WO2000034478A1 - Modification de betacelluline - Google Patents

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WO2000034478A1
WO2000034478A1 PCT/JP1999/006873 JP9906873W WO0034478A1 WO 2000034478 A1 WO2000034478 A1 WO 2000034478A1 JP 9906873 W JP9906873 W JP 9906873W WO 0034478 A1 WO0034478 A1 WO 0034478A1
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amino acid
seq
cellulin
acid sequence
mutein
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PCT/JP1999/006873
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Takashi Ito
Mitsuyo Kondo
Yoko Tanaka
Masayuki Kobayashi
Koichi Igarashi
Reiko Sasada
Osamu Nishimura
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Takeda Chemical Industries Ltd
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
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    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/485—Epidermal growth factor [EGF], i.e. urogastrone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a mutin having reduced proliferation promoting activity (EGF activity) of epithelial cells such as smooth muscle cells while retaining the activity of promoting cellulin (BTC) differentiation into three kidney cells (BTC activity).
  • EGF activity proliferation promoting activity
  • BTC activity cellulin
  • Cellulin is a protein factor consisting of 80 amino acids that has been excised from a precursor consisting of 178 amino acids, and its entire amino acid sequence has been determined.
  • baserulin acts on undifferentiated hepatocytes and has the effect of promoting the differentiation of insulin into hepatic 3 cells (BTC activity) [Mashima et al .; Journal of Clinical Invistigue. Jilin (J. Clin. Invest.), 97: 1647 (1996)] is useful as a preventive or therapeutic agent for diabetes (eg, insulin-dependent diabetes) and kidney dysfunction in diabetes.
  • diabetes eg, insulin-dependent diabetes
  • cellulin has a growth promoting activity on vascular smooth muscle cells and retinal pigment epithelial cells as described above, it is not suitable for use as a therapeutic agent for diabetes. Their proliferative activity is a problem.
  • the inventors of the present invention have conducted various studies on a modified form of cellulin, and found that the modification of cellulin reduced the proliferation promoting activity of smooth muscle cells and the like while maintaining the activity of promoting differentiation into tunnel i3 cells. As a result, the present inventors have found for the first time a modified version of a bay cellulin which can be caused to cause no antigenicity problem when administered to a living body, and as a result of further study, completed the present invention. That is, the present invention relates to a variant of cellulin and a method for obtaining the variant.
  • a cell line mutein or a salt thereof which retains the differentiation promoting activity of Teng 0 cells and has a reduced epithelial cell growth promoting activity
  • the ratio of the activity of promoting the differentiation of splenic cells to the activity of promoting the proliferation of epithelial cells to the epithelial cell is at least twice as high as that of the cellulin, and the salt of the cellulin mutein or salt thereof according to the above (1);
  • betacellulin 1 to 30 amino acid residues at the N-terminus of betacellulin may be deleted, and 1 to 30 amino acid residues from the C-terminus to the 23rd amino acid residue.
  • a transformant transformed with a recombinant vector containing DNA encoding the cellulite mutein according to (1) above is cultured to produce the cellulite mutein.
  • composition according to the above (9), wherein the composition is an agent for preventing and treating diabetes;
  • a method for preventing and treating diabetes which comprises administering to a mammal the above-mentioned celerin mutein or salt thereof according to (1);
  • FIG. 1 shows the construction of a 77-residue (3-terminal deletion type) C-cellulin expression plasmid.
  • FIG. 2 shows the construction of a 76-residue (4-terminal C-terminal deletion) betacellulin expression plasmid.
  • FIG. 3 shows a diagram showing the results of betacellulin mutein electrophoresis performed in Example 7.
  • FIG. 4 shows a diagram illustrating the results of the incorporation of 3- P-thymidine into cells performed in Example 8.
  • FIG. 5 shows a fluorescence micrograph of the cells differentiated into ⁇ cells described in Example 9.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of the activity of promoting 3-cell differentiation performed in Example 12.
  • FIG. 7 shows a construction diagram of an expression plasmid for 2- to 76-residue type (1 terminal at the ⁇ -terminal and 4 residues at the C-terminal deleted).
  • FIG. 8 shows a construction diagram of an expression plasmid for 24- to 76-residue (23 residues at the ⁇ -terminal and 4 residues at the C-terminus) -based cellulin.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of gel staining after electrophoresis performed in Example 19.
  • FIG. 10 shows an outline of the construction of plasmid pTB1976 described in Reference Example 1.
  • the level at which EGF activity is reduced while BTC activity is maintained is attenuated.
  • cellulin refers to Sasada et al .; as described in Biochemical and Biophysical Reseach Communications (Biochem. Biophys. Res. Commun.), 190: 1173 (1993).
  • Glu Gly Tyr lie Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Pe Tyr (SEQ ID NO: 35) means a polypeptide containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35.
  • Examples of the whole cellulin mutin having BTC activity include betacellulin mutein having an activity of 20% or more, preferably 50% or more of the BTC activity of whole cellulin.
  • the cellulin mutin having reduced EGF activity there is a cellulin mutin having an activity of about 20% or less, preferably 15% or less, of the GF activity of the cellulin.
  • the cellulin mutin of the present invention in which the EGF activity is reduced while retaining the BTC activity, has a ratio of the differentiation promoting activity of the pancreatic 3 cells to the epithelial cell growth promoting activity which is 2 times smaller than that of the cellulin.
  • the cellulin mutin or a salt thereof is more than twice.
  • 1 to 40 amino acid residues may be deleted from the ⁇ -terminal of the cellulin.
  • one to four amino acid residues including the third amino acid residue Leu from the C-terminus or the fourth amino acid residue Asp from the C-terminus are deleted Or other amino acid residues or other peptide chains, such as sulin mutein or a salt thereof, and more specifically, 1 to 40 or 1 to 20 from the N-terminus. Examples of the above-mentioned cellulin mutein in which an amino acid residue is deleted and the like are mentioned.
  • substitution with other amino acid residues or other peptide chains refers to the “replacement with other amino acid residues or other peptide chains” while maintaining BTC activity. If the substitution is within a range that does not impair the feature that “the EGF is attenuated while maintaining the BTC activity”, the amino acid residue or peptide chain of the overnight cellulin mutein of the present invention in which the EGF activity is attenuated, particularly Does not matter.
  • other amino acids include non-polar (hydrophobic) amino acids (eg, alanine, leucine, isoleucine, palin, proline, fenylalanine, tributofan, methionine), polar (neutral) amino acids ( Eg, glycine, serine, threonine, cystine, tyrosine, asparagine, glutamine etc.), with a positive charge (basic)
  • examples include amino acids (eg, arginine, lysine, histidine, etc.) and negatively charged (acidic) amino acids (eg, aspartic acid, glutamic acid, etc.).
  • other peptide chain refers to a peptide chain in which two or more of the above-mentioned “other amino acids” are bound, and are preferably composed of 2 to 4 amino acid residues. Peptide chains and the like.
  • amino acids 1 to 4 from the C-terminus may be deleted.
  • amino acids 1 to 4 from the C-terminus the third amino acid residue from the C-terminus Leu
  • one or four amino acid residues including the fourth amino acid residue Asp from the C-terminus are deleted or substituted with another amino acid residue or another peptide chain.
  • a good example is
  • amino acid residues 1 to 23 from the N-terminus of basel cellulin (iii) the amino acid residues 1 to 23 from the N-terminus of basel cellulin (AspGlyAsn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala) may be deleted,
  • a cellulin mutein containing an amino acid sequence represented by Tyr lie Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val (SEQ ID NO: 4);
  • a cellulin mutein containing an amino acid sequence represented by Tyr He Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Phe (SEQ ID NO: 14);
  • succin mutein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 37 or SEQ ID NO: 38, more preferably, SEQ ID NO: It is a cellulin mutein containing the amino acid sequence represented by 37 or SEQ ID NO: 38. Most preferably, it is a cellulin mutein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38.
  • amino acid sequence represented by 1SEQ ID NO: 1 is particularly preferred.
  • amino acid sequence represented by 2SEQ ID NO: 1 An amino acid sequence in which 1 to 40 amino acids have been deleted from the N-terminal of the amino acid sequence, 3 an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Or a cellulin mutein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38;
  • 1 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 1 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 3 amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, ⁇ ⁇ amino acid represented by SEQ ID NO: 4
  • a cellulite mutein containing the amino acid sequence represented by the sequence, 5SEQ ID NO: 37 or 6SEQ ID NO: 38, may be mentioned. Particularly preferred is cell lymutein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38.
  • the cellulosic mutin of the present invention in which EGF activity is reduced while retaining BTC activity is as follows: (1) One to 30 amino acid residues at the N-terminus of cellulin are deleted. Base cell with 1 to 5 amino acid residues inserted between the 2nd and 2nd amino acid residues from the C-terminus and the 2nd and 3rd amino acid residues Linmutein or a salt thereof; (2) Cellulin mutein or a salt thereof having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45;
  • amino acid in the “cellulin mutein (modified molecule) having an amino acid residue inserted therein”
  • non-polar (hydrophobic) amino acids eg, alanine, oral isin, isoleucine, norin
  • Proline phenylalanine, tryptophan, methionine, etc.
  • polar (neutral) amino acids eg, glycine, serine, threonine, cystine, tyrosine, asparagine, glutamine, etc.
  • positively charged (basic) amino acids eg, , Arginine, lysine, histidine, etc.
  • negatively charged (acidic) amino acids eg, aspartic acid, glutamic acid, etc.
  • Asparagine, proline and serine are preferred.
  • the “peptide chain” refers to a peptide chain formed by bonding 2 to 5 “amino acids”, preferably a peptide chain consisting of 2 to 4 amino acid residue
  • N-terminal 1 to 30 amino acid residues which may be deleted include, for example, (1) a polypeptide having the amino acid sequence represented by the above SEQ ID NO: 35 (2) a modified amino acid sequence of a cellulase which has 1 to 30 amino acid residues at the N-terminus deleted; (3) an amino acid sequence of the N-terminal 1st to 30th amino acid of the cellulase Includes amino acid residues (eg, 1 to 5 amino acid residues) in which the amino acid residues are modified.
  • the “Bayselin modified molecule in which 1 to 30 amino acid residues at the N-terminus have been deleted” includes: (1) 1 to 30 amino acid residues at the N-terminal side of cellulose (1) Betacellulin with 1 to 30 amino acid residues deleted at the N-terminal side and amino acid residues (eg, 1 to 5 amino acid residues) added And so on.
  • One to thirty amino acid residues at the N-terminus of cellulose may be deleted, and the second to second amino acid residues from the C-terminus (ie, represented by SEQ ID NO: 35
  • the 58th and 8th amino acid residues from the N-terminus of the amino acid sequence: G1n) and the 2nd and 3rd amino acid residues that is, 59th to 59th amino acids from the N-terminus of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35
  • the 1st to 5th amino acid residue between the 3rd amino acid residue: T hr) and the “cellulin-modified molecule” is the N-terminal 1 to Any portion of the 30 amino acid residues may be deleted, between 1 and 5 amino acids between the 2nd and 2nd amino acid residues from the C-terminus As long as the residue has an inserted cellulin-modified molecule, a specific example may be used.
  • the nightly cellulin-modified molecule of the present invention, preferably, a nightly cellulin-modified molecule containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 44 or SEQ ID NO: 45 and the like are exemplified.
  • the cellulin mutein has an N-terminal (amino terminal) at the left end and a C-terminal (carboxyl terminal) at the right end in accordance with the convention of peptide notation.
  • these cellulite muteins usually have a carboxyl group at the C-terminus (one C ⁇ H) or a hydroxyl group (one COO-), but have an amide (—C ⁇ NH 2 ) or ester (one C-terminus) at the C-terminus. COOR).
  • R of the ester examples include a 6-alkyl group such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl, Kuropenchiru, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as cyclohexyl, phenyl, C 6 _ 1 2 Ariru group such Hiichina Fuchiru, benzyl, phenethyl, full of such benzhydryl Eniru C Bok 2 alkyl or ⁇ - naphthylmethyl, ⁇ - Nafuchiru CJ _ 2 C 7 _ i 4 Ararukiru group such as an alkyl, such as, such as the Ru mentioned Viva port Iruokishimechiru group (5
  • cellulin mutin of the present invention also includes those having Met added to the N-terminal.
  • a salt with a physiologically acceptable base for example, an alkali metal or the like
  • an acid organic acid or inorganic acid
  • Acid addition salts are preferred.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, Salts with tartaric acid, cunic acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, Salts with tartaric acid, cunic acid, malic acid, oxalic acid
  • the cellulase mutein of the present invention can be obtained, for example, by treating the cellulin obtained by genetic engineering or cell culture of a tumor cell described in JP-A-6-87894 with a protease known per se.
  • it can also be prepared by treating with carboxypeptidase A, and more preferably by treating carcinomatous carboxypeptidase A.
  • it can be produced according to the peptide synthesis method described later.
  • it can be produced by culturing a transformant containing DNA encoding beycellin mutin described below.
  • tissue or cells of the human warm-blooded animal are homogenized and then extracted with an acid or the like.
  • the extract is subjected to salting out, dialysis, Purification and isolation can be performed by combining chromatography such as gel filtration, reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • a method for synthesizing a peptide for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method may be used. That is, the partial peptide or amino acid capable of constituting the betacellulin mutein of the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting group is removed. By separating, the desired basel cellulin mutein can be produced.
  • Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following 1 to 5.
  • the polypeptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • the polypeptide obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and conversely, when the polypeptide is obtained as a salt, it is converted to a free form by a known method be able to.
  • amide form of betacellulin mutein a commercially available resin for peptide synthesis suitable for amide formation can be used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4 -Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-Dimethoxyphenyl-1 Fmoc aminoethyl) phenoxy resin and the like.
  • amino acids having a suitably protected amino group and side chain functional group are condensed on the resin in accordance with the sequence of the target peptide in accordance with various known condensation methods.
  • the peptide is cleaved from the resin and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain the desired amide.
  • An activating reagent can be used, but carbodiimides are particularly preferable.
  • carbodiimides include DCC, N, N'-diisopropylcarboimide, and N-ethyl- ⁇ ⁇ '-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide.
  • Activation by these methods involves adding the protected amino acid directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, HOBt, H ⁇ Bt, etc.) or using a symmetrical acid anhydride or ⁇ Bt.
  • the amino acid protected beforehand as an ester or a HOOBT ester can be added to the resin after activation.
  • the solvent used for activation of the protected amino acid and condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for peptide condensation reactions.
  • acid amides such as N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide and N-methylpyrrolidone
  • halogenated hydrocarbons such as methylene chloride and chloroform
  • alcohols such as trifluoroethanol
  • Sulfoxides such as dimethylsulfoxide, tertiary amines such as pyridine
  • ethers such as dioxane and tetrahydrofuran
  • nitriles such as acetonitrile and propionitrile
  • esters such as methyl acetate and ethyl acetate or the like.
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range known to be usable for the peptide bond formation reaction, and is usually appropriately selected from the range of about 120 ° C to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4 times excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting amino acid include Z, B oc, Yuichi Shari-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, CI—Z, Br—Z Adamantyloxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like.
  • the coercive Mamorumoto carboxyl group for example ⁇ Bok 6 alkyl group described above as R, C 3 _ 8 cycloalkyl Le group, C 7 - other Ararukiru group, 2-Adamanchiru, 4 twelve Torobenjiru, 4-main Examples include toxic benzyl, 4-cyclohexyl benzyl, phenacyl group and benzyloxycarbonyl hydrazide, butyroxybutoxycarbonyl hydrazide, and trityl hydrazide.
  • the hydroxyl groups of serine and threonine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, lower alkanoyl groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, and groups derived from carbon such as benzyloxycarbonyl group and ethoxycarbonyl group.
  • groups suitable for etherification include, for example, a benzyl group, a tetrahydrovinyl group, and a short-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine include B zl, C l 2 - B zl, 2- nitrobenzyl, B r- Z, evening like one tert-butyl.
  • Histidine imidazole protecting groups include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like.
  • the activated carboxyl groups of the raw materials include, for example, the corresponding acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4-dinitro Phenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, H ⁇ NB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyfurimide, ester with HOB t)].
  • the activated amino group of the raw material includes, for example, the corresponding phosphoric amide.
  • Methods for removing (eliminating) the protecting group include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd black or Pd carbon, or anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonate, trifluorosulfone, or the like.
  • a catalyst such as Pd black or Pd carbon
  • anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonate, trifluorosulfone, or the like include acid treatment with an acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piberidine, piperazine, and the like, and reduction with sodium in liquid ammonia.
  • the elimination reaction by the above acid treatment is generally carried out at a temperature of -20 ° C to 40 ° C.
  • a cation scavenger such as 1,4-butanedithiol or 1,2-ethanedithiol
  • Histi The 2,4-dinitrophenyl group used as the imidazole protecting group of gin is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tributofan is 1,2-ethanedithiol, 1,4-butane described above.
  • alkali treatment with dilute sodium hydroxide and dilute ammonia.
  • a method for introducing a protecting group to a functional group that should not be involved in the reaction, a method for removing the protecting group, and a method for activating a functional group involved in the reaction can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Good.
  • Another method for obtaining an amide form of cellulin mutein is to first amidate the ⁇ -carboxyl group of the carboxyl-terminal amino acid and then extend the peptide chain to the desired length on the amino group side. Thereafter, a peptide (or amino acid) from which only the protecting group for the ⁇ -amino group at the ⁇ -terminal of the peptide chain has been removed and a peptide (or amino acid) from which only the protecting group for the carboxyl group at the C-terminal has been removed are prepared.
  • the peptide is condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the crude polypeptide is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired polypeptide.
  • the DNA encoding the betacellulin mutein of the present invention may include (1) 1 to 40 amino acid residues from the C-terminus of the cellulin, and 1 to 4 amino acids from the C-terminus.
  • any DNA may be used as long as it contains a DNA encoding a betacellulin mutein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45. Specifically, SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO:
  • DNA containing DNA having the nucleotide sequence represented by 43 (3) DNA containing DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 47 to SEQ ID NO: 49, (4) Stringent conditions
  • Non-hybridizing ability DNA that encodes a polypeptide having the same amino acid sequence is used.
  • Hybridization can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto.
  • the cellulite mutein of the present invention may be a DN encoding the cellulite mutein.
  • the expression vector of the beta-cellulin mutein of the present invention used in the production by culturing the transformant containing A is, for example, (1) a DNA encoding the beta-cellulin mutein of the present invention. (2) ligating the DNA fragment downstream of the promoter in a suitable expression vector; Can be manufactured.
  • vectors include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast Derived plasmids (eg, pSH19, pSH15), bacteriophages such as ⁇ phage, and animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus are used.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast Derived plasmids eg, pSH19, pSH15
  • bacteriophages such as ⁇ phage
  • animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus
  • the promoter used in the present invention may be any suitable promoter corresponding to the host used for gene expression.
  • the promoter derived from SV40, the retrovirus promoter, the metamouth thionine promoter, the heat shock promoter, the cytomegalovirus promoter, and the SR hypromo One can be used.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the trp promoter, T7 promoter, lac promoter, recA promoter, ⁇ PL promoter, 1 pp promoter, etc.
  • the host is a yeast, SP ⁇ 1 promoter, SP ⁇ 2 promoter, pen P promoter, etc.If the host is yeast, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH 1 promoter
  • the GAL promoter is preferable.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may contain, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a poly-A addition signal, a selection marker, and an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), if desired.
  • an enhancer e.g., a splicing signal
  • a poly-A addition signal e.g., a selection marker
  • an SV40 replication origin e.g., SV40 ori
  • the selectable marker include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr) gene [methotrexate (MTX) resistance] and an ampicillin resistance gene (hereinafter abbreviated as Amp) ), The neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo, G4 18 resistance), etc.
  • dh fr dihydrofolate reductase
  • Amp ampicillin resistance gene
  • Neo neomycin resistance gene
  • a signal sequence suitable for the host to the N-terminal side of the cellulin mutein.
  • Pho A signal if host is Escherichia Sequence, ⁇ mp A, signal sequence, etc. If the host is a Bacillus bacterium, the hairlamine signal sequence, subtilisin, the signal sequence, etc., if the host is yeast, the mating factor o;
  • the host is an animal cell, such as (MF ⁇ ) signal sequence, Inversease 'signal sequence, etc., for example, insulin signal sequence, ⁇ -inulin ferron signal sequence, antibody molecule, signal sequence Etc. can be used respectively.
  • a transformant can be produced using the thus-constructed vector containing DNA encoding succin mutein.
  • bacteria of the genus Escherichia bacteria of the genus Bacillus, yeast, insect or insect cells, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia examples include Escherichia coli K12 K12 DH1 [Procedings of the National Academy of Sciences, Obc. Natl. Acad. Sci. USA), Volume 60, 160 (1968)], JM 103 [Nucleic Acids Research ', (Nucleic Acids Research), Volume 9, 309 (1981)], J J221 [Journal' ⁇ Moleki Yura-I 'Biology (Journal of Molecular Biology)], 120, 517 (1 978)], HB 101 [Journal' ob '' Molecular 'Biology, 41, 459 (1969)], C 600 [ Genetics, 39, 440 (1954)], MM294 (Pro atl. Acad. Prossings of the National Affairs Demichi'ob'Sciences of the U.S.A. Sci. USA), 73, 4174 (1976)].
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis M11114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95] , 87 (1984)].
  • yeast for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R—, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12 and the like are used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al. PC J
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from the larvae of night moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG1 cells derived from the midgut of Trichoplusia ni, and eggs derived from eggs of Trichoplusia ni High Five TM cells, cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. If the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyx mori N; BmN cell) is used. Examples of the Sf cell include Sf9 cell (ATCC CRL1711), Sf21 cell [Vaughn, JL et al., In Vitro, Vol. 13, pp. 213-217 ( 1977) :) is used.
  • animal cells examples include monkey COS-7 cells, Vero cells, Chinese hamster cells CHO, DHFR gene-deficient Chinese hamster cells CHO
  • mouse L cells mouse 3T3 cells, mouse myeoma cells, human HEK293 cells, human FL cells, 293 cells, C127 cells, BAL B 3T3 cells, Sp-2 / 0 cells are used.
  • Transformation of animal cells is performed, for example, according to the method described in Virology, 52, 456 (1973).
  • Examples of a method for introducing an expression vector into cells include the lipofection method.
  • the above-mentioned method of selecting cells in which the expression vector introduced into the animal cells is integrated into the chromosome by clone selection is used. is there. Specifically, transformants are selected using the above selection marker as an index. Further, by repeatedly performing clone selection on the animal cells obtained using the selection marker in this manner, a stable animal cell line having high expression ability such as bersel mutein of the present invention is obtained. be able to.
  • the dh fr gene was used as a selective agent, the MTX concentration was gradually increased, and culturing was carried out to select resistant strains.
  • the DNA to be transfected can be amplified intracellularly to obtain a more highly expressed animal cell line.
  • the above transformant is cultured under conditions that allow expression of the DNA encoding the cellulin mutein of the present invention, and the beta cellulin mutein of the present invention is produced and accumulated, whereby the vector of the present invention is produced. Evening cellulin mutin can be manufactured.
  • a liquid medium is suitable as a medium used for the cultivation, and includes a carbon source necessary for growth of the transformant.
  • Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are included.
  • Carbon sources include, for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc.
  • Nonrogen sources include, for example, ammonium salts, nitrates, corn chips, liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract, etc.
  • Inorganic or organic substances For example, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like can be mentioned.
  • yeast, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • a culture medium for culturing a bacterium belonging to the genus Escherichia for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Journal (Journal of Experiments in Molecular) Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972].
  • an agent such as 3) 3-indolylacrylic acid can be added to make the promoter work efficiently.
  • the cultivation is usually carried out at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • Culture is usually carried out at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the medium used is Grace's Insect.
  • the pH of the medium is about 6.2 to 8.
  • Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and stirring are added as necessary.
  • the culture medium When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the culture medium may be, for example, about 5 to
  • MEM medium containing 20% fetal bovine serum [Science, 122, 50 1 (1952)], DMEM medium (Virology, 8, 396 (1959)), RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical Intermediary Association (The Journal of the American Medical) Association, 1999, 519 (1967)], 199 medium [Proceding of the Society for the Biological Medicine], 73, 1 (Proceding of the Society for the Biological Medicine), 73, 1 ( 1950)].
  • the pH is about 6-8. Culture is usually performed for about 30 to 40 to about 15 to 60 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • CHO (dhfr-) cells and the dhfr gene are used as selection agents, it is preferable to use a DMEM medium containing dialyzed fetal serum containing almost no thymidine.
  • the betacellulin mutein of the present invention can be separated and purified from the above culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method, and the cells are suspended in an appropriate buffer, and then subjected to ultrasound, lysozyme and After destroying the cells or cells by freezing and thawing, a method of obtaining a crude polypeptide extract by centrifugation or filtration may be appropriately used.
  • the buffer may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 (registered trademark, hereinafter sometimes abbreviated as TM).
  • betacellulin mutein When betacellulin mutein is secreted into the culture solution, after the culture is completed, the supernatant is separated from the cells or cells by a method known per se, and the supernatant is collected.
  • Purification of the polypeptide of the present invention contained in the thus obtained culture supernatant or extract can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods include methods utilizing solubility such as salting-out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight.
  • Method using difference in charge such as ion-exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, reversed-phase high-speed chromatography, etc. Hydrophobic
  • a method utilizing the difference, a method utilizing the difference between the isoelectric points such as isoelectric focusing and chromatofocusing are used.
  • the thus-obtained celerin mutin of the present invention when obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto. It can be converted to a free form or another salt by a known method or a method analogous thereto.
  • the recombinant cell-produced cellulin mutein of the present invention may be arbitrarily modified or partially removed by the action of a suitable protein-modifying enzyme. You can also.
  • a suitable protein-modifying enzyme for example, tribusin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the obtained cellulin mutein may be subjected to a refolding step described in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-1991-1989. Further, by adding cellulite mutein having Met added to the N-terminus to the N-terminal Met removal reaction described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-1989 / 1989, the N-terminus can be obtained. Met can also be removed.
  • DNA encoding the cellulin mutein of the present invention or the cellulin mutein or a salt thereof of the present invention may be used for diabetes (eg, insulin-dependent diabetes mellitus (type I diabetes), etc.), dysfunction of the kidney in diabetes, senility
  • diabetes eg, insulin-dependent diabetes mellitus (type I diabetes), etc.
  • dysfunction of the kidney in diabetes e.g.
  • senility e.g, diabetes-dependent diabetes mellitus (type I diabetes), etc.
  • drugs for undifferentiated renal cancer especially for the prevention and treatment of diabetes (eg, insulin-dependent diabetes, etc.) be able to.
  • the cellulin mutin of the present invention or a salt thereof or a DNA encoding the same can be used as a safe and low toxic drug because EGF activity is attenuated and there is no problem of antigenicity.
  • the cellulin mutein or salt thereof or the DNA encoding the same according to the present invention may be used for diabetes (for example, insulin-dependent sugar). It can be used as a remedy for diabetes mellitus dysfunction in diabetes mellitus, dysfunction of senile dysfunction associated with senile decrease in insulin secretion, and a therapeutic / prophylactic agent for diseases such as undifferentiated kidney cancer.
  • the cellulin mutin of the present invention or a salt thereof or DNA encoding the same as the above-mentioned medicament can be carried out in a conventional manner.
  • aseptic solution orally as tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc. coated with sugar coating or enteric coating as needed, or with water or other pharmaceutically acceptable liquids It can be used parenterally in the form of injections, or suspensions.
  • the compound or a salt thereof is mixed with a physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder and the like in a unit dosage form required for a generally accepted formulation. By doing so, it can be manufactured.
  • the amount of active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc. include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic, excipients such as crystalline cell mouth, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth gum, gum arabic, excipients such as crystalline cell mouth, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • a bulking agent such as magnesium stearate, a sweetener such as sucrose, lactose or saccharin, and a flavoring agent such as peppermint, cocoa oil or cherry may be used.
  • the unit dosage form is a capsule, the above type of material can further contain a liquid carrier such as an oil or fat.
  • Sterile compositions for injection are formulated according to standard pharmaceutical manufacturing methods, such as by dissolving or suspending the active substance in a pan-vehicle, such as water for injection, or naturally occurring vegetable oils such as sesame oil or coconut oil. be able to.
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • Agents such as alcohols (eg, ethanol), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol), and nonionic surfactants (eg, polysorbate 80 (TM), HCO-50) may be used in combination.
  • oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like as a solubilizing agent.
  • buffers for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents for example, benzalkonium chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers for example, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • a preservative eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • an antioxidant and the like.
  • the prepared injection solution is usually filled in an appropriate ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, and can be used, for example, in humans and mammals (e.g., Etc.).
  • the dosage of the beessellin mutein or a salt thereof according to the present invention varies depending on the symptoms and the like. However, in the case of oral administration, generally, in an adult diabetic patient (with a body weight of 60 kg), the dose is about 0 per day. .1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc., but it is used as an injection for adult diabetic patients (with a body weight of 60 kg).
  • a 1 a Alanine
  • Th r Threonine
  • NMP N-methylpyrrolidone A substituent commonly used in the present specification.
  • Trt trityl group The sequence numbers in the sequence listing in the present specification show the following sequences.
  • Fig. 2 shows the amino acid sequence of Bessellin mutein (BTC 1-76) of the present invention. [SEQ ID NO: 3]
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of succin mutein (BTC 1-76, 78-80) of the present invention.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of celite mutein (BTC 1-76, 78, 79) of the present invention.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of succin mutein (BTC 1_76, 78) of the present invention.
  • Fig. 2 shows the amino acid sequence of succin mutein (BTCl-77, 79, 80) of the present invention.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of succin mutein (BTC 1-77, 80) of the present invention.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of cellulin mutin (BTC 31-76, 78-80) of the present invention.
  • Fig. 2 shows the amino acid sequence of beta-cellulin mutein (BTC 31-76, 78, 79) of the present invention.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of succin mutein (BTC31-76, 78) of the present invention.
  • FIG. 1 shows the amino acid sequence of succin mutein (BTC 31-77, 79, 80) of the present invention.
  • the amino acid sequence of the cellulin mutin (BTC 31-77, 79) of the present invention is Show.
  • SEQ ID NO: 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the amino acid sequence represented by amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 2 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the amino acid sequence represented by amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 3 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the amino acid sequence represented by amino acid sequence represented by amino acid sequence.
  • SEQ ID NO: 5 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the cellulin mutein represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • SEQ ID NO: 6 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the cell line mutin represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
  • SEQ ID NO: 24 This shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the cellulite mutein represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • SEQ ID NO: 13 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the cellulin mutein represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13.
  • Primer RI-3Xho used in Examples 10 and 27 described below Shows the base sequence.
  • FIG 13 shows the nucleotide sequence of primer 4 used in Examples 13 and 16 described later.
  • SEQ ID NO: 38 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the cellulin mutein represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 38.
  • 1 shows the amino acid sequence of the modified amino acid molecule of the present invention (BTC31-58, Asn, Pro, Ser, 59-80).
  • 1 shows the amino acid sequence of the betacellulin-modified molecule (Asn, Ser, Asp, Ser, G1u, BTC 38-80) of the present invention.
  • [SEQ ID NO: 46] j shows the amino acid sequence of a cellulin-modified molecule (BTC 1-58, Asn, Pro, Ser, -80).
  • SEQ ID NO: 46 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding the cellulase-modified molecule represented by the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 46.
  • FIG. 14 shows the nucleotide sequence of Primer BT—95 h used in Reference Example 1 and Example 22 described later.
  • Example 15 shows the nucleotide sequence of primer BTC-7 used in Example 23 described later.
  • erchiacoli)] MM 294 (DE 3) / p TC II BTC77 has the accession number FERM BP-6584 as of January 24, 1998 on January 24, 1998 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NI BH; Ibaraki, Japan) It has been deposited with Tsukuba East Co., Ltd. It has been deposited with the Fermentation Research Institute (IFO; 2-17-85, Jusanhoncho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japan) under the accession number IFO16214 on January 1, 1998.
  • IFO Fermentation Research Institute
  • E. coli [Escherichiacoli] MM294 (DE 3) ZpTC II BTC76 obtained in Example 4 described below was obtained under the accession number FERM BP-6583 on January 24, 1998 by the Ministry of International Trade and Industry. Deposited at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology. It has been deposited with the Fermentation Research Institute (IF ⁇ ) under the accession number IF ⁇ 16213 on January 2, 1998.
  • IF ⁇ Fermentation Research Institute
  • E. coli [Escherichiacoli] MM 294 (DE 3) / p TC II BTC2-76 obtained in Example 13 described below was obtained under the accession number FERM BP-6948 on January 24, 1999. It has been deposited with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology of the Ministry of International Trade and Industry. It has been deposited with the Fermentation Research Institute (IF ⁇ ) under the accession number IF 0 16334 on January 9, 1999.
  • IF ⁇ Fermentation Research Institute
  • E. coli [Escherichiacoli] MM 294 (DE3) / pTC II BTC24-76 obtained in Example 16 described below was designated as Accession No. FERM BP-6949 on January 24, 1999 by the Ministry of International Trade and Industry. It is deposited at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. It was deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) under the accession number IFO 16335 on January 9, 1999.
  • IFO Fermentation Research Institute
  • Example 1 The Escherichiaco 1 i MM 294 (DE 3) / p Lys S, p TB 151 carrying the plasmid pTB 1516 used in Reference Example 1 described below was obtained from the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, NI BH) and deposited under the accession number FERM BP-3836 from April 21, 1992 (Heisei Era 4), and accession number IF ⁇ from the fermentation research institute on April 16, 1992 (Heisei Era 4). Deposited as 15 282.
  • NI BH Institute of Biotechnology and Industrial Technology
  • a 77-residue (3-terminal C-terminal deletion) vector cellulin expression plasmid was constructed as follows (Fig. 1).
  • 77-residue type C-terminal three-residue deletion type
  • the structural gene for cellulin cellulase was converted to a cellulase expression plasmid ⁇ ⁇ 41 [Se ⁇ et al .; Growth Factors, 13: 181 (1996)] shows that a primer 1 (5′—CATATGGATGGGAATT CCACCAGAAGTCCTG) having an NdeI cleavage site and an initiation codon adjacent to the upstream of the structural gene, and a stop codon and a BamHI after the 77th aspartate.
  • Amplification was performed by PCR using Primer 2 having a cleavage site (5'-GG AT CCCTA GTCAACTCTCTCACACCTTGCTCC).
  • the gene amplified by PCR was ligated to the pCR2.1 vector using TAo rig i n a c l in ng ng kit (manufactured by Invitrogen) to prepare pCR 2.1 / BTC77.
  • This was introduced into E. coli JM109, and transformants were selected using ampicillin resistance and 3-galactosidase activity as indices.
  • a transformant having pCR2.1 / BTC77 was cultured, and pCR2.1 / BTC77 was prepared using QIArep8Miniprepkit (Qiagen).
  • PBR322 was cut with NdeI, the ends were blunt-ended with T4 DNA polymerase (DNA B1 antigen kit, manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), and religated to delete the NdeI recognition site.
  • P BRdes Nde was prepared. After cutting pET3c with BglII-EcoRV and recovering a fragment of about 0.26 kbp, the ends were blunt-ended with T4 DNA polymerase, and the ScaI fragment of pBRdes nes Nde was used. Ligation was performed to produce PBRZT7 de sNde. In addition, pBR32 was introduced by site-directed mutagenesis (Quick Change, STRATA GENE).
  • PBR322 desBam was prepared from which the BamHI recognition site was deleted.
  • the SphI-EcoRV fragment of pBR322 desBam was ligated to the SphI-EcoRV fragment of pBRZT7desNde to produce a tetracycline resistance expression vector pTCII.
  • PCR2.1 / BTC77 was digested with NdeI and BamHI and subjected to agarose gel electrophoresis, and a 77-residue-type overnight serine structural gene of about 240 bp was QI Aq uick S pin Purification on Kit. (Manufactured by Qiagen).
  • the expression vector pTCII was digested with NdeI and BamHI and subjected to agarose gel electrophoresis. Similarly, a band of about 4.6 kbp was recovered. After ligating the 77-residue type cellulin structural gene to the NdeI-BamHI fragment of the expression vector pTCII, it was introduced into Escherichia coli JM109 to select transformants with tetracycline resistance. Then, the plasmid was recovered from the strain again to obtain an expression plasmid pTC II BTC 77.
  • LB medium containing 1 OmgZL of tetracycline 1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride
  • the cells were cultured in 1 liter at 30 ° C for 16 hours.
  • the obtained culture solution (15 OmL) was added to the main fermentation medium (1.68% sodium monohydrogen phosphate, 0.3% sodium dihydrogen phosphate, 0.1% ammonium chloride, 0.05% sodium chloride, 0.04% magnesium sulfate, 0.02% Newpol LB— 625, 0.0005% thiamine hydrochloride, 1.5% glucose, 1.0% casamino acid, 1.0% yeast extract) 1.5 liters
  • the mixture was transplanted to the charged 2 L jar mentor, and aeration and agitation culture was started at 37 ° C, aeration rate of 2 L / min, and agitation speed of 500 rpm.
  • Centrifugation (10000 rpm, 20 minutes) was performed to obtain 26 OmL of the centrifuged supernatant.
  • the centrifuged supernatant was concentrated using a YM3 membrane (fraction molecular weight: 3000, Millipore).
  • the pH was adjusted to 5.0 with hydrochloric acid.
  • centrifugation 10,000 rpm, 20 minutes
  • the obtained centrifuged supernatant was equilibrated with 5 OmM sodium acetate buffer (H5.0), SP-Toyopearl 650M column (2.2 cm x 12 cm).
  • 76-residue type (C-terminal 4 residues deleted) Structural gene of baseline cellulin was constructed from pTC II / BTC 77 constructed in Example 1 adjacent to the upstream of the structural gene at NdeI cleavage site and start The primer 1 having a codon (5'-CATATGGATGGG AATTCCACCAGAAGTCCTG) and the primer 1 having a termination codon and a BamHI cleavage site after the 76th valine (5'-GG AT CCCTAA.
  • the gene amplified by PCR was It was ligated to the pCR2.1 vector using the originalcl on ng kit (manufactured by Invitrogen) to produce pCR2.1ZBTC 76. This was introduced into E.
  • a transformant having pCR2.1 / BTC76 was cultured, and pCR2.1 / BTC76 was selected using QI Aprep 8 Miniprepkit (Qiagen). Was prepared.
  • pCR2.1ZBTC76 was digested with NdeI and BamHI and subjected to agarose gel electrophoresis, and the approximately 240 bp 76-residue cellulin structural gene was ligated with a QIA quick Spin Purification Kit ( (Qiagen).
  • the expression vector pTCIII prepared in Example 1 was digested with NdeI and BamHI and subjected to agarose gel electrophoresis. Similarly, a band of about 4.6 kbp was recovered.
  • After ligating the 76-residue type cellulin structural gene to the NdeI-BamHI fragment of the expression vector pTCII it was introduced into E. coli JM109, and a transformant was selected with tetracycline resistance. The plasmid was recovered again from the resulting plasmid to give the expression plasmid pTC II BTC76.
  • LB medium containing 1 Omg / L tetracycline 1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride
  • a 76 residue type overnight cellulin expressing strain MM294 (DE3) / pTC II BTC76 The cells were cultured in 1 liter at 30 ° C. for 16 hours. The obtained culture solution was used for the main fermentation medium (1.68% sodium monohydrogen phosphate, 0.3% sodium dihydrogen phosphate, 0.1% ammonium chloride, 0.05% sodium chloride, 0.024%).
  • centrifugation (10000 rpm, 20 minutes) was performed to obtain 20 L of centrifuged supernatant.
  • the centrifuged supernatant was concentrated using a Pellicon cassette system (molecular weight cut-off: 5000, Millipore).
  • Concentrated desalted solution 3 After adding 13.2 L of 2M urea to 3 L, the pH was adjusted to 5.0 with hydrochloric acid. It is adsorbed on a POROS 50HS column (2.2 cm x 12 cm, Nippon Perceptive) equilibrated with 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.0) at a flow rate of 3 OmL / min, and the buffer used for equilibration is sufficient.
  • the characteristics of the Met-77 residue type cellulin obtained in Example 3 and the Met-76 residue type cellulin obtained in Example 6 were determined as follows.
  • a modified overnight cellulin and a Me-80 residue type overnight cellulose prepared according to the method described in JP-A-10-191989 were added to a sample buffer (125 mM Tris-HC 1% sodium dodecyl sulfate, 1%).
  • the cells were suspended in 5% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol, 0.005% bromphenol and electrophoresed on Multigel 15-25 (Daiichi Pure Chemicals). The gel after electrophoresis was stained with Rapid CBBBB (Kanto Chemical Co., Ltd.). It was a single band [Figure 3].
  • the modified betacellulin is subjected to gas phase hydrolysis with 6 N hydrochloric acid containing 4% thioglycolic acid at 110 ° (:, 24, and 48 hours, and the amino acid analyzer (Hitachi L-1 8500AAmino Acid Ana 1 yzer As a result, all the variants contained methionine derived from the initiation codon ATG, and were consistent with the amino acid composition expected from the cDNA base sequence [Table 1, Table 2].
  • N-terminal amino acid sequence analysis was determined using a gas-phase protein sequencer (Applied Biosystems Model 477A). As a result, all the variants were in agreement with the amino acid composition predicted from the cDNA base sequence. All variants had a methionine derived from the initiation codon ATG at the N-terminus as in the 80 residue type [Tables 3 and 4]. [Table 3] N-terminal amino acid sequence analysis of 77-residue type betacellulin
  • the cells are washed once with PBS, fixed with 10% formaldehyde, treated with 0.1% Triton X-100 for 5 minutes, and then added with Block Ace (Snow Brand, Japan) and incubated at room temperature for 40 minutes. Blocking was performed for minutes.
  • An anti-insulin antibody (Advanced 'Immuno Chemical) diluted with 10% Block Ace was added and reacted at room temperature for 40 minutes. After 0.1% Triton X-100 was added and left at room temperature for 5 minutes, it was washed three times with PBS.
  • the activity of promoting differentiation into three cells was also performed using AR42J cells transformed with alkaline phosphatase ligated as a repo overnight downstream of the insulin promoter.
  • cells differentiated into / 3 cells by cellulase produce alkaline phosphatase, and by measuring the activity of this alkaline phosphatase, the activity of promoting differentiation into 3 cells is quantitatively measured. Is possible You.
  • Genomic DNA was prepared from the rat tail according to a conventional method. Using this DNA as a template, a primer synthesized based on the previously reported base sequence of rat insulin II gene promoter (GenBank: Accession No. J 00748).
  • the amplified 0.75 Kb DNA fragment was isolated, and the nucleotide sequence of the cloned fragment was determined using the plasmid pTB1881 obtained by incorporating it into the pT7 Blue vector (Novagen 69820-1). I confirmed that it was overnight. Plasmid pTB1881 was digested with XhoI-ClaI to obtain a 0.73 kb DNA fragment, which was rat insulin promoter overnight. Next, the expression plasmid PTB 1330 of 2.0 kbc DNA encoding human placental alkaline phosphatase (PLAP) (J. Berger et al., Gene 66, 1 (1988)) was transformed into XhoI-Hind.
  • PLAP placental alkaline phosphatase
  • AR42 J cells plasmid containing ne o r gene PL AP expression plasmid pTB 1898 and Tn 5 pMCn e opo ly A STRATAGENE
  • STRATAGENE a transflector Ekushi Yon reagent T rans IT TM - LT 1 ( M irus, P e nVe ra Coporation).
  • the transfected cells were cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum for 2 days, and then added to a selective medium supplemented with 800 g / mL of G418 (genetecin, GI BCO BRL), followed by culturing. Clones were isolated from cells grown to G418 resistance by the limiting dilution method.
  • the cells of each clone are seeded on a 24-well plate, cultivated with Me-80 residue type cellulin overnight with or without 20 ng ZmL, and the culture supernatant is collected and heat-treated at 65 ° C for 30 minutes. After performing, the alkaline phosphatase activity in the medium was measured. A clone showing an increase in alkaline phosphatase activity when 80-residue type cellulin was added was selected. The results of some clones are shown in [Table 7] below.
  • PLAP-expressing AR42 J cells Measurement of 3-cell differentiation promoting activity
  • the PLAP-expressing AR42J cells constructed in Example 11 were combined with various concentrations of the met-77 residue type cellulin prepared in Example 3 and the Met-76 residue type prepared in Example 6 for the cell line.
  • Dulbecco's Modified Eagle containing Me-80 residue type Cellulin and 10% fetal serum prepared by the method described in JP-A No. 109-191989. with MEM medium and suspended at 1 0 5 cells ZML, sown 1 0 0 L to 96 ⁇ El plate, carbon dioxide incubator base Isseki within one (5% carbon dioxide gas, 95% air) in The cells were cultured at 37 ° C for 5 days.
  • BTC 76 2-76 residue type (N-terminal 1 residue, C-terminal 3 residue deleted type) Betacellulin structural gene, 76-residue type (C-terminal 3 residue deleted type) II
  • BTC 76 [Example 4] Primer 3 (5′-CAGCATATGG GGAATTC CACCAGAAGTCCT) having an NdeI cleavage site and an initiation codon immediately upstream of the second glycine, and terminated after C-terminal valine. Primer 4 having a stop codon and a BamHI cleavage site (5, —Amplified with GGATCCC. The gene amplified by PCR was ligated to pCR2.1 vector using TA originalcloning kit (manufactured by Invitrogen).
  • pCR2.1 BTC2-76 was digested with NdeI and BamHI, followed by agarose gel electrophoresis, and the approximately 230 bp 2-76 residue type cellulin structural gene was ligated with QI AGEN gelextraction kit. (Manufactured by Qiagen).
  • the expression vector PTC II [Example 1] was cut with Nde I and Bam HI and subjected to agarose gel electrophoresis. Similarly, a band of about 4.6 kbp was recovered.
  • C2-76 was cultured in LB medium (1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride) 3 0111 containing 1 OmgZL of tetracycline at 30 ° for 16 hours.
  • the obtained culture solution is used as a main fermentation medium (1.68% sodium monohydrogen phosphate, 0.3% sodium dihydrogen phosphate, 0.1% ammonium chloride, 0.05% sodium chloride, 0.012% sulfuric acid).
  • ImM EDTA, ImM APMSF and 7 g of the cells obtained in Example 14 were added to 5 g of the cells.
  • Betacellulin expression plasmid pTC II BTC 76 upstream of the 24th alanine Primer 5 (5'-1 GG) with an adjacent NdeI cleavage site and initiation codon followed by a termination codon and a BamHI cleavage site (5'-1 CAGC phosphorus) was amplified by PCR.
  • the gene amplified by PCR was ligated to pCR2.1 vector using TA original clone kit (manufactured by Invitrogen) to produce pCR2.1 BTC 24_76.
  • transformants having pCR2.1 BTC 24-76 were cultured, and pCR2 was prepared using QI Aprep 8 Miniprepkit (Qiagen). 1 BTC 24-76 was prepared.
  • pCR2.1 BTC 24-76 was digested with NdeI and BamHI, and subjected to agarose gel electrophoresis.
  • the approximately 160 bp 24--76 residue type cellulite structural gene was ligated with QIAGEN geletraction. It was collected using a kit (Qiagen).
  • the expression vector pTCIII prepared in Example 1 was digested with NdeI and BamHI and subjected to agarose gel electrophoresis. Similarly, a band of about 4.6 kbp was recovered.
  • the gene was introduced into Escherichia coli JM109, and transformed strains were selected with tetracycline resistance.
  • the plasmid was recovered again from the strain and used as an expression plasmid pTC II BTC 24-76.
  • This pTC II BTC 24—76 was introduced into E. coli MM294 (DE 3), and a transformant was selected based on tetracycline resistance, and a 24—76 residue cellulin-expressing strain MM294 (DE3) p TCIIBTC 24—76 I got Example 17
  • LB medium containing 1 Omg / L tetracycline 1% Peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% yeast extract) 5% sodium chloride
  • the obtained culture solution was used as a main fermentation medium (1.68% sodium monohydrogen phosphate, 0.3% sodium dihydrogen phosphate, 0.1% ammonium chloride, 0.05% sodium chloride, 0.1% sodium chloride).
  • the fractions containing 24-76 residues of cellulin were collected, diluted three-fold with 5 OmM sodium acetate buffer (pH 4.5), and then equilibrated with this buffer to form a TSKgel CM-5PW column ( 0.75 cm X 7.5 cm, Tosoh Corporation). TSKg e 1 adsorbed with 24--cell residue cellulite The CM-5 PW column was eluted with a linear gradient of sodium chloride from 0.3 ⁇ 1 to 0.5 M.
  • the characteristics of the 2- to 76-residue cellulin obtained in Example 3 and the 24- to 4-residue cellulin obtained in Example 6 were determined as follows.
  • the modified cellulinated cellulin and the 76-residue type cellulin prepared in Example 6 were combined with sample buffer (125 mM Tris-HC and 1% sodium dodecyl sulfate, 15% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol, The mixture was suspended in 0.0005% bromphenol blue and electrophoresed on Multigel 15/25 (Daiichi Pure Chemicals). When the gel after electrophoresis was stained with Rabbit CBB KANTO (Kanto Chemical Co., Ltd.), almost all bands were single bands (Fig. 9).
  • the modified Bayerin cellulin was subjected to gas phase hydrolysis with 6 N hydrochloric acid containing 4% thioglycolic acid at 110 ° C for 24 and 48 hours, and an amino acid analyzer (Hitachi L-1 8500A Amino Acid Ana 1 Amino acid composition was determined using yzer). As a result, all of the variants matched the amino acid composition predicted from the cDNA nucleotide sequence [Table 8, Table 9]. [Table 8] Analysis of amino acid composition of 2-76 residue betacellulin Number of residues per mole of amino acid Theoretical value
  • Met 0.0.0 0 lie 2.02 then eu 0.0.0 0
  • N-terminal amino acid sequence analysis was determined using a gas phase protein sequencer (Applied Biosystems Model 477A). As a result, all the variants were in agreement with the amino acid sequence predicted from the cDNA nucleotide sequence [Table 10, Table 11].
  • the C-terminal amino acid was determined by a gas-phase hydrazine decomposition method (100 ° C, 6 hours) using an amino acid analyzer (Hitachi L-1800A Amino Acid AnaliZer). Palin was detected in all variants [Table 12, Table 13].
  • A431 cells is an highly expressed strain. That is, using a Dulbecco's Modified Eagle's MEM (DMEM) medium containing 10% fetal serum, seed the A431 cells suspended in a volume of 105 cells to 100 mL each in a 96-well plate, and place in a CO2 incubator. (5% CO 2, 95% air) at 37 ° C for 2 days.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's MEM
  • the cells were washed three times with 200 L of binding medium, and the cells were lysed with 200 aL of 0.1 N aqueous sodium hydroxide solution containing 1% SDS. Cell lysate The mixture was transferred to a scintillation vial, 1 mL of scintillator A (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and the binding inhibitory activity for 125 I-EGF was measured using a scintillation counter.
  • scintillation vial 1 mL of scintillator A (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and the binding inhibitory activity for 125 I-EGF was measured using a scintillation counter.
  • PLAP-expressing AR42 J cells were prepared at various concentrations using 2-76 residue type cellulin prepared in Example 15 and 24-18 residue type cellulin prepared in Example 18 and Example 6 Contains the prepared Met-76 residue type cellulin, or the Met-80 residue type cellulin prepared by the method described in JP-A No. 10-191989 and 10% fetal serum. was suspended at 10 5 cells / mL using Dulbecco's modified Eagle's MEM medium, 1 00 L were seeded 96 Uerupuredo, a carbon dioxide gas incubator (5% carbon dioxide, 95% air) 5 days at 37 ° C for at The culture was continued for a while.
  • 2-76 residue type cellulin prepared in Example 15 and 24-18 residue type cellulin prepared in Example 18 and Example 6 Contains the prepared Met-76 residue type cellulin, or the Met-80 residue type cellulin prepared by the method described in JP-A No. 10-191989 and 10% fetal serum. was suspended at 10 5 cells / mL using Dulbec
  • 5'-primer PET-1 5 and 3'-primer BTC-1: 5'-AGGAGGGCGTCGAGGGGTTTTGCTCGGCCA- 3 '
  • 5'-primer BTC-2 PCR was performed using 5'-TGG primer-BTC_3: 5'-TCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGC ACTGTC-3 ', respectively.
  • PCR was performed using the 5′-primer BT—95 h and the 3′-primer BT—94 h, and the hB TC 50
  • a DNA fragment encoding a modified molecule A was obtained in which three amino acids (A sn, Pro, Ser) in the sequence of Her were inserted between Cys 3 and Cys 4 of the DNA sequence.
  • NdeI and BamHI After digestion of this DNA fragment with NdeI and BamHI, it was incorporated into the NdeI-BamHI site of pET-3c to generate pTB1985.
  • PCR was performed using the 'and 3' primers BT-94h to obtain a DNA fragment encoding the modified molecule B in which the N-terminal 7 residues of hBTC50 were substituted with the corresponding 5 residues of EGF. .
  • This DNA fragment was digested with NdeI and BamHI, and then incorporated into the NdeI-BamHI site of pET3c to produce pTB1987.
  • E. coli BL21 DE3 ZpLysSS (Novagen) for expression.
  • Each E. coli recombinant was cultured at 37 ° C. in an LB medium containing 100 gZm1 ampicillin and 100 g / m1 chloramphenicol.
  • Cretutunite 160 isopropyl ⁇ -D_thiogalactovyranoside was added to a final concentration of 0.4 mM, and the culture was continued at 37 ° C for 4 hours. After the culture, the cells were collected by centrifugation and stored at 180 ° C until the extraction operation.
  • Example 24 Example 24
  • the cells collected from 400 ml of the culture were suspended in 20 ml of 10 mM Tris-HC1 (H8.0), 10% sucrose, 1 OmM EDTA, frozen and thawed. The cells were left on ice for 30 minutes to completely lyse the cells. After sonication (10 sec, 3 times) under ice-cooling, the precipitate was collected again by centrifugation (900 rpm, 15 min, 4 ° C: Bee km an). This washing operation was repeated three times to prepare an inclusion body.
  • the inclusion bodies obtained in 4-1) were suspended in 8 ml of 7 M guanidine-HC and 0.1 MT ris-CH 3 C ⁇ H (pH 8.0), suspended in ImM EDTA at 4 C for 1 hour.
  • the recombinant protein was extracted by gentle stirring with a stirrer.
  • reduced glutathione was added to a concentration of 0.1 M, the pH was adjusted to 8.4 with a NaOH solution, and nitrogen gas was blown into the extract to replace the air.
  • the 20-fold volume l OmM T ris- CH 3 C_ ⁇ _OH (pH8. 0), 0.
  • 3 H-thymidine [Amersham-Pharmacia Biotech] was added at 0.25 Ci / we 1 I.
  • the cells were washed three times with PBS, and 100 L of 5% SDS was added. Added cells were lysed. The cell lysate was transferred to a scintillation vial, 1 mL of Scintillation A (Wako Pure Chemical Industries) was added, and the uptake of 3 H-thymidine into the cells was measured with a scintillation counter.
  • hBTC 80 80-residue cellulin prepared by the method described in JP-A No. 10-191989, and 10%
  • FITC Fluorescein Isothiocyanate
  • Block Ace diluted with 10% Block Ace was added and reacted at room temperature for 40 minutes. After 0.1% Triton X-100 was added and left at room temperature for 5 minutes, it was washed three times with PBS and observed with a fluorescence microscope.
  • the activity of promoting differentiation into 3 cells was also carried out using AR42J cells transformed with an alkaline phosphatase gene ligated as a repo sequence downstream of the insulin promoter.
  • cells differentiated into i3 cells by overnight cellulin produce alkaline phosphatase, and by measuring the activity of this alkaline phosphatase, the activity of promoting differentiation into three cells is quantitatively measured. It is possible to do so.
  • Genomic DNA was prepared from the rat tail according to a conventional method. Using this DNA as a template, primers RI-1: 5'-AGAGTCAAGGATCCCCCAACCACT-3 'and primers synthesized based on the previously reported base sequence of rat insulin II gene promoter (GenBank: Accession No.] 00748) One
  • Plasmid pTB1881 was digested with XhoI-C1aI to obtain a 0.73 kb DNA fragment which was rat insulin promoter overnight.
  • the expression plasmid pTB1330 of 2.0 kbc DNA encoding human placental alkaline phosphatase (PLAP) J.
  • the culture supernatant was collected and heat-treated at 65 ° C for 30 minutes, and then the alkaline phosphatase activity in the medium was measured.
  • a clone showing an increase in alkaline phosphatase activity upon addition of 80-residue cellulin was selected, and one of the clones, AR71-104, was used in the following studies.
  • the protein concentration (ED 50 ) required to show 50% activity when the maximum absorbance when hBTC 50 is added is 100% is shown in [Table 16].
  • primer BT—95h: 5′- AGCAT PCR was performed using '.
  • the overnight cellulinmutin or a salt thereof according to the present invention is useful as an excellent therapeutic agent for diabetes, since EGF activity is attenuated while BTC activity is maintained and there is no problem of antigenicity.

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Description

明 細 書 ベー夕セルリン改変体 技術分野
本発明はべ一夕セルリン （BTC) の塍臓 3細胞への分化促進活性 （BTC活 性） を保持したまま平滑筋細胞等の上皮細胞の増殖促進活性 （EGF活性） を低 減させたムティン （以下、 改変体または改変分子と称することもある） 及びその 製造法などに関する。 背景技術
ヒ卜べ一夕セルリンは、 1 78アミノ酸からなる前駆体より切り出された 80 アミノ酸からなる蛋白性因子でその全アミノ酸配列が明らかにされている
CSasadaら ；バイオケミカル ·アンド ·バイオフィジカル · リサーチ ·コミュ二 ケーションズ（Biochem. Biophys. Res. Commun. ) , 190 : 1 1 73 (1 993)〕。 生体内に存在するべ一夕セルリンは極めて微量で、 これを取得するのは困難であ つたが、 遺伝子組換え技術を用いた製造法が特開平 6— 87894号公報などに 記載されている。 ベ一夕セルリンは当初マウス 3 T 3細胞に対する増殖促進活性 を持つ因子として見出されたが、 その後、 血管平滑筋細胞、 網膜色素上皮細胞に 対しても増殖促進活性（EGF活性） を有することが明らかとなった [Shingら ； サイエンス （Science) ， 259 : 1604 (1 993) ] 。 さらに、 ベー夕セル リンは塍臓未分化肝細胞に作用して、 ィンシュリンを産生する塍臓 3細胞への分 化を促進する作用 （BTC活性） を有する 〔Mashimaら ；ジャーナル ォブ ク リニカル インビスティゲ一シヨン （J. Clin. Invest. ) , 97 : 1647 (1 996) 〕 ことより、 糖尿病 （例えば、 インスリン依存性糖尿病） 、 糖尿病にお ける塍臓機能障害などの予防 ·治療剤として有用であるものと考えられる
[Miyagawaら、 1 997年日本糖尿病学会 講演要旨集， 125] 。
しかしながらべ一夕セルリンは前述のような血管平滑筋細胞、 網膜色素上皮細 胞に対する増殖促進活性を併せ持つため、 糖尿病治療剤として応用する場合には これらの増殖活性が問題である。
そのため塍臓 β細胞への分化促進作用を維持したまま、 血管平滑筋細胞等に対 する増殖促進活性を低減することが可能であるならば、 より医薬品としての可能 性を高めることができるが、 これまでそのようなべ一夕セルリン改変体について は知られていない。 発明の開示
本発明者らはべ一夕セルリンの改変体について種々の検討を重ねた結果、 ベー 夕セルリンの改変により隧臓 i3細胞への分化促進活性を保持したまま平滑筋細胞 等の増殖促進活性を低減させることを可能たらしめるベー夕セルリン改変体であ つて、 生体内に投与した場合に抗原性の問題を生じない改変体を初めて見出し、 さらに研究を続けた結果、 本発明を完成させた。 すなわち、 本発明はべ一夕セル リンの改変体及びその改変体を取得する方法などに関する。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 滕臓 0細胞の分化促進活性が保持され、 上皮細胞増殖促進活性が低減された ベ一夕セルりンムテインまたはその塩；
( 2 ) 上皮細胞増殖促進活性に対する塍臓 3細胞の分化促進活性の比が、 ベー夕 セルリンのそれに比べて 2倍以上である前記 （1 ) 記載のベー夕セルリンムテイ ンまたはその塩；
( 3 ) ベー夕セルリンの N末端から 1ないし 4 0個のアミノ酸残基が欠失していて もよく、 C末端から 1ないし 4番目のアミノ酸残基において、 C末端から 3番目の アミノ酸残基 L e uもしくは C末端から 4番目のアミノ酸残基 A s pを含む 1な いし 4個のアミノ酸残基が欠失または他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖 に置換された前記 （1 ) 記載のベ一夕セルリンムテインまたはその塩；
( 4 ) N末端から 1ないし 4 0個のアミノ酸残基が欠失した前記 （3 ) 記載のベー 夕セルリンムテインまたはその塩；
( 5 ) ①配列番号： 1で表されるアミノ酸配列、 ②配列番号： 1で表されるァミノ 酸配列の N末端から 1ないし 4 0個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、③配列番 号： 2で表されるアミノ酸配列または④配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の N 末端から 1ないし 40個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を含有する前記 （3) 記載のベー夕セルリンムテインまたはその塩；
(6) ①配列番号： 1で表されるアミノ酸配列、 ②配列番号： 2で表されるァミノ 酸配列、 ③配列番号： 3で表されるアミノ酸配列または④配列番号： 4で表される アミノ酸配列を含有する前記 （3) 記載のベ一夕セルリンムテインまたはその塩；
(7) ①配列番号： 37で表されるアミノ酸配列または②配列番号： 38で表さ れるアミノ酸配列を含有する前記 （3) 記載のベー夕セルリンムテインまたはそ の塩；
(8) ベータセルリンの N末端の 1ないし 30個のアミノ酸残基が欠失していて もよく、 C末端から第 22番目のアミノ酸残基と第 23番目のアミノ酸残基との 間に 1ないし 5個のアミノ酸残基が挿入された前記 （1) 記載のベー夕セルリン ムティンまたはその塩；
(9) ベ一夕セルリンの N末端の 1ないし 30個のアミノ酸残基が欠失した前記 (8) 記載のベー夕セルリンムテインまたはその塩；
(10) 配列番号： 44で表されるアミノ酸配列を有する前記 （8) 記載のベー夕 セルリンムテインまたはその塩；
(11) 配列番号： 45で表されるアミノ酸配列を有する前記 （8) 記載のベータ セルリンムテインまたはその塩；
(12) 前記 （1) 記載のベ一夕セルリンムテインをコードする DN Aを含有す る組換えベクターで形質転換された形質転換体を培養し、 該べ一夕セルリンムテ インを生成せしめることを特徴とする前記 （1) 記載のベ一夕セルリンムテイン またはその塩の製造法；
(13) 前記 （1) 記載のベー夕セルリンムテインまたはその塩を含有してなる 医薬組成物；
(14) 組成物が糖尿病予防 ·治療薬である前記 （9) 記載の医薬組成物；
(15) 前記 （1) 記載のベー夕セルリンムテインまたはその塩を哺乳動物に投 与することを特徴とする糖尿病予防 ·治療法；
(16) 糖尿病予防 ·治療剤の製造のための前記 （1) 記載のベ一夕セルリンム ティンまたはその塩の使用などに関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 77残基型 （C末端 3残基欠失型） ベ一夕セルリン発現プラスミドの構 築図を示す。
図 2は、 76残基型 （C末端 4残基欠失型） ベータセルリン発現プラスミドの構 築図を示す。
図 3は、 実施例 7で行われたベータセルリンムテインの電気泳動の結果を示す図 を示す。
図 4は、 実施例 8で行われた3 Η—チミジンの細胞への取り込み結果を示す図を 示す。
図 5は、 実施例 9に記載の β細胞に分化した細胞に関する蛍光顕微鏡写真図を 示す。
図 6は、 実施例 12で行われた 3細胞分化促進活性の結果を示す図を示す。 図 7は、 2— 76残基型 （Ν末端 1残基、 C末端 4残基欠失型） ベー夕セルリ ンの発現プラスミドの構築図を示す。
図 8は、 24— 76残基型 （Ν末端 23残基、 C末端 4残基欠失型） ベー夕セ ルリンの発現プラスミドの構築図を示す。
図 9は、 実施例 1 9で行われた泳動後のゲルの染色結果を示す図を示す。
図 10は、 参考例 1記載のプラスミド pTB 1 976の構築の概略を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明のベー夕セルリン改変体 （ベー夕セルリンムテイン） は、 上述のとおり、 BTC活性が保持されたまま、 E G F活性が低減あるレゝは減弱されている。
ここで、 ベ一夕セルリンとは、 Sasadaら；バイオケミカル ·アンド ·バイオフィ ジカリレ ' リサ一チ ·コミュニケーションズ (Biochem. Biop ys. Res. Commun. ) , 190 : 1 173 ( 1993) に記載のとおり、 Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gin Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gin Tyr Lys His Tyr Cys He Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gin Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp δ
Glu Gly Tyr lie Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu P e Tyr (配列番号： 3 5) で表されるァミノ酸配列を含有するポリペプチドのことを意味する。
BTC活性が保持されたべ一夕セルリンムティンとしては、 ベ一夕セルリンの B TC活性の 20%以上、 好ましくは 50%以上の活性を有するベータセルリンムテ インが挙げられる。
EGF活性が低減されたべ一夕セルリンムティンとしては、 ベ一夕セルリンの Ε GF活性の約 20%以下、 好ましくは 15 %以下の活性を有するベー夕セルリンム ティンが挙げられる。
BTC活性を保持したまま、 EGF活性が低減された本発明のベ一夕セルリンム ティンとしては、 上皮細胞増殖促進活性に対する塍臓 3細胞の分化促進活性の比が、 ベー夕セルリンのそれに比べて 2倍以上であるべ一夕セルリンムティンまたはそ の塩が好ましい。
BTC活性を保持したまま、 EGF活性が低減された本発明のベ一夕セルリンム ティンとして具体的には、 ベー夕セルリンの Ν末端から 1ないし 40個のアミノ酸 残基が欠失していてもよく、 C末端から 1ないし 4番目のアミノ酸残基において、 C末端から 3番目のアミノ酸残基 L e uもしくは C末端から 4番目のアミノ酸残 基 A s pを含む 1ないし 4個のアミノ酸残基が欠失または他のアミノ酸残基もし くは他のぺプチド鎖に置換されたべ一夕セルリンムテインまたはその塩などがあ げられ、 さらに具体的には、 N末端から 1ないし 40個または 1ないし 20個のァ ミノ酸残基が欠失した前述のベ一夕セルリンムテインなどがあげられる。
上記の 「他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に置換されたべ一夕セルリン ムティン」 中の他の 「他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に置換」 とは、 B TC活性を保持したまま、 EGF活性が減弱された本発明のベ一夕セルリンムテイ ンの 「BTC活性を保持したまま、 EGFが減弱される」 という特徴を損なわない 範囲での置換であれば、 特にアミノ酸残基またはペプチド鎖の種類は問わない。 上 記の 「他のアミノ酸」 の具体例として、 非極性 （疎水性） アミノ酸 （例、 ァラニン、 ロイシン、 イソロイシン、 パリン、 プロリン、 フエ二ルァラニン、 トリブトファン、 メチォニンなど） 、 極性 （中性） アミノ酸 （例、 グリシン、 セリン、 スレオニン、 システィン、 チロシン、 ァスパラギン、 グルタミンなど） 、 陽電荷をもつ （塩基性） アミノ酸 （例、 アルギニン、 リジン、 ヒスチジンなど） 、 負電荷をもつ （酸性） ァ ミノ酸 （例、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸など） などがあげられる。 上記の 「他 のペプチド鎖」 の具体例としては、 上記の 「他のアミノ酸」 が 2個以上結合してな るペプチド鎖のことをいい、 好ましくは 2ないし 4個のアミノ酸残基からなるぺプ チド鎖などがあげられる。
「ベー夕セルリンの N末端から 1ないし 40個のアミノ酸残基が欠失していて もよく C末端から 1ないし 4番目のアミノ酸残基において、 C末端から 3番目のァ ミノ酸残基 L e uもしくは C末端から 4番目のアミノ酸残基 As pを含む 1ない し 4個のアミノ酸残基が欠失または他のアミノ酸残基もしくは他のぺプチド鎖に 置換されたべ一夕セルリンムテイン」 の具体的な例としては、
(1) ベ一夕セルリンの N末端から 76番目までのアミノ酸配列 （Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gin Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gin Tyr Lys His Tyr Cys lie Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gin Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr lie Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val) を保持し、 C 末端から 1ないし 4番目のアミノ酸残基 （Asp Leu Phe Tyr) において、 C末端か ら 3番目のアミノ酸残基 L e uもしくは C末端から 4番目のアミノ酸残基 As p を含む 1ないし 4個のアミノ酸残基が欠失または他のアミノ酸残基もしくは他の ペプチド鎖に置換されたべ一夕セルリンムテイン、 例えば、
① Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gin Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gin Tyr Lys His Tyr Cys lie Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gin Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr lie Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val (配列番号： 2) で表されるアミノ酸配列を含有するべ一夕セルリンムテイン、 ② Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gin Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gin Tyr Lys His Tyr Cys lie Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gin Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr He Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp (配列番号： 1) で表されるアミノ酸配列を含有するべ一夕セルリンムテ S-iV ni3 SA3 SJV ¾IV ail Aj9 nio dsy δΛο ΙΕΛ SA3 JDS OJ<I jqェ UJQ
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OJd dsv Ai3 sA3 Π9ΐ nsi ΛΙ9 usy J¾ nio OJJ J3S SJV Jqi 3S usv Ajg dsv ⑥ 890/66dr/丄:) d SLPti/OQ OAV Val Asp Phe (配列番号： 9) で表されるアミノ酸配列を含有するベータセルリン ムティン、 および
⑧ ベー夕セルリンの c末端から 3番目のアミノ酸残基 （L e u) が他のアミノ酸 残基で置換されたべ一夕セルリンムテインなどがあげられる。
なかでも、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列を含有するべ一夕セルリンムテ インまたは配列番号： 2で表されるベ一夕セルリンムティンが特に好ましい例とし てあげられる。
(2)ベ一夕セルリンの Ν末端から 1ないし 40番目までのアミノ酸残基（AspGly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gin Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys) が欠失していてもよく、
N末端から 4 1番目ないし 7 6番目のアミノ酸配列 （Gin Tyr Lys His Tyr Cys lie Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gin Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr lie Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val) を保持し、 C末端から 1ないし 4番 目のアミノ酸残基 （Asp Leu Phe Tyr) において、 C末端から 3番目のアミノ酸残 基し e uもしくは C末端から 4番目のアミノ酸残基 A s pを含む 1ないし 4個の アミノ酸残基が欠失または他のアミノ酸残基もしくは他のぺプチド鎖に置換され たべ一夕セルリンムテイン、 好ましくは、
(i) ベ一夕セルリンの N末端から 1ないし 3 7番目までのアミノ酸残基 （Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gin Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg) が欠失し ていてもよく、
N末端から 38番目ないし 76番目のアミノ酸配列 （Cys Pro Lys Gin Tyr Lys His Tyr Cys lie Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gin Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr lie Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val) を保持し、 C末端から 1ないし 4番目のアミノ酸残基 （Asp Leu Phe Tyr) において、 C末端から 3番目 のアミノ酸残基 L e uもしくは C末端から 4番目のアミノ酸残基 A s pを含む 1 ないし 4個のアミノ酸残基が欠失または他のアミノ酸残基もしくは他のぺプチド 鎖に置換されたべ一夕セルリンムテイン、 (ii) ベ一夕セルリンの N末端から 1番目のアミノ酸残基 （Asp) が欠失していて もよく、
N末端から 2番目ないし 76番目のアミノ酸配列 （Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gin Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gin Tyr Lys His Tyr Cys lie Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gin Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr He Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val) を保持し、 C末端から 1ないし 4番 目のアミノ酸残基 （Asp Leu Phe Tyr) において、 C末端から 3番目のアミノ酸残 基し e uもしくは C末端から 4番目のアミノ酸残基 A s pを含む 1ないし 4個の ァミノ酸残基が欠失または他のァミノ酸残基もしくは他のぺプチド鎖に置換され たべ一夕セルリンムティン、
(iii)ベー夕セルリンの N末端から 1ないし 23番目のアミノ酸残基（AspGlyAsn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala) が欠失していてもよく、
N末端から 24番目ないし 76番目のアミノ酸配列 （Ala Thr Thr Thr Gin Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gin Tyr Lys His Tyr Cys lie Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gin Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr lie Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val) を保持し、 C末端から 1ないし 4番目のアミ ノ酸残基 （Asp Leu Phe Tyr) において、 C末端から 3番目のアミノ酸残基 L e u もしくは C末端から 4番目のアミノ酸残基 A s pを含む 1ないし 4個のアミノ酸 残基が欠失または他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に置換されたべ一夕 セルリンムテインなどが挙げられ、
例えば、
① Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gin Tyr Lys His Tyr Cys He Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gin Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly
Tyr lie Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val (配列番号： 4) で表されるアミノ酸配列 を含有するべ一夕セルリンムテイン、
② Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gin Tyr Lys His Tyr Cys lie Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gin Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr lie Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp (配列番号： 3) で表されるアミノ酸 配列を含有するべ一夕セルリンムティン、
③ Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gin Tyr Lys His Tyr Cys lie Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gin Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr lie Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Leu Phe Tyr (配列番号： 10) で表され るアミノ酸配列を含有するべ一夕セルリンムテイン、
④ Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gin Tyr Lys His Tyr Cys lie Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gin Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr lie Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Leu Phe (配列番号： 1 1) で表されるァ ミノ酸配列を含有するべ一夕セルリンムテイン、
⑤ Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gin Tyr Lys His Tyr Cys lie Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gin Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr lie Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Leu (配列番号： 12) で表されるァミノ 酸配列を含有するべ一夕セルリンムテイン、
⑥ Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gin Tyr Lys His Tyr Cys lie Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gin Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr lie Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Phe Tyr (配列番号： 13) で表され るアミノ酸配列を含有するべ一夕セルリンムティン、
⑦ Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gin Tyr Lys His Tyr Cys lie Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gin Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly
Tyr He Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Phe (配列番号： 14) で表されるァ ミノ酸配列を含有するべ一夕セルリンムテイン、
⑧ ベ一タセルリンの N末端から 31ないし 80番目のアミノ酸配列で表される 部分ペプチドにおいて、 C末端から 3番目のアミノ酸残基 （L e u) が他のアミノ 酸残基で置換されたべ一夕セルリンムティン、
⑨ Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pto Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gin Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gin Tyr Lys His Tyr Cys He Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gin Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr He Gly Ala Arg Cys Gl u Arg Val (配列番号： 3 7 ) で表されるアミノ酸配列を含有するべ一夕セ ルリンムティン、 および
⑩ Al a Thr Thr Thr Gi n Ser Lys Arg Lys Gly Hi s Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gin Tyr Lys Hi s Tyr Cys l i e Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Al a Glu Gin Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr l i e Gly Al a Arg Cys Glu Arg Val (配列番号： 3 8 ) で表されるアミノ酸配列を含有するべ一夕セルリンムテインなどがあげられ る。
なかでも、 配列番号： 3、 配列番号： 4、 配列番号： 3 7または配列番号： 3 8 で表されるアミノ酸配列を含有するべ一夕セルリンムテインが好ましく、 さらに好 ましくは、 配列番号： 3 7または配列番号： 3 8で表されるァミノ酸配列を含有す るべ一夕セルリンムテインである。 最も好ましくは配列番号： 3 8で表されるアミ ノ酸配列を含有するべ一夕セルリンムテインである。
上記 （1 ) 、 （2 ) に記載の本発明のベー夕セルリンムテインの好ましい例中、 特に好ましいものとしては、①配列番号： 1で表されるアミノ酸配列、②配列番号： 1で表されるアミノ酸配列の N末端から 1ないし 4 0個のアミノ酸が欠失したァ ミノ酸配列、 ③配列番号： 2で表されるアミノ酸配列、 ④配列番号： 2で表される アミノ酸配列の N末端から 1ないし 4 0個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ⑤ 配列番号： 3 7で表されるアミノ酸配列または⑥配列番号： 3 8で表されるァミノ 酸配列を含有するべ一夕セルリンムテインである。
さらに好ましくは、 ①配列番号： 1で表されるアミノ酸配列、 ②配列番号： 2で 表されるアミノ酸配列、 ③配列番号： 3で表されるアミノ酸配列、 ④配列番号： 4 で表されるアミノ酸配列、 ⑤配列番号： 3 7で表されるアミノ酸配列または⑥配列 番号： 3 8で表されるアミノ酸配列を含有するべ一夕セルリンムテインがあげられ る。 特に好ましくは配列番号： 3 8で表されるアミノ酸配列を含有するべ一夕セル リンムテインである。
B T C活性を保持したまま、 E G F活性が低減された本発明のベー夕セルリンム ティンとして具体的には、 （1 ) ベ一夕セルリンの N末端の 1ないし 3 0個のアミ ノ酸残基が欠失していてもよく、 C末端から第 2 2番目のアミノ酸残基と第 2 3番 目のアミノ酸残基との間に 1ないし 5個のアミノ酸残基が挿入されたベー夕セル リンムテインまたはその塩、 （2 ) 配列番号： 4 5で表されるアミノ酸配列を有す るべ一夕セルリンムテインまたはその塩なども挙げられる。
上記「アミノ酸残基が挿入されたべ一夕セルリンムテイン （改変分子）」 の 「ァ ミノ酸」 の具体例としては、 非極性 （疎水性） アミノ酸 （例、 ァラニン、 口イシ ン、 イソロイシン、 ノ リン、 プロリン、 フエ二ルァラニン、 トリプトファン、 メ チォニンなど） 、 極性 （中性） アミノ酸 （例、 グリシン、 セリン、 スレオニン、 システィン、 チロシン、 ァスパラギン、 グルタミンなど） 、 陽電荷をもつ （塩基 性） アミノ酸 （例、 アルギニン、 リジン、 ヒスチジンなど） 、 負電荷をもつ （酸 性） アミノ酸 （例、 ァスパラギン酸、 グルタミン酸など） などがあげられる。 ァ スパラギン、 プロリン、 セリンが好ましい。 該 「ペプチド鎖」 としては、 上記 「ァ ミノ酸」 が 2ないし 5個結合してなるペプチド鎖のことをいい、 好ましくは 2な いし 4個のアミノ酸残基からなるぺプチド鎖などがあげられる。
「 N末端の 1ないし 3 0個のアミノ酸残基が欠失していてもよいべ一タセルリ ン」 としては、 たとえば （1 ) 上記配列番号： 3 5で表されるアミノ酸配列を有 するポリペプチド、 （2 ) N末端の 1ないし 3 0個のアミノ酸残基が欠失したベ 一夕セルリン改変分子、 （3 ) ベ一夕セルリンの N末端の第 1番目から第 3 0番 目のアミノ酸配列中にアミノ酸残基 （例、 1ないし 5個のアミノ酸残基） が揷入 されたベー夕セルリン改変分子などが含まれる。
該 「N末端の 1ないし 3 0個のアミノ酸残基が欠失したベー夕セルりン改変分 子」 には、 （1 ) ベ一夕セルリンの N末端側の 1ないし 3 0個のアミノ酸残基が 欠失したもの、 （2 ) ベータセルリンの N末端側の 1ないし 3 0個のアミノ酸残 基が欠失し、 アミノ酸残基 （例、 1ないし 5個のアミノ酸残基） が付加したもの などが含まれる。
「ベ一夕セルリンの N末端の 1ないし 3 0個のアミノ酸残基が欠失していても よく、 C末端から第 2 2番目のアミノ酸残基 （すなわち、 配列番号： 3 5で表さ れるアミノ酸配列の N末端から第 5 8番目のアミノ酸残基： G 1 n ) と第 2 3番 目のアミノ酸残基 （すなわち、 配列番号： 3 5で表されるアミノ酸配列の N末端 から第 5 9番目のアミノ酸残基： T h r ) との間に 1ないし 5個のアミノ酸残基 が揷入されたべ一夕セルリン改変分子」 は、 ベー夕セルリンの N末端の 1ないし 30個のアミノ酸残基のどの部分のアミノ酸が欠失していてもよい、 C末端から 第 2 2番目のアミノ酸残基と第 2 3番目のアミノ酸残基との間に 1ないし 5個の アミノ酸残基が挿入されたべ一夕セルリン改変分子であればよく、 具体例として は、
① Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gin Ser Lys Arg Lys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gin Tyr Lys His Tyr Cys lie Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gin Asn Pro Ser Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr He Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr (配列番号： 46) で表されるアミノ酸配列を 含有するべ一夕セルリン改変分子、
② ベー夕セルリンの N末端から 1ないし 3 0番目までのアミノ酸残基 （Asp Gly Asn Ser Thr Arg Ser Pro Glu Thr Asn Gly Leu Leu Cys Gly Asp Pro Glu Glu Asn Cys Ala Ala Thr Thr Thr Gin Ser Lys) が欠失していて、 かつ
C末端から第 2 2番目のアミノ酸残基と第 2 3番目のアミノ酸残基との間に 1な いし 5個のアミノ酸残基が揷入されたべ一夕セルリン改変分子、例えば、 ArgLys Gly His Phe Ser Arg Cys Pro Lys Gin Tyr Lys His Tyr Cys He Lys Gly Arg Cys Arg Phe Val Val Ala Glu Gin Asn Pro Ser Thr Pro Ser Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr He Gly Ala Arg Cys Glu Arg Val Asp Leu Phe Tyr (配列番号： 44) で 表されるアミノ酸配列を含有するべ一夕セルリン改変分子などがあげられる。 本発明の 「ベ一夕セルリン改変分子」 として、 好ましくは、 配列番号： 44ま たは配列番号： 45で表されるアミノ酸配列を含有するべ一夕セルリン改変分子 などがあげられる。 本明細書におけるベ一夕セルリンムテインはぺプチド標記の慣例に従って左端 が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （カルボキシル末端） である。 またこれら のべ一夕セルリンムテインは C末端が通常カルボキシル基 （一 C〇〇H) または力 ルポキシレート （一 COO-) であるが、 C末端がアミド （—C〇NH2) またはェ ステル （一 COOR) であってもよい。 エステルの Rとしては、 例えばメチル、 ェ チル、 n—プロピル、 イソプロピルまたは n—ブチルなどの — 6アルキル基、 シ クロペンチル、 シクロへキシルなどの C 3_8シクロアルキル基、 フエニル、 ひ一ナ フチルなどの C 6_ 1 2ァリール基、 ベンジル、 フエネチル、 ベンズヒドリルなどのフ ェニルー C卜 2アルキル、 もしくは α—ナフチルメチルなどの α—ナフチルー C J _ 2アルキルなどの C 7 _ i 4ァラルキル基、 ビバ口ィルォキシメチル基などがあげられ る (5
また、 本発明のベ一夕セルリンムティンには N末端に M e tが付加したものも含 まれる。
本発明のベー夕セルリンムティンの塩としては、 生理学的に許容される塩基 （例 えばアルカリ金属など） や酸 （有機酸、 無機酸） との塩が用いられるが、 とりわけ 生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。 このような塩としては例えば無機酸 (例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 シユウ酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩 などが用いられる。
本発明のベー夕セルリンムテインは、 例えば、 特開平 6— 8 7 8 9 4に記載の遺 伝子工学的又はべ一夕腫瘍細胞の培養により得られたベ一夕セルリンを自体公知 のプロテアーゼ処理、 好ましくはカルボキシぺプチダーゼ処理さらに好ましくはゥ シ塍臓カルボキシぺプチダーゼ A処理することによつても調製する事が可能であ る。 また、 後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。 また、 後述する ベー夕セルリンムティンをコードする D NAを含有する形質転換体を培養するこ とによっても製造することができる。
ベ一夕セルリンをヒトゃ温血動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ温 血動物の組織または細胞をホモジナイズした後、 酸などで抽出を行い、 該抽出液を、 塩析、 透析、 ゲル濾過、 逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィ一などのクロマトグラフィーを組み合わせるこ とにより精製単離することができる。
ペプチドの合成法としては、 例えば固相合成法、 液相合成法のいずれによっても 良い。 すなわち、 本発明のベー夕セルリンムテインを構成し得る部分ペプチドもし くはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱 離することにより目的のベー夕セルリンムテインを製造することができる。 公知の 縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、 以下の①〜⑤に記載された方法が挙げ られる。
φ M. Bodanszky および M. A. Ondetti、ペプチド シンセシス (Peptide Synthesis), Interscience Publ ishers, New York (1966年)
② Schroeder および Luebke, ザ ペプチド（The Peptide), Academic Press, New York (1965年）
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明 および柳原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (1977年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発 第 14巻 ペプチド合成広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 たとえば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトダラ フィー ·液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明のポリべプチ ドを精製単離することができる。 上記方法で得られるポリぺプチドが遊離体である 場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られ た場合は、 公知の方法によって遊離体に変換することができる。
ベータセルリンムテインのアミド体は、 アミド形成に適した市販のペプチド合成 用樹脂を用いることができる。 そのような樹脂としては例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一ベン ジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 PA M樹脂、 4ーヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアク リルアミド樹脂、 4一 （2 ' , 4 ' —ジメトキシフエ二ルーヒドロキシメチル） フ エノキシ樹脂、 4一 （2 ' ， 4' —ジメトキシフエ二ル一 Fmo cアミノエチル） フエノキシ樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 ひーァミノ基 と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするペプチドの配列通りに、 自 体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からぺプチ ドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、 必要に応じて高希釈溶液中で分子内ジ スルフィド結合形成反応を実施し、 目的のアミド体を取得する。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、 ペプチド合成に使用できる各種 活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルボジィ ミド類としては D C C、 N， N ' —ジイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチル— Ν ' 一 （3—ジメチルァミノプロピル） カルポジイミドなどが挙げられる。 これら による活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t、 H〇〇B tなど） とと もに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または Η〇 B tエステルあるいは HOO B tエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸 の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。 保護されたアミノ酸の活性 化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 ペプチド縮合反応に使用しうること が知られている溶媒から適宜選択されうる。 たとえばな N—ジメチルホルムアミ ド、 N， N—ジメチルァセトアミド、 N—メチルピロリドンなどの酸アミド類、 塩 化メチレン、 クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、 トリフルォロエタノール などのアルコール類、 ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、 ピリジンなど の三級アミン類、 ジォキサン、 テトラヒドロフランなどのエーテル類、 ァセトニト リル、 プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル、 酢酸ェチルなどのエステ ル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応温度はペプチド結合形 成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、 通常約一 2 0 °C 〜 5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5な いし 4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十 分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な 縮合を行うことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾ一ルを用いて未反応アミノ酸をァセチル化して、 後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料アミノ酸のァミノ基の保護基としては、 たとえば、 Z、 B o c、 夕一シャリ —ペンチルォキシカルボニル、 イソボルニルォキシカルボニル、 4—メトキシベン ジルォキシカルボニル、 C I— Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 卜 リフルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—ニトロフエニルスルフエニル、 ジフエ二ルホスフイノチオイル、 Fm o cなどが挙げられる。 カルボキシル基の保 護基としては、 たとえば Rとして上記した〇卜6アルキル基、 C 3_8シクロアルキ ル基、 C 7— ァラルキル基の他、 2—ァダマンチル、 4一二トロベンジル、 4ーメ トキシベンジル、 4一クロ口ベンジル、 フエナシル基およびべンジルォキシカルボ ニルヒドラジド、 夕ーシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、 トリチルヒドラジ ドなどが挙げられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、 たとえばエステル化またはエーテル化によ つて保護することができる。 このエステル化に適する基としては例えばァセチル基 などの低級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカル ボニル基、 ェトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基などが挙げられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 たとえばベンジル基、 テトラヒドロビラ二 ル基、 夕一シャリーブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 たとえば B z l、 C l 2— B z l、 2—ニトロベンジル、 B r— Z、 夕一シャリーブチルなどが挙げられる。 ヒスチジンのイミダゾ一ルの保護基としては、 To s、 4—メトキシ— 2， 3， 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum、 B o c、 T r t、 Fmo cなどが挙げられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 たとえば対応する酸無水物、 アジド、 活性エステル [アルコール （たとえば、 ペンタクロロフエノ一ル、 2, 4, 5—トリクロ口フエノール、 2， 4ージニトロフエノール、 シァノメチルアルコ一 ル、 パラニトロフエノール、 H〇NB、 N—ヒドロキシスクシミド、 N—ヒドロキ シフ夕ルイミド、 HOB t) とのエステル] などが挙げられる。 原料のァミノ基の 活性化されたものとしては、 たとえば対応するリン酸アミドが挙げられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 たとえば Pd黒あるいは Pd炭素などの触 媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタンスルホ ン酸、 トリフルォロメ夕ンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれらの混合液 などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピベリジ ン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリウムによる還元 なども挙げられる。 上記酸処理による脱離反応は一般に— 20°C〜40°Cの温度で 行われるが、 酸処理においてはァニソール、 フエノール、 チオアニソ一ル、 メ夕ク レゾール、 パラクレゾール、 ジメチルスルフイ ド、 1， 4一ブタンジチオール、 1， 2—エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチ ジンのィミダゾ一ル保護基として用いられる 2 , 4—ジニトロフエニル基はチオフ ェノール処理により除去され、 トリブトファンのィンドール保護基として用いられ るホルミル基は上記の 1 , 2—エタンジチオール、 1， 4一ブタンジチオールなど の存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム、 希アンモニアなどに よるアルカリ処理によっても除去される。
反応に関与すべきでない官能基への保護基の導入法およびその保護基の脱離法、 反応に関与する官能基の活性化法などは、 自体公知の方法またはそれに準じた方 法に従って行えばよい。
また、 ベ一夕セルリンムテインのアミド体を得る別の方法としては、 まず、 カル ボキシル末端アミノ酸の α—カルボキシル基をアミド化した後、 アミノ基側にぺプ チド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ぺプチド鎖の Ν末端の α—アミノ基の保護 基のみを除いたペプチドと C末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたぺプチ ド （またはアミノ酸） とを製造し、 この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で 縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた保 護ペプチドを精製した後、 上記方法によりすベての保護基を除去し、 所望の粗ポリ ぺプチドを得ることができる。 この粗ポリぺプチドは既知の各種精製手段を駆使し て精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチドのアミド体を得るこ とができる。
ベータセルリンムティンのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のひ —カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 ポリ ペプチドのアミド体と同様にして所望のポリペプチドのエステル体を得ることが できる。 本発明のベータセルリンムテインをコードする D N Aとしては、 （1 ) ベ一夕セ ルリンの Ν末端から 1ないし 4 0個のアミノ酸残基が欠失していてもよく、 C末端 から 1ないし 4番目のアミノ酸残基において、 C末端から 3番目のアミノ酸残基 L e uもしくは C末端から 4番目のアミノ酸残基 A s pを含む 1ないし 4個のアミ ノ酸残基が欠失または他のアミノ酸残基もしくは他のペプチド鎖に置換されたべ 一夕セルリン、 （2 ) ベ一夕セルリンの N末端の 1ないし 3 0個のアミノ酸残基が 欠失していてもよく、 C末端から第 22番目のアミノ酸残基と第 23番目のァミノ 酸残基との間に 1ないし 5個のアミノ酸残基が挿入されたべ一夕セルリンムテイ ン、 （3) 配列番号： 45で表されるアミノ酸配列を有するベータセルリンムテイ ンをコードする DNAを含有する DNAであればいかなるものであってもよい。 具 体的には、 本発明の配列番号： 1ないし配列番号： 14、 配列番号 37、 配列番号
38、 配列番号： 44、 配列番号： 45、 配列番号： 46で表されるアミノ酸配列 を含有するべ一夕セルリンムティンをコードする塩基配列を含有するものがあげ られる。
より具体的には、 （1) 配列番号： 1ないし配列番号： 14で表されるアミノ酸 配列を含有するべ一夕セルリンムテインをコードする DN Aとしては、 配列番号： 15ないし配列番号： 28で表される塩基配列を有する DN Aを含有する DNA、 (2) 配列番号 37および配列番号 38で表されるアミノ酸配列を含有するべ一夕 セルリンムテインをコードする DN Aとしては、 配列番号： 42および配列番号：
43で表される塩基配列を有する DNAを含有する DNA、 (3) 配列番号： 47 ないし配列番号： 49で表される塩基配列を有する DN Aを含有する DNA、 （4) ストリンジェン卜な条件下で上記 （1) ないし （3) で規定された配列とハイプリ ダイズする哺乳動物由来の DNA、 (5) 遺伝コードの縮重のため上記 （1) ない し （4) に定められている配列とハイブリッド形成しない力 同一アミノ酸配列を もつポリペプチドをコ一ドする DNAなどが用いられる。 ハイブリダィゼーシヨン は、 自体公知の方法あるいはそれに準じた方法に従って行うことができる。 上記ス トリンジェン卜な条件としては、 例えば 42°C、 50%ホルムアミド、 4XSSP E(1 XSSPE=15 OmM NaC 1 , 1 OmM Ν aH2P04 - H20, lm M EDTA pH7. 4) 、 5Xデンハート溶液、 0. 1 %SDSである。 本発明のベー夕セルリンムテインを、 ベ一夕セルリンムテインをコードする DN
Aを含有する形質転換体を培養することによって製造する場合に用いられる本発 明のベー夕セルリンムテインの発現べクタ一は、 例えば、 （1) 本発明のベー夕セ ルリンムティンをコードする DN Aから目的とする DN A断片を切り出し、 （2) 該 DN A断片を適当な発現べクタ一中のプロモー夕一の下流に連結することによ り製造することができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR 322， pBR 32 5, pUC 1 2, pUC 1 3) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 1 1 0， p TP 5, pC 1 94) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH l 9， p SH 1 5) 、 λ ファージなどのバクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス， バキ ュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモー夕一としては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応し て適切なプロモー夕一であればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、 S V40由来のプロモー夕一、 レトロウイルスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモー夕一、 ヒートショック プロモーター、 サイトメガロウィルスプロモーター、 S Rひプロモ一夕一などが利 用できる。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモーター、 T 7プロ モー夕一、 l a cプロモー夕一、 r e cAプロモ一夕一、 λ PLプロモ一夕一、 1 p pプロモー夕一などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 S P〇 1プロモー夕 ―、 S P〇2プロモー夕一、 p e n Pプロモータ一など、 宿主が酵母である場合は、 PH05プロモ一夕一、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADH 1プロ モ一夕一、 GALプロモーターなどが好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポ リヘドリンプロモーター、 P 1 0プロモータ一などが好ましい。
発現べクタ一には、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシグ ナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マ一カー、 SV40複製オリジン （以下、 SV4 0 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることができる。 選択マーカ一としては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f rと略称す る場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシリン耐性遺 伝子 （以下、 Amp「と略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺伝子 （以下、 Ne oと略称する場合がある、 G4 1 8耐性） 等力挙げられる。 特に、 CH〇 (d h f r— ) 細胞を用いて DHFR遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、 チミ ジンを含まない培地によっても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 ベ一夕セルリンムテインの N端末側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 p h o A ·シグナル 配列、 〇mp A ·シグナル配列など力 宿主がバチルス属菌である場合は、 ひーァ ミラ一ゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主が酵母である 場合は、 メイティングファクター o; (MF α) ·シグナル配列、 インベル夕ーゼ 'シ グナル配列など、 宿主が動物細胞である場合には、 例えばインシュリン ·シグナル 配列、 α—ィン夕一フエロン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれ ぞれ利用できる。
このようにして構築されたべ一夕セルリンムテインをコ一ドする DNAを含有 するベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 たとえばェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫または昆 虫細胞、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌としては、 ェシエリヒア 'コリ （Escherichia col i) K 12 · DH 1 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェン シィズ 'ォブ ·ザ ·ュ一エスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 60巻， 16 0 (1968)〕 ， J M 103 〔ヌクイレック ·ァシッズ 'リサーチ， （Nucleic Acids Research) , 9巻， 309 (1981)〕 ， J Α221 〔ジャーナル 'ォブ ·モレキ ユラ一 'バイオロジ一 （Journal of Molecular Biology) 〕 ， 120巻， 517 (1 978)〕 ， HB 101 〔ジャーナル 'ォブ 'モレキュラー 'バイオロジー， 41 巻， 459 ( 1969)〕 ， C 600 〔ジエネティックス （Genetics) , 39巻， 4 40 (1954)] , MM294 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァ力 デミ一'ォブ 'サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Pro atl. Acad. Sci. USA) , 73巻， 4174 (1976)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 たとえばバチルス ·サチルス （Bacillus subtilis) M 1 1 14 〔ジーン， 24巻， 255 (1983)〕 ， 207 - 2 1 〔ジャーナル ·ォ ブ ·バイオケミストリー （Journal of Biochemistry) , 95巻， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 たとえばサッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 22， AH22R—， NA87— 1 1 A， DKD—5D, 20B 一 12などが用いられる。
昆虫としては、 例えばカイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネイチヤー PC J
22
(N ture) ， 315巻， 592 (1985)〕 。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由来 株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞) 、 Trichoplusia ni の中腸由 来の MG1細胞、 Trichoplusia ni の卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae 由来の細胞または Estigmena acrea 由来の細胞などが用いられる。 ゥ ィルスが BmNPVの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bombyx mori N； BmN細胞） な どが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 〔以上、 Vaughn, J. L.ら、 イン 'ヴィト口 （in Vitro) , 1 3巻， 21 3— 2 17頁 （1977年） ：） などが用いられる。
動物細胞としては、 たとえばサル COS— 7細胞、 Ve r o細胞、 チャイニーズ ハムスター細胞 CHO、 DHFR遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 CHO
(dh f r— CH〇細胞） 、 マウス L細胞、 マウス 3T3細胞、 マウスミエ口一マ 細胞， ヒト HEK293細胞、 ヒト FL細胞、 293細胞、 C 127細胞、 BAL B 3T3細胞、 S p— 2/0細胞などが用いられる。
ェシェリヒア属菌を形質転換するには、 たとえばプロシージングズ ·ォブ ·ザ · ナショナル ·アカデミー'ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ一 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 69巻， 2 1 10 ( 1972)、 ジーン （Gene) ， 17巻， 107 (1982)などに記載の方法に従って行なわれる。
バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラー'アンド'ジエネラル ' ジェネティックス （Molecular & General Genetics) ， 168巻， 1 1 1 (197 9 )などに記載の方法に従つて行われる。
酵母を形質転換するには、 たとえばプロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル · アカデミー'ォブ 'サイェンシィズ'ォブ'ザ 'ュ一エスェ一 （Pro atl. Acad. Sci. USA) , 75巻， 1929 (1978 )に記載の方法に従って行なわれる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 たとえばバイオ/テクノロジー
(Bio/Technology) , 6巻， 47— 55頁 （1988年） などに記載の方法に従つ て行なわれる。
動物細胞を形質転換するには、 たとえばヴイロロジー （Virology) ， 52巻， 4 56 (1973)に記載の方法に従って行なわれる。 発現ベクターの細胞への導入方法としては、 例えば、 リポフエクシヨン法
[Feigner, P. L. et al. プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー · ォブ 'サイェンジィズ'ォブ'ザ'ュ一エスェ一 （Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) ， 84巻， 7413頁 (1987年） 〕 、 リン酸カルシウム法 CGraham, F. L. and van der Eb, A. J. ヴイロロジ一 （Virology) , 52巻， 456— 467頁 （1973年） 〕 、 電気穿 孔法 CN'uemann, E. et al. ェンボ ·ジャーナル （EMBO J. ) , 1巻， 841— 84 5頁 （1982年） 〕 等が挙げられる。
このようにして、 本発明のベ一夕セルリンムティンをコードする DNAを含有す る発現べクタ一で形質転換された形質転換体が得られる。
なお、 動物細胞を用いて、 本発明のベ一夕セルリンムテインを安定に発現させる 方法としては、 上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた 細胞をクローン選択によって選択する方法がある。 具体的には、 上記の選択マーカ —を指標にして形質転換体を選択する。 さらに、 このように選択マ一カーを用いて 得られた動物細胞に対して、 繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明のベ —夕セルリンムテイン等の高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができ る。 また、 dh f r遺伝子を選択マ一力一として用いた場合、 MTX濃度を徐々に 上げて培養し、 耐性株を選択することにより、 dh f r遺伝子とともに、 本発明の ベ一夕セルリンムテインをコ一ドする DNAを細胞内で増幅させて、 さらに高発現 の動物細胞株を得ることもできる。
上記の形質転換体を本発明のベ一夕セルリンムテインをコ一ドする DNAが発 現可能な条件下で培養し、 本発明のベータセルリンムテインを生成、 蓄積せしめる ことによって、 本発明のベ一夕セルリンムティンを製造することができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養に 使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生育に 必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 たと えばグルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖など、 窒素源としては、 たと えばアンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ ' リカー、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液などの無機または有機物質、 無機物としては たとえば塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシウムなどが挙げ られる。 また、 酵母、 ビタミン類、 生長促進因子などを添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えばグルコース、 カザミノ酸 を含む M 9培地〔ミラ一（Miller) , ジャーナル ·ォブ ·ェクスペリメンッ ·イン - モレキュラー ·ンェ不ティックス (Journal of Experiments in Molecular Genetics) , 431—433， Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、 たとえば 3 )3—インド リルァクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がェシェリヒァ属菌の場合、 培養は通常約 1 5〜 43 °Cで約 3〜 24時間行 い、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜40° で約6〜24時間行ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 たとえばバークホ一 ルダ一 （Burkholder) 最小培地 [Bostian, K. L. ら、 「プロシージングズ ·ォブ- ザ'ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ—エスエー（Proc.
Natl. Acad. Sci. USA) ， 77巻， 4505 (1 980)〕 や 0. 5 %カザミノ酸を 含有する SD培地 〔Bitter, G. A.ら、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル- アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 81巻， 5330 (1984) 〕 が挙げられる。 培地の pHは約 5〜
8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 20°C〜35°Cで約 24〜72時間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace's Insect
Medium (Grace, T. C.C. ,ネイチヤー (Nature) , 195, 788 (1962)に非動化した 10 % ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培地の pHは約 6. 2〜
6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27°Cで約 3〜 5日間行い、 必要に 応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 たとえば約 5〜
20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) ， 122巻， 50 1 (1952)〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジ一 （Virology) ， 8巻， 396 ( 19 59)〕 ， RPMI 1640培地 〔ジャーナル'ォブ ·ザ ·アメリカン 'メディ力 リレ ·アソシエーション (The Journal of the American Medical Association) 1 99巻， 519 (1967)〕 ， 199培地 〔プロシージング ·ォブ ·ザ ·ソサイエ ティ ·フォー ·ザ ·バイオロジカル ·メディスン （Proceeding of the Society for the Biological Medicine) , 73巻， 1 ( 1950)〕 などが用いられる。 pHは 約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 30 〜40 で約15〜60時間行 い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
特に CHO (dh f r— ) 細胞および d h f r遺伝子を選択マ一力一として用い る場合には、 チミジンをほとんど含まない透析ゥシ胎児血清を含む DMEM培地を 用いるのが好ましい。
上記培養物から本発明のベータセルリンムテインを分離精製するには、 例えば下 記の方法により行なうことができる。
本発明のベー夕セルリンムテインを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際し ては、 培養後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁 し、 超音波、 リゾチームおよび Zまたは凍結融解などによって菌体あるいは細胞を 破壊したのち、 遠心分離やろ過によりポリぺプチドの粗抽出液を得る方法などが適 宜用い得る。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのたんばく変性剤や、 トリト ン X— 100 (登録商標。 以下、 TMと省略することがある。 ） などの界面活性剤 が含まれていてもよい。
培養液中にベータセルリンムテインが分泌される場合には、 培養終了後、 自体公 知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれる本発明のポリべ プチドの精製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができ る。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用 する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および SDS—ポリアクリルアミド ゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグ ラフィ一などの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィーなど の特異的親和性を利用する方法、 逆相高速 ί夜体ク口マトグラフィ一などの疎水性の 差を利用する方法、 等電点電気泳動法やクロマトフォーカシングなどの等電点の差 を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる本発明のベー夕セルリンムティンが遊離体で得られた場合に は、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離 体または他の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生する本発明のベ一夕セルリンムテインを、 精製前または精製 後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ベー夕 セルリンムテインを部分的に除去することもできる。 蛋白修飾酵素としては、 例え ば、 卜リブシン、 キモ卜リプシン、 アルギニルエンドべプチダ一ゼ、 プロテインキ ナーゼ、 グリコシダ一ゼなどが用いられる。
得られるベー夕セルリンムテインは、 例えば、 特開平 1 0— 1 9 1 9 8 9号公報 等に記載のリフォールデイング工程に付してもよい。 また、 N末端に M e tが付加 したべ一夕セルリンムテインを特開平 1 0— 1 9 1 9 8 9号公報等に記載の N末 端の M e tの除去反応に付すことにより、 N末端の M e tを除去することもでき る。
かくして生成する本発明のベ一夕セルリンムテインの存在は特異抗体を用いた ェンザィムィムノアッセィなどにより測定することができる。 本発明のベー夕セルリンムテインをコードする D NAまたは本発明のベー夕セ ルリンムテインもしくはその塩は、糖尿病（例えば、ィンシュリン依存性糖尿病（ I 型糖尿病） など） 、 糖尿病における塍臓機能障害、 老人性のインシュリン分泌低下 に伴う陴臓機能低下症などの改善剤および未分化型塍臓ガンなど （特に糖尿病 （例 えば、 インシュリン依存性糖尿病など） の予防 ·治療薬など） の医薬の開発に用い ることができる。
さらに、 本発明のベ一夕セルリンムティンもしくはその塩またはそれをコ一ドす る D NAは E G F活性が減弱されていることおよび抗原性の問題がないことから、 安全で低毒性な医薬として有用である。 本発明のベー夕セルリンムテインもしくは その塩またはそれをコードする D NAは、 糖尿病 （例えば、 インシュリン依存性糖 尿病） 、 糖尿病における塍臓機能障害、 老人性のインシュリン分泌低下に伴う滕臓 機能低下症などの改善剤および未分化型塍臓ガンなどの疾病の治療 ·予防剤として 用いることができる。
本発明のベー夕セルリンムティンもしくはその塩またはそれをコードする D N Aを上述の医薬として使用する場合、 常套手段に従って実施することができる。 例 えば、 必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に 許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用 できる。 例えば、 該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、 香味剤、 賦 形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認められた製剤に要 求される単位用量形態で混和することによつて製造することができる。 これら製剤 における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするもので ある。
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えばゼラチン、 コーンスターチ、 トラガントガム、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口一 スのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリンのよう な甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いら れる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料にさらに油脂の ような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射用水のよ うなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産出植物油などを溶 解または懸濁させるなどの通常の製剤製造法にしたがって処方することができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含 む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムなど） などがあげられ、 適当な溶解補助剤、 たとえばアルコール （たとえばエタノール） 、 ポリアルコール （たとえばプロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非 イオン性界面活性剤 （たとえばポリソルベート 8 0 (TM) 、 H C O— 5 0 ) など と併用してもよい。 油性液としてはゴマ油、 大豆油などがあげられ、 溶解補助剤と して安息香酸べンジル、 ベンジルアルコールなどと併用してもよい。 また、 緩衝剤（例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液） 、 無痛化剤（例 えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒ卜血清 アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコ一 ル、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調製された注射液は通 常、 適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えばヒトゃ哺乳動物 (例えば、 マウス、 ラット、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィ ヌ、 サル、 マントヒヒ、 チンパンジーなど） に対して投与することができる。 本発明のベー夕セルリンムテインもしくはその塩の投与量は、 症状などにより差 異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に成人の糖尿病患者 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 1から 100mg、 好ましくは約 1. 0から 50m g、 より好ましくは約 1. 0から 20mgである。 非経口的に投与する場合は、 そ の 1回投与量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 た とえば注射剤として、 成人の糖尿病患者 （体重 60 kgとして） に対し、 一日につ き約 0. 01から 30mg程度、 好ましくは約 0. 1から 2 Omg程度、 より好ま しくは約 0. 1から 1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他 の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。 本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I U P AC - I UB Co mm i s s i'on on B i o chemi c a l Nome n c 1 a t u r eによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくもので あり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に 明示しなければ L体を示すものとする。
DNA デォキシリボ核酸
c DNA 相補的デォキシリボ核酸
A ァテニン
T チミン
G グァニン
C シ卜シン EDTA ：エチレンジァミン四酢酸
APMS F ： (p—アミジノフエニル)
SDS ： ドデシル硫酸ナトリウム
TF A ： 卜リフルォロ酢酸
G 1 y ： グリシン
A 1 a ：ァラニン
Va 1 ：バリン
L e u ：ロイシン
I 1 e ：イソロイシン
S e r ：セリン
Th r ：スレオニン
C y s ：システィン
Me t ：メチォニン
G 1 u ：グル夕ミン酸
As ：ァスパラギン酸
L y s ： リジン
A r g ：アルギニン
H i s ： ヒスチジン
Ph e ： フエ二ルァラニン
T y r ：チロシン
T r p ： トリプトファン
P r o ：プロリン
A s n ：ァスパラギン
G 1 n ：ダル夕ミン
NMP ： N—メチルピロリドン また、 本明細書中で繁用される置換基、 る。
Me ：メチル基
E t ：ェチル基 Bu ブチル基
P h フエニル基
TC チアゾリジン一 4 (R) —カルボキサミド基
Bom ベンジルォキシメチル
PAM フエニルァセトアミドメチル
T o s p—トルエンスルフォニル
HONB N—ヒドロキシ一 5—ノルボルネンー 2， 3—ジカルボキシイミド B z 1
Z ベンジルォキシカルボニル基
B r -Z 2一ブロモベンジルォキシカルボニル基
C 1 -z
B o c t一ブチルォキシカルボニル基
HOB t 1—ヒドロキシベンズトリアゾ一ル
DCC TFA トリフルォロ酢酸
Fm o c N- 9一フルォレニルメトキシカルボニル基
DNP ジニトロフエニル基
Bum 夕ーシャリーブ卜キシメチル基
T r t トリチル基 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
本発明のベ一夕セルリンムテイン （BTC 1— 77) のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 2〕
本発明のベー夕セルリンムテイン （BTC 1— 76) のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 3〕
本発明のベ一夕セルリンムテイン （BTC 3 1— 77) のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 4〕
本発明のベ一夕セルリンムテイン （BTC 31— 76) のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 5〕
本発明のベ一夕セルリンムテイン （BTC 1— 76、 78 - 80) のアミノ酸配 列を示す。
〔配列番号： 6〕
本発明のベ一夕セルリンムテイン （BTC 1— 76、 78、 79) のアミノ酸配 列を示す。
〔配列番号： 7〕
本発明のベ一夕セルリンムテイン （BTC 1_76、 78) のアミノ酸配列を示 す。
〔配列番号： 8〕
本発明のベー夕セルリンムテイン （BTC l— 77、 79、 80) のアミノ酸配 列を示す。
〔配列番号： 9〕
本発明のベ一夕セルリンムテイン （BTC 1— 77、 80) のアミノ酸配列を示 す。
〔配列番号： 10〕
本発明のベ一夕セルリンムティン （BTC 31— 76、 78 - 80) のアミノ酸 配列を示す。
〔配列番号： 11〕
本発明のベー夕セルリンムテイン （BTC 31— 76、 78、 79) のアミノ酸 配列を示す。
〔配列番号： 12〕
本発明のベ一夕セルリンムテイン （BTC31— 76、 78) のアミノ酸配列を 示す。
〔配列番号： 13〕
本発明のベ一夕セルリンムテイン （BTC 31— 77、 79、 80) のアミノ酸 配列を示す。
〔配列番号： 14〕
本発明のベ一夕セルリンムティン （BTC 31 - 77, 79) のアミノ酸配列を 示す。
〔配列番号： 15〕
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列で表されるベー夕セルリンムテインをコ一 ドする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 16〕
配列番号： 2で表されるアミノ酸配列で表されるベー夕セルリンムテインをコ一 ドする c DN Αの塩基配列を示す。
〔配列番号： 17〕
配列番号： 3で表されるアミノ酸配列で表されるベー夕セルリンムテインをコ一 ドする c DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 18〕
配列番号： 4で表されるアミノ酸配列で表されるベー夕セルリンムティンをコー ドする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 19〕
配列番号： 5で表されるアミノ酸配列で表されるベ一夕セルリンムテインをコ一 ドする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 20〕
配列番号： 6で表されるアミノ酸配列で表されるベ一夕セルりンムティンをコー ドする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 21〕
配列番号： 7で表されるアミノ酸配列で表されるベ一夕セルリンムティンをコー ドする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 22〕
配列番号： 8で表されるアミノ酸配列で表されるベ一夕セルリンムテインをコ一 ドする cDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 23〕
配列番号： 9で表されるアミノ酸配列で表されるベータセルリンムティンをコー ドする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 24〕 配列番号： 10で表されるアミノ酸配列で表されるベ一夕セルリンムテインをコ ―ドする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 25〕
配列番号： 11で表されるアミノ酸配列で表されるベー夕セルリンムテインをコ —ドする cDN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 26〕
配列番号： 12で表されるアミノ酸配列で表されるベー夕セルリンムテインをコ ―ドする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 27〕
配列番号： 13で表されるアミノ酸配列で表されるベ一夕セルリンムテインをコ 一ドする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 28〕
配列番号： 14で表されるアミノ酸配列で表されるベー夕セルリンムテインをコ —ドする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 29〕
後述の実施例 1および実施例 4で用いられたプライマー 1の塩基配列を示す。 〔配列番号： 30〕
後述の実施例 1および実施例 4で用いられたプライマ一 2の塩基配列を示す。 〔配列番号： 31〕
後述の実施例 10および実施例 27で用いられたプライマー R I一 1の塩基配 列を示す。
〔配列番号： 32〕
後述の実施例 10および実施例 27で用いられたプライマー R I一 3の塩基配 列を示す。
〔配列番号： 33〕
後述の実施例 10および実施例 27で用いられたプライマー R I— 1 C 1 aの 塩基配列を示す。
〔配列番号： 34〕
後述の実施例 10および実施例 27で用いられたプライマ一 R I— 3Xhoの 塩基配列を示す。
〔配列番号： 35〕
ベー夕セルリンのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 36〕
ベ一タセルリンをコ一ドする c DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 37)
本発明のベータセルリンムテイン （BTC2— 76) のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 38〕
本発明のベ一夕セルリンムテイン （BTC24— 76) のアミノ酸配列を示す。 〔配列番号： 39〕
後述の実施例 13で用いられたプライマ一 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 40〕
後述の実施例 13および実施例 16で用いられたプライマー 4の塩基配列を示 す。
〔配列番号： 41〕
後述の実施例 16で用いられたプライマ一 5の塩基配列を示す。
〔配列番号： 42〕
配列番号： 37で表されるアミノ酸配列で表されるベータセルリンムテインをコ ―ドする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 43〕
配列番号： 38で表されるアミノ酸配列で表されるベ一夕セルリンムテインをコ 一ドする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 44〕
本発明のベー夕セルリン改変分子 （BTC31— 58, As n， P r o, S e r, 59— 80) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 45〕
本発明のベータセルリン改変分子 （As n, S e r， As p, S e r， G 1 u, BTC 38— 80) のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 46〕 jのべ一夕セルリン改変分子 （BTC 1— 58， As n, P r o, S e r , - 80) のアミノ酸配列を示す。
£列番号： 47〕
配列番号： 46に示されるアミノ酸配列で表されるベ一夕セルリン改変分子を コードする c DN Αの塩基配列を示す。
〔配列番号： 48〕
配列番号： 44に示されるアミノ酸配列で表されるベー夕セルリン改変分子を コードする cDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 49〕
配列番号： 45に示されるアミノ酸配列で表されるベ一夕セルリン改変分子を コードする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 50〕
後述の参考例 1および実施例 22で用いられたプライマ一 BT— 95 hの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 51〕
後述の参考例 1および実施例 23で用いられたプライマ一 B T— 94 hの塩基 配列を示す。
〔配列番号： 52〕
後述の実施例 22で用いられたプライマ一 PET— 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 53〕
後述の実施例 22で用いられたプライマー BTC— 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 54〕
後述の実施例 22で用いられたプライマー BTC— 2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 55〕
後述の実施例 22で用いられたプライマー BTC— 3の塩基配列を示す。
〔配列番号： 56〕
後述の実施例 23で用いられたプライマー BTC— 7の塩基配列を示す。 後述の実施例 1で得られた形質転換体大腸菌 [ェシエリヒア コリ （E s c h e r i c h i a c o l i ) ] MM 294 (DE 3) /p TC I I BTC77は、 受託番号 FERM BP— 6584として 1998年 1 1月 24日付で通産省ェ 業技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH； 日本国茨城県つくば巿東 1一 1一 3) に寄託されている。 また 1998年 1 1月 2日付で受託番号 I FO 162 14として財団法人発酵研究所 （I FO； 日本国大阪府大阪市淀川区十三本町 2 - 17 -85) に寄託されている。
後述の実施例 4で得られた形質転換体大腸菌 [ェシエリヒア コリ （E s c h e r i c h i a c o l i ) ] MM294 (DE 3) ZpTC I I BTC76は、 受託番号 FERM BP— 6583として 1998年 1 1月 24日付で通産省ェ 業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。 また 1998年 1 1月 2日 付で受託番号 I F〇 16213として財団法人発酵研究所 （ I F〇） に寄託さ れている。
後述の実施例 13で得られた形質転換体大腸菌 [ェシエリヒア コリ （E s c h e r i c h i a c o l i ) ] MM 294 (DE 3) /p TC I I BTC2 - 76は、 受託番号 FERM BP— 6948として 1999年 1 1月 24日付で 通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。 また 1999年 1 1月 9日付で受託番号 I F 0 16334として財団法人発酵研究所 （ I F〇） に寄託されている。
後述の実施例 16で得られた形質転換体大腸菌 [ェシエリヒア コリ （E s c h e r i c h i a c o l i) ] MM 294 (DE3) /pTC I I BTC24 —76は、 受託番号 FERM BP— 6949として 1999年 1 1月 24日付 で通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。 また 1999年 1 1月 9日付で受託番号 I FO 16335として財団法人発酵研究所（ I FO) に寄託されている。
後述の参考例 1で用いられたプラスミド pTB 1516を保持する E s c h e r i c h i a c o 1 i MM 294 (D E 3 ) / p L y s S , p T B 151せは、 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （N I BH) に 1992年 （平成 4年） 4月 21日から受託番号 FERM BP— 3836として寄託され、 また財 団法人発酵研究所に 1992年（平成 4年） 4月 16日から受託番号 I F〇 15 282として寄託されている。 以下に実施例および参考例を示し、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本 発明の範囲を限定するものではない。 実施例 1
77残基型 （C末端 3残基欠失型） ベー夕セルリン発現株の構築
77残基型 （C末端 3残基欠失型） ベー夕セルリン発現プラスミドを、 以下の ように構築した 〔図 1〕 。
77残基型 （C末端 3残基欠失型） ベ一夕セルリンの構造遺伝子を、 ベ一夕セ ルリン発現プラスミド ρ Β〇41 [S e η οら； G r ow t h Fa c t o r s, 13 : 181 (1996) ] より、 構造遺伝子の上流に隣接して N d e I切断部 位及び開始コドンを持つプライマ一 1 ( 5'— CATATGGATGGGAATT CCACCAGAAGTCCTG) 、 及び 77番目のァスパラギン酸の後に終止 コドン及び Bam H I切断部位を持つプライマ一 2 ( 5 '- G G AT C C C T A GTCAACTCTCTCACACCTTGCTCC) を用いて、 PCRで増幅 した。 PCRにより増幅した遺伝子を、 TA o r i g i n a l c l on i ng k i t (インヴィ トロジェン社製） を用いて pCR2. 1ベクタ一に連結し、 p CR 2. 1/BTC77を作製した。 これを大腸菌 J M 109に導入し、 アンピ シリン耐性と 3—ガラクトシダーゼ活性を指標として形質転換体を選択した。 p CR2. 1/BTC 77を有する形質転換体を培養し、 Q I Ap r e p 8 M i n i p r e p k i t (キアゲン社製） を用いて pCR2. 1/BTC 77を調製し た。
PBR322を Nd e Iで切断、 T4 DN Aポリメラ一ゼ（DNA B 1 u n t i ng k i t, 宝酒造株式会社製） で末端を平滑化し、 再度連結する事によつ て、 Nd e I認識部位を欠損させた p BRd e s Nd eを作製した。 p ET 3 c を Bg l I I— Ec o RVで切断し、 約 0. 26 k b pの断片を回収した後、 T4 DNAポリメラ一ゼで末端を平滑化し、 pBRd e s Nd eの S c a I断 片と連結して、 PBRZT7 d e sNd eを作製した。 また、 部位特異的変異導 入 （Qu i c k Ch ange, S TR AT A GENE社製） により、 p BR 32 2の B am H I認識部位を欠損させた p B R 322 d e s B amを作製した。 p BR 322 d e s B amの S p h I— Ec o RV断片を pBRZT7 d e s Nd eのS ph I— Ec o RV断片と連結して、 テトラサイクリン耐性発現べ クタ一 pTC I Iを作製した。 PCR2. 1/BTC 77を Nd e I及び B am H Iで切断してァガロース電気泳動を行い、約 240 bpの 77残基型べ一夕セ ルリン構造遺伝子を Q I Aq u i c k S p i n Pu r i f i c a t i on K i t (キアゲン社製） を用いて回収した。 発現ベクター pTC I Iを Nd e I及 び B am H Iで切断してァガロース電気泳動を行い、 同様に約 4. 6 k b pの バンドを回収した。 77残基型べ一夕セルリン構造遺伝子を発現べクタ一 pTC I Iの Nd e I— B am H I断片と連結した後、 大腸菌 J M 109に導入して テ卜ラサイクリン耐性で形質転換株を選択し、 その株より再度プラスミドを回収 して、 発現プラスミド pTC I I BTC 77とした。
この pTC I I BTC 77を大腸菌 MM 294 (DE 3) に導入して、 テトラ サイクリン耐性で形質転換株を選択し、 77残基型べ一夕セルリン発現株 MM 2 94 (DE 3) /pTC I I BTC 77を取得した。 実施例 2
77残基型べ一夕セルリン発現株の培養
77残基型べ一夕セルリン発現株 MM 294 (DE 3) /pTC I I BTC 7 7を 1 OmgZLのテトラサイクリンを含む LB培地（1 % ペプトン、 0. 5% 酵母エキス、 0. 5% 塩化ナトリウム） 1リットルで 30°C 1 6時間培養した。 得られた培養液 1 5 OmLを主発酵用培地（1. 68% リン酸一水素ナトリウム、 0. 3 % リン酸二水素ナトリウム、 0. 1 % 塩化アンモニゥム、 0. 05% 塩ィ匕ナトリウム、 0. 024% 硫酸マグネシウム、 0. 02% ニューポール L B— 625、 0. 0005% 塩酸チアミン、 1. 5% ブドウ糖、 1. 0 % カザ ミノ酸、 1. 0% イーストエキス） 1. 5リットルを仕込んだ 2 L容ジャーファ —メンターに移植して、 37°C、 通気量 2 L/m i n、 撹拌回転数 500 r p mで通気撹拌培養を開始した。 培養液の濁度が約 1200クレツト単位になった 時点で、 5. 95mgZL分のイソプロピル— D—チォガラクトビラノシド (I PTG) を添加した。 I PTG添加時、 添加後 1， 2. 5時間に 0. 75% のグルコースを添加し培養開始 9時間後まで培養を行った。 培養液を 1 0000 r pmで 30分間遠心分離を行い、 菌体を集めた。 実施例 3
Me t - 77残基型べ一夕セルリンの精製
実施例 2で得られた菌体 5 gに Ιπιλΐ EDTA、 1 mM APMS F及び 7 M グァニジン塩酸塩を含む 0. 1M T r i s— HC 1 (pH8. 0) 1 OmL を加え、 4°Cで一晩攪拌し抽出を行った後、 遠心分離 （1 0000 r pm、 20 分間） を行った。 得られた上清液 1 OmLに◦. 5mM 酸化型グル夕チオン、 1 mM 還元型グル夕チオン、 ImM EDTA、 0. 1 M アルギニン塩酸塩及び 2 M 尿素を含む 5 OmM T r i s -HC 1 (pH8. 0) 25 OmLを加え、 4で でー晚リフォールディングを行った後。 遠心分離 （10000 r pm、 20分間） を行い、遠心上清液 26 OmLを得た。 この遠心上清液を YM 3膜（分画分子量： 3000、 ミリポア社） を用いて濃縮を行った。 濃縮脱塩液 8 OmLに 2 M尿素 を 12 OmL加えた後、 塩酸で pH5. 0に調整した。 遠心分離 （10000 r pm、 20分間） を行い、 得られた遠心上清液を 5 OmM酢酸ナトリウム緩衝液 ( H 5. 0) で平衡化した S P—トヨパール 650Mカラム （2. 2 cmX 1 2 cm、 東ソ一社） に毎分 1 OmLの流速で吸着させ、 平衡化に用いた緩衝液で よく洗浄した後、 0 から 1. 0Mの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出を 行った。 Me t— 77残基型べ一夕セルリンを含む画分を集め、 その 1/3量を 0. 1 %トリフルォロ酢酸で平衡化した C 4 P— 50カラム （ 1. 0 cmX 2 5 cm、 昭和電工社） に吸着させ、 1 3. 5%から 2 1. 2%のァセトニトリル 直線濃度勾配により Me t— 77残基型べ一夕セルリンを溶出した。 同じ操作を さらに 2回行い得られた溶出液を 0. 02 %トリフルォロ酢酸で透析し、 凍結 乾燥を行った。 凍結乾燥粉末を蒸留水 1 OmLで溶解し、 酢酸型にした AG 1— X8カラム （1. O cmX 10 cm、 日本バイオラッド社） を通過させた後、 再 度凍結乾燥を行い Me t一 77残基型べ一夕セルリン 8 mgを得た。 実施例 4
76残基型 （C末端 4残基欠失型） ベータセルリン発現プラスミドの構築 76残基型 （C末端 4残基欠失型） ベー夕セルリンの発現プラスミドは以下の ように構築した 〔図 2〕 。
76残基型 （C末端 4残基欠失型） ベー夕セルリンの構造遺伝子を、 実施例 1 で構築した pTC I I/BTC 77より、 構造遺伝子の上流に隣接して Nd e I切断部位及び開始コドンを持つプライマー 1 (5'— CATATGGATGGG AATTCCACCAGAAGTCCTG) 及び 76番目のバリンの後に終止コ ドン及び B am H I切断部位を持つプライマ一 2 ( 5 '- G G AT C C C T A A した。 PCRにより増幅した遺伝子を、 TA o r i g i n a l c l on i ng k i t (インヴィ トロジェン社製） を用いて pCR2. 1ベクターに連結し、 p CR 2. 1ZBTC 76を作製した。 これを大腸菌 J M 109に導入し、 アンピ シリン耐性と 0—ガラク卜シダ一ゼ活性を指標として形質転換体を選択した。 p CR 2. 1/BTC 76を有する形質転換体を培養し、 Q I Ap r e p 8 M i n i p r e p k i t (キアゲン社製） を用いて pCR2. 1/BTC 76を調製 した。
p CR 2. 1ZBTC 76を Nd e I及び B am H Iで切断してァガロース 電気泳動を行い、約 240 bpの 76残基型べ一夕セルリン構造遺伝子を Q I A qu i c k S p i n Pu r i f i c a t i on K i t (キアゲン社製） を用い てを回収した。実施例 1で調製した発現ベクター pTC I Iを Nd e I及び B a m H Iで切断してァガロース電気泳動を行い、 同様に約 4. 6 kbpのバンドを 回収した。 76残基型べ一夕セルリン構造遺伝子を発現べクタ一 pTC I Iの N d e I -B am H I断片と連結した後、 大腸菌 JM109に導入してテトラサ イクリン耐性で形質転換株を選択し、 その株より再度プラスミドを回収して、 発 現プラスミド pTC I I BTC 76とした。
この pTC I I BTC76を大腸菌 MM 294 (DE 3) に導入して、 テトラ サイクリン耐性で形質転換株を選択し、 76残基型べ一夕セルリン発現株 MM2 94 (DE3) /pTC I I BTC 76を取得した。 実施例 5
76残基型べ一夕セルリン発現株の培養
76残基型べ一夕セルリン発現株 MM294 (DE3) /pTC I I BTC 7 6を 1 Omg/Lのテトラサイクリンを含む LB培地（1 % ペプトン、 0. 5% 酵母エキス、 0. 5% 塩化ナトリウム） 1リットルで 30°C 16時間培養した。 得られた培養液を主発酵用培地（1. 68% リン酸一水素ナトリウム、 0. 3% リン酸二水素ナトリウム、 0. 1 % 塩化アンモニゥム、 0. 05% 塩化ナトリ ゥム、 0. 024% 硫酸マグネシウム、 0. 02 % ニューポール LB— 625、 0. 0005 % 塩酸チアミン、 1. 5% ブドウ糖、 1. 0% カザミノ酸、 1. 0% イーストエキス） 20リットルを仕込んだ 50 L容発酵槽に移植して、 3 7°C、 通気量 20 L/m i n、 撹拌回転数 210 r p mで通気撹拌培養を開始し た。 培養液の濁度が約 1200クレット単位になった時点で、 5. 95mg/L のイソプロピル一 3—D—チォガラク卜ビラノシド （I PTG) を添加した。 I PTG添加時、 添加後 2及び 3. 5時間にそれぞれ 0. 75%のグルコースを添 加し培養開始 1 1時間後まで培養を行った。 培養液を l O O O O r pmで 30分 間遠心分離を行い、 菌体 540 gを集めた。 実施例 6
Me t— 76残基型べ一夕セルリンの精製
実施例 5で得られた菌体 375 gに ImM EDTA、 1 mM APMS F及び 7 M グァニジン塩酸塩を含む 0. lM Tr i s— HC 1 (pH8. 0) 1. 0 Lを加え、 4 °Cで一晩攪拌し抽出を行った後、 遠心分離 （10000 r pm、 2 0分間） を行った。 得られた上清液 1. 0Lに 0. 5mM 酸化型ダル夕チオン、 ImM還元型グル夕チオン、 ImM EDTA、 0. 1M アルギニン塩酸塩及び 2M 尿素を含む 5 OmM T r i s— HC 1 (pH8. 0) 19Lを加え、 4。C でー晚リフォールディングを行った後、 遠心分離 （10000 r pm、 20分間） を行い、 遠心上清液 20 Lを得た。 この遠心上清液をペリコンカセットシステム (分画分子量： 5000、 ミリポア社） を用いて濃縮を行った。 濃縮脱塩液 3. 3Lに2M 尿素を13. 2 L加えた後、塩酸で pH 5. 0に調整した。 50mM 酢酸ナトリウム緩衝液（pH5. 0)で平衡化した POROS 50HSカラム（2. 2 cmx 1 2 cm、 日本パーセプティブ社） に毎分 3 OmLの流速で吸着させ、 平衡化に用いた緩衝液でよく洗浄した後、 0. 3Mから 1. 3Mの塩化ナトリウ ム直線濃度勾配により溶出を行った。 76残基型べ一夕セルリンを含む画分を集 め、 蒸留水で 3倍に希釈した後、 50 mM酢酸ナトリウム緩衝液 （pH4. 5) で平衡化した TS Kg e l CM— 5 PWカラム （2. 1 5 cmX 15 cm、 東ソ —社） に添加した。 Me t— 76残基型べ一夕セルリンが吸着した TSKg e 1 CM— 5 PWカラムを、 0. 24^1から0. 44 Mの塩化ナトリウム直線濃 度勾配により溶出を行った。 Me t— 7 6残基型べ一夕セルリンを含む画分を集 め、 0. 1 %トリフルォロ酢酸で平衡化した TS Kg e 1 〇DS— 120T力 ラム （2. 1 5 cmx 30 cm、 東ソ一社） に吸着させ、 1 7%から 24%のァ セトニトリル直線濃度勾配により Me t - 76残基型べ一夕セルリンを溶出した。 溶出液を 0. 02% トリフルォロ酢酸で透析し、 凍結乾燥を行った。 凍結乾燥 粉末を蒸留水 1 OmLで溶解し、 酢酸型にした AG 1—X8カラム （1. O cm X 10 cm, 日本バイオラッド社） を通過させた後、 再度凍結乾燥を行い Me t - 76残基型べ一夕セルリン 93mgを得た。 実施例 7
ベー夕セルリン改変体の特徴の決定
実施例 3で得られた Me t— 77残基型べ一夕セルリン及び実施例 6で得られ た Me t— 76残基型べ一夕セルリンの特徴を以下のように決定した。
a) SDS—ポリアクリルアミド電気泳動を用いた分析
ベ一夕セルリン改変体及び特開平 10— 1 91989号に記載の方法により調 製した Me t— 80残基型べ一夕セルリンをサンプルバッファ一 （125mM T r i s -HC 1 % ドデシル硫酸ナトリウム、 1 5 % グリセロール、 5% 2—メルカプトエタノール、 0. 005 % ブロムフエノールブル一） で懸濁し、 マルチゲル 1 5 Ζ25 (第一化学薬品） で電気泳動を行った。 泳動後のゲルをラ ピッド CBB ΚΑΝΤΟ (関東化学社） で染色を行ったところ、 いずれもほ ぼ単一バンドであった 〔図 3〕 。
b) アミノ酸組成分析
ベータセルリン改変体を 4%チォグリコール酸を含む 6 N塩酸で 1 10° (：、 2 4及び 48時間気相加水分解を行い、 アミノ酸分析計 （日立 L一 8500AAm i n o Ac i d A n a 1 y z e r ) を用いてアミノ酸組成を決定した。 その 結果、 いずれの改変体も開始コドン ATGに由来するメチォニンを含み、 cDN A塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した 〔表 1, 表 2〕 。
〔表 1〕 77残基型ベータセルリンのアミノ酸組成分析
1モル当たりの残基数 理論値
Asx 7. 2 7
Thr 6. 0 6
Ser 4. 6 5
Glx 9. 1 9
Pro 3. 9 4
Gly 7. 1 7
Ala 4. 0 4
Val 3. 7 4
Met 0. 9 1
lie 2. 0 2
Leu 2. 1 2
Tyr 3. 0 3
Phe 2. 1 2
Lys 5. 0 5
His 3. 0 2
Arg 6. 8 7
Cys ND 8 〔表 2〕 76残基型ベータセルリンのアミノ酸組成分析
Figure imgf000046_0001
c ) N末端アミノ酸配列分析
N末端アミノ酸配列分析を気相プロテインシーケンサ一 （アプライドバイオシ ステムズ モデル 4 7 7 A) を用いて決定した。 その結果、 いずれの改変体も c D N A塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一致した。 いずれの改変体も 8 0 残基型と同様に開始コドン A T Gに由来するメチォニンを N末端に有していた 〔表 3， 表 4〕 。 〔表 3〕 77残基型ベータセルリンの N末端アミノ酸配列分析
Figure imgf000047_0001
d) C末端アミノ酸分析
気相ヒドラジン分解法 （100° (：、 6時間） により、 C末端アミノ酸をァミノ 酸分析計 （日立 L— 8500 AAm i n o Ac i d An a l y z e r) を用 いて決定した。 Me t— 77残基型べ一夕セルリンではァスパラギン酸が、 Me t一 76残基型べ一夕セルリンではバリンカ S検出された 〔表 5， 表 6〕 。 〔表 5〕
77残基型ベータセルリンの C末端アミノ酸分析
Asp (収率： 32.5%)
〔表 6〕
76残基型ベータセルリンの C末端アミノ酸分析
Val (収率： 77. 8%) 実施例 8
3 T 3細胞を用いた増殖促進活性の測定
モレキュラー 'セル ·バイオロジー、 8巻、 588 ( 1988) に記載のごと く、 静止状態の 3 T 3 A31— 714クローン 4 (ィン夕ーナショナル ·ジャー ナル ·ォブ ·キャンサ一、 12巻、 463 ( 1973) ) 中への3 H—チミジンの 取り込みによつて増殖促進活性を測定した。
すなわち、 5% ゥシ血清を含むダルベッコ改変イーグル MEM培地を用いて、 1000細胞 ZmLになるように懸濁した 3 T 3 A 31 - 714クローン 4を 96ゥエルプレートに 100 Lづっ播き、 炭酸ガスインキュベーター内 （5% 炭酸ガス、 95%空気） において 37 °Cで 1日培養した。 上清 75 / Lを抜き取 り、 血清を含まないダルベッコ改変イーグル MEM培地を 100 L加える事に より血清濃度を 1 %にした。 さらに 2日間培養した後、 種々の濃度の実施例 3で 調製した Me t― 77残基型べ一夕セルリン、 実施例 6で調製した Me t - 76 残基型べ一夕セルリン及び特開平 10— 191989号に記載の方法により調製 した Me t— 80残基型べ一夕セルリンを添加した。添加 16時間後に3 H—チミ ジン [アマ一シャム ·フアルマシア ·バイオテク] を 0. 25 C i /we 1 1 加え、 その 4時間後に細胞を PBSで 3回洗浄した後、 5% SDSを 100 /iL 加え細胞を溶解した。 細胞溶解液をシンチレーシヨンバイアルに移し、 シンチレ —夕一 A (和光純薬社） を lmL加え、 シンチレーシヨンカウン夕一で3 H—チミ ジンの細胞への取り込みを測定した 〔図 4〕 。 実施例 9 AR42 J細胞を用いた /3細胞分化促進活性の測定
化学発癌剤で誘発された塍臓癌由来細胞株 A R 42 J [Ch i r i s t oph e ；アメリカン 'ジャーナル 'ォブ · フイジォロギ一 （Am. J. Phy s i o 1. ) , 266 : G963 (1994) ] を、 実施例 3で調製した Me t - 77 残基型べ一夕セルリン、 実施例 6で調製した Me t— 76残基型べ一夕セルリン または特開平 10— 191989号に記載の方法により調製した Me t— 80残 基型べ一夕セルリン及び 10 %ゥシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル ME M培地を用いて 105細胞 ZmLになるように懸濁し、 500 をチャンバース ライドに播き、 炭酸ガスインキュベータ一内 （5% 炭酸ガス、 95%空気） に おいて 37 °Cで 5日間培養した。 5日後に細胞を PBSで 1回洗浄した後に、 1 0 %ホルムアルデヒドで固定し、 0. 1 % トライトン X— 100で 5分間処理し た後に、 ブロックエース （雪印、 日本） を添加し室温で 40分間ブロッキングを 行った。 10% ブロックエースで希釈した抗インスリン抗体 （アドバンスド 'ィ ムノ ·ケミカル社） を添加し室温、 40分間反応した。 0. 1 % トライトン X— 100を添加し室温 5分間放置した後、 P B Sで 3回洗浄した。 10 % ブロック エースで希釈した F I TC (F l uo r e s c e i n I s o t h i o c y an a t e) 標識抗マウス I gG抗体 （カッペル社） を添加し、 室温で 40分間反応 した。 0. 1 %トライトン X— 100を添加し室温 5分間放置した後、 PBSで 3回洗浄し、 蛍光顕微鏡で観察した。 いずれのベー夕セルリンを添加した場合に おいても、 蛍光染色された細胞、 すなわちインスリンを産生する /3細胞に分化し た細胞が観察された 〔図 5〕 。 実施例 10
ヒト胎盤アル力リフォスファ夕ーゼ遺伝子発現べクタ一の構築
3細胞への分化促進活性はインスリンプロモー夕一の下流にレポ一夕一として アルカリフォスファタ一ゼを連結したものにより形質転換された AR 42 J細胞 を用いても実施した。 すなわちべ一夕ーセルリンにより /3細胞へと分化した細胞 はアルカリフォスファタ一ゼを産生し、 このアルカリフォスファタ一ゼの活性を 測定することにより 3細胞への分化促進活性を定量的に測定することが可能であ る。
ラット尾から常法に従ってゲノム DNAを調製した。 この DNAをテンプレー トとして、 既報のラッ卜インスリン I I遺伝子プロモータ一の塩基配列 （Gen Ban k : Ac c e s s i on No. J 00748) をもとに合成したプライ
を用いて PCR法によりインスリンプロモー夕一領域 0. 75Kbを増幅した。 さらに、 この P CR産物をテンプレートとしてプライマ一 R I— 1 C 1 a [5，
用いて PCRを行った。 増幅された 0. 75Kb DNA断片を単離し、 pT7 B l u eベクター （Nov a g e n 69820— 1) に組み込んで得られたプ ラスミド pTB 1881を用いてクローニングされた断片の塩基配列を決定し、 ラットインスリンプロモ一夕一であることを確認した。 プラスミド pTB 188 1を Xho I— C l a Iで切断してラットインスリンプロモ一夕一である 0. 73 k b DNA断片を得た。 次にヒト胎盤アルカリフォスファタ一ゼ （PL A P) をコードする 2. 0 k b c DNA (J. B e r g e rら、 Ge n e 6 6， 1 ( 1988) ) の発現プラスミド PTB 1330を Xho I— H i nd I I Iで切断して得られた 2. 7 k b DNA断片 （PLAPcDNA、 SV4 0由来スプライシング部位およびポリ A付加部位、 p B R 322由来 o 1- iおよ びアンピシリン耐性遺伝子を含む） を単離し、 前述のラットインシュリンプロモ 一夕一領域 0. 73 kb Xho I— C l a I断片を T 4 D N Aリガーゼ反応 によって連結してプラスミド pTB 1898を得た。 実施例 1 1
?し八？発現八尺42 J細胞の構築
AR42 J細胞に PL A P発現プラスミド pTB 1898と Tn 5の ne or 遺伝子を含むプラスミド pMCn e opo l y A (STRATAGENE) を トランスフエクシヨン試薬 T r a n s I TTM— LT 1 (M i r u s、 P e nVe r a Co r p o r a t i o n)を用いて同時に導入した。導入後の細胞は 10% 牛胎児血清を加えた DMEMで 2日間培養した後、 G418 (ゲネテシン、 G I BCO BRL) 800 g/mLを添加した選択培地に加えて培養を続けた。 G418耐性となって生育した細胞を限界希釈法によりクローンを単離した。 各クローンの細胞を 24穴プレートに播き、 Me t— 80残基型べ一夕セルリ ンを 20 n gZmL添加および無添加で 4日間培養し、 培養上清を集めて 6 5°C30分間熱処理を行った後、 培地中のアルカリフォスファタ一ゼ活性を測定 した。 80残基型べ一夕セルリン添加時にアルカリフォスファタ一ゼ活性の上昇 が認められるクローンを選択した。 いくつかのクローンの結果を以下の 〔表 7〕 に示す。
〔表 7〕
Figure imgf000051_0001
実施例 12
PLAP発現 AR42 J細胞を用いた; 3細胞分化促進活性の測定
実施例 1 1で構築した PLAP発現 AR 42 J細胞を、 各種濃度の実施例 3で 調製した Me t— 77残基型べ一夕セルリン、 実施例 6で調製した Me t - 76 残基型べ一夕セルリンまたは特開平 1 0— 1 9 1 9 8 9号に記載の方法により調 製した Me t— 80残基型べ一夕セルリン及び 10 %ゥシ胎児血清を含むダルべ ッコ改変イーグル MEM培地を用いて 1 05細胞 ZmLになるように懸濁し、 1 0 0 Lを 96ゥエルプレートに播き、 炭酸ガスインキュべ一夕一内 （5% 炭酸ガ ス、 9 5 % 空気） において 3 7°Cで 5日間培養した。 5日後に培養上清をサンプ リングし、 6 5 °Cで 3 0分間処理した後、 5 0 Lをあらかじめ 50 の 2 X SEAP (2 M ジエタノールァミン、 lmM MgC l 2、 20mM ホモアルギ ニン） を添加した 96ウェルマイク口プレートに加えた。 37T:で 10分間保つ た後、 2 OmgZmLの p—ニトロフエニルリン酸 （シグマ社） を 10 添 加し 37 °Cで 16時間反応を行った 〔図 6〕 。 Me t— 77残基型べ一夕セルリ ンおよび Me t一 76残基型べ一夕セルリンは Me t - 80残基型べ一夕セルリ ンとほぼ同じ分化誘導促進活性を示した。 実施例 13
2— 76残基型 （N末端 1残基、 C末端 3残基欠失型） ベー夕セルリン発現株 の構築
2— 76残基型 （N末端 1残基、 C末端 3残基欠失型） ベー夕セルリンの発現 プラスミドは以下のように構築した 〔図 7〕 。
2— 76残基型 （N末端 1残基、 C末端 3残基欠失型） ベータセルリンの構造 遺伝子を、 76残基型 （C末端 3残基欠失型） ベー夕セルリン発現プラスミド p TC I I BTC 76 [実施例 4] より、 2番目のグリシンの上流に瞵接して N d e I切断部位及び開始コドンを持つプライマ一 3 (5'-CAGCATATGG GGAATTC CACCAGAAGTCCT) 、 および C末端のバリンの後に終 止コドン及び B am H I切断部位を持つプライマー 4 (5， — GGATCCC で増幅した。 PCRにより増幅した遺伝子を、 TA o r i g i n a l c l on i n g k i t (インヴィ トロジェン社製） を用いて pCR2. 1ベクターに連結 し、 pCR2. 1 BTC 2— 76を作製した。 これを大腸菌 J M 109に導入し、 アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択した。 pCR2. 1 BTC2- 76を有する形質転換体を培養し、 Q I Ap r e p 8 M i n i p r e p k i t (キアゲン社製） を用いて PCR2. 1 BTC 2— 76を調製した。
pCR2. 1 BTC2— 76を Nd e I及び B am H Iで切断してァガ口一 ス電気泳動を行い、約 230 b pの 2— 76残基型べ一夕セルリン構造遺伝子を Q I AGEN g e l e x t r a c t i on k i t (キアゲン社製） を用いて回 収した。 発現ベクター PTC I I [実施例 1] を Nd e I及び Bam H Iで切 断してァガロース電気泳動を行い、 同様に約 4. 6 k b pのバンドを回収した。 2-76残基型べ一夕セルリン構造遺伝子を発現べクタ一 pTC I Iの Nd e I -B am H I断片と連結した後、大腸菌 J M 109に導入してテトラサイクリ ン耐性で形質転換株を選択し、 その株より再度プラスミドを回収して、 発現ブラ スミド pTC I I BTC2— 76とした。
この pTC I I BTC 2— 76を大腸菌 MM294 (DE 3) に導入して、 テ トラサイクリン耐性で形質転換株を選択し、 2— 76残基型べ一夕セルリン発現 株 MM 294 (DE 3) /p TC I I BTC 2 - 76を取得した。 実施例 14
2- 76残基型べ一夕セルリン発現株の培養
2— 76残基型べ一夕セルリン発現株 MM294 (DE 3) /pTC I I BT
C 2— 76を 1 OmgZLのテトラサイクリンを含む L B培地（ 1 % ペプトン、 0. 5% 酵母エキス、 0. 5% 塩化ナトリウム） 3 0111しで30° 16時間 培養した。 得られた培養液を主発酵用培地 （1. 68% リン酸一水素ナトリウム、 0. 3 % リン酸二水素ナトリウム、 0. 1% 塩化アンモニゥム、 0. 05% 塩化ナトリウム、 0. 012 % 硫酸マグネシウム、 0. 0007 % 塩酸チアミ ン、 1. 5% ブドウ糖、 1. 5% ハイケース） 20 OmLを入れた 1 L容マイ ヤー 6本に 1 Om 1ずつ移植して、 37° (：、 撹拌回転数 200 r pmで撹拌培養 を開始した。 培養液の濁度が約 160クレツト単位になった時点で、 5. 95 mg/L分のイソプロピル一 i3— D—チォガラクトビラノシド （I PTG) を添 加した。 I PTG添加後 4時間後まで培養を行った。 培養液を 9000 r pmで 30分間遠心分離を行い、 菌体 5. l gを集めた。 実施例 15
2-76残基型べ一夕セルリンの精製
実施例 14で得られた菌体 5 gに ImM EDTA、 ImM APMSF及び 7
M グァニジン塩酸塩を含む 0. lM T r i s— HC 1 (pH8. 0) 15mL を加え、 4°Cで一晩撹拌し抽出を行った後、 遠心分離 （9000 r pm、 10分 間） を行った。 得られた上清液 15mLに 0. 5mM 酸化型ダルタチオン、 lm M 還元型グル夕チオン、 ImM EDTA、 0. 1M アルギニン塩酸塩及び 2 M 尿素を含む 5 OmM T r i s— HC 1 (pH 8. 0) 250mLを加え、 4°C でー晚リフォールディングを行った後、 遠心分離 （ 10000 r pm、 10分間） を行い、 遠心上清液 265mLを得た。 この遠心上清液に 2M 尿素を 1 L加えた 後、 酢酸で pH5. 0に調整し、 4°Cでー晚静置した。 遠心分離 （10000 r pm、 10分間） を行い、 得られた遠心上清液を 5 OmM酢酸ナトリウム緩衝液 (pH5. 0) で平衡化した POROS 50HSカラム （2. 2 cmX 12 cm, 日本パ一セプティブ社） に毎分 3 OmLの流速で吸着させ、 平衡化に用いた緩衝 液でよく洗浄した後、 0. 3^1から 1. 3 Mの塩化ナトリウム直線濃度勾配によ り溶出を行った。 2— 76残基型べ一夕セルリンを含む画分を集め、 50 mM 酢酸ナトリウム緩衝液 （pH4. 5) で 3倍に希釈した後、 この緩衝液で平衡化 した TSKge l CM— 5 PWカラム （0. 75 cmX 7. 5 cm、 東ソ一社） に添加した。 2— 76残基型べ一夕セルリンが吸着した TS Kg e 1 CM— 5 P Wカラムを、 0. 3Mから0. 5 Mの塩化ナトリウム直線濃度勾配により溶出を 行った。 2— 76残基型べ一夕セルリンを含む画分を集め、 0. 1 % トリフルォ 口酢酸で平衡化した TSKg e 1 ODS— 120Tカラム （2. 15 cmX 30 cm、 東ソ一社） に吸着させ、 20%から 44%のァセトニトリル直線濃度勾配 により 2— 76残基型べ一夕セルリンを溶出した。 溶出液を凍結乾燥した後、 蒸 留水 5 mLで溶解し、 酢酸型にした AG 1—X8カラム （1. O cmX 10 cm、 日本バイオラッド社） を通過させた後、 再度凍結乾燥を行い 2— 76残基型べ一 夕セルリン 0. 7mgを得た。 実施例 16
24 - 76残基型 （N末端 23残基、 C末端 3残基欠失型） ベー夕セルリン発 現株の構築
24 - 76残基型 （N末端 23残基、 C末端 3残基欠失型） ベー夕セルリンの 発現プラスミドは以下のように構築した 〔図 8〕 。
24 - 76残基型 （N末端 23残基、 C末端 3残基欠失型） ベー夕セルリンの 構造遺伝子を、 実施例 4で調製した 76残基型 （C末端 3残基欠失型） ベータセ ルリン発現プラスミド pTC I I BTC 76より、 24番目のァラニンの上流に 隣接して Nd e I切断部位及び開始コドンを持つプライマ一 5 (5 ' 一 CAGC リンの後に終止コドン及び B am H I切断部位を持つプライマ一 4 (5 ' 一 GG て、 PCRで増幅した。 PCRにより増幅した遺伝子を、 TA o r i g i n a l c l on i ng k i t (インヴィ トロジェン社製） を用いて p C R 2. 1べク 夕一に連結し、 pCR2. 1 BTC 24 _ 76を作製した。 これを大腸菌 JM1 09に導入し、 アンピシリン耐性を指標として形質転換体を選択した。 pCR2. 1 BTC 24-76を有する形質転換体を培養し、 Q I Ap r e p 8 M i n i p r e p k i t (キアゲン社製） を用いて p CR 2. 1 BTC 24 - 76を調製し た。
pCR 2. 1 BTC 24— 76を Nd e I及び B am H Iで切断してァガロ —ス電気泳動を行い、 約 160 bpの 24— 76残基型べ一夕セルリン構造遺伝 子を Q IAGEN g e l e t r a c t i on k i t (キアゲン社製） を用い て回収した。実施例 1で調製した発現べクタ一 pTC I Iを Nd e I及び Bam H Iで切断してァガロース電気泳動を行い、 同様に約 4. 6 kb pのバンドを回 収した。 24— 76残基型べ一夕セルリン構造遺伝子を発現ベクター pTC I I の Nd e I -B am H I断片と連結した後、 大腸菌 J M 109に導入してテト ラサイクリン耐性で形質転換株を選択し、その株より再度プラスミドを回収して、 発現プラスミド p TC I I BTC 24— 76とした。
この pTC I I BTC 24— 76を大腸菌 MM294 (DE 3) に導入して、 テトラサイクリン耐性で形質転換株を選択し、 24— 76残基型べ一夕セルリン 発現株 MM294 (DE3) p T C I I B T C 24— 76を取得した。 実施例 17
24- 76残基型べ一夕セルリン発現株の培養
24 - 76残基型べ一夕セルリン発現株 MM 294 (DE 3) ZpTC I I B TC24— 76を 1 Omg/Lのテトラサイクリンを含む LB培地（1 % ぺプト ン、 0. 5% 酵母エキス、 0. 5% 塩化ナトリウム） 30mLで 30° (：、 16 時間培養した。 得られた培養液を主発酵用培地 （1. 68% リン酸一水素ナトリ ゥム、 0. 3% リン酸二水素ナトリウム、 0. 1 % 塩化アンモニゥム、 0. 0 5 % 塩化ナトリゥム、 0. 012 % 硫酸マグネシウム、 0. 0007 % 塩酸チ ァミン、 1. 5% ブドウ糖、 1. 5% ハイケース） 1501111^を入れた1し容 マイヤ一 5本に移植して、 37°C、 撹拌回転数 200 r pmで撹拌培養を開始し た。 培養液の濁度が約 160クレット単位になつた時点で、 5. 95mgZL分 のイソプロピル一 /3—D—チォガラクトピラノシド （I PTG) を添加した。 I PTG添加後 4時間後まで培養を行った。 培養液を 10000 r pmで 30分間 遠心分離を行い、 菌体 3. 9 gを集めた。 実施例 18
24 - 76残基型べ一夕セルリンの精製
実施例 5で得られた菌体 3. 9 gに lmM EDTA、 ImM APMSF及び 7 M グァニジン塩酸塩を含む 0. lM T r i s— HC 1 (pH8. 0) 12m Lを加え、 4 °Cで一晩撹拌し抽出を行った後、 遠心分離 （9000 r pm、 10 分間） を行った。 得られた上清液 12mLに 0. 5mM 酸化型ダル夕チオン、 1 mM 還元型グル夕チオン、 ImM EDTA、 0. 1M アルギニン塩酸塩及び 2 M 尿素を含む 5 OmM T r i s -HC 1 (pH8. 0) 20 OmLを加え、 4°C でー晚リフォールディングを行った後、 遠心分離 （ 10000 r pm 10分間） を行い、 遠心上清液 212 mLを得た。 この遠心上清液に 2 M尿素を 0. 8 L加 えた後、 酢酸で PH5. 0に調整し、 4°Cでー晚静置した。 遠心分離 （1000 O r pm、 10分間） を行い、 得られた遠心上清液を 50 mM酢酸ナトリウム緩 衝液 （pH5. 0) で平衡化した POROS 50HSカラム （2. 2 cmX 12 cm、 日本パーセプティブ社） に毎分 3 OmLの流速で吸着させ、 平衡化に用い た緩衝液でよく洗浄した後、 ◦ . 3 Mから 1. 3 Mの塩化ナ卜リゥム直線濃度勾 配により溶出を行った。 24— 76残基型べ一夕セルリンを含む画分を集め、 5 OmM酢酸ナトリウム緩衝液 （pH4. 5) で 3倍に希釈した後、 この緩衝液で 平衡化した TSKg e l CM— 5PWカラム （0. 75 cmX 7. 5 cm、 東ソ 一社） に添加した。 24— 76残基型べ一夕セルリンが吸着した TSKg e 1 CM— 5 PWカラムを、 0. 3^1から0. 5 Mの塩化ナトリウム直線濃度勾配に より溶出を行った。 24— 76残基型べ一夕セルリンを含む画分を集め、 0. 1% トリフルォロ酢酸で平衡化した TS Kg e 1 〇DS— 120 Tカラム （2. 1 5 cmX 30 cm、 東ソ一社） に吸着させ、 20 %から 44 %のァセトニトリル 直線濃度勾配により 24— 76残基型べ一夕セルリンを溶出した。 溶出液を凍結 乾燥した後、 蒸留水 5mLで溶解し、 酢酸型にした AG 1— X 8カラム （1. 0 cmX 10 cm、 日本バイオラッド社） を通過させた後、 再度凍結乾燥を行い 2 4— 76残基型べ一夕セルリン 0. 4mgを得た。 実施例 19
ベー夕セルリン改変体の特徴の決定
実施例 3で得られた 2— 76残基型べ一夕セルリン及び実施例 6で得られた 2 4-76残基型べ一夕セルリンの特徴を以下のように決定した。
a) SDS—ポリアクリルアミド電気泳動を用いた分析
ベー夕セルリン改変体及び実施例 6で調製した 76残基型べ一夕セルリンをサ ンプルバッファ一 （ 125mM T r i s — HCし 1 % ドデシル硫酸ナトリウ ム、 15% グリセロール、 5% 2—メルカプトエタノール、 0. 005 % ブロ ムフエノールブルー） で懸濁し、 マルチゲル 15/25 (第一化学薬品） で電気 泳動を行った。 泳動後のゲルをラビッド CBB KANTO (関東化学社） で染 色を行ったところ、 いずれもほぼ単一バンドであった 〔図 9〕 。
b) アミノ酸組成分析
ベー夕セルリン改変体を 4%チォグリコール酸を含む 6 N塩酸で 1 10°C、 24及び 48時間気相加水分解を行い、 アミノ酸分析計 （日立 L一 8500A Am i no Ac i d An a 1 y z e r ) を用いてアミノ酸組成を決定した。 その結果、 いずれの改変体も c DNA塩基配列から予想されるアミノ酸組成と一 致した 〔表 8， 表 9〕 。 〔表 8〕 2— 76残基型ベータセルリンのアミノ酸組成分析 アミノ酸 1モル当 りの残基数 理論値
Asx 5. 2 5
Thr 6. 0 6
Ser 4. 6 5
Glx g. 4 q
Pro A 3 A iy フ 7 / 厶 la ク
\/Q l * >+1
Π U. Π U u Π ゥ l ie ク. U
し eu 2. 0 2
Tyr 2. 9 3
Phe 2. 1 2
Lys 5. 1 5
His 2. 3 2
Arg 7. 2 7
Cys ND 8
24— 76残基型ベータセルリンのアミノ酸組成分析 アミノ酸 1モル当たりの残基数 理論値
Asx 1 . 0 1
Thr 3. 8 4
Ser 2. 9 3
Glx 6. 0 6
Pro 2. 1 2
Gly 4. 0 4
Ala 3. 0 3
Val 3. 9 4
Met 0. 0 0 lie 2. 0 2 し eu 0. 0 0
Tyr 2. 9 3
Phe 2. 1 2
Lys 4. 9 5
His 2. 2 2
Arg 6. 0 6
Cys ND 6 c) N末端アミノ酸配列分析
N末端アミノ酸配列分析を気相プロテインシーケンサー （アプライドバイオシ ステムズ モデル 477 A) を用いて決定した。 その結果、 いずれの改変体も c DNA塩基配列から予想されるアミノ酸配列と一致した 〔表 10， 表 1 1〕 。
〔表 10〕 2— 76残基型ベータセルリンの N末端アミノ酸配列分析 検出された PTH—アミノ酸（pmole) 塩基配列から予想されるアミノ酸
1 Gly (388) Gly
2 Asn (319) Asn
3 Ser (245) Ser
4 Thr (261) Thr
5 Arg (225) Arg
6 Ser (144) Ser
7 Pro (246) Pro
8 Glu (105) Glu
9 Thr (120) Thr
10 Asn (162) Asn
〔表 11〕 24—フ6残基型ベータセルリンの N末端アミノ酸配列分析 検出された PTH—アミノ酸（pmole) 塩基配列から予想されるアミノ酸
1 Ala (463) Ala
2 Thr (251) Thr
3 Thr (245) Thr
4 Thr (483) Thr
5 Gin (302) Gin
6 Ser (109) Ser
7 Lys (64) Lys
8 Arg (145) Arg
9 Lys (209) Lys
10 Gly (170) Gly d) C末端アミノ酸分析
気相ヒドラジン分解法 （100°C、 6時間） により、 C末端アミノ酸をァミノ 酸分析計 （日立 L一 8500A Am i no Ac i d An a l y z e r) を 用いて決定した。 いずれの改変体もパリンが検出された 〔表 12, 表 13〕 。
〔表 12〕
2— 76残基型べ - -タセルリンの C末端アミノ酸分析
Val (収率： 95.4 %)
〔表" 13〕
24— 76残基型べ-ータセルリンの C末端アミノ酸分析
Val (収率： 83.3 %)
実施例 20
1) A431細胞を用いた EGFバインディングアツセィ
EGFレセプ夕一高発現株であるヒト扁平上皮癌細胞 A431細胞を用いた1 25 I一 EGFに対する結合阻害活性によって細胞増殖促進活性を測定した。 すなわち、 10% ゥシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル MEM (DME M)培地を用いて、 105細胞 ZmLになるように懸濁した A431細胞を 96ゥ エルプレートに 100 xLずつ播き、 炭酸ガスインキュベーター内 （5%炭酸ガ ス、 95%空気） において 37°Cで 2日間培養した。 2日後に 20mM HEPE Sおよび 0. 1% ゥシ血清アルブミンを含む、 DMEMと F— 12を等量混合し た結合培地 200 ^ L/ゥエルで 3回洗浄した後、 各種濃度の標識されていない EGF、 実施例 15で調製した 2— 76残基型べ一夕セルリン、 実施例 18で調 製した 24— 76残基型べ一夕セルリン、 実施例 6で調製した Me t一 76残基 型べ一夕セルリン、 または特開平 10— 191989号に記載の用法により調製 した Me t— 80残基型べ一夕セルリン及び 0. 25nM 125 I -EGF (ァ マシャム ·フアルマシア ·バイオテク） を含む結合培地 100 Lを添加した。 4°C, 90分静置した後に結合培地 200 Lで 3回洗浄し、 1% S D Sを含む 0. 1 N 水酸化ナトリゥム水溶液 200 a Lで細胞を溶解した。細胞溶解液をシ ンチレーシヨンバイアルに移し、 シンチレ一ター A (和光純薬社） を lmL加え、 シンチレーシヨンカウンターで125 I—EGFに対する結合阻害活性を測定した。
2) ヒト胎盤アルカリフォスファタ一ゼ発現 AR42 J細胞を用いた ;3細胞分化 促進活性の測定
PLAP発現 AR42 J細胞を、 各種濃度の実施例 1 5で調製した 2— 76残 基型べ—夕セルリン、 実施例 1 8で調製した 24 - 76残基型べ一夕セルリン、 実施例 6で調製した Me t— 76残基型べ一夕セルリン、 または特開平 10— 1 91989号に記載の用法により調製した Me t一 80残基型べ一夕セルリン及 び 10% ゥシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル MEM培地を用いて 105 細胞/ mLになるように懸濁し、 1 00 Lを 96ゥエルプレードに播き、 炭酸 ガスインキュベーター内 （5%炭酸ガス、 95% 空気） において 37°Cで 5日 間培養した。 5日後に培養上清をサンプリングし、 65 °Cで 30分間処理した後、 50 Lをあらかじめ 50 Lの 2 X S EAP (2M ジェ夕ノールァミン、 lm M MgC 12、 2 OmM ホモアルギニン） を添加した 96ウェルマイク口プレ一 卜に加えた。 2 Omg/mLの p—ニトロフエニルリン酸 （シグマ社） を 10 L添加し 37°Cで 16時間反応を行った。 いずれの改変体も EG F活性対 BTC 活性の比が Me t—80残基型べ一夕セルリンの 5%ほどに低下し、 Me t— 7 6残基型べ一夕セルリンと同程度であり N末欠失による影響は認められなかった。
3)上記 1) および 2) の結果を 〔表 14〕 にまとめ示す。
〔表 14〕
Figure imgf000061_0001
実施例 21
Cy s 3— Cy s 4間にへレギュリン （He r) に由来する 3残基が挿入され た hBTC 50改変分子 A発現プラスミド pTB 1985の構築
pTB 1976をテンプレートとして、 （1) 5'側プライマ一 PET— 1 ： 5 び 3'側プライマ一 BTC— 1 ： 5'— AGGAGGGCGTCGAGGGGTT CTGCTCGGCCA— 3'、 (2) 5 '側プライマ一 B T C— 2 ： 5 '— T G G ライマ— BTC_3 : 5' - TCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGC ACTGTC— 3'を用いて、 それぞれ PCRを行った。
次に （1) と （2) の P CR産物の混合物をテンプレートとして、 5'側プライ マ一 BT—95 h、 3 ' 側プライマ一 BT— 94 hを用いて P CRを行い、 hB TC 50の Cy s 3— Cy s 4間に He rの配列中の 3アミノ酸 （A s n, P r o， S e r) を挿入した改変分子 Aをコードする DNA断片を得た。 この DNA 断片を Nd e Iおよび B amH Iで消化後、 pET— 3 cの Nd e I— B amH I部位に組み込み、 p TB 1985を作製した。 実施例 22
N末 7残基をその部位に相当する上皮成長因子 （EGF) の 5残基で置換され た hBTC 50改変分子 B発現プラスミド pTB 1987の構築
pTB 1976をテンプレートとして、 5 '側プライマ一 BTC— 7 ： 5'— T
'および 3'側プライマー BT— 94 hを用いて PC Rを行い、 hBTC 50の N 末 7残基を相当する EG Fの 5残基に置換した改変分子 Bをコードする DNA断 片を得た。 この DNA断片を Nd e Iおよび B amH Iで消化後、 pET3 cの Nd e I一 B amH I部位に組み込み、 p TB 1987を作製した。 実施例 23
大腸菌での発現
T 7ファ一ジの Φ 10プロモー夕一の支配下に、 後述の参考例および上記の実 施例で得られたプラスミド pTB 1976、 プラスミド pTB 1985およびプ ラスミド pTB 1 98 7を、 発現用大腸菌 BL 2 1 (DE 3) ZpLy s S (N o v a g e n) に導入した。 それぞれの大腸菌組換え体を 1 0 0 gZm 1アン ピシリンおよび 1 0 g/m 1クロラムフエ二コールを含む LB培地を用いて 3 7°Cで培養した。クレツトュニット 1 60の時点でイソプロピル β—D_チォガ ラクトビラノシドを最終濃度 0. 4 mMになるように添加し、 さらに 3 7°Cで 4 時間培養を継続した。 培養後遠心により集菌し、 抽出操作まで一 8 0°Cで保存し た。 実施例 24
h BTC 5 0、 改変分子 Aおよび改変分子 Bの精製
4 - 1) 大腸菌封入体の調製
40 0m lの培養液から集めた菌体を 2 0m 1の 1 0 mM T r i s -HC 1 ( H 8. 0) 、 1 0 % s u c r o s e, 1 OmM EDTAに懸濁して、 凍結 · 融解した後、 氷中に 3 0分間静置して完全に細胞を溶かした。 氷冷下で超音波破 碎 （ 1 0 s e c， 3回） 後、 遠心 （9 0 00 r pm, 1 5m i n, 4 °C： B e e km a n) して再度沈殿を集めた。 この洗浄操作を 3回繰り返して封入体を調製 した。
4 - 2) タンパクの抽出およびリフォールデイング
4— 1 ) で得られた封入体を 8m lの 7M gu a n i d i n e— HC し 0. 1 M T r i s— CH3C〇ひ H (pH 8. 0)、 ImM EDTAに懸濁して 4 C、 1時間スターラーで穏やかに撹拌し、 組換えタンパクを抽出した。 次に還元型グ ル夕チオンを 0. 1 Mになるように添加して、 NaOH溶液でpHを8. 4に合 わせた後、 抽出液中に窒素ガスを吹き込み空気と置換した。 室温で 2時間静置し た後、 20倍容量の l OmM T r i s— CH3C〇OH (pH8. 0) 、 0. δ mM フエ二ルメチルスルホニルフルオリド、 ImM ベンズアミジンで稀釈した。 遠心 （90 0 0 r pm， 1 5m i n， 2 5°C) して不溶物を除いた上清に、 酸化 型グル夕チオンを 0. 5mMになるように添加し、 室温で 1 6時間静置した。 次 いで、 遠心 （9 0 0 0 r pm, 1 5m i n, 2 5°C) 上清を凍結乾燥して濃縮後、 4°Cで 50mM T r i s— CH3C〇〇H (pH 5. 5) 、 ImM EDTAに透 析 （S p e c t r a p o r : MWCO 1， 000) した。 透析後、 遠心 （9
000 r m, 15m i n, 4°C) 上清を酢酸セル口一ス膜 （M i 1 1 e x G V, 0. 22 um : M i 1 1 i p o r e) で濾過して、 不溶物を除いた。
4-3) タンパクの精製
リフォールデイングしたタンパクを含む溶液を 5 OmM 酢酸ナトリウム （p H5. 5) で平衡化した陽イオン交換 H PLCカラム （250 X 4. 1mm I . d. ， Syn c h r om CM300, Syn c h r op ak) にかけ、 0— 1 Mの N a C 1濃度勾配でタンパクを溶出、 分画した。 〇D2S。でモニターした溶 出画分を、 0. 1% HCし 1 % CH3CNで平衡化した C4逆相 HPLCカラ ム （150X4. 6 mm I. d. ， U l t r on 300 C4： C h r oma t o p a c k i n g Ce n t e r) にかけて、 1—40 %の CH3CN濃度勾配 で溶出した。 次にカラムクロマトグラフィーで得たピーク画分を凍結乾燥した。 改変分子 Aおよび Bの収量は、 各々 78. 7 および 103. 1 /igであった。 4— 4) タンパクの純度検定
精製標品の純度検定の目的で、 C18逆相HPLCカラム（150 X4. 6mm
1. d. , ODS 120T, To s oh) にかけて、 15〜30%のCH3CN濃 度勾配で溶出し、 改変分子 Aおよび Bのピークパターンの単一性を確認した。 両 タンパクの純度は 94%以上であることが分かった。 実施例 25
3 T 3細胞を用いた細胞増殖促進活性の測定
モレキュラー .アンド ·セルラ一 ·バイオロジー、 8巻、 588頁、 1988年に記 載の方法に準じ、 静止状態の 3 T 3 A31— 714クローン 4 (イン夕一ナシ ョナル ·ジャーナル ·ォブ ·キャンサー、 12巻、 463頁、 1973年） 中へ の3 H—チミジンの取り込みによつて細胞増殖促進活性を測定した。
5 % ゥシ血清を含むダルベッコ改変イーグル MEM培地を用いて、 1000細 胞 ZmLになるように懸濁した 3 T 3 A 31 - 714クローン 4を 96ゥエル プレートに 100 /zLづっ播き、 炭酸ガスインキュベーター内 （5%炭酸ガス、 95%空気） において 37°Cで 1日培養した。 上清 75 Lを抜き取り、 血清を 含まないダルベッコ改変イーグル MEM培地を 100 L加えることにより血清 濃度を 1%にした。 さらに 2日間培養した後、 種々の濃度の上記の実施例で調製 した hBTC 50、 改変分子 Aまたは改変分子 Bを添加した。添加 16時間後に3 H—チミジン [アマ一シャム ·フアルマシア ·バイオテク] を 0. 25 C i / we 1 I加え、 その 4時間後に細胞を PB Sで 3回洗浄した後、 5% SDSを 100 L加え細胞を溶解した。細胞溶解液をシンチレーシヨンバイアルに移し、 シンチレ一夕一 A (和光純薬社） を lmL加え、 シンチレーシヨンカウンターで3 H—チミジンの細胞への取り込みを測定した。
この測定結果より、 80残基型べ一夕セルリン （標準品） の最大取り込み値を 100 %として、 50 %の活性を示した時の h BTC 50および改変分子の濃度 (ED50) を求めた結果を 〔表 15〕 に示す。
〔表 15〕 細胞増殖促進活性
Figure imgf000065_0001
実施例 26
AR42 J細胞を用いた 3細胞分化誘導活性の測定
上記で調製した hBTC 50、 改変分子 A、 改変分子 Bおよび特開平 10— 1 91989号に記載の方法により調製した 80残基型べ一夕セルリン （hBTC 80)から選ばれる 1種と、 10% ゥシ胎児血清とを含むダルベッコ改変ィーグ ル MEM培地に、 化学発癌剤で誘発された降臓癌由来細胞株 A R 4 2 J [C iristop e; アメリカン 'ジャーナル'ォブ 'フイジォロギ一（Am. J. Physiol. ), 266巻、 G963頁、 1994年] を 105細胞/ mLになるように懸濁し、 5 00 をチャンバースライドに播き、 炭酸ガスインキュベーター内 （5% 炭 酸ガス、 95% 空気） において 37°Cで 5日間培養した。 5日後に細胞を PBS で 1回洗浄した後に、 10 % ホルムアルデヒドで固定し、 0. 1 % トリトン X — 100で 5分間処理した後に、 ブロックエース （雪印、 日本） を添加し、 室温 で 40分間ブロッキングを行った。 10% ブロックエースで希釈した抗インスリ ン抗体 （ァドバンスド ·ィムノ ·ケミカル社） を添加し室温、 40分間反応した。 0. 1 % トリ トン X— 100を添加し室温 5分間放置した後、 PBSで 3回洗浄 した。 10% ブロックエースで希釈した F I TC (Fluorescein Isothiocyanate) 標識抗マウス I gG抗体 （カッペル社） を添加し、 室温で 40分間反応した。 0. 1%トリトン X— 100を添加し室温 5分間放置した後、 P B Sで 3回洗浄し、 蛍光顕微鏡で観察した。
その結果、 hBTC 80を添加した場合と同様に、 hBTC 50、 改変分子 A および改変分子 Bを添加した場合においても、 蛍光染色された細胞、 すなわちィ ンスリンを産生する i3細胞に分化した細胞が観察された。
また、 インスリン産生細胞の出現頻度は、 hBTC 80、 hBTC 50, 改変 分子 Aおよび改変分子 B間で差が見られなかった。 実施例 27
PLAP発現 AR42 J細胞を用いた 3細胞分化誘導活性の測定
3- 1) ヒト胎盤アルカリフォスファターゼ遺伝子発現べクタ一の構築
)3細胞への分化促進活性はインスリンプロモーターの下流にレポ一夕一として アルカリフォスファ夕一ゼ遺伝子を連結したものにより形質転換された A R 42 J細胞を用いても実施した。 すなわちべ一夕一セルリンにより i3細胞へと分化し た細胞はアルカリフォスファタ一ゼを産生し、 このアルカリフォスファタ一ゼの 活性を測定することにより 3細胞への分化促進活性を定量的に測定することが可 能である。
ラット尾から常法に従ってゲノム DNAを調製した。 この DNAをテンプレ一 トとして、 既報のラッ トインスリン I I遺伝子プロモー夕一の塩基配列 (GenBank:Accession No. ]00748) をもとに合成したプライマー R I— 1 ： 5' -AGAGTCAAGGATCCCCCAACCACT - 3'およびプライマ一
PCR法によりインスリンプロモーター領域 0. 75 Kbを増幅した。 さらに、 この PC R産物をテンプレートとしてプライマ一 R I— 1 C 1 a： 5'— GAAT CGATAGAGTCAAGGATCCCCCA-3'およびプライマ一 R I一
PCRを行った。 増幅された 0. 75 Kb DNA断片を単離し、 pT7 B l u eベクタ一 （Novagen 69820-1) に組み込んで得られたプラスミド pTB 1881 を用いてクローニングされた断片の塩基配列を決定し、 ラットインスリン I Iプ 口モータ—であることを確認した。プラスミド pTB 1881を Xho I -C 1 a Iで切断してラットインスリンプロモ一夕一である 0. 73 kb DNA断片 を得た。 次にヒト胎盤アルカリフォスファタ一ゼ （PLAP) をコードする 2. 0 k b c DNA (J. Bergerら、 Gene 66, 1 (1988)) の発現プラスミド pTB 1330を Xho I— H i nd I I Iで切断して得られた 2. 7 k b D N A断 片 （PLAP c DNA, S V40由来スプライシング部位およびポリ A付加部 位、 p BR 322由来 o r iおよびアンピシリン耐性遺伝子を含む） を単離し、 前述のラットインシュリンプロモー夕一領域 0. 73 k b Xho I— C l a I断片を T 4 DNAリガ一ゼ反応によって連結してプラスミド pTB 1898 を得た。
3-2) PLAP発現 AR42 J細胞の構築
AR 42 J細胞に P LAP発現プラスミド pTB 1898と Tn 5の n e o「 遺伝子を含むプラスミド pMC n e o p o 1 y A (STRATAGENE) をトランスフ ェクシヨン試薬 T r a n s I TTM— LT 1 (Mirus、 PenVera Coi^orat ion) を用 いて同時に導入した。 導入後の細胞は 10 %牛胎児血清を加えた DMEMで 2日 間培養した後、 G418 (ゲネチシン、 GIBC0BRL) 800 g /mLを添加した 選択培地にかえて培養を続けた。 G418耐性となって生育した細胞を限界希釈 法によりクローンを単離した。
各クローンの細胞を 24穴プレートに播き、 80残基型 BTCを 20 n gZm
L添加および無添加で 4日間培養し、 培養上清を集めて 65°C、 30分間熱処理 を行った後、 培地中のアルカリフォスファタ一ゼ活性を測定した。 80残基型べ —夕セルリン添加時にアルカリフォスファターゼ活性の上昇が認められるクロ一 ンを選択し、 その中の 1クローン AR 71 - 104を以下の検討に用いた。 3-3) PLAP発現 AR42 J細胞を用いた 細胞分化誘導活性の測定 各種濃度の上記で調製した hBTC 50、 改変型分子 Aおよび改変型分子 Bか ら選ばれる 1種と、 10%ゥシ胎児血清とを含むダルベッコ改変イーグル MEM 培地に、 上記 3— 2)で構築した PL A P発現 AR 42 J細胞を 3 X 104細胞/ mLになるように懸濁し、 100 Lを 96ゥエルプレートに播き、 炭酸ガスィ ンキュベー夕一内 （5% 炭酸ガス、 95 %空気） において 37 °Cで 5日間培養 した。 5日後に培養上清をサンプリングし、 65°Cで 30分間処理した後、 50 iLをあらかじめ 50 Lの 2XSEAP (2M ジェタノ一ルァミン、 1 mM MgC l 2、 20mM ホモアルギニン） を添加した 96ウェルマイク口プレート に加えた。 37°Cで 10分間保った後、 2 OmgZmLの p—ニトロフエ二ルリ ン酸 （シグマ社） を 10 L添加し 37°Cで 16時間反応を行い、 405 nmの 吸光度 A4()5を測定した。
hBTC 50添加時の最大吸光度を 100%とした際の 50%の活性を示すの に必要なタンパク濃度 （ED50) を 〔表 16〕 に示す。
〔表 16〕 β細胞への分化誘導活性
Figure imgf000068_0001
参考例 1
50残基型ヒ卜べ一夕セルリン （h BTC 50) 発現プラスミド pTB 197
6の構築
80残基型 hBTC c DNAを組み込んだプラスミド pTB 1516 (特開平 6 - 87894号公報記載；受託番号 FERM BP- 3836 ,受託番号 I FO 15282) をテンプレートとして、 プライマ一 BT— 95 h： 5' -AGCAT 'を用いて PC Rを行った。 hBTCの C末 50残基型の 5'末端に翻訳開始コド ンおよび Nd e Iサイトを、 3'末端に終止コドンおよび B amH Iサイ卜をそれ ぞれ揷入した P CR産物を Nd e Iおよび B amH Iで消化し、 T 7ファージの Φ 10プロモーターを保持する発現用プラスミド ρΕΤ— 3 c (Nov ag e n) の Nd e I— B amH I部位に DNA L i ga t i on K i t V e r . 2 (Ta k a r a) を用いて組み込み、 h B T C 50の発現プラスミド p T B 1 976を作製した。 組み込んだ c DNAの塩基配列は AB I社の DNAシ一ゲン サ一 （AB I 377 DNA S e Q u e n c e r ) により確認した。
プラスミド pTB 1976の構築の概略を 〔図 10〕 に示す。 産業上の利用可能性
本発明のベ一夕セルリンムティンまたはその塩は、 BTC活性を保持したまま、 EGF活性が減弱されており、 抗原性の問題もないことから、 優れた糖尿病治療 薬として有用である。

Claims

請求の範囲
1 . 塍臓 /3細胞の分化促進活性が保持され、 上皮細胞増殖促進活性が低減されたべ —夕セルリンムテインまたはその塩。
2 . 上皮細胞増殖促進活性に対する腾臓 3細胞の分化促進活性の比が、 ベー夕セ ルリンのそれに比べて 2倍以上である請求項 1記載のベータセルリンムティンま たはその塩。
3 . ベー夕セルリンの N末端から 1ないし 4 0個のアミノ酸残基が欠失していても よく、 C末端から 1ないし 4番目のアミノ酸残基において、 C末端から 3番目のァ ミノ酸残基 L e uもしくは C末端から 4番目のアミノ酸残基 A s pを含む 1ない し 4個のアミノ酸残基が欠失または他のアミノ酸残基もしくは他のぺプチド鎖に 置換された請求項 1記載のベー夕セルリンムテインまたはその塩。
4 . N末端から 1ないし 4 0個のアミノ酸残基が欠失した請求項 3記載のベー夕セ ルリンムテインまたはその塩。
5 . ①配列番号： 1で表されるアミノ酸配列、 ②配列番号： 1で表されるアミノ酸 配列の N末端から 1ないし 4 0個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ③配列番 号： 2で表されるアミノ酸配列または④配列番号： 2で表されるアミノ酸配列の N 末端から 1ないし 4 0個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を含有する請求項 3 記載のベー夕セルリンムテインまたはその塩。
6 . ①配列番号： 1で表されるアミノ酸配列、 ②配列番号： 2で表されるアミノ酸 配列、 ③配列番号： 3で表されるアミノ酸配列または④配列番号： 4で表されるァ ミノ酸配列を含有する請求項 3記載のベータセルリンムティンまたはその塩。
7 . ①配列番号： 3 7で表されるアミノ酸配列または②配列番号： 3 8で表され るアミノ酸配列を含有する請求項 3記載のベー夕セルリンムティンまたはその塩。
8 . ベー夕セルリンの N末端の 1ないし 3 0個のアミノ酸残基が欠失していても よく、 C末端から第 2 2番目のアミノ酸残基と第 2 3番目のアミノ酸残基との間 に 1ないし 5個のアミノ酸残基が挿入された請求項 1記載のベ一夕セルリンムテ インまたはその塩。
9 . ベー夕セルリンの N末端の 1ないし 3 0個のアミノ酸残基が欠失した請求項 8 記載のベ一夕セルリンムテインまたはその塩。
1 0 . 配列番号： 4 4で表されるアミノ酸配列を有する請求項 8記載のベ一夕セル リンムテインまたはその塩。
1 1 . 配列番号： 4 5で表されるアミノ酸配列を有する請求項 8記載のベー夕セル リンムティンまたはその塩。
1 2 . 請求項 1記載のベータセルリンムティンをコードする D N Aを含有する組 換えベクターで形質転換された形質転換体を培養し、 該べ一夕セルリンムティン を生成せしめることを特徴とする請求項 1記載のベ一夕セルリンムテインまたは その塩の製造法。
1 3 . 請求項 1記載のベー夕セルリンムテインまたはその塩を含有してなる医薬 組成物。
1 4. 組成物が糖尿病予防 ·治療薬である請求項 9記載の医薬組成物。
1 5 . 請求項 1記載のベ一夕セルリンムテインまたはその塩を哺乳動物に投与す ることを特徴とする糖尿病予防 ·治療法。
1 6 . 糖尿病予防 ·治療剤の製造のための請求項 1記載のベ一夕セルリンムテイ ンまたはその塩の使用。
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