WO2001002018A2 - Intermolekular assoziierende verbindungen und diese umfassende aggregate - Google Patents

Intermolekular assoziierende verbindungen und diese umfassende aggregate Download PDF

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Alexandr Alexandrovich Chinarev
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials

Definitions

  • the present invention relates to special low-molecular compounds which are suitable for forming aggregates by intermolecular association.
  • the present invention also relates to aggregates comprising such compounds, and to methods for producing such aggregates.
  • the invention further relates to special uses of the compounds and aggregates, in particular for therapeutic and diagnostic purposes.
  • Multivalent interactions are very widespread in biology, and the interacting units can have ligands such as oligosaccharides, proteins, nucleic acids or lipids. Multivalent interactions are characterized by a large number of individual weak monovalent bonds, which are often preferred in biological systems over a single strong monovalent bond (M. Mammen, S-K. Choi, G. M. Whitesides, Angew. Chemie, 110, 2908, 1998).
  • Multivalent inhibitors are those in which several ligands are covalently attached to a low molecular weight support (LL Kiesling, NL Pohl, Chemistrv & Biolo ⁇ v. 3, 71, 1996; GD Glick, PL Toogood, DC Wiley, JJ Skehel, JR Knowles, J. Biol Chem., 266, 23660, 1991) or to a dendrimer (D. Zanini, R. Roy, J. Org. Chem., 63, 3486, 1998). In these cases, however, the specific binding affinity is increased only slightly.
  • WO 98/14215 discloses glucoconjugates as inhibitors of viral cell adhesion.
  • the compound [Neu5Ac ⁇ 2-6Galß1-4GlcNAcß1-NHCOCH 2 NH-CO (CH 2 ) 4 CO- (NHCH 2 -CO) 3 -NHCH 2 -] 4 C is disclosed.
  • this compound does not form aggregates in aqueous solution.
  • multivalent inhibitors are also known in which the active ligands are bound to a polymeric carrier. These compounds show increased efficiency compared to the corresponding monomeric ligands.
  • a multivalent polymer-based inhibitor affects this interaction (monovalent: K D ⁇ 2 xl O ⁇ M, multivalent: K D ⁇ 3 x 10 _7 M; A. Jonstein et al., J. Am. Chem. Soc, 113, 686, 1991).
  • the multivalent polymer inhibitors known to date are also unsuitable for therapeutic use.
  • the disadvantages are due to the polymer carrier molecules used and their properties.
  • High polymers (60-70 kDa) are no longer effectively filtered by the kidney, and their breakdown by the liver can lead to intolerance due to the formation of toxic metabolites.
  • Patent applications EP 601417 and WO 95/34673 describe polymer-based carbohydrate receptor blockers which are physiologically compatible as a whole molecule and as degradation products. These properties are achieved through the use of biodegradable polymers. However, these products also have a fundamental disadvantage for use as a pharmaceutical, because in practice polymers are not pure and precisely defined compounds, but rather consist of complex mixtures of compounds of different molecular sizes. This fact makes the use (approval) of such a polymeric inhibitor as a medicament extremely difficult.
  • Another group of multivalent inhibitors are compounds in which the ligands are bound to the surface of liposomes. Liposomes have the disadvantage that their lipophilic components can enter into unspecific interactions, e.g. through the installation in cell membranes.
  • X stands for an m-valued unit and the B are the same or different and stand for K-R, where
  • K stands for a bond or for A 1 - (A 2 -A 3 ) k -sp, where A 1 stands for (CH 2 ) t Y (CH 2 ) u , where
  • Y for> C O,> NH, -O-, -S- or a bond
  • t for an integer from 0 to 6 and u represents an integer from 0 to 6
  • a 2 represents -NHCO-, -CONH-, -OCONH- or SCONH-
  • a 3 represents (CH 2 ) r , 0 (CH 2 ) r , NH (CH 2 ) r , S (CH 2 ) r , or - (CHQ) -, where r is an integer from 1 to 6 and
  • Q stands for a substituted or unsubstituted alkyl or aryl group
  • sp stands for a divalent spacer or a bond
  • k stands for an integer from 5 to 100
  • R stands for hydrogen, a ligand suitable for specific binding to a receptor , a marker molecule or a catalytically active group
  • m is at least 2, with the proviso that
  • At least one R in the compound is not hydrogen
  • X, B and m are chosen so that an intermolecular association of K in the liquid phase is possible through the formation of hydrogen bonds with the formation of aggregates which present several R which are not hydrogen on the surface, and
  • the molecular weight of the fragment X (K) m is less than 20,000.
  • a 2 can also mean -CO-.
  • the molecular weight of the fragment X (K) m is less than 10,000, more preferably less than 4,000.
  • X, B and m are chosen such that an intermolecular association of K in the liquid phase, in particular also under aqueous conditions, preferably under in vivo conditions, with the formation of aggregates which have several on the surface Present R that are not hydrogen is possible.
  • the compounds of the present invention enable the polyvalent interaction of a molecular unit with several receptors with subsequent optimization of the ligand arrangement, a thermodynamically favorable arrangement being found without it undesirable side effects, such as the storage of the compounds in the cell membrane.
  • the compounds of the present invention are small molecules for which an action as an antigen is not to be expected and the other disadvantages occurring with polymeric polyvalent active ingredients are also avoided.
  • the molecular structure of the compounds of the general formula (I) is essentially characterized by three structural features: an m-valent fragment X, several molecular chains K, which are covalently bound to the fragment X, at least one terminal group R, one for specific binding is a suitable ligand, a marker molecule or a catalytically active group on a receptor.
  • the molecular chains K are characterized by a chemical structure which enables intermolecular association in the liquid phase even under aqueous, in particular in vivo conditions with the formation of aggregates.
  • the formation of the aggregates is based on non-covalent interactions, the non-covalent interactions being ionic interactions, van der Waals interactions, hydrophobic interactions or, preferably, hydrogen bonds.
  • the formation of non-covalent bonds between several compounds of the general formula (I) causes self-association and thus the formation of aggregates.
  • the compounds of the general formula (I) have at least one terminal group R which is derived, for example, from a biologically active ligand or a marker.
  • the terminal groups R are covalently bonded to the terminal ends of the molecular chains used for association. These groups can be bound directly or via a spacer.
  • a divalent molecular fragment can be used as a spacer, which is linked to the intermolecular association by non- covalent interactions does not participate, but only serves to hold the terminal groups R.
  • Such a spacer is formally part of the molecular chain K.
  • a 1 represents (CH 2 ) t Y (CH 2 ) u ,
  • t stands for an integer from 0 to 6
  • u stands for an integer from 0 to 6
  • a 2 stands for -NHCO-, - CONH-, -OCONH- or SCONH- stands, A 3 for (CH 2 ) r , 0 (CH 2 ) r ⁇ NH (CH 2 ) r , S (CH 2 ) r , or
  • Q stands for a substituted or unsubstituted alkyl or aryl group
  • sp stands for a divalent spacer or a bond
  • k stands for an integer from 5 to 100.
  • a 2 can also mean -CO-.
  • ligands which are suitable for specific binding to a receptor and act as terminal groups R of the compounds of the general formula (I) include naturally occurring biological recognition structures such as mono- or oligosaccharides, peptides, mono- or oligonucleotides or nucleotides. However, synthetic derivatives of these compounds or other organic or inorganic compounds which are recognized by biological receptors can also be used. Known compounds which are used in free form as therapeutic agents can also be used as ligands. Examples include:
  • Anti-tumor agents such as B. Daunomycin, Doxorubicin, Vinblastin, Bleomycin;
  • Antibiotics such as B. Peniciline, Erythromycine, Azidamfenicol, Cephalotin and
  • Inhibitors of the cyclooxygenase system such as. B. salicylic acid compounds
  • Anti-inflammatory drugs such as B. indomethacin;
  • Antirheumatics such as B. nifenazone;
  • Radionuclides such as bismuth
  • Inhibitors e.g. Zanamivir.
  • Oligosaccharides which are used on cell surfaces are preferably used Components of glycoproteins, glycolipids or proteoglycans occur, as well as any sections thereof.
  • oligosaccharides that can be used as the terminal group R are as follows: sialic acid, sialyllactose, sialyllactosamine, lactose, Gal ⁇ 1-3Gal, Gal ⁇ l- 3 (Fuc ⁇ 1-2) Gal, GalNAc ⁇ 1-3 (Fuc ⁇ 1-2) Gal, Neu5Ac ⁇ 2-6GalNAc , SiaLe A , SiaLe x , HS0 3 Le A , HS0 3 Le x , Gal ⁇ 1-3Galß1-4GicNAc, Gai ⁇ 1-3Galß1-4Glc, Neu5Ac ⁇ 2-6Galß1- 4GlcNAc.
  • sialic acid benzylglycoside HS0 3 GlcAß1 -3Gal, HS0 3 GlcAß1 -3Galß1 - 4GlcNAcß1 -3Galß1 -4Glc, GalNAc ⁇ , GalNAc ⁇ 1 -3 (Fuc ⁇ 1 -2) Galß1 -4GlcNAc, Gal ⁇ l - 3 (Fuc 1G0 -4) 3 (Sia) Le x , HS0 3 (Sia) Le A , Le ⁇ , GlcNAcß1 -6 (GlcNAcß1 - 3) Galß1-4Glc, GalNAcß1-4 (Neu5Ac ⁇ 2-3) Galß1-4Glc, mannose-6-phosphate, GalNAcßl- 4GlcNAc, oligo-sialic acid, N-glycolylneuraminic acid, Gal ⁇ 1 -4Galß1 -4Glc, Gal ⁇ l
  • the terminal groups R can also be derived from marker molecules.
  • marker molecules enable the compounds of the general formula (I) to be used in diagnostic applications.
  • All marker molecules known to the person skilled in the art for in vitro diagnostic test systems such as e.g. B. biotin, fluorescein, rhodamine, digoxygenin or radioactive markers are suitable for the purposes of the present invention.
  • markers known to those skilled in the art for in vivo diagnosis such as radioactive markers containing a bound radionuclide, e.g. B. Technetium, X-ray contrast media, the z. B. contain an iodinated compound, or nuclear magnetic resonance contrast agents, for. B. based on gadolinium compounds may be mentioned.
  • terminal groups R are selected so that aggregates are obtained which, on the one hand, interact with suitable receptors via suitable ligands through polyvalent interactions and, on the other hand, contain marker units. This makes the polyvalent interactions accessible for detection and the compounds can be used in a diagnostic procedure.
  • the aggregates can be constructed from compounds of the formula (I) which contain both ligand and marker residues.
  • Such an aggregate preferably comprises only a special compound of the general formula (I).
  • an aggregate can also comprise several different compounds of the formula (I), the compounds containing either ligands or marker residues.
  • the present invention further provides an aggregate of the following general formula (II)
  • X (B) m may be the same or different and stand for a compound of the general formula (I) as defined in one of claims 1 to 11, and n stands for 2 to 100,000, and wherein the X ( B) m are non-covalently bound.
  • the present invention provides an aggregate with a sheet-like structure and with a linear, cyclic, polycyclic, polyhedral, spherical or dendritic structure.
  • the aggregates can consist of two or more different compounds of the general formula (I).
  • the present invention also provides compounds of general formula (III).
  • the compounds of the general formula (III) correspond to those of the formula (II), where all terminal groups R stand for a hydrogen atom. These compounds can be used with the compounds of the general formula (I) described above in order to change the properties of the aggregates.
  • the present invention provides a compound of the general formula (III)
  • a 1 represents (CH 2 ) t Y (CH 2 ) u ,
  • t is an integer from 0 to 6
  • u is an integer from 0 to 6
  • a 2 stands for -NHCO-, -CONH-, -OCONH- or SCONH-,
  • a 3 represents (CH 2 ) r , 0 (CH 2 ) r , NH (CH 2 ) r , S (CH 2 ) r , or - (CHQ) -, where r is an integer from 1 to 6 and
  • Aryl group, sp stands for a divalent spacer or a bond, and stands for an integer from 5 to 100, and m is at least 2, with the proviso that
  • X, B and m are chosen such that an intermolecular association of K in the liquid phase, in particular under aqueous conditions, is possible by forming hydrogen bonds with the formation of aggregates, and
  • the molecular weight of the fragment X (K) m is less than 20,000, in particular less than 4,000.
  • a 2 can also mean -CO-.
  • K in formula (III) is
  • a 1 represents (CH 2 ) t Y (CH 2 ) u ,
  • t is an integer from 0 to 6
  • u is an integer from 0 to 6
  • a 2 stands for -NHCO-, -CONH-, -OCONH- or SCONH-, A 3 for (CH 2 ) r , 0 (CH 2 ) r , NH (CH 2 ) r , S (CH 2 ) r , or
  • Q stands for a substituted or unsubstituted alkyl or aryl group
  • sp stands for a divalent spacer or a bond
  • k stands for an integer from 5 to 100.
  • terminal groups are also advantageously linked via the active ester method to the compounds of the general formula (I) synthesized according to scheme 1 (scheme 2).
  • Fig. 3 shows the influence of the temperature and the presence of urea on the
  • the aggregates are high-molecular, non-covalent polymers that are formed by self-assembly of compounds of the general formula (I) (Scheme 3).
  • the non-covalent nature of the bonds between the compounds of the general formula (I) causes the reversibility of the aggregate formation and, when the external conditions change, enables the aggregates to dissociate to compounds of the general formula (I) or their conversion into other aggregates, in each case in In terms of the formation of the most thermodynamically stable structures.
  • the external conditions which determine the formation of the aggregates and the course of the intermolecular association include, in addition to the temperature, the pH and the type and composition of the solvent. It was shown by light scattering studies that the compound [HCl H-Gly 7 -NHCH 2 -] 4 C (22a) is present in water at 20 ° C in an unassociated form, but by adding a 0.8 M NaHC0 3 solution Self-association of the connection is achieved. The association can then be reversed by adding HCI (see Example 9).
  • the formation of aggregates is also influenced by the presence of components which can interact with the compounds of the general formula (I). These can be organic molecules, e.g. B. Compounds of formula (III), urea ( Figure 3), trifluoroethanol, methanol, acetone or other organic solvents. There may also be other compounds of the general formula (I) or (III) which on their own - under the given conditions - do not form any associates.
  • the process of self-association is also influenced by the interactions between the ligands and the corresponding receptors.
  • This influence can e.g. B. consist in the fact that only the presence of the receptors causes an association of compounds of the general formula (I), under conditions in which no association of these compounds would otherwise take place.
  • the reversibility of the aggregate formation also makes it possible for aggregates to change in the presence of receptors while rearranging or changing the composition in such a way that a thermodynamically favorable state of the overall system consisting of aggregate and receptor is achieved.
  • the aggregates can therefore adapt to different receptor arrangements and thus optimize an interaction between the receptors and ligands. This optimization through subsequent adaptation of the polyvalent interactions represents a significant advantage over the prior art.
  • Tables 2 and 3 show the influence of the matrix structure on the inhibition of viral cell adhesion by influenza viruses, measured in a fetuin binding assay known to the person skilled in the art. Doing so reinforces the specific activity of the inhibitor by more than three orders of magnitude compared to the activity of the free ligand Neu ⁇ Ac ⁇ Bn in the case of the aggregate ⁇ [Neu5Ac-Gab-Ad-AC 3 -Gly 5 -NHCH 2 -] 4 C ⁇ X (44).
  • Another example of the increase in the biological activity of a biological ligand by its binding to an aggregate is the compound ⁇ [B dr Ap-Ad-AC 3 - Gly g -NHCH 2 -] 4 C ⁇ X (49) as an inhibitor of cytotoxicity of human blood sera against the pig kidney kidney cells PK15.
  • the aggregate (49) shows a specific activity three orders of magnitude higher than the free ligand Gal ⁇ 1-3Gal (B-disaccharide).
  • Mass spectra were recorded with a time-of-flight spectrometer of the type MSBCh (Sumy, Ukraine) (ionization by fission products from Californium-252 at an acceleration voltage of +15 eV).
  • silica gel 60 (Merck) and silica gel 60 glass plates with fluorescent Indicator F254 (Merck) used.
  • Tetrakis (aminomethyl) methane tetrahydrochloride (1) was prepared analogously to the literature (E. B. Fleischer, A.E. Gebala, A. Levey, P.A.
  • Neu5Ac ⁇ 2-3Galß1-4Glcß-NHCOCH 2 NH 2 (12) was prepared analogously to the literature (LM Likhosherstov, OS Novikova, VA Derevitskaja, NK Kochetkov, Carbohydrate Research, 146, C1-C5, 1986; and ID Manger, TW Rademacher, RA Dwek, Biochemistry, 31, 10724, 1992).
  • BocGlyNOS, BocGlyGlyNOS and BocAC-ONp were prepared using N.N'-dicyclohexylcarbodiimide analogously to the literature (GW Anderson, JE Zimmerman, FM Callahan, J. Amer. Chem. Soc. 86, 1839, 1964; M. Bodanszky , V. du Vigneaud,, J. Amer. Chem. Soc, 81, 5688, 1959).
  • the compound Neu5Ac-Gab-Ad-ONp (15) was prepared in an analogous manner from (3) and Neu5Ac ⁇ -OCH 2 (pC 6 H 4 ) -NHCOCH 2 NH 2 (US Patent 5,571, 836, 1996) manufactured .
  • Gal ⁇ 1-3Galß-O (CH 2 ) 3 NHCO (CH 2 ) 4 COO (pC 3 H 4 NO 2 ) (16) was prepared in an analogous manner from (3) and Gal ⁇ 1-3Galß-0 (CH 2 ) 3 NH 2 (13).
  • New 5Ac ⁇ 2-OCH 2 C 6 H 4 fragment 1,677, 1,918, 1,975, 2,024 and 2,094 (s, 15H, 5 COCH 3 ), 1,761 (dd, 1 H, J 4 12.2 Hz, H-3ax), 2,570 (dd , 1H, J 3ax 12.5 Hz, J 4 4.6 Hz, H-3eq), 3,697 (s, 3H, COOCH 3 ), 3,904 (ddd, 1H, J 4 10.3 Hz, H-5), 4,028 (dd, 1 H , J 8 6.3 Hz, H-9b), 4.087 (dd, 1 H, J 5 10.7 Hz, H-6), 4.233 (dd, 1 H, J 9b 12.5 Hz, J 8 3 Hz, H-9a), 4,320 and 4,643 (d, 2H, J 11.8 Hz, ArCÜ), 4,711 (ddd, 1 H, H-4), 5,192 (ddd, 1 H, J 8 8.4 Hz,
  • New 5Ac ⁇ 2-OCH 2 C 6 H 4 fragment 1,677, 1,918, 1,975, 2,024 and 2,094 (s, 15H, 5 COCH 3 ), 1,761 (dd, 1 H, J 4 12.2 Hz, H-3ax), 2,570 (dd , 1 H, J 3ax 12.5 Hz, J 4 4.6 Hz, H-3eq), 3,697 (s, 3H, COOCH 3 ), 3,904 (ddd, 1 H, J 4 10.3 Hz, H-5), 4,028 (dd, 1 H, J 8 6.3 Hz, H-9b), 4.087 (dd, 1 H, J 5 10.7 Hz, H-6), 4.233 (dd, 1 H, J 9b 12.5 Hz, J 8 3 Hz, H-9a ), 4,320 and 4,643 (d, 2H, J 11.8 Hz, ArCJi), 4,711 (ddd, 1 H, H-4), 5,192 (dd, 1 H, J 8 8.4 Hz,
  • Neu5Ac ⁇ 2-OCH 2 C 6 H 4 fragment 1,677, 1,918, 1,975 , 2,024 and 2,094 (s, 15H, 5 COCH 3 ), 1,761 (dd, 1 H, J 4 12.2 Hz, H-3ax), 2,570 (dd, 1 H, J 3ax 12.5 Hz, J 4 4.6 Hz, H- 3eq), 3,697 (s, 3H, COOCH 3 ), 3,904 (ddd, 1 H, J 4 10.3 Hz, H-5), 4,028 (dd, 1 H, J 8 6.3 Hz, H-9b), 4,087 (ddd , 1 H, J 5 10.7 Hz, H-6), 4,233 (dd, 1 H, J 9b 12.5 Hz, J 8 3 Hz, H-9a), 4,320 and 4,643 (d, 2H, J 11.8 Hz, ArCH, ), 4,711 (ddd, 1 H, H-4), 5,192 (dd, 1 H, J 8 8.4
  • New 5Ac ⁇ 2-OCH 2 C 6 H 4 fragment 1,677, 1,918, 1,975, 2,024 and 2,094 (s, 15H, 5 COCH 3 ), 1,761 (dd, 1 H, J 4 12.2 Hz, H-3ax), 2,570 (dd , 1 H, J 3ax 12.5 Hz, J 4 4.6 Hz, H-3eq), 3,697 (s, 3H, COOCH 3 ), 3,904 (ddd, 1 H, J 4 10.3 Hz, H-5), 4,028 (dd, 1 H, J 8 6.3 Hz, H-9b), 4.087 (dd, 1 H, J 5 10.7 Hz, H-6), 4.233 (dd, 1 H, J 9b 12.5 Hz, J 8 3 Hz, H-9a ), 4,320 and 4,643 (d, 2H, J 11.8 Hz, ArCH,), 4,711 (ddd, 1 H, H-4), 5,192 (ddd, 1 H, J 8 8.4 Hz,
  • Neu ⁇ Ac ⁇ fragment 1, 680 (dd, 1 H, J 4 12 Hz, H-3ax), 2.036 (s, 3H, NAc), 2.778 (dd, 1 H, J 3ax 12.5 Hz, J 4 4, 6 Hz, H-3eq), 3.598 (dd, 1 H, J 8 9 Hz, H-7), 3.636 (dd, 1 H, J 8 6 Hz, H-9b), 3.695 (ddd, 1 H, J 5 9.8 Hz, H-4), 3.728 (dd, 1 H, J 7 1.5 Hz, J 5 10.2 Hz, H-6), 3.782 (ddd, 1 H, H-8), 3.822 (dd, 1H, H-5), 3.846, (dd, 1H, J 9b 12 Hz, J 8 2.3 Hz, H-9a).
  • Neu ⁇ Ac ⁇ fragment 1, 680 (dd, 1 H, J 4 12 Hz, H-3ax), 2.036 (s, 3H, NAc), 2.778 (dd, 1 H, J 3ax 12.5 Hz, J 4 4.6 Hz, H -3eq), 3.598 (dd, 1 H, J 8 9 Hz, H-7), 3.636 (dd, 1 H, J 8 6 Hz, H-9b), 3.695 (ddd, 1 H, J 5 9.8 Hz, H-4), 3.728 (dd, 1 H, J 7 1, 5 Hz, J 5 10.2 Hz, H-6), 3.782 (ddd, 1 H, H-8), 3.822 (dd, 1 H, H-5), 3.846, (dd, 1 H, J 9b 12 Hz, J 8 2.3 Hz, H-9a).
  • Neu ⁇ Ac fragment 1, 680 (dd, 1 H, J 4 12 Hz, H-3ax), 2.036 (s, 3H, NAc), 2.778 (dd, 1 H, J 3ax 12.5 Hz, J 4 4, 6 Hz, H-3eq), 3.598 (dd, 1 H, J 8 9 Hz, H-7), 3.636 (dd, 1 H, J 8 6 Hz, H-9b), 3.695 (ddd, 1 H, J 5 9.8 Hz, H-4), 3.728 (dd, 1 H, J 7 1.5 Hz, J 5 10.2 Hz, H-6), 3.782 (ddd, 1 H, H-8), 3.822 (dd, 1H, H-5), 3.846, (dd, 1H, J 9b 12 Hz, J 8 2.3 Hz, H-9a).
  • Neu ⁇ Ac ⁇ fragment 1, 680 (dd, 1 H, J 4 12 Hz, H-3ax), 2.036 (s, 3H, NAc), 2.778 (dd, 1 H, J 3ax 12.5 Hz, J 4 4, 6 Hz, H-3eq), 3.598 (dd, 1 H, J 8 9 Hz, H-7), 3.636 (dd, 1 H, J 8 6 Hz, H-9b), 3.695 (ddd, 1 H, J 5 9.8 Hz, H-4), 3.728 (dd, 1 H, J 7 1.5 Hz, J 5 10.2 Hz, H-6), 3.782 (ddd, 1 H, H-8), 3.822 (dd, 1H, H-5), 3.846, (dd, 1H, J 9b 12 Hz, J 8 2.3 Hz, H-9a).
  • Neu ⁇ Ac ⁇ fragment 1, 680 (dd, 1 H, J 4 12 Hz, H-3ax), 2.036 (s, 3H, NAc), 2.778 (dd, 1 H, J 3ax 12.5 Hz, J 4 4, 6 Hz, H-3eq), 3.598 (dd, 1 H, J 8 9 Hz, H-7), 3.636 (dd, 1 H, J 8 6 Hz, H-9b), 3.695 (ddd, 1 H, J 5 9.8 Hz, H-4), 3.728 (dd, 1 H, J 7 1.5 Hz, J 5 10.2 Hz, H-6), 3.782 (ddd, 1 H, H-8), 3.822 (dd, 1H, H-5), 3.846, (dd, 1H, J 9b 12 Hz, J 8 2.3 Hz, H-9a).
  • Neu ⁇ Ac ⁇ fragment 1, 680 (dd, 1 H, J 4 12 Hz, H-3ax), 2.036 (s, 3H, NAc), 2.778 (dd, 1 H, J 3ax 12.5 Hz, J 4 4, 6 Hz, H-3eq), 3.598 (dd, 1 H, J 8 9 Hz, H-7), 3.636 (dd, 1 H, J 8 6 Hz, H-9b), 3.695 (ddd, 1 H, J 5 9.8 Hz, H- 4), 3.728 (dd, 1 H, J 7 1.5 Hz, J 5 10.2 Hz, H-6), 3.782 (ddd, 1 H, H-8), 3.822 (dd, 1H, H-5), 3.846, (dd, 1H, J 9b 12 Hz, J 8 2.3 Hz, H-9a).
  • Neu ⁇ Ac ⁇ fragment 1, 680 (dd, 1 H, J 4 12 Hz, H-3ax), 2.036 (s, 3H, NAc), 2.778 (dd, 1 H, J 3ax 12.5 Hz, J 4 4, 6 Hz, H-3eq), 3, ⁇ 98 (dd, 1 H, J 8 9 Hz, H-7), 3.636 (dd, 1 H, J 8 6 Hz, H-9b), 3.69 ⁇ (ddd, 1 H, J 5 9.8 Hz, H-4), 3.728 (dd, 1 H, J 7 1, ⁇ Hz, J 5 10.2 Hz, H-6), 3.782 (ddd, 1 H, H- 8), 3.822 (dd, 1 H, H- ⁇ ), 3.846, (dd, 1 H, J 9b 12 Hz, J 8 2.3 Hz, H-9a).
  • Neu ⁇ Ac ⁇ fragment 1, 680 (dd, 1H, J 4 12 Hz, H-3ax), 2.036 (s, 3H, NAc), 2.778 (dd, 1H, J 3ax 12.5 Hz, J 4 4.6 Hz , H-3eq), 3, ⁇ 98 (dd, 1 H, J 8 9 Hz, H-7), 3.636 (dd, 1 H, J 8 6 Hz, H-9b), 3.69 ⁇ (ddd, 1H, J 5 9.8 Hz, H-4), 3.728 (dd, 1 H, J 7 1, 5 Hz, J 5 10.2 Hz, H-6), 3.782 (ddd, 1H, H-8), 3.822 (dd, 1H, H-5), 3.846, (dd, 1H, J 9b 12 Hz, J 8 2.3 Hz, H-9a).
  • Neu ⁇ Ac ⁇ fragment 1, 680 (dd, 1 H, J 4 12 Hz, H-3ax), 2.036 (s, 3H, NAc), 2.778 (dd, 1 H, J 3ax 12, ⁇ Hz, J 4
  • the particle size determined here was ⁇ 2.5 nm.
  • 50 ⁇ l of a 0.8 M NaHC0 3 solution were added to this solution.
  • the light scattering was measured as described above, the average particle size determined here being 200-400 nm.
  • Carbohydrate signals 1, 730 (dd, 1 H, H-3ax Neu ⁇ Ac), 2.049 and 2.078 (s, 2x3H, 2 COCH 3 , Neu ⁇ Ac and GIcNAc), 2.693 (dd, 1 H, J 3ax 12.4 Hz, J 4 4.6 Hz, H-3eq Neu ⁇ Ac), 3.64-3.96 (21 H, superimposition of carbohydrate signals and OCH 2 ), 4.468 (d, 1 H, J 2 8 Hz, H-1 Gal) , 4, ⁇ 62 (d, 1 H, J 2 8 Hz, H-1 GlcNAc).
  • the compound [6'SLN-Ap-Ad-AC 2 -Gly 5 -NHCH 2 ] 4 C was prepared in an analogous manner starting from tetrahydrochloride [HCl-H-AC 2 -Gly 5 -NHCH 2 ] 4 C (24a ) and NeuAc ⁇ 2-6Galß1 -4GlcNAcß-0 (CH 2 ) 3 NH-CO (CH 2 ) 4COO (pC 6 H 4 N0 2 ) ( ⁇ 2). Yield ( ⁇ 4) - 63%.
  • TLC R f ⁇ 0 (i-PrOH / acetone / H 2 0 4: 3: 2).
  • ⁇ 4 C does not form aggregates according to the invention, as was shown by the following methods:

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Abstract

Verbindung der allgemeinen Formel (I): X(B)m, wobei X für eine m-wertige Einheit steht und die B gleich oder verschieden sind und für K-R stehen, wobei K für eine Bindung oder für A?1-(A2-A3)¿k-sp steht, wobei A1 für (CH¿2?)tY(CH2)u steht, wobei Y für ⊃C=O, ⊃NH, -O-, -S- oder eine Bindung, t für eine ganze Zahl von 0 bis 6 und u für eine ganze Zahl von 0 bis 6 steht, A?2¿ für -NHCO-, -CONH-, -OCONH- oder SCONH- steht, oder für -CO- steht, A3 für (CH¿2?)r, O(CH2)r, NH(CH2)r, S(CH2)r, oder -(CHQ)- steht, wobei r für eine ganze Zahl von 1 bis 6 und Q für eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl- oder Aryl- Gruppe steht, sp für einen zweiwertigen Spacer oder eine Bindung steht, und k für eine ganze Zahl von 5 bis 100 steht, und R für Wasserstoff, einen zur spezifischen Bindung an einen Rezeptor geeigneten Liganden, ein Marker-Molekül oder eine katalytisch aktive Gruppe steht, und m mindestens 2 ist, mit der Massgabe, dass (1) in der Verbindung mindestens ein R nicht Wasserstoff ist, (2) mindestens zwei K vorliegen, die nicht für eine Bindung stehen, und (3) X, die B und m so gewählt sind, dass eine intermolekulare Assoziation der K in flüssiger Phase durch Bildung von Wasserstoffbrücken-Bindungen unter Ausbildung von Aggregaten, die auf der Oberfläche mehrere R präsentieren, die nicht Wasserstoff sind, möglich ist, und (4) die Molmasse des Fragments X(K)m weniger als 20.000 beträgt.

Description

Intermolekular assoziierende Verbindungen und diese umfassende Aggregate
Die vorliegende Erfindung betrifft spezielle niedermolekulare Verbindungen, die geeignet sind durch intermolekulare Assoziation Aggregate zu bilden. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Aggregate, die solche Verbindungen umfassen, sowie Verfahren zur Herstellung solcher Aggregate. Ferner betrifft die Erfindung spezielle Verwendungen der Verbindungen und Aggregate, insbesondere für therapeutische und diagnostische Zwecke.
Die simultane und spezifische Assoziation von mindestens zwei Liganden mit entsprechenden Rezeptoren führt zu multivalenten Wechselwirkungen zwischen zwei Einheiten, die diese Liganden bzw. Rezeptoren tragen. Derartige multivalente Wechselwirkungen sind in der Biologie sehr weit verbreitet, wobei die wechselwirkenden Einheiten Liganden, wie Oligosaccharide, Proteine, Nucleinsäuren, oder Lipide aufweisen können. Multivalente Wechselwirkungen sind gekennzeichnet durch eine Vielzahl von einzelnen schwachen monovalenten Bindungen, die in biologischen Systemen häufig gegenüber einer einzigen starken monovalenten Bindung bevorzugt sind (M. Mammen, S-K. Choi, G. M. Whitesides, Angew. Chemie, 110, 2908, 1998).
In biologischen Systemen werden multivalente Wechselwirkungen häufig dann ausgebildet, wenn Bindungen zwischen Einheiten mit wenig affinen Liganden und Rezeptoren ausgebildet werden. Bekannte Beispiele für Wechselwirkungen zwischen wenig affinen Liganden und Rezeptoren sind Kohlenhydrat-Protein- und Kohlenhydrat- Kohlenhydrat-Wechselwirkungen (A. Danguy, K. Kayser, N. V. Bovin, H.-J. Gabius, Trends Glycosc. Glycotech., 7, 261 , 1995), die beispielsweise bei viralen und bakteriellen Infektionen, bei der Einleitung von Entzündungsprozessen, bei derTumor- Metastasierung oder bei der Immunerkennung eine entscheidende Rolle spielen.
Natürliche multivalente Wechselwirkungen können insbesondere zu therapeutischen und diagnostischen Zwecken blockiert werden. Für die in-vitro Blockierung derartiger multivalenter Wechselwirkungen sind bisher sowohl monovalente als auch multivalente Inhibitoren eingesetzt worden.
Bei Derivaten von natürlichen Liganden als monovalente Inhibitoren zeigt sich in der Praxis, dass aufgrund der geringen Bindungsaffinität keine effiziente Inhibition multivalenter Wechselwirkungen erreicht werden kann. Zum Beispiel beträgt die Bindungskonstate bei der Wechselwirkung zwischen einem monovalenten Galaktosid und dem entsprechenden Lectin lediglich KD ~ l O^M (D. T. Connolly et al., J. Bio!. Chem., 257, 939, 1982). Für eine therapeutische Anwendung müssten in einem solchen Fall sehr grosse Mengen I nhibitor eingesetzt werden . Ei ne Behandlungsmethode mit einem solchen Inhibitor wäre somit nicht wirtschaftlich.
Als multivalente Inhibitoren sind solche, bei denen mehrere Liganden kovalent an einen niedermolekularen Träger (L. L. Kiesling, N. L. Pohl, Chemistrv & Bioloαv. 3, 71 , 1996; G. D. Glick, P. L. Toogood, D. C. Wiley, J. J. Skehel, J. R. Knowles, J. Biol. Chem., 266, 23660, 1991) oder an ein Dendrimer (D. Zanini, R. Roy, J. Org. Chem., 63, 3486, 1998) gebunden sind, bekannt. In diesen Fällen wird jedoch die spezifische Bindungsaffinität nur geringfügig erhöht.
Die WO 98/14215 offenbart Glucokonjugate als Inhibitoren der viralen Zelladhäsion. Insbesondere wird die Verbindung [Neu5Acα2-6Galß1-4GlcNAcß1-NHCOCH2NH- CO(CH2)4CO-(NHCH2-CO)3-NHCH2-]4C offenbart. Diese Verbindung bildet jedoch in wäßriger Lösung keine Aggregate.
Ferner sind auch multivalente Inhibitoren bekannt, bei denen die aktiven Liganden an einen polymeren Träger gebunden sind. Diese Verbindungen zeigen im Vergleich zu den entsprechenden monomeren Liganden eine erhöhte Effizienz. Am Beispiel der Wechselwirkung zwischen dem Influenza-Hämagglutinin, das an Neuraminsäure- Derivate an der Zelloberfläche bindet, wurde gezeigt, wie sich die Verwendung eines multivalenten Inhibitors auf Polymer-Basis auf diese Wechselwirkung auswirkt (monovalent: KD ~ 2 x l O^M, multivalent: KD ~ 3 x 10_7 M; A. Spaltenstein et al., J. Am. Chem. Soc, 113, 686, 1991).
Trotz der verbesserten Wirksamkeit sind auch die bisher bekannten multivalenten polymeren Inhibitoren für einen therapeutischen Einsatz nicht geeignet. Die Nachteile sind hierbei auf die verwendeten polymeren Trägermoleküle und auf deren Eigenschaften zurückzuführen.
Bei der Verwendung von Polylysin oder von sulfatierten Polysacchariden als polymere Träger treten unspezifische ionische Wechselwirkungen mit Zelloberflächenstrukturen auf.
Polyacrylamide und andere Polymere, deren Polymeranteil ausschliesslich aus C-C-Bindungen besteht, haben den entscheidenden Nachteil, dass sie im Organismus zu toxischen Metaboliten abgebaut werden.
Hochpolymere (60-70 kDa) werden nicht mehr wirkungsvoll von der Niere filtriert, wobei ihr Abbau durch die Leber durch die Bildung von toxischen Metaboliten zu Unverträglichkeiten führen kann.
In den Patentanmeldungen EP 601417 und WO 95/34673 werden Kohlenhydrat- rezeptorblocker auf Polymerbasis beschrieben, die als Gesamtmolekül und als Abbauprodukte physiologisch verträglich sind. Diese Eigenschaften werden durch die Verwendung von biodegradablen Polymeren erreicht. Für einen Einsatz als Arzneimittel haben jedoch auch diese Produkte einen grundsätzlichen Nachteil, denn Polymere sind in der Praxis keine reinen und exakt definierten Verbindungen, sondern bestehen vielmehr aus komplexen Gemischen von Verbindungen unterschiedlicher molekularer Grosse. Durch diesen Umstand wird die Anwendung (Zulassung) eines solchen polymeren Inhibitors als Arzneimittel ausserordentlich erschwert.
Wichtig für ein Arzneimittel sind genaue Kenntnisse der Zusammenhänge zwischen der chemischen Struktur eines Wirkstoffs und seinen pharmakologischen Eigenschaften. Im Falle von Substanz-Gemischen müsste gezeigt werden, in welcher Art und Weise die Zusammensetzung eines Gemisches seine jeweiligen pharmakologischen Eigenschaften beeinflusst. Zudem muss ein Arzneimittel in seiner chemischen Zusammensetzung genau definiert sein und nachweislich in eben dieser hergestellt werden können. Beide Voraussetzung können im Fall der polymeren multivalenten Inhibitoren mit den derzeit verfügbaren synthetischen und analytischen Methoden und unter einem technisch sinnvollen Aufwand nicht erfüllt werden.
Eine weitere Gruppe von multivalenten Inhibitoren bilden Verbindungen bei denen die Liganden an die Oberfläche von Liposomen gebunden sind. Liposome haben den Nachteil, dass ihre lipophilen Bestandteile unspezifische Wechselwirkungen eingehen können, z.B. durch den Einbau in Zellmembranen.
Daher ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden und neue Verbindungen mit verbesserten Eigenschaften als mutivalente Inhibitoren biologischer Erkennungsprozesse bereitzustellen, wobei die Verbindungen spezifisch wirken und zur Verwendung als Arzneimittel geeignet sind.
Diese Aufgabe wird gemäß der Ansprüche gelöst mit einer Verbindung der allgemeinen Formel (I)
X(B)m (I)
wobei
X für eine m-wertige Einheit steht und die B gleich oder verschieden sind und für K-R stehen, wobei
K für eine Bindung oder für A1-(A2-A3)k-sp steht, wobei A1 für (CH2)tY(CH2)u steht, wobei
Y für >C=O, >NH, -O-, -S- oder eine Bindung, t für eine ganze Zahl von 0 bis 6 und u für eine ganze Zahl von 0 bis 6 steht, A2 für -NHCO-, -CONH-, -OCONH- oder SCONH- steht, A3 für (CH2)r, 0(CH2)r, NH(CH2)r, S(CH2)r, oder -(CHQ)- steht, wobei r für eine ganze Zahl von 1 bis 6 und
Q für eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl- oder Aryl- Gruppe steht, sp für einen zweiwertigen Spacer oder eine Bindung steht, und k für eine ganze Zahl von 5 bis 100 steht, und R für Wasserstoff, einen zur spezifischen Bindung an einen Rezeptor geeigneten Liganden, ein Marker-Molekül oder eine katalytisch aktive Gruppe steht, und m mindestens 2 ist, mit der Maßgabe, dass
(1 ) in der Verbindung mindestens ein R nicht Wasserstoff ist,
(2) mindestens zwei K vorliegen, die nicht für eine Bindung stehen, und
(3) X, die B und m so gewählt sind, dass eine intermolekulare Assoziation der K in flüssiger Phase durch Bildung von Wasserstoffbrücken- Bindungen unter Ausbildung von Aggregaten, die auf der Oberfläche mehrere R präsentieren, die nicht Wasserstoff sind, möglich ist, und
(4) die Molmasse des Fragments X(K)m weniger als 20.000 beträgt.
In der Verbindung der Formel (I) kann A2 auch -CO- bedeuten.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche.
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Molmasse des Fragments X(K)m weniger als 10.000, noch bevorzugter weniger als 4.000.
Durch Selbstassoziation von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) entstehen Aggregate, die als hocheffiziente multivalente Inhibitoren biologischer Erkennungsprozesse wirken.
Bei den Verbindungen der Formel (I) sind X, die B und m so gewählt, dass eine intermolekulare Assoziation der K in flüssiger Phase, insbesondere auch unter wässrigen Bedingungen, vorzugsweise unter in vivo Bedingungen, unter Ausbildung von Aggregaten, die auf der Oberfläche mehrere R präsentieren, die nicht Wasserstoff sind, möglich ist.
Es wurde gefunden, dass durch die Ausbildung der erfindungsgemäßen Aggregate die Nachteile der bisher bekannten multivalenten Wirkstoffe vermieden werden können.
Es wurde insbesondere gefunden, dass die geringe Erhöhung der Bindungsaffinität gegenüber einem monovalenten Wirkstoff bei kovalenter Bindung mehrerer Liganden an einen niedermolekularen Träger oder an ein Dendrimer darauf zurückzuführen ist, dass solche Moleküle zwar mehrere Liganden präsentieren, diese aber nicht oder nur teilweise so angeordnet werden können, dass es zu einer thermodynamisch günstigen Wechselwirkung mit Rezeptoren kommt. Es wurde gefunden , dass die Wechselwirkung eines polyvalenten Wirkstoffs verbessert werden kann, indem die Ligandenanordnung mit der Rezeptorenanordnung dynamisch gekoppelt wird. Es wurde gefunden, dass diese dynamische Kopplung über eine intermolekulare Aggregatbildung erreicht werden kann, bei der sich spezielle Molekülbereiche des Wirkstoffs intermolekular assozieren und so eine Anpassung der Ligandenanordnung ermöglicht wird. Schließlich wurde gefunden, dass die dadurch ermöglichte Anpassung der Ligandenanordnung zu einer drastischen Erhöhung der Bindungsaffinität des polyvalenten Wirkstoffs führt.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung ermöglichen durch die Reversibilität der Aggregatbildung die polyvalente Wechselwirkung einer molekularen Einheit mit mehreren Rezeptoren unter nachträglicher Optimierung der Ligandenanordnung, wobei eine thermodynamisch günstige Anordung gefunden wird ohne dass es zu unerwünschten Nebenwirkungen, wie der Einlagerung der Verbindungen in die Zellmembran, kommt.
Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind kleine Moleküle für die eine Wirkung als Antigen nicht zu erwarten ist und auch die anderen bei polymeren polyvalenten Wirkstoffen auftretenden Nachteile vermieden werden.
Der molekulare Aufbau der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) ist im wesentlichen gekennzeichnet durch drei Strukturmerkmale: ein m-wertiges Fragment X, mehrere Molekülketten K, die kovalent an das Fragment X gebunden sind, mindestens eine terminale Gruppe R, die ein zur spezifischen Bindung an einen Rezeptor geeigneter Ligand, ein Marker-Molekül oder eine katalytisch aktive Gruppe ist.
Die Molekülketten K zeichnen sich durch eine chemische Struktur aus, die eine intermolekulare Assoziation in flüssiger Phase auch unter wässrigen, insbesondere in vivo Bedingungen unter Ausbildung von Aggregaten ermöglicht. Die Ausbildung der Aggregate beruht auf nicht-kovalenten Wechselwirkungen, wobei die nicht-kovalenten Wechselwirkungen ionische Wechselwirkungen, van der Waals-Wechselwirkungen, hydrophobe Wechselwirkungen oder bevorzugt Wasserstoffbrückenbindungen sein können. Der Aufbau von nicht-kovalenten Bindungen zwischen mehreren Verbindungen der allgemeinen Formel (I) bewirkt eine Selbstassoziation und somit die Bildung von Aggregaten.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) weisen mindestens eine terminale Gruppe R auf, die beispielsweise von einem biologisch aktiven Liganden oder einem Marker abgeleitet ist. Die terminalen Gruppen R sind kovalent an die terminalen Enden der zur Assoziation dienenden Molekülketten gebunden. Die Bindung dieser Gruppen kann direkt oder über einen Spacer geschehen. Als Spacer kann ein zweiwertiges Molekülfragment dienen, das an der intermolekularen Assoziation durch nicht- kovalente Wechselwirkungen nicht teilnimmt, sondern lediglich dazu dient, die terminalen Gruppen R zu halten. Ein solcher Spacer ist formal Teil der Molekülkette K.
Erfindungsgemäß kann K in der Formel (I) für
A1-(A2-A3)k-sp
stehen, wobei
A1 für (CH2)tY(CH2)u steht, wobei
Y für >C=O, >NH, -O-, -S- oder eine Bindung, t für eine ganze Zahl von 0 bis 6 und u für eine ganze Zahl von 0 bis 6 steht, A2 für -NHCO-, -CONH-, -OCONH- oder SCONH- steht, A3 für (CH2)r, 0(CH2)rι NH(CH2)r, S(CH2)r, oder
-(CHQ)- steht, wobei r für eine ganze Zahl von 1 bis 6 und
Q für eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl- oder Aryl- Gruppe steht, sp für einen zweiwertigen Spacer oder eine Bindung steht, und k für eine ganze Zahl von 5 bis 100 steht.
In der Verbindung der Formel (I) kann A2 auch -CO- bedeuten.
Besonders bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel (I), wobei m für eine ganze Zahl von 2 bis 4 steht, und
X für CH4.m, NH3.m, NΗ4.m, >P- (wenn m = 3), >P+< (wenn m = 4), >B- (wenn m = 3), eine lineare Atomgruppe C2H6-m, >CH(CH2)ZCH<, >C=C< >N-N<, >N(CH2)ZN< wobei z = 2 - 6, wenn m = 4), eine carbocyclische Atomgruppe C6H6-m, C6H12.m, oder eine heterocyclische Atomgruppe C3N3 (wenn m = 3), C4N2 (wenn m = 4) steht. Es ist besonders bevorzugt, dass bei einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) mindestens 3 K vorliegen. Speziell sind Verbindungen der allgemeinen Formel (I) bevorzugt, bei denen mindestens zwei, noch bevorzugter drei R nicht Wasserstoff sind.
Wenn mehr als eine terminale Gruppe R in einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) vorliegt, dann können diese Gruppen gleich oder verschieden sein.
Als Beispiele der für die spezifische Bindung an einen Rezeptor geeigneten Liganden, die als terminale Gruppen R der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) fungieren, seien natürlich vorkommende biologische Erkennungsstrukturen wie Mono- oder Oligosaccharide, Peptide, Mono- oder Oligonukleotide oder Nukleinbasen genannt. Es können aber auch synthetische Derivate dieser Verbindungen oder andere organische oder anorganische Verbindungen, die von biologischen Rezeptoren erkannt werden, verwendet werden. Als Liganden können ferner bekannte Verbindungen verwendet werden, die in freier Form als therapeutische Wirkstoffe zum Einsatz kommen. Beispielhaft seien genannt:
Antitumormittel, wie z. B. Daunomycin, Doxorubicin, Vinblastin, Bleomycin;
Antibiotika, wie z. B. Peniciline, Erythromycine, Azidamfenicol, Cephalotin und
Griseofulvin;
Antagonisten der Blutplättchenaktivierungsfaktoren;
Leukotrien Antagonisten;
Inhibitoren des Cyclooxygenase-Systems, wie z. B. Salicylsäureverbindungen;
Lipoxygenase-Inhibitoren;
Antiphlogistika, wie z. B. Indomethacin;
Antirheumatica, wie z. B. Nifenazon;
Therapeutische Radionuklide, wie z.B. Wismuth;
Neuraminidase;
Inhibitoren, wie z.B. Zanamivir.
Vorzugsweise werden Oligosaccharide verwendet, die auf Zelioberflächen als Bestandteil von Glycoproteinen, Glycolipiden oder Proteoglycanen vorkommen, sowie beliebige Teilstücke daraus.
Spezielle Oligosaccharide, die als terminale Gruppe R verwendet werden können sind wie folgt: Sialinsäure, Sialyllactose, Sialyllactosamin, Lactose, Galα1-3Gal, Galαl- 3(Fucα1-2)Gal, GalNAcα1-3(Fucα1-2)Gal, Neu5Acα2-6GalNAc, SiaLeA, SiaLex, HS03LeA, HS03Lex, Galα1-3Galß1-4GicNAc, Gaiα1-3Galß1-4Glc, Neu5Acα2-6Galß1- 4GlcNAc.
Außerdem sind Sialinsäurebenzylgiycosid, HS03GlcAß1 -3Gal, HS03GlcAß1 -3Galß1 - 4GlcNAcß1 -3Galß1 -4Glc, GalNAcα, GalNAcα1 -3(Fucα1 -2)Galß1 -4GlcNAc, Galαl - 3(Fuc 1 -2)Galß1 -4GlcNAc, HS03(Sia)Lex, HS03(Sia)LeA, Leγ, GlcNAcß1 -6(GlcNAcß1 - 3)Galß1-4Glc, GalNAcß1-4(Neu5Acα2-3)Galß1-4Glc, Mannose-6-phosphat, GalNAcßl- 4GlcNAc, Oligo-Sialinsäure, N-Glycolylneuraminsäure, Galα1 -4Galß1 -4Glc, Galαl - 4Galß1-4GlcNAc bevorzugt.
Derivate oder Mimetika der oben genannten Mono- oder Oligosaccaride, Peptide, Mono- oder Oligonukleotide bzw. Nukleinbasen können auch verwendet werden.
Die terminalen Gruppen R können auch von Markermolekülen abgeleitet sein. Solche Markermoleküle ermöglichen den Einsatz der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) bei diagnostischen Anwendungen. Alle dem Fachmann bekannten Markermoleküle für in vitro diagnostische Testsysteme wie z. B. Biotin, Fluorescein, Rhodamin, Digoxygenin oder radioaktive Marker kommen für die Zwecke der vorliegenden Erfindung in Frage. Insbesondere dem Fachmann bekannte Marker für die in vivo Diagnose, wie radioaktive Marker, die ein gebundenes Radionuklid enthalten, z. B. Technetium, Röntgenkontrastmittel, die z. B. eine iodierte Verbindung beinhalten, oder Kernresonanzkontrastmittel, z. B. auf Basis von Gadoliniumverbindungen seien erwähnt. Es wird vorgeschlagen, dass in einer bevorzugten Ausführungsform die terminalen Gruppen R so gewählt werden, dass Aggregate erhalten werden, die einerseits über geeignete Liganden durch polyvalente Wechselwirkungen mit geeigneten Rezeptoren wechselwirken und andererseits Markereinheiten enthalten. Dadurch werden die polyvalenten Wechselwirkungen einer Detektion zugänglich und die Verbindungen können in einem diagnostischen Verfahren eingesetzt werden.
Die Aggregate können in diesem Fall aus Verbindungen der Formel (I) aufgebaut sein, die sowohl Liganden- als auch die Markerreste enthalten. Vorzugsweise umfasst ein solches Aggregat nur eine spezielle Verbindung der allgemeinen Formel (I). Andererseits kann ein Aggregat aber auch mehrere verschiedene Verbindungen der Formel (I) umfassen, wobei die Verbindungen entweder Liganden oder Markerreste enthalten.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Aggregat der folgenden allgemeinen Formel (II) bereit,
{X(B)m}n (II)
wobei die X(B)m gleich oder verschieden sein können und für eine Verbindung der allgemeinen Formel (I), wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 11 definiert ist, stehen, und n für 2 bis 100.000 steht, und wobei die X(B)m nicht-kovalent gebunden sind.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Aggregat mit blattartiger Struktur bereit sowie mit linearer, zyklischer, polyzyklischer, polyedrischer, kugelförmiger oder dendritischer Struktur bereit. Die Aggregate können aus zwei oder mehreren verschiedenen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) bestehen. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verbindungen der allgemeinen Formel (III) bereit. Die Verbindungen der allgemeinen Formel (III) entsprechen denjenigen der Formel (II), wobei alle terminalen Gruppen R für ein Wasserstoffatom stehen. Diese Verbindungen können mit den oben beschriebenen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) eingesetzt werden, um die Eigenschaften der Aggregate zu verändern.
Speziell stellt die vorliegende Erfindung eine Verbindung der allgemeinen Formel (III) bereit,
X(B)„ (III)
wobei
X für eine m-wertige Einheit steht und die
B gleich oder verschieden sind und für K-H stehen, wobei
K für A1-(A2-A3)k-sp
steht, wobei
A1 für (CH2)tY(CH2)u steht, wobei
Y für >C=0, >NH, -O-, -S- oder eine Bindung, t für eine ganze Zahl von 0 bis 6 und u für eine ganze Zahl von 0 bis 6 steht,
A2 für -NHCO-, -CONH-, -OCONH- oder SCONH- steht,
A3 für (CH2)r, 0(CH2)r, NH(CH2)r, S(CH2)r, oder -(CHQ)- steht, wobei r für eine ganze Zahl von 1 bis 6 und
Q für eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl- oder
Aryl- Gruppe steht, sp für einen zweiwertigen Spacer oder eine Bindung steht, und für eine ganze Zahl von 5 bis 100 steht, und m mindestens 2 ist, mit der Maßgabe, dass
(1 ) X, die B und m so gewählt sind, dass eine intermolekulare Assoziation der K in flüssiger Phase, insbesondere unter wässrigen Bedingungen, durch Bildung von Wasserstoffbrücken-Bindungen unter Ausbildung von Aggregaten möglich ist, und
(2) die Molmasse des Fragments X(K)m weniger als 20.000, insbesondere weniger als 4000, beträgt.
In der Verbindung der Formel (III) kann A2 auch -CO- bedeuten.
In einer bevorzugten Ausführungsform steht K in der Formel (III) für
A1-(A2-A3)k-sp
wobei
A1 für (CH2)tY(CH2)u steht, wobei
Y für >C=0, >NH, -O-, -S- oder eine Bindung, t für eine ganze Zahl von 0 bis 6 und u für eine ganze Zahl von 0 bis 6 steht,
A2 für -NHCO-, -CONH-, -OCONH- oder SCONH- steht, A3 für (CH2)r, 0(CH2)r, NH(CH2)r, S(CH2)r, oder
-(CHQ)- steht, wobei r für eine ganze Zahl von 1 bis 6 und
Q für eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl- oder Aryl- Gruppe steht, sp für einen zweiwertigen Spacer oder eine Bindung steht, und k für eine ganze Zahl von 5 bis 100 steht.
Jetzt wird die Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) beschrieben. Entsprechend dieser Herstellungsweise können auch die Verbindungen der Formel (III) hergestellt werden.
Die Synthese der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) wird vorteilhafterweise jeweils ausgehend von den entsprechenden Tetraminen durch sukzessive Kettenverlängerung durchgeführt (Schema 1). Hierbei werden bekannte Methoden aus der Peptid-Chemie angewendet, wobei als N-Schutzgruppe die Boc-Gruppe verwendet wird. Die Amidbindungen werden vorzugsweise mit der Aktiv-Ester-Methode gebildet.
Schema 1
[H2NCH2-]4C → [BocNH(CH2)pCONHCH2-]4C → [H2N(CH2)pCONHCH2-]4C -- → [H-ACmGlynNHCH2-]4C
p = 1 oder 6, n = 0 bis 7, m = 0 bis 3
Die terminalen Gruppen werden vorteilhafterweise ebenfalls über die Aktiv-Ester- Methode an die gemäss Schema 1 synthetisierten Verbindungen der allgemeinen Formel (I) geknüpft (Schema 2).
Schema 2
[H-ACmGlyπNHCH2-]4C + Sug-sp-ACm-Ad-ONp → → [Sug-sp-ACm-Ad-ACmGlynNHCH2-]4C
Sug-sp- = Neu5Acα2-OCH2(p-C6H4)NHCOCH2NH- (Neu5Ac-Gab-)
Neu5Acα2-0(CH2)3NH- (Neu5Ac-Ap-)
Neu5Acα2-3Galß1-4Glcß1-NHCOCH2NH- (3 SL-NHCOCH2NH2-)
Galα1-3Galß1-0(CH2)3NH- (Bdi-Ap-)
Jetzt wird die Bildung der Aggregate in Einzelheiten und anhand der Figuren beschrieben. Es zeigen
Fig. 1 Elutionsprofile der Aggregate {[Neu5Ac-Gab-ACm-Ad-Gly5-NHCH2-]4C}x , HPLC,
TSK-4000, 0.2M NaCI;
Fig. 2 die relative Partikelgrössenverteilung des Aggregats {[Neu5Ac-Gab-Ad-AC3- Gly5-NHCH2-]4C}X, 20°C H 2O;
Fig. 3 den Einfluss der Temperatur und der Anwesenheit von Harnstoff auf die
Partikelgrösse des Aggregats {[Neu5Ac-Gab-Ad-Gly7-NHCH2-]4C }x
Die Aggregate sind hochmolekulare nicht-kovalente Polymere, die durch Selbstassoziation von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) entstehen (Schema 3).
Schema 3
χ[A i-( A2- A3)k- sp-R]m {X[A1-( A2- A3)k- sp-R]m} n
Diese intermolekulare Assoziation verläuft spontan und führt zur Bildung von stabilen und geordneten Strukturen. Der Verlauf dieses Prozesses hängt von der molekularen Struktur der eingesetzten Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und von den äusseren Bedingungen ab. Die Molmassen, Grossen und Formen der hierbei gebildeten Aggregate werden ebenfalls von diesen Faktoren bestimmt.
Die nicht-kovalente Natur der Bindungen zwischen den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) bedingt die Reversibilität der Aggregatbildung und ermöglicht bei einer Veränderung der äusseren Bedingungen eine Dissoziation der Aggregate zu Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder ihre Umwandlung in andere Aggregate, jeweils im Sinne der Bildung der thermodynamisch stabilsten Strukturen.
Die Selbstassoziation von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) zu Aggregaten kann sowohl in Lösungen als auch auf Oberflächen beobachtet werden.
Mittels Raster-Tunnel-Mikroskopie (STM) und Atomkraft-Mikroskopie wurde gezeigt, dass das Aggregat {[Neu5Ac-Gab-Ad-Gly7-NHCH2-]4C}x auf einer Graphit-Unterlage geordnete Kettenstrukturen ausbildet. Die Bildung von Aggregaten in Lösungen kann durch Lichtstreuungs-Experimente oder Gelpermeations-Chromatographie beobachtet werden.
Die Verbindung der allgemeinen Formel (I) Neu5Ac-Gab-ACm-Ad-Gly5-NHCH2-]4C (m=1-3) assoziert bei Raumtemperatur in wässrigen und organischen Lösungsmitteln. Die Untersuchung der in Wasser gebildeten Assoziate mittels Gelpermeations- Chromatographie zeigte die Bildung von Aggregaten mit Molekulargewichten von ca. 2000 kD, wie es in Figur 1 gezeigt wird.
Die Untersuchung der Assoziation der Verbindung der allgemeinen Formel (I) [Neu5Ac-Gab-Ad-AC3-Gly5-NHCH2-]4C in Wasser bei 20°C zeigte die Bildung von drei Typen von Aggregaten mit Partikelgrössen zwischen 25 und 2000nm (Figur 2). Beim Erwärmen der Probe auf 60°C wurde eine Abnahme des relativen Anteils der kleineren Partikel beobachtet, wobei gleichzeitig der relative Anteil der grösseren Partikel zunahm und die Gesamtanzahl der Teilchen abnahm. Eine Zunahme der Aggregat-Grösse mit der Temperatur wurde auch bei der Verbindung der allgemeinen Formel (I) (48) beobachtet. Diese Verbindung bildet in Wasser bei 60°C Teilchen mit Grossen bis zu 8000nm (Figur 3).
Zu den äusseren Bedingungen, die die Bildung der Aggregate und den Verlauf der intermolekularen Assoziation bestimmen, zählen neben der Temperatur, der pH-Wert und die Art und Zusammensetzung des Lösungsmittels. Durch Lichtstreuungs- Untersuchungen wurde gezeigt, dass die Verbindung [HCI H-Gly7-NHCH2-]4C (22a) in Wasser bei 20°C in nicht-assoziierter Form vorliegt, jedoch durch Zugabe einer 0.8 M NaHC03-Lösung eine Selbstassoziation der Verbindung erreicht wird. Durch Zugabe von HCI kann dann anschließend die Assoziation wieder rückgängig gemacht werden (vgl. Beispiel 9).
Die Bildung von Aggregaten wird auch durch die Anwesenheit von Komponenten beeinflusst, welche mit den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) Wechselwirkungen eingehen können. Dies können organische Moleküle sein, wie z. B. Verbindungen der Formel (III), Harnstoff (Abbildung 3), Trifluorethanol, Methanol, Aceton oder andere organische Lösungsmittel. Es können auch andere Verbindungen der allgemeinen Formel (I) bzw. (III) sein, die für sich alleine - unter den gegebenen Bedingungen - keine Assoziate ausbilden.
Bei Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und Aggregaten wird der Prozess der Selbstassoziation auch durch die Wechselwirkungen zwischen den Liganden und den entsprechenden Rezeptoren beinflusst. Dieser Einfluss kann z. B. darin bestehen, dass erst durch die Anwesenheit der Rezeptoren eine Assoziation von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) hervorgerufen wird, und zwar unter Bedingungen bei denen sonst keine Assoziation dieser Verbindungen stattfinden würde. Durch die Reversibilität der Aggregatbildung ist es ebenso möglich, dass sich Aggregate in Anwesenheit von Rezeptoren unter Umlagerung oder Veränderung der Zusammensetzung so verändern, dass ein thermodynamisch günstiger Zustand des Gesamtsystems aus Aggregat und Rezeptor erreicht wird. Die Aggregate können sich daher an unterschiedliche Rezeptoranordnungen anpassen und so eine Wechselwirkung zwischen den Rezeptoren und Liganden optimieren. Diese Optimierung durch nachträgliche Anpassung der polyvalenten Wechselwirkungen stellt einen wesentlichen Vorteil gegenüber dem Stand der Technik dar.
Jetzt werden spezielle biologisch aktive Aggregate beschrieben. Durch die Selbstassoziation von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) mit biologisch aktiven Liganden entstehen biologisch aktive Aggregate, die als hocheffektive multivalente Inhibitoren von biologischen Erkennungsprozesse wirken. Die spezifische Aktivität eines solchen Inhibitors ist abhängig von der Affinität der terminalen Gruppen R, aber auch von der "Matrix" des Aggregats, d. h. der Struktur der als Träger verwendeten Verbindung der allgemeinen Formel (I).
Die Tabellen 2 und 3 zeigen den Einfluss der Matrix-Struktur auf die Inhibition der viralen Zelladhäsion von Influenza-Viren, gemessen in einem dem Fachmann bekannten Fetuin-Binding Assay. Dabei wird die Verstärkung der spezifischen Aktivität des Inhibitors um mehr als drei Grössenordnungen gegenüber der Aktivität des freien Liganden NeuδAcαBn im Falle des Aggregats {[Neu5Ac-Gab-Ad-AC3-Gly5-NHCH2- ]4C}X (44) deutlich.
Tabelle 1
Inhibition der viralen Zelladhasion von Influenza Viren, Stamm A/NIB/44/90M H3N2, FBl-test, NeuδAcαBn als a Referenz-Verbindung, spezifische Aktivität pro NeuδAc-Gruppe
Figure imgf000021_0001
Tabelle 2
Inhibition der viralen Zelladhasion von Influenza Viren Inhibition of Stamm A/Duck/Alberta/60/67 H12N5, FBl-test, 3"SL als a Referenz-Verbindung, s ezifische Aktivität pro 3'SL-Gruppe
Figure imgf000021_0002
Ein weiteres Beispiel für die Erhöhung der biologischen Aktivität eines biologischen Liganden durch seine Bindung an ein Aggregat ist die Verbindung {[BdrAp-Ad-AC3- Glyg-NHCH2-]4C}X (49) als Inhibitor der Zytotoxizität von menschlichen Blutseren gegenüber der Schweinenieren-Nieren-Zellen PK15. Das Aggregat (49) zeigt eine um drei Grössenordnung höhere spezifische Aktivität als der freie Ligand Galα1-3Gal (B- disaccharid).
Verwendete Abkürzungen:
Np para-Nitrophenyl NOS N-Oxysucinimidyl Boc tert-Butyloxycarbonyl AC 6-Aminocaproyl
Ad 1 ,6-Hexandioyl
Ap 3-Aminopropyl
Gab 4-(Glycylamido)-benzyl
Sug Kohlenhydratrest
SL Sialyllactose
Bn Benzyl
LC Säulenchromatographie
DC Dünnschichtchromatographie
Jetzt wird die Erfindung anhand von Beispielen in weiteren Einzelheiten beschrieben.
Materialien und Methoden:
1H-NMR Spektren (δ, ppm, TMS) wurden mit einem Spektrometer des Typs WM-500 der Firma Bruker (USA) bei 303° K aufgenommen.
Massenspektren wurden mit einem Flugzeit-Spektrometer des Typs MSBCh (Sumy, Ukraine) aufgenommen (Ionisation durch Spaltprodukte von Californium-252 bei einer Beschleunigungsspannung von +15 eV).
Die Lichtstreuungs-Experimente wurden mit folgenden Geräten durchgeführt: Coultronics Coulter N4-MD (He-Ne Laser, λ=632.8 nm, Messung der Streuung bei einem Winkel von 62.5° zum eintretenden Lichtstrahl), Spectra-Physics 164 (Argon Laser, λ=528.7 nm und λ=611.5 nm, Messung der Streuung bei einem Winkel von 90° zum eintretenden Lichtstrahl).
Kieselgel 60 (40-63 μm) (Merck) wurde für Säulenchromatographie verwendet. Sephadex der Typen LH-20, G-10, G-25 (Pharmacia, Schweden) und TSK-4000 (HPLC) wurden für Gelpermeations-Chromatographie gebraucht.
Für DC wurden Kieselgel 60 (Merck) und Kieselgel 60 Glassplatten mit Fluoreszenz- Indikator F254 (Merck) verwendet. Zur Detektion der Flecken auf den DC-Platten wurden folgende Methoden verwendet:
Erwärmen nach Besprühen mit einer 7%igen H3P04-Lösung
(Kohlenhydratverbindungen);
Erwärmen nach Besprühen mit einer 2%igen Ninhydrin-Lösung in Ethanol
(Verbindungen mit primären Aminogruppen);
Erwärmen nach einer Verweilzeit von 10 Minuten in einer Kammer über konz.
HCI und anschliessenden Besprühen mit einer 2%igen Ninhydrin-Lösung in
Ethanol (Verbindungen mit Boc-geschützten Aminogruppen);
Verweilzeit von 10 Minuten in einer Kammer über konz. NH3
(4-Nitrophenylester);
Betrachten der Platten unter UV.
Für DC wurden folgende Eluenten-Systeme verwendet:
A - Toluol/Ethylacetat 2:1
B - Aceton/Ethylacetat/Methanol 10:4:1
C - CHCI3/MeOH 7:1
D - CHCI3/Ethylacetat/MeOH/AcOH 9:3:2:0,2
E - iPrOH/Ethylacetat/H20 2:3:1
F - EtOH/NH3 (aq) 2:1
G - iPrOH/Ethylacetat/H20 4:3:2
H - iPrOH/Aceton/H20 4:3:2
Herstellung bekannter Ausgangsverbindungen
Tetrakis-(aminomethyl)-methan-tetrahydrochlorid (1 ) wurde analog der Literatur hergestellt (E. B. Fleischer, A.E. Gebala, A. Levey, P.A.
Tasker, J.Org.Chem., 36, 3042, 1971).
DC: Rf=0,6; Eluent - 25% Ammoniak Wasser; Entwickler - Ninhydrin.
Schmp >300°C.
1H NMR-Spektrum in D20 (δ, ppm): 3,45 (s, CH2). 4-Nitrophenyl-trifluoracetat i2) wurde analog der Literatur hergestellt (S. Sakakibara, N. Inukai, Bull. Chem. Soc.Jap.,
37, 1231 , 1964).
Di-(4-NitroDhenyl)-adipat (3) wurde analog der Literatur hergestellt (S. Sakakibara, N. Inukai, Bull. Chem. Soc.Jap.,
37, 1231 , 1964).
Rf=0,76, Eluent Θ A.
1H NMR-Spektrum in CDCI3 (δ, ppm): 1 ,871 (m, 4H, 2 COCHaCh , 2,666 (m, 4H, 2 COCH2), 7,255 und 8,240(m, 8H, J23 9Hz, Ar).
Methyl f4-(tert-butyloxycaώonyl-αlvcilamido)benzyl 5-acetamido-4.7.8.8-tetra-O-acetyl- 3.5-didesoxy-α-D-αlvcero-D-αalakto-nonulopyranosid]oat Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-Boc (4) wurde analog der Literatur hergestellt (US Patent 5,571 ,836, 1996). 1H NMR-Spektrum (CDCI3, δ, ppm):1 ,448 (s, 9H, CMe3), 1 ,849, 1 ,994, 2,008, 2,111 , 2,127 (s, 5x3H, 5 Ac), 1 ,979 (dd, 1 H, H-3ax Neu5Ac), 2,613 (dd, 1 H, J4 4,6 Hz, J3ax 12,9 Hz, H-3eq NeuδAc), 3,637 (s, 3H, COOCH3), 3,882 (d, 2H, J 6 Hz, COCÜNH), 4,058 (ddd, 1 H, H-5 Neu5Ac), 4.074 (dd, 1 H, J9b 12,5 Hz, J8 5,9 Hz, H-9a NeuδAc), 4,112 (dd, 1 H, J5 10,6, J7 2,3 Hz, H-6 Neu5Ac), 4,299 (dd, 1 H, J9b 12,5 Hz, J8 2,7 Hz, H-9b NeuδAc), 4,366 und 4,73δ (d, 2x1 H, J 12 Hz, OCh^Ar), 4,847 (ddd, 1 H, J5 10 Hz, J3ax 12,3 Hz, J3eq 4,6 Hz, H-4 Neu5Ac), 6,24 (verb., 1 H, NHBoc), δ,261 (d, 1 H, J5 9,8 Hz, NH), 6,314 (dd, 1 H, J6 2,3 Hz, J8 8,2 Hz, H-7 NeuδAc), δ,424 (ddd, 1 H, H-8 NeuδAc), 7,258 und 7,445 (d, 2x2H, J 8,4 Hz, Ar), 8,144 (verb. s, 1 H, NHAr).
Neu5Acα2-3Galß1-4Glcß-NHCOCH2NH2 (12) wurde analog der Literatur hergestellt (L.M. Likhosherstov, O.S. Novikova, V.A. Derevitskaja, N.K. Kochetkov, Carbohydrate Research, 146, C1-C5, 1986; und I.D. Manger, T.W. Rademacher, R.A. Dwek, Biochemistry, 31 , 10724, 1992). 1H-NMR Spektrum (D20, δ, ppm): 1 ,82 (dd, 1 H, H-3^ NeuδAc, J4 12 Hz), 2,06 (s, 3H, NAc), 2,79 (dd, 1 H, H-3eq NeuδAc, J3ax 12,4 Hz, J4 4,6 Hz), 3,48 (m, 1 H, H-2 Glc, J3 9 Hz), 3,61 (dd, 1 H, H-2 Gal), 3,99 (dd, 1 H, H-4 Gal), 4,14 (dd, 1 H, H-3 Gal, J2 9,8 Hz, J4 3,1 Hz), 4,δ7 (d, 1 H, H-1 Gal, J2 7,8 Hz), δ,09 (d, 1 H, H-1 Glc, J2 9,3 Hz). Galα1-3Galß-0(CH2)3NH2 (13) wurde analog der Literatur hergestellt (E. Yu. Korchagina, N. V. Bovin,
Bioorganicheskaya Khimiya, 1992, 18, 283, Rus).
Die Verbindungen BocGlyNOS, BocGlyGlyNOS und BocAC-ONp wurde unter Verwendung von N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid analog der Literatur hergestellt (G. W. Anderson, J. E. Zimmerman, F. M. Callahan, J. Amer. Chem. Soc, 86, 1839, 1964; M. Bodanszky, V. du Vigneaud, , J. Amer. Chem. Soc, 81 , 5688, 1959).
Beispiel 1.
Herstellung von Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-AC-Boc (5).
Zu 0,5mM der Verbindung (4) wurden 10ml CHCI3 und 2ml CF3COOH zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt, mit 2ml Toluol versetzt, im Vakuum eingedampft und getrocknet. Der Rückstand wurde in 10ml CHCI3 gelöst und mit 1 ,5mM 6-N-Boc-Amino-(4-nitrophenyl)-hexanoat und 0,3ml NEt3 versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und im Vakuum eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde über Kieselgel chromatographiert.
Die Verbindungen Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-AC2-Boc (6) und Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-
AC8-Boc (7) wurden auf analoge Weise hergestellt (siehe Tabelle 4).
Tabelle 3 (Beispiel 1)
Figure imgf000025_0001
1H NMR-Spektren (CDCI3, δ, ppm):
Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-AC-Boc (5): 1 ,331 , 1 ,468, 1 ,655 (m, 3CH2), 1 ,402 (s, 9H, CMe3), 2,264 (t, 2H,
J 7,5 Hz, CH2CONHCH2CO), 3,066 (m ~ quadr, 2H, J 6,6 Hz, CHjNHBoc), 4,060 (d, 2H, J 5 Hz,
COCÜNH), 4,364 und 4,733 (d, 2x1 H, J 12 Hz, OCJiAr), 4,δ71 (verb., 1 H, NHBoc), 6,621 (verb., 1 H,
COCH2NHCO), 7,263 und 7,460 (d, 2x2H, J 8,4 Hz, Ar), 8,δ47 (verb. s, 1 H, NHAr).
NeuδAcα-Fragment: (s. (4)).
Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-AC2-Boc (6): 1 ,280, 1 ,338, 1 ,447, 1 ,482, 1 ,682, 1 ,655, 2,107 (m, 7CH2), 1 ,403
(s, 9H, CMe3), 2,276 (t, 2H, J 7,2 Hz, CHsCONHC^CO), 3,060 (m ~ quadr, 2H, J 6,6 Hz, CHjNHBoc),
3,216 (m ~ quadr, 2H, J 6,4 Hz, Ch^NH), 4,040 (d, 2H, J 5 Hz, COCH^NH), 4,3δ3 und 4,728 (d, 2x1 H, J
12 Hz, OCÜAr), 4,6δ1 (verb., 1 H, NHBoc), 6,793 (t, 1 H, J δ Hz, CH2NHCO), 6,714 (verb., 1 H,
COCH2NHCO), 7,24δ und 7,467 (d, 2x2H, J 8,4 Hz, Ar), 8,666 (verb. s, 1 H, NHAr). NeuδAcα-Fragment:
(s. (4)).
Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-AC3-Boc (7): 1 ,283, 1 ,336, 1 ,447, 1 ,482, 1 ,δ94, 1 ,655, 2,117 (m, 11 CH2), 1 ,401 (s, 9H, CMe3), 2,282 (t, 2H, J 7,2 Hz, CüCONHCH2CO), 3,045 (m ~ quadr, 2H, J 6,6 Hz, CÜNHBoc), 3,214 (m ~ quadr, 4H, J 6,4 Hz, ChbNH), 4,040 (d, 2H, J 5 Hz, COCÜNH), 4,353 und 4,728 (d, 2x1 H, J 12 Hz, OCüAr), 4,669 (verb., 1 H, NHBoc), 5,876 (t, 1 H, J 5,5 Hz, CH2NHCO), 6,071 (verb., 1 H, CH2NHCO), 6,940 (verb., 1 H, COCH2NHCO), 7,242 und 7,483 (d, 2x2H, J 8,4 Hz, Ar), 9,033 (verb. s, 1 H, NHAr). NeuδAcα -Fragment: (s. (4)).
Beispiel 2.
Herstellung von Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-AC-Ad-ONp (9).
Zu 0,5mM der Verbindung (5) wurden 10ml CHCI3 und 2ml CF3COOH zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt, mit 5ml Toluol versetzt, im Vakuum eingedampft und getrocknet. Der Rückstand wurde in 15ml Tetrahydrofuran gelöst und mit 5mM der Verbindung (3) und 0,3 ml NEt3 versetzt und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, Das überschüssige NEt3 wurde mit CH3COOH neutralisiert, und das Reaktionsgemisch eingedampft. Der Rückstand wurde in CHCI3 gelöst, die erhaltene Lösung wurde mit Wasser gewaschen und eingedampft. Das erhaltene Gemisch wurde über eine Kieselgelsäule chromatographiert (siehe Tabelle 4).
Die Verbindungen Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-Ad-ONp (8), Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-AC2- Ad-ONp (10) und Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-AC3-Ad-ONp (11) wurden auf analoge Weise hergestellt (siehe Tabelle 4).
Tabelle 4 (Beispiel 2)
Figure imgf000027_0001
1H NMR-Spektren
Ac4(OMβ)Neu5Ac-Gab-Ad-ONp (8) (CDCI3, δ, ppm) 1 ,774 (m, 2H, CHjCHaCOO), 1 ,843, 1 ,984, 2,00, 2,100, 2,117 (s, 5x3H, δ Ac), 1 ,966 (dd, 1 H, H-3^ NeuδAc), 2,336 und 2,393 (m, 2x1 H, CJiC^CONH), 2,601 (t, 2H, J 6Hz, CH^ÜCOO), 2,604 (dd, 1 H, H-3eq NeuδAc), 3,64δ (s, 3H, COOCH3), 3,688 (t, 2H, J 4,7Hz, C^CÜCONH), 4,049 (ddd, 1 H, H-δ NeuδAc), 4,062 (dd, 1 H, J86_Hz, H-9a NeuδAc), 4,074 (d, 2H, JNH 5,5Hz, COCHzNHCO), 4,111 (dd, 1H, J5 10,7, J7 2,3Hz, H-6 NeuδAc), 4,298 (dd, 1H, J9b 12,5Hz, J8 2,9Hz, H-9b NeuδAc), 4,343 und 4,722 (d, 2x1 H, J 12Hz, OCÜAr), 4,839 (ddd, 1 H, Js 10,2Hz, J3ax 12,3Hz, J3eq 4,6Hz, H-4 Neu5Ac), 5,307 (dd, 1 H, J8 8,4Hz, J6 2,3Hz, H-7 NeuδAc), 6,3δ9 (d, 1 H, J5 9,7Hz, NH), 6,406 (ddd, 1 H, H-8 NeuδAc), 6,616 (t, 1 H, COCH2NHCO), 7,243 und 7,450 (d, 2x2H, J 8,5Hz, p-C^NH), 7,221 und 8,208 (d, 2x2H, J 9Hz, p-C^NO;,), 8,δ86 (s, 1 H, NHAr) Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-AC-Ad-ONp (9) (CDCI3, δ, ppm) 1 ,341 (m, 2H, COCH2CH2CH2CH2CH2NH), 1 ,49δ und 1 ,666 (m, 2x2H, COC^CH^CH^ÜCH^H), 1 ,729 (m, 2H, CÜCH.COO), 1 ,8δ6, 1 ,991 , 2,010, 2,110 und 2,129 (s, δx3H, δ Ac), 1 ,976 (dd, 1 H, H-3^ NeuδAc), 2,138, 2,176 (m, 2x1 H, CHsC^CONH), 2,182 und 2,267 (t, 2x2H, 2 CJiCONH), 2,601 (~t, 2H, J 6,8Hz, C^CJiCOO), 2,611 (dd, 1 H, J3ax 12,8, J4 4,5Hz, H-3eq Neu5Ac), 3,228 (m ~ quadr, 2H, J 6,6Hz, CÜNHCO), 3,645 (s, 3H, COOCH3), 4,022 (d, 2H, JNH 5,4Hz, COCJiNHCO), 4,060 (ddd, 1 H, H-δ NeuδAc), 4,06δ (dd, 1 H, Js 6Hz, H-9a NeuδAc), 4,113 (dd, 1 H, J5 10,8, J7 2,3Hz, H-6 NeuδAc), 4,29δ (dd, 1 H, J9a 12,δHz, J8 2,9Hz, H-9b NeuδAc), 4,3δ7 und 4,732 (d, 2x1 H, J 12Hz, OCH^Ar), 4,848 (ddd, 1 H, J5 10Hz, J3ax 12,2Hz, J3eq 4,δHz, H-4 NeuδAc), δ, 170 (d, 1 H, J5 10Hz, NH), δ,308 (dd, 1 H, J8 8,6Hz, J6 2,3Hz, H-7 NeuδAc), 6,413 (ddd, 1 H, H-8 NeuδAc), 6,708 (t, 1 H, CH,CH,NHCO), 6,483 (t, 1 H, COCH2NHCO), 7,261 und 7,427 (d, 2x2H, J 8,7Hz, -CeJ^NH), 7,243 und 8,224 (d, 2x2H, J 9Hz, -C^NC^), 8,298 (s, 1 H, NHAr) Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-AC2-Ad-ONp (10) (D6-DMSO, δ, ppm) 1 ,231 , 1 ,376, 1 ,485 und 1 ,608 (m, CH2), 1 ,757 (dd, 1 H, H-3^ NeuδAc), 1 ,678, 1 ,917, 1 ,974, 2,023 und 2,092 (s, 5x3H, δ Ac), 2,670 (dd, 1 H, J3ax 12,4, J44,δHz, H-3eq NeuδAc), 2,638 (t, 2H, J 7Hz, CH,CH,COO), 3,009 (m, 4H, 2CH.2NHCO), 3,699 (s, 3H, COOCH3), 3,859 (d, 2H, JNH 5,9Hz, COCH,NHCO), 3,904 (ddd, 1 H, H-δ NeuδAc), 4,027 (dd, H, J8 6,2Hz, H-9a NeuδAc), 4,089 (dd, 1 H, J5 10,8, J7 2,6Hz, H-6 NeuδAc), 4,235 (dd, 1 H, J9a 12,4Hz, J8 3,1 Hz, H-9b NeuδAc), 4,322 und 4,645 (d, 2x1 H, J 11 ,7Hz, OCH^Ar), 4,715 (ddd, 1 H, J5 10Hz, J3ax 12Hz, J3eq 4,5Hz, H-4 Neu5Ac), 5,193 (dd, 1 H, J8 8,4Hz, J6 2,Hz, H-7 NeuδAc), 5,341 (ddd, 1 H, H-8 Neu5Ac), 7,216 und 7,554 (d, 2x2H, J 8,4Hz, p-CsJ^NH), 7,433 und 8,296 (d, 2x2H, J 9,2Hz, -Ce^NO,), 7,674 (t, 1 H, J 5,5Hz, CH2CH2NHCO), 7,706 (d, 1 H, J5 9,8Hz, NH), 7,764 (t, 1 H, J δ,8Hz, CH2CH2NHCO), 8,081 (t, 1 H, J δ,9Hz, COCH2NHCO), 9,961 (s, 1 H, NHAr).
Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-AC3-Ad-ONp (11) (D6-DMSO, δ, ppm): 1 ,214, 1 ,360, 1 ,478, 1 ,609 (m, CH2), 2,639 (t, 2H, J 7Hz, CH CH OO). 2,999 (m, 6H, SC ^NHCO), 3,864 (d, 2H, JNH δ,9Hz, COCH.NHCO), 4,324 und 4,645 (d, 2x1 H, J 11 ,7Hz, OCBpAr), 7,212 und 7,568 (d, 2x2H, J 8,4Hz, -CsJH^NH), 7,435 und 8,295 (d, 2x2H, J 9,2Hz,
Figure imgf000028_0001
7,700 (m, 2H, 2CH2CH2NHCO), 7,750 (t, 1 H, J 5,8Hz, CHXH.NHCO), 8,122 (t, 1 H, J δ,9Hz, COCH2NHCO), 10,047 (s, 1 H, NHAr), NeuδAcα-Fragment: s. (10).
Beispiel 3.
Herstellung von Neu5Acα2-3Galß1-4Glcß-NHCOCH2NHCO(CH2)4COO(4-C6H4NO2) (14).
119mg (0,172mM) der Verbindung (12) in 0,5ml DMSO wurde unter Rührung zu einer Lösung von 334mg (0,86mM) der Verbindung (3) in 2ml DMF zugegeben. Das Gemisch wurde 24 Stunden bei 20°C gerührt. Nach Zugabe von 200μl AcOH wurde das Reaktionsgemisch mit 15ml Wasser verdünnt. Die Lösung wurde filtriert und das Filtrat wurde auf ein Volumen von ~2ml eingedampft. Der Rückstand wurde auf eine Sephadex LH-20 Säule (1 ,5x50cm) gegeben und mit MeCN/H20 (1 :1 , 0,2% AcOH) eluiert. Nach Isolation wurden 140mg (14) erhalten, entsprechend einer Ausbeute von 87%. DC: Rf 0,41 (Eluent H).
1H-NMR Spektrum (D20, δ, ppm): 1 ,737 (m, 1 H,
Figure imgf000028_0002
1 ,779 (dd, 1 H, H-3ax NeuδAc, J4 12,6 Hz), 2,003 (s, 3H, NAc), 2,383 (t, 1 H, J 7 Hz, CH2CO), 2,733 (dd, 1 H, H-3eq NeuδAc, J3ax 12,6 Hz, J4 4,5 Hz), 3,432 (m, 1 H, H-2 Glc, J39 Hz), 3,5δ6 (dd, 1 H, H-2 Gal), 3,933 (dd, 1 H, H-4 Gal), 4,090 (dd, 1 H, H-3 Gal, J2 10 Hz, J4 3 Hz), 4,499 (d, 1 H, H-1 Gal, J2 8 Hz), 4,98δ (d, 1 H, H-1 Glc, J2 9 Hz).
Die Verbindung Neu5Ac-Gab-Ad-ONp (15) wurde auf analoge Weise ausgehend von (3) und Neu5Acα-OCH2(p-C6H4)-NHCOCH2NH2 (US Patent 5,571 ,836, 1996) hergestellt .
1H-NMR Spektrum (CD3OD, δ, ppm): 1 ,968 (dd, 1 H, H-3ax NeuδAc), 1 ,980 (m, 4H, CHJCHJC^CO), 2,205 (s, 3H, NCOCH3), 2,56δ und 2,874 (t, 2x2H, J 6,8 Hz, 2 CH2CO), 2,976 (dd, 1 H, J4 4,6 Hz, J3ax 13 Hz, H-3eq NeuδAc), 3,743 (dd, 1 H, J6 1 ,5 Hz, J8 9 Hz, H-7 NeuδAc), 3,821 (dd, 1 H, J5 10 Hz, H-6 NeuδAc), 3,840 (dd, 1 H, J9b 12 Hz, J8 6 Hz, H-9a Neu5Ac), 3,924 (ddd, 1 H, H-4 NeuδAc), 3,978 (ddd, 1 H, H-5 NeuδAc), 4,047 (dd, 1 H, J8 2 Hz, H-9b NeuδAc), 4,083 (ddd, 1 H, H-8 NeuδAc), 4,196 (s, 2H, COCHjNH), 4,653 und 4,973 (d, 2x1 H, J 11 Hz, OCÜAr), 7,474 und 7,707 (d, 2x2H, J 8,3 Hz, p- CshUNH), 7,561 und 8,467 (d, 2x2H, J 8,8 Hz, p-CsJi,N02).
Die Verbindung Galα1-3Galß-O(CH2)3NHCO(CH2)4COO(p-C3H4NO2) (16) wurde auf analoge Weise ausgehend von (3) und Galα1-3Galß-0(CH2)3NH2 (13) hergestellt. 1H-NMR Spektrum (D20, δ, ppm): 1 ,78 (m, 4H, CH2CH2), 1 ,89 (m, 2H, CH2), 2,36 (t, 2H, CH2COO), 2,77 (m, 2H, NHCOCH,), 3,36 (m, 2H, CH2N), 3,69 (t, 1 H, J3 9 Hz, 2-Galß), 3,76 (m, 1 H, OCH"), 3,78 (m, 6,6"- Galα), 3,91 (dd, 1 H, J3 10 Hz, 2-Galα), 4,00 (dd, 1 H, 3-Galα), 4,01 (m, 1 H, OCH), 4,06 (verb. d, 1 H, 4- Galα), 4,20 (verb. d, 1 H, 4-Galß), 4,23 (verb. t, 1 H, δ-Galα), 4,48 (d, 1 H, J2 8 Hz, 1-Galß), δ,19 (d, 1 H, J2 4 Hz, 1-Galα), 8,38, 7,43 (d, 2x2H, J 9,6 Hz, Ar).
Beispiel 4.
Tetra-(N-tert.-butyloxycarbonyl-pentaglvcilamidomethyl)methan [BocGly5-NHCH2-]4C (21).
1mM der Verbindung (19) (siehe Tabelle 5) wurde in 4 ml CF3COOH aufgenommen und zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 4ml Toluol versetzt, im Vakuum eingedampft und getrocknet. Der Rückstand wurde in 5ml Wasser gelöst, mit 4 ml einer 2M HCI-Lösung versetzt und eingeengt. Das erhaltene Tetrahydrochlorid (19a) wurde im Vakuum getrocknet, in 0.5ml DMF suspendiert, mit 6 mM BocGlyGlyNOS und 0.5 ml NEt3 versetzt und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt und und das Produkt wurde mittels Säulenchromatographie gereinigt. Nach Trocknen im Vakuum wurde die Verbindung (21) als weißes Pulver in 69% Ausbeute erhalten (s. Tabelle 5). Die Verbindungen (17)-(20), (22)-(25) wurden auf analoge Weise hergestellt (siehe Tabelle 5).
H-NMR-Spektren (Für die Zuordnung der H-NMR-Sιgnale wurden die Glycine innerhalb der Ketten nummeπert, diese Nummeπerung beginnt jeweils am N-terminalen Ende der Ketten)
[BocGly-NHCH2-]4C (17) 1H-NMR Spektrum in Ds-DMSO (δ, ppm) 1 ,366 (s, 9H, OCMe3), 2,759 (verb d, 2H, CCH2), 3 494 (d, 2H, JNH 6 Hz, CH2 Gly), 7,368 (t, 1 H, NHGl ), 7,969 (verb t, 1H, CCH2NH),
Massenspektrum 783 (M+Na)
[HCI H-Gly2-NHCH2-]4C (18a) 1H-NMR Spektrum in D20 (δ, ppm) 2,952 (s, 2H, CCH2), 3,966 (s, 2H,
CH2 Gly), 4,013 (s, 2H, CH2 Gl )
[BocGly3-NHCH2-]4C (19) 1H-NMR Spektrum in Ds-DMSO (δ, ppm) 1 ,375 (s, 9H, OCMe3),2,690 (verb d, 2H, JNH 6,5 Hz, CCH2), 3,586 (d, 2H, JNH 6 Hz, CH2 Gly3), 3,725 (d, 2H, JNH 5,5 Hz, CH2 Gly1), 3,847 (d, 2H,
JNH 5,5 Hz, CH2 Gly2), 6,976 (t, 1 H, NHGly3), 7,811 (t, 1 H, NH0'5'2), 7,975 (t, 1 H, CCH,NH), 8,534 (t, 1 H,
NHGly1) Massenspektrum 1239 (M+Na)
[BocGly4-NHCH2-]4C (20) 1H-NMR Spektrum in D6-DMSO (δ, ppm) 1 ,374 (s, 9H, OCMe3), 2,694 (verb d, 2H, CCH2), 3,576 (d, 2H, CH2 Gly4), 3,707 (d, 2H, CH2 Gly1), 3,750 (d, 2H, CH2 Gly3), 3,835 (d, 2H, CH2 Gly2),
6,980 (t, 1 H, NHGly4), 7,827 (t, 1 H, CCH NH), 8,048 (t, 1 H, NHGly3), 8,096 (t, 1 H, NHGly2), 8,590 (t, 1 H,
NHGly1) Massenspektrum 1467 (M+Na)
[BocGly5-NHCH2-]4C (21) 1H-NMR Spektrum in D6-DMSO (δ, ppm) 1 ,380 (s, 9H, OCMe3), 2,688 (verb d, 2H, CCH2), 3,579 (d, 2H, JNH 6 Hz, CH2 GlyS), 3,718 (d, 2H, JNH 5 Hz, CH2 Gly1), 3,750 (d 4H, JNH~5 Hz,
CH2 Gly34), 3,840 (d, 2H, JNH 6,5 Hz, CH2 Gly2), 6,974 (t, 1 H, NHGly5), 7,770 (t, 1 H, CCH2NH), 8,006 (t, 1 H
NHGly4), 8,075 und 8,102 (t, 1 H, NHGly23), 8,550 (t, 1 H, NHGly1) Massenspektrum 1695 (M+Na),
1711(M+K)
[BocGly7-NHCH--]4C (22) 1H-NMR Spektrum in D6-DMSO (δ, ppm) 1 ,378 (s, 9H, OCMe3), 2,688 (verb ,
2H, CCH2), 3,581 (d, 2H, CH2 Gly7), 3,723 (verb d, 2H, CH2 Gly1), 3,751 (m, 8H, CH2 GlyW5), 3,840 (verb d,
2H, CH2 Gly2), 6,970 (verb t, 1H, NHGly7), 7,814 (verb t, 1 H, CCH2NH), 8,018 (verb t, 1 H, NHGly6), 8,081 ,
8,08δ, 8,092 und 8,118 (m, 4H, NHGly2 5), 8,645 (verb t, 1 H, NHGly1)
[HCI H-AC-Gly5-NHCH2-]4C (23a) 1H-NMR Spektrum in D20 (δ, ppm) 1 ,446 (m, 2H, CH2), 1 ,689 (m, 2H,
COCH2Ch , 1 ,724 (m, 2H, Cli,CH2N), 2,398 (t, 2H, J 7,4 Hz, COCH2), 2,967 (verb s, CCH2), 3,044 (t,
2H, J 7,4 Hz, CH2N), 3,994, 4,012, 4,049 (x2) und 4,096 (s, 10H, 5 COCH2N)
[HCI H-AC2-Gly5-NHCH2-]4C (24a) 1H-NMR Spektrum in D20 (δ, ppm) 1 ,336 und 1 ,382 (m, 4H, 2 CH2),
1 ,548 (m, 2H, Ch^C^N), 1 ,656 (m, 4H, 2 COCH^Ü), 1 ,712 (m, 2H, CüCH^), 2,283 (t, 2H, J 7,4 Hz,
COCH2), 2,370 (t, 2H, J 7,4 Hz, COCH^HCOChy, 2,955 (verb s, CCH2), 3,031 (t, 2H, J 7,4 Hz,
CH2N+), 3,206 (t, 2H, J 6,6 Hz, CH2N), 3,988, 4,00, 4,044 (x2) und 4,091 (s 10H, 5 COCH2N)
[HCI H-AC3-Gly5-NHCH2-]4C (25a) 1H-NMR Spektrum in D20 (δ, ppm) 1 ,34-1 ,42 (m, 6H, 3 CH2), 1 ,551 (m, 4H, 2 CÜCHjN), 1 ,653 (x2) und 1 ,689 (m, 6H, 3 COC^C ,), 1,717 (m, 2H, CHjCHjN*), 2,270 und 2,288 (t, 4H, J 7,5 Hz, 2 COCH2), 2,376 (t, 2H, J 7,5 Hz, COCHjNHCOCh , 2,952 (verb. s, CCH2), 3,033 (t, 2H, J 7,5 Hz, CH2N+), 3,208 (t, 4H, J 7 Hz, 2 CH2N), 3,990, 4,004, 4,049 (x2) und 4,097 (s, 10H, 5 COCH2N).
H
Tabelle 5. Herstellun tetravalenter Matrizen 17-25 Beis iel 4 0) cr
CD n
ZC
CD c «→n-
CD
C
-3
CQ
CD
—x
0)
<
0)
CD ZI r+
CD ω
N
Φ
Figure imgf000032_0001
oα
CD
Figure imgf000032_0002
"σ -
Beispiel 5.
Herstellung der geschützten Tetrasialoside
Herstellung von fAc/,(OMe)Neu5Acσ-OCH,(p-CRH,)NHCOCH-,NH-CO(CH2)1CO-
(NHCH?CO)<NHCH,LC
[Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-Ad-Gly5-NHCH2-]4C (31).
1 mM der Verbindung (21) (siehe Tabelle 6) wurde in 4 ml CF3COOH aufgenommen und zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 4ml Toluol versetzt, im Vakuum eingedampft und getrocknet. Der Rückstand wurde in 5ml Wasser gelöst, mit 4 ml einer 2_M HCI-Lösung versetzt und eingeengt. Das erhaltene Tetrahydrochlorid (21a) wurde im Vakuum getrocknet, in 0.5ml DMF suspendiert, mit 6 mM Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-Ad-ONp (8) und 0.5 ml NEt3 versetzt und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt und und das Produkt wurde mittels Säulenchromatographie gereinigt (s. Tabelle 6). Nach Trocknen im Vakuum wurde die Verbindung (21) als farbloses amorphes Produkt in 65% Ausbeute erhalten.
Die Verbindungen (26)-(30), (32)-(36) wurden auf analoge Weise hergestellt (siehe Tabelle 6).
[Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-Ad-NHCH2-]4C (26). 1H-NMR Spektrum in D6-DMSO (δ, ppm): Matrix: 1.534 (m, 4H, 2 COCHjCJi), 2.171 (m, 4H, 2 COCH^CI-y, 2.891 (verb., 2H, CCH2), 3.867 (d, 2H, ArNHCOCJi), 7.674 (verb. t, 1 H, CCH2NH), 8.107 (t, 1 H, J 6 Hz, NHCOCH2CH2), 9.964 (s, 1 H, ArNH); Neu5Acα2- OCH2C6H4-Fragment: 1.677, 1.918, 1.975, 2.024 und 2.094 (s, 15H, 5 COCH3), 1.761 (dd, 1 H, J4 12.2 Hz, H-3ax), 2.570 (dd, 1 H, J3ax 12.5 Hz, J4 4.6 Hz, H-3eq), 3.697 (s, 3H, COOCH3), 3.904 (ddd, 1 H, J4 10.3 Hz, H-5), 4.028 (dd, 1 H, J8 6.3 Hz, H-9b), 4.087 (dd, 1 H, J5 10.7 Hz, H-6), 4.233 (dd, 1 H, J9b 12.5 Hz, J8 3 Hz, H-9a), 4.320 und 4.643 (d, 2H, J 11.8 Hz, ArCHa), 4.711 (ddd, 1 H, H-4), 5.192 (dd, 1 H, J88.4 Hz, J6 2.4 Hz, H-7), 5.341 (ddd, 1 H, H-8), 7.214 und 7.555 (d, 2H, J 8.6 Hz, Ar), 7.708 (d, 1 H, J5 9.6 Hz, NH).
[Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-Ad-Gly-NHCH2-]4C (27). Η-NMR Spektrum in D6-DMSO (δ, ppm): Matrix: 1.509 (m, 4H, 2 COCH2CHy, 2.147 und 2.231 (m, 4H, 2 COCHzCH,), 2.674 (verb., 2H, CCH2), 3.647 (m, 2H, Gly), 3.859 (d, 2H, ArNHCOChy, 7.852 (verb. t, 1 H, CCH2NH), 8.100 (t, 1 H, J 6 Hz, NHCOCH2CH2), 8.453 (t, 1 H, J 6 Hz, NHGIy), 9.962 (s, 1 H, ArNH). Neu5Acα2-OCH2C6H4-Fragment: 1.677, 1.918, 1.975, 2.024 und 2.094 (s, 15H, 5 COCH3), 1.761 (dd, 1 H, J4 12.2 Hz, H-3ax), 2.570 (dd, 1H, J3ax 12.5 Hz, J44.6 Hz, H-3eq), 3.697 (s, 3H, COOCH3), 3.904 (ddd, 1H, J4 10.3 Hz, H-5), 4.028 (dd, 1 H, J8 6.3 Hz, H-9b), 4.087 (dd, 1 H, J5 10.7 Hz, H-6), 4.233 (dd, 1 H, J9b 12.5 Hz, J8 3 Hz, H-9a), 4.320 und 4.643 (d, 2H, J 11.8 Hz, ArCÜ), 4.711 (ddd, 1 H, H-4), 5.192 (dd, 1 H, J8 8.4 Hz, J6 2.4 Hz, H-7), 5.341 (ddd, 1 H, H-8), 7.214 und 7.555 (d, 2H, J 8.6 Hz, Ar), 7.708 (d, 1 H, J5 9.6 Hz, NH).
[Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-Ad-Gly2-NHCH2-]4C (28). 1H-NMR Spektrum in D6-DMSO (δ, ppm): Matrix: 1.495 (m, 4H, 2 COCH2Chy, 2.150 (m, 4H, 2 COCH^CH,), 2.694 (verb., 2H, CCH2), 3.716 (d, 2H, CH2 Gly2), 3.818 (d, 2H, CH2 Gly1), 3.865 (d, 2H, ArNHCOCh , 7.824 (verb. t, 1 H, CCH2NH), 7.993 (t, 1 H, J 6 Hz, NHGly2), 8.096 (t, 1 H, J 6 Hz, NHCOCH2CH2), 8.544 (t, 1 H, J 6 Hz, NHGly ), 9.975 (s, 1 H, ArNH). Neu5Acα2-OCH2C6H4-Fragment: 1.677, 1.918, 1.975, 2.024 und 2.094 (s, 15H, 5 COCH3), 1.761 (dd, 1 H, J4 12.2 Hz, H-3ax), 2.570 (dd, 1 H, J3ax 12.5 Hz, J4 4.6 Hz, H-3eq), 3.697 (s, 3H, COOCH3), 3.904 (ddd, 1 H, J4 10.3 Hz, H-5), 4.028 (dd, 1 H, J8 6.3 Hz, H-9b), 4.087 (dd, 1 H, J5 10.7 Hz, H-6), 4.233 (dd, 1 H, J9b 12.5 Hz, J8 3 Hz, H-9a), 4.320 und 4.643 (d, 2H, J 11.8 Hz, ArCH^), 4.711 (ddd, 1 H, H-4), 5.192 (dd, 1 H, J8 8.4 Hz, J62.4 Hz, H-7), 5.341 (ddd, 1 H, H-8), 7.214 und 7.555 (d, 2H, J 8.6 Hz, Ar), 7.708 (d, 1 H, J5 9.6 Hz, NH).
[Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-Ad-Gly3-NHCH2]4C (29). 1H-NMR Spektrum in D6-DMSO (δ, ppm): Matrix: 1.498 (m, 4H, 2 COCH^Ü), 2.143 und 2.158 (m, 4H, 2 COCJiCH.), 2.693 (verb., 2H, CCH2), 3.728 (m, 4H, 2 CH2 Gly2'3), 3.841 (d, 2H, CH2 Gly1), 3.862 (d, 2H, ArNHCOCH,), 7.820 (verb. t, 1H, CCH2NH), 8.049 und 8.059 (t, 2H, J 5.7 Hz, NH0'1'2'3), 8.098 (t, 1 H, J 5.8 Hz, NHCOCH2CH2), 8.547 (t, 1 H, J 5.5 Hz, NHGly1), 9.972 (s, 1H, ArNH). Neu5Acα2-OCH2C6H4-Fragment: 1.677, 1.918, 1.975, 2.024 und 2.094 (s, 15H, 5 COCH3), 1.761 (dd, 1 H, J4 12.2 Hz, H-3ax), 2.570 (dd, 1 H, J3ax 12.5 Hz, J4 4.6 Hz, H-3eq), 3.697 (s, 3H, COOCH3), 3.904 (ddd, 1 H, J4 10.3 Hz, H-5), 4.028 (dd, 1 H, J8 6.3 Hz, H-9b), 4.087 (dd, 1 H, J5 10.7 Hz, H-6), 4.233 (dd, 1 H, J9b 12.5 Hz, J8 3 Hz, H-9a), 4.320 und 4.643 (d, 2H, J 11.8 Hz, ArCJi), 4.711 (ddd, 1 H, H-4), 5.192 (dd, 1 H, J8 8.4 Hz, J62.4 Hz, H-7), 5.341 (ddd, 1 H, H-8), 7.214 und 7.555 (d, 2H, J 8.6 Hz, Ar), 7.708 (d, 1 H, J5 9.6 Hz, NH).
[Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-Ad-Gly4-NHCHJ4C (30).1H-NMR Spektrum in D6-DMSO (δ, ppm), Matrix: 1.500 (m, 4H, 2 COCH^Ü,), 2.151 (m, 4H, 2 COCJiCH^, 2.688 (verb., 2H, CCH2), 3.720 (x2) und 3.753 (d, 6H, 3 CH2 Gly2M), 3.841 (d, 2H, CH2 Gly1), 3.864 (d, 2H, ArNHCOChi,), 7.818 (verb. t, 1 H, CCH2NH), 8.045 und 8.084 (x2) (t, 3H, J 6 Hz, NHGly2"4), 8.102 (t, 1 H, J 6 Hz, NHCOCH2CH2), 8.555 (t, 1 H, J 5.5 Hz, NHGly1), 9.980 (s, 1 H, ArNH). Neu5Acα2-OCH2C6H4-Fragment: 1.677, 1.918, 1.975, 2.024 und 2.094 (s, 15H, 5 COCH3), 1.761 (dd, 1 H, J4 12.2 Hz, H-3ax), 2.570 (dd, 1 H, J3ax 12.5 Hz, J44.6 Hz, H-3eq), 3.697 (s, 3H, COOCH3), 3.904 (ddd, 1 H, J4 10.3 Hz, H-5), 4.028 (dd, 1 H, J8 6.3 Hz, H-9b), 4.087 (dd, 1 H, J5 10.7 Hz, H-6), 4.233 (dd, 1 H, J9b 12.5 Hz, J8 3 Hz, H-9a), 4.320 und 4.643 (d, 2H, J 11.8 Hz, ArChü, 4.711 (ddd, 1H, H-4), 5.192 (dd, 1H, J8 8.4 Hz, J6 2.4 Hz, H-7), 5.341 (ddd, 1H, H-8), 7.214 und 7.555 (d, 2H, J 8.6 Hz, Ar), 7.708 (d, 1 H, J5 9.6 Hz, NH). [ActOMeJNeuδAc-Gab-Ad-Glys-NHCH^C (31). 1H-NMR Spektrum in D6-DMSO (δ, ppm): Matrix: 1.502 (m, 4H, 2 COCH2CHa), 2.147 und 2.159 (m, 4H, 2 COCJiCHz), 2.688 (verb., 2H, CCH2), 3.738 (x2) und 3.765 (x2) (m, 8H, 4 CH2 Gly2-5), 3.857 (d, 2H, CH2 Gly1), 3.877 (d, 2H, ArNHCOCH,), 7.818 (verb. t, 1 H, CCH2NH), 8.074 (m, 5H, NHCOCH2CH2, NHGly2"5), 8.551 (t, 1 H, J 6 Hz, NHGly1), 9.968 (s, 1 H, ArNH). Neu5Acα2-OCH2C6H4-Fragment: 1.677, 1.918, 1.975, 2.024 und 2.094 (s, 15H, 5 COCH3), 1.761 (dd, 1 H, J4 12.2 Hz, H-3ax), 2.570 (dd, 1 H, J3ax 12.5 Hz, J44.6 Hz, H-3eq), 3.697 (s, 3H, COOCH3), 3.904 (ddd, 1 H, J4 10.3 Hz, H-5), 4.028 (dd, 1 H, J8 6.3 Hz, H-9b), 4.087 (dd, 1 H, J5 10.7 Hz, H-6), 4.233 (dd, 1 H, J9b 12.5 Hz, J8 3 Hz, H-9a), 4.320 und 4.643 (d, 2H, J 11.8 Hz, ArCH,), 4.711 (ddd, 1 H, H-4), 5.192 (dd, 1 H, J8 8.4 Hz, J52.4 Hz, H-7), 5.341 (ddd, 1 H, H-8), 7.214 und 7.555 (d, 2H, J 8.6 Hz, Ar), 7.708 (d, 1 H, J5 9.6 Hz, NH).
[Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-Ad-AC2-Gly5-NHCH2]4C (32). 1H-NMR Spektrum in D6-DMSO (δ, ppm), Matrix: 1.224, 1.366 und 1.469 (m, 12H, 6 CH2), 1.502 (m, 4H, 2 COCHjCÜ), 2.032 und 2.121 (m, 2 COCH2), ), 2.147 und 2.159 (m, 4H, 2 COCH,CH2), 2.688 (verb., 2H, CCH2), 3.00 (m, 4H, 2 CH,NHCO), 3.738 (x2) und 3.765 (x2) (m, 8H, 4 CH2 Gly2-5), 3.857 (d, 2H, CH2 Gly1), 3.877 (d, 2H, ArNHCOCH,), 7.679 und 7.700 (verb. t, 2H, 2 NHCO), 7.818 (verb. t, 1 H, CCH2NH), 8.074 (m, 5H, NHCOCH2CH2, NHGly2-5), 8.551 (t, 1H, J 6 Hz, NHGly1), 9.968 (s, 1H, ArNH). Neu5Acα2-OCH2C6H4-Fragment: 1.677, 1.918, 1.975, 2.024 und 2.094 (s, 15H, 5 COCH3), 1.761 (dd, 1 H, J4 12.2 Hz, H-3ax), 2.570 (dd, 1 H, J3ax 12.5 Hz, J4 4.6 Hz, H-3eq), 3.697 (s, 3H, COOCH3), 3.904 (ddd, 1 H, J4 10.3 Hz, H-5), 4.028 (dd, 1 H, J86.3 Hz, H-9b), 4.087 (dd, 1 H, J5 10.7 Hz, H-6), 4.233 (dd, 1 H, J9b 12.5 Hz, J8 3 Hz, H-9a), 4.320 und 4.643 (d, 2H, J 11.8 Hz, ArCH,), 4.711 (ddd, 1 H, H-4), 5.192 (dd, 1 H, J8 8.4 Hz, J6 2.4 Hz, H-7), 5.341 (ddd, 1 H, H-8), 7.214 und 7.555 (d, 2H, J 8.6 Hz, Ar), 7.708 (d, 1 H, J5 9.6 Hz, NH).
[Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-Ad-AC3-Gly5-NHCH2]4C (33). 1H-NMR Spektrum in D6-DMSO (δ, ppm) ist dem Spektrum der Verbindung (32) sehr ähnlich (die Signale sind zum Teil stärker verbreitert und die Integrale der Amidocapronsäure-Gruppen sind entsprechend größer).
[Ac4(OMe)Neu5Ac-Gab-AC-Ad-Gly5-NHCHJ4C (34). 1H-NMR Spektrum in D6-DMSO (δ, ppm): Matrix: 1.250, 1.382, 1.465 und 1.506 (m, 10H, 5 CH2), 2.033 und 2.140 (m, 6H, 3 COCH2), 2.697 (verb., 2H, CCH2), 3.009 (m~q, 2H, J 6.4 Hz, CH,NHCO), 3.719 (x2) und 3.748 (x2) (m, 8H, 4 CH2 Gly2"5), 3.843 (d, 2H, CH2 Gly1), 3.862 (d, 2H, ArNHCOCH;,), 4.327 und 4.648 (d, 2H, J 11.8 Hz, ArCh , 7.216 und 7.555 (d, 2H, J 8 Hz, Ar), 7.698 (t, 1H, NHCO), 7.818 (verb. t, 1H, CCH2NH), 8.039, 8.072, 8.084 (x2), 8.110 (m, 5H, NHCOCH2CH2, NHGly2"5), 8.547 (t, 1 H, NHGly1), 9.970 (s, 1H, ArNH). Neu5Acα2-OCH2CsH4-Fragment: 1.677, 1.918, 1.975, 2.024 und 2.094 (s, 15H, 5 COCH3), 1.761 (dd, 1 H, J4 12.2 Hz, H-3ax), 2.570 (dd, 1 H, J3ax 12.5 Hz, J44.6 Hz, H-3eq), 3.697 (s, 3H, COOCH3), 3.904 (ddd, 1 H, J4 10.3 Hz, H-5), 4.028 (dd, 1 H, J8 6.3 Hz, H-9b), 4.087 (dd, 1 H, J5 10.7 Hz, H-6), 4.233 (dd, 1 H, J9b 12.5 Hz, J8 3 Hz, H-9a), 4.320 und 4.643 (d, 2H, J 11.8 Hz, ArCH,), 4.711 (ddd, 1 H, H-4), 5.192 (dd, 1 H, J8 8.4 Hz, J6 2.4 Hz, H-7), 5.341 (ddd, 1 H, H-8), 7.214 und 7.555 (d, 2H, J 8.6 Hz, Ar), 7.708 (d, 1 H, J5 9.6 Hz, NH). [Ac OMeϊNeuSAc-Gab-AC.-Ad-Glys-NHCH^C (35). 1H-NMR Spektrum in D6-DMSO (δ, ppm): Matrix: 1.239, 1.375, 1.465 und 1.509 (m, CH2), 2.026 und 2.142 (m, COCH2), 2.711 (verb., 2H, CCH2), 3.003 (m, 4H, 2 CÜNHCO), 3.718 (x2) und 3.746 (x2) (m, 8H, 4 CH2 Gly2-5), 3.839 (d, 2H, CH2 Gly1), 3.861 (d, 2H, ArNHCOCH , 4 329 und 4 649 (d, 2H, J 11 8 Hz, ArCH,), 7 218 und 7 561 (d, 2H, J 8 Hz, Ar), 7 681 und 7.695 (m, 2H, 2 NHCO), 7 834 (verb t, 1 H, CCH2NH), 8 077, 8 133 (x3), 8 177 (m, 5H, NHCOCH2CH2, NHGly2 5), 8 587 (t, 1 H, NHGly1), 10 01 (s, 1 H, ArNH) Neu5Acα2-OCH,C6H4-Fragment 1 677, 1 918, 1 975, 2 024 und 2 094 (s, 15H, 5 COCH3), 1 761 (dd, 1 H, J4 12 2 Hz, H-3ax), 2 570 (dd, 1 H, J3ax 12 5 Hz, J4 4 6 Hz, H-3eq), 3 697 (s, 3H, COOCH3), 3 904 (ddd, 1 H, J4 10 3 Hz, H-5), 4 028 (dd, 1 H, J8 6 3 Hz, H-9b), 4 087 (dd, 1 H, J5 10 7 Hz, H-6), 4 233 (dd, 1 H, J9b 12 5 Hz, J8 3 Hz, H-9a), 4 320 und 4 643 (d, 2H, J 11 8 Hz, ArCH,), 4 711 (ddd, 1 H, H-4), 5 192 (dd, 1 H, J8 8 4 Hz, J62 4 Hz, H-7), 5 341 (ddd, 1 H, H-8), 7 214 und 7 555 (d, 2H, J 8 6 Hz, Ar), 7 708 (d, 1 H, J5 9 6 Hz, NH)
[Ac^OMeJNeuδAc-Gab-ACj-Ad-Glys-NHCHJ^ (36) Das 1H-NMR Spektrum in D6-DMSO entspricht weitesgehend dem Spektrum der Verbindung (35), die Signale sind zum Teil starker verbreitert Matrix (δ, ppm) 1 239, 1 375, 1 465 und 1 509 (m, CH2), 2 026 und 2 142 (m, COCH2), 2 629 (verb , 2H, CCH2), 3 00 (m, 6H, 3 CH MHCO), 3 813 (verb , 2H, CH2 Gly1), 3 861 (d, 2H, ArNHCOCH , 4 329 und 4 649 (d, 2H, J 11 8 Hz, ArCH,), 7 218 und 7 561 (d, 2H, J 8 Hz, Ar), 7 693 (m, 3H, 3 NHCO), 7 904 (verb , 1 H, CCH2NH), 8 083 (x2), 8 158 und 8 215 (x2) (m, 5H, NHCOCH2CH2, NHGly2 5), 8 538 (t, 1 H, NHGly1) Neu5Acα2-OCH2C6H4-Fragment 1 677, 1 918, 1 975, 2 024 und 2 094 (s, 15H, 5 COCH3), 1 761 (dd, 1H, J4 12 2 Hz, H-3ax), 2 570 (dd, 1 H, J3ax 12 5 Hz, J44 6 Hz, H-3eq), 3 697 (s, 3H, COOCH3), 3 904 (ddd, 1 H, J4 10 3 Hz, H-5), 4 028 (dd, 1 H, J8 6 3 Hz, H-9b), 4 087 (dd, 1 H, J5 10 7 Hz, H-6), 4 233 (dd, 1 H, J9b 12 5 Hz, J8 3 Hz, H-9a), 4 320 und 4 643 (d, 2H, J 11 8 Hz, ArCH,), 711 (ddd, 1 H, H-4), 5 192 (dd, 1 H, J8 8 4 Hz, J6 2 4 Hz, H-7), 5 341 (ddd, 1 H, H-8), 7 214 und 7 555 (d, 2H, J 8 6 Hz, Ar), 7 708 (d, 1H, J5 9 6 Hz, NH)
CD
CD
CD"
CO
Tabelle 6 Herstellung der geschützten Tetrasialoside 2β-36 Beis iel 5 I
CD
CΛ
CD
—
CQ
Q. CD Ω CD CΛ O T c F r-t-
CD
3
H CD
CΛ ω_ o ω
Q.' CD ro cn co
CD CD
CΛ T3
Figure imgf000037_0001
CD cn
Beispiel 6.
Herstellung der freien Tetrasialoside
Herstellung von [Neu5Aca-OCH,(D-CκH,)NHCOCH,NH-CO(CH,),CO-(NH(CH,).CO),- (NHCH,CO)*-NHCHτLC (Ammonium Salz) NeuδAc-Gab-Ad-ACa-Glys-NHCHj C (44).
Zu einer Lösung von 10 μM des geschützten Tetrasialosids (33) in 3ml absoluten MeOH wurden 80 μl 2N NaOH Lösung zugegeben, nach 3 Stunden wurden nochmals 1 ,5 ml Wasser und 80 μl 2N NaOH Lösung zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, mit 80 μl AcOH versetzt und zur Trockne eingedampft. Das Produkt wurde mittels Gelchromatographie über Sephadex G-10 mit einer 0,05 M wässrigen NH4OH-Lösung erhalten, (siehe Tabelle 7).
Die Verbindungen (37)-(43), (45)-(47) wurden in analoger Weise erhalten (siehe Tabelle 7).
Tabelle 7 (Beispiel 6)
Figure imgf000039_0001
Bestimmt mittels epermeations-Chromatographie
[Neu5Ac-Gab-Ad-NHCH2-]4C (37). 1H-NMR Spektrum in D20 (δ, ppm): Matrix: 1 ,633 (m, 4H, COCH2CH2), 2,293 und 2,358 (m, 4H, 2 COCJiCH.), 2,943 (s, 2H, CCH2), 4,003 (s, 2H, ArNHCOCH,). 4,493 und 4,718 (d, 2H, J 11 Hz, ArCH2), 7,388 (m, 4H, Ar). NeuδAcα-Fragment : 1 ,680 (dd, 1 H, J4 12 Hz, H-3ax), 2,036 (s, 3H, NAc), 2,778 (dd, 1 H, J3ax 12,5 Hz, J44,6 Hz, H-3eq), 3,598 (dd, 1 H, J8 9 Hz, H- 7), 3,636 (dd, 1 H, J8 6 Hz, H-9b), 3,695 (ddd, 1 H, J5 9,8 Hz, H-4), 3,728 (dd, 1 H, J7 1 ,5 Hz, J5 10,2 Hz, H-6), 3,782 (ddd, 1 H, H-8), 3,822 (dd, 1 H, H-5), 3,846, (dd, 1 H, J9b 12 Hz, J8 2,3 Hz, H-9a). [Neu5Ac-Gab-Ad-Gly-NHCH2-]4C (38). H-NMR Spektrum in D20 (δ, ppm): Matrix: 1 ,622 (m, 4H, COCH2CH2), 2,340 und 2,382 (m, 4H, 2 COCÜCH^, 2,810 (s, 2H, CCH2), 3,847 (s, 2H, CH2 Gly), 4,016 (s, 2H, ArNHCOChy. 4,492 und 4,707 (d, 2H, J 11 Hz, ArCH2), 7,402 (m, 4H, Ar). NeuδAcα-Fragment : 1 ,680 (dd, 1 H, J4 12 Hz, H-3ax), 2,036 (s, 3H, NAc), 2,778 (dd, 1 H, J3ax 12,5 Hz, J4 4,6 Hz, H-3eq), 3,598 (dd, 1 H, J8 9 Hz, H-7), 3,636 (dd, 1 H, J8 6 Hz, H-9b), 3,695 (ddd, 1 H, J5 9,8 Hz, H-4), 3,728 (dd, 1 H, J7 1 ,5 Hz, J5 10,2 Hz, H-6), 3,782 (ddd, 1 H, H-8), 3,822 (dd, 1 H, H-5), 3,846, (dd, 1 H, J9b 12 Hz, J8 2,3 Hz, H-9a).
[Neu5Ac-Gab-Ad-Gly2-NHCH2-]4C (39). 1H-NMR Spektrum in D20 (δ, ppm): Matrix: 1 ,626 (m, 4H, COCH2Chy, 2,341 (m, 4H, 2 COCH^CH^, 2,831 (s, 2H, CCH2), 3,894 und 3,991 (s, 4H, 2 CH2 Gly1'2), 4,022 (s, 2H, ArNHCOChy. 4,492 und 4,719 (d, 2H, J 11 Hz, ArCH2), 7,402 (m, 4H, Ar). NeuδAc - Fragment : 1 ,680 (dd, 1 H, J4 12 Hz, H-3ax), 2,036 (s, 3H, NAc), 2,778 (dd, 1 H, J3ax 12,5 Hz, J44,6 Hz, H- 3eq), 3,598 (dd, 1 H, J8 9 Hz, H-7), 3,636 (dd, 1 H, J8 6 Hz, H-9b), 3,695 (ddd, 1 H, J5 9,8 Hz, H-4), 3,728 (dd, 1 H, J7 1 ,5 Hz, J5 10,2 Hz, H-6), 3,782 (ddd, 1 H, H-8), 3,822 (dd, 1 H, H-5), 3,846, (dd, 1 H, J9b 12 Hz, J8 2,3 Hz, H-9a).
[Neu5Ac-Gab-Ad-Gly3-NHCH2-]4C (40). 1H-NMR Spektrum in D20 (δ, ppm): Matrix: 1 ,631 (m, 4H, COCH2CH;,), 2,344 (m, 4H, 2 COChkCH^, 2,857 (s, 2H, CCH2), 3,912, 3,931 und 4,024 (s, 6H, 3 CH2 Gly1- 3), 4,029 (s, 2H, ArNHCOCH,). 4,500 und 4,725 (d, 2H, J 11 Hz, ArCH2), 7,408 (m, 4H, Ar). NeuδAcα- Fragment : 1 ,680 (dd, 1 H, J4 12 Hz, H-3ax), 2,036 (s, 3H, NAc), 2,778 (dd, 1 H, J3ax 12,5 Hz, J44,6 Hz, H- 3eq), 3,598 (dd, 1 H, J8 9 Hz, H-7), 3,636 (dd, 1 H, J8 6 Hz, H-9b), 3,695 (ddd, 1 H, J5 9,8 Hz, H-4), 3,728 (dd, 1 H, J7 1 ,5 Hz, J5 10,2 Hz, H-6), 3,782 (ddd, 1 H, H-8), 3,822 (dd, 1 H, H-5), 3,846, (dd, 1 H, J9b 12 Hz, J8 2,3 Hz, H-9a).
[Neu5Ac-Gab-Ad-Gly4-NHCH2-]4C (41). 1H-NMR Spektrum in D20 (δ, ppm): Matrix: 1 ,636 (m, 4H, COCHzCJi), 2,350 (m, 4H, 2 COCJiCH.), 2,864 (s, 2H, CCH2), 3,912, 3,934, 3,968 und 4,025 (s, 8H, 4 CH^1"4), 4,032 (s, 2H, ArNHCOCü). 4,497 und 4,725 (d, 2H, J 11 Hz, ArCH2), 7,408 (m, 4H, Ar). NeuδAcα-Fragment : 1 ,680 (dd, 1 H, J4 12 Hz, H-3ax), 2,036 (s, 3H, NAc), 2,778 (dd, 1 H, J3ax 12,5 Hz, J4 4,6 Hz, H-3eq), 3,598 (dd, 1 H, J8 9 Hz, H-7), 3,636 (dd, 1 H, J86 Hz, H-9b), 3,695 (ddd, 1 H, J5 9,8 Hz, H- 4), 3,728 (dd, 1 H, J7 1 ,5 Hz, J5 10,2 Hz, H-6), 3,782 (ddd, 1 H, H-8), 3,822 (dd, 1 H, H-5), 3,846, (dd, 1 H, J9b 12 Hz, J8 2,3 Hz, H-9a).
[Neu5Ac-Gab-Ad-Gly5-NHCH2-]4C (42). 1H-NMR Spektrum in D20 (δ, ppm): Matrix: 1,638 (m, 4H, COCHsChy, 2,355 (m, 4H, 2 COChkCH;,), 2,878 (s, 2H, CCH2), 3,921 , 3,933, 3,974 (x2) und 4,032 (s, 10H, 5 CH2 Gly1-5), 4,036 (s, 2H, ArNHCOChy. 4,502 und 4,724 (d, 2H, J 11 Hz, ArCH2), 7,410 (m, 4H, Ar). NeuδAcα-Fragment : 1 ,680 (dd, 1 H, J4 12 Hz, H-3ax), 2,036 (s, 3H, NAc), 2,778 (dd, 1 H, J3ax 12,5 Hz, J4 4,6 Hz, H-3eq), 3,598 (dd, 1 H, J8 9 Hz, H-7), 3,636 (dd, 1 H, J8 6 Hz, H-9b), 3,695 (ddd, 1 H, J5 9,8 Hz, H-4), 3,728 (dd, 1 H, J7 1 ,5 Hz, J5 10,2 Hz, H-6), 3,782 (ddd, 1 H, H-8), 3,822 (dd, 1 H, H-5), 3,846, (dd, 1 H, J9b 12 Hz, J8 2,3 Hz, H-9a).
[Neu5Ac-Gab-Ad-AC2-Gly5-NHCH2-]4C (43). 1H-NMR Spektrum in D20 (δ, ppm): Matrix: 1 ,286, 1 ,476 und 1 ,567 (m, 12H, 6 CH2), 1 ,623 (m, 4H,
Figure imgf000041_0001
(t, 2H, J 7,4 Hz, CH2CO), 2,245 und 2,367 (m, 4H, COCH^CH.CH.CH^CO), 2,299 (t, 2H, J 7,4 Hz, CH2CO), 2,882 (s, 2H, CCH2), 3,133 (m, 4H, 2 CH2N), 3,928, 3,940, 3,987 (x2) und 4,043 (x2) (s, 12H, 6 COCH2N), 4,502 und 4,730 (d, 2H, J 11 Hz, ArCH2), 7,418 (m, 4H, Ar). NeuδAcα-Fragment : 1 ,680 (dd, 1 H, J4 12 Hz, H-3ax), 2,036 (s, 3H, NAc), 2,778 (dd, 1 H, J3ax 12,5 Hz, J44,6 Hz, H-3eq), 3,598 (dd, 1 H, J8 9 Hz, H-7), 3,636 (dd, 1 H, J8 6 Hz, H-9b), 3,695 (ddd, 1 H, J5 9,8 Hz, H-4), 3,728 (dd, 1 H, J7 1 ,5 Hz, J5 10,2 Hz, H-6), 3,782 (ddd, 1 H, H-8), 3,822 (dd, 1 H, H-5), 3,846, (dd, 1 H, J9b 12 Hz, J8 2,3 Hz, H-9a).
Aggregat [Neu5Ac-Gab-Ad-AC3-Gly5-NHCH2-]4C (44). H-NMR Spektrum in D20 ist dem Spektrum der Verbindung (43) sehr ähnlich,
Matrix (δ.ppm): 1 ,283, 1 ,476, 1 ,570 (m, 18H, 9 CH2), 2,178 und 2,189 (t, 2x2H, J 7,4 Hz, 2 CH2CO), 2,301 (t, 2H, J 7,4 Hz, CH2CO), 3,135 (m, 6H, 3 CH2N), 3,928, 3,940, 3,987 (x2) und 4,043 (x2) (s, 12H, 6 COCH2N), 4,502 und 4,730 (d, 2H, J 11 Hz, ArCH2), 7,418 (m, 4H, Ar).
NeuδAcα-Fragment : 1 ,680 (dd, 1 H, J4 12 Hz, H-3ax), 2,036 (s, 3H, NAc), 2,778 (dd, 1 H, J3ax 12,5 Hz, J4 4,6 Hz, H-3eq), 3,598 (dd, 1 H, J8 9 Hz, H-7), 3,636 (dd, 1 H, J8 6 Hz, H-9b), 3,695 (ddd, 1 H, J5 9,8 Hz, H- 4), 3,728 (dd, 1 H, J7 1 ,5 Hz, J5 10,2 Hz, H-6), 3,782 (ddd, 1 H, H-8), 3,822 (dd, 1 H, H-5), 3,846, (dd, 1 H, J9b 12 Hz, J8 2,3 Hz, H-9a).
[Neu5Ac-Gab-AC-Ad-Gly5-NHCH2-]4C (45). 1H-NMR Spektrum in D20 (δ, ppm): Matrix: 1 ,334 (m, 2H, CH2), 1 ,504 (m, 2H, CHzC^NH), 1 ,569 (m, 4H, COCH^hbCH∑CHsCO), 1 ,625 (m, 2H, CHzC^CO), 2,207 und 2,313 (m, 4H, COCH^CH-CH.Ch CO), 2,344 (t, 2H, J 7 Hz, CH2CO), 2,885 (s, 2H, CCH2), 3,156 (t, 2H, J 7,4 Hz, CH2N), 3,928, 3,942, 3,979, 3,984, 4,037 und 4,042 (s, 12H, 6 COCH2N), 4,506 und 4,729 (d, 2H, J 11 Hz, ArCH2), 7,420 (m, 4H, Ar). NeuδAcα-Fragment : 1 ,680 (dd, 1 H, J4 12 Hz, H- 3ax), 2,036 (s, 3H, NAc), 2,778 (dd, 1 H, J3ax 12,5 Hz, J4 4,6 Hz, H-3eq), 3,δ98 (dd, 1 H, J8 9 Hz, H-7), 3,636 (dd, 1 H, J86 Hz, H-9b), 3,69δ (ddd, 1 H, J5 9,8 Hz, H-4), 3,728 (dd, 1 H, J7 1 ,δ Hz, J5 10,2 Hz, H-6), 3,782 (ddd, 1 H, H-8), 3,822 (dd, 1 H, H-δ), 3,846, (dd, 1 H, J9b 12 Hz, J8 2,3 Hz, H-9a). Aggregat [Neu5Ac-Gab-AC2-Ad-Gly5-NHCH2-]4C (46). 1H-NMR Spektrum in D20 (δ, ppm): Matrix: 1 ,268, 1 ,δ04 und 1 ,630 (m, 12H, 6 CH2), 1 ,δ72 (m, 4H, COC^CHsCJiCH.CO), 2,186 (t, 2H, J 7 Hz, CH2CO), 2,212 und 2,31δ (m, 4H, COCH^C^C^CÜCO), 2,349 (t, 2H, J 7,4 Hz, CH2CO), 2,898 (s, 2H, CCH2), 3,130 und 3,168 (t, 2x2H, J 7,4 Hz, 2 CH2N), 3,934, 3,94δ, 3,987 (x2), 4,039 und 4,045 (s, 12H, 6 COCH2N), 4,509 und 4,72δ (d, 2H, J 11 Hz, ArCH2), 7,422 (m, 4H, Ar). NeuδAcα-Fragment : 1 ,680 (dd, 1H, J4 12 Hz, H-3ax), 2,036 (s, 3H, NAc), 2,778 (dd, 1H, J3ax 12,5 Hz, J4 4,6 Hz, H-3eq), 3,δ98 (dd, 1 H, J8 9 Hz, H-7), 3,636 (dd, 1 H, J8 6 Hz, H-9b), 3,69δ (ddd, 1H, J5 9,8 Hz, H-4), 3,728 (dd, 1 H, J7 1 ,5 Hz, J5 10,2 Hz, H-6), 3,782 (ddd, 1H, H-8), 3,822 (dd, 1 H, H-5), 3,846, (dd, 1 H, J9b 12 Hz, J8 2,3 Hz, H-9a). Aggregat [Neu5Ac-Gab-AC3-Ad-Gly5-NHCH2-]4C (47). Das 1H-NMR Spektrum in D20 ist dem Spektrum der Verbindung (46) sehr ähnlich, die Signale sind zum Teil stärker verbreitert.
Matrix (δ, ppm): 1 ,276, 1 ,461 und 1 ,630 (m, 18H, 9 CH2), 2, 186 (t, 2x2H, J 7 Hz, 2 CH2C0), 2,349 (t, 2H,
J 7,4 Hz, CH2CO), 3,132 (m, 6H, 3 CH2N), 3,934, 3,94δ, 3,987 (x2), 4,039 und 4,04δ (s, 12H, 6
COCH2N), 4,609 und 4,72δ (d, 2H, J 11 Hz, ArCH2), 7,422 (m, 4H, Ar).
NeuδAcα-Fragment : 1 ,680 (dd, 1 H, J4 12 Hz, H-3ax), 2,036 (s, 3H, NAc), 2,778 (dd, 1 H, J3ax 12,δ Hz, J4
4,6 Hz, H-3eq), 3,δ98 (dd, 1 H, J8 9 Hz, H-7), 3,636 (dd, 1 H, J8 6 Hz, H-9b), 3,696 (ddd, 1H, J5 9,8 Hz, H-
4), 3,728 (dd, 1 H, J7 1 ,5 Hz, J5 10,2 Hz, H-6), 3,782 (ddd, 1 H, H-8), 3,822 (dd, 1 H, H-5), 3,846, (dd, 1 H,
J9b 12 Hz, J8 2,3 Hz, H-9a).
Beispiel 7.
Herstellung des Aggregats UNeu5Acσ-0CH-,(D-CRH NHC0CH,NH-C0(CH,),C0- (NHCH,CO),-NHCH2-JήC (Ammonium-Salz) {[Neu5Ac-Gab-Ad-Gly7-NHCH2-]4C}x (48).
6,1 mg, (3,25μM) des Tetrahydrochlorids (22a), hergestellt wie im Beispiel 4 beschrieben, wurden in 0,5 ml Wasser mit 18,8 mg (26 μM) der lyophilisierten Verbindung (15) versetzt. Der pH des Reaktionsgemisches wurde mit 1M NaHCO3 - Lösung auf pH=8 gestellt. Die Reaktionslösung wurde 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt, wobei der pH durch Zugabe von 1 M NaHCO3 -Lösung auf pH=8 gehalten wurde. Das Reaktionsgemisch wurde über eine Sephadex LH-20 Säule mit einer 0,05 M wässrigen NH4OH-Lösung getrennt. Nach Einengen und Trocknen im Vakuum wurden 9,6mg des Produkts (48) erhalten, entsprechend einer Ausbeute von 71 %.
1H-NMR Spektrum (D20, δ, ppm): Matrix: 1,638 (m, 4H, COCH2Chy, 2,3δ8 (m, 4H, 2 COCÜCH^, 2,878 (s, 2H, CCH2), 3,918, 3,938, 3,978 (x4) und 4,034 (s, 14H, 7 CH2 G,y1-7), 4,037 (s, 2H, ArNHCOChy. 4,498 und 4,718 (d, 2H, J 11 Hz, ArCH2), 7,408 (m, 4H, Ar). NeuδAcα-Fragment : 1 ,680 (dd, 1 H, J4 12 Hz, H- 3ax), 2,036 (s, 3H, NAc), 2,778 (dd, 1 H, J3ax 12,δ Hz, J4 4,6 Hz, H-3eq), 3,δ98 (dd, 1 H, J8 9 Hz, H-7), 3,636 (dd, 1 H, J86 Hz, H-9b), 3,69δ (ddd, 1 H, J5 9,8 Hz, H-4), 3,728 (dd, 1 H, J7 1 ,5 Hz, J5 10,2 Hz, H-6), 3,782 (ddd, 1 H, H-8), 3,822 (dd, 1 H, H-5), 3,846, (dd, 1 H, J9b 12 Hz, J8 2,3 Hz, H-9a). Beispiel 8.
Herstellung von Aggregaten
Herstellung von fGala1-3Galß1-0(CH,),NH-CO(CH,)/CO-(NH(CH-,).CO),- (NHCH,CO),-NHCH-,-hcL
{[Bdl-Ap-Ad-AC3-Gly5-NHCH2-]4c}x(49).
Zu einer Suspension von 5,6mg (2μM) des Tetrahydrochlorids (25a), hergestellt wie im Beispiel 4 beschrieben, in 0,5ml DMSO wurden 15,6mg (16) und 5 μl Et3N zugegeben. Die Reaktionslösung wurde 3 Tage bei 40°C gerührt. Nach Zugabe von 0,2ml konz. NH4OH-Lösung wurde das Reaktionsgemisch 30 Minuten gerührt und über eine Sephadex LH-20 Säule mit MeCN/H20 1 :1 getrennt. Nach Einengen und Trocknen im Vakuum wurden 6.4mg des Produkts (49) erhalten, entsprechend einer Ausbeute von 69%.
1H-NMR Spektrum (D20/CD3OD 2:1 , δ, ppm): 1 ,374, 1 ,δ62 und 1 ,646 (m, CH2), 1 ,883 (m, 2H, OCH2CH2CH2N), 2,26δ (t, 4H, J 7.δ Hz, 2 CH2CO), 2,292 (m, 4H, 2 CH2CO), 2,377 (t, 2H, J 7.6 Hz, CH2CO), 2,9δδ (verb. s, CCH2), 3,213 (t, 6H, 3 CH2N), 3,348 (m, 2H, OC^C^CHL-N), 3,697 (dd, 1 H, H-2 Galß), 3,7δ6 (m, OCHCH2CH2N), 3,910 (dd, 1 H, J3 10 Hz, H-2 Gala), 4,00, 4,046 und 4,097 (s, 10H, δ COCH2N), 4,20δ (d, 1 H, J3 3 Hz, H-4 Galß), 4,2δδ (m, 1 H, H-δ Gala), 4,462 (d, 1 H, J2 8 Hz, H-1 Galß), δ,184 (d, 1 H, J2 4 Hz, H-1 Gala).
Herstellung von {[Neu5Aca2-3Galß1-4Glcß1-NHCOCH,NH-CO(CH->),CO-(NHCH,CO)^
NHCHrhcL
{[3 SL-NHCOCH2NH-Ad-Gly5-NHCH2-]4C}X (50) wurde ausgehend von (21a) und (14) analog zur Verbindung (49) hergestellt. DC: Rf 0.52 (Methanol/AcetonitrilΛ Vasser 6:6:3). Ausbeute 65%.
1H-NMR Spektrum (D20, δ, ppm): 1 ,622 (m, 4H, C LCüC^CO), 1 ,797 (dd, 1 H, J4 12 Hz, H-3^ NeuδAc), 2,017 (s, 3H, COCH3), 2,342 (m, 4H, 2 CH2CO), 2,744 (dd, 1 H, J3ax 12.6 Hz, J4 4.6 Hz, H-3eq NeuδAc), 2,89δ (verb. s, CCH2), 3,4δ2 (dd, 1 H, H-2 Gieß), 3,668 (dd, 1 H, J3 10 Hz, H-2 Galß), 3,964, 3,992 und 4,041 (s, 12H, 6 COCH2N), 4,10δ (dd, 1 H, J2 10 Hz, J4 3 Hz, H-3 Galß), 4,δ23 (d, 1 H, J2 8 Hz, H-1 Galß), δ,00δ (d, 1 H, J2 9 Hz, H-1 Gieß). Herstellung von {[Neu5Aca2-3Galß1-4Glcß1-NHCOCH2NH-CO(CH,),CO-(NHCH,CO)^
NHCH -LC l
{[3 SL-NHCOCH2NH-Ad-Giy7-NHCH2-]4c}x (51 ) wurde ausgehend von (22a) und (14) analog zur Verbindung (48) hergestellt.
Ausbeute 78%.
1H-NMR Spektrum (D20, δ, ppm): 1,622 (m, 4H, Ch C ύjC^CO), 1 ,797 (dd, 1 H, J4 12 Hz, H-3ax
NeuδAc), 2,017 (s, 3H, COCH3), 2,342 (m, 4H, 2 CH2CO), 2,744 (dd, 1 H, J3ax 12.δ Hz, J4 4.6 Hz, H-3eq
NeuδAc), 2,89δ (verb. s, CCH2), 3,452 (dd, 1 H, H-2 Gieß), 3,568 (dd, 1 H, J3 10 Hz, H-2 Galß), 3,954,
3,992 und 4,041 (s, 16H, 8 COCH2N), 4,10δ (dd, 1 H, J2 10 Hz, J4 3 Hz, H-3 Galß), 4,623 (d, 1 H, J2 8 Hz,
H-1 Galß), δ,00δ (d, 1H, J2 9 Hz, H-1 Gieß).
Beispiel 9
Induktion der Selbstassoziation von [HCI H-Gly7-NHCH2-]4C (22a).
Die Untersuchung der Lichtstreuung einer 50 mM Lösung der Verbindung (22a) in Wasser wurde mit einem Spectra-Physics 164 Argon Laser (Plasma Linien λ=528.7 and 611.5 nm) durchgeführt, die Streuung wurde in einem Winkel von 90° zum eintretenden Lichtstrahl gemessen. Die hierbei bestimmte Teilcheng rosse betrug <2.5 nm. Zu dieser Lösung wurden 50 μl einer 0.8 M NaHC03-Lösung zugegeben. Die Lichtstreuung wurde, wie oben beschrieben, vermessen, die hierbei bestimmte durchschnittliche Teilchengrösse betrug 200-400 nm.
Zu dieser Lösung wurden 50 μ\ einer 0.8 M HCI zugegeben, und die Probe mittels Lichtstreuung, wie oben beschrieben, untersucht. Die hierbei bestimmte Teilchengrösse betrug < 2.5 nm.
Beispiel 10
Inhibition der viralen Zeil-Adhäsion von Influenza-Viren
Die spezifischen Bindungskonstanten der Inhibitor-Virus-Komplexe wurden mittels eines Fetuin-Binding-Assay, wie in der Literatur beschrieben, bestimmt (US Patent 5,571 ,836, 1996; PCT WO 98/14215).
Tabelle 8, Beispiel 10 Influenza virus A/NIB/44/90M H3N2
Figure imgf000045_0001
Beispiel 11
Inhibition der Complement-abhängigen Zytotoxizität von menschlichen Blutseren gegenüber PK 15 Zellen durch das Aggregat {[BdrAp-Ad-AC3-Gly5-NHCH2-]4C}x (49;
Verdünnungsserien des B-Disaccharides Galα1-3Gal und des Aggregats {[BdrAp-Ad- AC3-Gly5-NHCH2-]4C}x (49) mit menschlichem Blutserum wurden über Nacht bei 4°C inkubiert, und die Inhibition der Zytotoxizität wurde, wie in der Literatur beschrieben, nachgewiesen (R. Rieben, E.von Allmen, E.Y.Korchagina, U. E. Nydegger, F.A.Neethling, M.Kujundzic, E. Koren, N.V.Bovin, D.K.C.Cooper, Xenotransplantation, 2, 98, 1995). Nach Zugabe der Complement-Bestandteile in Form von 10% Kaninchen-Serum (Sigma) wurden die Proben 10 Minuten lang mit auf Terasaki- Platten gezogenen PK15-Zellen inkubiert. Anschliessend wurden die Zellen gewaschen und mit einem Zytotoxizitätskit ("live/dead" viability/cytotoxicity kit, Molecular Probes, Eugene, OR, USA) angefärbt. Durch Messung der Fluoreszenz- Intensitäten wurden die lebend/tod-Anteile bestimmt. Die Inhibition der Zytotoxizität wurde im Vergleich zu einer Serum-Probe, der keine Inhibitoren zugesetzt waren, berechnet. Bei folgenden Konzentrationen (berechnet als molare Konzentration der B-Disaccharid-Einheiten) wurde eine Inhibition der Zytotoxizität um 50% erreicht: Galα1-3Gal (B-Disaccharide) 200 μM
{[Bdl-Ap-Ad-AC3-Gly5-NHCH2-]4c}x Aggregat (49) 0.5 μM
Beispiel 12
Die divalenten Matrizen der Formel [HCI-H-Glyπ-NHCH2CH2-]2 (n = 2, 4) wurden ausgehend von 1 ,4-Diaminobutan analog der Synthese in Beispiel 4 hergestellt.
Herstellung von Bis - 1 Λ-(hexaalvcilamido)-butan [HCI-H-Gly6-NHCH2CH2-]2 (52).
Zu einer Lösung von 30 mg der Verbindung [HCI-H-Gly4-NHCH2CH2-]2 (48.6 μM) in
0.5 ml DMSO wurden 48 mg BocGlyGlyNOS (146 μM) und 0.1 ml Et3N zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei sich ein Niederschlag bildete. Nach Zugabe von 1 ml Wasser wurde der Niederschlag durch Zentrifugation abgetrennt, dreimal in jeweils 1 ml MeOH suspendiert und nochmals abzentrifugiert. Nach Trocknen im Vakuum wurde der Rückstand mit 0.5 ml Trifluoressigsäure versetzt. Nach zwei Stunden wurden zweimal jeweils 3 ml Toluol zugegeben und die Lösung eingeengt. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst und nach Zugabe von 0.1 ml einer 2 M HCI-Lösung bis zur Trockne eingedampft. Das Produkt wurde mittels Gelchromatographie über eine Sephadex LH-20 Säule (1 x30 cm) mit einer 50%igen wässrigen Acetonitril-Lösung erhalten. Nach Gefriertrocknung der Produktfraktion erhielt man 26 mg (63%) der Verbindung (52) . Η-NMR Spektrum in D20 (5, ppm): 1 ,455 (m, 4H, CH2CH2CH2CH2), 3,172 (m, 4H. 2CH2N). 3.856, 3.872, 3.9^7, 3.960, 3,975 und 4,028 (s, 2H, C0CH2N).
Das Aggregat {rNeuδAca-OCHXD-C.H NHCOCH.NH-COfCHX.CO-fNHCHxCO),-
Figure imgf000047_0001
(53) wurde analog der Verbindung (48) in Beispiel 7 hergestellt.
Ausbeute 72%.
Η-NMR Spektrum in D20 (δ, ppm): Matrix: 1 ,470 (m, 4H, CH2CH2CH2CH2), 1 ,649
(m, 4H, COCH2CH2), 2,363 (m, 4H, 2COCH2CH2), 3.181 (m, 4H, 2CH2N), 3,869, 3,941 , 3,962, 3,977 (x3) und 4.045 (s, 2H, COCH2N), 4,505 und 4,727 (d, 2H, J 1 1 Hz, ArCH2). 7,415 (m, 4H, Ar). Neu5Acoc-Fragment : 1 ,680 (dd, 1 H, J4 12 Hz, H-3ax), 2,036 (s, 3H. NAc), 2,778 (dd, 1 H, J3ax 12,5 Hz, J4 4,6 Hz, H-3eq), 3,598 (dd, 1 H, J8 9
Hz, H-7), 3,636 (dd, 1 H, J8 6 Hz, H-9b), 3,695 (ddd, 1 H, J5 9,8 Hz, H-4), 3,728 (dd, 1 H, J7 1 ,5 Hz, J5 10,2 Hz, H-6), 3,782 (ddd, 1 H, H-8), 3,822 (dd, 1 H, H-5), 3,846, (dd, 1 H, J9b 12 Hz, J8 2,3 Hz, H-9a).
Beispiel 13
Herstellung von NeuAcα2-6Galß1 -4GlcNAcß-0(CH2)3NH-CO(CH2)4COO(p-C6H4N02) 6'SLN-Ap-Ad-ONp (52).
Zu einer Lösung von 28 mg (38 μmol) der Verbindung 6'SLN-O(CH2)3NH2 in 400 μL DMSO wurde eine Lösung von 65 mg (195 μmol) Di-(4-Nitrophenyl)-adipat (3) in 300 μL DMF zugegeben. Das Gemisch wurde 16 Stunden bei 20°C gerührt. Nach Zugabe von 5ml H20 und 0,1 ml AcOH wurde der Überschuss (3) abfiltriert. Das Filtrat wurde auf ein geringes Volumen von ca. 1 ml eingeengt und mittels Gelpermeations- Chromatographie über Sephadex LH-20 aufgetrennt (MeCN /H20/AcOH 1 :1 :0,005). Ausbeute (52) - 71 %. DC: Rf0,46 (i-PrOH /Aceton /H2O 4:3:2). 1H-NMR Spektrum (D20, δ, ppm): 1 ,641 (m, 6H, 2 COCH2CH2 und OCH2CH2), 1 ,674 (dd, 1 H, H-3-ax NeuδAc), 1 ,930 und 1 ,958 (s, 2x3H, 2 COCH3, Neu5Ac und GIcNAc), 2,218 (t, 2H, NCOCH2), 2,559 (dd, 1 H, J3ax, 13Hz, J44,7 Hz, H-3eq NeuδAc), 2,646 (m, 2H, CH2COOAr), 3,090 und 3,190 (m, 2x1 H, NCH2), 3,42-3,94 (21 H, Überlagerung der Kohlenhydrat-Signale und OCH2), 4,328 (d, 1 H, J2 8 Hz, H-1 Gal), 4,419 (d, 1 H, J2 8 Hz, H-1 GIcNAc), 7,291 und 8,256 (d, 2x2H, J 8,3 Hz, Ar).
Herstellung von [6'SLN-Ap-Ad-Gly7-NHCH2]4C (53)
Zu einer Lösung von 5 mg (2,7 μmol) des Tetrahydrochlorids [HCL Gly7-NHCH2-]4C
(22a) in 500 μL H20 wurden 15 mg (16,2 μmol) der Verbindung NeuAcα2-6Galß1-
4GlcNAcß-0(CH2)3NH-CO(CH2)4COO(p-C6H4N02) (52) zugegeben.
Der pH-Wert der erhaltenen Lösung wurde durch tropfenweise Zugabe von 1 M
NaHC03-Lösung auf pH~8 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Tage bei
Raumtemperatur gerührt und mittels Gelpermeations-Chromatographie (G10, 0,05 M
NH3) aufgetrennt.
Ausbeute (53) 34%, DC: Rf~0 (i-PrOH /Aceton/H20 4:3:2).
1H-NMR Spektrum (D20, δ, ppm): Matrix: 1 ,628 (m, 4H, C0CH2CH2), 1 ,789 (m, 2H,
OCH2CH2), 2,275 und 2,373 (m, 2x2H, 2 C0CH2CH2), 2,935 (s, 2H, CCH2), 3,197 und
3,279 (m, 2x1 H, NCH2), 3,971 , 3,990, 4,026 (x3) und 4,077 (x2) (s, 14H, 7 CH2 Gly1"7). Kohlenhydrat-Signale: 1 ,730 (dd, 1 H, H-3ax NeuδAc), 2,049 und 2,078 (s, 2x3H, 2 COCH3, NeuδAc und GIcNAc), 2,693 (dd, 1 H, J3ax 12,4 Hz, J44,6 Hz, H-3eq NeuδAc), 3,64-3,96 (21 H, Überlagerung der Kohlenhydrat-Signale und OCH2), 4,468 (d, 1 H, J2 8Hz, H-1 Gal), 4,δ62 (d, 1 H, J2 8 Hz, H-1 GIcNAc).
Die Verbindung [6'SLN-Ap-Ad-AC2-Gly5-NHCH2]4C (54) wurde auf analoge Weise ausgehend vom Tetrahydrochlorid [HCI-H-AC2-Gly5-NHCH2]4C (24a) und NeuAcα2- 6Galß1 -4GlcNAcß-0(CH2)3NH-CO(CH2)4COO(p-C6H4N02) (δ2) hergestellt. Ausbeute (δ4) - 63%. DC: Rf~0 (i-PrOH/Aceton/H20 4:3:2).
1H-NMR Spektrum in D20 (δ, ppm): Matrix: 1 ,341 , 1 ,δ24 und 1 ,631 (m, 12H, 6 CH2), 1 ,δ99 (m, 4H, COCH2CH2CH2CH2CO), 1 ,78δ (m, 2H, OCH2CH2), 2,238 (t, 2H, J 7,4 Hz, CH2CO), 2,260 (m, 4H, COCH2CH2CH2CH2CO), 2,349 (t, 2H, J 7,5 Hz, CH2CO), 2,929 (s, 2H, CCH2), 3,182 (breit, t, 4H, J 6,6 Hz, 2 CH2N), 3,195 und 3,276 (m, 2x1 H, NCH2), 3,979, 4,022 (x3) und 4,073 (s, 10H, δ COCH2N). Kohlenhydrat-Signale: siehe (53).
Tabelle 9, Beispiel 13
Inhibition der viralen Zeit-Adhäsion von Influenza-Viren; Stamm A/NIB/H1 N1/89M, FBI- text [siehe Tabelle 1], 6'SLN als Referenz-Verbindung.
Figure imgf000050_0001
Verαleichsbeispiel 1
Die aus Beispiel 7 der WO 98/1421 δ bekannte Verbindung der Formel {Neu5Acα2-6Galß1-4GlcNAcß1-NHCOCH2NH-CO(CH2)4CO-(NHCH2CO)3-NHCH2-
}4C bildet keine erfindungsgemäßen Aggregate, wie mit folgenden Methoden gezeigt wurde:
1. Dünnschichtchromatographisch läßt sich unter folgenden Bectingungen nur eine einzige Verbindung, und zwar des Monomeren, beobachten. Spuren von Aggregaten fehlen völlig:
Silikagel 60 TLC Platten, Katalognr. 1.05724, Merck; Eluens: /-PrOH / Aceton / H20 4:3:2; Beobachtung: Verschwelung nach Eintauchen in 7% H3P04.
2. Das 1H NMR Spektrum (Bruker 500 MHz, D20, 300 K) der Verbindung zeigt keine Linienverbreiterung, die charakteristisch wäre für Glycopeptidaggregate. 3. Laserlichtstreuungsexperimente (Coulter Submicron Model N4MD, He-Ne Laser,
I 632,8) der Verbindung in wäßrigen Lösungen ergeben keine Hinweise auf die Bildung von Aggregaten.
4. Mit Gel-Permeations-HPLC (TSK-4000 Säule, 0.2 M NaCI) wird nur ein Peak beobachtet, der dem Molekulargewicht des Monomeren entspricht.
δ. Die Aktivität dieser Verbindung bei der Inhibierung von Influenzaviren (A/NIB/23/89M H1 N1 , A/NIB/44/90M H3N2, B/NIB/15/89M, FBI-Test) ist vergleichbar mit derjenigen von 6"SLN Trisaccharid, während typische assoziierte Glycopeptide, wie beispielsweise das Gly7 Analogon) um Zehnerpotenzen aktiver sind.
Es ist somit klar, dass die aus dem Stand der Technik bekannte Verbindung von denjenigen Verbindungen der vorliegenden Erfindung grundlegend verschieden ist. Der nachgewiese funktioneile Unterschied beruht auf dem strukturellen Unterschied des Fragments K, dass zu einer intermolekularen Assoziation nicht geeignet ist, weil die Anzahl der zur Bildung von Wasserstoffbrücken geeigneten Kettensegmente zu gering ist.

Claims

δ0 Patentansprüche
1. Verbindung der allgemeinen Formel (I)
X(B)m (I)
wobei
X für eine m-wertige Einheit steht und die B gleich oder verschieden sind und für K-R stehen, wobei
K für eine Bindung oder für A1-(A2-A3)k-sp steht, wobei A1 für (CH2)tY(CH2)u steht, wobei
Y für >C=0, >NH, -O-, -S- oder eine Bindung, t für eine ganze Zahl von 0 bis 6 und u für eine ganze Zahl von 0 bis 6 steht, A2 für -NHCO-, -CONH-, -OCONH- oder SCONH- steht, oder für
-CO- steht, A3 für (CH2)r, 0(CH2)r, NH(CH2)r, S(CH2)r, oder -(CHQ)- steht, wobei r für eine ganze Zahl von 1 bis 6 und
Q für eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl- oder Aryl- Gruppe steht, sp für einen zweiwertigen Spacer oder eine Bindung steht, und k für eine ganze Zahl von δ bis 10 steht, und R für Wasserstoff, einen zur spezifischen Bindung an einen Rezeptor geeigneten Liganden, ein Marker-Molekül oder eine katalytisch aktive Gruppe steht, und m mindestens 2 ist, mit der Maßgabe, dass
(1 ) in der Verbindung mindestens ein R nicht Wasserstoff ist,
(2) mindestens zwei K vorliegen, die nicht für eine Bindung stehen, und
(3) X, die B und m so gewählt sind, dass eine intermolekulare Assoziation der K in flüssiger Phase durch Bildung von Wasserstoffbrücken-Bindungen unter Ausbildung von Aggregaten, die auf der Oberfläche mehrere R präsentieren, die nicht Wasserstoff sind, möglich ist, und (4) die Molmasse des Fragments X(K)m weniger als 20.000 beträgt.
2. Verbindung nach Anspruch 1 , wobei die Molmasse des Fragments X(K)m weniger als 4.000 beträgt.
3. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei m für eine ganze Zahl von 2 bis 4 steht,
X für CH4.m, NH3.m) N+H4.m, >P- (wenn m = 3), >P+< (wenn m = 4), >B- (wenn m = 3), eine lineare Atomgruppe C2H6.m, >CH(CH2)ZCH<, >C=C< >N-N<, >N(CH2)ZN< wobei z = 2 - 6, wenn m = 4), eine carbocyclische Atomgruppe C6H6.m, C6H12.m, oder eine heterocyclische Atomgruppe C3N3 (wenn m = 3), C4N2 (wenn m = 4) steht.
4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei mindestens 3 K vorliegen.
5. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei mindestens zwei R nicht Wasserstoff sind.
6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei mindestens drei R nicht Wasserstoff sind.
7. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Ligand R ein Mono- oder Oligo-Saccharid, ein Peptid, ein Mono- oder Oligo-Nukleotid oder eine Nuklein-Base ist sowie deren Derivate und Mimetika.
8. Verbindung nach Anspruch 7, wobei das Saccharid R Sialinsäure, Sialyllactose, Sialyllactosamin, Lactose, Mannose, Gaiα1-3Gal, Galα1 -3(Fucα1-2)Gal, GalNAcα1-3(Fucα1-2)Gal, NeuδAcα2-6GalNAc, SiaLeA, SiaLex, HS03LeA, HS03Lex, Galα1-3Galß1-4GlcNAc, Galα1-3Galß1-4Glc, HS03GlcAß1-3Galß1- 4GlcNAc, N-Acetyl-Iactosamin oder Polylactosamin ist, oder wobei das Saccarid Sialinsäurebenzylglycosid, HS03GlcAß1-3Gal, HS03GlcAß1 -3Galß1 -4GlcNAcß1- 62
3Galß1-4Glc, GalNAcα, GalNAcα1 -3(Fucα1 -2)Galß1 -4GlcNAc, Galα1 -3(Fucα1 - 2)Galß1 -4GlcNAc, HS03(Sia)Lex, HS03(Sia)LeA, Leγ, GlcNAcß1 -6(GlcNAcß1 - 3)Galß1 -4Glc, GalNAcß1 -4(NeuδAcα2-3)Galß1 -4Glc, Mannose-6-phosphat, GalNAcß1 -4GlcNAc, Oligo-Sialinsäure, N-Glycolylneuraminsäure, Galα1-4Galß1 - 4Glc, Galα1-4Galß1-4GlcNAc ist.
9. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei m für eine ganze Zahl von 2 bis 4 steht,
X für CH4.m,
A1 für CH2,
A2 für NHCO,
A3 für CH2, k für 8, sp für (CH2)3CONHCH2CONHC6H4-4-CH20- und
R für NeuδAcα2-6Galß1 -4GlcNAc steht.
10. Aggregat der allgemeinen Formel (II):
{X(B)m}n (II)
wobei die X(B)m gleich oder verschieden sein können und für eine Verbindung der allgemeinen Formel (I), wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 11 definiert ist, stehen, und n für 2 bis 100.000 steht, und wobei die X(B)m nicht-kovalent gebunden sind.
11. Aggregat nach Anspruch 10 mit blattartiger, linearer, zyklischer, polyzyklischer, polyedrischer, kugelförmiger oder dendritischer Struktur.
12. Aggregat nach Anspruch 10 oder 11 aus zwei oder mehreren verschiedenen Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
13. Verfahren zur Herstellung eines Aggregats wie es in einem der Ansprüche 10 bis δ3
12 definiert wird, durch Selbstassoziation von Verbindungen nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9.
14. Verfahren nach Anspruch 13, umfassend bei einer Lösung der Verbindung Zugabe einer konzentrierten Salzlösung, eine Änderung des pH bzw. der Temperatur oder eine Zugabe von organischen Lösungsmitteln.
1δ. Verfahren zur Änderung der Struktur der Aggregate wie sie in einem der Ansprüche 10 bis 12 definiert werden, das umfasst eine Zugabe einer konzentrierten Salzlösung, eine Änderung der Temperatur bzw. des pH oder eine Zugabe von Harnstoff, Trifluorethanol, oder Peptiden.
16. Verfahren zur Verstärkung der spezifischen physiologischen Aktivitäten von Molekülen durch ihren Einbau als Rest R in eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert wird bzw. in ein Aggregat der allgemeinen Formel (II) wie es in einem der Ansprüche 10 bis 12 definiert wird.
17. Mittel, umfassend eine Verbindung wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert wird bzw. ein Aggregat wie es in einem der Ansprüche 10 bis 12 definiert wird, zur Anwendung in therapeutischen oder diagnostischen Verfahren.
18. Mittel nach Anspruch 17 gegen Entzündungen, virale und bakterielle Infektionen, Influenza-Viren, Selektin-vermittelte Entzündungsprozesse, Tumor-Metastasen, oder zur Neutralisation von Antikörpern bei Autoimmunerkrankungen und Transplantationen.
19. Verwendung einer Verbindung wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert wird bzw. eines Aggregats wie es in einem der Ansprüche 10 bis 12 definiert wird, zur Herstellung eines Medikaments gegen Entzündungen, virale und bakterielle Infektionen, Influenza Viren, Selektin-vermittelte Entzündungsprozesse, Tumor- Metastasen, oder zur Neutralisation von Antikörpern bei Autoimmunerkrankungen und Transplantationen. δ4
20. Verwendung einer Verbindung wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert wird bzw. eines Aggregats wie es in einem der Ansprüche 10 bis 12 definiert wird, zur Herstellung von funktionalisierten molekularen Oberflächen.
21. Verwendung einer Verbindung wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert wird bzw. eines Aggregats wie es in einem der Ansprüche 10 bis 12 definiert wird, in einem analytischen Verfahren.
22. Verwendung nach Anspruch 21 in einem diagnostischen Verfahren.
23. Verbindung der allgemeinen Formel (III),
X(B)„ (III)
wobei
X für eine m-wertige Einheit steht und die
B gleich oder verschieden sind und für K-H stehen, wobei
K für A1-(A2-A3)k-sp
steht, wobei
A1 für (CH2)tY(CH2)u steht, wobei
Y für >C=0, >NH, -O-, -S- oder eine Bindung, t für eine ganze Zahl von 0 bis 6 und u für eine ganze Zahl von 0 bis 6 steht,
A2 für -NHCO-, -CONH-, -OCONH- oder SCONH- steht, oder für
-CO- steht,
A3 für (CH2)r, 0(CH2)r, NH(CH2)r, S(CH2)r, oder -(CHQ)- steht, wobei r für eine ganze Zahl von 1 bis 6 und
Q für eine substituierte oder unsubstituierte Alkyl- oder
Aryl- Gruppe steht, sp für einen zweiwertigen Spacer oder eine Bindung steht, und δδ k für eine ganze Zahl von δ bis 100 steht, und m mindestens 2 ist, mit der Maßgabe, dass
(1) X, die B und m so gewählt sind, dass eine intermolekulare Assoziation der K in flüssiger Phase, insbesondere unter wässrigen Bedingungen, durch Bildung von Wasserstoffbrücken-Bindungen unter Ausbildung von Aggregaten möglich ist, und
(2) die Molmasse des Fragments X(K)m weniger als 20.000, insbesondere weniger als 4000, beträgt.
24. Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel (III) nach einem der Ansprüche 22 oder 23 zur Modifikation eines Aggregats, wie es in einem der Ansprüche 10 oder 11 definiert ist.
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