WO2000039154A2 - Peptide des at1-rezeptors und ihre verwendung bei präeklampsie und maligner hypertonie - Google Patents

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Definitions

  • ATi receptor peptides and their use in preeclampsia and malignant hypertension
  • the invention relates to peptides of the ATi receptor and their use and their secondary products in antigenic and immunogenic agents or test kits, in particular for the elimination of specifically binding, cell-physiologically active, pathological antibodies in pre-eclampsia and for their diagnostic detection.
  • the invention relates to a method for the detection of anti-ATi receptor antibodies in biological fluids.
  • the immune system is an essential component in all animal life. In mammals, it is used in particular to ward off microorganisms, to regenerate tissue and to destroy tumor cells. In classic immunology, a distinction is made between cellular and humoral immune defense. These are two distinguishable, but cooperating systems that ultimately represent the immune system.
  • autoimmune diseases There are a number of diseases known as autoimmune diseases. In such diseases, the immune system of those affected is directed against itself.
  • the predominantly cell-mediated autoimmune diseases include multiple sclerosis and type I diabetes.
  • a second group is made up of antibody-mediated autoimmune diseases. They include, for example, rheumatism or the less common autoimmune diseases such as myasthenia gravis or lupus erymathematodes.
  • autoimmune diseases The pathogenesis of most autoimmune diseases is unknown. There are various hypotheses and models on how to explain the development of autoimmune diseases.
  • An explanatory model is, for example, the antigenic / molecular mimicry. It is assumed that microorganisms, e.g. B. viruses or parasites equip themselves with certain molecules that are not recognized by the host's own immune system and undermine it. However, if they are recognized as foreign and antibodies are induced and produced against them, these antibodies recognize similar endogenous structures.
  • autoimmune diseases or autoantibodies that they bind to the body's own cells and tissues.
  • the cellular immune system and the complement system can be activated, which then on site pathogenic reactions in the tissue - e.g. B. chronic inflammation - triggers or there is a pathological malfunction of the cells to which the autoantibodies have bound.
  • a classic example of this is dilated cardiomyopathy.
  • the organism incorrectly forms autoantibodies that bind to a defined epitope of the ß1-adrenergic receptor.
  • These autoantibodies produce an increase in the pulsation rate in biological tests on rat cardiomyocytes in cell culture (these cells have an almost identical ⁇ 1-adrenergic receptor on the surface).
  • Dilated cardiomyopathy is an autoimmune disease that, if left untreated, severely impairs cardiac output by reducing pumping power while expanding cardiac muscle tissue due to infiltrates.
  • the antibodies are removed from the blood of the patient in the preliminary stages of the disease by blood washing, the heart muscle regenerates over the course of a year and the cardiac muscle performance improves drastically, almost returning to the values of healthy people.
  • Preeclampsia is a high pressure form specific to pregnancy and is one of the most important causes of maternal deaths during pregnancy and during childbirth. Preeclampsia is even more important for the fate of the fruit, meaning that it is responsible for prematurity, growth retardation and perinatal mortality.
  • the object of the invention was therefore to find substances which enable the detection of pathological antibodies in preeclampsia and malignant hypertension and to provide appropriate systems for this purpose. enable the elimination of such antibodies from the blood.
  • the invention is based on the first proof that patients with preeclampsia have specific antibodies against angiotensin ATi receptors which have an effect on blood pressure. These antibodies did not occur in women with normal pregnancy, nor in pregnant women with chronic hypertension, that is, pregnancy-independent hypertension. The observed angiotensin II ATi receptor antibodies lead to an activation of the ATi receptor, which is probably jointly responsible for dangerous increases in blood pressure and an acute deterioration in blood flow to vital maternal and child organs.
  • an immunoglobulin fraction can be isolated from the plasma, which contains autoantibodies that bind to the angiotensin-1 receptor and thereby activate the cell. If - in vitro - peptides of the AT1 receptor, which represent the binding site for the antibodies, are added to the cell culture system, the pathological effect of the autoantibodies can be eliminated. The same is possible through the use of functionally analogous peptides, preferably with the amino acid sequence AFHYESQ, AVHYQSN, SHFYQTR, GYYFDTN or ENTNIT.
  • Serum samples from patients with preeclampsia contain autoantibodies directed against the angiotensin II ATi receptor subtype. These antibodies develop a positive chronotropic effect in a bioassay. This effect, like that of angiotensin II, is prevented by the subtype-selective ATi receptor blocker losastan.
  • Alpha and beta adrenergic antagonists and the AT 2 receptor blocker PD 123319 were without influence.
  • the antibodies recognize an epitope on the second extracellular loop of the ATi receptor and that they can be neutralized or purified by affinity chromatography using peptides that correspond to this loop.
  • the epitope is characterized by the amino acid sequence AFHYESQ.
  • functionally analogous peptides with the amino acid sequence AVHYQSN, SHFYQTR, GYYFDTN or ENTNIT also belong to the scope of the invention.
  • the invention thus relates to peptides which contain the physiologically active autoantibody binding epitope of the AT1 receptor, preferably consisting of 5 to 10 amino acids and their variants which form an epitope and can bind autoantibodies which occur in preeclampsia.
  • the peptides are synthesized according to methods known per se by building up the amino acids or are produced by genetic engineering.
  • Antibodies according to the invention which are directed against the epitope of the ATi receptor are characterized in that they recognize these peptides. They preferably recognize the peptide of SEQ ID No. 1 or its variants. Other antibodies recognize the peptides with the amino acid sequence AVHYQSN, SHFYQTR, GYYFDTN or ENTNIT. They are produced according to methods known per se by immunizing small mammals or immunizing spleen cells in vitro with the peptides according to the invention. O
  • the antibodies are used in various bio-assays, immunological
  • the invention relates to antigenic agents for the detection of preeclampsia, which contain at least one peptide according to the invention, preferably the peptide of SEQ ID No. 1 or also peptides with the amino acid sequence AVHYQSN, SHFYQTR, GYYFDTN or ENTNIT. They react with the specific antibodies against angiotensin-AT receptors which are active in preeclampsia. Possibly. the antigenic agents are bound to various carriers, e.g. activated Sepharose, cellulose or polystyrene carrier.
  • carriers e.g. activated Sepharose, cellulose or polystyrene carrier.
  • peptides according to the invention are in immunogenic agents. These contain at least one peptide, preferably the peptide of SEQ ID No. 1 or also peptides with the amino acid sequence AVHYQSN, SHFYQTR, GYYFDTN or ENTNIT, which induce the production of antibodies which are able to recognize autoantigens in preeclampsia.
  • the invention also provides a test kit for the determination of anti-ATr receptor antibodies for the detection of preeclampsia.
  • the test kit includes
  • At least one peptide according to the invention optionally bound to a solid phase
  • the bio-assay includes
  • the invention further relates to a method for the detection of anti-ATi receptor antibodies in biological fluids.
  • the sample to be examined is brought into contact with at least one peptide according to the invention or with a compound of these peptides with a carrier material under conditions which permit an antigen-antibody reaction.
  • the detection is then carried out using known chemical or physical methods.
  • the anti-ATi receptor antibodies could be detected in all sera examined by patients with preeclampsia. The antibodies appear after the 20th week of pregnancy and disappear relatively quickly after delivery. The anti-ATi receptor antibodies have not been detected in normal pregnancies or in pregnant hypertensives.
  • the antibodies behave like the agonist angiotensin II in in vitro tests, these antibodies play a role in pathogenesis or preeclampsia. Since they are detectable in all pre-eclampsia sera examined, they are important as diagnostic markers.
  • Cultivated neonatal rat heart cells were used as bioassay. These cells develop a rhythmic spontaneous pulsation and react to angiotensin-Il stimulation with an increase in the stroke rate.
  • the detection of these A ⁇ receptor antibodies serves both for the early detection of preeclampsia and as a basis for new types of therapy.
  • the invention thus also relates to therapeutic agents against preeclampsia which contain these peptides, since the removal of the angiotensin ATi receptor antibodies from the mother's blood (for example by means of specific or non-specific immunoadsorption) leads to an improvement in the clinical picture or at least one Prevent progression, which is associated with a reduction in the maternal risk and in particular with a significant improvement in the child's chances of survival.
  • the specific immunoglobulin adsorption is carried out on a column on which there are peptides which contain at least the antibody-binding sequence AFHYESQ (which preferably contains the second extracellular loop of the AT receptor or the sequence ID No. 1).
  • the non-specific immunoglobulin adsorption is carried out on a column which preferably contains sheep or chicken antibodies against the human immunoglobulins or protein A or C1 q .
  • preeclampsia The invention described using the example of preeclampsia is equally applicable to some cases of malignant hypertension in which an autoantibody is found which recognizes the same epitope (the same sequence).
  • the ⁇ -globulin fraction on the serum of preeclampsia patients increases the heart rate of the heart muscle cells by 22 + x beats per minute (fictitious). If the ⁇ -globulin fractions are preincubated with peptides which represent parts of the ATi receptor corresponding to Loops I - III, and the antibodies are subsequently added to the Zeil test system, the Loop II peptides inhibit the antibody effect on the cells.
  • the ⁇ -globulin fraction on the serum of pre-eclampsia patients increases the beat frequency of the heart muscle cells.
  • the amino acid sequence AFHYESQ from Loop II inhibits the action of the autoantibodies, but not the sequence regions from other parts of Loop II. 3. Bioassay for the detection of the antibodies
  • a sensitive bioassay was used to identify and characterize the ATi receptor antibodies. Pulsating cardiac myocytes were used spontaneously, which reacted to angiotensin II stimulation with an increase in the stroke rate. This positive chronotropic effect was blocked by the selective antagonist losartan. Incubation of these cells with the anti-ATi receptor autoantibody also led to an increase in the pulsation rate, which was prevented by losartan. Furthermore, this agonistic effect could be neutralized by a peptide that corresponded to the second extracellular loop of the ATi receptor.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Peptide des AT1-Rezeptors und ihre Verwendung zur Elimination von spezifisch bindenden, zellphysiologisch aktiven, pathologischen Antikörpern bei Präeklampsie sowie für ihren diagnostischen Nachweis. Bevorzugt sind Peptide mit der Sequenz AFHYESQ, AVHYQSN, SHFYQTR, GYYFDTN oder ENTNIT.

Description

Peptide des ATi-Rezeptors und ihre Verwendung bei Präeklampsie und maligner Hypertonie
Die Erfindung betrifft Peptide des ATi -Rezeptors und deren Verwendung und ihrer Folgeprodukte in antigenen und immunogenen Mitteln bzw. Testkits, insbesondere zur Elimination von spezifisch bindenden, zellphysiologisch aktiven, pathologischen Antikörpern bei Präeklampsie sowie für ihren diagnostischen Nachweis. Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Anti-ATi -Rezeptor- Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten.
Das Immunsystem ist ein essentieller Bestandteil bei allen tierischen Lebewesen. Bei den Säugetieren dient es insbesondere zur Abwehr von Mikroorganismen, zur Geweberegeneration und zur Vernichtung von Tumorzellen. In der klassischen Immunologie wird unterschieden zwischen einer zellulären und einer humoralen Immunabwehr. Darunter versteht man zwei unterscheidbare, aber miteinander kooperierende Systeme, die letztlich das Immunsystem darstellen.
Es existieren eine Reihe von Krankheiten, die als Autoimmunerkrankungen bezeichnet werden. Bei solchen Krankheiten richtet sich das Immunsystem bei den Betroffenen gegen sich selbst. Zu den vorwiegend zel [vermittelten Autoimmunerkrankungen gehörern Multiple Sklerose und Diabetes Typ I. Eine zweite Gruppe machen die antikörpervermittelten Autoimmunerkrankungen aus. Zu ihnen zählt beispielsweise Rheuma oder auch die seltener vorkommenden Autoimmunerkrankungen wie Myasthenia gravis oder Lupus erymathematodes.
Die Pathogenese.der meisten Autoimmunerkrankungen ist unbekannt,. Es gibt verschiedene Hypothesen und Modelle, wie man die Entstehung von Autoimmunerkrankungen erklären kann. Ein Erklärungsmodell stellt beispielsweise das antigene/molekulare Mimikry dar. Hierbei geht man davon aus, daß Mikroorganismen, z. B. Viren oder Parasiten sich mit bestimmten Molekülen ausstatten, die vom wirtseigenen Immunsystem nicht erkannt werden und es unterlaufen. Werden sie allerdings als fremd erkannt und gegen sie Antikörper induziert und produziert, erkennen diese Antikörper ähnliche körpereigene Strukturen.
Es gehört zum Wesen von Autoimmunerkrankungen bzw. Autoantikörpern, daß sie an körpereigene Zellen und Gewebe binden. Hierbei kann entweder das zelluläre Immunsystem und das Komplementsystem aktiviert werden, welches dann vor Ort pathogene Reaktionen im Gewebe - z. B. chronische Entzündungen - auslöst oder aber es kommt zu einer pathologischen Fehlfunktion der Zellen, an denen die Autoantikörper gebunden haben.
Als ein klassisches Beispiel hierfür kann die Dilatative Cardiomyopathie gelten. Bei dieser Autoimmunerkrankung bildet der Organismus fehlerhaft Autoantikörper, die an ein definiertes Epitop des ß1-adrenergen Rezeptors binden. Diese Autoantikörper erzeugen in biologischen Tests an Ratten-Cardiomyozyten in der Zellkultur (Diese Zellen haben einen nahezu identischen ß1-adrenergen Rezeptor auf der Oberfläche) eine Erhöhung der Pulsationsrate. Man spricht hier von einer pharmakoaktiven, dem Adrenalin ähnlichen Wirkung, der Autoantikörper.
Die Dilatative Cardiomyopathie ist eine Autoimmunerkrankung, die unbehandelt zu einer starken Beeinträchtigung der Herzleistung durch Reduktion der Pumpleistung bei gleichzeitiger Ausdehnung des Herzmuskelgewebes durch Infiltrate führt. Werden allerdings in den Vorstufen der Erkrankung dem Patienten durch eine Blutwäsche die Antikörper aus dem Blut entfernt, kommt es im Laufe eines Jahres zu einer Regeneration des Herzmuskels und zu einer drastischen Verbesserung der Herzmuskelleistung, die beinahe wieder die Werte von gesunden Personen erreicht.
Offensichtlich kann also durch die Elimination der pathologischen Antikörper aus dem Blutkreislauf - und nichts anderes geschieht bei der Entfernung der Gesamt- immunglobuline - die Regeneration des Herzmuskels eingeleitet werden.
Ähnlich ist die Situation bei der Präeklampsie.
Die Präeklampsie ist eine schwangerschaftsspezifische Hochdruckform und zählt zu den wichtigsten Ursachen von mütterlichen Todesfällen während der Schwangerschaft und unter der Geburt. Eine noch größere Bedeutung hat die Präeklampsie für das Schicksal der Frucht, das heißt sie ist verantwortlich für Frühgeburtlichkeit, Wachstumsretardierung und perinatale Sterblichkeit.
Obwohl in den letzten Jahren zahlreiche Erkenntnisse gewonnen wurden, sind die Ursachen dieses Krankheitsbildes weiterhin nicht geklärt. Die einzige kausale Therapie ist die vorzeitige Beendigung der Schwangerschaft. Dies ist jedoch bei frühem Auftreten der Kranheitssymptome, das heißt insbesondere vor der 20. Schwangerschaftswoche, kaum mit dem gesunden Überleben des Kindes vereinbar. Auf der anderen Seite kann jeder Tag der Verlängerung einer Schwangerschaft in dieser kritischen Zeitspanne die kindlichen Überlebenschancen verbessern. Beste Voraussetzungen, dieses Ziel zu erreichen, bieten eine frühzeitige Erkennung (Diagnose) der Entwicklung einer Präeklampsie und darauf aufbauende Überwachungs- und Behandlungsverfahren (Immunglobulinadsorption)
Die Aufgabe der Erfindung bestand deshalb darin, Substanzen zu finden, die bei Präeklampsie und maligner Hypertonie den Nachweis von pathologischen Antikörpern zu ermöglichen und dafür entsprechende Systeme bereitzustellen Eine weitere Aufgabe besteht darin,. die Elimination solcher Antikörper aus dem Blut zu ermöglichen.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
Die Erfindung beruht auf dem erstmaligen Nachweis, daß Patientinnen mit Präeklampsie spezifische Antikörper gegen blutdruckwirksame Angiotensin-ATi- Rezeptoren aufweisen. Bei Frauen mit normaler Schwangerschaft traten diese Antikörper nicht auf, ebenso nicht bei Schwangeren mit einer chronischen Hypertonie, das heißt einer schwangerschaftsunabhängigen Hypertonie. Die beobachteten Angiotensin-ll-ATi -Rezeptor-Antikörper führen zu einer Aktivierung des ATi -Rezeptors, die wahrscheinlich mitverantwortlich ist für gefährdende Blutdruckerhöhungen und eine akute Durchblutungsverschlechterung lebenswichtiger mütterlicher und kindlicher Organe.
Bei Patientinnen mit dieser Erkrankung läßt sich aus dem Plasma eine Immunglobulinfraktion isolieren, welche Autoantikörper enthält, die an den Angiotensin-1 Rezeptor binden und darüber die Zelle aktivieren. Fügt man - in vitro - dem Zellkultursystem Peptide des AT1 -Rezeptors hinzu, welche die Bindungsstelle für die Antikörper darstellen, läßt sich der pathologische Effekt der Autoantiköper aufheben. Ähnliches ist möglich durch die Verwendung funktionsanaloger Peptide, vorzugsweise mit der Aminosäuresequenz AFHYESQ, AVHYQSN, SHFYQTR, GYYFDTN oder ENTNIT.
Überraschend ist, daß dieselben Epitopstrukturen, wenn sie an eine Festphase gebunden sind, aus dem Blutplasma von den Patientinnen die Antiköper eliminieren, die für den pathologischen Effekt zuständig sind. Ein wesentlicher Teil der Erfindung ist damit die Bereitstellung von Aminosäuresequenzen in Form von Peptiden, die pathologische Autoantikörper aus dem Plasma von Patientinnen mit Präemklampsie erkennen, binden und eliminieren.
Serumproben von Patienten mit Präeklampsie enthalten Autoantikörper, die gegen den Angiotensin-ll-ATi -Rezeptorsubtyp gerichtet sind. In einem Bioassay entfalten diese Antikörper einen positiv chronotropen Effekt. Dieser Effekt wird wie der des Angiotensin II durch den subtypselektiven ATi-Rezeptorblocker Losastan unterbunden. Alpha- und beta-adrenergene Antagonisten und der AT2- Rezeptorblocker PD 123319 waren ohne Einfluß.
Es wurde überraschend festgestellt, daß die Antikörper ein Epitop auf der zweiten extrazellulären Schleife des ATi -Rezeptors erkennen und daß sie mit Hilfe von Peptiden, die dieser Schleife entsprechen, neutralisiert bzw. affinitäts- chromatographisch gereinigt werden können. Das Epitop ist durch die Aminosäuresequenz AFHYESQ charakterisiert. Ferner gehören auch funktionsanaloge Peptide mit der Aminosäuresequenz AVHYQSN, SHFYQTR, GYYFDTN oder ENTNIT zum Umfang der Erfindung.
Gegenstand der Erfindung sind somit Peptide, die das die physiologisch aktiven Autoantiköφer bindende Epitop des AT1 -Rezeptors enthalten, vorzugsweise bestehend aus 5 bis 10 Aminosäuren sowie ihre Varianten, die ein Epitop bilden und Autoantikörper binden können, die bei Präeklampsie vorkommen.
Bevorzugt sind Peptide, die ganz oder teilweise die SEQ ID Nr. 1 AFHYESQ enthalten.
Die Peptide werden nach an sich bekannten Verfahren durch Aufbau der Aminosäuren synthetisiert oder gentechnisch hergestellt.
Erfindungsgemäße Antikörper, die gegen das Epitop des ATi -Rezeptors gerichtet sind, sind dadurch gekennzeichnet, daß sie diese Peptide erkennen. Bevorzugt erkennen sie das Peptid der SEQ ID Nr. 1 bzw. seine Varianten. Weitere Antikörper erkennen die Peptide mit der Aminosäuresequenz AVHYQSN, SHFYQTR, GYYFDTN oder ENTNIT. Sie werden nach an sich bekannten Verfahren durch Immunisierung von Kleinsäugern oder Immunisierung von Milzzellen in vitro mit den erfindungsgemäßen Peptiden hergestellt. o
Anwendung finden die Antikörper in verschiedenen Bio-Assays, immunologischen
Nachweissystemen und ELISA-Testsystemen.
Weiterhin betrifft die Erfindung antigene Mittel zum Nachweis von Präeklampsie, die mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid vorzugsweise das Peptid der SEQ ID Nr. 1 bzw. auch Peptide mit der Aminosäuresequenz AVHYQSN, SHFYQTR, GYYFDTN oder ENTNIT, enthalten. Sie reagieren mit den bei Präeklampsie vorkommenden spezifischen Antikörpern gegen blutdruckwirksame Angiotensin-AT Rezeptoren. Ggf. sind die antigenen Mittel an verschiedene Träger gebunden, wie z.B. aktivierte Sepharosen, Zellulosen oder Polystyrolträger.
Eine weitere Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide besteht in immunogenen Mitteln. Diese enthalten mindestens ein Peptid, vorzugsweise das Peptid der SEQ ID Nr. 1 bzw. auch Peptide mit der Aminosäuresequenz AVHYQSN, SHFYQTR, GYYFDTN oder ENTNIT, die die Produktion von Antikörpern, die fähig sind, Autoantigene bei Präeklampsie zu erkennen, induzieren.
Außerdem wird durch die Erfindung eine Testkit zur Bestimmung von Anti-ATr Rezeptor-Antikörpern zum Nachweis von Präeklampsie bereitgestellt.
Der Testkit umfaßt
- mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid ggf. an eine feste Phase gebunden
- einen Puffer
- ein spezifisches Konjugat nebst Enzym
- eine Waschlösung
- die Substratlösung zum Nachweis der Enzymreaktion
- und eine Stopplösung
Der Bio-Assay umfaßt
- spontan pulsierende neonatale Kardiomyocyten in Primärkultur oder
- aus undifferenzierten embryonalen Stammzellen differenzierte Kardiomyocyten
- in einem Kulturmedium
Durch Entwicklung des neuen Testkits auf der Basis der erfindungsgemäßen Peptide lassen sich der Nachweis von Präeklampsie und Verlaufsbeurteilungen einfach und schnell durchführen. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Nachweis von Anti-ATi -Rezeptor- Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten. Die zu untersuchende Probe wird mit mindestens einem erfindungsgemäßen Peptid oder mit einer Verbindung dieser Peptide mit einem Trägermaterial unter solchen Bedingungen in Kontakt gebracht, die eine Antigen-Antikörper-Reaktion zulassen. Der Nachweis wird anschließend mittels an sich bekannter chemischer oder physikalischer Methoden durchgeführt.
Die Anti-ATi -Rezeptor-Antikörper konnten in allen bisher untersuchten Seren von Patienten mit Präeklampsie nachgewiesen werden. Die Antikörper erscheinen nach der 20. Schwangerschaftswoche und verschwinden nach der Entbindung relativ schnell. Die Anti-ATi -Rezeptor-Antikörper wurden nicht bei normalen Schwangerschaften bzw. bei schwangeren Hypertonikerinnen nachgewiesen.
Da sich die Antikörper in in vitro Tests wie der Agonist Angiotensin II verhalten, kommt diesen Antikörpern eine Rolle in der Pathogenese oder Präeklampsie zu. Da sie in allen untersuchten Präeklampsieseren nachweisbar sind, sind sie als diagnostische Marker von Bedeutung.
Als Bioassay wurden kultivierte neonatale Rattenherzzellen eingesetzt. Diese Zellen entwickeln eine rhythmische spontane Pulsation und reagieren auf eine Angiotensin- Il-Stimulierung mit einer Steigerung der Schlagfrequenz.
Der Nachweis dieser A^ -Rezeptor-Antikörper dient erfindungsgemäß sowohl der Früherkennung einer Präeklampsie als auch als Grundlage für neuartige Therapieverfahren.
Gegenstand der Erfindung sind somit auch therapeutische Mittel gegen Präeklampsie, die diese Peptide enthalten, da die Entfernung der Angiotensin-ATi- Rezeptor-Antikörper aus dem mütterlichen Blut (zum Beispiel mittels spezifischer oder unspezifischer Immunadsorption) zu einer Besserung des klinischen Bildes führt oder zumindest eine Progredienz verhindern kann, was mit einer Verminderung der mütterlichen Gefährdung und insbesondere mit einer deutlichen Verbesserung der kindlichen Überlebenschancen verbunden ist.
Die spezifische Immunglobulinadsorption wird durchgeführt an einer Säule, an der sich Peptide befinden, in denen mindestens die Antikörper-bindende Sequenz AFHYESQ enthalten ist(die bevorzugt die zweite extrazelluläre Schleife des AT Rezeptors bzw. die Sequenz ID Nr. 1 enthält). Die unspezifische Immunglobulinadsorption wird durchgeführt an einer Säule, die bevorzugt Schafs- bzw. Hühnerantikörper gegen die humanen Immunglobuline bzw. Protein A oder C1q enthält.
Mit diesem Adsorber werden alle Ig des Blutplasmas, so auch die gegen den AT1- Rezeptor gerichteten Autoantikörper, gebunden und eliminiert unter Verwendung einer geeigneten und dem Fachmann bekannten Apparatur.
Die am Beispiel der Präeklampsie beschriebene Erfindung ist gleichermaßen anwendbar für einige Fälle der malignen Hypertonie, bei denen ein Autoantikörper gefunden wird, der dasselbe Epitop (dieselbe Sequenz) erkennt.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.
Abb. 1 :
Wirkung der Loops I - III des ATi -Rezeptors auf die zellkontrahierende Aktivität der Autoantikörper (enthalten in der aus dem Serum von Präeklampsiepatientinnen isolierten γ-Globulinfraktion)
Die γ-Globulinfraktion an dem Serum von Präeklampsiepatientinnen erhöht die Schlagfrequenz der Herzmuskelzellen um 22 + x Schläge pro Minute (fiktiv). Werden die γ-Globulinfraktionen mit Peptiden, die diese Loops I - III entsprechenden Teile des ATi -Rezeptors darstellen, vorinkubiert, und anschließend die Antikörper dem Zeil-Testsystem zugesetzt, hemmen die Loop Il-Peptide die Antikörper-Wirkung auf die Zellen.
Abb. 2:
Epitopanalyse von Loop II des ATi -Rezeptors - Wirkung von Aminosäuresequenzen aus Loop II auf die Autoantikörper-vermittelten Zellstimulationen
Die γ-Globulinfraktion an dem Serum von Präeklampsiepatientinnen erhöht die Schlagfrequenz der Herzmuskelzellen. Die Aminosäuresequenz AFHYESQ aus Loop II inhibiert die Wirkung der Autoantiköφer, nicht hingegen die Sequenzbereiche aus anderen Teilen vom Loop II. 3. Bioassay zum Nachweis der Antikörper
Zur Identifizierung und Charakterisierung der ATi -Rezeptor Antikörper wurde ein sensitiver Bioassay eingesetzt. Es wurden spontan pulsierende Herzmyozyten genutzt, die auf eine Angiotensin II Stimulierung mit einer Steigerung der Schlagfrequenz reagierten. Dieser positiv chronotrope Effekt wurde duch den selektiven Antagonisten Losartan geblockt. Die Inkubation dieser Zellen mit dem Anti-ATi -Rezeptor Autoantikörper führte ebenfalls zu einer Steigerung der Pulsationsrate, die durch Losartan unterbunden wurde. Des weiteren konnte dieser agonistische Effekt durch ein Peptid, das der zweiten extrazellulären Schleife des ATi-Rezeptors entsprach neutralisiert werden.
Um auf der zweiten extrazellulären Schleifen des Angiotensin II ATi -Rezeptors die Epitope der Autoantikörper zu identifizieren, wurde versucht mit kurzen sich überlappenden Peptiden die Anti- ATi -Rezeptor Autoantikörper zu neutralisieren. Es zeigte sich, dass auf dieser extrazellulären Schleife des ATi-Rezeptors von Hypertonikern zwei Epitope existieren, die in der Lage waren, die Wirkung des Antikörpers aufzuheben. Es handelte sich um die Epitope ENTNIT und AFHYESQ. Bei Präeklampsiepatienten wurde der über den ATi -Rezeptor realisierte agonistische Effekt der Antikörper nur durch das Peptid AFHYESQ neutralisiert. Dieses Epitop besitzt bei dieser Erkrankung eine besondere Bedeutung, da es bei allen untersuchten Patientinnen identifiziert wurde. Die funktionsanalogen Peptide SHFYQTR und GYYFDTN waren ebenfalls in der Lage die Antikörper zu neutralisieren Tab. I.
Tab. I Patientenantikörper vorbehandelt mit Peptid
Patient Antikörper + Peptid
Nr. 1 :40 AFHYESQ SHFYQTR GYYFDTN
1 19,6+1 ,90 1 ,2+0,84 0,8±1 ,16 2,4±0,72
2 20,0+1 ,90 1 ,6±1 ,24 0,8+0,80 2,8±1 ,20

Claims

Patentansprüche
1. Peptide des ATi-Rezeptors, vorzugsweise bestehend aus 5 bis 30, vorzugsweise 5 bis 10 Aminosäuren sowie ihre Varianten, die ein Epitop bilden und Autoantikörper binden können, die bei Präeklampsie und maligner Hypertonie vorkommen.
2. Peptide nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie ganz oder teilweise oder als Variante der SEQ ID Nr. 1 AFHYESQ aufgebaut sind.
3. Peptide nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie ganz oder teilweise oder als Variante der funktionsanalogen Peptide mit der Aminosäuresequenz AVHYQSN, SHFYQTR, GYYFDTN oder ENTNIT aufgebaut sind.
4. Antikörper, die gegen das Epitop des ATi -Rezeptors gerichtet sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Peptide gemäß Anspruch 1 bis 3 erkennen.
5. Antiköφer nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Peptide der SEQ ID Nr. 1 bzw. funktionsanaloge Peptide mit der Aminosäuresequenz AVHYQSN, SHFYQTR, GYYFDTN oder ENTNIT bzw. ihre Varianten erkennen.
6. Verwendung des ganzen humanen ATi-Rezeptors oder Teilen davon, mindestens enthaltend die Aminosäuresequenz AFHYESQ oder Teilen davon oder von funktionsanalogen Peptiden zur Bindung pathologischer, funktioneil aktiver Autoantikörper, zu diagonistischen und therapeutischen Zwecken bei Krankheiten mit positivem Antikörperstatus, insbesondere der Präeklampsie.
7. Verwendung nach Anspruch 6. dadurch gekennzeichnet, daß Autoantikörperbin- dende Varianten sowie funktionsanaloge Peptide von AFHYESQ benutzt werden.
8. Verwendung nach Anspruch 6 und 7. dadurch gekennzeichnet, daß rekombinant hergestellte Autoantikörperbindende Rezeptorteile des ATi -Rezeptors sowie funktionsanaloge Peptide verwendet werden.
9. Verwendung nach Anspruch 6 bis 8. dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz AFHYESQ sowie funktionsanaloge Peptide oder Varianten davon enthaltende Moleküle löslich oder festphasengebunden zum direkten oder indirekten (kompetitiven) Antikörpernachweis in Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut verwendet werden.
10. Verwendung nach Anspruch 6 bis 9. dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz AFHYESQ sowie funktionsanaloge Peptide oder Varianten davon enthaltende Moleküle festphasengebunden zur Bindung und Elimination der pathologischen, funktioneil aktiven Autoantikörper in Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, also zur Immunglobulinadsorption verwendet werden.
11. Verwendung nach Anspruch 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz AFHYESQ sowie funktionsanaloge Peptide oder Varianten davon enthaltende Moleküle festphasengebunden zur Bindung und Elimination der pathologischen, funktionell aktiven Autoantikörper in Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, also zur Immunglobulinadsroption verwendet werden.
12. Verwendung nach Anspruch 6 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäuresequenz AFHYESQ sowie funktionsanaloge Peptide oder Varianten davon enthaltende Moleküle festphasengebunden zur Bindung und Elimination der pathologischen, funktionell aktiven Autoantiköφer in Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, also zur Immunglobulinadsorption in Kombination mit unspezifischer (Gesamtimmungloblin-bindenden Liganden) verwendet werden.
13. Bindung und Elimination der pathologischen, funktionell aktiven Autoantikörper in Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, durch Verwendung unspezifischer Adsor- bermoleküle wie Protein A, Protein G, anti-human-lmmunglobuline sowie Gesamt-immungloblin-bindende Liganden wie Aminosäuren, insbesondere L- Tryptophan oder Peptide.
14. Verwendung von Peptiden, mindestens enthaltend die Aminosäuresequenz AFHYESQ sowie funktionsanaloge Peptide zur Immunisierung von Säugetieren zum Zwecke der Gewinnung poly- und monoklonaler Antikörper.
15. Verwendung von Antikörpern, die gegen die Aminosäuresequenz AFHYESQ und funktionsanaloge Peptide gerichtet sind, zur Immunisierung von Säugetieren zum Zwecke der Gewinnung antiidiotypischer Antikörper.
16.Antigenes Mittel zum Nachweis von Präeklampsie bzw. der malignen Hypertonie, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens ein Peptid gemäß der Ansprüche 1 bis 3, vorzugsweise der SEQ ID Nr. 1 , enthält.
17. Immunogenes Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens ein Peptid gemäß der Ansprüche 1 bis 3, vorzugsweise der SEQ ID Nr. 1 , enthält, das die Produktion von Antikörpern, die fähig sind, Autoantigene bei Präeklampsie oder maligner Hypertonie zu erkennen, induziert.
18. Testkit zur Bestimmung von Anti-ATi -Rezeptor-Antikörpern zum Nachweis von Präeklampsie oder maligner Hypertonie, enthaltend mindestens ein Peptid gemäß Anspruch 1 bis 3.
19. Verfahren zum Nachweis von Anti-ATi -Rezeptor-Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Probe mit mindestens einem Peptid der Ansprüche 1 bis 3 in Kontakt bringt oder einer Verbindung dieser Peptide mit einem Trägermaterial unter solchen Bedingungen, die eine Antigen-Antikörper-Reaktion zulassen und den Nachweis mittels an sich bekannter chemischer oder physikalischer Methoden führt.
20. Verwendung der Peptide gemäß Anspruch 1 bis 3 zur Herstellung therapeutischer Mittel gegen Präeklampsie oder maligne Hypertonie.
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