WO2001024628A1 - Model animal of mesangial cell proliferative nephritis - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to an animal model of mesangial cell proliferative nephritis caused by a check animal.
  • Mesangial cells play a central role in maintaining the structure and function of renal glomeruli.
  • Mesangial cells also have central pathophysiological significance in various types of nephritis. For example, proliferation of mesangial cells and accumulation of extracellular mesangial matrix is an important pathological finding of glomerulosclerosis in patients with various glomerular diseases such as chronic glomerulonephritis and diabetic nephropathy. It is.
  • model animals play a large role in analyzing disease states.
  • transgenic mice into which the c-myc oncogene has been introduced have greatly contributed to elucidating the pathology as a model animal for leukemia. If model animals exhibiting mesangial cell proliferative symptoms are realized, they will be modeled for various glomerular diseases, but in reality such model animals are not known. Glomerulonephritis is a major cause of progressive glomerular lesions leading to renal failure, and elucidation of the etiology using animal models is awaited.
  • Thyl antigen is known as a marker of mesangial cells in rats. However, this gene is not specific to mesangial cells and is not expressed in mesangial cells in humans (Miyata T. et al., Immunology (1989); 67: 531-533; Miyata T. et al., I Thigh unology (1990); 69: 391-395).
  • mesangial cells express smooth muscle actin when activated, but this gene is not mesangial cell-specific. Therefore, it is presumed that even if transgenic animals are produced based on these genes, a mesangial cell proliferative nephritis model animal will not be obtained.
  • transgenic mice Tsukuba hypertensive gene
  • renin and angiotensin genes have been introduced. mice
  • mice are known to exhibit glomerular sclerosis (Shimokama et al. Virchows Arch 432, 169, 1998).
  • this disorder is caused by hypertension, it cannot be a model animal for glomerular disorders in humans.
  • transgenic animal that can serve as a model for glomerular disease in humans, which involves the proliferation of mesangial cells and the proliferation of mesangial substrates. Renal lesions in conventional transgenic mice are often found as accidental products, often due to the effects of genes introduced for other purposes. Therefore, it can be said that there have been no reports suggesting what genes should be used to obtain human glomerular disease model animals.
  • megsin as a protein specifically expressed in mesangial cells (J. Clin. Invest, 1998 Aug 15, 120: 4, 828-36). However, it is not known that a mesangial cell proliferative nephritis model animal can be obtained by introducing a DNA encoding this protein. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a mesangial cell proliferative nephritis model animal and a method for producing the same. It is also an object of the present invention to provide a method for screening a therapeutic agent using a mesangial cell proliferative nephritis model animal obtainable by the present invention.
  • Megsin is a protein encoded by a gene that is specifically expressed in mesangial cells (J. Clin. Invest, 1998 Aug 15, 120: 4, 828-36).
  • the structure of human megsin or its homologue in rats and mice has already been elucidated by the present inventors, and a patent application has been filed (W099 / 15652). However, it has not been clarified how overexpression of megsin affects mesangial cells.
  • the present inventors have introduced the DNA encoding megsin.
  • transgenic mouse produced by the above-mentioned method exhibited typical symptoms of renal mesangial cell proliferative nephritis. That is, in the renal glomerular tissue of the transgenic mouse, which has reached the age of about 35 to 40 weeks, remarkable cell proliferation mainly of mesangial cells, proliferation of mesangial substrates, and immunity composed of immunoglobulins and complements Increased deposition of the complex was observed, and segmental sclerosis was observed. Based on the results of this observation, it was found that transgenic animals useful as mesangial cell proliferative nephritis model animals could be produced by introducing DNA encoding megsin, and the present invention was completed. That is, the present invention relates to the following animal model for mesangial cell proliferative nephritis, a method for producing the animal model, and uses.
  • a mesangial cell proliferative nephritis model animal which is a transgenic non-human animal that expresses exogenous DNA encoding human megsin or a protein functionally equivalent to human megsin in renal mesangial cells.
  • a method for producing a mesangial cell proliferative nephritis model animal comprising the following steps:
  • step b) a step of selecting an individual carrying the introduced exogenous gene among the primary transgenic animals generated from the fertilized egg of step a)
  • step a) The method for producing a mesangial cell proliferative nephritis model animal according to [5], further comprising the following steps c) and d).
  • step b) crossing the individual selected in step b) with a normal animal to obtain a heterologous F1 animal carrying an exogenous gene
  • step c) a step of crossing the F1 animals obtained in step c) to obtain F2 animals homozygously carrying the foreign gene
  • a method for evaluating the therapeutic effect of a candidate compound on mesangial cell proliferative nephritis comprising the following steps:
  • a method for screening a compound for treating mesangial cell proliferative nephritis comprising the following steps:
  • a pharmaceutical composition for treating and / or preventing mesangial cell proliferative nephritis comprising as a main component a compound obtainable by the screening method according to [8].
  • the present invention relates to a recombinant gene comprising a DNA encoding human megsin or a protein functionally equivalent to human megsin, and a promoter capable of expressing this MA in renal mesangial cells of animals.
  • the present invention relates to the use in the production of murine cell proliferative nephritis model animals.
  • the mesangial cell proliferative nephritis model animal according to the present invention can be obtained by a known method for producing a transgenic animal.
  • the mesangial cell proliferative nephritis in the present invention means a renal disease accompanied by proliferation of renal mesangial cells and increase in mesangial matrix.
  • renal diseases include IgA nephropathy, membranous proliferative glomerulonephritis, SLE (systemic lupus erythematosus) nephropathy, diabetic nephropathy, and cryoglobulin nephropathy.
  • Transgenic animals are described, for example, in “Developmental Engineering Experiment Manual” (supervised by Tatsuji Nomura, Motoya Katsuki, edited by Kodansha, 1989) and “New Course on Experimental Chemistry ⁇ Animal Experiments” (edited by The Biochemical Society of Japan, Tokyo Chemical) Doujin, 1991). The following description is based on a protocol for preparing a general transgenic animal.
  • human megsin is a protein encoded by a DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the deduced amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the transgenic animal of the present invention can be one into which not only human megsin but also a DNA encoding a protein having a biologically equivalent function to human megsin has been introduced.
  • Such a protein can be, for example, a homolog of megsin in another species.
  • the homolog of megsin for example, the structures of rat megsin and mouse megsin have been elucidated by the present inventors.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of rat megsin are shown in SEQ ID NOs: 3 and 4, and the nucleotide sequence of mouse megsin and the amino acid sequence are shown in SEQ ID NOs: 5 and 6.
  • eukaryotic genes often show polymorphism, as is known for the human interferon gene. Due to this polymorphism, protein activity is usually maintained even if one or more amino acid substitutions occur in the amino acid sequence. In general, it is known that protein activity is often maintained by modification of one or several amino acids. Therefore, the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 6 is artificially modified Any gene encoding a protein having the amino acid sequence described above can be used in the present invention as long as the protein causes renal mesangial cell proliferative nephritis.
  • megsin derived from humans, rats, or mice and proteins having biologically equivalent functions are collectively referred to as megsins.
  • megsins Even when MA encoding megsin derived from a mouse as a megsin is introduced into a mouse, the DNA derived from the artificially introduced mouse is exogenous DNA.
  • it is advantageous to use human megsin DNA. is there. This is because it is expected that the effects on human megsin in transgenic animals could be more faithfully reflected.
  • Codons for amino acids are known per se, and their choice may be arbitrarily determined.
  • codons can be determined according to a conventional method in consideration of the frequency of codon usage of the host to be used [Grantham, R. et al. , R43 (1981)]. Therefore, those obtained by appropriately modifying DNA in consideration of the degeneracy of codons are also included in the DM of the present invention.
  • partial modification of the codons of these nucleic acid sequences can be performed by a conventional method using site-specific displacement induction using a primer consisting of a synthetic oligonucleotide coding for the desired modification (sitespecific mutagenesis) [Mark, DF et al. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5662 (1984)].
  • the protein encoded by the DNA is renal mesangial cell proliferative nephritis Is included in the DNA according to the present invention.
  • Many of the sequences that can hybridize to a specific sequence under stringent conditions are likely to have activities similar to the protein encoded by the specific sequence.
  • Stringent conditions are typically conditions for washing, typically around lxSSC, 0.1% SDS, 37 ° C, and more stringent conditions. Is about 0.5xSSC, 0.13 ⁇ 4SDS, 42 ° C.
  • a fragment thereof can be used as long as it causes renal mesangial cell proliferative nephritis in the transgenic animal.
  • MA coding for megsin used for producing a transgenic animal can be obtained by a known method based on the nucleotide sequence disclosed in the present specification.
  • the cDNA library of mesangial cells is replaced by SEQ ID NO:
  • the DNA encoding the megsins is a recombinant gene construct linked to a promoter that can be expressed in the cells of the animal into which the gene is to be introduced.
  • the recombinant gene construct of the present invention is obtained by inserting a DNA encoding the megsin and a promoter upstream thereof into a vector that can be cloned by using an appropriate host, and performing the clone.
  • a promoter that can be used in the present invention a chicken actin promoter capable of inducing the expression of a foreign gene in a wide range of vertebrates such as mice and rats can be shown.
  • an enhancer can be combined to enhance the expression of a foreign gene.
  • Enhansa from CMV is known to enhance the expression of foreign genes in mammals.
  • an enhancer and a promoter are provided, and a downstream multi-site for inserting a foreign gene is further provided.
  • a vector having a cloning site can be used.
  • Vectors having such a structure are used, for example, based on pCAGGS (Niwa H, Yamamura K and Miyazaki J (1991) Efncient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.Gene 108, 193-200.) It can be constructed by the method shown in the example.
  • a heron, 5 globin, and a rice plant are placed downstream of the multicloning site, which contributes to the improvement of the expression efficiency of the inserted foreign gene.
  • the recombinant gene construct cut out from the vector with an appropriate restriction enzyme is sufficiently purified and used for producing a transgenic animal.
  • a transgenic animal is produced by introducing the above-described construct into an unfertilized egg, a fertilized egg, a sperm and a germ cell containing its progenitor cells.
  • the cells into which the construct is introduced those at the stage of embryonic development in non-human mammal development, more specifically, at the stage of a single cell or a fertilized egg cell, usually before the 8-cell stage, are used.
  • a calcium phosphate method As a method for introducing a construct, a calcium phosphate method, an electric pulse method, a lipofection method, an agglomeration method, a microinjection method, a partial gun method, a DAE-dextran method, and the like are known. Furthermore, a transgenic animal can also be produced by fusing the thus obtained transformed cells with the above-mentioned germinal cells.
  • the cells into which the construct is introduced can be cells from any non-human vertebrate capable of producing a transgenic animal. Specifically, cells of mice, rats, hamsters, guinea pigs, egrets, goats, sheep, bush, horses, dogs, cats and the like can be used.
  • fertilized eggs into which a construct can be introduced can be collected by mating a normal mouse with a female mouse to which an ovulation-inducing agent has been administered.
  • fertilized mouse eggs the construct is generally introduced by microinjection into the male pronucleus.
  • the cells into which the construct has been introduced are cultured outside the body overnight, and then transfected.
  • the surrogate mother is a pseudopregnant female that has been bred to a female whose vas deferens have been cut.
  • Transgenic chimeric animals were born by analyzing the genes of their somatic cells, confirming that a foreign gene (DNA encoding megsin) had been incorporated into the genome, and then creating an F1 animal. Mating with normal animals for At this time, desirably, individuals having a higher copy number are selected. Generally, multiple copies of exogenous DNA introduced as a construct are tandemly integrated into the same part of the genome. Usually, the larger the number of integrated copies, the more gene expression, and a clearer phenotype can be expected. The correct integration of the foreign gene (DNA encoding megsin) in the somatic cell genome can be confirmed by PCR using primers specific to the construct. In addition, the dot plot method enables relative comparison of copy numbers.
  • any generation of these transgenic animals can be used as long as the mesangial cells express exogenous megsin DNA.
  • transgenic animals that retain megsin DNA heterologously Expression of sex megsin in mesangial cells is useful as a model animal for renal mesangial cell proliferative nephritis.
  • a renal mesangial cell proliferative nephritis model animal can be used as long as exogenous MA of megsin can be expressed in at least mesangial cells. Therefore, it is not always necessary to express exogenous megsin DNA specifically in the kidney. For example, as shown in the Examples, even a transgenic mouse that expresses human megsin systemically can obtain remarkable renal mesangial cell proliferative nephritis.
  • transgenic animals exhibiting symptoms of renal mesangial cell proliferative nephritis can be confirmed by observing the following indicators.
  • PAS staining of kidney tissue can be used to observe the number of mesangial cells, the area of mesangial matrix, and score the degree of proliferative glomerulonephritis.
  • pathological findings are exemplified as typical findings of the transgenic animal of the present invention.
  • the renal glomerular tissue of the transgenic mouse according to the present invention which is about 35 to 40 weeks old, marked cell proliferation mainly involving mesangial cells, mesangial substrate proliferation, and complement and immunoglobulin Deposition of the resulting immune complex is observed, and it is observed that the sclerosis has fallen into segmental sclerosis.
  • Animal model of renal mesangial cell proliferative nephritis caused by the transgenic animal of the present invention exhibits chronic progression of cell proliferation and extracellular matrix accumulation in the mesangial and glomerular endothelial cell regions, and shows clear renal mesangial cell proliferative nephritis. Have symptoms.
  • model animals produced by other methods such as injection of nephritis-inducing agent or surgery, it is excellent in that it does not require much labor for preparing model animals and can supply a large number of uniform individuals. I have.
  • the model animal of the present invention is useful for elucidating the pathology of renal mesangial cell proliferative nephritis and for large-scale drug screening for therapeutic drug development.
  • the therapeutic effect of the candidate compound on mesangial cell proliferative nephritis can be evaluated.
  • the evaluation method according to the present invention is implemented by the following steps.
  • a compound for treating mesangial cell proliferative nephritis can be screened using the mesangial cell proliferative nephritis model animal of the present invention.
  • the screening method according to the present invention is implemented by the following steps.
  • the nephritis symptom may be a pathological finding in kidney tissue or, if expecting an activity of regulating the expression level of megsin, the mRNA or protein level of megsin in mesangial cells.
  • the effectiveness is evaluated using the measurement result as an index.
  • the level of the pathological findings of the kidney tissue can be compared, for example, by a scoring method as shown in the Examples.
  • mRNA can be measured according to a known method using a probe or primer set based on the nucleotide sequence of DNA encoding megsin described in SEQ ID NO: 1 or the like.
  • the protein level of megsin can be measured by an immunoassay using an antibody against the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the efficacy of the candidate compound as a therapeutic agent can be evaluated.
  • the efficacy of the candidate compounds can be compared by comparing the observations of these indicators between animals.
  • candidate compounds used in the screening of the present invention include natural or synthetic compounds, various organic compounds, natural or synthetic saccharides, proteins, peptides, expression products of gene libraries, cell extracts, and bacterial cell components. Can be mentioned.
  • antisense nucleic acids that regulate the expression of megsins and anti-megsins antibodies that are expected to suppress the activity of megsins can also be used as candidate compounds.
  • These candidate compounds can be used in animal models of mesangial cell proliferative nephritis. It is administered orally or parenterally.
  • the candidate compound selected by the screening method of the present invention is further tested for safety and stability, and then used as a main component of a therapeutic and / or prophylactic pharmaceutical composition for mesangial cell proliferative nephritis. can do.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated and administered by a known pharmaceutical manufacturing method.
  • the main component of the compound itself can be directly administered. When it is formulated, it can be administered, for example, by appropriately combining it with a vehicle or carrier generally used as a drug.
  • the DNA may be incorporated into a vector for gene therapy to perform gene therapy.
  • Administration can be performed by, for example, intraarterial injection, intravenous injection, intranasal administration, intrabronchial administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, oral administration, direct administration to the affected area, and the like.
  • the dose varies depending on conditions such as the patient's body weight, age, health degree, and administration method, and those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the effective concentration is determined by comparing the effect of alleviating nephritis symptoms between various doses. And by each administration route as described above, mesangial cells A dose is determined empirically such that the concentration of the administered compound reaches its effective concentration. In general dosage forms, the dosage per kg body weight is determined assuming that the active ingredient is distributed systemically. If the compound is considered to have high renal translocation based on the results of pharmacokinetic analysis in experimental animals, the dose can be set lower.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is mixed with a vehicle or carrier in consideration of the determined dosage and administration form.
  • the skilled artisan will normally formulate the active ingredients so that the required dosage can be achieved.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention can be usually from 1 to 10 mg, more usually 10 zg to 1 mg per kg of body weight. In the case of injections, the dose can be about 1/100 of that for oral administration.
  • the dosage can be adjusted by special formulation design.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be made into a sustained-release preparation by holding it in an appropriate carrier.However, in such a preparation, a high blood concentration can be maintained. The amount can be set lower.
  • the mesangial cell proliferative nephritis model animal of the present invention is useful for the following uses in addition to screening for compounds that can be used for treatment or prevention. First, it can be used as a material for examining guidelines for improving lifestyle habits such as dietary therapy. Alternatively, since the pathological image is very similar to that of human glomerulonephritis, it can be used for pathological analysis of nephritis. Furthermore, using the fact that the transgenic mouse of the present invention spontaneously develops symptoms of glomerulonephritis at about 35-40 weeks of age, the relationship between genetic predisposition and the environmental factors in the development of glomerulonephritis was clarified. It is also useful as an experimental material for performing experiments.
  • FIG. 1 is a diagram showing a construction diagram of a recombinant gene construct.
  • A shows the structure of pBsCAG-2.
  • B shows the structure of pBsCAG2 / Megsin and the DNA fragment used for microinjection into eggs.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of Northern blot analysis of the expression of the human megsin gene in renal mesangial cells of transgenic mice.
  • Lanes 1 and 3 are non-transgenic littermates from lanes 2 and 4, lanes 2 and 4 are transgenic mice, and lane 5 is wild type.
  • the strain of the transgenic mouse in each lane is as shown below.
  • Lanes 1 and 2 are strain A, lanes 3 and 4 are strain B, and lane 5 is wild type.
  • FIG. 3 is a photograph showing the result of analyzing the expression of human megsin protein in the kidney tissue of transgenic mice using an immunoblot using an anti-human megsin peptide antibody.
  • Lane 1 is maltose binding protein 'megsin fusion protein expressed in E. coli (positive control); lanes 2 and 4 are kidneys of wild-type mice; lanes 3 and 5 are transgenic mice (strain A, respectively) And B) for kidneys.
  • Figure 4 shows the detection of the human megsin gene product in the kidneys of F1 generation transgenic mice (a) and wild-type mice (b) by immunohistochemical staining (immunohistochemist) using an anti-human megsin peptide antibody. 4 is a photograph showing the result of the measurement. Magnification 16x (50x for inset).
  • FIG. 5 is a photograph showing PAS-stained images of kidneys of normal mice and mesangial cell proliferative nephritis model mice.
  • "Wild type littermatej is wild-type
  • "Megsin Tg / + j is a kidney section of a megsin transgenic mouse (" hetero ").
  • Figure 6 shows the results of measuring the size of glomeruli (a) and the number of mesangial cells per glomerulus (b) for 25 wild-type mice and 19 transgenic mice .
  • ⁇ open circle
  • • (close circle) indicates those exceeding this standard.
  • Figure 7 shows that immune complexes consisting of immunoglobulins (IgA, IgG, IgM) and complement were deposited on the glomerular mesangial region in F1 transgenic mice (a) and wild-type mice at 40 weeks of age. It is the photograph observed by immunofluorescence staining about (b). Magnification is 50x.
  • immunoglobulins IgA, IgG, IgM
  • FIG. 8 is a photograph obtained by observing the deposition of the immune complex in the glomerular mesangial region of a 40-week-old F1 generation transgenic mouse (a) and a wild-type mouse (b) using an electron microscope. Magnification is 2500x.
  • FIG. 9 is a photograph showing the results of a Northern plot in which the expression of human megsin mRNA in each tissue of a transgenic mouse was analyzed. From top to bottom, the results for the kidney, heart, liver, and lung are shown. The photographs of each tissue show the results of lane 1 for wild type, lane 2 for transgenic mice (line A), and lane 3 for transgenic mice (line B). The upper part is the result of Northern plot, and the lower part is a photograph of ethidium-muff stain after RNA electrophoresis.
  • FIG. 10 is a photograph showing the results of immunohistochemical staining of kidney tissues of transgenic mice and wild-type mice. From the top, the results of staining with an anti-type I collagen antibody, an anti-fibronectin antibody, an anti-laminin antibody, and an anti-type IV collagen antibody are shown. The row on the right side of the photo is the result of the transgenic mouse (strain A). BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Example 1 Recombinant gene construct An expression vector that expresses human 'megsin cDNA under the control of CAG Promo Overnight, which is a hybrid of Enhansa 1 and Bird / actin' Promo Overnight 'of CMV, was constructed as follows.
  • a sense primer (B44F: 5'-ATGGATCCGCCGCCATGGCCTCCCTTGCTGCAGCAAATGCAGAG-3 '/ SEQ ID NO: 7) and antisense primer (H30 Using -R: 5, -TATCCTGAGGCAGTGTTAACATGAAG-3 '/ SEQ ID NO: 8), perform PCR on plasmid (pUC-MEGSIN) (WO 99/15652) containing human' megsin cDNA and start codon Immediately before, a fragment of human 'megsin cDNA in which Kozak sequence was substituted was amplified.
  • the plasmid was cut with restriction enzymes BamHI and HindiII, and a 1.2 kb fragment containing the full-length megsin was purified using TaKaRa Blunting Kit (Takara Shuzo). To make blunt ends.
  • pBsCAG-2 (Kawarabayashi T, Shoji M, Sato M, Sasaki A, Ho L, Eckman CB, Prada CM, Younkin SG, Kobayashi T, Tada N, Matsubara E, Iizuka T, Harigaya Y, Kasai K and Hirai S (1996 ) Accumulation of b-amyloid fibrils in pancreas of transgenic mice. Neurobiol. Agin 17, 215-222) was cut with EcoRI to form a linear chain, and the ends were similarly blunted to give alkaline phosphatase.
  • PBsCAG-2 was obtained from pCAGGS (Niwa H, Yamamura K and Miyazaki J (1991) Efficient selection Gene 108, 193-200., CMV Enhancer and Mammalian cell expression vector with chicken actin promoter and heron globin, Yuichi Minei Yoichi ) was inserted into the SalI-Pstl site of plasmid vector pBluescript (registered trademark) II SK (-) (Stratagene) (FIG. 1A).
  • pBsCAG2Megsin was digested with restriction enzymes Scal, Sall, and Notl. After agarose gel electrophoresis, a fragment of about 3.4 kb containing megsin cDNA was cut out and recovered, and used for the production of transgenic mice (Figure IB). o
  • PMSG pregnant horse serum gonadotrobin
  • hCG human placental gonadotropin
  • the pseudopregnancy days of the recipient mice were calculated one day younger than the embryonic days. Judging the number of fetuses from their appearance, spontaneous delivery was performed if the number of fetuses was expected to be 5 or more, and cesarean section was performed if the number of fetuses was 4 or less. Born mice were separated from their parents between 3 and 4 weeks after birth, and housed separately for males and females.
  • CMV-F1 primer-1 (5'- GTC GAC ATT GAT TAT TGA CTA G-3, / SEQ ID NO: 9) and CMV-R1 primer-1 (5, -CCA TAA GGT CAT GTA CTG-3 '/ SEQ ID NO: 10),?
  • -Gl-3 primer (5, -CTT CTG GCG TGT GAC CGG CG-3, / SEQ ID NO: 11) and hM2-2 primer (5,-ATC GAA TTC TGA GAT CAT AAT CCC TGT GGG ATG C-3, / SEQ ID NO: 12), and hM8-1 primer (5,-TTA TTC AGT GGC AAA GTT TCT TGC CCT TGA-3 '/ SEQ ID NO: 13) ?-globinR Primer (5, -TCG AGG GAT CTT CAT AAG AGA AGA G-3, / SEQ ID NO: 14) Using 3 pairs of primers, amplification products can be obtained by PCR with all 3 pairs of primers Individuals were selected. The obtained six F0 generations (three males and three females) were crossed with normal individuals (C57BL / 6N Jcl) to obtain the F1 generation, and the heterogeneous F1s were crossed to obtain F2.
  • Example 4 Expression Analysis of Human Megsin Gene
  • Northern Plot Analysis Northern blot analysis of the human megsin gene was performed as follows. The BglII / BamHI fragment of the vector pBsCAG-2 containing the human megsin gene as an insert was RI-labeled by random DNA labeling and used as a probe. This fragment corresponds to the vector near the poly A signal.
  • Total MA (10 ⁇ g) extracted from mouse kidney mesangial cells was separated on a 1% agarose gel containing 2.2 M formamide and transferred to Nitrocellulose Filler. Filters were hybridized in Rapid Hyb solution (Amersham, Arlington Heights, IL). After hybridization, the plate was washed at 55 ° C with a final stringency of 0.1xSSPE / 0.1% SDS. The mice used in the experiments were transgenic mice.
  • a polyclonal antibody against the megsin protein was produced using a region having low homology to other serpin families and having hydrophilicity as an immunogen. Specifically, the following amino acid sequence was selected as an immunogen from the amino acid sequence constituting human megsin (SEQ ID NO: 2).
  • a peptide having C added to the N-terminus of the above amino acid sequence was synthesized using an automatic synthesizer model 432A (Perkin Elmer, Foster City, CA). Synthetic peptides were purified by reversed-phase HPLC, lyophilized, and used in immunization and competition experiments to confirm immunological specificity. The synthetic peptide was combined with ⁇ chiro globulin (manufactured by Sigma) using N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide (manufactured by Dojindo Laboratories), dialyzed against 0.85% NaCl solution, and adjuvanted ( Difco) and emulsified, and administered subcutaneously to Egret.
  • an automatic synthesizer model 432A Perkin Elmer, Foster City, CA.
  • a second immunization 50 mg / chick was performed, and thereafter, immunization was performed four times (50, 100, 200 zg / chick) every two weeks.
  • the adjuvant was Freund's complete adjuvant only for the first time, and incomplete Freund's adjuvant for the second and subsequent times.
  • the antibody titer of the serum was evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to confirm that the serum obtained by blood collection reacted with the synthetic peptide.
  • Antigen serum serially diluted in a 96-well plate on which 50 ng / well of antigen was immobilized was added at 100 / L to each well to perform a primary reaction.
  • HRP-conjugated goat anti-Peagle IgG was used as a secondary reaction.
  • the antibody was purified by affinity with a Peptide column after diluting Egret serum whose antibody titer was raised by immunization with the megsin protein with PBS (-) and then using a peptide column.
  • the obtained purified antibody was confirmed to react with the megsin protein fusion protein by Western plot, and was proved to be specific to the megsin protein.
  • Example 6 Expression analysis of human 'megsin gene (2) Immunoblot analysis Human megsin protein was subjected to immunoblot analysis as follows. Kidney tissue (10 mg) was used as a sample buffer (0.35 M Tris-HC1 (pH 6.8), 10 ° SDS, 36% glycerol, 5% mercaptoethanol, 0.012 % Promophenol blue) and homogenized in 100/1 and centrifuged at 5000 g for 15 minutes. The proteins in the supernatant are denatured by boiling for 5 minutes, separated by SDS-PAGE on a 10% acrylamide gel, and then electrophoretically analyzed by polyvinylidene fluoride membrane (Bio Rad Laboratories, Hercules, CA).
  • the membrane was blocked once with phosphate buffered saline containing 0.5% Tween 20, 2% serum albumin at 4 ° C., and incubated with a heron anti-human megsin IgG (10 zg / ml). Next, the membrane was washed with PBS containing 0.05% Tween 20 and incubated with 1: 5000 diluted alkaline phosphatase-labeled goat anti-Peagle IgG (Cappel, Durham, NC). P-nitro blue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate solution (Bio Rad Laboratories). As a positive control, maltose-binding protein-megsin fusion protein (MBP-megsin) expressed in E. coli was used.
  • MBP-megsin maltose-binding protein-megsin fusion protein
  • Example 7 Expression analysis of human 'megsin gene (3) Immunohistochemical staining (Immunohistochemist)
  • Kidney tissue was collected from transgenic mice. Kidney tissue was embedded in a frozen tissue embedding medium (0. CT compound II Tissue Tek Miles, Elkhart, IN) and immediately frozen in dry ice Z acetone. Four-millimeter frozen sections were prepared from the frozen embedded tissues. This frozen section was blocked with 4% skim milk at room temperature for 60 minutes, and then was mixed with egret anti-human 'megsin IgG (10 ig / ml) or fluorescein isothiosinate (FITC) diluted 1: 200. Labeled goat anti-mouse IgG, Incubation was performed with either IgA, IgM, or C3 antibody (Cappel) in 4 doses.
  • a frozen tissue embedding medium (0. CT compound II Tissue Tek Miles, Elkhart, IN
  • FITC fluorescein isothiosinate
  • the plate was incubated with a 1:50 diluted peroxidase-labeled anti-perian anti-magpie antibody (Dako, Glostrup, Denmark) for 20 minutes at room temperature, followed by incubation with 3,3'-diaminobenzene containing 0.03% hydrogen peroxide. Color was developed with the Ndidine solution. Thereafter, counterstaining with hematoxylin was performed.
  • the pathological analysis of the F1 generation transgenic mouse obtained in Example 3 was performed. These mice had no apparent change compared to normal mice. The behavior was not different from that of normal mice. Necropsy revealed no significant changes other than the kidney (described below). Observation of tissue sections (HE staining) of major organs revealed no abnormalities other than kidneys.
  • PAS staining of the kidney of each transgenic mouse was used to analyze changes in the area of the mesangial substrate and the number of mesangial cells.
  • F1 hetero
  • F1 hetero
  • Fig. 5 shows the PAS-stained image of the kidney at this time.
  • Typical findings of mesangial cell proliferative nephritis were seen, including glomerular hypertrophy, increased mesangial cells, and increased mesangial matrix.
  • the PAS-stained images were scanned with a 3CCD camera (Olympus, Tokyo, Japan), and the total glomerular size and the number of mesangial cells per glomerulus were measured using software: Image Grabber PCI (Fuji Film, (Tokyo, Japan) and Mac Aspect (Mitani, Tokyo, Japan).
  • the glomerulus size was defined as the area of the region surrounding the outer bundle of capillaries forming the glomerulus. Twenty glomeruli in the middle cortex were identified and measured. Sections containing less than 20 glomeruli were not used for measurements. Of the 20 glomeruli, the largest and the smallest were excluded from the measurement in order to avoid variability in the measured values by the operator.
  • Kidney tissue was fixed by immersion in 0.1 M sodium phosphate buffer containing 2% glutaraldehyde for 2 hours, and post-fixed with 2% osmium tetroxide. The fixed kidney tissue was dehydrated with ethanol and finally embedded in Epon 812 (TAAB, England). Ultrathin sections cut from this sample were stained with peranil acetate, treated with acetone, and analyzed by an electron microscope (JEM-1200EX, JEOL, Tokyo, Japan).
  • Northern blot analysis confirmed overexpression of human megsin mA in transgenic mice ( Figure 9). The transgene was expressed in all tissues, but particularly in the kidney and heart. Expression of human megsin cDNA in transgenic mice began at the pre-implantation stage and continued until 40 weeks of age.
  • Example 11 In order to identify the components of the substrate with increased accumulation of type IV collagen and laminin by immunohistochemical analysis, the following antibodies were used to immuno-tissue-stain a frozen section (Nangaku, M. et. al., J. Am. Soc. Nephrol. 10, 2323-2331, 1999). Type IV collagen and type I collagen were identified using goat anti-type IV collagen polyclonal antibody and goat anti-type I collagen 'polyclonal antibody, respectively (Southern Biotechnology. Birmingham, AL). Five-mouth nectin was confirmed using a perforated anti-fibronectin antibody (Chemicon).
  • FIG. 10 shows the results of staining the kidney using an antibody against the above-mentioned extracellular mesangial matrix component.
  • No accumulation of collagen type I was observed in both wild type and transgenic mice.
  • Transgenic mice showed accumulation of type IV collagen and laminin in the glomeruli.
  • transgenic mice had lower levels of fibronectin than wild-type mice.
  • the increased mesangial matrix was composed of type IV collagen and laminin.
  • megsin is localized in the glomerular mesangial region, but in transgenic mice, megsin expression was observed in all tissues. This is probably because the promoter used for gene transfer had no tissue specificity. According to immunohistological studies, the presence of megsin was observed throughout the host animal, including regions other than the mesangial region of the kidney. However, the effects of overexpression of megsin were limited to mesangium. This knowledge The look is very interesting in that it suggests the presence of a megsin target molecule (megsin 'ligand) localized in mesangium. In other words, the expression of megsin activity may require the presence of a ligand that exists only in this region. In any case, it was found that forced expression of megsin in mesangium resulted in the typical pathology of mesangial proliferative nephritis.
  • megsin target molecule megsin target molecule
  • a model animal of mesangial cell proliferative nephritis by introduction of a megsin gene is provided.
  • the pathological features characteristic of the transgenic animal of the present invention include the point that the cell proliferation and extracellular matrix accumulation in the mesangial and glomerular endothelial cell regions are exhibited in a progressive manner.
  • Such pathological findings support that the model animals of the present invention exhibit a pathology closer to that of human chronic glomerulonephritis. Therefore, it is considered to be useful for elucidating the cause of chronic glomerulonephritis.
  • Such pathological findings have not been confirmed in conventional model animals.
  • model animal of the present invention it is possible to analyze the onset mechanism and pathological condition of mesangial cell proliferative nephritis.
  • the model animal of the present invention is a mesangial cell expansion. It is useful for the development and screening of therapeutic agents for reproductive nephritis, as well as for drug testing.
  • the mesangial cell proliferative nephritis model animal of the present invention is a transgenic animal, a highly uniform model animal can be easily supplied in a large amount, thereby enabling highly accurate experiments. Furthermore, the mesangial cell proliferative nephritis model animal of the present invention showed typical mesangial cell proliferative nephritis accompanied by an increase in the mesangial matrix region, an increase in mesangial cells, and the deposition of an immune complex. In particular, the significance of the present invention in which a model animal faithful to such an actual disease state is provided is extremely large.

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Description

明細 メサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物 技術分野
本発明は、 ェ . ック動物によるメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル 動物に関する , 自景技術
メサンギゥム細胞 (mesangial cel l )は、 腎糸球体の構造および機能の維持に 中心的な役割を果たしている。 またメサンギゥム細胞は、 各種腎炎においても中 心的な病態生理学的意義を有する。 例えばメサンギゥム細胞の増殖、 および細胞 外メサンギゥム基質（extracellular mesangial matrix)の蓄積は、 慢性糸球体 腎炎や糖尿病性腎症のような様々な糸球体疾患の患者の糸球体硬化症の重要な病 理所見である。
一般に病態の解析を進めるうえで、 モデル動物の果たす役割は大きい。 たとえ ば、 c- myc 癌遺伝子が導入された トランスジヱニックマウス （米国特許 5087571) は、 白血病のモデル動物として病態解明に大きく貢献した。 メサンギ ゥム細胞の増殖症状を呈するモデル動物が実現すれば、 様々な糸球体疾患のモデ ルとなることが予測されるが、 現実にはこのようなモデル動物は知られていない ヒ卜の慢性糸球体腎炎は、 腎不全に至る進行性糸球体病変の大きな原因となつ ており、 その動物モデルを利用した病因の解明が待たれている。 メサンギゥム細 胞増殖性腎炎モデル動物の提供は、 メサンギゥム細胞の生物学的性質の解明、 メ サンギゥム細胞に関連する疾患の原因の究明、 ひいては、 メサンギゥム細胞に関 連する疾病の治療薬の探索や検定において重要な実験材料となりうる。 メサンギゥム細胞のマ一カーとしては、 ラットでは Thyl抗原が知られている。 しかしこの遺伝子はメサンギゥム細胞特異的ではないうえ、 ヒトではメサンギゥ ム細胞には発現していない (Miyata T. et al .， Immunology ( 1989) ; 67: 531- 533; Miyata T. et al .， I腿 unology( 1990) ; 69 : 391-395 ) 。 また、 メサンギ ゥム細胞は活性化されるとひ平滑筋ァクチンを発現することが知られているが、 この遺伝子もメサンギゥム細胞特異的ではない。 したがって、 これらの遺伝子を もとにトランスジエニック動物を作製しても、 メサンギゥム細胞増殖性腎炎モデ ル動物は得られないものと推測される。
これまで、 一般的にはマウスにおける腎疾患モデルの作製は難しいとされてい た。 そこで、 しばしば基底膜に対する抗体 （抗 GBM 抗体） を投与する腎炎モデ ルが使用されてきた。 しかしこのモデルは個体間の症状の発現レベルに差を生じ やすく、 またラッ 卜に比べて顕著な病変が得にくいなどの問題があった。
近年になって、 Johnson のグループは抗糸球体抗体の投与による腎疾患モデ ル動物を報告した。 彼らの腎疾患モデル動物は、 重篤な糸球体障害を呈し、 糸球 体半月（crescent)の形成を示す。 しかし、 これらの病態はいずれもヒ トにおけ る急速進行性糸球体腎炎に相応していると考えられる（Ophascharoensuk et al . Kidney Int 54， 416, 1998)。 このため、 よりヒト慢性糸球体腎炎に近い病態を 示すモデル動物の実現が待たれていた。
このような要求に応えるため、 最近では遺伝子操作によるモデル動物の作製が 試みられている。 たとえば、 SV40 によるもの （MacKay et al . Kidney Int 32, 827, 1987) や成長ホルモンによるもの（Doi et al . Am J Pathol 137, 541 , 1990 )が有名であるが、 これらは糸球体硬化が主病変で糸球体における増殖性変 化に乏しい。 ィン夕ーロイキン一 6の遺伝子を導入したトランスジエニックマウ スが腎不全を呈することも知られているが、 主病変は糸球体硬化と尿細管間質障 害である（Fattori et al . Blood 83, 2570, 1994)。 また、 レニンとアンギオテ ンシンの遺伝子を導入したトランスジヱニックマウス（Tsukuba hypertensive mice)は、 糸球体硬化を呈することが知られている（Shimokama et al .Virchows Arch 432, 169, 1998)。 しかしこの障害は高血圧症状によってもたらされるも ので、 やはりヒトにおける糸球体障害のモデル動物とはなりえない。 このように、 メサンギゥム細胞の増殖ゃメサンギゥム基質の増生を伴う、 ヒ卜の糸球体疾患の モデルとなりうるトランスジエニック動物は知られていない。 従来のトランスジ エニックマウスにおける腎病変は、 しばしば他の目的で導入された遺伝子の影響 によって、 いわば偶然の産物として発見されたものが多い。 したがって、 ヒトの 糸球体疾患のモデル動物を得るために、 どのような遺伝子を用いるべきかを示唆 する報告は無かったと言える。
なお本発明者は、 先にメサンギゥム細胞に特異的に発現しているタンパク質と してメグシンを報告している (J. Clin. Invest, 1998 Aug 15, 120:4, 828-36) 。 しかし、 このタンパク質をコードする DNA を導入することによってメサンギゥ ム細胞増殖性腎炎モデル動物を得られることは知られていない。 発明の開示
本発明は、 メサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物と、 その作製方法の提供を 課題とする。 また、 本発明によって得ることができるメサンギゥム細胞増殖性腎 炎モデル動物を用いた治療薬のスクリーニング方法を提供することも、 本発明の 課題である。
前記課題の解決のために、 本発明者はメグシンとそれをコードする DNA に着 目した。 メグシンは、 メサンギゥム細胞に特異的に発現する遺伝子によってコ一 ドされるタンパク質である (J.Clin. Invest, 1998 Aug 15， 120:4, 828-36) 。 ヒ ト ·メグシン、 あるいはラットやマウスにおけるそのホモログは、 本発明者によ つて既にその構造が明らかにされ、 特許出願されている（W0 99/15652)。 しかし メグシンの過剰発現がメサンギゥム細胞にどのような影響を与えるのかについて は明らかにされていなかった。 本発明者は、 メグシンをコードする DNA の導入 によって作製されたトランスジエニックマウスが、 典型的な腎メサンギゥム細胞 増殖性腎炎の症状を呈することを確認した。 すなわち、 約 35-40 週齢を迎えた 前記トランスジエニックマウスの腎糸球体組織では、 メサンギゥム細胞を主体と する著明な細胞増殖、 メサンギゥム基質の増生、 並びに免疫グロブリンや補体か ら成る免疫複合体の沈着亢進が認められ、 分節性の硬化（segmental sclerosis) に陥っていることが観察された。 この観察結果に基づいて、 メグシンをコードす る DNA の導入によって、 メサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物として有用な トランスジエニック動物を作製できることを見出し、 本発明を完成した。 すなわ ち本発明は、 以下のメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物、 このモデル動物の 作製方法と用途に関する。
〔1〕 ヒト ·メグシン、 またはヒト .メグシンと機能的に同等なタンパク質を コードする外来性の DNAを腎メサンギゥム細胞において発現するトランスジ エニック非ヒト動物であるメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物。
〔 2〕 ヒト ·メグシンをコードする DNA が、 配列番号： 1に記載の塩基配列の コード領域からなる 〔1〕 に記載のメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物。
〔3〕 非ヒト動物がマウスである 〔 1〕 に記載のメサンギゥム細胞増殖性腎炎 モデル動物。
〔4〕 ヒト 'メグシン、 またはヒト .メグシンと機能的に同等なタンパク質を コ一ドする DNAと、 この DNAを動物の腎メサンギゥム細胞において発現させ ることができるプロモーターとを含むメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動 物作製用組み換え遺伝子。
〔5〕 次の工程を含む、 メサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物の作製方法。
a ) 動物の受精卵に 〔4〕 に記載の組み換え遺伝子を導入する工程
b ) 工程 a ) の受精卵から発生した初代トランスジエニック動物のうち導入 した外来性遺伝子を保持した個体を選択する工程 〔6〕 更に次の工程 c ) および d ) を含む 〔5〕 に記載のメサンギゥム細胞増 殖性腎炎モデル動物の作製方法。
c ) 工程 b ) で選択した個体と正常動物を交配させて外来性遺伝子をへテロ で保有する F 1動物を得る工程
d ) 工程 c ) で得た F 1動物同士を交配させて外来性遺伝子をホモで保有す る F 2動物を得る工程
〔7〕 次の工程を含む、 メサンギゥム細胞増殖性腎炎に対する候補化合物の治 療効果を評価する方法。
a ) 〔1〕 に記載のメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物に候補化合物を 投与する工程、
b ) 前記モデル動物における腎炎症状の変化を観察する工程
〔8〕 次の工程を含む、 メサンギゥム細胞増殖性腎炎治療用の化合物をスクリ —ニングする方法。
a ) 〔1〕 に記載のメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物に候補化合物を 投与する工程、
b ) 前記モデル動物における腎炎症状の変化を観察する工程
c ) メサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物の腎炎症状を緩和する化合物を 選択する工程
〔9〕 〔8〕 に記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を 主成分として含む、 メサンギゥム細胞増殖性腎炎の治療、 および/または予 防用医薬組成物。
あるいは本発明は、 ヒト ·メグシン、 またはヒト ·メグシンと機能的に同等な タンパク質をコードする DNA と、 この MA を動物の腎メサンギゥム細胞におい て発現させることができるプロモーターとを含む組み換え遺伝子の、 メサンギゥ ム細胞増殖性腎炎モデル動物の作製における使用に関する。 本発明によるメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物は、 公知のトランスジェ ニック動物の作製方法によって得ることができる。 本発明におけるメサンギゥム 細胞増殖性腎炎とは、 腎メサンギゥム細胞の増殖とメサンギゥム基質の増生を伴 ぅ腎疾患を意味する。 このような腎疾患には、 たとえば IgA 腎症、 膜性増殖性 糸球体腎炎、 SLE( systemic lupus erythematosus)腎症、 糖尿病性腎症、 あるい はクリオグロブリン腎症等が知られている。 トランスジエニック動物は、 たとえ ば 「発生工学実験マニュアル」 （野村達次監修、 勝木元也編、 講談社、 1989 年） や、 「新生化学実験講座 ·動物実験法」 （日本生化学会編、 東京化学同人、 1991 年） などに従って作製される。 以下に、 一般的なトランスジエニック動物 の作製プロトコ一ルに従って述べる。
本発明において、 ヒ ト ·メグシンとは、 配列番号： 1に示す塩基配列を持つ DNA によってコードされるタンパク質である。 その推定アミノ酸配列を、 配列番 号： 2に示す。 本発明のトランスジエニック動物は、 ヒト ·メグシンのみならず、 ヒト ·メグシンと生物学的に同等な機能を有するタンパク質をコードする DNA を導入したものであることができる。 このようなタンパク質としては、 たとえば 他の種におけるメグシンのホモログを示すことができる。 メグシンのホモ口グに は、 たとえばラヅ ト ·メグシン、 そしてマウス ·メグシンの構造が本発明者によ つて明らかにされている。 ラットメグシンの塩基配列、 並びにアミノ酸配列を配 列番号： 3、 および配列番号： 4に、 そしてマウス ·メグシンの塩基配列、 並び にアミノ酸配列を配列番号： 5、 および配列番号： 6に示す。
また、 一般に、 真核生物の遺伝子はヒトインターフヱロン遺伝子で知られてい るように多形現象を示すことが多い。 この多形現象によって、 アミノ酸配列に 1 個あるいはそれ以上のアミノ酸の置換を生じても、 通常タンパク質の活性は維持 される。 また一般に、 1個または数個のアミノ酸の改変では、 タンパク質の活性 は維持される場合が多いことが知られている。 従って、 配列番号： 2、 配列番 号： 4、 および配列番号： 6のいずれかに示されるアミノ酸配列を人工的に改変 したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子は、 該タンパク質が腎 メサンギゥム細胞増殖性腎炎をもたらす限り、 すべて本発明に利用することがで きる。 以下、 ヒト、 ラット、 あるいはマウスに由来するメグシンと、 その生物学 的に同等な機能を有するタンパク質を総称してメグシン類と記載する。 なおメグ シン類としてマウスに由来するメグシンをコードする MA をマウスに導入する 場合であっても、 人為的に導入したマウスに由来する DNA は外来性の DNA であ る。 しかしながら、 本発明によるトランスジエニック動物をメサンギゥム細胞増 殖性腎炎のモデル動物として、 ヒ卜における治療剤に有用な化合物のスクリー二 ングを行うには、 ヒト ·メグシンの DNA を用いるのが有利である。 トランスジ エニック動物の体内でヒト ·メグシンに対する影響を、 より忠実に反映できる可 能性が期待できるためである。
また、 アミノ酸に対するコドンはそれ自体公知であり、 その選択も任意でよく、 例えば利用する宿主のコ ドン使用頻度を考慮して常法に従い決定できる [Grantham, R. et al. Nucleic Acids Res. 9， r43 ( 1981 )] 。 従って、 コ ド ンの縮重を考慮して、 DNAを適宜改変したものもまた本発明の DMに含まれる。 さらに、 これら核酸配列のコドンの一部改変は、 常法に従い、 所望の改変をコー ドする合成ォリゴヌクレオチドからなるプライマ一を利用した部位特異的変位導 ( sitespecif ic mutagenesis ) [Mark, D.F. et al . Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.A. 81, 5662 ( 1984)] 等に従うことができる。
更に、 配列番号： 1、 配列番号： 3、 および配列番号： 5のいずれかに記載の 塩基配列を含む DNA とハイブリダィズすることができ、 かつその DNA によって コードされるタンパク質が腎メサンギゥム細胞増殖性腎炎をもたらす限り、 その DNAは本発明による DNAに含まれる。 ストリンジェントな条件下で特定配列にハ イブリダィズすることができる配列は、 特定配列がコードするタンパク質と類似 した活性を持つものが多いと考えられる。 ストリンジェントな条件とは、 洗浄の ための条件として通常 「lxSSC、 0.1% SDS、 37°C」 程度、 より厳しい条件として は 「0.5xSSC、 0.1¾ SDS、 42°C」 程度、 さらに厳しい条件として 「0.1xSSC、
0.1% SDS、 55°C」 程度を示すことができる。 加えて、 本発明におけるメグシン 類をコードする DNA は、 トランスジエニック動物に腎メサンギゥム細胞増殖性 腎炎をもたらす限り、 その断片を利用することもできる。
本発明においてトランスジエニック動物の作製に用いられるメグシン類をコー ドする MA は、 本明細書に開示した塩基配列に基づいて公知の方法により得る ことができる。 たとえば、 メサンギゥム細胞の cDNA ライブラリーを配列番号：
1、 配列番号： 3、 あるいは配列番号： 5に示した塩基配列からなる DNA をプ ローブとしてスクリーニングすることにより、 メグシン類をコードする cDNA の 単離が可能である。 またこの cDNA ライブラリ一を錡型として、 配列番号： 1、 配列番号： 3、 あるいは配列番号： 5に示した塩基配列に基づいて設定したブラ イマ一を用いて PCR を行うことによって、 メグシン類をコードする DNA を増幅 することができる。 増幅生成物は、 公知の方法に基づいてクローニングする。 メグシン類をコードする DNA は、 この遺伝子を導入すべき動物の細胞におい て発現可能なプロモ一夕一に連結した組み換え遺伝子コンストラクトとするのが 有利である。 本発明の組み換え遺伝子コンストラクトは、 適当な宿主を利用して クロ一ニング可能なベクタ一に、 前記メグシン類をコードする DNA と、 その上 流にプロモー夕一とを挿入し、 クロ一ニングすることによって構築することがで きる。 本発明に利用することができるプロモ一夕一としては、 マウスやラットな ど、 幅広い脊椎動物で外来遺伝子の発現を誘導できるニヮトリ ?ァクチン ·プロ モーターを示すことができる。
また、 外来遺伝子の発現を増強するために、 ェンハンサーを組み合わせること ができる。 たとえば、 CMV に由来するェンハンサ一は、 哺乳動物における外来遺 伝子の発現を増強することが知られている。
これらの遺伝子から構成される組み換え遺伝子コンストラク卜の構築にあたり、 ェンハンサ一とプロモーターを備え、 更にその下流に外来遺伝子挿入用のマルチ クローニングサイ トを配置したベクターを用いることができる。 このような構造 を持つベクターは、 たとえば pCAGGS(Niwa H, Yamamura K and Miyazaki J ( 1991 ) Efncient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108, 193- 200. )等をもとに実施例に示すような 方法によって構築することができる。 このべクタ一は、 マルチクローニングサイ 卜の下流にゥサギ 5グロビン ·夕一ミネ一夕一が配置されており、 挿入された外 来遺伝子の発現効率の向上に貢献する。
適当な制限酵素によつて前記べク夕一から切り出した組み換え遺伝子コンスト ラクトは、 十分に精製されトランスジエニック動物の作製に用いられる。 トラン スジエニック動物は、 未受精卵、 受精卵、 精子およびその始原細胞を含む胚芽細 胞などに、 前記コンストラクトを導入することによって作製される。 コンストラ クトを導入する細胞としては、 非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階、 よ り具体的には単細胞あるいは受精卵細胞の段階で、 通常 8細胞期以前のものが利 用される。 コンストラクトの導入方法としては、 リン酸カルシウム法、 電気パル ス法、 リポフエクシヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーテイク ルガン法、 D E A E—デキストラン法等が公知である。 さらに、 こうして得られ た形質転換細胞を上述の胚芽細胞と融合させることにより トランスジエニック動 物を作製することもできる。
コンストラクトを導入する細胞は、 トランスジエニック動物の作製が可能なあ らゆる非ヒト脊椎動物に由来する細胞であることができる。 具体的には、 マウス、 ラット、 ハムスター、 モルモット、 ゥサギ、 ャギ、 ヒヅジ、 ブ夕、 ゥシ、 ィヌ、 あるいはネコ等の細胞を利用することができる。 たとえばマウスにおいては、 排 卵誘発剤を投与したメスのマウスに正常なォスのマウスを交配させることにより、 コンストラクトの導入が可能な受精卵を回収することができる。 マウス受精卵で は、 一般に雄性前核へのマイクロインジェクションによりコンストラクトが導入 される。 コンストラクトを導入した細胞は、 体外での一晩程度の培養の後、 導入 に成功したと思われるものが代理母の卵管に移植され、 トランスジヱニックキメ ラ動物が誕生する。 代理母には、 精管を切断したォスと交配させて偽妊娠状態と したメスが利用される。
生まれたトランスジエニックキメラ動物は、 その体細胞の遺伝子を解析するこ とによって、 ゲノムに外来遺伝子 （メグシン類をコードする DNA) が組み込まれ ていることを確認した上で、 F 1動物の誕生のために正常な動物と交配させる。 このとき、 望ましくは、 より多くのコピー数を持つ個体を選択するようにする。 一般にコンストラクトとして導入した外来性の DNA は、 ゲノムの同一の部分に 複数コピーが直列に組み込まれる。 通常はこの組み込みコピー数が多いほど、 多 量の遺伝子発現につながり、 より明瞭な発現型が期待できるためである。 体細胞 ゲノムにおいて、 外来遺伝子 （メグシン類をコードする DNA) が正しい方向で組 み込まれていることは、 コンストラク卜に特異的なプライマ一を用いた PCR に よって確認することができる。 また、 ドッ トプロット法によって、 コピー数の相 対的な比較が可能である。
この交配の結果誕生する F 1動物の中で、 体細胞に外来遺伝子 （メグシン類を コードする DNA) を備えるものは、 ヘテロザィゴート（heterozygote )ながら生殖 細胞に外来遺伝子 （メグシン類をコードする DNA) を伝えることができるトラン スジエニック動物である。 したがって、 F 1動物の中から体細胞に外来遺伝子 (メグシン類をコードする DNA) を保持するものを選び、 これらを両親とする F 2動物を誕生させることができれば、 外来遺伝子 （メグシン類をコードする DNA) をホモで保持するホモザィゴート動物（homozygote animal )が F 2動物と して得られる。
本発明の腎メサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物には、 メサンギゥム細胞で 外来性のメグシン類の DNA を発現するものである限り、 これらトランスジェニ ック動物のいずれの世代であっても、 利用することができる。 たとえば、 メグシ ン類の DNA をへテロで保持するトランスジエニック動物であっても、 この外来 性のメグシン類がメサンギゥム細胞で発現すれば、 腎メサンギゥム細胞増殖性腎 炎モデル動物として有用である。
なお本発明においては、 外来性のメグシン類の MA を、 少なくともメサンギ ゥム細胞で発現させることができれば、 腎メサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動 物とすることができる。 したがって、 外来性のメグシン類の DNA を、 必ずしも 腎特異的に発現させなくてもよい。 たとえば実施例に示すように、 ヒトメグシン を全身性に発現するトランスジエニックマウスであっても、 著明な腎メサンギゥ ム細胞増殖性腎炎症状を得ることができる。
トランスジエニック動物が腎メサンギゥム細胞増殖性腎炎の症状を呈している ことは、 次のような指標を観察することによって確認することができる。 たとえ ば、 腎臓組織の PAS 染色により、 メサンギゥム細胞数ゃメサンギゥム基質の面 積を観察し、 増殖性糸球体腎炎の程度をスコア—化することができる。 具体的に は、 次のような病理所見が、 本発明のトランスジエニック動物に典型的な所見と して例示される。 すなわち、 約 35-40 週齢を迎えた本発明によるトランスジェ ニックマウスの腎糸球体組織では、 メサンギゥム細胞を主体とする著明な細胞増 殖、 メサンギゥム基質の増生、 並びに補体、 免疫グロブリンから成る免疫複合体 の沈着が認められ、 分節性の硬化（segmental sclerosis)に陥っていることが観 察される。
本発明のトランスジエニック動物による腎メサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル 動物は、 メサンギゥムおよび糸球体内皮細胞領域の細胞増殖と細胞外基質の蓄積 を慢性進行性に呈し、 明確な腎メサンギゥム細胞増殖性腎炎の症状を有する。 ま た、 腎炎誘発剤の注射や手術など、 他の方法により作製したモデル動物に比べ、 モデル動物を調製するための手間がかからず、 均一な個体を多数供給することが できる点でも優れている。 従って、 本発明のモデル動物は、 腎メサンギゥム細胞 増殖性腎炎の病態解明や、 治療薬開発のための大規模な薬剤スクリーニングに有 用である。 本発明のメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物を利用して、 メサンギゥム細 胞増殖性腎炎に対する候補化合物の治療効果を評価することができる。 本発明に よる評価方法は、 以下の工程によって実施される。
a ) 本発明によるメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物に候補化合物を投与す る工程、
b ) 前記モデル動物における腎炎症状の変化を観察する工程
また本発明のメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物を利用して、 メサンギゥ ム細胞増殖性腎炎治療用化合物のスクリーニングを実施することができる。 本発 明によるスクリ一ニング方法は、 次の工程によって実施される。
a ) 本発明によるメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物に候補化合物を投与す る工程、
b ) 前記モデル動物における腎炎症状の変化を観察する工程
c ) 候補化合物を投与したモデル動物の腎炎症状を緩和する化合物を選択するェ 程
本発明の評価方法、 あるいはスクリーニング方法において、 腎炎症状は、 腎臓 組織の病理所見、 あるいは、 メグシン類の発現レベルを調整する活性を期待する 場合には、 メサンギゥム細胞におけるメグシン類の mRNAやタンパク質レベルの 測定結果を指標として有効性の評価が行われる。 腎臓組織の病理所見は、 たとえ ば実施例に示すようなスコア一化方法によって、 そのレベルを比較することがで きる。 一方 mRNA は、 配列番号 ： 1などに記載されたメグシン類をコードする DNA の塩基配列に基づいて設定されたプローブやプライマ一を用いて、 公知の方 法にしたがって測定することができる。 またメグシン類のタンパク質レベルを測 定するには、 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に対する抗 体を用いたィムノアヅセィによって評価することができる。
したがって、 候補化合物を投与する前後で、 これらの指標の観察結果を比較す ることにより、 候補化合物の治療薬としての有効性を評価することができる。 あ るいは、 同系のトランスジエニック動物を用いれば、 動物の間でこれらの指標の 観察結果を比較することによって、 候補化合物間の有効性を比較することもでき る。
本発明のスクリーニングに用いる候補化合物としては、 例えば、 天然または合 成化合物、 各種有機化合物、 天然または合成された糖類、 タンパク質、 ペプチド、 遺伝子ライブラリ一の発現産物、 細胞抽出物、 あるいは菌体成分などを挙げるこ とができる。 この他、 メグシン類の発現を制御するアンチセンス核酸や、 メグシ ン類の活性抑制が期待される抗メグシン類抗体を候補化合物とすることもできる これらの候補化合物は、 メサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物に、 経口的に、 あるいは非経口的に投与される。
本発明のスクリーニング方法によって選択された候補化合物は、 更に安全性や 安定性などを試験したうえで、 メサンギゥム細胞増殖性腎炎のための治療用、 お よび/または予防用医薬組成物の主成分とすることができる。 本発明の医薬組成 物は、 公知の製剤学的製造法により製剤化して投与することができる。 また主成 分である化合物自体を直接投与することもできる。 製剤化する場合は、 例えば、 薬剤として一般的に用いられる媒体または担体と適宜組み合わせて投与すること ができる。
また、 該化合物が MA によりコードされうるものであれば、 該 DNA を遺伝子 治療用ベクターに組み込み、 遺伝子治療を行うことも考えられる。 投与は、 例え ば、 動脈内注射、 静脈内注射、 鼻腔内投与、 気管支内投与、 筋肉内投与、 皮下投 与、 経口投与、 患部への直接投与などの方法で行うことができる。 投与量は、 患 者の体重、 年齢、 健康度、 あるいは投与方法などの条件によって変動するが、 当 業者であれば適宜適当な投与量を選択することができる。
すなわち、 たとえば本発明のメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物において、 腎炎症状の緩和効果を、 様々な投与量の間で比較することにより有効濃度が決定 される。 そして、 上記のような各投与ルートによって、 メサンギゥム細胞におけ る投与化合物の濃度がその有効濃度に達するような投与量を経験的に決定する。 一般的な投与形態においては、 有効成分が全身に分布するものとして、 体重 1 kg 当たりの投与量を決定する。 実験動物における薬物動態の解析結果に基づい て腎移行性が高いと考えられる化合物であれば、 投与量をより低く設定すること ができる。
本発明の医薬組成物は、 決定された投与量と投与形態とを考慮して、 媒体や担 体と配合される。 必要な投与量を達成することができるように有効成分を配合す ることは、 当業者が通常行っている。 本発明による医薬組成物の投与量は、 体重 lkg あたり通常 l〃g— 10mg、 より一般的には 10 zg- lmg とすることができる。 また、 注射剤の場合は経口投与の 100 分の 1程度を投与量の目安とすることが できる。 さらに特殊な製剤設計を施すことにより、 投与量を調整することができ る。 例えば、 本発明の医薬組成物は、 適当な担体に保持することによって徐放化 製剤とすることもできるが、 このような製剤においては、 高い血中濃度を維持す ることができるので、 配合量を低く設定することができる。
本発明のメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物には、 治療や予防に用いるこ とができる化合物のスクリーニングのほかにも、 次のような用途に有用である。 まず、 食餌療法に代表される生活習慣の改善の指針を検討するための材料とする ことができる。 あるいは、 ヒトの糸球体腎炎と病理像が良く似ていることから、 腎炎の病態解析に用いることができる。 更に、 本発明のトランスジエニックマウ スがおよそ 35-40 週齢で糸球体腎炎の症状を自然発症することを利用して、 糸 球体腎炎の発症における遺伝的素因と環境因子の関連を明らかにするための実験 材料としても有用である。 図面の簡単な説明 図 1は、 組み換え遺伝子コンス トラク トの構築図を示す図である。 Aは pBsCAG-2の構造を示す。 Bは pBsCAG2/Megsin、 および卵へのマイクロインジェ クシヨンに用いた DNA断片の構造を示す。
図 2は、 トランスジエニックマウスの腎メサンギゥム細胞におけるヒト ·メグ シン遺伝子の発現を解析したノーザンブロッ卜の結果を示す写真である。 レーン 1、 3がレーン 2、 4の非トランスジエニック同腹仔、 レーン 2、 および 4がト ランスジエニックマウス、 レーン 5は野生型のものである。 各レーンのトランス ジエニックマウスの系統は、 以下に示すとおりである。 レーン 1、 2は、 系統 A、 レーン 3、 4は系統 B、 レーン 5は野生型。
図 3は、 トランスジエニックマウスの腎臓組織におけるヒト ·メグシンタンパ ク質の発現を抗ヒトメグシンべプチド抗体を用いたィムノブロッ卜で解析した結 果を示す写真である。 レーン 1は大腸菌で発現させたマルト一ス結合タンパク 質 'メグシン融合タンパク質 （陽性対照） 、 レーン 2、 および 4は野生型マウス の腎臓、 レーン 3、 および 5はトランスジエニックマウス （それぞれ系統 A、 お よび B ) の腎臓についての結果である。
図 4は、 F1 世代トランスジエニックマウス（a)、 および、 野生型マウス（b)の 腎臓においてヒト ·メグシン遺伝子産物を抗ヒトメグシンべプチド抗体を用いた 免疫組織染色 （ィムノヒストケミスト） により検出した結果を示す写真である。 倍率は 16倍 （挿入図については 50倍） 。
図 5は、 正常マウスおよびメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデルマウスの腎臓の PAS 染色像を示す写真である。 「Wild type littermatej は野生型、 「Megsin Tg/+j はメグシントランスジエニックマウス （ 「ヘテロ」 ） の腎臓切片である。 図 6は、 糸球体の大きさ（a)、 および糸球体あたりのメサンギゥム細胞の数 (b)を、 野生型マウス 25匹、 およびトランスジエニックマウス 19匹について測 定した結果を示す図である。 トランスジエニックマウスについての測定値のうち、 〇（open circle)は野生型マウスの平均値 + 2SD という基準以下のものを表し、 • (close circle)はこの基準を超えるものを表す。
図 7は、 免疫グロブリン （IgA， IgG, IgM) や補体から成る免疫複合体の糸球 体メサンギゥム領域への沈着を 40 週齢目の F1 世代トランスジエニックマウス (a)、 および野生型マウス（b)について免疫蛍光染色により観察した写真である。 倍率は 50倍。
図 8は、 40 週齢目の F1 世代トランスジエニックマウス（a)、 および野生型マ ウス（b)における、 免疫複合体の糸球体メサンギゥム領域への沈着を電子顕微鏡 により観察した写真である。 倍率は 2500倍。
図 9は、 トランスジエニックマウスの各組識におけるヒトメグシン mRNA の発 現を解析したノーザンプロットの結果を示す写真である。 上から順に、 腎臓、 心 臓、 肝臓、 そして肺の結果を示す。 各組織の写真は、 レーン 1が野生型、 レーン 2がトランスジエニックマウス （系統 A) 、 レーン 3がトランスジエニックマウ ス （系統 B) の結果である。 上段がノーザンプロットの結果、 下段が RNA電気泳 動後のェチジゥムブ口マイ ド染色の写真である。
図 1 0は、 卜ランスジヱニックマウス及び野生型マウスの腎臓組織の免疫組識 染色法による観察結果を示す写真である。 上から順に、 抗 I型コラーゲン抗体、 抗フイブロネクチン抗体、 抗ラミニン抗体、 そして抗 IV型コラーゲン抗体によ る染色結果を示す。 写真右側の列がトランスジヱニックマウス （系統 A) の結果 ^あ 。 発明を実施するための最良の形態
以下本発明を実施例として更に具体的に説明するが、 本発明は該実施例に限定 されるものではない。
[実施例 1 ] 組み換え遺伝子コンストラクト CMV のェンハンサ一と二ヮトリ/?ァクチン 'プロモ一夕一のハイプリッ ドであ る CAGプロモ一夕一の制御下にヒト 'メグシン cDNAを発現する発現ベクターを 以下のように構築した。 まず、 ヒト ，メグシンの開始コドンの直前の塩基配列を Kozak 配列 （ GCCGCC ) に置換するため、 センスプライマ一 （ B44F ： 5' - ATGGATCCGCCGCCATGGCCTCCCTTGCTGCAGCAAATGCAGAG-3' /配列番号： 7 ) およびァ ンチセンスプライマー （ H30-R ： 5， -TATCCTGAGGCAGTGTTAACATGAAG-3' /配列番 号： 8 ) を用いて、 ヒト 'メグシン cDNAを含むプラスミ ド （pUC-MEGSIN) (WO 99/15652) を錡型に PCR を行い、 開始コドン直前が Kozak配列に置換されたヒ ト 'メグシン cDNAの 5，断片を増幅した。 pUC-MEGSINを制限酵素 BamHIおよび Hpalで切断し、 メグシン cDNA の開始コドンを含む約 180bpの断片を取り除き、 PCR で得られた断片を挿入して、 Kozak 配列に置換されたヒ ト ·メグシン cDNA を持つプラスミ ドを構築した。
大腸菌 JM109 に形質転換しクロ一ニングした後、 プラスミ ドを制限酵素 BamHIおよび Hindi I Iで切断し、 得られたメグシン全長を含む 1.2kbの断片を精 製し、 TaKaRa Blunting Kit (宝酒造製） を用いて平滑末端化した。 pBsCAG- 2(Kawarabayashi T, Shoji M, Sato M, Sasaki A, Ho L, Eckman CB, Prada C-M, Younkin SG， Kobayashi T， Tada N, Matsubara E， Iizuka T， Harigaya Y, Kasai K and Hirai S ( 1996 ) Accumulation of b-amyloid fibrils in pancreas of transgenic mice. Neurobiol. Agin 17， 215-222)を EcoRI によ り切断して直鎖にした後、 同様に末端を平滑化し、 アルカリフォスファタ一ゼ
(宝酒造製） により脱リン酸化処理を行った。 このプラスミ ドに上記の 1.2kb の断片をライゲ一シヨンして組換えプラスミ ドを作製し、 大腸菌 JM109 に形質 転換しクロ一ニングした。 挿入されたヒト MEGSIN cDNA の方向性が chicken beta- actin promoter と同じクローンをシークェンシングにより選抜し、 この組 換えプラスミ ドを pBsCAG2Megsin とした （図 1 B ) 。 なお、 pBsCAG-2 は、 pCAGGS ( Niwa H, Yamamura K and Miyazaki J ( 1991 ) Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108, 193-200. , CMVェンハンサ一およびニヮトリ ?ァクチン ·プロモーターおよ びゥサギ ?グロビン ·夕一ミネ一夕一を持つ哺乳動物細胞発現べクタ一） の Sall-Pstl 断片を プラスミ ドベクタ一 pBluescript (登録商標） I I SK (-) (Stratagene社） の Sal l-Pstl部位に組込んで作製された （図 1 A) 。
pBsCAG2Megsinを制限酵素 Scal、 Sal l、 および Notlで切断し、 ァガロースゲ ル電気泳動後、 メグシン cDNAを含む約 3.4kbの断片を切り出して回収し、 トラ ンスジエニックマウスの作製に使用した （図 I B ) o
[実施例 2 ] トランスジエニックマウスの作製
ィンジェクシヨンの 3日前夕方に PMSG (妊馬血清ゴナドトロビン） を 8-20週 齢の雌マウス （C57BL/6 と C3Hの F1) に腹腔投与し、 その 2日後の夕方に hCG (ヒト胎盤性ゴナドトロピン） を腹腔投与した。 これにつづき、 8-20 週齢の雄 マウス（C57BL/6 )を 1匹ずつゲージに入れ交配を開始した。 交配の翌日の午前中 に膣栓の検査を行い、 膣栓が確認できた雌マウスを頸椎脱曰により屠殺後、 輸卵 管を単離し、 ヒアルロニ夕一ゼ添加した Whitten培養液に移した。 実体顕微鏡 下で卵を排出させ、 受精卵の分離 ·洗浄を行った。
微分干渉装置 （ノマルスキー装置） 付きの倒立顕微鏡に、 マニピュレータを組 み合わせたシステムを用い、 穴あきスライ ドグラス上の培養液滴に 5-30個の受 精卵を移動し、 一つの受精卵あたり約 2, 000 コピーの上記で調製した DNA断片 を含む 2 piの DNA溶液を雄性前核にマイクロインジヱクシヨンした。 DNA注入 が終了した卵は、 卵管に移植するまで培養した。 移植部位は胚の発生段階で異な り、 1-2細胞期の胚は卵管内へ、 8細胞期-胚盤胞期の胚は子宮内へ移植した。 胚移植操作に先立ち、 レシピエントメスの黄体の活性化処理を行い、 偽妊娠を 誘起させた。 すなわち、 発情前期のメスを精管結紮したォスと不妊交尾させた。 移植胚の出産予定日は、 レシピエントメスの膣栓のついた日を第 1日とし、 第 20 日目として計算した。 卵管内へ移植する場合は、 1細胞期および 2細胞期の 胚とも、 ネンブ夕一ル麻酔下で偽妊娠一日目のレシピエントマウスの卵管内に実 体顕微鏡下で移植した。 片側卵管あたり 10個程度の胚を移植した。 子宮内に移 植する場合は、 体外培養によって桑実胚期から胚盤胞期まで発生させた胚を、 ネ ンブタール麻酔下の偽妊娠を誘起しておいたレシピエントマウスの子宮内に移植 した。 レシピエントマウスの偽妊娠日齢は胚の日齢よりも 1日若く計算した。 外 見から胎仔の数を判断し、 胎仔の数が 5匹以上と予想された場合は自然分娩、 4 匹以下ならば帝王切開を行った。 生まれたマウスは、 生後 3—4週の間に親から 離し、 雌雄を分けて飼育した。
[実施例 3 ] トランスジエニックマウスの選択
生後 4週齢以降に尾の一部を切断し、 キット （Qiagen tissue kit; Qiagen 社） を用いてゲノム DNAを抽出した。 これを錶型にして、 導入遺伝子断片の PCR による増幅を行った。 増幅には、 CMV-F1 プライマ一 （5' - GTC GAC ATT GAT TAT TGA CTA G-3，/配列番号： 9 ) と CMV-R1 プライマ一 （5，- CCA TAA GGT CAT GTA CTG-3' /配列番号： 1 0 ) 、 ? -gl-3 プライマ一 （5，- CTT CTG GCG TGT GAC CGG CG-3，/配列番号： 1 1 ) と hM2-2 プライマ一 （5，- ATC GAA TTC TGA GAT CAT AAT CCC TGT GGG ATG C-3， /配列番号： 1 2 ) 、 および hM8- 1 プライマ一 （5，- TTA TTC AGT GGC AAA GTT TCT TGC CCT TGA-3' /配列番号 : 1 3 ) と/? - globinR プライマ一 （5，-TCG AGG GAT CTT CAT AAG AGA AGA G-3， /配列番号： 1 4 ) の 3対のプライマーを用い、 3対のプライマーによる PCR の全てで増幅産物が得 られる個体を選別した。 得られた F0 世代 6個体 （雄 3個体、 雌 3個体） を、 正 常個体 (C57BL/6N Jcl )と交配させ F1 世代を得、 さらにへテロの F1 同士を掛け 合わせて F2を得た。
[実施例 4 ] ヒト ·メグシン遺伝子の発現解析 ( 1 ) ノーザンプロット解析 ヒト ·メグシン遺伝子のノーザンブロヅト解析を、 以下のようにして行った。 ヒ ト · メグシン遺伝子をィンサ一トとして含むベクタ一 pBsCAG- 2 の Bgl I I/BamHI断片をランダム DNAラベリングによって RI標識し、 プローブとした。 この断片はべクタ一の poly A シグナル近辺に相当する。 マウスの腎メサンギゥ ム細胞から抽出した全 MA (10〃g) を、 2.2Mホルムアミ ドを含む 1%ァガロース ゲルで分離し、 ニトロセルロースフィル夕一へ転写した。 フィルターを Rapid Hyb溶液 （Amersham社， Arlington Heights, IL) 中でハイブリダィズさせた。 ハイブリダィズ後に、 55°Cで、 0.1xSSPE/0.1%SDS という最終ストリンジェンシ 一で洗浄した。 実験に用いたマウスは、 トランスジエニックマウスとして A卜 14
(キメラ） 、 および F1- 18 ( F 1 ) を、 また正常マウス （非トランスジエニック マウス） として Al-11 (A卜 14の同腹子） 、 および Fl-19 ( F 1 ) の 4匹である。 陰性対照 (N. ）には形質転換していない正常マウス（C57BL/6)を用いた。
得られた結果を図 2に示した。 トランスジエニックマウスの腎メサンギゥム細 胞において、 外来遺伝子であるヒト ·メグシン遺伝子が発現していることが確認 できた （レーン 2、 および 4 ) 。
[実施例 5 ] 抗ヒト 'メグシン抗体の製造 ·精製
他のセルピンフアミリーとの相同性が低く、 かつ親水性を有する領域を免疫原 として利用し、 メグシンタンパク質に対するポリクローナル抗体を製造した。 具 体的には、 ヒト ·メグシンを構成するアミノ酸配列 （配列番号： 2 ) から、 次の アミノ酸配列を免疫原として選択した。
N末端からの位置： 72-86
アミノ酸配列： SQSGLQSQLKRVFSD
配列番号： 1 5
ぺプチド名 ： P2
上記アミノ酸配列の N 末端に C を付加したペプチドを、 自動合成装置モデル 432A(Perkin Elmer, Foster City, CA)で合成した。 合成ペプチドは逆相 HPLC で精製後、 凍結乾燥して、 免疫および、 免疫学的特異性の確認のための競合実験 に用いた。 合成ペプチ ド と ゥ シチ ロ グロ ブ リ ン （ シ グマ社製） を N-(6- maleimidocaproyloxy) succinimide (同仁化学研究所製） を用いて結合させ、 0.85%NaCl溶液にて透析後、 アジュバント （D if co製） と充分混和 し乳化させ、 ゥサギ皮下に投与した。 初回免疫 （20 /g /羽） 後 3週間後に 2 回目 （50〃g/羽） の免疫を行い、 以後 2週間毎に 4回免疫 （50、 100、 200 zg/羽） を行った。 アジュバントは初回のみフロインド完全アジュバン 卜で、 2回目以降はフロインド不完全アジュバントを用いた。 41日後、 55日 後、 採血で得た血清が合成ペプチドと反応することを確認するため、 血清の抗体 価を酵素免疫測定法 （ELI SA) により評価した。 抗原 50ng/well を固相化 した 96穴プレートに連続的に希釈した抗血清を各ゥエルに 100 /L加えて一 次反応を行い、 洗浄後、 二次反応として HRP結合ャギ抗ゥサギ I gG (カツべ ルプロダクト製） を反応させた。 洗浄後、 基質としてオルトフエ二レンジァミン (和光純薬製） を用い発色させ吸光度 492nmで測定し、 抗体価が上昇してい ることを確認した。
メグシンタンパク質の合成ペプチド P2に対するポリクロ一ナル抗体は、 公知 の方法 （細胞工学別冊 実験プロトコールシリーズ 抗ペプチド抗体実験プロ ト コール、 秀潤社） に従ってィムノアフィニティクロマトグラフィーにより精製し た。 操作は、 次のとおりである。 合成ペプチ ドを FMP (2-fluoro-l- methylpyridinium toluene-4-sulfonate) 活性化セル口ファイン （生化学工業 製） に固定化し、 ァフィ二ティ一カラムを作製した。 抗体は、 メグシンタンパク 質を免疫し抗体価の上昇したゥサギ血清を PB S (-) で希釈したのち、 ぺプチ ドカラムを用いてァフィ二ティー精製した。 得られた精製抗体はウエスタンプロ ットによりメグシンタンパク質融合タンパク質と反応することを確認し、 メグシ ンタンパク質に特異的であることを証明した。
[実施例 6 ] ヒト 'メグシン遺伝子の発現解析 (2) ィムノブロット解析 ヒト ·メグシンタンパク質のィムノブロット解析を、 以下のようにして行った 腎臓組織 （10mg) をサンプルバッファー （0.35M トリス- HC1 (pH 6.8)、 10° SDS、 36% グリセロール、 5% メルカプトエタノール、 0.012% プロモフエノ ールブルー） 100 / 1 中でホモジナイズし、 5000 gで 15分間遠心した。 上清中の タンパク質を 5分間煮沸して変性させ、 10% アクリルアミ ドゲル上で SDS-PAGE によ り分離したのち、 電気泳動的にポリ フ ッ化ビ二リデン膜 （Bio Rad Laboratories, Hercules, CA) に移した。 この膜を 0.5% Tween 20、 2% ゥシ血 清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水により 4°Cで一晚ブロッキングし、 ゥ サギ抗ヒト ·メグシン IgG (10 zg/ml) とインキュベートした。 次に、 この膜を 0.05% Tween 20を含む PBSで洗浄したのち、 1 :5000に希釈したアルカリフォス ファタ一ゼ標識ャギ抗ゥサギ IgG (Cappel 社、 Durham, NC) とインキュベート し、 p—二 卜 ロ ブソレー塩ィ匕テ 卜 ラゾ リ ゥム ( p-nitro blue tetrazolium chloride) /5-ブロモ -4-クロ口- 3-ィンドリルリン酸 (5-bromo-4-chloro-3- indolyl- phosphate) 溶液 (Bio Rad Laboratories) で発色させた。 陽性対照と して、 大腸菌で発現させたマルト一ス結合タンパク質 ·メグシン融合タンパク質 (MBP-メグシン） を用いた。
図 3に示すように、 トランスジエニックマウスの腎臓においてヒト ·メグシン タンパク質が発現していることが確認できた （レーン 3、 および 5 ) o
[実施例 7 ] ヒト 'メグシン遺伝子の発現解析 （3 ) 免疫組織染色 （ィムノヒス トケミスト）
トランスジヱニックマウスから腎臓組織を採取した。 腎臓組織は、 凍結組織包 埋剤 (0. C. T. compoundヽ Tissue Tek Miles 社、 Elkhart, IN) に包埋し、 ド ライアイス Zアセトンで瞬時に凍結した。 この凍結包埋組織から 4〃m の凍結切 片を作製した。 この凍結切片を 4%のスキムミルクにより室温で 60 分間ブロッ キングしたのち、 ゥサギ抗ヒト 'メグシン IgG (10 ig/ml) , あるいは 1 :200に 希釈したフルォレヅセインイソチオシァネート （FITC) 標識ャギ抗マウス IgG、 IgA、 IgM、 または C3抗体 （Cappel社） のいずれかと 4口でー晚ィンキュベ一ト した。 ついで、 1 :50 に希釈したペルォキシダ一ゼ標識ブ夕抗ゥサギ抗体 (Dako 社、 Glostrup, Denmark) と室温で 20 分間インキュベートし、 0.03%の過酸化 水素水を含有する 3, 3' -ジァミノべンジジン溶液で発色させた。 その後、 へマト キシリンによる対比染色を行った。
トランスジエニックマウスの腎臓組織に対して免疫組織染色した顕微鏡写真
(Carl Zeiss(New York, NY)製 Zeiss Ortholux 9902) を図 4に示す。 図から 明らかなように、 トランスジエニックマウスの腎臓ではメグシンタンパク質がー 様に発現していることが確認された。
[実施例 8 ] メグシン · トランスジェニヅクマウスの病理解析 （ 1 ) PAS 染色に よる観察と定量化
実施例 3で得られた F1世代のトランスジヱニックマウスの病理解析を行つた。 これらのマウスは外見上、 正常マウスに比べ明らかな変化は見られなかった。 ま た、 行動も正常マウスと違いは認められなかった。 また、 剖検によっても、 腎臓 (後述） 以外に著変は見られなかった。 主要臓器の組織切片 （HE 染色） の観察 によっても、 腎臓以外に特に異常は見られなかった。
各トランスジエニックマウスの腎臓の PAS 染色により、 メサンギゥム基質の 面積およびメサンギゥム細胞数の変化などの解析を行った。 F1 (ヘテロ） 個体 では、 10 週目まで著変はなかったが、 36-40 週目にかけてメサンギゥム細胞を 主体とした細胞増殖、 メサンギゥム基質の増生が認められ、 増殖性腎炎像が観察 された。 このときの腎臓の PAS 染色像を図 5に示す。 糸球体肥大、 メサンギゥ ム細胞の増加、 メサンギゥム基質の増生を含む、 メサンギゥム細胞増殖性腎炎の 典型的な所見が見られた。
これらの観察結果を以下のように定量化した。 PAS染色像を 3CCD カメラ （ォ リンパス、 Tokyo, Japan) でスキャンし、 糸球体全体の大きさと糸球体あたり のメサンギゥム細胞の数とをソフトウエア： Image Grabber PCI (富士フィルム、 Tokyo, Japan) および Mac Aspect (Mitani, Tokyo, Japan) により測定した。 糸球体の大きさは糸球体を形成する毛細血管の外束を囲んで生じる領域の面積と して定義した。 皮質中層部に存在する 20個の糸球体を同定し、 測定した。 20個 未満の糸球体しか含まない切片は測定に用いなかった。 測定者によって測定値が ばらつくのを避けるために、 20 個の糸球体のうち、 最大および最小のものを測 定から除外した。 つまり、 切片ごとに 18個の糸球体を測定し、 測定値を平均値 士標準偏差 （SD) で表した。 有意差を評価するために、 分散分析 （AN0VA) を行 つた。 その結果として、 もし、 有意差が認められたら、 Scheffe の t-テストを 行い、 トランスジヱニックマウス、 および野生型マウスそれぞれについて得られ た結果を比較した。
野生型マウス 25 匹について測定を行い、 トランスジエニックマウスの測定値 が野生型マウスの平均値 +2SD 以下の場合には正常であると見なした。 この基準 に従うと、 生後 20 週目の F1 (ヘテロ） トランスジエニックマウスでは、 14 匹 のうち、 3 匹が変化を示したが、 40 週目では、 19 匹のうち、 11 匹 （57.9%) に ついて糸球体の大きさが増加し、 12 匹 （63.2%) について糸球体細胞の数が増加 した （図 6 ) 。 合わせると、 14匹 （73.0%) が組織学的に糸球体の異常を示した。 このような疾患の重篤度 （severity) 、 および浸透率 （penetrance) は性別に よらず一定であった。 また、 これまでに調べた他の器官、 例えば、 脳、 心臓、 肺、 脾臓、 肝臓、 胃、 腸、 精巣、 および子宮においては病理学的な変化は検出されな かった。 野生型マウスでは、 40 週目にメサンギゥム基質の増生を示した 1 匹を 除き、 病理学的な変化は観察されなかった。
[実施例 9 ] メグシン · トランスジエニックマウスの病理解析 （2 ) 免疫複合体 沈着の観察
腎臓が異常を示すようになる 40 週齢目のトランスジエニックマウス （F1 世 代） において、 免疫グロブリン （IgA, IgG, IgM) や補体から成る免疫複合体の 糸球体メサンギゥム領域への沈着が同週齢の野生型マゥスの場合に比べて著しく 増大するのが免疫蛍光染色により示された （図 7 ) 。
上記の組織に対して電子顕微鏡による解析を行った。 腎組織を、 2% グルター ルアルデヒドを含む 0. 1M リン酸ナトリウム緩衝液中に 2時間浸して固定し、 さ らに 2% 四酸化オスミウムで後固定した。 固定した腎組織をエタノールで脱水し、 最終的に Epon 812 (TAAB, England) 中に包埋した。 この試料から切り出した超 薄切片を酢酸ゥラニルで染色し、 アセトンで処理したのち、 電子顕微鏡 （JEM - 1200EX, JEOL, Tokyo, Japan) により解析した。
その結果、 非トランスジエニックマウスではメサンギゥム領域における高電子 密度の沈着物が少数観察されるのみだつたのに対し、 トランスジエニックマウス では高電子密度の沈着物は著しく増加しており、 その大きさは 100~1000nm に およんだ （図 8 ) 。 トランスジエニックマウスのメサンギゥム領域における異常 はメサンギゥム細胞数の増加、 およびメサンギゥム基質の増生によるものであつ た。 病理的な異常はメサンギゥム領域に限られており、 毛細血管内皮は概して正 常な外観を示し、 内皮細胞の有窓性 （fenestration) は維持されていた。 糸球 体上皮細胞は足突起 （foot process) の正常な形態的特徴を維持しており、 無 傷であった。 皮質尿細管も正常な外観を示した。 単核白血球、 または多形核白血 球の浸潤は検出されなかった。
[実施例 1 0 ] ノーザンブロッ ト分析によるトランスジエニックマウス各種臓器 におけるヒトメグシン発現の確認
全 RMを ISOGEN (Wako Pure Chemicals, Osaka, Japan) を用いて、 凍結腎 臓や各種組識より迅速に単離した。 RNA 20〃gを 1%ァガロースホルムアルデヒ ドゲル上で電気泳動し、 ナイロンメンブレン （GeneScreen PlusTM) にキヤビラ リートランスファ一した。 転写した RNAは、 32P標識した導入ヒトメグシン遺伝 子とハイブリダィズさせ、 ォ一トラジオグラフィーの前に 0. 1%ドデシル硫酸ナ トリウム （SDS) を含む 0.2 X SSCで洗浄した。 ノーザンブロット分析から、 トランスジエニックマウスにおいてヒトメグシン m Aの過剰発現が確認された （図 9 ) 。 導入遺伝子はあらゆる組識で発現して いたが、 特に腎臓および心臓において強い発現が見られた。 トランスジエニック マウスにおけるヒトメグシン cDNAの発現は、 着床前段階で始まり、 40週齢後ま で続いた。
[実施例 1 1 ] 免疫組識化学分析による IV 型コラーゲン及びラミニンの蓄積の 増生した基質の成分を同定するために、 以下の抗体を用いて、 凍結切片に免疫 組識染色法（Nangaku, M. et. al . , J. Am. Soc . Nephrol . 10， 2323-2331 , 1999 )を施行した。 IV型コラーゲンと I型コラーゲンは、 それぞれ、 ャギ抗 IV 型コラーゲン ·ポリクロ一ナル抗体、 およびャギ抗 I型コラーゲン 'ポリクロ —ナル抗体 (Southern Biotechnology. Birmingham, AL)で同定した。 フイブ口 ネクチンはゥサギ抗フィブロネクチン抗体（Chemicon)で確認した。
上記の細胞外メサンギゥム基質成分に対する抗体を用いて腎臓部分を染色した 結果を図 1 0に示した。 野生型及びトランスジエニックマウス両方で、 I型コラ 一ゲンの蓄積は観察されなかった。 トランスジエニックマウスでは、 糸球体にお いて、 IV型コラーゲンおよびラミニンの蓄積を示した。 対照的にトランスジェ ニックマウスでは、 フイブロネクチンの量が野生型マウスと比較してより少なか つた。 つまり、 増大したメサンギゥム基質は IV型コラーゲンおよびラミニンか ら構成されていることが明らかになった。
正常な状態ではメグシンは糸球体メサンギゥム領域に局在するが、 トランスジ エニックマウスにおいては全ての組織においてメグシンの発現が見られた。 これ は、 遺伝子導入に用いたプロモー夕一が、 組織特異性の無いものであったことに よるものと考えられる。 免疫組織学的な検討によれば、 腎臓のメサンギゥム領域 以外の領域を含む、 宿主動物の全身におけるメグシンの存在が観察された。 とこ ろが、 メグシンの過剰発現による影響はメサンギゥムに限局されていた。 この知 見は、 メサンギゥムに局在しているメグシンの標的分子 （メグシン ' リガンド） の存在を示唆する点で、 非常に興味深い。 つまり、 メグシンの活性発現には、 こ の領域にのみ存在するリガンドの存在が必要であることが考えられる。 いずれに せよ、 メサンギゥムにおけるメグシンの強制発現によって、 メサンギゥム増殖性 腎炎の典型的な病態がもたらされることが明らかとなった。
以上の結果が示すとおり、 ヒトメグシン遺伝子導入トランスジエニックマウス では、 メサンギゥム基質の増生とメサンギゥム細胞の増加が観察された。 メサン ギゥム基質の増生は、 IV型コラーゲンとラミニンによるものであった。 また障 害を受けた糸球体には、 免疫グロブリンと補体を含む免疫複合体が集積していた メグシンの強制発現によって、 病態をより忠実に反映したメサンギゥムの損傷 がもたらされた。 これらの結果は、 メグシントランスジエニックマウスが、 腎機 能の保持と、 メサンギゥム損傷の進行を調節可能な薬剤研究のモデルとして利用 できることを裏付けている。 また本発明のメサンギゥム増殖性腎炎モデル動物を 通じて、 メグシンに基づいてヒト糸球体疾患の病態を理解できる可能性がある。 産業上の利用の可能性
本発明により、 メグシン遺伝子の導入によるメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデ ル動物が提供された。 本発明のトランスジェニック動物に特徴的な病理像として は、 メサンギゥムおよび糸球体内皮細胞領域の細胞増殖と細胞外基質の蓄積を慢 性進行性に呈する点を挙げることができる。 このような病理所見は、 本発明のモ デル動物がよりヒ卜の慢性糸球体腎炎に近い病態を呈していることを裏付けてい る。 したがって、 慢性糸球体腎炎の原因解明に役立つものと考えられる。 このよ うな病理所見は従来のモデル動物では確認されていなかったものである。
本発明のモデル動物を用いて、 メサンギゥム細胞増殖性腎炎の発症メカニズム や病態の解析が可能になる。 また、 本発明のモデル動物は、 メサンギゥム細胞増 殖性腎炎の治療薬の開発やスクリーニング、 さらには薬剤の検定などのために有 用である。
本発明のメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物は、 トランスジエニック動物 であるため、 均一性の高いモデル動物を容易に、 しかも多量に供給できることか ら、 精度の高い実験を可能とするものである。 しかも、 本発明のメサンギゥム細 胞増殖性腎炎モデル動物により、 メサンギゥム基質領域の増生、 メサンギゥム細 胞の増加、 そして免疫複合体の沈着を伴う典型的なメサンギゥム細胞増殖性腎炎 の所見が認められた。 特に、 このような実際の病態に忠実なモデル動物が提供さ れた本発明の意義は、 非常に大きい。

Claims

請求の範囲
1.ヒト ·メグシン、 またはヒト ·メグシンと機能的に同等なタンパク質をコ一 ドする外来性の DNAを腎メサンギゥム細胞において発現するトランスジェニ ック非ヒト動物であるメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物。
2.ヒト ·メグシンをコードする DNAが、 配列番号： 1に記載の塩基配列のコー ド領域からなる請求項 1に記載のメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物。
3.非ヒト動物がマウスである請求項 1に記載のメサンギゥム細胞増殖性腎炎モ デル動物。
4.ヒト ·メグシン、 またはヒト ·メグシンと機能的に同等なタンパク質をコ一 ドする DNAと、 この DNAを動物の腎メサンギゥム細胞において発現させるこ とができるプロモー夕一とを含むメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物作 製用組み換え遺伝子。
5.次の工程を含む、 メサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物の作製方法。
a) 動物の受精卵に請求項 4に記載の組み換え遺伝子を導入する工程 b) 工程 a) の受精卵から発生した初代トランスジヱニック動物のうち導入 した外来性遺伝子を保持した個体を選択する工程
6.更に次の工程 c) および d) を含む請求項 5に記載のメサンギゥム細胞増殖 性腎炎モデル動物の作製方法。
c) 工程 b) で選択した個体と正常動物を交配させて外来性遺伝子をへテロ で保有する F 1動物を得る工程
d) 工程 c) で得た F 1動物同士を交配させて外来性遺伝子をホモで保有す る F 2動物を得る工程
7.次の工程を含む、 メサンギゥム細胞増殖性腎炎に対する候補化合物の治療効 果を評価する方法。
a) 請求項 1に記載のメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物に候補化合物 を投与する工程、
b ) 前記モデル動物における腎炎症状の変化を観察する工程
次の工程を含む、 メサンギゥム細胞増殖性腎炎治療用の化合物をスクリー二 ングする方法。
a ) 請求項 1に記載のメサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物に候補化合物 を投与する工程、
b ) 前記モデル動物における腎炎症状の変化を観察する工程
c ) メサンギゥム細胞増殖性腎炎モデル動物の腎炎症状を緩和する化合物を 選択する工程
請求項 8に記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を主 成分として含む、 メサンギゥム細胞増殖性腎炎の治療、 および Zまたは予防 用医薬組成物。
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