処置方法を注目のこと（Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ　ｆｏｒ　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　Ｃｅ１ｌｓ、　１Ｂ−３２，１４０−１，７４頁）。この刊行物は参考としてそのまま組み込まれる。

本発明のモノクローナル抗体は多数の利用性を有する。例えば、単量体Ｍ−Ｃ３Ｆから、および該分子の不適当な再生または化学的誘導化から生じた実質的な生物活性を失ってしまった二量体分子から、生物活性二量体Ｍ−Ｃ３Ｆｔ分離するために用いることができる。それらの場合のモノクローナル抗体の好ましい応用は、免疫アフィニティーカラム方式においてそれを使用することである。

本明細書中に記載されるモノクローナル抗体は生物活性二量体Ｍ−Ｃ３Ｆ上の配座エピトープに結合するため、該抗体は生物学的に不活性なまたは実質的に不活性な二量体Ｍ−Ｃ３Ｆへの適切な結合を欠くだろう。ただし、活性の損失は前記エピトープの変化に起因する。よって、化学的誘導化に関しては、該抗体は誘導化された不活性の分子から、化学的に誘導化された活性二量体Ｍ−Ｃ３Ｆ分子を分離するために最も有用であろう。もちろん、特に様々な目的で科学者により使用される多数の試薬を使ってＭ−Ｃ３Ｆを誘導化し得ることは注目に値すると当業者により理解されるであろう。誘導化反応は特にＭ−Ｃ３Ｆへの水溶性ポリマーの接合である。

好ましくは、水溶性ポリマーはポリエチレングリコール、または機能的に関連する分子、例えばポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールである。そのような水溶性ポリマーによるＭ−Ｃ３Ｆの誘導化は、生体内半減期を増加させ、その免疫原性を減少させ、そしてタンパク質の凝集を減少または削除し、更に生体内に導入した時に起こり得る免疫原性および凝集を減少させることができる。記載したような水溶性ポリマーによるＭ−Ｃ３Ｆの誘導化は、５ｈａｋｅｄらの米国特許第４゜８４７、３２５号に与えられている。

次の実施例は本発明を実施することができる種々の方法の例示である。しかしながら、特定の材料および方法を示すそのような例の提示が本発明を制限すると解釈してはならないことは当業者により理解されるだろう。

皇五医ＩＣ３Ｆ−１の二量体α−クローンＭ−Ｃ３Ｆに対してマウスモノローナル抗体を生起させた。

米国特許第８，８４７，２０１号に記載されたようにして、該分子を生産し、再生し、そして精製した。簡単に言えば、Ｍ−Ｃ５Ｆのα−クローンを含むプラスミドを用いて大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）を形質転換せしめ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む６ｄ！の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，５中に該大腸菌を８４のＯＤ６．。

に懸濁しそして超音波処理により細胞を溶解させることにより、大腸菌細胞ペーストを調製した。溶解物を遠心し、得られたペレントを１０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む２．５　ｍの３０％シａＪＲ，ｐＨ８゜０中に再懸濁した。このシｇｍ溶液を１０．０００　Ｘ　ｇにおいて１５分間遠心することによりＭ−ＣＳＦを含む封入体を回収し、そして１　ｄ　ＥＤＴＡおよび１０１１Ｍ　ＤＴＴを含む８Ｍ尿素、５０＋ａＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，５中に室温で３０分間可溶化した。可溶化Ｍ−Ｃ３Ｆを含むこの溶液を、１０，０００Ｘｇで１０分間の更なる遠心分離段階および０．４５ミクロンのフィルターを通した濾過により、清澄化した。最後に、予め８Ｍ尿素、　０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、　１ｍＭ　ＤＴＴおよび１ｍＭ　ＥＤＴＡで平衡化されたＢｌｏ−５ｉｌ＠ＴＳＫ−２５０カラム（２１，５Ｘ　６００　ｗａ　）上でのサイズ排除高圧液体クロマトグラフィーによりＭ−Ｃ３Ｆモノマーを精製した。

単量体Ｍ−Ｃ３Ｆは検出された主要タンパク質ピークに相当し、そしてこのピークを含む分画をプールし、Ｙト１０膜を使ってＡｍ１ｃｏｎ攪拌セルを用いて５．０ｍｇ／ｄに濃縮した。

上述のようにして単離したＭ−Ｃ３Ｆ単量体を次のようにして再生した。　５ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｏ＋Ｍ還元型グルタチオンおよび１ＢＭ酸化型グルタチオンを含む予め冷却された５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ〜）ＩＣＩ、ｐＨ８，５緩衝液に０．３または０．７ｍｇ／ｄのタンパク質濃度に単量体を希釈した。この混合物を４　 ’Ｃで４日間インキュベートし、単量体から二量体Ｍ−Ｃ３Ｆへ最大再生せしめた。再生反応は、混合物からアリコートを取り出し、未反応のスルフヒドリル基をヨードアセトアミド（５ｋＭ濃度）でブロックし、−７０”Ｃで試料を凍結し、そして解凍した試料を、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（Ｖａｒｉａｎ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓから入手可能）を使ったサイズ排除高圧液体クロマトグラフィー分析にかけた。

前記カラムは、１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６，８で予め緩衝化された。

再生期間の終わりに、Ｍ−Ｃ３Ｆを０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，０に対して４℃で１８時間透析し、残余のグルタチオンを除去した。次に、再生混合物に硫酸アンモニウムを１．２Ｍの濃度に添加し、溶液のｐＨを７．０に調整し、そして１．２Ｍ硫酸アンモニウム、　０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐ）Ｉ　７．０で予め平衡化された脱発熱物１ｊＢｉｏ−Ｒａｄ　ＴＳＫ−フェニル −５−ＰＷカラム（７，５Ｘ　７５ａｕｗ）上に混合物を負荷した。最後に、硫酸アンモニウムを減少させそしてエチレングリコールを増加させる４５分間の交差勾配により、Ｍ−Ｃ３Ｆをカラムから溶出させた（溶液Ｂ−３０％エチレングリコール、　０．１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，０）。最後に、精製Ｍ−Ｃ３Ｆを含む分画をプールし、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ＩＩＩＭ塩化ナトリウム、　ｐａｌ　７．４を含む１％マンニトール中で透析し、濾過滅菌し、そしてマウスを免疫処置するのに使用するといった時点まで保存した。

Ｍ−Ｃ３Ｆ調製物中に存在する内毒素を削除または削減するために、発熱物質除去された水とガラス製品を使って全ての緩衝液を調製した。

！廉五ｌ几上記の再生ｒＭ−Ｃ３Ｆを用いてＢａ１ｂ／ｃマウスを免疫処置した。免疫処置は、完全フロインドアジュバント中の４０μｇのｒＭ−Ｃ３Ｆによる腹腔内−次免疫処置に次いで、各々２０μｇのＭ−Ｃ３Ｆから成る完全フロインドアジュバント無しの２回の腹腔内注射から成った。２０μｇから成る１回目の免疫処置は一次免疫処置の約３週間後に投与し、２回目の２０μｇのブースター注射はその約１週間後に投与した。２回目の２０ｇｇのブースター注射から約５．５週間後、１０μｇのＭ−Ｃ３Ｆを静脈内に投与することから成る最終免疫処置を行った。

３日後、免疫処置マウスからｌｐＨｌ１ｉを取り出し、肺細胞をマウスミエローマ細胞系と融合させた。

下記の融合操作は、Ｋｏｈｌｅｒ　＆　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５．　Ｎａｔｕｒｅ。

１４９５により記載され、Ｆｅｎｄｌｙらｒ　−ｂ上もｊ！組、６：３５９　（１９８７）により変更されたものである。簡単に言えば、マウスを犠牲にし、免疫処置されたｎ臓がら肺細胞をかき裂き、そして無血清ダルベツコ改良イーグル培地中で洗浄した。同様に、ＳＰ”１０Ａｇ１４　ミエローマ細胞を洗浄し、そして５：１の肺細胞対ミエローマ細胞比において肺細胞と混合した。この細胞混合物をペレット化し、培地を除去し、室温で６０秒間に渡る滴下添加によりポリエチレングリコール１５００の４０％（ν／ｖ）溶液１．０　ｄを添加し、次いで３７℃で６０秒間インキュベートすることにより融合を行った。！１やかに攪拌しながら細胞懸濁液に９ｉｄのダルベツコ改良イーグル培地を５分間に渡り添加した。混合物中の細胞凝集塊を穏やかに再懸濁し、細胞を洗浄して残余のＰＥＧを除去し、そして２０％ウシ胎児血清が補足されたダルベツコ改良イーグル培地中に約２　Ｘ　１０’細胞／ウエルに播種した。２４時間後、細胞にヒボキサンチンとアザセリン選択培地の２×溶液を供給した。細胞を全部で１５．５枚のミクロタイタープレート（これは１４８８ウエルに相当する）に播種した０次いで、約２．４週間後、６８４ウエルが良好な細胞増殖を示し、それらをＭ−Ｃ３Ｆに対する抗体についてスクリーニングした。

実蓋班ｌ汎生挫且立ハイブリドーマ上清を、最初に免疫沈降アッセイを使ってＭ−Ｃ３Ｆに対する抗体の産生についてスクリーニングし、続いてウェスタンプロットアッセイを使って再スクリーニングし、それらが分子の単量体および／または二量体形のいずれを認識するかを決定した。最初のスクリーニングは、５０μｌのハイブリドーマ培養上清を約１０’ＣＰＭ／ウェルの１．ｓ　ｌ　−標識大腸菌再生Ｍ−Ｃ３Ｆと室温で約１時間混合することから成った０次いで、二次抗体、即ち免疫ビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に接合したウサギ抗マウス抗体をウェルに添加し、更に１時間インキュベートした。この時間は、培養上清中に存在し得るマウス抗体への該ウサギ抗体の効率的な結合を可能にする。

次に、未結合の”’ｒ　Ｍ−ＣＳＦを遠心により除去し、次いで結合した抗Ｍ− Ｃ３Ｆ抗体を含む免疫ビーズを洗浄した。

ビーズを３回洗浄し、該ビーズを含むウェルを切り取り、そしてＴ−カウンターを使ってカウントした。陽性のハイブリドーマ細胞増殖を示す６８４個のウェルから、３個のみが大腸菌Ｍ−Ｃ３Ｆに対する抗体を分泌するハイブリッドを生した。

それらのハイブリドーマを３８２〜５１（４，３８２−３Ｆ１および３８２−４８５と命名した。３Ｂ２−５Ｈ４をサブクローニングし、得られたサブクローンを３８２−５Ｈ４１Ａ８１Ｆ６と命名し、更なる研究に用いた。

３８２−３Ｆ１および３８２−４Ｂ５は、低い力価の抗体を産生ずるため、広範には特徴付けなかった。

ウェスタンプロット技術を使って再生ｒＭ−Ｃ３Ｆに関して３８２−５）１４１４８１Ｆ６のエピトープ特異性を評価し、それがＦＭ−ＣＳＦの単量体、二量体またはその両方のいずれに結合するかを決定した。胃性材料のアリコートを再生反応中の様々な時点で取り出し、還元しく試料を煮沸しながら１０ｍＭ　ＤＴＴで）そして５０＋ｏＭヨードアセトアミドでブロックするか、または還元せずにブロックし、次いでＬａｅｎｎ＋ｌｉ、１９７０．　Ｎａｔｕｒｅ＋皿６８０により記載されたようにして電気泳動した。電気泳動は１０％ゲルを使って行った。その後に行ったプロッティング法は、Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、　１９８１．＾ｎａ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、１１２　：１９５により記載されている。還元および非還元型の両方のＭ−ＣＳＦをニトロセルロース上にブロッティングし、モノクローナル抗体で探索し、そして＋２Ｊ−プロティンＡで暴露した０図ＩＢはオートラジオグラフィーの結果を示し、図ＩＡは対応するクーマシーブルー染色図を示す。レーン１−１０と１３の試料は非還元／ブロック条件下で泳動した。レーン１２と１３の試料は還元／ブロックであった。レーンｌは、反応の０時、即ち再生の開始直後に採取した０、３　＋ｗｇ／ｍｌの再生反応液からのＭ− Ｃ３Ｆのアリコートを示す、レーン２〜８は、それぞれ１５分、６０分、　３，６．１７．２５および９６時間の時点で採取した再生資料を示す。レーン９は、９６時間の時点における０、７　ｍｇ／ｍｌ（７）Ｍ−Ｃ３Ｆの再生を示す、レーンＩＯおよび１１は、フェニル−ＨＰＬＣ精製後の再生Ｍ−Ｃ３Ｆタンパク質を示す。図面から、二量体Ｍ−Ｃ５Ｆについて予想される分子量の所でのレーン４〜８に存在するタンパク質の標識により示されるように、モノクローナル抗体（３８２−５）１４１Ａ８１Ｆ６）が非還元の、即ち二量体のＭ−Ｃ３Ｆと反応することは明らかである。かなりの量の単量体を含むレーン１〜６においてＭ− Ｃ３Ｆ単量体の標識が無いことにより示されるように、該抗体がＭ−Ｃ３Ｆ分子の二量体形とは実質的に反応しないことも更に明白である。

未変性のＳＥＣニー）ＩＰＬｃにより解離された各種の面積を測定することにより、Ｍ−Ｃ３Ｆ単量体から二量体への変換を定量した０図３は、Ｍ−Ｃ３Ｆの生物活性が該分子の単量体から二量体への再生と互いに関係があることを示す。Ｍ −Ｃ３Ｆ活性は、上記に記載の単球Ｍ−Ｃ３Ｆ依存性細胞系増殖アッセイを使って測定した。

第二のアッセイは、３８２−５Ｈ４１Ａ８１Ｆ６が二量体Ｍ−Ｃ３Ｆに結合するが単量体には結合しないことを証明するために実施した。このアッセイは次の免疫沈降実験を行うことから成った。実施例■の再生反応中に採取した試料の１６ μ！アリコート（上述のようにしてヨードアセトアミドでブロックした）を、リン酸塩緩衝化塩溶液（ＰＢＳ）中の３８２−５１（４１Ａ８１Ｆ６モノクローナル抗体１０μｌと混合し、そして４°Ｃで一晩維持した。各試料にプロティンＡ −セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の５０％スラリーを２０μｆｆ添加し、４°Ｃで２時間維持し、次いでＰＢＳで２回洗浄し、遠心した。ヨードアセトアミドを含む５ＤＳ−試料緩衝液中で貧沸することによりＭ−Ｃ３Ｆタンパク質をビーズから溶出させ、次いで５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析とクーマシーブルー染色にかけた。再生試料を免疫沈降せしめるのに、正の対照として、Ｍ−Ｃ３Ｆの二量体形と単量体形の両方を検出するＭ−Ｃ３Ｆに対するポリクローナル抗体（米国特許第４．８４７，３２５号に記載）も使用した。部分的に折りたたまれた単量体形のＭ−Ｃ３Ｆはモノクローナル抗体により再生反応液から全く沈降されず、二量体形のみが検出された。対照抗体は、予想通りそれらの再生試料からＭ−ＣＳＦの単量体形と二量体形の両方を沈降させた。

それらの結果は、モノクローナル抗体３８２−５）１４１Ａ８１Ｆ６が溶液中のＭ−Ｃ３Ｆの二量体形にのみ特異的であることを証明する。

当業者に既知の標準技術を使って３Ｂ２−５Ｈ４１Ａ８１Ｆ６をイソタイプ決定すると、ＩｇＧ１クラスであると決定された。

ｌ星勇ヱ生胆孟血Ｍ−Ｃ５Ｆの生物活性を中和する３８２−５Ｈ４１Ａ８１Ｆ６の能力を測定した。アッセイはマウス単球細胞系のＭ−Ｃ３Ｆ刺激細胞増殖の阻害に基づく。Ｍ− ＮＦＳ−６０はマウスレトロウィルスで形質転換された骨髄性白血病細胞系であり、Ｍ−Ｃ３Ｆ中での増殖について最初に選択されそしてＮ５Ｆ−６０（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら。

１９８６、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ、　８３：５０１０により記載された細胞系）由来である。Ｍ−ＮＦＳ−６０は寄託番号１０５２３でＣｅｔｕｓ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎに寄託されている。

ウシ胎児血清を含まないが１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．０５ｍＭ　２−メルカプトエタノール、２ｍＭグルタミンを含み、そして約１　、０００マウス骨髄コロニ一形成単位／　ｍＲのＭ−Ｃ３Ｆを含むかまたは含まないＲＰＭＩ　１６４０培地中でアッセイを行った。Ｍ−Ｃ３Ｆは組換えヒトＭ−Ｃ３Ｆであることもでき、またはマウスＭ−Ｃ３Ｆを含む細胞順化培地を用いることもできる。

生来のまたは組換えＭ−ＣＳＦに対する３８２−５Ｈ４１Ａ８１Ｆ６の中和抗体価を測定するために、次のアッセイを行った。上述のようにして大腸菌もしくはＣＨＯ細胞において生産された組換えＭ−Ｃ３Ｆ、またはＭＩＡ　ＰａＣａ細胞からの生来のＭ−Ｃ３Ｆ（部分精製したもの）を、組織培養培地に約４０００Ｕ／−の最終濃度に希釈した。各々のＭ−Ｃ３Ｆを組織培養培地中に約２００００／−の最終濃度に１７２希釈した。３８２−５Ｈ４１Ａ８１Ｆ６の腹水調製物の１／１００希釈液を組織培養培地中に調製した。この希釈抗体１５０μ２を４０００Ｕ／ａｄのＭ−Ｃ３Ｆ原液１５０μ尼と混合し、各タイプのＭ−Ｃ３Ｆを別々にアッセイした。それらの試料の各々を渦動攪拌し、次いで１５０μ２を捨て、そして対応する２０００Ｌｌ／ｄのＭ−Ｃ３Ｆ溶！１５０μｆを添加した。

この段階を更に６回繰り返した。こうして、１／２００〜１１５１２００の希釈範囲に渡り一定量の組換えまたは生来のＭ−Ｃ３Ｆ中でモノクローナル抗体を連続希釈した。それらの試料を一晩４°Ｃに維持し、次いでＭ−ＮＦＳ−６０細胞増殖活性を刺激することができるＭ−Ｃ３Ｆについて試験した。５０μｌの適当な抗体／Ｍ−Ｃ３Ｆ希釈液に、５０μ！のアッセイ媒質と５０μＥの約５　ＸＩＯ３細胞を添加した。次いでこの混合物をミクロタイター組織培養ウェルに添加し、そして５％ｃｏｚ／９５％空気の雰囲気中で３７°Ｃにて４８時間細胞をインキュベートした。

４８時間のインキュベーション期間の後、３−　（４，５−ジメチルチアゾール −２−イル）−２，５−ビフェニルテトラゾリウムプロミド（ＭＴＴ）を使って細胞数を評価した。リン酸塩緩衝化塩溶液中５　ｍｇ／ｌ１ｌｌの濃度においてＭＴＴの原液を作製し、使用前に０．２μのフィルターを通して濾過し、そして遮光箱中で４°Ｃで保存した。ＭＴＴ溶液を３７°Ｃに温め、ミクロタイタープレートをミクロプレート振盪器上で毎分７００回転において３〜５分間振盪した後にウェルあたり２５μ２を添加した。再び５％ＣＯ□７９５％空気の雰囲気中で３７°Ｃにて３時間インキュベートし、次いでプレートをインキュベーターから取り出し、それらをミクロプレート振盪器上で毎分７００回転において３〜５分間攪拌し、そして水中２０％ドデシル硫酸ナトリウム（重量／容量）から成るＭＴＴ可溶化溶液１００μ２を添加した。ウェルを混合し、そして室温で数時間静置した後、ＯＤ２．。７．を測定した。

それらの結果から、Ｍ−Ｃ３Ｆで刺激されたＭ−ｉＳ−６０細胞増殖活性を阻害するモノクローナル抗体の能力が決定され、そしてこのモノクローナル抗体の腹水調製物の中和抗体価が決定された。　３８２−５Ｈ４１Ａ８１Ｆ６　？ＩＡｂは、試験した３つの形態のＭ−Ｃ３Ｆの全てに対して本質的に同等の中和抗体価を示し、腹水１ｉあたり約４　Ｘ　１０’中和単位の力価を有した。

第二のアッセイを用いて、マウス骨髄コロニー形成を阻害する能力に基づいて抗体の中和活性を評価することができる。

それはＭｅｔｃａｌｆ、Ｊ、、　１９７０．　Ｃｅ１ｌヱＭ旺虹、　、　７６　：　８９により記載されている。

どのアッセイを行うかに関係なく、旧Ａ　ＰａＣａ−２細胞上清から精製されたＭ−Ｃ３Ｆを使って、Ｍ−Ｃ３Ｆ活性を標準化することができる。マウス骨髄コロニー形成アッセイにおいてそれの活性を繰り返し測定することにより、ＭＩＡ　ＰａＣａ−２標準を定量した。　ＭＩＡ　ＰａＣａ−２はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシボン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）受入番号ＣＲＬ１４０から入手可能である膵臓ガン細胞系であり、Ｂｏｏｓｔｍａｎ　ら＋　１９８７．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、ユｅｓ、　Ｃｏｍ、、　１４１ニア４により記載されたようにして培養上清からＭ−Ｃ３Ｆを単離することができる。

１施１五滋ｍ庄哺乳動物細胞中で生産されたｒＭ−Ｃ３Ｆと交差反応する３８２−５Ｈ４１４８１Ｆ６の能力を測定した。２つの哺乳動物発現系を使った。Ｍ−ＣＳＦをＣＯＳ細胞、より詳しくは、Ｗｅａｖｅｒら、　１９８８．　Ｂｉｏ、　Ｔｅｃｈ、、　鉦２８７により記載されたＣ　Ｖ　−’　１細胞中で発現させた。この系では、ｒＭ−Ｃ５ＦをコードするαＭ−Ｃ３Ｆ　ｃＤＮＡクローンは、ＣＶ−１細胞中に安定して組み込まれるプラスミドｐＣＳＦ−１７（米国特許第４　、８４７　。

２０１号に記ｉり中に存在する。ＣＶ−１細胞にＳＶ４０のＴ抗原が提供されると、この系でｒＭ−Ｃ３Ｆが発現される。

Ｔ抗原はｐＣ５Ｆ−１７の複製および発現に影響を及ぼし、プラスミドのコピー数の一時的上昇および付随してｒＭ−Ｃ５Ｆの発現の増加を引き起こす。標準法を使って細胞培養培地からｒＭ−Ｃ３Ｆを単離した。

Ｍ−Ｃ３Ｆを第二の哺乳動物系、即ち−ｏｎｇら、ト江匹ｈ１５０４頁、第２３５巻（１９８７）により記載されたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞においても発現させた。

この系では、Ｍ−Ｃ３Ｆ　ｃＤＮＡクローンによりコードされる全長Ｍ−Ｃ３Ｆが発現される。細胞を標準細胞培養培地中で増殖させ、その中に分泌されたＭ− Ｃ３Ｆを次のようにして精製する。まず、細胞培養上清を透析し、Ｚｅｔａ　ｐｒｅｐアニオン交換カラムに通用し、次いでＢｉｏ−Ｒａｄ　ＴＳＫ　ＤＥＡＥ −５−ＰＷカラム（２１，５Ｘ１５０　ｍｍ）を使ったＤＥＡＥ−ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより精製した。３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ８，５においてタンパク質を該カラムに負荷し、そして４５分間のＯ〜０．６Ｍ塩化ナトリウム勾配を用いて溶出せしめた。Ｍ−ＣＳＦに冨む分画を同定し、プールし、そして硫酸アンモニウムを１．２Ｍに添加した。溶液の最終ｐＨは７．０であった。疎水的相互作用クロマトグラフィーを使ってこの材料を精製し、大腸菌産生Ｍ−Ｃ３Ｆについて実施例■に記載したようにして配合した。図ＩＡのレーン１３と１４は精製したＣＨＯＭ−Ｃ３Ｆを示す。

ＣＶ−１／５Ｖ−４０またはＣＨＯ中で生産されたｒＭ−Ｃ３Ｆを中和する３Ｂ２−５Ｈ４１Ａ８１Ｆ６の能力を、前の実施例に記載のようにして単核細胞アッセイを使って測定した。データは、３８２−５８４１Ａ８１Ｆ６が両方の系においてＭ−Ｃ３Ｆ活性を完全に中和したことを示した。

３８２−５Ｈ４１Ａ８１Ｆ６抗体の追加の活性を説明するために更なる研究を行った。哺乳動物によって発現されたＭ−Ｃ３Ｆを沈澱させる該モノクローナル抗体の能力を測定した。実施例Ｉに記載の免疫沈降技術を使って、３８２−５Ｈ４１Ａ８１Ｆ６がＣＶ−１細胞中で生産されたＭ−Ｃ３Ｆを沈澱させることが確かめられた。

スｌ江■ 悸　Ｍ−Ｃ３Ｆの」本発明のモノクローナル抗体が、単量体Ｍ−Ｃ３Ｆから、または誘導化工程から生ずる不適切に折りたたまれた不活性な形態の分子から、事実上全ての生物学的に活性の化学的に誘導化された二量体Ｍ−Ｃ３Ｆを分離するために使用できることは認識されるだろう、この応用の好ましいＭ様は、ＰＥＧが結合しているかまたは結合していない単量体Ｍ−Ｃ３Ｆを含む反応混合物中に存在する他の種のＭ −Ｃ３Ｆ、および生物学的に不活性なＰＥＧ化された（ｐｅｇｙｌａ　ｔｅｄ）二量体Ｍ−Ｃ３Ｆから、生物学的に活性なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導化Ｍ−Ｃ３Ｆ、即ちＰＥＧ化ＭｆｃｓＦを分離することである。

Ｍ−Ｃ３Ｆは、米国特許第４，８４７，３２５号に記載のようにしてＰＥＧ化することができる。反応は、Ｍ−Ｃ３ＦＩ分子あたりｌまたは複数のＰＥ０分子が結合するような条件下で行うことができる（即ちＭ−Ｃ３Ｆ　ＰＥＧ　１マー、２マー等）好ましくはＭ−Ｃ３ＦＩモルあたり１モルのＰＥＧが結合されるだろう。この場合、ＰＥＧ化された活性Ｍ−Ｃ３Ｆを他の反応体から分離するのに一段階法において該抗体を用いることができる。というのは、抗体結合を目当てに競争する非ＰＥＧ化Ｍ−Ｃ３Ｆがほとんど存在しないからである。

反応混合物は、上記実施例に記載したような５Ｈ４１Ａ８１Ｆ６免疫アフイニテイーカラムを使ってクロマトグラフィー精製することができる。あるいは、ＰＥＧ化Ｍ−Ｃ３Ｆをまず精製して実質的に均質な１マーの調製物を得、そしてこの調製物を本モノクローナル抗体を使った免疫アフィニティークロマトグラフィーにかけ、生物学的に活性な二量体１マーの富化集団を生成せしめてもよい。

今まで本発明を実施例により幾分詳細に記載してきたが、実施例において示したものに関して様々な変更および改良を行うことができ、そして本特許請求の範囲が添付の請求の範囲による以外に限定されると解釈してはならないことは当業者に明らかであろう。

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Claims

【特許請求の範囲】

１．ａ）二量体Ｍ−ＣＳＦと卓越的に反応し；ｂ）単量体Ｍ−ＣＳＦとは実質上反応せず；そしてｃ）Ｍ−ＣＳＦの生物活性を中和する、モノクローナル抗体。
２．前記抗体がｃＤＮＡα，βまたはγＭ−ＣＳＦクローンによりコードされるＭ−ＣＳＦと結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
３．前記抗体がマウスまたはヒトモノクローナル抗体から成る群から選択される、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
４．モノクローナル抗体３８２−５Ｈ４　１Ａ８　１Ｆ６の特性を有しているモノクローナル抗体。
５．二量体Ｍ−ＣＳＦと卓越的に結合するモノクローナル抗体の生産方法であって、次の段階：ａ）αクローンｃＤＮＡによりコードされるＭ−ＣＳＦによりリンパ球を免疫処置し；ｂ）前記リンパ球を不死化し；そしてｃ）前記モノクローナル抗体を分泌する前記不死化リンパ球を同定しそして単離する、を含んで成る方法。
６．溶液中のＭ−ＣＳＦ単量体または二量体の存在を測定する方法であって、次の段階：ａ）前記単量体と二量体を分離し；ｂ）前記単量体または二量体を請求項１の前記モノクローナル抗体と接触させ；そしてｃ）前記モノクローナル抗体の存在を暴露する、を含んで成る方法。
７．前記単量体と二量体の分離が電気泳動によるものである、請求項６に記載の方法。
８．溶液中のＭ−ＣＳＦ単量体または二量体の存在を測定する方法であって、次の段階：ａ）前記溶液を請求項１のモノクローナル抗体と接触させ、それによって前記モノクローナル抗体とＭ−ＣＳＦ二量体とを含んで成る複合体を形成せしめ；そしてｂ）前記複合体を単難しそして暴露する、を含んで成る方法。
９．実質上不活性な単量体または実質上不活性な二量体から生物学的に活性な二量体Ｍ−ＣＳＦを分離する方法であって、次の段階：ａ）Ｍ−ＣＳＦの生物学的に活性な二量体および生物学的に不活性な二量体または不活性な単量体を含んで成る溶液を、前記活性二量体への３８２−５Ｈ４　１Ａ８　１Ｆ６の性質を有する抗体の結合を可能にする条件下で、前記抗体と接触させることにより、前記抗体と生物学的に活性な二量体Ｍ−ＣＳＦとを含んで成る複合体を形成せしめ；ｂ）結合した生物学的に活性な二量体Ｍ−ＣＳＦを含む前記複合体を、前記不活性二量体または不活性単量体から分離し；そしてｃ）前記抗体から前記二量体を解離させる、を含んで成る方法。
１０．実質上不活性な単量体および実質上不活性な二量体から生物学的に活性な二量体Ｍ−ＣＳＦを分離する方法であって、次の段階：ａ）Ｍ−ＣＳＦの生物学的に活性な二量体および生物学的に不活性な二量体および不活性な単量体を含んで成る溶液を、前記活性二量体への３８２６Ｈ４　１Ａ８　１Ｆ６の性質を有する抗体の結合を可能にする条件下で、前記抗体と接触させることにより、前記抗体と生物学的に活性な二量体Ｍ−ＣＳＦとを含んで成る複合体を形成せしめ；ｂ）結合した生物学的に活性な二量体Ｍ−ＣＳＦを含む前記複合体を、前記不活性二量体および不活性単量体から分離し；そしてｃ）前記抗体から前記二量体を解離させる、を含んで成る方法。
１１．前記生物学的に活性または不活性な二量体Ｍ−ＣＳＦが化学的に誘導化される、請求項９に記載の方法。
１２．前記化学的誘導化が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールから成る群から選択された分子にＭ−ＣＳＦを接合させることを含んで成る、請求項１１に記載の方法。
１３．前記化学的誘導化がポリエチレングリコールヘのＭ−ＣＳＦの接合を含んで成る、請求項１２に記載の方法。
１４．前記生物学的に活性または不活性な二量体Ｍ−ＣＳＦが化学的に誘導化される、請求項１０に記載の方法。
１５．前記化学的誘導化が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールから成る群から選択された分子にＭ−ＣＳＦを接合させることを含んで成る、請求項１４に記載の方法。
１６．前記化学的誘導化がポリエチレングリコールヘのＭ−ＣＳＦの接合を含んで成る、請求項１５に記載の方法。
１７．３８２−５Ｈ４　１Ａ８　１Ｆ６の特性を有するモノクローナル抗体により結合可能であるＭ−ＣＳＦエピトープであって、本質的には二量体Ｍ−ＣＳＦと関連がありそして単量体Ｍ−ＣＳＦとは関連せず、少なくとも１つのジスルフィド結合により共有結合的に近位に配置されたＭ−ＣＳＦのモノマーを含んで成り、前記近位配置が前記モノマーの空間的整列を行い、それにより前記エピトープが生成する、Ｍ−ＣＳＦエビトープ。
１８．３８２−５Ｈ４　１Ａ８　１Ｆ６の特性を有するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ。
１９．モノクローナル抗体３８２−５Ｈ４　１Ａ８を分泌するハイブリドーマであって、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に受入番号ＨＢ１００２７で寄託され、そしてシタス・ティシュ・カルチャーコレクション（Ｃｅｔｕｓ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ＣｏｌＩｅｃｔｉｏｎ）に寄託番号１０５２３で寄託されたハイブリドーマ。