WO2001016151A1

WO2001016151A1 - Acide nucleique a photocouplage reversible et phosphoroamidite

Info

Publication number: WO2001016151A1
Application number: PCT/JP2000/005715
Authority: WO
Inventors: Isao Saito; Kenzo Fujimoto; Shigeo Matsuda
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1999-08-27
Filing date: 2000-08-24
Publication date: 2001-03-08
Anticipated expiration: 2002-02-27
Also published as: DE60002821D1; EP1125945A1; US6593088B1; TWI239337B; EP1125945B1; DE60002821T2; EP1125945A4

Description

明細書

可逆的光連結性核酸とフォスフォロアミダイ卜技術分野

この出願の発明は、可逆的光連結性核酸とフォスフォロアミダイ卜に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、アンチセンス D N A、アンチジーン D N A、光遺伝子診断治療、 D N A 一蛋白質相互作用の解析等への応用に有用で、生体関連分子の連結構造の形成や特異的な解裂を光により制御できる新しい可逆的光連結性核酸とその合成において有用なフォスフォロアミダイト、さらにはこれらを用いた光連結と光解裂の方法に関するものである。背景技術

従来より、生体機能の解明や生理活性機序、そして生理活性物質の創製にとって、 D N A、 R N A、 P N A、蛋白質等の相互の連結や局所的解裂を制御することが重要であると認識されている。

たとえば、 D N A — D N A、 D N A— R N A、 D N A— P N A、 D N A—蛋白質等の連結構造の形成と、それらの解裂を制御することは、アンチセンス D N A、アンチジーン D N A、遺伝子診断治療、 D N A—蛋白質等の相互作用の解明や、これに基づく生体分子構造のコントロールにとって極めて重要である。

このため、従来より、これらの連結や解裂のための手段についての検討が進められており、光を照射することによる方法も検討されてきている。

しかしながら、これまで報告されている例においては、連結収率は 4 0 %前後と低く、また副反応も多いという問題がある。さらにまた、連結部分だけを特異的に光解裂させた例は知られていない。そこで、この出願の発明は、以上のとおりの従来の技術の問題点を解消し、選択的に高い連結収率を与え、連結部の特異的な光解裂をも可能として、光連結と光解裂とを自由自在に可逆的に制御することのできる新しい技術的手段を提供することを課題としている。発明の開示

この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第 1 には次式（ 1 )

で表わされる可逆的光連結制御核酸を提供する

また、第 2には、次式（ 2 )

で表わされるフォスフォロアミダイ卜を提供する。

さらにこの出願の発明は、第 3には、前記の可逆的光連結性核酸と生体関連高分子との系に光照射して両者の連結構造を形成することを特徴とする光連結方法を、第 4には、可逆的光連結性核酸と生体関連高分子との連結構造を短波長の光照射により解裂することを特徴とする光解裂方法を提供する。

この出願の発明の上記のとおりの可逆的光連結性核酸、すなわち光連結性ヌクレオシド含有 D N Aの光照射により、 1 ) D N A— D N A、 D N A— R N A、 D N A— P N A、 D N A—蛋白質等の連結と解裂反応が可能になり、 a ) アンチセンス D N A、 b ) アンチジーン D N A、 c ) 光遺伝子診断治療、 d ) D N A—蛋白相互作用解析等への利用が拓かれる。

そして、この出願の発明によれば、 9 5 %以上という極めて高い連結収率が得られ、しかも光によって、連結部分の特異的解裂も可能となる。図面の簡単な説明

図 1 は、可逆的な光連結と光解裂の反応の例を示した吸収スぺクトル図である。発明を実施するための最良の形態

この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。

この発明の前記式（ 1 ) の可逆的光連結性核酸、すなわち光連結性ヌクレオシド含有 D N Aは、ピリミジン環の 5位にビニル基を持つ特徴のある構造を有している。この構造におけるビニル基の存在力相手となる生体関連高分子、たとえば、 D N A、 R N A、 P N A、蛋白質等との連結と解裂を光制御できるようにしている。また、この可逆的光連結性核酸は、ビニルシトシンを含む機能性核酸と呼ぶこともできる。そして、この可逆的光連結性核酸は、ビリミジン環ゃヌクレオシド部分に許容される他の置換基を有していてもよく、またアミノ基（ N H ₂ )、ヒドロキシ基（〇 H ) は、許容される保護基によリ保護されていてもよい。この出願の発明はこれらの誘導体も包含している。

式（ 1 ) で表わされるこの発明の光連結性の核酸は、たとえば次式のステップ 1 およびステップ 2の経路によって、前記式（ 2 ) で表わされるフォスフォロアミダイトを経由することによって簡便に合成することができる。

ステップ 1 においては、たとえば 5 —ビニルデォキシゥリジン D M T r 体にアミダイト化剤を反応させてビニルシトシンアミダイト前駆体を合成し、次いで、 1 ， 2 , 4一トリァゾールと反応させることにより実施される。この場合のアミダイト化剤としては次のものが示される。

〇

〇 N P I—

2-Cynanoeth l Ν,Ν,ΝΉ'- 2-し ynanoethyl Ν,Ν- tetraisopropylphosphorodiamidite dusopropvlchlorophosphoroamidite またステップ 2では、 D N A合成機において固相合成法で D N A オリゴマーを合成すること等により実施される。

光による連結は、相手となる生体関連高分子、つまり D N A、 R N A、 P N A、あるいは蛋白質の共存下に光照射することで可能とされる。一方、光解裂については、より短波長の光を照射することで連結部での特異的な解裂として実施される。具体的には、たとえば 3 3 0 n mよりも長波長の光励起により光連結を生じさせ、 3 2 0 n mより単波長の光励起により解裂を生じさせることができる。光の照射の方法としては各種の手段から選択され、たとえばトランスイルミネーターを用いることができる。

そこで以下に実施例を示し、さらに詳しくこの出願の発明について説明する。実施例

<実施例 1 > (合成）

前記反応式のステップ 1 およびステップ 2に従ってこの発明の可逆的光連結性核酸としてのビニルシトシンを含む機能性核酸を合成した。

( a ) ステップ 1

5 —ビニルデォキシゥリジン D M T r 体（ 1 6 6 m g， 0. 2 9 8 m m o I ) の C H ₃ C N溶液に、アミダイ卜化剤（ 9 8. ◦ L 、 0. 3 0 9 m m o l ) と 0. 5 M亍トラゾ一ルの入った C H ₃C N 2. 0 m Lを加え、反応混合物を 1 . 0 h攪拌した後、抽出操作を行い、有機層を乾燥し、 C H ₃C Nで共沸し、ビニルシトシンァミダイト前駆体を 2 2 8 m g定量的に得た。次いで、 3塩化リン（ 0. 3 2 g , 2. 1 0 m m o l )、 1 , 2， 4 一トリァゾ一ル（ 0 • 6 6 7 g , 9. 6 フ 6 m m o I ) の C H ₃ C N混合溶液にビニルシトシンアミダイト前駆体を 0 °Cで 3回に分けて加え、 3時間撹拌した。その後、抽出操作を行い、有機層を乾燥し、 C H ₃C Nで共沸し、ビニルシトシンアミダイトを 9 5. 7 m g ( 0. 1 1 8 mm o I ) フ 5 %の収率で得た。

表 1

Ή NMR (400 MHz, CDC1₃) δ 2.21 (ddd. J = 12.1 Hz, J = 7.4 Hz, J = 6.3 Hz, IH, Η-2'β),2.35 (ddd, J = 12.1 Hz, J = 6.1 Hz, J = 3.1 Hz, IH, Η-2'α), 2.95 (dd, J = 10.6 Hz, J = 3.4 Hz, 1H， H-5'), 3.38 (dd. J = 10.6Hz, J = 3.4 Hz, IH. H-5'), 3.71 (s, 6H, 0CH₃ x 2), 3.90-3.99 (m, IH, H-4')_: 4.45-4.48 (m， 3H, H-3'), 4.86 (dd, J = 10.2Hz, 2.0 Hz, IH, vmyl trans), 5.60-5.73 (m, IH, vinyl cis, H-1'), 6.29 (dd, J = 7.4 Hz, J = 6.1Hz, IH, H-1'), 6.73-6.77 (m, 4H, Η-β to 0CH₃ x 4), 7.17-7.23 (m, 9H, phenyl), 7.29-7.32 (m, IH, CH=CH₂), 7.58 (s, IH, H-6), 8.23 (bs, IH, NH). 3¹P NMR (CDCI3, 85% - H₃P0, in D₂0 ext. 0 ppm) δ 149.811 & 150.386 (diastereomer of the products).

( b ) ステップ 2

ステップ 1 で得られたビニルシトシンアミダイ卜の C H ₃ C N溶液（ 0. 1 M 3 m L ) を全自動 D N A合成機にとりつけ、通常の固相合成法により D N Aオリゴマーを合成し、切り出し、脱保護後、高速液体クロマトにより精製した。

E S I — T〇 F法による分子量測定で化合物の同定を行った。ぐ実施例 2 > (可逆的光連結と光解裂）

錶型となるオリゴマー（ 5 ， - C A C G C G A G C A C A - 3 ' 、 2 5 m M ) の存在下、連結するオリゴマー（ 5 ' — T G T G C T 一 3 '、 2 0 m M ) 及びビニルシトシンを含むオリゴマー（ 5 ' - V C G C G T G— 3 '、 2 0 m M ) を混合し、 5 0 0 m Mのカコジル酸緩衝液（ 5 0 m M、 p H 7. 0 ) 中で 3 6 6 n mの波長でトランスイルミネーターを用いて光照射を行った。 9 0 %以上の収率でオリゴマーを連結することに成功した（図 1 ； a )， b ))。

次にこの溶液に対し 3 0 2 n mの波長でトランスイルミネ一タ一を用いて光照射を行ったところほぼ定量的にオリゴマーを解裂させることに成功した（図 "！； b )， c ))。

なお、 5 ' — V C G C G T G— 3 ' の分子量測定を E S I — T〇 F Fによって測定した。結果は以下の表 2のとおりであった。

表 2

E S I -T O F Fmass calcd. for C₆₀ H ₇₅ N ₂₃0₃₅ P ₅ (M-H), 1832.36; found, 1832.34 産業上の利用可能性

以上詳し〈説明したとおり、この出願の発明によって、選択的に高い連結収率を与え、連結部の特異的な光解裂をも可能として、光連結と光解裂とを自由自在に可逆的に制御することのできる新しい技術的手段が提供される。

Claims

請求の範囲次式（ 1 )

で表わされる可逆的光連結性核酸,

2 . 次式（ 2 )

で表わされるフォスフォロアミダイト。

3 . 請求項 1 の可逆的光連.結性核酸と生体関連高分子との系に光照射して両者の連結構造を形成することを特徴とする光連結方法。

4 . 請求項 1 の可逆的光連結性核酸と生体関連高分子との連結構造を短波長の光照射により解裂することを特徴とする光解裂方法。