WO2001017538A1 - Utilisation d'hydrolysats enzymatiques de chair d'huitres pour la preparation de compositions antiradicalaires - Google Patents

Utilisation d'hydrolysats enzymatiques de chair d'huitres pour la preparation de compositions antiradicalaires Download PDF

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Patrick Durand
Annie Landrein
Philippe Roy
Albert Lindenbaum
Marvin Edeas
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Institut Francais de Recherche pour lExploitation de la Mer (IFREMER)
Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
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Institut Francais de Recherche pour lExploitation de la Mer (IFREMER)
Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
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Definitions

  • the present invention relates to the use of enzymatic hydrolysates of oyster flesh for the preparation of anti-free radical compositions, useful in particular in therapeutics, dietetics and cosmetology.
  • Oxygenated free radicals are atoms or molecules which have an unpaired electron at their external orbital (OH “ , O 2 " , ROO “ , RO “ , ). As a result, they are extremely unstable and can react with stable molecules such as lipids, carbohydrates, proteins or nucleic acids, fundamental elements of cells, to pair their electron, a reaction which leads to the chain formation of new free radicals. Also, they are likely to cause serious cellular damage such as a mutation or cell aging, or even cell death. At the cellular level, oxygenated free radicals are constantly formed. They can also form during detoxification mechanisms after exposure to certain substances or under the effect of radiation.
  • oxygenated free radicals are counterbalanced by the presence of defense systems represented, on the one hand, by enzymes (superoxide dismutases, catalases, glutathione peroxidases) which intercept the active forms of oxygen, and, d on the other hand, by "free radical scavengers” (glutathione, uric acid, vitamin C, vitamin A, vitamin E, taurine, ...) which block the peroxidation in the chain of membrane lipids, so that organisms do not don't have to suffer from it.
  • enzymes superoxide dismutases, catalases, glutathione peroxidases
  • free radical scavengers glycol, uric acid, vitamin C, vitamin A, vitamin E, taurine
  • oxygenated free radicals can also be linked to a genetic disease or to a reduction in defenses: immaturity of the enzymatic systems in newborns, aging, nutritional deficits in vitamins and trace elements (selenium, zinc, ... ).
  • marine molluscs were likely to constitute a source of anti-free radical compounds usable in the prevention and the treatment of the harmful effects of the oxygenated free radicals.
  • a certain number of Authors are more particularly interested in the potential anti-free radicals of oyster extracts.
  • - TAPIERO and TEW (Biomed. & Pharmacother., 1996, 5 ⁇ , 149-153) studied the effects of an oyster lyophilisate called JCOE (JAPAN CLLNIC Oyster Extract) on the intracellular content of glutathione-stimulating hormone (GSH) , as well as the activity of glutathione-S-transferase (GST), from a culture of HL60 cells.
  • This lyophilisate is obtained by heating the oyster meat at 80 ° C for 1 hour, then subjecting the resulting product to centrifugation and lyophilizing the supernatant thus collected.
  • TAPIERO and TEW have thus demonstrated a significant increase in the synthesis of GSH in HL60 cells cultured in the presence of the lyophilisate, without however noting any significant modification in the activity of GST.
  • oyster hydrolysates obtained by subjecting the oyster flesh to the action of a protease under appropriate conditions surprisingly exhibit even more anti-radical activity high than that observed for the aqueous oyster extracts tested by DUSSART in the aforementioned study, and are therefore likely to be advantageously used for the manufacture of compositions intended to prevent or treat the deleterious effects of oxygenated free radicals.
  • the present invention therefore relates to the use of an enzymatic hydrolyzate of oysters for the preparation of an anti-free radical composition, this use being characterized in that said hydrolyzate is capable of being obtained by hydrolysis of oyster flesh in by means of a protease.
  • the hydrolysis of the oyster flesh is carried out by a protease chosen from subtilisin, pepsin and trypsin.
  • a protease chosen from subtilisin, pepsin and trypsin.
  • the pH and temperature conditions under which the hydrolysis of oyster flesh is carried out depend on the protease chosen to carry out this hydrolysis .
  • these pH and temperature conditions are such that they allow optimal activity of the protease to be obtained.
  • the hydrolysis is preferably carried out at a pH of approximately 8 and a temperature of approximately 60 ° C. in the case of subtilisin, at a pH of approximately 2 and a temperature about 40 ° C in the case of pepsin, and at a pH of about 8 and a temperature of about 37 ° C in the case of trypsin.
  • the hydrolysis of the oyster flesh is carried out for a time sufficient for the hydrolyzate to have a degree of protein hydrolysis at least equal to 30% and, preferably, to 50 %, this degree of protein hydrolysis being determined by the following formula (ADLER-NISSEN, 1977, Proc. Biochem., 12, 18-23):
  • - h represents the number of peptide bonds hydrolyzed during the hydrolysis, and is determined by the difference between the number of free amino (or carboxylic) ends present in the hydrolyzate at the end of the hydrolysis (h t ) and the number of free amino (or carboxylic) ends present in the ground material at the start of the hydrolysis (h o ).
  • the beginning of the hydrolysis corresponds to the moment when the protease is brought into contact with the oyster flesh, while its term corresponds to the moment when the hydrolysis is stopped by inactivation of said protease, by example by thermal denaturation or by modification of the pH.
  • the total number of peptide bonds (h total) present in the oyster flesh can be obtained by the difference between the quantity of total amino acids (free + bound) and the quantity of free amino acids contained in this flesh. These amounts of total amino acids and free can be determined, for example using a kit such as that marketed under the brand WATERS AccQ- Tag Chemistry Package ® by WATERS Company.
  • the number of hydrolyzed peptide bonds (h) during the hydrolysis is itself obtained by the difference between the quantity of free amino ends (h t ) present in the hydrolyzate at the end of the hydrolysis and the amount of free amino ends (h 0 ) present in the oyster flesh at the start of the hydrolysis, which can be determined, for example, by reaction with fluorodinitrobenzene according to the protocol described in Biochem. J., 45, 563, 1949.
  • the time which should be allowed to hydrolysis take place in order to obtain a hydrolyzate having a degree of protein hydrolysis at least equal to 30% and, preferably, at 50% depends on the protease chosen to carry out this hydrolysis, and, for the same protease, the pH conditions, the temperature under which the hydrolysis is carried out, as well as the dose at which this protease is used, the hydrolysis taking place, all the more quickly the higher the dose of protease.
  • the hydrolyzate can be obtained by a process comprising, prior to hydrolysis, an operation of draining the oyster flesh.
  • this operation can be carried out by simply letting the oysters, once extracted from their shells, stand in a drainer, preferably at a temperature between 4 and 8 ° C. to prevent any deterioration of the flesh, and this, until no more liquid flows from said drip tray.
  • the hydrolyzate can be obtained by a process comprising, prior to hydrolysis, an operation of grinding the oyster flesh followed optionally by an operation of dilution in the water from the resulting ground material.
  • the grinding operation is carried out after an operation of draining the oyster flesh.
  • the hydrolysis is stopped by thermal denaturation of the protease.
  • the hydrolyzate can be obtained by a process which further comprises an operation for collecting the liquid phase of the hydrolyzate as it occurs at the end of hydrolysis.
  • This collection which is intended to eliminate various debris (debris from shells, membrane debris, ...) likely to be present in this hydrolyzate, can be carried out by all the techniques conventionally used to separate a liquid phase from a solid phase such as centrifugation, ultracentrifugation, filtration, microfiltration, these techniques can be advantageously combined with one another.
  • the hydrolyzate can be obtained by a process which comprises the following steps: a) grinding oyster meat previously drained, b) diluting the ground product in water, in a ground / water ratio of between 30/70 and 70/30 (mv), and preferably between 40/60 and 60/40 (m / v), c) hydrolysis of the ground material thus diluted with subtilisin at a pH of about 8 and at a temperature of about 60 ° C, for a time sufficient for the hydrolyzate to have a degree of protein hydrolysis at least equal to 50%, d) stopping hydrolysis by inactivation of subtilisin, and e) collecting the liquid phase of the hydrolyzate.
  • the hydrolyzate can be obtained by a process which comprises the following steps: a) grinding oyster meat previously drained, b) diluting the ground product in l water, in a ground / water ratio of between 30/70 and 70/30 (m / v), and preferably between 40/60 and 60/40 (m / v), c) hydrolysis of the ground material thus diluted with pepsin, at a pH of approximately 2 and at a temperature of approximately 40 ° C, for a time sufficient for the hydrolyzate to have a degree of protein hydrolysis at least equal to 50%, d) stopping hydrolysis by inactivation of pepsin, and e) collecting the liquid phase of the hydrolyzate.
  • the hydrolyzate can be obtained by a process which comprises the following steps: a) grinding oyster meat previously drained, b) diluting the ground material in water, in a ground / water ratio of between 30/70 and 70/30 (m / v), and preferably between 40/60 and 60/40 (m / v ), c) hydrolysis of the ground material thus diluted with trypsin, at a pH of about 8 and at a temperature of about 37 ° C, for a time sufficient for the hydrolyzate to have a degree of protein hydrolysis at least equal to 50%, d) stopping the hydrolysis by inactivation of the trypsin, and e) collecting the liquid phase of the hydrolyzate.
  • Such enzymatic hydrolysates of oysters have anti-free radical properties which, in addition to being pronounced, are extremely interesting since they prove to be capable, not only of neutralizing the effects of the oxygenated free radicals produced during peroxidation reactions, but also to prevent the formation of these free radicals by what appears to be a mechanism for chelating metals such as for example copper, which are involved in the genesis of said free radicals.
  • they have the advantage of being able to be obtained by a process which is simple to implement and economically compatible with industrial requirements, in particular because it does not require the use of any organic solvent.
  • compositions intended to treat pathologies appearing linked to an imbalance between the production and the destruction of oxygenated free radicals as previously mentioned
  • - food supplements suitable for use either as adjuvants to medical treatment, or as a preventive measure, in particular by people in whom it is desirable to strengthen the natural defense mechanisms against oxygenated free radicals, because these defenses are physiologically diminished (elderly people, people suffering from nutritional deficiencies of vitamins and trace elements, ...) or because these people are led to find themselves in situations favoring the excessive formation of radicals free of oxygen (intense exposure to the sun, exposure to chemicals, etc.), or
  • compositions intended to prevent or treat skin aging, the origin of which is largely linked to the free radicals generated in the skin by ultraviolet radiation.
  • vitamins A, C or E for example, they can be used either as such, that is to say in aqueous form or optionally in the form of dry powders obtained for example by lyophilization, or in admixture with physiologically acceptable excipients and / or other active substances and, in particular, substances also having intrinsic anti-free radical properties, and capable of acting synergistically (vitamins A, C or E, for example), within more complex formulations.
  • the invention also comprises other provisions which will emerge from the additional description which follows, which relates to examples illustrating the hydrolytic activity of enzymes on ground oyster meat, the preparation of 'enzymatic hydrolysates of oyster flesh as well as the biological properties of these hydrolysates, and which refers to the appended drawings in which:
  • FIG. 1 shows the kinetics of two hydrolyses conducted on ground oyster meat with two different doses of subtilisin
  • FIG. 2 shows the kinetics of a hydrolysis conducted on a crushed oyster flesh with pepsin.
  • the reactor temperature is maintained at 60 ° C throughout the duration of the hydrolysis, that is to say for 4 hours. Stirring is also maintained and the pH is regulated using a pH-stat so as to be constantly at a value of 8.
  • subtilisin After 4 hours of hydrolysis, the activity of subtilisin is stopped by thermal denaturation of the latter, by placing the reaction mixture in a water bath at 90 ° C for 25 minutes.
  • Figure 1 represents the kinetics of the hydrolysis carried out with the dose of subtilisin of 14 AU / kg (m) and that carried out with the dose of subtilisin of 38 AU / kg (• *), the values of the concentrations in free amino ends being expressed on the ordinate and in mM, the time being expressed on the abscissa and in minutes.
  • This figure shows that hydrolysis is faster when the dose of subtilisin is increased.
  • the plateau is reached after 90 minutes of hydrolysis for the dose of 14 AU / kg, and this period is reduced to 60 minutes for the dose of 38 AU / kg.
  • the concentration of free amino ends for which the plateau is reached is similar for the two doses of enzyme. The same is true of the final concentration of free amino ends (about 120 mM).
  • Table I below presents the values of the degrees of protein hydrolysis (DH), expressed in percentages, obtained for each of the doses of subtilisin.
  • the hydrolytic activity of pepsin on ground oyster meat is assessed using an operating protocol identical to that used in Example 1, except that the hydrolysis is carried out with a dose of 1% by mass of pepsin related to the total mass of the ground mixture / deionized water present in the reactor, at a temperature of 40 ° C. and at a pH equal to 2.
  • FIG. 2 represents the kinetics of the hydrolysis thus obtained, the values of the concentrations of free amino functions being expressed on the ordinate and in mM, the time being expressed on the abscissa and in minutes.
  • This figure shows that hydrolysis takes place much faster than when it is carried out with subtilisin, even at a dose of 38 AU / kg, since the plateau is reached 30 minutes after the introduction of pepsin into the reactor.
  • the final concentration of free amino functions in the hydrolyzate which is around 120 mM, is quite comparable to that obtained when the hydrolysis is carried out with subtilisin.
  • hydrolyzate A and hydrolyzate B respectively - by subjecting two crushed flesh oysters previously drained by hydrolysis with subtilisin.
  • the ground oyster meat is prepared and the hydrolyses are carried out under the same conditions as those described in Example 1, using a dose of subtilisin of 38 AU per kg of ground mixture / deionized water.
  • hydrolysis is stopped 4 hours after the introduction of the enzyme into the reactor, so that it has a maximum degree of protein hydrolysis, ie close to 60%.
  • hydrolysis is stopped 30 minutes after introduction of the enzyme into the reactor, so that it has a degree of protein hydrolysis substantially equal to half the maximum degree of protein hydrolysis, i.e. about 30%.
  • the dry matter content is determined by placing samples of hydrolyzate A at a temperature of 100 ° C until a constant weight is obtained (6 hours minimum), and calculating the percentage represented by this weight by compared to the initial weight of these samples.
  • the mineral content is determined by incinerating samples of hydrolyzate A at a temperature of 600 ° C for 12 hours, and calculating the percentage represented by the weight of the residue relative to the weight of the dry matter.
  • Soluble proteins are measured using the kit sold by the company PIERCE under the trade name BCA ® Protein Assay Reagent. Bovine albumin is used as a standard. Total sugars and glycogen are measured according to the method described by M. DUBOIS et al. (Anal. Chem., 1956, 28, 350-356). For these assays, the samples are delipidated beforehand according to the method of EG BLIGHT and WJ DYER (Can. J. Biochem. Physiol, 1959, 37, 911-917). The content and composition of total amino acids and free amino acids are, in turn, determined using a WATERS AccQ-Tag Chemistry Package ® kit.
  • the hydrolyzate A samples are subjected beforehand to acid hydrolysis, by the action of 6N HCl for 12 hours, at 110 ° C. and under vacuum, while, for the determination of amino acids free, the hydrolyzate A samples are added beforehand with sulfosalicilic acid and centrifuged so as to cause precipitation of the proteins present in these samples.
  • Table II below presents the contents of dry matter, mineral matter, soluble proteins, total sugars, glycogen, total amino acids and free amino acids presented respectively by hydrolyzate A, oyster meal and the aqueous extract of oysters.
  • the dry matter contents are expressed in percentages relative to the lyophilized weight (% w / w) of the samples, except in the case of the ground material where the dry matter is expressed in percentage relative to the fresh weight (% w / w *) of the samples. samples.
  • the contents of mineral matter, soluble proteins, total sugars, glycogen, total amino acids and free amino acids are expressed as percentages relative to the dry weight (% w / w) of the samples.
  • Table III presents the total and free amino acid compositions of hydrolyzate A, ground oysters and aqueous oyster extract. The contents of each amino acid are expressed as percentages relative to the total weight (% w / w) of the amino acids present in the samples. TABLE III
  • Table II shows that hydrolyzate A has a higher total sugar content than that found in the ground material and in the aqueous extract. This increase is due to the destructuring of the tissues caused by the enzymatic hydrolysis, thus allowing greater solubilization of the sugars.
  • the decrease in the soluble protein content observed between the ground material and the hydrolyzate is a consequence of the hydrolysis of native proteins. This hydrolysis generates a significant amount of peptides and free amino acids which react little with the reagent used for the determination of soluble proteins (BCA ® ).
  • the mineral content does not vary between the three preparations.
  • hydrolyzate A is significantly higher than the free amino acid content of the aqueous oyster extract, the latter being very close to that found for ground oyster meat.
  • the increase in the amount of free amino acids present in hydrolyzate A is directly linked to the breakdown of peptide bonds caused by the hydrolysis reaction.
  • the biological activity of the hydrolysates A and B prepared according to Example 3 is assessed by a series of experiments aimed at testing: - on the one hand, the ability of these hydrolysates to inhibit the hemolysis induced by the introduction of 'a generator of peroxide radicals, namely 2,2'-azo- bis- (2-amidinopropane) dichlorhydric (AAPH), in a suspension of red blood cells, and
  • AAPH 2,2'-azo- bis- (2-amidinopropane) dichlorhydric
  • the globular suspension obtained is brought into contact for 10 minutes with the solutions (NaCl 9% o or PBS) of hydrolysates A or B, the volume of which is calculated so that the final solution corresponds to 25, 50 and 100 mg / 1.
  • a sample without hydrolyzate constitutes the control.
  • 300 ⁇ l of an AAPH solution having previously been incubated at 37 ° C. are then introduced into the red blood cell suspensions and the whole is placed under gentle agitation in a water bath for 40 minutes.
  • a sample of the red cell suspension (without AAPH or product) is placed in parallel for 1 hour at -80 ° C.
  • Red blood cell lysis is assessed by measuring the activity of lactate dehydrogenase (LDH) using a HITACHI ® 911 automated system. Each measurement is performed in duplicate.
  • LDH lactate dehydrogenase
  • the LDH activity determined on the samples placed at -80 ° C. corresponds to the total hemolysis of the red cells.
  • the LDH activity determined on the samples not containing hydrolyzate corresponds to the sensitivity of red cells to "radical stress" under the experimental conditions. This measurement also makes it possible to verify that the experimental conditions (hemolysis ⁇ 100%) are suitable for the study.
  • Table IV presents the average of the inhibition percentages (la) obtained for solutions of 25, 50 and 100 mg / 1 of hydrolyzate A and hydrolyzate B. TABLE IV
  • LDL are prepared from 100 ml of plasma (blood taken from EDTA). First, the VLDL are eliminated by ultracentrifugation,
  • the LDL (0.2 mg of proteins / ml of solution), previously dialyzed against PBS buffer, are incubated for 24 hours at 37 ° C. in the presence of copper (oxidant) and in the presence or not of the products studied.
  • the LDL solution is dialyzed for 24 hours at + 4 ° C. and filtered through a 0.2 ⁇ m "millipore" membrane.
  • the inhibitory effect of hydrolysates on the oxidation of LDL by copper is quantified by the determination of 2 lipoperoxidation markers:
  • MDA forms with thiobarbituric acid, hot and in an acid medium, a fluorescent chromogenic complex. After extraction with normal butanol, the intensity of the fluorescence is measured using a spectrofluorimeter. MDA concentrations are determined using a range of MDA ranging from 0.2 to 1 nmol.
  • Hydroperoxides release iodine from a stabilized solution of potassium iodide.
  • the released iodine is measured by determining the optical density (OD) at 365nm.
  • Tables V and VI below show the inhibition percentages (Ib) and (le) respectively as obtained for solutions of 25, 50, 100 and 250 mg / 1 of hydrolyzate A and hydrolyzate B.

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Abstract

L'invention se rapporte à l'utilisation d'un hydrolysat enzymatique d'huîtres pour la préparation d'une composition antiradicalaire, cette utilisation étant caractérisée en ce que ledit hydrolysat est susceptible d'être obtenu par hydrolyse de chair d'huîtres au moyen d'une protéase. Applications: thérapeutique, diététique, cosmétologie.

Description

UTILISATION D'HYDROLYSATS ENZYMATIQUES DE CHAIR D'HUITRES POUR LA PREPARATION DE COMPOSITIONS ANTIRADICALAIRES
La présente Invention se rapporte à l'utilisation d'hydrolysats enzymatiques de chair d'huîtres pour la préparation de compositions antiradicalaires, utiles notamment en thérapeutique, en diététique et en cosmétologie.
Les radicaux libres oxygénés sont des atomes ou des molécules qui possèdent un électron non apparié au niveau de leur orbitale externe (OH", O2 ", ROO", RO",...). De ce fait, ils sont extrêmement instables et peuvent réagir avec des molécules stables telles que des lipides, des glucides, des protéines ou des acides nucléiques, éléments fondamentaux des cellules, pour apparier leur électron, réaction qui conduit à la formation en chaîne de nouveaux radicaux libres. Aussi, sont-ils susceptibles de provoquer de graves altérations cellulaires telles qu'une mutation ou un vieillissement cellulaire, voire la mort des cellules. Au niveau cellulaire, des radicaux libres oxygénés se forment en permanence. Ils peuvent également se former au cours des mécanismes de détoxication après exposition à certaines substances ou sous l'effet de radiations. Normalement, la production endogène de radicaux libres oxygénés est contrebalancée par la présence de systèmes de défense représentés, d'une part, par des enzymes (superoxyde dismutases, catalases, glutathion peroxydases) qui interceptent les formes actives de l'oxygène, et, d'autre part, par des "piégeurs de radicaux libres" (glutathion, acide urique, vitamine C, vitamine A, vitamine E, taurine, ...) qui bloquent les peroxydations en chaîne des lipides membranaires, en sorte que les organismes n'ont pas à en souffrir. Cependant, de nombreuses situations peuvent entraîner la formation excessive de radicaux libres oxygénés : l'exposition intense au soleil, l'intoxication par certains produits chimiques et certains médicaments, l'hyperoxygénation ou la réoxygénation brutale de tissus préalablement privés d'oxygène, la survenue d'une réaction inflammatoire intense (brûlures, infections, ...) ou chronique. Un excès de radicaux libres oxygénés peut également être lié à une maladie génétique ou à une diminution des défenses : immaturité des systèmes enzymatiques chez les nouveau-nés, vieillissement, déficits alimentaires en vitamines et en oligo-éléments (sélénium, zinc, ...). Quoi qu'il en soit, on impute à un déséquilibre entre la production et la destruction des radicaux libres oxygénés une responsabilité dans la genèse et l'entretien d'un certain nombre de pathologies chroniques telles que l'athérosclérose, les affections malignes, les pathologies inflammatoires (maladie de Crohn par exemple) et neurodégénératives (maladie d'Alzheimer, maladie de Parkinson, ...) ou encore le vieillissement, ainsi que de pathologies aiguës comme les lésions de reperfusion post-ischémique, les brûlures, les chocs septiques, les infections virales, les états infectieux graves et les allergies, sans qu'il soit toujours possible de préciser si ces radicaux libres sont la cause ou la conséquence, ou les deux simultanément, de la maladie. On comprend, de ce fait, que de très nombreux travaux visent actuellement à mieux appréhender l'implication des radicaux libres oxygénés en physiopathologie et à développer des composés ou compositions propres à s'opposer aux effets délétères de ces radicaux libres.
Des Auteurs (LIVLNGSTONE et al, 1990, Funct. Ecol., 4, 415- 424 ; REGOLI et PRINCIPATO, 1995, Aquat. Tox., 31, 143-164) ont mis en évidence chez les mollusques marins, non seulement la présence de superoxydes dismutases, de catalases et de glutathion peroxydases, mais également celle d'enzymes anti-oxydantes spécifiques comme la glyoxalase qui catalyse la détoxification des cétoaldéhydes formés au cours du stress oxydatif, et les glutathion transférases qui catalysent une grande variété de réactions de conjugaison du glutathion avec des composés xénobiotiques, signant une aptitude de ces organismes à se protéger contre les radicaux libres oxygénés. Par ailleurs, des anti-oxydants comme le glutathion, la vitamine A, la vitamine E et la taurine, ont été détectés chez les mollusques marins, et se sont montrés dans certains cas être quantitativement proportionnels au stress oxydatif subi par ces animaux.
Aussi, est-il apparu que les mollusques marins étaient susceptibles de constituer une source de composés antiradicalaires utilisables dans la prévention et le traitement des effets néfastes des radicaux libres oxygénés.
Un certain nombre d'Auteurs se sont plus spécialement intéressés aux potentiels antiradicalaires d'extraits d'huîtres. Notamment : - TAPIERO et TEW (Biomed. & Pharmacother., 1996, 5β, 149- 153) ont étudié les effets d'un lyophilisât d'huîtres dénommé JCOE (JAPAN CLLNIC Oyster Extract) sur la teneur intracellulaire en hormone stimulant le glutathion (GSH), ainsi que sur l'activité de la glutathion-S-transférase (GST), d'une culture de cellules HL60. Ce lyophilisât est obtenu en chauffant à 80°C pendant 1 heure de la chair d'huîtres, puis en soumettant le produit résultant à une centrifugation et en lyophilisant le surnageant ainsi recueilli. TAPIERO et TEW ont ainsi mis en évidence une augmentation significative de la synthèse de la GSH chez les cellules HL60 cultivées en présence du lyophilisât, sans toutefois noter de modification significative de l'activité de la GST.
- YOSHIKAWA et al. (Biomed. & Pharmacother., 1997, 51, 328- 332) ont montré qu'un lyophilisât d'huîtres JCOE est capable in vitro de piéger les radicaux superoxydes et hydroxyles, et de protéger des cellules de la muqueuse gastrique de rats contre les effets délétères du peroxyde d'hydrogène, lorsque ces cellules sont prétraitées pendant 24 heures par ce lyophilisât.
- K1MURA et al. (Journal of Ethnopharmacology, 1998, 5£>, 117- 123) ont montré que des rats nourris avec de l'huile de maïs peroxydée et recevant, deux fois par jour et par voie orale, un extrait aqueux d'huîtres, présentent des taux sériques en acides gras libres, triglycérides et peroxydes lipidiques, et un taux hépatique en cholestérol total moins élevés que ceux observés chez des rats nourris de la même façon mais ne recevant pas d'extrait aqueux d'huîtres. Par ailleurs, ces Auteurs ont mis en évidence la présence, dans cet extrait aqueux, d'une substance capable à la fois d'inhiber la lipolyse induite par l'adrénaline et de stimuler la lipogenèse à partir du glucose dans des cellules adipeuses de rats, et qu'ils ont identifiée comme étant de l'adénosine.
- NOMURA et al. ont proposé, dans la Demande de Brevet Européen publiée sous le n° 0 806 465 au nom de JAPAN CLLNIC Co. Ltd, de préparer une composition anti-oxydante par un procédé consistant à fractionner par de l'éthanol un extrait aqueux d'huîtres préalablement obtenu en chauffant un mélange de chair d'huîtres et d'eau à une température comprise entre 50 et 90°C pendant 2 à 3 heures. Les propriétés anti-oxydantes de la composition ainsi préparée sont mises en évidence, dans cette Demande de Brevet, par le biais de tests visant à apprécier son aptitude à inhiber in vitro la réaction entre des anions superoxydes produits par un système enzymatique xanthine-xanthine oxydase et le 5,5-diméthyl-l-pyrrolen-l- oxyde.
- DUSSART (Rapport IFREMER : Stage de Vfème Année, 1997, Faculté de Pharmacie, UNIVERSITE DE LILLE II) a réalisé une étude visant à comparer les propriétés antiradicalaires d'extraits aqueux d'huîtres préparés en mélangeant un broyât de chair d'huîtres avec de l'eau désionisée, puis en soumettant le mélange résultant à une centrifugation suivie d'une lyophilisation du surnageant, avec celles présentées par des extraits d'huîtres préparés en soumettant un broyât d'huîtres uniquement à une lyophilisation. Les résultats de cette étude montrent que, si les deux types d'extraits d'huîtres ont in vitro un effet protecteur contre les oxydations induites d'une part, par un générateur de radicaux peroxydes sur des hématies, et, d'autre part, par le cuivre sur les lipoprotéines de basse densité (LDL), les extraits aqueux d'huîtres apparaissent présenter le potentiel anti-oxydant le plus intéressant.
Il a par ailleurs été proposé, dans les Demandes de Brevets Japonais publiées sous les n° 7-082132 et n° 7-102252, d'utiliser dans des compositions cosmétiques des hydrolysats préparés à partir de mucus d'huîtres, en tant qu'agents anti-oxydants propres à prévenir le vieillissement cutané et notamment l'apparition des rides. Ces hydrolysats sont obtenus en centrifugeant ou pressant des huîtres, après extraction de leurs coquilles et en éliminant la chair. Le mucus est alors soumis à une série de fractionnements par l'éthanol pour le débarrasser du chlorure de sodium qu'il renferme, puis à une protéolyse. Dans la Demande de Brevet Japonais n° 7-102252, le mucus, une fois hydrolyse, est soumis à une opération de dessalage complémentaire, toujours à l'aide d'éthanol, pour diminuer sa coloration.
Le coût de fabrication de tels hydrolysats est très élevé, notamment en raison des quantités non négligeables d'éthanol mises en jeu lors des opérations de dessalage et de la nécessité de disposer d'installations spécifiques et relativement onéreuses qu'impose l'utilisation de solvants organiques. De ce fait, indépendamment du point de savoir s'ils présentent une activité antiradicalaire significative, il n'est pas souhaitable d'utiliser ce type d'hydrolysats pour la fabrication à une échelle industrielle de compositions antiradicalaires, en particulier si ces dernières sont destinées à être commercialisées en tant que compléments alimentaires. Or, dans le cadre de leurs travaux, les Inventeurs ont constaté que des hydrolysats d'huîtres obtenus en soumettant de la chair d'huîtres à l'action d'une protease dans des conditions appropriées, présentent de manière surprenante une activité antiradicalaire encore plus élevée que celle observée pour les extraits aqueux d'huîtres testés par DUSSART dans l'étude précitée, et sont donc susceptibles d'être avantageusement utilisés pour la fabrication de compositions destinées à prévenir ou traiter les effets délétères des radicaux libres oxygénés.
La présente Invention a donc pour objet l'utilisation d'un hydrolysat enzymatique d'huîtres pour la préparation d'une composition antiradicalaire, cette utilisation étant caractérisée en ce que ledit hydrolysat est susceptible d'être obtenu par hydrolyse de chair d'huîtres au moyen d'une protease.
Selon une première disposition avantageuse de l'Invention, l'hydrolyse de la chair d'huîtres est réalisée par une protease choisie parmi la subtilisine, la pepsine et la trypsine. En effet, outre que ces protéases ont un coût compatible avec une exploitation industrielle de l'Invention, elles présentent l'avantage de faire partie des enzymes dont l'utilisation est autorisée dans de très nombreux pays pour la préparation d'hydrolysats protéiques entrant dans la fabrication de compléments alimentaires.
Dans la mesure où les protéases ne sont pas toutes actives dans les mêmes gammes de pH et de température, les conditions de pH et de température dans lesquelles l'hydrolyse de la chair d'huîtres est effectuée dépendent de la protease choisie pour réaliser cette hydrolyse.
De préférence, ces conditions de pH et de température sont telles qu'elles permettent d'obtenir une activité optimale de la protease. Ainsi, par exemple, l'hydrolyse est conduite préférentiellement à un pH d'environ 8 et une température d'environ 60°C dans le cas de la subtilisine, à un pH d'environ 2 et une température d'environ 40°C dans le cas de la pepsine, et à un pH d'environ 8 et une température d'environ 37°C dans le cas de la trypsine.
Selon une autre disposition avantageuse de l'Invention, l'hydrolyse de la chair d'huîtres est effectuée pendant un temps suffisant pour que l'hydrolysat présente un degré d'hydrolyse protéique au moins égal à 30% et, de préférence, à 50%, ce degré d'hydrolyse protéique étant déterminé par la formule ci-après (ADLER- NISSEN, 1977, Proc. Biochem., 12, 18-23) :
DH = (h/h total) x 100
dans laquelle :
- h total représente le nombre total de liaisons peptidiques présentes dans la chair d'huîtres au début de l'hydrolyse, tandis que
- h représente le nombre de liaisons peptidiques hydrolysées au cours de l'hydrolyse, et est déterminé par la différence entre le nombre d'extrémités aminées (ou carboxyliques) libres présentes dans l'hydrolysat au terme de l'hydrolyse (ht) et le nombre d'extrémités aminées (ou carboxyliques) libres présentes dans le broyât au début de l'hydrolyse (ho).
Au sens de la présente Invention, le début de l'hydrolyse correspond au moment où la protease est mise en contact avec la chair d'huîtres, tandis que son terme correspond au moment où l'hydrolyse est arrêtée par inactivation de ladite protease, par exemple par dénaturation thermique ou par modification du pH.
Le nombre total de liaisons peptidiques (h total) présentes dans la chair d'huîtres peut être obtenu par la différence entre la quantité d'acides aminés totaux (libres + liés) et la quantité d'acides aminés libres que renferme cette chair. Ces quantités d'acides aminés totaux et libres peuvent être déterminées, par exemple au moyen d'une trousse telle que celle commercialisée sous la marque WATERS AccQ- Tag Chemistry Package® par la Société WATERS. Le nombre de liaisons peptidiques hydrolysées (h) au cours de l'hydrolyse est, lui, obtenu par la différence entre la quantité d'extrémités aminées libres (ht) présentes dans l'hydrolysat au terme de l'hydrolyse et la quantité d'extrémités aminées libres (h0) présentes dans la chair d'huîtres au début de l'hydrolyse, lesquelles peuvent être déterminées, par exemple, par réaction avec du fluorodinitrobenzène selon le protocole décrit dans Biochem. J., 45, 563, 1949. Là également, le temps qu'il convient de laisser l'hydrolyse se faire afin d'obtenir un hydrolysat présentant un degré d'hydrolyse protéique au moins égal à 30% et, de préférence, à 50%, dépend de la protease choisie pour réaliser cette hydrolyse, et, pour une même protease, des conditions de pH, de température dans lesquelles l'hydrolyse est conduite, ainsi que de la dose à laquelle cette protease est utilisée, l'hydrolyse s'effectuant, en effet, d'autant plus rapidement que la dose de protease est plus élevée.
Selon encore une disposition avantageuse de l'Invention, l'hydrolysat est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant, préalablement à l'hydrolyse, une opération d'égouttage de la chair d'huîtres. Conformément à l'Invention, cette opération peut être réalisée en laissant simplement les huîtres, une fois extraites de leurs coquilles, reposer dans un égouttoir, de préférence à une température comprise entre 4 et 8°C pour prévenir toute altération de la chair, et ce, jusqu'à ce qu'il ne s'écoule plus de liquide dudit égouttoir.
Selon une disposition préférée de l'Invention, l'hydrolysat est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant, préalablement à l'hydrolyse, une opération de broyage de la chair d'huîtres suivie éventuellement d'une opération de dilution dans l'eau du broyât résultant.
De manière particulièrement préférée, l'opération de broyage est réalisée après une opération d'égouttage de la chair d'huîtres. Selon encore une autre disposition avantageuse de l'Invention, l'hydrolyse est arrêtée par dénaturation thermique de la protease.
Selon encore une autre disposition avantageuse de l'Invention, l'hydrolysat est susceptible d'être obtenu par un procédé qui comprend, de plus, une opération de recueil de la phase liquide de l'hydrolysat tel qu'il se présente au terme de l'hydrolyse. Ce recueil, qui est destiné à éliminer les différents débris (débris de coquilles, débris membranaires, ...) susceptibles d'être présents dans cet hydrolysat, peut être réalisé par toutes les techniques classiquement utilisées pour séparer une phase liquide d'une phase solide telle que la centrifugation, l'ultracentrifugation, la filtration, la microfiltration, ces techniques pouvant être avantageusement combinées entre elles.
Selon une autre disposition préférée de l'Invention, l'hydrolysat est susceptible d'être obtenu par un procédé qui comprend les étapes suivantes : a) le broyage de chair d'huîtres préalablement égouttée, b) la dilution du broyât dans de l'eau, dans un rapport broyat/eau compris entre 30/70 et 70/30 (m v), et, de préférence, entre 40/60 et 60/40 (m/v), c) l'hydrolyse du broyât ainsi dilué par de la subtilisine à un pH d'environ 8 et à une température d'environ 60°C, pendant un temps suffisant pour que l'hydrolysat présente un degré d'hydrolyse protéique au moins égal à 50%, d) l'arrêt de l'hydrolyse par inactivation de la subtilisine, et e) le recueil de la phase liquide de l'hydrolysat.
Selon encore une autre disposition préférée de l'Invention, l'hydrolysat est susceptible d'être obtenu par un procédé qui comprend les étapes suivantes : a) le broyage de chair d'huîtres préalablement égouttée, b) la dilution du broyât dans de l'eau, dans un rapport broyat/eau compris entre 30/70 et 70/30 (m/v), et, de préférence, entre 40/60 et 60/40 (m/v), c) l'hydrolyse du broyât ainsi dilué par de la pepsine, à un pH d'environ 2 et à une température d'environ 40°C, pendant un temps suffisant pour que l'hydrolysat présente un degré d'hydrolyse protéique au moins égal à 50%, d) l'arrêt de l'hydrolyse par inactivation de la pepsine, et e) le recueil de la phase liquide de l'hydrolysat.
Selon encore une autre disposition préférée de l'Invention, l'hydrolysat est susceptible d'être obtenu par un procédé qui comprend les étapes suivantes : a) le broyage de chair d'huîtres préalablement égouttée, b) la dilution du broyât dans de l'eau, dans un rapport broyat/eau compris entre 30/70 et 70/30 (m/v), et, de préférence, entre 40/60 et 60/40 (m/v), c) l'hydrolyse du broyât ainsi dilué par de la trypsine, à un pH d'environ 8 et à une température d'environ 37°C, pendant un temps suffisant pour que l'hydrolysat présente un degré d'hydrolyse protéique au moins égal à 50%, d) l'arrêt de l'hydrolyse par inactivation de la trypsine, et e) le recueil de la phase liquide de l'hydrolysat.
De tels hydrolysats enzymatiques d'huîtres présentent des propriétés antiradicalaires qui, outre d'être prononcées, sont extrêmement intéressantes puisqu'ils s'avèrent être capables, non seulement de neutraliser les effets des radicaux libres oxygénés produits au cours de réactions de peroxydation, mais également d'empêcher la formation de ces radicaux libres par ce qui apparaît être un mécanisme de chélation des métaux comme par exemple le cuivre, qui sont impliqués dans la genèse desdits radicaux libres. De plus, ils présentent l'avantage de pouvoir être obtenus par un procédé simple à mettre en oeuvre et économiquement compatible avec les impératifs industriels, notamment en raison de ce qu'il ne requière l'utilisation d'aucun solvant organique.
Ces hydrolysats sont donc susceptibles d'être avantageusement utilisés pour la préparation :
- de compositions pharmaceutiques destinées à traiter les pathologies apparaissant liées à un déséquilibre entre la production et la destruction des radicaux libres oxygénés telles que précédemment évoquées,
- de compléments alimentaires propres à être utilisés, soit en tant qu'adjuvants à un traitement médical, soit à titre préventif, notamment par des personnes chez lesquelles il est souhaitable de renforcer les mécanismes naturels de défense contre les radicaux libres oxygénés, parce que ces moyens de défense sont physiologiquement diminués (personnes âgées, personnes souffrant de déficits alimentaires en vitamines et oligo-éléments, ...) ou parce que ces personnes sont amenées à se trouver dans des situations favorisant la formation excessive de radicaux libres oxygénés (exposition intense au soleil, exposition aux produits chimiques, ...), ou encore
- de compositions cosmétiques visant à prévenir ou à traiter le vieillissement cutané dont l'origine est en grande partie liée aux radicaux libres générés au niveau de la peau par les rayonnements ultraviolets.
A cette fin, ils peuvent être utilisés soit tels quels, c'est-à-dire sous forme aqueuse ou éventuellement sous la forme de poudres sèches obtenues par exemple, par lyophilisation, soit en mélange avec des excipients physiologiquement acceptables et/ou d'autres substances actives et, notamment, des substances ayant également des propriétés antiradicalaires intrinsèques, et capables d'agir de manière synergique (vitamines A, C ou E, par exemple), au sein de formulations plus complexes.
Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront du complément de description qui suit, qui se rapporte à des exemples illustrant l'activité hydrolytique d'enzymes sur des broyats de chair d'huîtres, la préparation d'hydrolysats enzymatiques de chair d'huîtres ainsi que les propriétés biologiques de ces hydrolysats, et qui se réfère aux dessins annexés dans lesquels :
- la Figure 1 représente la cinétique de deux hydrolyses conduites sur des broyats de chair d'huîtres avec deux doses différentes de subtilisine ; tandis que
- la Figure 2 représente la cinétique d'une hydrolyse conduite sur un broyât de chair d'huîtres avec de la pepsine.
Il va de soi, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustrations de l'objet de l'Invention et n'en constituent en aucune manière une limitation
EXEMPLE 1 : Etude de l'activité hydrolytique de la subtilisine sur des brovats de chair d'huîtres
Des huîtres creuses Crassostrea gigas vivantes, provenant de la station conchylicole expérimentale IFREMER de Bouin (VENDEE - FRANCE), après extraction de leurs coquilles, sont égouttées sur un tamis métallique pendant 1 heure à une température comprise entre 4 et 8°C, puis broyées pendant 2 minutes à
1 000 tr/minute à l'aide d'un Ultra-Turrax® (de puissance maximale égale à 170 W à
2 000 tr/minute). Le broyât obtenu, après une éventuelle conservation à une température de -20°C et, dans ce cas, une décongélation, est introduit dans un réacteur. Il est additionné, sous agitation, de 60% (v/m) d'eau désionisée. Puis, on introduit dans le réacteur, toujours sous agitation, une dose de 14 UA (unités actives) ou de 38 UA de subtilisine (commercialisée sous la marque alcalase® 2.4L par la Société NOVO NORDISK) par kg du mélange qu'il contient. La température du réacteur est maintenue à 60°C pendant toute la durée de l'hydrolyse, soit pendant 4 heures. L'agitation est également maintenue et le pH est régulé à l'aide d'un pH-stat de manière à être constamment à une valeur de 8.
Au terme des 4 heures d'hydrolyse, l'activité de la subtilisine est arrêtée par dénaturation thermique de cette dernière, en plaçant le mélange reactionnel dans un bain-marie à 90°C pendant 25 minutes.
Des échantillons sont prélevés dans le réacteur, au moyen d'une pompe péristaltique, juste avant que n'y soit introduite la subtilisine (t0), puis 15 et 30 minutes après l'introduction de cette enzyme dans le réacteur (soit à tl5 et t30), puis toutes les 30 minutes et ce, jusqu'à l'arrêt de l'hydrolyse (soit à t60, t90, t120, t150, t180, t2,0 et t240). Les échantillons qui renferment de la subtilisine sont placés dans un bain-marie à 90°C pendant 25 minutes de manière à stopper l'activité de cette dernière. Puis, tous les échantillons sont soumis à une centrifugation à 13 000 tr/minute. Les surnageants sont filtrés sur une membrane de 0,7 μm, puis sur une membrane de 0,16 μm. L'activité hydrolytique de la subtilisine est appréciée en suivant :
- d'une part, l'évolution de la concentration des broyats en extrémités aminées libres entre t15 et t240, en dosant ces extrémités par réaction avec du fluorodinitrobenzène, ce suivi permettant d'établir la cinétique de l'hydrolyse, et
- d'autre part, l'évolution du degré d'hydrolyse protéique (DH) des broyats entre tl5 et t240, ce degré d'hydrolyse protéique étant calculé selon la formule DH = (h/h total) x 100, dans laquelle h total est obtenu par le dosage des acides aminés totaux et libres présents dans les broyats à l'aide d'une trousse WATERS AccQ-Tag Chemistry Package®, tandis que h est déterminé par le dosage des extrémités aminées libres présentes dans les échantillons prélevés à tl 5, t30, ..., jusqu'à t240 inclus, par réaction avec du fluorodinitrobenzène.
La Figure 1 représente la cinétique de l'hydrolyse conduite avec la dose de subtilisine de 14 UA/kg (m) et celle conduite avec la dose de subtilisine de 38 UA/kg (•*), les valeurs des concentrations en extrémités aminées libres étant exprimées en ordonnées et en mM, le temps étant exprimé en abscisses et en minutes. Cette Figure montre que l'hydrolyse est plus rapide lorsque la dose de subtilisine est augmentée. Ainsi, le plateau est atteint au bout de 90 minutes d'hydrolyse pour la dose de 14 UA/kg, et ce délai est réduit à 60 minutes pour la dose de 38 UA/kg. Toutefois, la concentration en extrémités aminées libres pour laquelle le plateau est atteint est similaire pour les deux doses d'enzyme. Il en est de même de la concentration finale en extrémités aminées libres (environ 120 mM).
Le Tableau I ci-après présente les valeurs des degrés d'hydrolyse protéique (DH), exprimées en pourcentages, obtenues pour chacune des doses de subtilisine.
TABLEAU I
Temps DH (%) (minutes) 14 UA/kg 38 UA/kg
15 14 —
30 23 31
60 34 46
90 45 48
120 47 51
150 50 51
180 47 56
210 54 54
240 54 58
Ce Tableau montre que, quelle que soit la dose de subtilisine utilisée, la vitesse d'hydrolyse diminue lorsque 45% des liaisons peptidiques potentiellement hydrolysables ont été rompues. L'hydrolyse se poursuit toutefois, mais de manière discrète, puisque les valeurs finales du degré d'hydrolyse protéique dépassent 50%, pour atteindre 54% dans un cas, et 58% dans l'autre cas. EXEMPLE 2 : Etude de l'activité hydrolytique de la pepsine sur des brovats de chair d'huîtres
L'activité hydrolytique de la pepsine sur des broyats de chair d'huîtres est appréciée en utilisant un protocole opératoire identique à celui utilisé dans l'exemple 1, à ceci près que l'hydrolyse est conduite avec une dose de 1% en masse de pepsine rapportée à la masse totale du mélange broyat/eau désionisée présent dans le réacteur, à une température de 40°C et à un pH égal à 2.
La Figure 2 représente la cinétique de l'hydrolyse ainsi obtenue, les valeurs des concentrations en fonctions aminés libres étant exprimées en ordonnées et en mM, le temps étant exprimé en abscisses et en minutes. Cette Figure montre que l'hydrolyse s'effectue nettement plus rapidement que lorsqu'elle est conduite avec de la subtilisine, même à la dose de 38 UA/kg, puisque le plateau est atteint 30 minutes après l'introduction de la pepsine dans le réacteur. Toutefois, la concentration finale en fonctions aminés libres dans l'hydrolysat, qui se situe aux environs de 120 mM, est tout à fait comparable à celle obtenue lorsque l'hydrolyse est conduite avec de la subtilisine.
EXEMPLE 3 : Préparation d'hydrolysats enzymatiques de chair d'huîtres par utilisation de la subtilisine
Sur la base des résultats obtenus dans l'étude objet de l'exemple 1, on prépare deux hydrolysats présentant des degrés d'hydrolyse protéique différents - qui seront dénommés ci-après respectivement hydrolysat A et hydrolysat B - en soumettant deux broyats de chair d'huîtres préalablement égouttée à une hydrolyse par de la subtilisine.
Les broyats de chair d'huîtres sont préparés et les hydrolyses sont conduites dans les mêmes conditions que celles décrites dans l'exemple 1, en utilisant une dose de subtilisine de 38 UA par kg de mélange broyat/eau désionisée.
Pour l'hydrolysat A, l'hydrolyse est arrêtée 4 heures après l'introduction de l'enzyme dans le réacteur, de manière à ce qu'il présente un degré d'hydrolyse protéique maximal, soit proche de 60%. Pour l'hydrolysat B, l'hydrolyse est arrêtée 30 minutes après introduction de l'enzyme dans le réacteur, afin qu'il présente un degré d'hydrolyse protéique sensiblement égal à la moitié du degré d'hydrolyse protéique maximal, soit d'environ 30%.
Dans les deux cas, l'activité hydrolytique de la subtilisine est stoppée en plaçant les mélanges réactionnels dans un bain-marie à 90°C pendant 25 minutes. Les mélanges sont ensuite centrifugés à 4 000 tr/minute. Les surnageants sont filtrés sur une membrane de 0,7 μm, puis sur une membrane de 0,16 μm. Les hydrolysats ainsi préparés présentent un aspect granuleux de couleur brun-vert. Ils sont lyophilisés et placés dans des flacons à -20°C. EXEMPLE 4 : Caracterisation biochimique d'un hydrolysat enzymatique de chair d'huîtres obtenu conformément à l'Invention
On réalise une étude visant à déterminer pour l'hydrolysat A préparé selon l'exemple 3 : - sa teneur en matière sèche,
- sa teneur en matière minérale,
- sa teneur en protéines solubles,
- sa teneur en sucres totaux et en glycogène, ainsi que
- sa teneur et sa composition en acides aminés totaux et en acides aminés libres, et à comparer les résultats avec ceux obtenus, dans les mêmes conditions, d'une part, pour un broyât de chair d'huîtres préparé comme décrit dans l'exemple 1 et d'autre part, pour un extrait aqueux d'huîtres préparé :
• en mélangeant un broyât de chair d'huîtres avec de l'eau désionisée (1/3, v/v) jusqu'à obtenir un mélange homogène, puis
. en soumettant le mélange résultant à une centrifugation à 3000 g pendant 20 minutes, et
• en lyophilisant le surnageant recueilli au terme de cette centrifugation. La teneur en matière sèche est déterminée en plaçant des échantillons de l'hydrolysat A à une température de 100°C jusqu'à l'obtention d'un poids constant (6 heures minimum), et en calculant le pourcentage représenté par ce poids par rapport au poids initial de ces échantillons.
La teneur en matière minérale est déterminée en incinérant des échantillons de l'hydrolysat A à une température de 600°C pendant 12 heures, et en calculant le pourcentage représenté par le poids du résidu par rapport au poids de la matière sèche.
Les protéines solubles sont dosées à l'aide de la trousse commercialisée par la Société PIERCE sous la dénomination commerciale BCA® Protein Assay Reagent. L'albumine bovine est utilisée comme étalon. Les sucres totaux et le glycogène sont dosés selon la méthode décrite par M. DUBOIS et al. (Anal. Chem., 1956, 28, 350-356). Pour ces dosages, les échantillons sont prélablement délipidés selon la méthode de E. G. BLIGHT et W. J. DYER (Can. J. Biochem. Physiol, 1959, 37, 911-917). La teneur et la composition en acides aminés totaux et en acides aminés libres sont, quant à elles, déterminées à l'aide d'une trousse WATERS AccQ- Tag Chemistry Package®. Pour le dosage des acides aminés totaux, les échantillons de l'hydrolysat A sont préalablement soumis à une hydrolyse acide, par action d'HCl 6N pendant 12 heures, à 110°C et sous vide, tandis que, pour le dosage des acides aminés libres, les échantillons de l'hydrolysat A sont préalablement additionnés d'acide sulfo- salicilique et centrifugés de manière à provoquer une précipitation des protéines présentes dans ces échantillons.
Le Tableau II ci-après présente les teneurs en matière sèche, en matière minérale, en protéines solubles, en sucres totaux, en glycogène, en acides aminés totaux et en acides aminés libres présentées respectivement par l'hydrolysat A, le broyât d'huîtres et l'extrait aqueux d'huîtres.
Les teneurs en matière sèche sont exprimées en pourcentages par rapport au poids lyophilisé (% p/p) des échantillons, sauf dans le cas du broyât où la matière sèche est exprimée en pourcentage par rapport au poids frais (% p/p*) des échantillons. Les teneurs en matière minérale, en protéines solubles, en sucres totaux, en glycogène, en acides aminés totaux et en acides aminés libres sont exprimées en pourcentages par rapport aux poids sec (% p/p) des échantillons.
TABLEAU II
Figure imgf000018_0001
Le Tableau III ci-après présente, lui, les compositions en acides aminés totaux et libres de l'hydrolysat A, du broyât d'huîtres et de l'extrait aqueux d'huîtres. Les teneurs de chaque acide aminé sont exprimées en pourcentages par rapport au poids total (% p/p) des acides aminés présents dans les échantillons. TABLEAU III
Figure imgf000019_0001
Le Tableau II montre que l'hydrolysat A présente une teneur en sucres totaux supérieure à celles retrouvées dans le broyât et dans l'extrait aqueux. Cet accroissement est dû à la déstructuration des tissus provoquée par l'hydrolyse enzymatique, permettant ainsi une plus forte solubilisation des sucres. La diminution de la teneur en protéines solubles que l'on observe entre le broyât et l'hydrolysat est une conséquence de l'hydrolyse des protéines natives. Cette hydrolyse génère une quantité importante de peptides et d'acides aminés libres qui réagissent peu avec le réactif utilisé pour le dosage des protéines solubles (BCA®). Par contre, la teneur en matières minérales ne varie pas entre les trois préparations. Par ailleurs, il résulte du Tableau II que la teneur en acides aminés libres de l'hydrolysat A est notablement plus élevée que la teneur en acides aminés libres de l'extrait aqueux d'huîtres, cette dernière étant très proche de celle retrouvée pour le broyât de chair d'huîtres. L'augmentation de la quantité d'acides aminés libres présents dans l'hydrolysat A est directement liée à la rupture des liaisons peptidiques provoquée par la réaction d'hydrolyse.
Toutefois, au vu du Tableau III, il apparaît que la proportion de taurine libre, qui est connue pour présenter une activité anti-oxydante, est plus faible dans l'hydrolysat A que dans l'extrait aqueux d'huîtres. En effet, la taurine sous forme libre représente 60.66% des acides aminés libres dans l'extrait aqueux d'huîtres contre seulement 19,25% dans l'hydrolysat A.
EXEMPLE 4 : Activité biologique des hydrolysats enzymatiques de chair d'huîtres obtenus conformément à l'Invention
L'activité biologique des hydrolysats A et B préparés selon l'exemple 3 est appréciée par une série d'expérimentations visant à tester : - d'une part, l'aptitude de ces hydrolysats à inhiber l'hémolyse induite par l'introduction d'un générateur de radicaux peroxydes, à savoir le 2,2'-azo- bis-(2-amidinopropane) dichlorhydrique (AAPH), dans une suspension d'hématies, et
- d'autre part, l'aptitude de ces hydrolysats à protéger les lipoprotéines de basse densité, plus connues sous la terminologie anglaise "Low Density Lipoproteins" (LDL) contre une oxydation induite par le cuivre. 4.1 - Inhibition de l'hémolyse induite par l'AAPH : a) Protocole :
5 ml de sang humain sont prélevés sur tube EDTA (lequel est immédiatement placé dans de la glace pilée) et centrifugés pendant 10 minutes, à 1 000 g et à 4°C. Le plasma est éliminé et les hématies sont lavées 3 fois avec une solution de NaCl à 9%o ou avec du tampon PBS (pH 7,4). 200 μl du culot cellulaire d'hématies sont ensuite dilués dans 9,8 μl de solution de NaCl à 9%o ou de tampon PBS.
Dans un premier temps, la suspension globulaire obtenue est mise en contact pendant 10 minutes avec les solutions (NaCl 9%o ou PBS) d'hydrolysats A ou B dont le volume est calculé de manière à ce que la solution finale corresponde à 25, 50 et 100 mg/1. Un échantillon sans hydrolysat constitue le témoin.
300 μl d'une solution d'AAPH ayant préalablement été mise à incuber à 37°C sont alors introduits dans les suspensions d'hématies et l'ensemble est disposé sous agitation douce au bain-marie pendant 40 minutes.
Un échantillon de la suspension d'hématies (sans AAPH ou produit) est parallèlement disposé pendant 1 heure à -80°C.
La lyse des hématies est appréciée en mesurant l'activité de la lactate déshydrogénase (LDH) à l'aide d'un automate HITACHI® 911. Chaque mesure est réalisée en double.
L'activité LDH déterminée sur les échantillons disposés à -80°C correspond à l'hémolyse totale des hématies.
L'activité LDH déterminée sur les échantillons ne contenant pas d'hydrolysat correspond à la sensibilité des hématies au "stress radicalaire" dans les conditions expérimentales. Cette mesure permet par ailleurs de vérifier que les conditions expérimentales (hémolyse < 100 %) sont convenables pour l'étude.
Pour chaque concentration d'hydrolysat, l'activité LDH est comparée à l'activité des échantillons ne contenant pas de produit et exprimée en pourcentage d'activité. b) Résultats :
Le Tableau IV ci-après présente la moyenne des pourcentages d'inhibition (la) obtenus pour des solutions de 25, 50 et 100 mg/1 d'hydrolysat A et d'hydrolysat B. TABLEAU IV
Concentration la (%) (mg/1) Hydrolysat A Hydrolysat B
25 38 25
50 74 48
100 96 98
Ce Tableau montre que les hydrolysats enzymatiques de chair d'huîtres obtenus conformément à l'Invention présentent une aptitude marquée à inhiber l'hémolyse induite par l'introduction d'un générateur de radicaux peroxydes au sein d'une suspension d'hématies - ce qui signifie qu'ils sont capables de neutraliser les effets oxydants de ces radicaux peroxydes -, puisque la concentration inhibitrice 50 (IC50) de l'hydrolysat A est comprise entre 25 et 50 mg/1, tandis que celle de l'hydrolysat B s'élève à 50 mg/1. A titre de comparaison, la concentration inhibitrice 50 (IC50) obtenue par DUSSART (ibid) pour un extrait aqueux d'huîtres est de 275 mg/1.
4.2 - Protection des LDL contre une oxydation induite par le cuiyre : a) Protocole :
Les LDL sont préparées à partir de 100 ml de plasma (sang prélevé sur EDTA). Dans un premier temps, les VLDL sont éliminées par ultracentrifugation,
24 heures à 40 000 g (densité : 1,019). Une seconde ultracentrifugation, 24 heures à
40 000 g (densité : 1,063) permet l'obtention des LDL. Les LDL sont alors dialysées pendant 24 heures à 4°C contre du tampon TRIS-EDTA, aliquotées puis conservées à 4° C.
Les LDL (0,2 mg de protéines/ml de solution), préalablement dialysees contre du tampon PBS, sont mises à incuber 24 heures à 37°C en présence de cuivre (oxydant) et en présence ou non des produits étudiés.
Pour chaque étude, 3 déterminations sont donc réalisées parallèlement :
- LDL en absence de cuivre (témoin LDL natives),
- LDL en présence de 5 μM de sulfate de cuivre (témoin LDL oxydées),
- LDL en présence de 5 μM de sulfate de cuivre et de concentrations croissantes des hydrolysats A et B.
Après arrêt de l'oxydation par du BHT/EDTA, la solution de LDL est dialysée 24 heures à + 4°C et filtrée sur membrane "millipore" de 0,2 μm. L'effet inhibiteur des hydrolysats vis à vis de l'oxydation des LDL par le cuivre est quantifié par le dosage de 2 marqueurs de lipoperoxydation :
- le MDA (malondialdéhyde), pour le calcul du pourcentage d'inhibition Ib,
- les hydroperoxydes, pour le calcul du pourcentage d'inhibition le.
• Dosage du MDA
Le MDA forme avec l'acide thiobarbiturique, à chaud et en milieu acide, un complexe chromogène fluorescent. Après extraction par le butanol normal, l'intensité de la fluorescence est mesurée à l'aide d'un spectrofluorimètre. Les concentrations de MDA sont déterminées au moyen d'une gamme de MDA s'étendant de 0,2 à 1 nmole.
• Dosage des hydroperoxydes
Les hydroperoxydes libèrent l'iode à partir d'une solution stabilisée d'iodure de potassium. L'iode libéré est mesuré par détermination de la densité optique (DO) à 365nm. La concentration en iode de l'échantillon est ensuite calculée à partir du coefficient d'extinction ε (=2,46 104, 1cm, 1M) de cet élément, b) Résultats :
Les Tableaux V et VI ci-après présentent respectivement les pourcentages d'inhibition (Ib) et (le) tels qu'obtenus pour des solutions de 25, 50, 100 et 250 mg/1 d'hydrolysat A et d'hydrolysat B.
TABLEAU V
Concentration Ib (%) (mg/1) Hydrolysat A Hydrolysat B
25 -9 40
50 75 82
100 73 86
250 86 89
TABLEAU VT
Figure imgf000025_0001
Ces Tableaux montrent que les hydrolysats enzymatiques de chair d'huîtres obtenus conformément à l'Invention ont également une aptitude prononcée à s'opposer à une oxydation des LDL induite par le cuivre, aptitude qui pourrait être liée à un effet chélateur vis-à-vis des métaux.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'un hydrolysat enzymatique d'huîtres pour la préparation d'une composition antiradicalaire, caractérisée en ce que ledit hydrolysat est susceptible d'être obtenu par hydrolyse de chair d'huîtres au moyen d'une protease.
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'hydrolyse est effectuée au moyen d'une protease choisie parmi la subtilisine, la pepsine et la trypsine.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que l'hydrolyse est effectuée pendant un temps suffisant pour que l'hydrolysat présente un degré d'hydrolyse protéique au moins égal à 30% et, de préférence, à 50%, ce degré d'hydrolyse protéique étant déterminé par la formule ci- après :
DH = (h/h total) x 100
dans laquelle :
- h total représente le nombre total de liaisons peptidiques présentes dans la chair d'huîtres au début de l'hydrolyse, tandis que
- h représente le nombre de liaisons peptidiques hydrolysées au cours de l'hydrolyse, et est déterminé par la différence entre le nombre d'extrémités aminées libres présentes dans l'hydrolysat au terme de l'hydrolyse (h,) et le nombre d'extrémités aminées libres présentes dans la chair d'huîtres au début de l'hydrolyse (h0).
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'hydrolysat est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant, préalablement à l'hydrolyse, une opération d'égouttage de la chair d'huîtres.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'hydrolysat est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant, préalablement à l'hydrolyse, une opération de broyage de la chair d'huîtres suivie éventuellement d'une opération de dilution dans l'eau du broyât résultant.
6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'opération de broyage est réalisée après une opération d'égouttage de la chair d'huîtres.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'hydrolyse est arrêtée par dénaturation thermique de la protease.
8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'hydrolysat est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant, postérieurement à l'hydrolyse, une opération de recueil de la phase liquide de l'hydrolysat.
9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 3 à 8, caractérisé en ce que l'hydrolysat est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant les étapes suivantes : a) le broyage de chair d'huîtres préalablement égouttée, b) la dilution du broyât dans de l'eau, dans un rapport broyat/eau compris entre 30/70 et 70/30 (m/v) et, de préférence, entre 40/60 et 60/40 (m/v), c) l'hydrolyse du broyât ainsi dilué par de la subtilisine, à un pH d'environ 8 et à une température d'environ 60°C, pendant un temps suffisant pour que l'hydrolysat présente un degré d'hydrolyse protéique au moins égal à 50%, d) l'arrêt de l'hydrolyse par inactivation de la subtilisine, et e) le recueil de la phase liquide de l'hydrolysat.
10. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 3 à 8, caractérisé en ce que l'hydrolysat est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant les étapes suivantes : a) le broyage de chair d'huîtres préalablement égouttée, b) la dilution du broyât dans de l'eau, dans un rapport broyat/eau compris entre 30/70 et 70/30 (m/v) et, de préférence, entre 40/60 et 60/40 (m/v), c) l'hydrolyse du broyât ainsi dilué par de la pepsine, à un pH d'environ 2 et à une température d'environ 40°C, pendant un temps suffisant pour que l'hydrolysat présente un degré d'hydrolyse protéique au moins égal à 50%, d) l'arrêt de l'hydrolyse par inactivation de la pepsine, et e) le recueil de la phase liquide de l'hydrolysat.
11. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 3 à 8, caractérisée en ce que l'hydrolysat est susceptible d'être obtenu par un procédé comprenant les étapes suivantes : a) le broyage de chair d'huîtres préalablement égouttée, b) la dilution du broyât dans de l'eau, dans un rapport broyat/eau compris entre 30/70 et 70/30 (m/v) et, de préférence, entre 40/60 et 60/40 (m/v), c) l'hydrolyse du broyât ainsi dilué par de la trypsine, à un pH d'environ 8 et à une température d'environ 37°C, pendant un temps suffisant pour que l'hydrolysat présente un degré d'hydrolyse protéique au moins égal à 50%, d) l'arrêt de l'hydrolyse par inactivation de la trypsine, et e) le recueil de la phase liquide de l'hydrolysat.
12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la composition antiradicalaire est une composition pharmaceutique, un complément alimentaire ou une composition cosmétique.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1330771C (zh) * 2005-07-15 2007-08-08 中国海洋大学 用复合酶酶解牡蛎制备具有胰蛋白酶抑制活性的肽的方法
CN100358439C (zh) * 2002-12-11 2008-01-02 张之中 牡蛎系列产品精加工方法

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2798140B1 (fr) * 1999-09-03 2003-04-11 Ifremer Hydrolysats enzymatiques d'huitres et leurs applications
ES2444215T3 (es) * 2002-07-29 2014-02-24 Zymtech Production As Método para la producción de péptidos y aminoácidos a partir de material de origen animal que comprende proteínas
KR100693379B1 (ko) * 2004-12-28 2007-03-09 주식회사 고려호이스트 방폭 및 로우헤드형 체인 호이스트
TW200745337A (en) * 2006-02-24 2007-12-16 Aminotech As Modified process
EP2085474A4 (fr) * 2006-10-12 2010-12-01 Nec Corp Peptide liant les molecules hla, son precurseur, fragment d'adn le codant et vecteur recombinant
CN102250997B (zh) * 2011-05-17 2013-04-10 钦州学院 一种用复合酶水解牡蛎蛋白制备活性肽的方法
CN107354234B (zh) * 2017-09-20 2020-12-25 中国科学院海洋研究所 用于筛选长牡蛎高糖原含量亲贝的方法及其相关引物对
FR3084261B1 (fr) * 2018-07-30 2021-01-08 Bcr Compositions cosmetiques ou dermatologiques
CN110050872B (zh) * 2019-05-09 2021-03-19 烟台嘉惠海洋生物科技有限公司 一种酶法制备牡蛎肽的工业化生产方法
CN114196717B (zh) * 2021-11-01 2023-10-10 中国科学院南海海洋研究所 一种缓解化疗药物对肠黏膜损伤且提高抑瘤率的低分子量牡蛎酶解物制备方法及其应用
FR3164912A1 (fr) * 2024-07-15 2026-01-30 Naperla Principe actif à base d’un extrait de laitance d’huitre

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0782132A (ja) * 1993-09-14 1995-03-28 Mikimoto Pharmaceut Co Ltd 活性酸素抑制剤
JPH07102252A (ja) * 1993-10-05 1995-04-18 Mikimoto Pharmaceut Co Ltd 抗酸化剤
JPH10236941A (ja) * 1997-02-21 1998-09-08 Noevir Co Ltd 皮膚外用剤
NZ329018A (en) * 1998-12-22 2000-04-28 Ind Res Ltd Extracting glycogen from Green Shell Mussels and the use of the glycogen as a food supplement or additive or in the treatment of inflammatory diseases such as arthritis.

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4822661B1 (fr) 1969-10-31 1973-07-07
FR2511597B1 (fr) * 1981-08-21 1994-07-29 Lemonnier Monique Produits extraits d'invertebres marins, leur preparation et leurs applications en dietetique et en cosmetologie
US6001401A (en) * 1994-09-02 1999-12-14 Designing Health, Inc. Food supplement composition
US5656312A (en) * 1994-09-02 1997-08-12 Erasmus; Udo Dietary food supplement and method of preparing
FR2798140B1 (fr) * 1999-09-03 2003-04-11 Ifremer Hydrolysats enzymatiques d'huitres et leurs applications
EP1227736B1 (fr) * 1999-10-20 2004-01-07 Nordur EHF Hydrolysats proteiques obtenus a partir de proteases marines

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0782132A (ja) * 1993-09-14 1995-03-28 Mikimoto Pharmaceut Co Ltd 活性酸素抑制剤
JPH07102252A (ja) * 1993-10-05 1995-04-18 Mikimoto Pharmaceut Co Ltd 抗酸化剤
JPH10236941A (ja) * 1997-02-21 1998-09-08 Noevir Co Ltd 皮膚外用剤
NZ329018A (en) * 1998-12-22 2000-04-28 Ind Res Ltd Extracting glycogen from Green Shell Mussels and the use of the glycogen as a food supplement or additive or in the treatment of inflammatory diseases such as arthritis.

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE WPI Section Ch Week 197413, Derwent World Patents Index; Class D12, AN 1974-23535V, XP002140617 *
DATABASE WPI Section Ch Week 199521, Derwent World Patents Index; Class B04, AN 1995-158876, XP002140618 *
DATABASE WPI Section Ch Week 199846, Derwent World Patents Index; Class B04, AN 1998-537367, XP002140619 *
DATABASE WPI Section Ch Week 200036, Derwent World Patents Index; Class B04, AN 2000-420753, XP002153646 *
PATENT ABSTRACTS OF JAPAN vol. 1995, no. 07 31 August 1995 (1995-08-31) *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100358439C (zh) * 2002-12-11 2008-01-02 张之中 牡蛎系列产品精加工方法
CN1330771C (zh) * 2005-07-15 2007-08-08 中国海洋大学 用复合酶酶解牡蛎制备具有胰蛋白酶抑制活性的肽的方法

Also Published As

Publication number Publication date
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US6841171B1 (en) 2005-01-11

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